CN113416730B - 一种降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变的方法。所述降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变的方法包括向细胞中导入基因编辑元件和辅助核苷酸，进行基因编辑，所述辅助核苷酸包括能够促进基因编辑位点进行同源重组修复或非同源性末端连接修复的核苷酸。本发明中，通过在基因编辑位点整合核苷酸序列，能够有效降低大片段删除突变，采用单链寡核苷酸(ssODN)、双链寡核苷酸或腺相关病毒与基因编辑元件共转化入细胞进行基因编辑，能够显著降低编辑位点附近大片段删除概率，并能保证高效的基因编辑效率，对提高基因编辑治疗的安全性具有重要意义。

Description

一种降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变的方法。

背景技术

CRISPR-Cas9是一种基因编辑系统，一般的CRISPR-Cas9系统包括一段人工合成的Guide RNA和Cas9酶，人工设计的Guide RNA代替了细菌中的crRNA，Guide RNA包括两部分：Spacer和Scaffold，Scaffold连接至Cas9，形成gRNA-Cas9复合物(RNP)，而spacer中包含了与目标序列互补的RNA序列，引导Cas9复合物与目标基因片段相邻的PAM序列结合，发挥剪切作用，DNA被切割后能够通过非同源性末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)途径或者同源重组修复(Homology directed repair，HDR)途径进行基因修复，这为细胞的基因编辑奠定了基础(参见：Cox DB,Platt RJ,Zhang F.Therapeutic genome editing:prospects and challenges.Nat Med,2015,21:121-131.)。

但是基因编辑技术仍具备一定的安全风险，在走向临床应用前还需要有更深入的研究来规避其带来的副作用，脱靶效应一直备受关注，且广泛存在于CRISPR-Cas9介导的基因编辑细胞中，有研究通过对检测方法的改进(参见：Tsai SQ,Zheng Z,Nguyen NT,etal.GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.Nat Biotechnol,2015,33:187-197.)，Cas9核酸酶的优化(参见：Slaymaker IM,Gao L,Zetsche B,et al.Rationally engineered Cas9 nucleases withimproved specificity.Science,2016,351:84-88.)或者改进递送方式能够在一定程度降低脱靶效应；除了脱靶效应之外，基因编辑的细胞还有可能在基因切割位点产生长达数千碱基对的大片段删除突变，有研究利用长片段的PCR结合三代测序技术能够发现大片段产删除突变这一现象(参见：Kosicki M,Tomberg K,Bradley A:Repair of double-strandbreaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complexrearrangements.Nat Biotechnol 2018,36:765-771.)。

目前常规的三代测序技术为PacBio和纳米孔(nanopore)测序技术，相比前者，纳米孔测序能够更快速精确完成长达100kb读长的测序工作，因此，长片段PCR结合纳米孔测序技术可以做为一个方便快捷的检测大片段删除突变的方法。

虽然有研究报道了人的胚胎，诱导多能干细胞以及小鼠的胚胎干细胞中进行基因编辑会产生大片段删除突变，但是这些研究都没有涉及目前和临床相关的人类细胞，比如T细胞和造血干/祖细胞(HSPC)，并且这些研究虽然系统地研究了大片段删除突变的现象和一般规律，但是没有提出降低或者规避这类大片段删除突变的方法。

综上所述，提供一种降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变的方法，对于基因编辑领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变的方法，所述方法包括向细胞中导入基因编辑元件和辅助核苷酸，进行基因编辑，既能够保证高效的基因编辑效率，还能有效降低大片段删除概率，对于基因编辑领域具有重要意义。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变的方法，所述方法包括：

向细胞中导入基因编辑元件和辅助核苷酸，进行基因编辑，所述辅助核苷酸包括能够促进基因编辑位点进行同源重组修复(HDR)或非同源性末端连接修复(NHEJ)的核苷酸。

本发明中，通过在基因编辑位点整合核苷酸序列，能够有效降低大片段删除突变。

优选地，所述辅助核苷酸包括单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、质粒或腺相关病毒中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述单链寡核苷酸包括同源臂和插入序列，所述同源臂包括与基因编辑位点同源的同源左臂和同源右臂，所述插入序列位于所述同源左臂和同源右臂之间。

优选地，所述质粒包括同源臂，所述同源臂包括与基因编辑位点同源的同源左臂和同源右臂。

优选地，所述质粒中的同源臂的两端携带sgRNA识别序列。

优选地，所述腺相关病毒包括同源臂，所述同源臂包括与基因编辑位点同源的同源左臂和同源右臂。

本发明中，单链寡核苷酸(ssODN)具有基因编辑位点的同源左臂和同源右臂及插入序列，基因编辑时，Cas9蛋白在sgRNA介导下切割基因组(Genome)产生双链DNA断裂，经同源重组修复途径(HDR)可实现插入序列整合到基因组，能够有效降低基因编辑位点附近大片段删除概率；双链寡核苷酸能通过非同源性末端接合(NHEJ)途径插入双链DNA断裂位置，整合到基因组，有效降低编辑位点附近大片段删除概率；质粒或者腺相关病毒具有基因编辑位点的同源左臂和同源右臂，同样能够作为修复模板，通过HDR方式将预定插入序列整合到基因组，有效降低编辑位点附近大片段删除概率。

根据本发明，所述单链寡核苷酸中同源左臂和同源右臂的长度各自独立地为40～60bp，包括但不限于41bp、42bp、43bp、44bp、46bp、48bp、50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、58bp或59bp。

优选地，所述插入序列的长度为1～30bp，包括但不限于2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、15bp、20bp、21bp、22bp、23bp或30bp。

本发明中，单链寡核苷酸(ssODN)具有同源臂和插入序列，应用其他类似的ssODN比如略微改变同源臂的长度、改变插入序列长度或对ssODN核苷酸进行修饰均能达到降低大片段删除的目的。

优选地，所述双链寡核苷酸的长度为24～39bp，包括但不限于26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、33bp、36bp或38bp。

优选地，所述双链寡核苷酸包括SEQ ID NO.1～3任一项所示的核酸序列。

SEQ ID NO.1：

GACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAG。

SEQ ID NO.2：

GGGTTAGGGGTTAGGGTAACGGGTTAGGG。

SEQ ID NO.3：

GTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGTAT。

根据本发明，HDR虽然能够介导在特异位点插入外源DNA，但是在非分裂的细胞中HDR效率较低，相反，NHEJ途径可存在于分裂细胞和非分裂细胞中，并且在哺乳动物细胞中NHEJ修复途径比HDR修复途径更高效，Cas9通常能够切割DNA产生2个平末端，然后通过NHEJ途径将两个双链DNA断裂的平末端连接，在这种情况下，将可能发生第二次切割，增加大片段删除的风险，具有平末端的短的双链寡核苷酸(dsODN)能够通过NHEJ机制插入双链DNA断裂的位置，在双链DNA断裂发生后，及时提供一个dsODN并插入双链DNA断裂的位置能够降低大片段删除概率。

本发明中，应用其他类似的双链寡核苷酸(dsODN)比如略微改变双链寡核苷酸的长度，略微改变双链寡核苷酸的序列，均能达到降低大片段删除的目的。

优选地，所述质粒或腺相关病毒中的同源左臂和同源右臂的长度各自独立地为300～1200bp，包括但不限于310bp、420bp、540bp、650bp、700bp、920bp、1040bp、1150bp、1180bp或1190bp。

本发明中，腺相关病毒载体具有同源臂，应用其他类似的腺相关病毒载体比如略微改变同源臂的长度均能达到降低大片段删除的目的。

优选地，所述腺相关病毒包括腺相关病毒血清型6。

优选地，所述质粒包括同源重组修复双切模板质粒(HDR双切模板质粒)。

优选地，所述基因编辑元件包括Cas9蛋白与sgRNA的复合物、表达Cas9和/或sgRNA的mRNA、表达Cas9和/或sgRNA的载体中的任意一种。

优选地，所述表达Cas9和/或sgRNA的载体包括表达Cas9和/或sgRNA的逆转录病毒、慢病毒载体或质粒中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述单链寡核苷酸的5’端和3’端包含分别经过硫代磷酸修饰的核苷酸。

优选地，所述经过硫代磷酸修饰的核苷酸的个数为1～5个，包括但不限于2个、3个或4个。

本发明中，对所述单链寡核苷酸的5’端和3’端的核苷酸分别进行硫代磷酸修饰，能够增强其稳定性。

本发明中，所述方法除了可应用于T细胞和人造血干/祖细胞(HSPC)的基因编辑外，还可应用于和T细胞和HSPC类似的原代细胞，比如自然杀伤细胞(NK细胞)，以及经重编程得到的人的诱导多能性干细胞(iPSC)等。

优选地，所述细胞包括T细胞、HSPC、NK细胞或iPSC中的任意一种。

优选地，所述导入的方法包括电转导、脂质体、纳米颗粒、基因枪法、显微注射法或化学诱导法中的任意一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明中，通过在基因编辑位点整合核苷酸序列，能够有效降低大片段删除突变；

(2)本发明中，采用单链寡核苷酸(ssODN)、双链寡核苷酸、双切模板质粒或腺相关病毒与基因编辑元件共转化入细胞进行基因编辑，能效降低编辑位点附近大片段删除概率，并能保证高效的基因编辑效率；

(3)本发明中，添加ssODN可以平均降低40％的DI，添加dsODN可以平均降低58％的DI，添加双切模板或AAV6-HDR载体可以平均降低82％的DI；添加ssODN降低64％的D100，添加dsODN降低63％的D100，添加AAV6降低78％的D100。

附图说明

图1为T细胞和HSPC基因编辑后检测基因编辑效率和大片段删除概率的流程示意图；

图2为基因编辑位点长片段PCR引物设计的示意图；

图3为三代测序数据的分析流程示意图；

图4为野生型细胞(未编辑组)和基因编辑的细胞(RNP编辑组)的代表性数据经分析后的IGV可视化图；

图5为不同的二维码(barcode)的PCR产物技术重复相关性分析图；

图6为不同细胞的不同位点的基因编辑效率图；

图7为不同细胞不同位点的删除绝对值(Raw deletion)；

图8A为T细胞中基因编辑后删除长度分别大于100bp(D100)，500bp(D500)，1000bp(D1000)，1500bp(D1500)和2000bp(D2000)的读长所占比例；

图8B为HSPCs细胞中基因编辑后删除长度分别大于100bp(D100)，500bp(D500)，1000bp(D1000)，1500bp(D1500)和2000bp(D2000)的读长所占比例；

图9为大片段删除(DI)和删除大于100bp的读长所占比例(D100)的相关性分析图；

图10为ssODN介导基因编辑HDR插入的示意图；

图11为T细胞中ssODN对不同位点基因编辑效率的影响图，“-”表示未加入ssODN，“+”表示加入ssODN，统计分析总编辑效率的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)；

图12为T细胞中ssODN对不同位点基因编辑后大片段删除(DI)影响图，统计分析DI的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图13为HSPCs中ssODN对不同位点对基因编辑效率的影响图，“-”表示未加入ssODN，“+”表示加入ssODN，统计分析总编辑效率的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)；

图14为HSPCs中ssODN对不同位点基因编辑后大片段删除(DI)影响图，统计分析DI的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图15为ssODN对T细胞和HSPCs中删除大于100bp的读长所占比例(D100)影响图，统计分析D100的变化差异，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图16为ssODN参与基因编辑的细胞的DI和D100相关性分析图；

图17为EEF2位点的腺相关病毒血清型6载体(AAV6-HDR载体)设计及其介导HDR基因修复的示意图；

图18为T细胞和HSPC中利用RNP和AAV6进行基因编辑后检测基因编辑效率和大片段删除概率的流程示意图；

图19为T细胞中腺相关病毒血清型6(AAV6)对不同位点基因编辑效率的影响图，“-”表示未加入AAV6，“+”表示加入AAV6，统计分析总编辑效率的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)，百分比表示和对照相比上调(向上箭头)的比例；

图20为EEF2位点的AAV6载体HDR效率的流式检测代表图；

图21为T细胞中AAV6对不同位点基因编辑后大片段删除(DI)影响图，统计分析DI的变化差异，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图22为AAV6对不同细胞基因编辑后D100影响图，统计分析D100的变化差异，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图23为T细胞中不同剂量的腺相关病毒载体(AAV6)在不同位点对基因编辑效率的影响图，统计分析总编辑效率的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)；

图24为不同剂量的腺相关病毒载体(AAV6)对T细胞中DI的影响图，统计分析DI的变化差异，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图25为HSPC中AAV6对不同位点基因编辑效率的影响图，“-”表示未加入AAV6，“+”表示加入AAV6，统计分析总编辑效率的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)，百分比表示和对照相比上调(向上箭头)的比例；

图26为HSPC中AAV6对不同位点基因编辑后大片段删除概率DI影响图，统计分析DI的变化差异，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图27为dsODN在CRISPR-Cas9切割DNA双链断裂位置插入的示意图；

图28为二代测序(PE150)检测基因编辑效率和dsODN在插入DNA双链断裂的效率代表性结果图；

图29为T细胞中dsODN(34bp dsODN)对不同位点基因编辑效率的影响图，“-”表示未加入dsODN，“+”表示加入dsODN，统计分析总编辑效率的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)；

图30为T细胞中dsODN(34bp dsODN)对不同位点基因编辑后大片段删除概率DI影响图，统计分析DI的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图31A为T细胞中EEF2位点不同剂量dsODN(34bp dsODN)对总编辑效率，dsODN插入率和相对大片段删除率(RDI)的影响，ns表示没有统计学差异(p>0.05)；

图31B为T细胞中AAVS1位点不同剂量dsODN(34bp dsODN)对总编辑效率，dsODN插入率和相对大片段删除率(RDI)的影响，ns表示没有统计学差异(p>0.05)；

图31C为T细胞中BCL11A-2位点不同剂量dsODN(34bp dsODN)对总编辑效率，dsODN插入率和相对大片段删除率(RDI)的影响，ns表示没有统计学差异(p>0.05)；

图32为dsODN的插入占总编辑效率的比例和相对大片段删除率(RDI)的线性相关性图；

图33为HSPC中经RNP和dsODN(34bp dsODN)在不同位点的基因编辑效率图，“-”代表未加入dsODN，“+”表示加入dsODN，统计分析总编辑效率的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)；

图34为HSPCs中dsODN(34bp dsODN)在不同位点对大片段删除(DI)的影响结果图，统计分析DI的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图35为T细胞经RNP和不同长度dsODN(28bp或29bp dsODN)在不同位点基因编辑效率图，“-”代表未加入dsODN，“28bp”表示加入28bp的dsODN，“29bp”表示加入29bp的dsODN，统计分析总编辑效率的变化差异，ns表示没有统计学差异(p>0.05)；

图36为T细胞中dsODN(28bp或29bp dsODN)对大片段删除(DI)的影响结果图，统计分析DI的变化差异，百分比表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图37为不同基因编辑方案的相对大片段删除率(RDI)结果图，百分比代表各组的平均值，百分比和箭头表示和对照相比下调(向下箭头)的比例；

图38为不同基因编辑方案的大D100结果图，统计分析D100的变化差异，百分比代表各组的平均值，百分比和箭头表示和对照相比下调(向下箭头)的比例。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

本发明实施例中，细胞培养方法包括：

(1)从新鲜的外周血中用Ficoll密度梯度离心常规方法提取外周血单个核细胞，用CD3磁珠富集T细胞，在细胞培养板中，将T细胞培养于ImmunoCult^TM-XF T CellExpansion Medium(购买自Stemcell Technologies公司)并添加20ng/mL人重组IL2(Peprotech)和20μL/mL的Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco)；

(2)人造血干/祖细胞(HSPC)分离自新鲜脐带血样本，脐带血样本先用羟乙基淀粉沉淀大部分红细胞后，上清细胞悬液用Ficoll密度梯度离心常规方法提取脐带血单个核细胞，并用CD34磁珠富集HSPC，将HSPC培养于StemSpan^TM SFEM II medium(StemcellTechnologies)，并添加100ng/mL人重组SCF(Peprotech)、100ng/mL人重组Flt3-L(Peprotech)、100ng/mL人重组TPO(Peprotech)、50ng/mL人重组IL6(Peprotech)、750nMSR1(Sigma)和50nM UM171(Sigma)。

制备Cas9-sgRNA复合物(RNP)：

均匀混合12μL crRNA(200μM，Integrated DNA Technologies)、6μL tracrRNA(200μM，Integrated DNA Technologies)、8μL 5x退火缓冲液(Synthego)和14μL无核酸酶的水，在PCR仪中78℃处理15分钟，25℃冷却后即为sgRNA。

将Cas9(Alt-R S.p.Cas9 Nuclease V3，Integrated DNA Technologies，#1081058)和sgRNA按摩尔比为1:2.5均匀混合，室温孵育15分钟，即得到Cas9-sgRNA复合物，实施例中所涉及的sgRNA识别序列如表1所示。

表1

基因位点	sgRNA识别序列
		EEF2	CTTCCTGGACAAATTGTAGG
AAVS1	TAAGGAATCTGCCTAACAGG
		BCL11A-1	CTAACAGTTGCTTTTATCAC
BCL11A-2	GTAGGCGACCAACATGGGGT

T细胞的电转化包括：

T细胞在激活4天后，按每个电转反应取(1.0-1.5)x10⁶个细胞离心弃掉上清，保留细胞沉淀，按P3Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit(Lonza，V4XP-3032)准备电转液，并加入RNP，终浓度为3.1μM，如果使用ssODN或dsODN，ssODN和dsODN的终浓度分别是1.9μM和2.4μM，用配置好的电转液轻弹重悬细胞沉淀，使用EH-115程序电转(电转仪LONZA 4D-Nucleofector^TM)，电转后将电转反应器在37℃孵育5分钟，将细胞转移到新鲜的培养液中，如果使用腺相关病毒载体(AAV载体)，在电转后的15分钟内，按照1x10⁴ vg/细胞剂量加入AAV载体，实施例中所涉及的ssODN的序列如表2所示。

表2

实施例中所涉及的AAV载体的同源臂序列和插入序列如下：

EEF2-AAV6(SEQ ID NO.8)

cagcttgtggaccccctaaatcactgaattcccaggggaggggctctcctatccccagtgtgagaagggctctgggcctggagctctgaaggcctacgccctgggccggtagagcagccgagctgtagcacagggttgtcccaaacgagcagcggcatgaggcccatgagtggcctgctaggcccttcgtgaagtgctgggcaccaggccgagtgtctggtctgcagggtgactcaggctgaggaactagcctgagctcctgacaggactttccttctgccctgccaccttctcgatggcccagtgagcctctcgcttccctctgcaggcttcaccgctgacctgaggtccaacacgggcggccaggcgttcccccagtgtgtgtttgaccactggcagatcctgcccggagaccccttcgacaacagcagccgccccagccaggtggtggcggagacccgcaagcgcaagggcctgaaagaaggcatccctgccctggacaacttcctggacaaattgcagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtcccatggtgagcaagggcgaggaggataacatggcctctctcccagcgacacatgagttacacatctttggctccatcaacggtgtggactttgacatggtgggtcagggcaccggcaatccaaatgatggttatgaggagttaaacctgaagtccaccaagggtgacctccagttctccccctggattctggtccctcatatcgggtatggcttccatcagtacctgccctaccctgacgggatgtcgcctttccaggccgccatggtagatggctccggataccaagtccatcgcacaatgcagtttgaagatggtgcctcccttactgttaactaccgctacacctacgagggaagccacatcaaaggagaggcccaggtgaaggggactggtttccctgctgacggtcctgtgatgaccaactcgctgaccgctgcggactggtgcaggtcgaagaagacttaccccaacgacaaaaccatcatcagtacctttaagtggagttacaccactggaaatggcaagcgctaccggagcactgcgcggaccacctacacctttgccaagccaatggcggctaactatctgaagaaccagccgatgtacgtgttccgtaagacggagctcaagcactccaagaccgagctcaacttcaaggagtggcaaaaggcctttaccgatgtgatgggcatggacgagctgtacaagtaacgcgtgcggcccttcctgcagcgcctgccgccccggggactcgcagcacccacagcaccacgtcctcgaattctcagacgacacctggagactgtcccgacacagcgacgctcccctgagaggtttctggggcccgctgcgtgccatcactcaaccataacacttgatgccgtttctttcaatatttatttccagagtccggaggcagcagacacgccctcttagtagggacttaatgggccggtcggggagggggaggcgggatgggacacccaacactttttccatttcttcagagggaaactcagatgtccaaactaattttaacaaacgcattaagaggtttatttgggtacatggcccgcagtggcttttgccccagaaaggggaaaggaacacgcgggtagatgatttctagcaggcaggaagtcctgtgcggtgtcaccatgagcacctccagctgtactagtgccattggaataataaatttgataaggtggtgactctgttctgcatttttcacggtgtcttcgcaggggagcggggctgcccagtactgggctccctggagcctagaaggggacccgggccct。

AAVS1-AAV6(SEQ ID NO.9)

gggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccacgcgtagtttaaacttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctg。

BCL11A-1-AAV6(SEQ ID NO.10)

gggcaatacagactggttctgtgatgacaaataactcctagctcattcctaatgatttatcaccaaatgttctttcttcagctggaatttaaaatatggactcatccgtaaaataggaataataatagtatatgcttcatagggtttgtatgaaaataaaatgagtgcgtatttgtaaagttcctagagcagagtaagtgctccgagcttgtgaactaaaatgctgcctcctggtatttattagttacacctcagcagaaacaaagttatcaggccctttccccaattcctagtttgggtcagaagaaaagggaaaagggagaggaaaaaggaaaagaatatgacgtcagggggaggcaagtcagttgggaacacagatcctaacacagtagctggtacctgataggtgcctatatgtgatggatgggtggacagcccgacagatgaaaaatggacaattatgaggaggggagagtgcagacaggggaagcttcacctcctttacaattttgggagtccacacggcatggcatacaaattatttcattcccattgagaaataaaatccaattctccatcaccaagagagccttccgaaagaggcccccctgggcaaacggccaccgatggagaggtctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaacgcgtagtttaaacctgtgataaaagcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgccatatctcttttctggcctatgttattacctgtatggactttgcactggaatcagctatctgctcttacttatgcacacctggggcatagagccagccctgtatcgcttttcagccatctcactacagataactcccaagtcctgtctagctgccttccttatcacaggaatagcacccaaggtccatcagtacctcagagtagaaccccctataaactagtctggtttgcccatggggcacagtcaggctgttttccagggtggggtgcagacattctctgcctgttgtgatgcttacatataacgtcataacagacacacgtatgtgttgtgatccctgtggtttgagagtttggagcttccctaaaagtcaaaatattctcaatgggccctcaatcagcacatacacacaaaaggtacctggaaaactgtaattcttttcctgctcaaagacaggcaattcaataccccttcccccaaccaaaaaccct。

BCL11A-2-AAV6(SEQ ID NO.11)

ggctacacttccttttcctttcctctccatttcatccctttccaaaaagtgtttagacaaatagtttcccagacttggttttatcatgctgggttgacaaaggttgtgtacagagctggaataattttttcttctttctactgttggcacatcaatatctttttttctgcaaagaaggggctaagcttgcacgaaaacaccggtgggaacccactggagaagggcatgggtggtttttggttcggttggtggctgatctgatgggtggtataggcagaatgtctggctgccccttcagattcctgtagattccgtaggcgaccaacatgggtttaaacggtgggggtgggggactgtctgctctttttgatgcaaatatcttcactctccttggtgcttctgtggttgtgcctatgaatttaggaccttatgcctcatagtgttgagtcagagcaaaacagtttacatcaaaggccacttatttaattttcctcagaaaactctgtgaggataatttctccttcttataaacggaatgcgaatgtgtacacaaatgtgtacattatcccaccgaagggtgatgctctttacttttataatctagattttaaaaaatttggtggcacttgatttcaggtcctcagactccagaatttatactcactgattagtaatgcattatgcaaataattcagtttacatatccaaatactgttttgcatcattcacacctcatgtcttgaaaaaaaaagtgaaatgtttcctcaaaataaacaaaacctgcagaagagtttattgtaagggtgaaaattaaagaggaacccatttgcctgggaacttttgaggaaaattttaatactcctgcataaataattttgcaattatttttgattcctacctaatcaatataccttgccacgcaaggtatattctattatctttggctttctgaatttttcaattttcagaaaaagaagcc。

造血干/祖细胞(HSPCs)的电转化：

HSPC经过2天的培养，按每个电转反应取(1.0-1.5)x10⁶个细胞离心弃掉上清，保留细胞沉淀，按P3Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit(Lonza，V4XP-3032)准备电转液，并加入RNP，终浓度为3.1μM，如果使用ssODN或dsODN，ssODN和dsODN的终浓度分别是1.9μM和2.4μM，用配置好的电转液轻弹重悬细胞沉淀，使用DO-100程序电转(电转仪LONZA 4D-Nucleofector^TM)，电转后将电转反应器在37℃孵育5分钟，将细胞转移到新鲜的培养液中，如果使用腺相关病毒载体(AAV载体)，在电转后的15分钟内，按照1x10⁴ vg/细胞剂量加入AAV载体。

长片段PCR：

使用常规方法提取细胞基因组DNA，设计靶向位点的引物使用

GXLPremixed DNA polymerase(Takara Bio)扩增4～6kbp长度的DNA，PCR程序为98℃10秒，60℃15秒，68℃4～6分钟(按每千碱基对一分钟计算)，以上程序扩增30个循环，实施例中所涉及的基因编辑位点对应的不含二维码序列的长片段PCR引物序列如表3所示。

表3

引物名称	引物序列(5’-3’)
		EEF2-F	AAGTCTTGGGCTCCTCAGTC
EEF2-R	GACCAACCAGGCCAAGCAAA
		AAVS1-F	TGCAAACAGGAAGTGAACGG
AAVS1-R	CGACCTACTCTCTTCCGCAT
		BCL11A-1-F	GTGTGGTGTTCGGAGTCCTA
BCL11A-1-R	AGGAGCGGCAGTTTAAGTCT
		BCL11A-2-F	GCTGTGCTTTCTTCTATGATTCCTC
BCL11A-2-R	TGAAATCTCCCTTCTTTACGGTTCT

Nanopore三代测序：

用带8-12nt不相同的二维码序列的引物扩增同一个位点的多个样本，混合后按照PromethION平台的三代测序相关技术流程进行建库和测序，样本测序委托诺禾致源公司。

Nanopore测序数据分析：

测序数据经初步筛选得到质控合格的原始数据后，用Seqkit根据序列不同特点和不同样本PCR所采用的不同二维码序列进行提取得到每个样本的fastq格式文件，用Minimap2软件包进行参考序列的比对，并用Samtools和IGV进行大片段删除的分析和可视化。

Illumina测序和基因编辑效率的分析：

将长片段PCR的产物稀释100倍做为2次PCR的模板，2次PCR扩增200～250bp长度的PCR产物用于Illumina双端测序(PE150)，用带5-8nt不相同的二维码序列的引物区分不同样本，测序结果经Seqkit和Barcode-splitter软件包处理可以得到每一个样本的fsatq文件，利用CRISPResso2在线工具进行基因编辑效率或删插突变(indel)的分析，实例中所涉及的基因编辑位点对应的不含二维码序列的2次PCR引物序列如表4所示。

表4

引物名称	引物序列(5’-3’)
		EEF2-F	CAGTCTCCAGGTGTCGTCTG
EEF2-R	GTTTGACCACTGGCAGATCC
		AAVS1-F	GGCAAGGAGAGAGATGGC
AAVS1-R	GGCTCTGGTTCTGGGTACTT
		BCL11A-1-F	TCCATCACCAAGAGAGCCT
BCL11A-1-R	AGACATAACACACCAGGGTCA
		BCL11A-2-F	CACAACCACAGAAGCACCAA
BCL11A-2-R	GCTTGCACGAAAACACCGGT

实施例1

本实施例建立大片段删除的检测方法，所述检测方法流程如图1所示。

本实施例选择了4个基因编辑的位点并设计引物扩增基因编辑位点附近4～6kb的DNA序列(图2)，并用Nanopore三代测序技术进行测序，流程如图3所示，测序得到的数据用Seqkit软件包进行数据的处理，并用Minimap2软件包将数据比对到参考序列上，然后用IGV软件可视化测序结果，利用Samtools来计算删除率，计算公式为删除绝对值＝(读长深度-平均比对深度)/读长深度，由图4可知，未编辑组(野生型细胞)的删除绝对值是3.3％，这反映了测序技术本身所产生的碱基删除错误率，也称为测序背景删除率，将RNP编辑组的删除绝对值减去未编辑组的删除绝对值，得到RNP编辑组的大片段删除(Deletion index，DI)，此外，为了验证包括PCR和测序分析等在内的整个流程的可靠性，使用带不同二维码序列的PCR引物扩增相同的基因组并进行测序，然后进行关联分析，两个技术重复的结果呈显著的线性相关(R²＝0.86，图5)。

利用上述建立的基因编辑后大片段删除的检测方法，在T细胞和造血干组细胞(HSPC)中选择4个基因位点进行CRISPR-Cas9基因编辑，分别为靶向EEF2的终止密码子位置的位点、靶向基因组的安全位点AAVS1、靶向BCL11A的GATA结构域的位点(本发明中这个位点为BCL11A-1)和靶向BCL11A的其他位置的位点(称之为BCL11A-2)，将Cas9蛋白和sgRNA复合物(RNP)通过电转化导入细胞进行基因编辑，并分析基因编辑效率，基因编辑效率在不同细胞之间几乎没有差别(图6)，但在T细胞中，基因编辑位点附近有较高的大片段删除现象，HSPC次之，作为对照，在iPSC中大片段删除率较低(图7)。

为了更直观统计发生删除的长度，我们分别统计删除大于100bp，500bp，1000bp，1500bp和2000bp的读长数，利用公式：Xbp的读长比例(DX)＝删除Xbp的读长数/读长深度，即可得到删除X bp的读长比例，简称DX(X为100，500，1000，1500或2000)，结果说明大部分基因删除的长度为100～1000bp，而2000bp以上的基因删除很低(图8A和图8B)，一些研究报道将删除大于100bp以上(D100)的称之为大片段删除，经过分析发现，D100和DI呈线性相关性(图9)，后续的实施例也将采用DI和D100来评估大片段删除比例。

实施例2

本实施例验证单链寡核苷酸(ssODN)能降低基因编辑后大片段删除突变。

在T细胞和HSPC中进行RNP基因编辑后会产生大片段删除突变，为了测试ssODN介导HDR是否能降低大片段删除突变，设计了具有50bp同源臂长度并且插入6bp或18bp的ssODN(图10)，将ssODN与RNP共同转入细胞进行基因编辑，以单独转入RNP作为对照，基因编辑后进行基因编辑效率的检测，在上述4个位点进行基因编辑研究，和RNP对照比较，在T细胞中RNP加ssODN组HDR效率为38％～46％，总的基因编辑效率(Indel和HDR之和)没有显著差异(图11)，但是，在EEF2位点和AAVS1位点，添加了ssODN的基因编辑组DI分别显著降低了64％和52％，在两个BCL11A位点，虽然ssODN组没有显著降低DI，但是相比RNP组，DI值也更低(图12)。

研究ssODN在HSPC基因编辑过程中对大片段删除的影响，同样地，通过检测基因编辑效率，在HSPC中，ssODN可介导45％～57％的HDR效率，总的基因编辑效率可从60％～80％提高到80％～90％(图13)，在四个基因编辑位点里，在EEF2能使DI降低75％，在BCL11A-1位点能使DI降低53％(图14)。

如果用D100来衡量大片段删除，发现在T细胞和HSPC中，ssODN的添加分别能降低62％和59％的大片段删除比例(图15)，并且D100和DI呈线性相关(图16)，经统计分析在T细胞和HSPCs的所有数据，添加ssODN组比单独的RNP组能降低40％的DI(图37)，降低64％的D100(图38)，

综上所述，单链寡核苷酸能够有效降低基因编辑位点大片段删除突变。

实施例3

本实施例验证腺相关病毒降低基因编辑后大片段删除突变。

腺相关病毒如腺相关病毒血清型6(AAV6)可以做为HDR模板在T细胞和HSPC中介导HDR基因编辑修复，本实施例中所涉及的AAV6载体因介导HDR修复，也称为AAV6-HDR载体，使用含有600bp同源臂长度的AAV6-HDR载体来替代50bp同源臂的ssODN同源重组模板，研究AAV6介导HDR是否能降低基因编辑后的大片段删除突变，为了方便分析HDR和基因编辑效率，设计AAV6载体在AAVS1和BCL11A位点介导8bp或15bp短长度序列的HDR插入，在EEF2位点介导无启动子的mNeonGreen绿色荧光蛋白的HDR插入(图17)，细胞在进行RNP转染后，将细胞分为两份，分别加或者不加AAV6载体检测流程如图18所示，在T细胞中使用流式检测到在EEF2位点有65％的mNeonGreen的插入(图19)，在EEF2位点终止密码子位置利用HDR插入E2A-mNeonGreen绿色荧光蛋白报告基因(编辑EEF2组+AAV6-EEF2)，经流式检测有60％细胞表达mNeonGreen，做为对照，未编辑组，只加AAV载体组(未编辑组+AAV6-EEF2)，编辑AAVS1位点(编辑AAVS1组+AAV6-EEF2)或BCL11A-1位点(编辑BCL11A-1组+AAV6-EEF2)并添加AAV6-EEF2载体及编辑EEF2但不加AAV6组(编辑EEF2组)组均无细胞表达mNeonGreen，证明在EEF2是HDR介导的精确插入(图20)。在AAVS1和BCL11A位点，通过高通量测序分析得知短长度序列的HDR插入率为40％(图19)，AAV6组比不加AAV6的RNP组能显著降低DI，在3个位点降低幅度分别是81％，90％和54％(图21)，因此，AAV6可以显著降低T细胞基因编辑后的大片段删除(图21和图22)，为了更深入地研究得到AAV6降低DI更为确凿的证据，本实施例研究了AAV6剂量跟DI的关系，发现将AAV6的MOI从1000增加到10000，HDR效率稳步上升(图23)，伴随着DI从2％降低到1％(图24)。

随后分析AAV介导的HDR对HSPC基因编辑的影响，发现在HSPC中4个不同位点的HDR效率平均值为25％～64％，可见，添加AAV6对总的编辑效率无显著影响(图25)，但是，AAV6组比RNP组能显著降低DI高达90％(图26)，甚至在某些位点，如AAVS1和BCL11A-1位点DI值为负值，说明了在HSPC中进行RNP基因编辑时添加AAV6-HDR载体能降低大片段删除到一个背景水平。

将T细胞和HSPC的数据分别进行整合分析，如图37所示，将RNP编辑组设定为100％，添加AAV6-HDR载体(RNP+AAV6编辑组)可以平均降低82％DI，如图38所示，可降低78％D100，同样利用D100来评估大片段删除，添加AAV6-HDR载体能降低70％～80％的D100(图22)。

实施例4

本实施例验证双链寡核苷酸(dsODN)降低基因编辑后大片段删除突变。

本实施例设计了化学修饰的34bp长度的dsODN(图27)，并将其和RNP一起电转T细胞和HSPCs，以单独转化RNP作为对照，高通量测序结果显示dsODN能够插入双链DNA断裂位置(图28)，dsODN的插入效率(％)在不同位点和不同细胞不相同，T细胞中，在EEF2，AAVS1位点和BCL11A-2位点的dsODN插入效率(％)平均值分别是10％，14％和46％(图29)，由于dsODN的毒性，总编辑效率略微下降，但是并不具备统计学差异(图29)，此外，发现dsODN的插入能够降低大片段删除突变60％～70％(图30)，随后研究了dsODN剂量与插入效率(％)和大片段删除的关系，发现dsODN插入效率随dsODN剂量降低而降低(图31A、图31B和图31C)，虽然在不同位点的dsODN的插入效率(％)不同，但是dsODN的插入效率(％)和相对大片段删除率(Relative deletion indexes，RDI)呈现一定的线性相关性(R²＝0.51～0.76)(图32)，其中RDI＝实验组DI/对照组DI×100％，体现加入dsODN的基因编辑DI相较于未加入dsODN的基因编辑DI的倍数变化。

在HSPC中，dsODN能够实现12％～52％的插入率，并且总基因编辑效率无明显变化(图33)，和T细胞基因编辑后dsODN插入能降低大片段删除率类似，在HSPC基因编辑时，dsODN的插入能降低27％～66％的大片段删除率(图34)。

使用28bp和29bp的dsODN在T细胞中进行进一步测试(图27)，在EEF2和AAVS1位点28bp的dsODN插入率是9％～18％(图35)，能降低大片段删除比例51％～67％(图36)，同样的，29bp的dsODN在EEF2和AAVS1位点的插入率是27％～29％(图35)，能够降低大片段删除率70％(图36)。

在T细胞和HSPC基因编辑时在双链DNA断裂位置通过NHEJ途径插入一个28bp～34bp的短的寡核苷酸序列能够显著降低的大片段删除突变，如图37所示，将RNP编辑组(RNPonly)设定为100％，可以平均降低58％DI，如图38所示，可降低63％D100。

综上所述，本发明在对细胞进行CRISPR-Cas9基因编辑过程中，加入ssODN、腺相关病毒或dsODN均能有效降低基因编辑位点大片段删除突变，且保证编辑效率，对于基因编辑领域具有重要意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）

<120> 一种降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变的方法

<130> 20210705

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gacctcaccc tgtggagcca caccctag 28

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gggttagggg ttagggtaac gggttaggg 29

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gtttaattga gttgtcatat gttaataacg gtat 34

<210> 4

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gcctgaaaga aggcatccct gccctggaca acttcctgga caaattgtag tactaagcgg 60

cccttcctgc agcgcctgcc gccccgggga ctcgcagcac ccacag 106

<210> 5

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cccatcctta ggcctcctcc ttcctagtct cctgatattg ggtctaaccc gaattcttag 60

gcagattcct tatctggtga cacaccccca tttcctggag ccatct 106

<210> 6

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

acggccaccg atggagaggt ctgccagtcc tcttctaccc cacccacgcc cccaccctaa 60

tcagaggcca aacccttcct ggagcctgtg ggtgtggcac aacagggtat aaaagcaact 120

gttagcttgc actagactag cttc 144

<210> 7

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gtctggctgc cccttcagat tcctgtagat tccgtaggcg accaacatgg gaattcggtg 60

ggggtggggg actgtctgct ctttttgatg caaatatctt cactct 106

<210> 8

<211> 1883

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cagcttgtgg accccctaaa tcactgaatt cccaggggag gggctctcct atccccagtg 60

tgagaagggc tctgggcctg gagctctgaa ggcctacgcc ctgggccggt agagcagccg 120

agctgtagca cagggttgtc ccaaacgagc agcggcatga ggcccatgag tggcctgcta 180

ggcccttcgt gaagtgctgg gcaccaggcc gagtgtctgg tctgcagggt gactcaggct 240

gaggaactag cctgagctcc tgacaggact ttccttctgc cctgccacct tctcgatggc 300

ccagtgagcc tctcgcttcc ctctgcaggc ttcaccgctg acctgaggtc caacacgggc 360

ggccaggcgt tcccccagtg tgtgtttgac cactggcaga tcctgcccgg agaccccttc 420

gacaacagca gccgccccag ccaggtggtg gcggagaccc gcaagcgcaa gggcctgaaa 480

gaaggcatcc ctgccctgga caacttcctg gacaaattgc agtgtactaa ttatgctctc 540

ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac ccaggtccca tggtgagcaa gggcgaggag 600

gataacatgg cctctctccc agcgacacat gagttacaca tctttggctc catcaacggt 660

gtggactttg acatggtggg tcagggcacc ggcaatccaa atgatggtta tgaggagtta 720

aacctgaagt ccaccaaggg tgacctccag ttctccccct ggattctggt ccctcatatc 780

gggtatggct tccatcagta cctgccctac cctgacggga tgtcgccttt ccaggccgcc 840

atggtagatg gctccggata ccaagtccat cgcacaatgc agtttgaaga tggtgcctcc 900

cttactgtta actaccgcta cacctacgag ggaagccaca tcaaaggaga ggcccaggtg 960

aaggggactg gtttccctgc tgacggtcct gtgatgacca actcgctgac cgctgcggac 1020

tggtgcaggt cgaagaagac ttaccccaac gacaaaacca tcatcagtac ctttaagtgg 1080

agttacacca ctggaaatgg caagcgctac cggagcactg cgcggaccac ctacaccttt 1140

gccaagccaa tggcggctaa ctatctgaag aaccagccga tgtacgtgtt ccgtaagacg 1200

gagctcaagc actccaagac cgagctcaac ttcaaggagt ggcaaaaggc ctttaccgat 1260

gtgatgggca tggacgagct gtacaagtaa cgcgtgcggc ccttcctgca gcgcctgccg 1320

ccccggggac tcgcagcacc cacagcacca cgtcctcgaa ttctcagacg acacctggag 1380

actgtcccga cacagcgacg ctcccctgag aggtttctgg ggcccgctgc gtgccatcac 1440

tcaaccataa cacttgatgc cgtttctttc aatatttatt tccagagtcc ggaggcagca 1500

gacacgccct cttagtaggg acttaatggg ccggtcgggg agggggaggc gggatgggac 1560

acccaacact ttttccattt cttcagaggg aaactcagat gtccaaacta attttaacaa 1620

acgcattaag aggtttattt gggtacatgg cccgcagtgg cttttgcccc agaaagggga 1680

aaggaacacg cgggtagatg atttctagca ggcaggaagt cctgtgcggt gtcaccatga 1740

gcacctccag ctgtactagt gccattggaa taataaattt gataaggtgg tgactctgtt 1800

ctgcattttt cacggtgtct tcgcagggga gcggggctgc ccagtactgg gctccctgga 1860

gcctagaagg ggacccgggc cct 1883

<210> 9

<211> 1259

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gggcatctct cctccctcac ccaaccccat gccgtcttca ctcgctgggt tcccttttcc 60

ttctccttct ggggcctgtg ccatctctcg tttcttagga tggccttctc cgacggatgt 120

ctcccttgcg tcccgcctcc ccttcttgta ggcctgcatc atcaccgttt ttctggacaa 180

ccccaaagta ccccgtctcc ctggctttag ccacctctcc atcctcttgc tttctttgcc 240

tggacacccc gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt tgggcagctc 300

ccctaccccc cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt catggcatct 360

tccaggggtc cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct atgtccactt 420

caggacagca tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga ccaccttata 480

ttcccagggc cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc cctccacccc 540

acagtggggc cactagggac aggattggtg acagaaaagc cccatcctta ggcctcctcc 600

ttcctagtct cctgatattg ggtctaaccc acgcgtagtt taaacttagg cagattcctt 660

atctggtgac acacccccat ttcctggagc catctctctc cttgccagaa cctctaaggt 720

ttgcttacga tggagccaga gaggatcctg ggagggagag cttggcaggg ggtgggaggg 780

aaggggggga tgcgtgacct gcccggttct cagtggccac cctgcgctac cctctcccag 840

aacctgagct gctctgacgc ggccgtctgg tgcgtttcac tgatcctggt gctgcagctt 900

ccttacactt cccaagagga gaagcagttt ggaaaaacaa aatcagaata agttggtcct 960

gagttctaac tttggctctt cacctttcta gtccccaatt tatattgttc ctccgtgcgt 1020

cagttttacc tgtgagataa ggccagtagc cagccccgtc ctggcagggc tgtggtgagg 1080

aggggggtgt ccgtgtggaa aactcccttt gtgagaatgg tgcgtcctag gtgttcacca 1140

ggtcgtggcc gcctctactc cctttctctt tctccatcct tctttcctta aagagtcccc 1200

agtgctatct gggacatatt cctccgccca gagcagggtc ccgcttccct aaggccctg 1259

<210> 10

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gggcaataca gactggttct gtgatgacaa ataactccta gctcattcct aatgatttat 60

caccaaatgt tctttcttca gctggaattt aaaatatgga ctcatccgta aaataggaat 120

aataatagta tatgcttcat agggtttgta tgaaaataaa atgagtgcgt atttgtaaag 180

ttcctagagc agagtaagtg ctccgagctt gtgaactaaa atgctgcctc ctggtattta 240

ttagttacac ctcagcagaa acaaagttat caggcccttt ccccaattcc tagtttgggt 300

cagaagaaaa gggaaaaggg agaggaaaaa ggaaaagaat atgacgtcag ggggaggcaa 360

gtcagttggg aacacagatc ctaacacagt agctggtacc tgataggtgc ctatatgtga 420

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cctggaaaac tgtaattctt ttcctgctca aagacaggca attcaatacc ccttccccca 1260

accaaaaacc ct 1272

<210> 11

<211> 979

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ggctacactt ccttttcctt tcctctccat ttcatccctt tccaaaaagt gtttagacaa 60

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Claims (10)

1.辅助核苷酸在降低细胞因基因编辑产生的大片段删除突变中的应用；

所述应用为：

向细胞中导入基因编辑元件和辅助核苷酸，进行基因编辑；

所述辅助核苷酸为能够促进基因编辑位点进行同源重组修复或非同源性末端连接修复的核苷酸；

所述辅助核苷酸为单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、质粒或腺相关病毒中的任意一种或至少两种的组合；

所述单链寡核苷酸为同源臂和插入序列，所述同源臂为与基因编辑位点同源的同源左臂和同源右臂，所述插入序列位于所述同源左臂和同源右臂之间，所述插入序列的长度为6bp或18bp；

所述双链寡核苷酸的长度为28～34bp；

所述质粒或腺相关病毒各自独立地含有同源臂，所述同源臂为与基因编辑位点同源的同源左臂和同源右臂；

所述质粒或腺相关病毒中的同源左臂和同源右臂的长度各自独立地为300～1200bp；

所述腺相关病毒为腺相关病毒血清型6。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单链寡核苷酸中同源左臂和同源右臂的长度各自独立地为40～60bp。

3.根据权利要求1所述的应用，所述双链寡核苷酸为SEQ ID NO.1～3任一项所示的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述质粒为同源重组修复双切模板质粒。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编辑元件为Cas9蛋白与sgRNA的复合物、表达Cas9的mRNA和/或sgRNA、表达Cas9和/或sgRNA的载体中的任意一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述表达Cas9和/或sgRNA的载体为表达Cas9和/或sgRNA的逆转录病毒或慢病毒载体。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单链寡核苷酸的5’端和3’端为分别经过硫代磷酸修饰的核苷酸。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述经过硫代磷酸修饰的核苷酸的个数为1～5个。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞为T细胞、人造血干/祖细胞、自然杀伤细胞或人诱导多能性干细胞中的任意一种。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述导入的方法为电转导、脂质体、纳米颗粒、基因枪法、显微注射法或化学诱导法中的任意一种。

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