CN104857503A - 促进造血损伤修复的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进造血损伤修复的药物组合物，包含重组人骨形态发生蛋白-2和人粒细胞刺激因子。重组人骨形态发生蛋白与粒细胞刺激因子有良好的协同作用，可以有效地促进造血损伤时造血干细胞以及脾脏和胸腺功能细胞的恢复，还可促进造血功能低下时外周血血细胞的恢复，加速骨髓移植时外周血白细胞的恢复，可以用于预防和/或治疗造血损伤的药物，还可用作外周血干细胞移植动员剂。

Description

促进造血损伤修复的药物组合物

技术领域

本发明涉及医学领域，特别涉及一种促进造血损伤修复的药物组合物，具体涉及包含重组人骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein，rhBMP-2)和人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)的组合物，用于促进造血损伤修复方面。

背景技术

近年来，全球范围内由于环境污染、化学污染、电离辐射等因素所引发的恶性肿瘤、急性放射病及各类血液病的发病率不断提高，现阶段临床上主要采用放疗和化疗手段治疗肿瘤。骨髓抑制是放化疗中最常见的毒副作用之一，但当机体受到致死剂量的射线照射或者接受相当剂量的化疗药物后，会导致造血功能严重衰竭，甚至并发感染及出血等症状，导致死亡，因此恢复和重建造血功能是造血损伤修复研究的重中之重。

机体造血重建分为两个阶段，即早期由造血祖细胞主导和晚期由造血干细胞主导的造血功能的恢复。前者用来维持和提供移植前期外周血细胞和淋巴免疫细胞，后者的作用是后期替代并维持永久性正常造血功能。因此通过相关药物干预，同时刺激造血祖细胞和造血干细胞功能的发挥，是加快造血损伤修复的关键。

造血细胞因子能够对造血干细胞的增殖和分化起到重要作用，在造血功能极度低下的状况下，应用大剂量的造血细胞因子将有利于促进或加速造血功能的恢复或成熟血细胞的生成。目前临床上主要用集落刺激因子来促进造血功能的恢复。集落刺激因子(CSFs)包括粒系集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、M-CSF等。其中GM-CSF具有促进粒细胞-巨噬细胞集落生成的作用，主要用于肿瘤放射/化疗后白细胞减少的防治、骨髓衰竭病人的白细胞减少等，其常见的不良反应有低血压、发热、恶心、水肿、胸痛和骨痛。G-CSF主要作用是促进粒细胞生成，对造血细胞的生长和分化起介导作用，具有刺激骨髓细胞增殖和成熟的生物学功能，1991年被批准用于临床治疗，与GM-CSF应用范围相似，但副作用轻；M-CSF主要功能是通过调控单个核吞噬细胞，影响其存活、增殖和分化，从而刺激造血。

集落刺激因子虽然疗效快，但价格昂贵，此外还存在一些临床问题，如使用高剂量会产生骨痛，并伴随着发热等不良反应；一些肿瘤细胞，如白血病细胞具有CSF的正常受体，用药后可能通过提高宿主残余肿瘤细胞的增殖，提高肿瘤的复发率。另外，由于CSF是直接刺激无自我更新能力的造血祖细胞的增殖，导致造血祖细胞的耗竭，不利于长期的造血功能的恢复，甚至导致骨髓储备不足，同时，由于其作用稳定性差，往往导致外周血及骨髓象中充满大量幼稚白细胞，使白细胞计数呈现成倍增长、成倍下降的现象，患者为维持正常疗程不得不反复用药。并且用集落因子动员外周血干细胞用于细胞移植时，很难在一个给药疗程获得足量的外周血干细胞用于移植，对于移植供体带来更多痛苦，同时增加了移植受体患者的危险率。

近年来研究发现多种生长因子可以促进高剂量化疗组或正常组小鼠外周血干细胞动员，或提高放化疗后骨髓有核细胞数量，恢复外周血白细胞数量，其中包括骨形态发生蛋白。骨形态发生蛋白是转化生长因子(TGF-β)超家族的成员，对胚胎骨形成及出生后骨骼发育有重要作用。其中BMP-2是最重要的成员之一，已实现了基因工程制备，并已获得FDA批准应用于临床骨组织修复。目前关于BMP-2的研究大部分集中在骨修复方面，近年来研究表明，BMP还与动物胚胎时期的造血发生关系密切。在BMP家族中，BMP-4已被证明具有促进造血的功能，并且有文献报道造血细胞因子与BMP-4合用能显著促进造血干细胞的分化。田琼等(田琼,张绍章,张发科.骨形成蛋白对造血的影响[J].中华放射医学与防护杂志,2000(2):140.)报道BMP-2对成年动物造血损伤也具有修复作用。刘昌胜等发现，rhBMP-2融合蛋白对放、化疗引起的造血损伤有有效的治疗作用，但其白细胞数的恢复速度不如粒细胞集落刺激因子快。

目前临床迫切需要能够快速，稳定地对造血损伤起修复作用且副作用低的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进造血损伤修复的药物组合物。

本发明的第一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含重组人骨形态发生蛋白-2和人粒细胞刺激因子。

在另一优选例中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述重组人骨形态发生蛋白-2的序列如SEQ ID NO 2所示。

在另一优选例中，所述人粒细胞刺激因子为重组人粒细胞刺激因子。

在另一优选例中，所述重组人骨形态发生蛋白-2和人粒细胞刺激因子的重量比为1-100：1，较佳地为10-80:1，更佳地为15-50:1，最佳为20-35:1或20-30:1。

在另一优选例中，所述药物组合物还包含GM-CSF、EPO、IL-2中的一种或两种以上的组合。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、散剂、溶液剂或酊剂。

本发明的第二方面，提供第一方面所述的药物组合物的制备方法，包括将所述重组人骨形态发生蛋白-2和人粒细胞刺激因子进行混合得到所述药物组合物的步骤。

在另一优选例中，在混合步骤中还包括加入药学上可接受的载体，从而得到药物组合物。

在另一优选例中，所述重组人骨形态发生蛋白-2和人粒细胞刺激因子的重量比为1-100：1，较佳地为10-80:1，更佳地为15-50:1，最佳为20-35:1或20-30:1。

本发明的第三方面，提供一种药盒，包含：

(1)第一剂，所述第一剂中含有重组人骨形态发生蛋白-2；和

(2)第二剂，所述第二剂中含有人粒细胞刺激因子。

在另一优选例中，所述第一剂还包含药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述第二剂还包含药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药盒中还包含药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述第一剂为重组人骨形态发生蛋白-2。

在另一优选例中，所述第二剂为人粒细胞刺激因子。

在另一优选例中，所述人粒细胞刺激因子为重组人粒细胞刺激因子。

本发明的第四方面，提供第一方面所述的药物组合物或第三方面的药盒的用途，用于体外促进造血祖细胞增殖和/或分化。

本发明的第五方面，提供第一方面所述的药物组合物或第三方面的药盒的用途，用于：

(1)制备预防和/或治疗白细胞减少症的药物；

(2)制备外周血干细胞移植动员剂；

(3)制备预防和/或治疗造血损伤的药物；

(4)制备防护电离辐射的药物。

在另一优选例中，所述造血损伤由化疗药物引起或由放疗射线引起，所述药物组合物或药盒在放疗或化疗之前、和/或之中、和/或之后使用。

rhBMP-2具有促进造血干细胞恢复的作用，与CSF联用后，其促进造血干细胞再生的作用更为显著。rhBMP-2与G-CSF联合使用能有效促进化疗药物或辐照放射所导致的造血功能低下的恢复。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了化疗实验各组小鼠不同时间白细胞数(WBC)数的变化。

图2显示了化疗实验各组小鼠实验开始后第10天外周血造血干细胞HSCs含量的比例的变化，从左至右依次为正常组、CTX组、BMP组、G-CSF组以及BMP+G-CSF组。

图3显示了化疗实验各组小鼠实验开始后第10天骨髓CD4⁺细胞含量比例的变化，从左至右依次为正常组、CTX组、BMP组、G-CSF组以及BMP+G-CSF组。

图4显示了化疗实验各组小鼠实验开始后第10天骨髓CD8a⁺细胞含量比例变化，从左至右依次为正常组、CTX组、BMP组、G-CSF组以及BMP+G-CSF组。

图5显示了化疗实验各组小鼠实验开始后第10天骨髓造血干细胞HSCs含量的比例的变化，从左至右依次为正常组、CTX组、BMP组、G-CSF组以及BMP+G-CSF组。

图6显示了化疗实验各组小鼠实验开始后第10天和第15天脾系数的变化，从左至右依次为正常组、CTX组、BMP组、G-CSF组以及BMP+G-CSF组。

图7显示了化疗实验各组小鼠实验开始后第10天和第15天胸腺系数的变化，从左至右依次为正常组、CTX组、BMP组、G-CSF组以及BMP+G-CSF组。

图8显示了放疗实验各组小鼠的存活率情况。

图9显示了放疗实验各组小鼠不同时间红细胞数(RBC)数的变化。

图10显示了放疗实验各组小鼠不同时间血红蛋白(HGB)的变化。

图11显示了放疗实验各组小鼠不同时间白血小板(PLT)数的变化。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现重组人骨形态发生蛋白与粒细胞刺激因子有良好的协同作用，可以有效地促进造血损伤时造血干细胞以及脾脏和胸腺功能细胞的恢复，还可促进造血功能低下时外周血血细胞的恢复，加速骨髓移植时外周血白细胞的恢复，可以用于预防和/或治疗造血损伤的药物，还可用作外周血干细胞移植动员剂。在此基础上，完成了本发明。

粒细胞刺激因子(G-CSF)

可用于本发明的G-CSF可以是任何来源，天然的，重组的G-CSF，其类似物和活性片段，以及医学上可接受的赋形剂和载体以及盐等。

特别优选重组人G-CSF，G-CSF的国产商品化产品，包括(但并不限于)：吉粒芬，赛格力，瑞血新，惠尔血，瑞白，特尔津，洁欣，泉升等或其混合物。

粒细胞刺激因子的安全有效量通常为0.1-1000μg/Kg体重，较佳的为0.2-250μg/Kg体重。

骨形态发生蛋白

本发明所用的重组人骨形态发生蛋白-2是114个氨基酸的人骨形态发生蛋白-2天然全长成熟肽，与体内的天然BMP-2的序列相同。蛋白单链分子量约13-15kD，经复性后该活性蛋白为二聚体，分子量约为25-30kD。另外，由于本发明的rhBMP-2具有与天然存在的人BMP-2相同的结构，从而避免了长期使用后可能造成的免疫原性。

本发明中优选的重组人骨形态发生蛋白-2，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示(参见CN200910045832制备)。

药物组合物

本发明的药物组合物含有以下组分：

重组人骨形态发生蛋白-2和人粒细胞刺激因子。

本发明中，骨形态发生蛋白-2与粒细胞刺激因子的质量比为1-100：1，较佳地为10-80:1，更佳地为15-50:1，最佳为20-35:1或20-30:1。

除了含有rhBMP-2外，本发明的药物组合物还可以含有任何临床上使用的应用于造血方面的药物，如GM-CSF、EPO等。

本发明的药物组合物可按制药领域已知的常规方法，如将rhBMP-2与G-CSF混合，加入适当的载体或稀释剂，如水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液等以制成可经肠胃道以外途径给药的注射剂。也可加入淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘油、脂质体、明胶、甘露醇等赋形剂或载体。

此外，本发明的药物组合物还可以含有临床上使用的应用于提高免疫方面的药物，如IL-2。

除含有上述组分外，本发明的药物组合还包含有常规的溶剂和防腐剂。对于溶液形成的药物组合物，其pH范围没有特别限制，通常为从4到8.5。

用途

rhBMP-2具有促进造血干细胞恢复的作用，而与CSF联用后，其促进造血干细胞再生的作用更为显著。体内动物实验研究显示，rhBMP-2与G-CSF联合使用能有效促进化疗药物或辐照放射所导致的造血功能低下的恢复。经腹腔注射rhBMP-2与rhG-CSF后，能促进注射化疗药物环磷酰胺和/或放射造成的小鼠骨髓有核细胞数和外周血白细胞数、红细胞、血红蛋白、血小板及造血干细胞损伤的恢复，并且与环磷酰胺或放射对照组以及rhBMP-2，rhG-CSF单独用药组相比较差异显著，表明rhBMP-2与rhG-CSF联合应用，能够加快外周血其他血项指标快速稳定地恢复。

本发明的研究表明，rhBMP-2与rhG-CSF联合是一种有效的促造血损伤修复的药物组合物，在促进化疗药物和放射所导致的造血损伤修复方面具有临床应用前景。

此外，rhBMP-2与rhG-CSF在体内通过不同途径，改善造血微环境，促进自然发生或诱导发生的骨髓抑制或损伤的造血功能恢复，并能刺激骨髓移植后的造血重建。

本发明的药物组合具有提高造血干/祖细胞的增殖活性、促进造血功能恢复，特别是促进造血干细胞再生的功能，可用于治疗放、化疗引起或自然发生的骨髓损伤造成的造血功能低下。

本发明的rhBMP-2与rhG-CSF的组合药物可通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等常规途径给药。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

基于本发明的新发现，预期可将本发明的rhBMP-2与rhG-CSF药物组合物用于治疗放、化疗引起或自然发生的骨髓损伤造成的造血功能低下，加快自体或异体骨髓移植的植入成功率，促进造血损伤修复的有效药物。具体而言，rhBMP-2与rhG-CSF的组合药物可应用于以下方面：

促进化疗药物引起造血功能低下时外周血血细胞的恢复；

促进放射损伤致造血功能低下时外周血血细胞的恢复；

促进造血损伤时造血干细胞的恢复；

促进造血损伤时脾脏和胸腺功能细胞的恢复；

促进外周血干细胞移植供者的外周血干细胞动员；

加速骨髓移植时外周血白细胞的恢复。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)与粒细胞刺激因子(G-CSF)在放疗药物所致造血损伤修复方面的协同作用

该实施例的目的是观察rhBMP-2与G-CSF对化疗药物所导致的外周血白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板减少症的治疗恢复作用方面的协同作用，从而寻找一种临床上能够快速、稳定提高针对化疗损伤的治疗药物新体系。

材料

重组人骨形态发生蛋白-2：rhBMP-2(参见CN200910045832制备，SEQ IDNO:2)；

粒细胞刺激因子：rhG-CSF，商品化的重组人粒细胞刺激因子注射液(商品名：吉粒芬)

方法

采用SPF级C57BL/6小鼠，雄性，6-8周龄，18-20g，随机分组，每组20只。

实验分组如下：

A组：正常组，连续9天腹腔注射给予PBS溶液，总注射体积为200μL/天。

B组：CTX组，连续腹腔注射给予环磷酰胺(CTX)，剂量为100mg/kg体重/天，连续给药3天后，连续6天给予PBS溶液，总注射体积为200μL/天。

C组：BMP组，在连续腹腔注射给予环磷酰胺(100mg/kg体重/天)3天后，连续6天给予rhBMP-2，剂量为50μg/鼠/天，总注射体积为200μL/天。

D组：G-CSF组，在连续腹腔注射给予环磷酰胺(100mg/kg体重/天)3天后，连续6天给予rhG-CSF，剂量为2μg/鼠/天，(约100μg/kg体重)，总注射体积为200μL/天。

E组：BMP+G-CSF组，在连续腹腔注射给予环磷酰胺(100mg/kg体重/天)3天后，连续6天同时给予rhBMP-2和rhG-CSF，rhBMP-2的剂量为50μg/鼠/天，rhG-CSF的剂量为2μg/鼠/天，(约100μg/kg)，总注射体积为200μL/天。

各组小鼠第9天后停止给药，正常饲养，并于第15天全部处死。

具体检测指标如下：

(1)各组分别于第0天(未给药时)，第3天化疗药物给药结束时到第12天连续检测外周血白细胞(WBC)数变化情况；

(2)第10天检测各组小鼠外周血造血干细胞HSCs含量；

(3)第10天检测各组小鼠外骨髓造血干细胞HSCs及造血干细胞C-kit+及Sca-1+亚群含量；

(4)第10天检测各组小鼠外骨髓造CD4⁺淋巴细胞含量；

(5)第10天检测各组小鼠外骨髓CD8a⁺淋巴细胞含量；

(6)第10天检测各组小鼠脾脏系数；

(7)第10天检测各组小鼠胸腺系数；

统计学处理

各项数据均以表示，实验数据经方差齐性检验后，采用方差分析或t检验。

结果：

表1显示自实验开始第10天，各组小鼠骨髓中造血干细胞亚群C-kit⁺及Sca-1⁺亚群含量的变化情况。

表1造血干细胞亚群C-kit⁺及Sca-1⁺亚群含量变化

分组	C-kit+(％)	Sca-1+(％)
			Normal对照组	0.136±0.054	0.355±0.067
CTX对照组	0.109±0.016	0.135±0.019
			rhBMP-2给药组	0.125±0.082	0.215±0.045
rhG-CSF给药组	0.114±0.022	0.188±0.046
			rhBMP-2+rhG-CSF给药组	0.134±0.002	0.322±0.111

由表1可以看出，小鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX)后，骨髓造血干细胞亚群C-kit⁺及Sca-1⁺亚群含量均显著下降。通过单独干预rhBMP-2和rhG-CSF后，可以看出C-kit⁺及Sca-1⁺亚群含量均有一定的回升，且rhBMP-2组的效果要优于rhG-CSF组对造血干细胞含量的影响。而同时干预rhBMP-2和rhG-CSF联合给药组，与正常对照组相比较，其造血干细胞亚群C-kit⁺及Sca-1⁺亚群含量接近正常组的90％以上，具有非常显著的促进造血干细胞数量恢复的作用。

由图1可以看出，对于化疗所导致的外周血白细胞数量的显著下降，干预各组药物2天后均出现回升趋势，且联合rhBMP-2与CSF给药组在给药3天后恢复至正常值，其后白细胞值继续迅速升高，高至正常值的3倍左右，其后在给药4天后开始下降，在6天给药结束后恢复至正常水平。

相较于单独给药组，联合rhBMP-2与CSF给药组在白细胞恢复作用方面显著快于CSF单独给药组，而单独rhBMP-2给药组则显示出较缓慢恢复的趋势。同时可以看出各给药组效果均明显优于CTX对照组的效果。由此可见联合使用rhBMP-2和CSF可以快速治疗化疗造成的外周血白细胞数量降低情况。

图2显示了化疗实验各组小鼠实验开始后第10天外周血造血干细胞HSCs含量的比例的变化。实验第10天，正常对照组外周血造血干细胞LSK含量为0.355％，CTX对照组0.234％，单独BMP组0.288％，单独CSF组0.240％，BMP和CSF联合治疗组0.368％。CTX化疗对照组、单独CSF治疗组外周血造血干细胞含量都显著低于正常组，单独BMP治疗组外周血造血干细胞有效恢复到正常值的80％左右，BMP和CSF联合用药组在第10天已经恢复到正常水平。结果表明，单独CSF无促进造血干细胞恢复的作用，单独给予BMP-2对造血干细胞的作用效果优于单独CSF作用，而BMP和CSF联合给药治疗，能够显著促进外周血造血干细胞的恢复，说明二者联用在促进外周血造血干细胞恢复作用中表现出协同效果。

图3和图4显示了化疗实验开始后第10天各组小鼠骨髓中CD4⁺细胞和CD8a⁺成熟T淋巴细胞的含量比例变化。可以看出，相对于CTX对照组，各给药组均起到恢复淋巴细胞，提升机体免疫机能作用。而且联合给药组促进作用最显著，显示出rhBMP-2与CSF的协同作用。

图5显示了化疗实验开始后第10天各组小鼠骨髓造血干细胞HSCs含量的比例的变化。实验第10天，正常对照组骨髓造血干细胞LSK含量为0.202％，CTX对照组0.072％，单独BMP组0.131％，单独CSF组0.081％，BMP和CSF联合治疗组0.195％。CTX化疗对照组、单独CSF治疗组骨髓LSK含量都显著低于正常组，第10天单独BMP治疗组骨髓造血干细胞有效恢复到正常值的65％左右，BMP和CSF联合用药组在第10天已经恢复到正常值的97％，基本达到正常水平。结果表明，单独CSF对于骨髓造血干细胞无恢复作用，单独BMP-2对于骨髓造血干细胞的恢复作用优于单独CSF，而BMP和CSF联合给药治疗，能够显著促进骨髓造血干细胞的恢复，并且高于单独BMP-2的恢复情况，表明二者联用在促进骨髓干细胞恢复作用中表现出有协同效果。

由图2和图5可见，联合BMP和CSF治疗，能够显著提高外周血和骨髓造血干细胞的含量，进而促进机体造血功能的改善和有助于造血损伤的修复。

图6显示了化疗实验开始后第10天和第15天各组小鼠脾系数的变化。在第10天，各实验组表现出较严重的脾脏肿大现象，提示脾脏功能严重亢进以及出现血液病状况，此阶段骨髓造血功能受到一定抑制，脾脏为恢复其造血功能，机体出现不同程度的髓外造血所导致的脾脏肿大现象，且脾脏造血功能越活跃，其肿大情况越突出。由图6可以看出，联合给药组脾脏造血功能最为活跃。同时可以看出在实验第15天，各组恢复正常状况和水平，脾系数均恢复至正常状态。

图7显示了化疗实验开始后第10天和第15天各组小鼠胸腺系数的变化。第10天各组均表现出显著的免疫抑制现象，胸腺系数越低，其抑制作用越严重，由图可以看出联合干预rhBMP-2和CSF组能有有效减缓免疫抑制现象，在整个恢复阶段对免疫机能的恢复作用均显著优于CTX对照组及单独给药。

综上分析可以发现，联合干预rhBMP-2和CSF对化疗所致的造血功能损伤，能够显著加速外周血血象恢复，对外周血及骨髓造血干细胞能起到动员保护及促增殖作用，同时可以有效地动员脾脏造血功能和降低机体免疫抑制作用。rhBMP-2与CSF在对化疗造血损伤修复方面表现出良好的协同作用，提示其是一种非常有效的组合药物，可用于造血损伤治疗。

实施例2

重组人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)与粒细胞刺激因子(G-CSF)在放疗射线所致造血损伤修复方面的协同作用

该实施例的目的是观察rhBMP-2与G-CSF对放疗射线所导致的红细胞、血红蛋白、血小板减少症的治疗恢复作用方面的协同作用。

材料

重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)

粒细胞刺激因子：商品化的重组人粒细胞刺激因子注射液(商品名吉粒芬)

方法

采用SPF级C57BL/6小鼠，雄性，6-8周龄，18-20g，随机分组，每组20只。

实验分组如下：

各组小鼠除正常对照组外，一次性全身辐照X射线，总剂量6.0Gy，剂量率1.09Gy/min，辐照时间5min 30s，建立急性放射致造血损伤模型。

A组：正常对照组，辐照后，连续6天腹腔注射给予PBS溶液，总注射体积为200μL/天。

B组：放疗X-ray对照组，辐照后，连续6天给予PBS溶液，总注射体积为200μL/天。

C组：rhBMP-2给药组，辐照后，连续6天给予rhBMP-2，剂量为50μg/鼠/天，总注射体积为200μL/天。

D组：rhG-CSF给药组，辐照后，连续6天给予rhG-CSF，剂量为100mg/kg体重，总注射体积为200μL/天。

E组：rhBMP-2与rhG-CSF联合给药组，辐照后，连续6天同时给予rhBMP-2(剂量为50μg/鼠/天)和rhG-CSF(剂量为2μg/鼠/天)，总注射体积为200μL/天。

各组小鼠第7天开始均正常喂食饲养，于第30天全部处死。

具体检测指标如下：

1各组从实验开始连续一个月检测各组存活率变化情况。

2各组分别于第0天(未辐照时)，及辐照后第1天开始每三天眼眶取血检测外周血红细胞(RBC)数；

3各组分别于第0天(未辐照时)，及辐照后第1天开始每三天眼眶取血连续检测外周血血红蛋白含量(HGB)；

4各组分别于第0天(未辐照时)，及辐照后第1天开始每三天眼眶取血连续检测外周血血小板(PLT)数；

统计学处理

各项数据均以表示，实验数据经方差齐性检验后，采用方差分析或t检验。

结果：

图8显示了放疗实验各组小鼠实验开始后存活率的变化。由图可以看出，对于重度放射射线损伤30天的存活率状况，放疗对照组存活率仅有70％，CSF单独给药组75％，rhBMP-2单独给药组80％，联合rhBMP-2和CSF给药组100％，联合给药组显著提高了放疗损伤的存活状况，且优于单独给药组。

图9和图10显示了放疗实验各组小鼠不同时间红细胞数(RBC)数和血红蛋白(HGB)含量的变化。由图可以发现联合rhBMP-2和CSF给药组可以显著降低外周血红细胞和血红蛋白损伤程度，经过三天左右即可恢复至正常水平，其恢复速度显著快于单独给药组。

图11显示了放疗实验各组小鼠不同时间白血小板(PLT)数的变化，可以发现在恢复阶段，联合rhBMP-2和CSF给药组作用明显快于其余对照组和单独给药组，提示其具有有效的促进造血损伤修复作用。

综上可以发现，在重度放疗所致的造血损伤修复过程中，联合干预rhBMP-2和CSF进行治疗，rhBMP-2和CSF显示出明显的协同作用，能够显著提高实验小鼠的存活率状况，并能够加速外周各项血项指标的快速回复，是一种有效的治疗放疗造成的造血损伤的药物组合。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含重组人骨形态发生蛋白-2和人粒细胞刺激因子。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组人骨形态发生蛋白-2的序列如SEQ ID NO 2所示。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组人骨形态发生蛋白-2和人粒细胞刺激因子的重量比为1-100：1，较佳地为10-80:1，更佳地为15-50:1。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含GM-CSF、EPO、IL-2中的一种或两种以上的组合。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、散剂、溶液剂或酊剂。

6.如权利要求1所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将所述重组人骨形态发生蛋白-2和人粒细胞刺激因子进行混合得到所述药物组合物的步骤。

7.一种药盒，其特征在于，所述药盒包含：

(1)第一剂，所述第一剂中含有重组人骨形态发生蛋白-2；和

(2)第二剂，所述第二剂中含有人粒细胞刺激因子。

8.如权利要求1所述的药物组合物或权利要求7所述的药盒的用途，其特征在于，用于体外促进造血祖细胞增殖和/或分化。

9.如权利要求1所述的药物组合物或权利要求7所述的药盒的用途，其特征在于，用于：

(1)制备预防和/或治疗白细胞减少症的药物；

(2)制备外周血干细胞移植动员剂；

(3)制备预防和/或治疗造血损伤的药物；

(4)制备防护电离辐射的药物。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述造血损伤由化疗药物引起或由放疗射线引起，所述药物组合物或药盒在放疗或化疗之前、和/或之中、和/或之后使用。