CN116004720A - 一种针对atp7b基因p992l突变的碱基编辑拆分载体系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种针对ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统及其应用。将NGABEmax载体中的spCas9‑NG蛋白在573‑574位之间拆分得到两部分；随后将sgP992L构进NGABEmax‑DOWN中，得到sgP992L‑NGABEmax‑DOWN载体。拆分后的NGABEmax更便于运输至靶细胞内，可通过内含肽方式在靶细胞内重新组合，发挥完整的碱基编辑作用。本发明通过对ATP7B基因P992L突变位点设计gRNA，搭配拆分的NGABEmax系统实现目标基因位点碱基A→G的高效双载体修复，是针对ATP7B基因P992L突变的威尔逊病患者基因治疗研究的一种新型载体和有力手段。
Description
技术领域
本发明涉及碱基编辑基因治疗技术领域，具体涉及一种针对ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统及其应用。
背景技术
威尔逊病(Wilson Disease,WD)又称为肝豆状核变性，该病是由ATP7B基因突变引起的铜代谢障碍疾病。ATP7B基因定位于染色体13q14.3，全长80kb，包含21个外显子，其中第13外显子中的P992L突变为G·C→A·T的单碱基突变，该类型患者占中国威尔逊病患者的15.5％，属于高发突变类型，但是目前尚无彻底有效的治疗手段。近年来，碱基编辑(Baseediting,BE)技术发展迅速且日渐成熟，ABE碱基编辑器适合用于G·C→A·T突变类型的基因修复研究，使得针对WD患者点突变的基因修复治疗成为可能。
目前WD基因治疗临床应用最广泛的递送载体为AAV病毒，AAV具有免疫原性较低，基本不组合到宿主的基因组等优点，但其包装容量有所限制仅为4.7kb。碱基编辑系统加上sgRNA序列一般都会超过4.7kb，为了解决这个问题，将碱基编辑系统进行拆分，使其分别包装进AAV病毒中进行蛋白表达和特定sgRNA表达，然后两个蛋白和sgRNA组合成完整的体系行使其碱基编辑功能，修复碱基突变。
发明内容
本发明提供了一种高效治疗ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统。本发明为解决目前在利用碱基编辑载体系统基因治疗ATP7B基因P992L突变WD疾病时，碱基编辑系统过大，无法完全包装进临床应用最广泛的AAV病毒中的问题。AAV病毒的包装容量一般小于4.7kb，而目前应用的碱基编辑系统加上sgRNA普遍超过4.7kb，所以，本发明通过对NGABEmax这个碱基编辑系统进行拆分，使其分为两部分，分别包装进AAV病毒中递送至靶细胞内，在靶细胞内通过内含肽方式将其重新组合，发挥其作用，以此解决包装容量的问题。NGABEmax拆分之后NGABEmax-UP ITR中间序列长度为4.3kb，如图1中a所示。rsgP992L-NGABEmax-DOWN ITR中间序列长度为4.0kb，如图1中b所示，都未超过AAV病毒的包装限制4.7kb。故本拆分系统可以使用AAV病毒进行包装用于治疗ATP7B基因P992L突变WD疾病，为临床基因治疗ATP7B基因P992L突变提供参考。
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：一种用于治疗ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统，所述碱基编辑系统为NGABEmax，将NGABEmax系统拆分成两段氨基酸序列，拆分后的NGABEmax系统更便于运输至靶细胞内，可通过内含肽方式在靶细胞内重新组合发挥完整的碱基编辑作用，配合sgP992L实现ATP7B基因P992L突变的编辑。
一种针对ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统，所述碱基编辑系统的载体为NGABEmax，将NGABEmax载体中的spCas9-NG蛋白在573-574位氨基酸之间拆分得到NGABEmax-UP和NGABEmax-DOWN两部分；随后将sgP992L构进NGABEmax-DOWN中，得到sgP992L-NGABEmax-DOWN载体。
作为优选，所述NGABEmax-UP载体构建分为3部分：Cbh启动子由px458载体PCR扩增而得；核定位序列SV40NLS、腺嘌呤脱氨酶ABEmax和1-573位spCas9-NG-N由NGABEmax载体PCR扩增而得；内含肽inteinN和polyA序列BGHpA由pLV302载体PCR扩增而得，然后将3个片段的PCR扩增产物使用无缝克隆试剂盒，进行同源重组放进AAV的骨架得到NGABEmax-UP载体，其ITR中间序列如SEQ ID No.1所示。
作为优选，所述sgP992L-NGABEmax-DOWN载体构建分为4部分：Cbh启动子由px458载体PCR扩增而得；内含肽inteinC由pLV312.3载体PCR扩增而得；574-1368位spCas9-NG-C、核定位序列SV40NLS和polyA序列BGHpA由NGABEmax载体PCR扩增而得，将这3个片段的PCR扩增产物使用无缝克隆试剂盒，按照说明书进行同源重组放进AAV的骨架中，得到同源重组中间载体，第4部分hU6-sgP992L部分由pGL3-U6-sgP992L-PGK-puromycin9载体PCR扩增而得，经MluⅠ和XbaⅠ酶切PCR片段和同源重组载体后，T4DNA连接酶两片段，转化，挑单克隆菌株，扩大培养提质粒，而后得到sgP992L-NGABEmax-DOWN载体，ITR中间序列如SEQ ID No.2所示。
作为优选，所述碱基编辑拆分载体系统采用ABE碱基编辑的方式，通过gRNA靶向ATP7B基因P992L突变目标位点，利用整合ABE功能原件进行碱基A→G的突变，实现ATP7B基因P992L突变的编辑。
作为优选，所述P992L突变对应的gRNA长度为20碱基，PAM序列为NG，所述目标碱基A位于gRNA5’-3’的第6位。
更进一步优选，所述gRNA对应的寡核苷酸单链DNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
本发明第二方面，还提供所述碱基编辑拆分载体系统的用途，所述碱基编辑拆分载体系统能够制备用于治疗ATP7B基因P992L突变的威尔逊病药物。
本发明的有益效果是：本发明针对ATP7B基因P992L突变设计gRNA，搭配NGABEmax拆分载体使用可实现ATP7B基因P992L突变位点碱基A·T→G·C的高效修复，是针对中国高发ATP7B基因P992L突变的威尔逊病患者基因治疗研究的一种有力手段。
附图说明
图1是用于表达拆分Cas9蛋白的载体主要元件构成示意图；
图2是NGABEmax-UP表达载体图谱；
图3是sgP992L-NGABEmax-DOWN表达载体图谱；
图4是本发明中的gRNA设计示意图；
图5为验证结果的测序示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
1载体构建
NGABEmax拆分载体构建涉及到的载体有NGABEmax(#124163)、pLV302(#119943)、pLV312.3(#119944)、pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin9(#51133)和pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(#48138)
1.1pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin9质粒线性化
使用BsaⅠ酶切pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin9(#51133)载体制备线性化载体，酶切反应体系和步骤如下。
表1酶切反应体系
200μL的PCR管中配制以上反应液，用移液枪轻轻混匀，盖好盖子，瞬时离心，在37℃条件下反应3h。配置1％琼脂糖凝胶，酶切完成之后取2μL进行凝胶电泳，确定酶切成功后用胶回收试剂盒(
Quick Gel Extraction Kit)进行线性化质粒的纯化。
1.2寡核苷酸链的退火
根据spCas9-NG系统的PAM识别位点NG，设计P992L的gRNA，并由第三方公司合成gRNA对应的寡核苷酸单链DNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，线性化的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin9载体形成两个粘性末端，一端为accg，另一端为aaac，所以需要在正义链5’端添加accg，反义链5’端添加aaac，这样两条寡核苷酸链通过退火后自带两端粘性末端，与载体的粘性末端互补进行连接。sgRNA引物设计如图4所示，引物如表2所示。
表2引物序列
1.3T4DNA连接酶连接
使用全式金的T4DNA连接酶将线性pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin9(#51133)载体和退火后的sgRNA双链进行连接，连接体系如表3所示。
表3连接体系
体系配置好后在25℃下反应20分钟。连接产物转化至DH5ɑ(TSINGKE TSC-C01
5αChemically Competent Cell)感受态细胞中，培养12h后挑单克隆菌株，扩大培养提质粒，得到pGL3-U6-sgP992L-PGK-puromycin9载体，此载体中的hU6-sgP992L部分通过PCR扩增下来作为sgP992L-NGABEmax-DOWN载体的一部分。
1.4NGABEmax拆分载体构建
NGABEmax-UP载体构建分为3部分：Cbh启动子由px458载体PCR扩增而得；核定位序列SV40NLS(使蛋白运进细胞核)、腺嘌呤脱氨酶ABEmax和spCas9-NG-N(1-573位)由NGABEmax载体PCR扩增而得；内含肽inteinN(自我拼接的蛋白质元件)和polyA序列BGHpA(终止转录和添加多聚腺苷酸尾保护mRNA)由pLV302载体PCR扩增而得，PCR扩增引物如表4所示。
表4引物序列
PCR反应体系和反应程序如表5所示。
表5PCR反应体系
200μL的PCR管中配制以上反应液，用移液枪轻轻混匀，盖好盖子，瞬时离心，放进PCR仪中，使用以下程序：
配置1％的琼脂糖凝胶，PCR扩增完成后核酸电泳检测。之后将所得PCR产物使用Omega公司PCR产物纯化试剂盒(Cycle Pure Kit D6492)纯化，然后将3个片段的PCR扩增产物使用汉恒HB-infusionTM无缝克隆试剂盒，按照说明书进行同源重组放进AAV的骨架中得到NGABEmax-UP载体。如图2所示。
sgP992L-NGABEmax-DOWN载体构建分为4部分：Cbh启动子由px458载体PCR扩增而得；内含肽inteinC(自我拼接的蛋白质元件)由pLV312.3载体PCR扩增而得；spCas9-NG-C(574-1368位)、核定位序列SV40NLS(使蛋白运进细胞核)和polyA序列BGHpA(终止转录和添加多聚腺苷酸尾保护mRNA)由NGABEmax载体PCR扩增而得，将这3个片段的PCR扩增产物使用汉恒HB-infusionTM无缝克隆试剂盒，按照说明书进行同源重组放进AAV的骨架中，得到同源重组中间载体，第4部分hU6-sgP992L部分由pGL3-U6-sgP992L-PGK-puromycin9载体PCR扩增而得，经MluⅠ和XbaⅠ酶切PCR片段和同源重组载体后，T4DNA连接酶两片段，转化，挑单克隆菌株，扩大培养提质粒，酶切体系如下表6和表7所示，连接体系如表8所示，实验操作同1.1和1.3。而后得到sgP992L-NGABEmax-DOWN载体。如图3所示。同源重组PCR扩增程序和步骤和NGABEmax-UP载体构建一致，此过程中所用到扩增引物如下表9所示。
hU6-sgP992LPCR产物酶切体系：
表6酶切体系
同源重组中间载体酶切体系：
表7酶切体系
将以上两酶切产物进行连接，连接体系如下：
表8连接体系
表9引物序列
实施例2NGABEmax拆分载体的基因编辑效率检测
细胞培养及转染
细胞培养基的配置：
表10
细胞培养基的配置需在超净工作台中进行配置，为防止细菌污染，配置完成后用0.22μM的过滤器过滤除菌，封口膜封口后保存在4℃。
细胞传代
为验证P992L gRNA和NGABEmax拆分载体的有效性，本实施例在293细胞上制作了一个P992L细胞模型，其序列于病人序列一致(序列测序图谱为图5中a表示，箭头所示为ATP7B第13号外线反向序列，G突变为A)。细胞传代步骤如下：
待细胞的密度在培养皿中达到70～80％进行传代；
用移液枪弃掉培养皿中的液体，沿孔壁轻柔缓慢加入PBS冲洗细胞，重复两次，弃去PBS；
向培养皿中加入0.025％的胰酶(37℃提前预热)，放在37℃温箱孵育，在显微镜下观察到细胞分散成单个细胞时，用手轻轻拍打培养皿使细胞脱落；
向培养皿中加入适量培养基，终止消化；
将培养皿中细胞用移液枪轻轻吹打混匀，之后将细胞加入15ml离心管中，取出10μl用于计数；
将离心管置于离心机以800rpm/min的速度离心5min；
弃掉上清，加入新鲜的培养基重悬细胞；
计算出细胞的数量后按3:1的比例进行传代；
将培养皿放在37℃温箱中培养。
Xfect Transfection Reagent细胞转染
在转染前1天传代合适密度的细胞于6孔板中，转染当天细胞融合度达到50％即可；
取出Xfect Transfection Reagent试剂盒中试剂；
转染试剂配制如下：
表11
以上反应液以适中的速度震荡15s；
室温孵育10min，形成Xfect/DNA复合物；
逐滴加入细胞培养基中，柔和地前后晃动混合均匀；
加完细胞转染试剂后，37℃温箱培养细胞；
4h后换液，48h后回收细胞进行基因鉴定。
提取基因组鉴定
使用Wizard@genomic DNApurification kit试剂盒提取细胞基因组，而后对目标位点进行PCR测序鉴定ABE的编辑效率，编辑结果如图5中b所示，红色箭头所示为目标碱基，该位置的重叠峰能一定程度上代表A→G碱基编辑修复效率，由此可看出本拆分系统能有效实现目标碱基的修复。
综上所述，本发明针对ATP7B基因P992L突变设计gRNA，搭配NGABEmax拆分载体可实现ATP7B基因P992L突变位点碱基A→G的高效修复，是针对中国高发的P992L突变的威尔逊病(肝豆状核变性)患者基因治疗研究的一种有力手段。
上述实施例仅是对本发明的详细阐述，但本发明并不局限于上述实施方式，在本发明的精神和权利要求保护范围之内，对本发明做出的任何修改、替换和改变等，均在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种针对ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统，其特征在于，所述碱基编辑系统的载体为NGABEmax，将NGABEmax载体中的spCas9-NG蛋白在573-574位氨基酸之间拆分得到NGABEmax-UP和NGABEmax-DOWN两部分；随后将sgP992L构进NGABEmax-DOWN中，得到sgP992L-NGABEmax-DOWN载体。
2.根据权利要求1所述的针对ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统，其特征在于，所述NGABEmax-UP载体构建分为3部分：Cbh启动子由px458载体PCR扩增而得；核定位序列SV40NLS、腺嘌呤脱氨酶ABEmax和1-573位spCas9-NG-N由NGABEmax载体PCR扩增而得；内含肽inteinN和polyA序列BGHpA由pLV302载体PCR扩增而得，然后将3个片段的PCR扩增产物使用无缝克隆试剂盒，进行同源重组放进AAV的骨架得到NGABEmax-UP载体，ITR中间序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的针对ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统，其特征在于，所述sgP992L-NGABEmax-DOWN载体构建分为4部分：Cbh启动子由px458载体PCR扩增而得；内含肽inteinC由pLV312.3载体PCR扩增而得；574-1368位spCas9-NG-C、核定位序列SV40NLS和polyA序列BGHpA由NGABEmax载体PCR扩增而得，将这3个片段的PCR扩增产物使用无缝克隆试剂盒，按照说明书进行同源重组放进AAV的骨架中，得到同源重组中间载体，第4部分hU6-sgP992L部分由pGL3-U6-sgP992L-PGK-puromycin9载体PCR扩增而得，经MluⅠ和XbaⅠ酶切PCR片段和同源重组载体后，T4DNA连接酶两片段，转化，挑单克隆菌株，扩大培养提质粒，而后得到sgP992L-NGABEmax-DOWN载体，ITR中间序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的针对ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统，其特征在于，所述碱基编辑拆分载体系统采用ABE碱基编辑的方式，通过gRNA靶向ATP7B基因P992L突变目标位点，利用整合ABE功能原件进行碱基A→G的突变，实现ATP7B基因P992L突变的编辑。
5.根据权利要求4所述的针对ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统，其特征在于，所述P992L突变对应的gRNA长度为20碱基，PAM序列为NG，所述目标碱基A位于gRNA5’-3’的第6位。
6.根据权利要求4所述的针对ATP7B基因P992L突变的碱基编辑拆分载体系统，所述gRNA对应的寡核苷酸单链DNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，分别如SEQ ID No.3和SEQIDNo.4所示。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的碱基编辑拆分载体系统的用途，其特征在于，所述碱基编辑拆分载体系统制备用于治疗ATP7B基因P992L突变的威尔逊病药物。
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2022
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