CN118048397A - 靶向敲除znf410基因的单碱基编辑系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向敲除ZNF410基因的单碱基编辑系统及其应用。本发明提供了一种用于沉默ZNF410基因表达的单碱基编辑系统，包括单碱基编辑器和与其配合使用的gRNA；所述gRNA的靶点的序列为序列3或序列2。本发明通过将单碱基碱基编辑器与特定的gRNA序列共同转染至哺乳动物细胞中，测序检测编辑效率，成功筛选出特异性较高的gRNA序列及其对应的碱基编辑器，从而安全终止ZNF410基因的表达，以期增加细胞内γ‑珠蛋白的含量，达到β‑地中海贫血疾病治疗的目的。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及靶向敲除ZNF410基因的单碱基编辑系统及其应用。
背景技术
单碱基编辑系统是基于CRISPR/Cas9技术发展起来的一种新型的碱基替换技术，通过没有活性的或者具有单条链切割活性的Cas蛋白与碱基脱氨酶融合，在特定gRNA的引导下可以引起碱基的定向突变但是不会造成双链的断裂，具有更高的编辑效率。目前常见的碱基编辑器有胞嘧啶碱基编辑器(CBE)，其可以将碱基C突变为T，腺嘌呤碱基编辑器(ABE)可以将碱基A突变为G，以及GBE碱基编辑器可以实现哺乳动物细胞中碱基C到G的转化。其中CBE碱基编辑器可以在基因中提前引入终止密码子，从而达到基因安全终止的目的。ABE碱基编辑器可以破坏基因的起始密码子序列，同样达到基因安全终止的目的。
β-地中海贫血症(β-mediterranean anemia)是世界范围内高发的单基因遗传病，在我国以广西省携带率最高。主要是一种由于β链珠蛋白合成受阻导致的以溶血性贫血为特征的血红蛋白病。目前的研究结果表明对于β-地中海贫血症主要是通过提高β-珠蛋白的含量达到疾病治疗的目的。另外有研究证明增加γ-珠蛋白的含量也能够弥补β-珠蛋白缺失造成的症状，据报道一种称为遗传性胎儿血红蛋白持续存在症(HPFH)的遗传病，该类患者的胎儿血红蛋白在成人时期仍能表达，对于正常人来说患有该类疾病并没有引起明显的症状，但是对于β-地中海贫血患者来说却可以得到有效的缓解，因此在β-地中海贫血患者中重新激活γ-珠蛋白的表达可能是治疗该类遗传病的一种策略。目前主要是通过敲除启动子区的保守序列-102到-114，破坏转录抑制因子BCL11A的结合区，从而可以提高其表达。
最近的研究表明ZNF410基因可以特异性的激活NuRD复合体中的CHD4基因，而CHD4基因可以沉默成年人红细胞中γ-珠蛋白的表达。基因敲除ZNF410基因的表达后CHD4基因的含量降低，从而抑制血红蛋白表达的作用减弱。该研究结果为β-地中海贫血症的治疗提供了一定的理论指导。
发明内容
本发明的目的是提供靶向敲除ZNF410基因的单碱基编辑系统及其应用。
一方面，本发明提供了一种用于沉默ZNF410基因表达的单碱基编辑系统，包括单碱基编辑器和与其配合使用的gRNA；
所述gRNA的靶点的序列为序列3或序列2。
上述系统中，所述单碱基编辑器为BE4max、A3ABE4max、eA3ABE4max、hyBE4max、hyA3ABE4max或hyeA3ABE4max；
所述BE4max为如下a1-a3任一种：
(a1)序列表中序列5所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)与(a1)-(a2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述hyBE4max为如下b1-b3任一种：
(b1)序列表中序列6所示的蛋白质；
(b2)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(b3)与(b1)-(b2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述hyA3ABE4max为如下c1-c3任一种：
(c1)序列表中序列7所示的蛋白质；
(c2)在(c1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(c3)与(c1)-(c2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述hyeA3ABE4max为如下d1-d3任一种：
(d1)序列表中序列8所示的蛋白质；
(d2)在(d1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(d3)与(d1)-(d2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述A3ABE4max为如下e1-e3任一种：
(e1)序列表中序列9所示的蛋白质；
(e2)在(e1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(e3)与(e1)-(e2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述eA3ABE4max为如下f1-f3任一种：
(f1)序列表中序列10所示的蛋白质；
(f2)在(f1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(f3)与(f1)-(f2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
上述系统中的gRNA和与其配合使用单碱基编辑器为如下1)或2)：
1)所述gRNA的靶点的序列为序列3，与其配合使用单碱基编辑器为BE4max、A3ABE4max、eA3ABE4max、hyBE4max、hyA3ABE4max或hyeA3ABE4max；
2)所述gRNA的靶点的序列为序列2，与其配合使用单碱基编辑器为hyA3ABE4max。
上述单碱基编辑系统为如下1)或2)：
1)由如下1)-A和1)-B)组成：
1)-A为所述单碱基编辑器或其mRNA或表达该蛋白的重组载体；
1)-B为所述gRNA；
2)为表达所述单碱基编辑器和所述gRNA的载体。
上述系统中，所述gRNA为序列2或序列3编码的RNA。
第二方面，本发明提供了第一方面的单碱基编辑系统在提高ZNF410基因编辑效率中的应用；
或本发明提供了第一方面的单碱基编辑系统在制备提高ZNF410基因编辑效率产品中的应用。
第三方面，本发明提供了第一方面的单碱基编辑系统在提高γ-珠蛋白的表达中的应用；
或，本发明提供了第一方面的单碱基编辑系统在制备提高γ-珠蛋白的表达产品中的应用；
或，本发明提供了第一方面的单碱基编辑系统在制备治疗β-地中海贫血疾病产品中的应用。
第四方面，本发明提供了ZNF410基因中序列2或序列3所示的DNA分子作为靶点在开发或制备提高ZNF410基因编辑效率产品中的应用；
或，本发明提供了ZNF410基因中序列2或序列3所示的DNA分子作为靶点在开发或制备提高γ-珠蛋白的表达产品中的应用；
或本发明提供了ZNF410基因中序列2或序列3所示的DNA分子作为靶点在开发或制备治疗β-地中海贫血疾病产品中的应用。
第五方面，本发明提供了一种基因编辑ZNF410基因的方法，包括如下步骤：用第一方面所述的单碱基编辑系统对细胞基因组的ZNF410基因进行基因编辑，使ZNF410基因终止表达，实现基因编辑ZNF410基因。
在本发明的实施例中，上文的细胞举例为HEK293T细胞。
本发明通过将单碱基编辑器与特定的gRNA序列共同转染至哺乳动物细胞中，测序检测编辑效率，成功筛选出特异性较高的gRNA序列及其对应的碱基编辑器，从而安全终止ZNF410基因的表达，以期增加细胞内γ-珠蛋白的含量，达到β-地中海贫血疾病治疗的目的。
附图说明
图1为不同单碱基碱基编辑器与gRNA的编辑效率结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、利用单碱基编辑器引入提前终止密码子安全终止ZNF410基因的表达
一、沉默ZNF410基因表达的单碱基编辑系统的构建
1、gRNA的设计合成
在NCBI网站上下载ZNF410基因的全序列，根据PAM框NGG选取多条含有CAG、CAA、CGA或者TGG的gRNA序列。为了确保引入终止密码子后达到基因安全终止的目的，gRNA的选取尽量在mRNA序列的前二分之一内。根据gRNA载体的酶切位点Bsa I，将新设计的gRNA序列以引物对的形式合成：将用于制备gRNA的引物对经过98℃变性并逐渐冷却至室温，此时引物对中上下游引物碱基配对形成含有粘性末端的DNA双链，该DNA双链表达gRNA。
不同gRNA的靶点如下：
gRNA1的靶点:gatgggcagtcaaaagattc(序列1，ZNF410基因1号gRNA靶点)；
gRNA2的靶点:gagctggccatacaaatgtc(序列2，ZNF410基因2号gRNA靶点)；
gRNA3的靶点:tagcctccgaaaacatctgg(序列3，ZNF410基因3号gRNA靶点)。
制备上述gRNA的引物对如下：
制备gRNA1的引物对：g1-F:caccgatgggcagtcaaaagattc，g1-R:aaacgaatcttttgactgcccatC；
制备gRNA2的引物对：g2-F:caccGagctggccatacaaatgtc，g2-R:aaacgacatttgtatggccagctC；
制备gRNA3的引物对：g3-F:caccGtagcctccgaaaacatctgg，g3-R:aaacccagatgttttcggaggctaC。
将上述各个gRNA对应的引物对经过98℃变性并逐渐冷却至室温，得到gRNA1的含有粘性末端的编码DNA双链、gRNA2的含有粘性末端的编码DNA双链和gRNA3的含有粘性末端的编码DNA双链。
2、表达gRNA质粒的构建
将上述1制备的各个gRNA的含有粘性末端的编码DNA双链和gRNA空载体加入Golden Gate的反应体系中，经过一系列的酶切连接反应即可将gRNA序列插入载体中，构建gRNA的表达质粒并进行测序验证。
上述gRNA空载体按照如下方法制备：将序列4所示的DNA分子通过同源重组的方式插入pU6-sp-sgRNA-RNF2_+41nick载体(Addgene公司购买，货号为#135958)中，获得gRNA空载体，其中序列4两端gagacc和ggtctc分别为BsaI酶切位点。
表达gRNA1质粒为将gRNA1的含有粘性末端的编码DNA双链替换gRNA空载体两个BsaI酶切位点间的片段，得到的质粒，该质粒表达gRNA1(序列1编码的RNA)。
表达gRNA2质粒为将gRNA2的含有粘性末端的编码DNA双链替换gRNA空载体两个BsaI酶切位点间的片段，得到的质粒，该质粒表达gRNA2(序列2编码的RNA)。
表达gRNA3质粒为将gRNA3的含有粘性末端的编码DNA双链替换gRNA空载体两个BsaI酶切位点间的片段，得到的质粒，该质粒表达gRNA3(序列3编码的RNA)。
3、单碱基编辑系统的构建
将上述表达各个gRNA质粒和表达单碱基编辑器的质粒配合使用，获得单碱基编辑系统。
六种代表性胞嘧啶碱基编辑器如下：BE4max、A3ABE4max、eA3ABE4max、hyBE4max、hyA3ABE4max和hyeA3ABE4max。
表达单碱基编辑器BE4max的质粒pCMV_BE4max_P2A_GFP在Addgene公司购买，货号为#112099，其氨基酸序列为序列5。
表达单碱基编辑器hyBE4max的质粒hyBE4max在Addgene公司购买，货号为#157942，单碱基编辑器hyBE4max的氨基酸序列为序列6。
表达单碱基编辑器hyA3ABE4max的质粒hyA3A-BE4max在Addgene公司购买，货号为#157943，单碱基编辑器hyA3ABE4max的氨基酸序列为序列7。
表达单碱基编辑器hyeA3ABE4max的质粒hyeA3A-BE4max在Addgene公司购买，货号为#157944，单碱基编辑器hyeA3ABE4max的氨基酸序列为序列8。
表达单碱基编辑器A3ABE4max的质粒A3A-BE4为在hyA3A-BE4max基础上删除该质粒的第1932-2369位碱基获得的质粒，单碱基编辑器A3ABE4max的氨基酸序列为序列9。
表达单碱基编辑器eA3ABE4max的质粒eA3A-BE4max在hyeA3A-BE4max基础上删除该质粒的第1962-2399位碱基获得的质粒，单碱基编辑器eA3ABE4max的氨基酸序列为序列10。
二、沉默ZNF410基因表达的单碱基编辑系统的编辑效率检测
HEK293T细胞(实施例中用293T表示)为本实验室保存，在文献Dongdong Zhao,JuLi,Siwei Li,Xiuqing Xin,Muzi Hu,Marcus A Price,Susan J Rosser,Changhao Bi,Xueli Zhang New base editors change C to A in bacteria and C to G inmammalian cells.Nature Biotechnol 2020-07中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
将HEK293T细胞按5×105个/孔铺24孔板，等每个孔细胞长至40％-60％时，将表达6种单碱基编辑器的质粒分别与上述2制备的表达不同gRNA质粒，按照600ng单碱基编辑器质粒、300ng gRNA质粒的量，利用Lipofectamine 2000(Life,Invitrogen,11668019)试剂转染到HEK293T。
每种质粒组合转染设3个重复，转染24小时后添加5ug/ml嘌呤霉素(Merck,USA)到培养基中。转染120小时后使用快速提取DNA提取液(Epicentre,USA)提取基因组DNA，对被编辑位点附近200bp-300bp区域利用Taq DNA聚合酶(康为世纪，中国)PCR，将PCR产物进行高通量测序计算编辑效率(金唯智，中国)。对上述3个gRNA靶点的测序引物对如下：
测序gRNA1的引物对：g1-seqF:agtatctgagtagggtctttcc，g1-seqR:agtcttgaggtggtatttaaagt；
测序gRNA2的引物对：g2-seqF:aagtggaaaagaagctca，g2-seqR:ctggagtccctactttcctgta；
测序gRNA3的引物对：g3-seqF:gtgaagcccaaggatgtg，g3-seqR:attctgtcatgatgatgagaagctt。
结果如图1和表1所示，
表1为编辑器配合对应的gRNA的编辑效率(％)
| BE4max | A3ABE4max | eA3ABE4max | hyBE4max | hyA3ABE4max | hyeA3ABE4max | |
| gRNA1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 13 | 0 |
| gRNA2 | 15 | 11 | 6 | 13 | 27 | 5 |
| gRNA3 | 53 | 44 | 45 | 44 | 47 | 56 |
从上述可以看出，在HEK293T的3个gRNA位点中，ZNF410的2号gRNA和3号gRNA靶点对应的gRNA2和gRNA3具有较高的编辑效率，单碱基编辑系统中的gRNA2和其对应的碱基编辑器hyA3ABE4max编辑效率高，单碱基编辑系统中的gRNA3和其对应的6种碱基编辑器均高。
Claims (9)
1.一种用于沉默ZNF410基因表达的单碱基编辑系统，包括单碱基编辑器和与其配合使用的gRNA；
所述gRNA的靶点的序列为序列3或序列2。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述单碱基编辑器为BE4max、A3ABE4max、eA3ABE4max、hyBE4max、hyA3ABE4max或hyeA3ABE4max；
所述BE4max为如下a1-a3任一种：
(a1)序列表中序列5所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)与(a1)-(a2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述hyBE4max为如下b1-b3任一种：
(b1)序列表中序列6所示的蛋白质；
(b2)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(b3)与(b1)-(b2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述hyA3ABE4max为如下c1-c3任一种：
(c1)序列表中序列7所示的蛋白质；
(c2)在(c1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(c3)与(c1)-(c2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述hyeA3ABE4max为如下d1-d3任一种：
(d1)序列表中序列8所示的蛋白质；
(d2)在(d1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(d3)与(d1)-(d2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述A3ABE4max为如下e1-e3任一种：
(e1)序列表中序列9所示的蛋白质；
(e2)在(e1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(e3)与(e1)-(e2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述eA3ABE4max为如下f1-f3任一种：
(f1)序列表中序列10所示的蛋白质；
(f2)在(f1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(f3)与(f1)-(f2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述系统中的gRNA和与其配合使用单碱基编辑器为如下1)或2)：
1)所述gRNA的靶点的序列为序列3，与其配合使用单碱基编辑器为BE4max、A3ABE4max、eA3ABE4max、hyBE4max、hyA3ABE4max或hyeA3ABE4max；
2)所述gRNA的靶点的序列为序列2，与其配合使用单碱基编辑器为hyA3ABE4max。
4.根据权利要求1-3中任一所述的单碱基编辑系统，其特征在于：
所述单碱基编辑系统为如下1)或2)：
1)由如下1)-A和1)-B)组成：
1)-A为所述单碱基编辑器或其mRNA或表达该蛋白的重组载体；
1)-B为所述gRNA；
2)为表达所述单碱基编辑器和所述gRNA的载体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的单碱基编辑系统，其特征在于：
所述gRNA为序列2或序列3编码的RNA。
6.权利要求1-5中任一所述的单碱基编辑系统在提高ZNF410基因编辑效率中的应用；
或权利要求1-5中任一所述的单碱基编辑系统在制备提高ZNF410基因编辑效率产品中的应用。
7.权利要求1-5中任一所述的单碱基编辑系统在提高γ-珠蛋白的表达中的应用；
或，权利要求1-5中任一所述的单碱基编辑系统在制备提高γ-珠蛋白的表达产品中的应用；
或，权利要求1-5中任一所述的单碱基编辑系统在制备治疗β-地中海贫血疾病产品中的应用。
8.ZNF410基因中序列2或序列3所示的DNA分子作为靶点在开发或制备提高ZNF410基因编辑效率产品中的应用；
或，ZNF410基因中序列2或序列3所示的DNA分子作为靶点在开发或制备提高γ-珠蛋白的表达产品中的应用；
或ZNF410基因中序列2或序列3所示的DNA分子作为靶点在开发或制备治疗β-地中海贫血疾病产品中的应用。
9.一种基因编辑ZNF410基因的方法，包括如下步骤：用权利要求1-5中任一所述的单碱基编辑系统对细胞基因组的ZNF410基因进行基因编辑，使ZNF410基因终止表达，实现基因编辑ZNF410基因。
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