KR20180092951A - 줄기세포로부터 t-세포를 생산하는 방법 및 상기 t-세포를 이용한 면역치료 방법 - Google Patents

줄기세포로부터 t-세포를 생산하는 방법 및 상기 t-세포를 이용한 면역치료 방법 Download PDF

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크리스토퍼 에스. 시트
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Abstract

본 발명은 T 세포의 생산을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 조작된 T 세포를 이용한 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 양태의 방법은 기질세포 및 조혈모세포 또는 조혈전구세포를 포함하는 3차원 세포 배양 조성물을 T 세포를 생산하기 위한 무 혈청 배지에서 제조하는 단계를 포함한다.

Description

줄기세포로부터 T-세포를 생산하는 방법 및 상기 T-세포를 이용한 면역치료 방법
본 출원은 2015년 10월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/248,931호, 2015년 12월 9일자로 출원된 미국 가출원 제62/265,204호 및 2016년 7월 7일자로 출원된 미국 가출원 제62/359,456호의 우선권을 주장한다. 상기 언급된 각각의 개시물의 전체 내용은 여기에 구체적으로 포함된다.
본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)의 허가번호 HL066992에 따른 정부 지원으로 이루어졌으며, 정부는 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.
본 발명은 일반적으로 세포 배양 및 개발 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 줄기세포 또는 전구세포로부터 T 세포를 생산하는 것과 관련이 있다.
현재 조작된 T 세포 치료법(TCR-조작 방법 및 CAR-T 방법을 포함)은 자가 말초 혈액 T 세포를 유전적으로 변형시키는 것에 의존한다(즉, 유전적 변형을 위한 T 세포는 수혜자와 동일한 환자로부터 분리된다). 수혜자에게 공여자의 T 세포가 이식 될 때, 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD)으로 알려진 수혜 환자에서 조직 손상 증후군을 일으킬 수 있는 동종(비자가) 공여자 T 세포의 동종이식편반응성(alloreactivity) 때문에 자가 조직유래 접근법이 필요하다. 그러나 환자-특이적 자가 조작 T 세포 치료법의 사용은 현재 후기 임상 시험중인 자가 세포 치료법의 상업화를 급속하게 추진하고 있음에도 불구하고, 극도로 노동력이 많이 드는 동시에 비용이 많이 소요되며 확장성이 불확실하다. 게다가, 정상적인 T 세포를 적절하게 채취할 수 없는 환자(예: 림프구감소증 환자) 또는 T 세포 기능이 손상된 환자(예: HIV/AIDS 환자, 나이 관련 면역 결핍이 발생한 노인 환자)에서는 자가 조작 T 세포 치료법의 사용이 배제되거나, 그 효능이 감소된다. 이러한 많은 단점에도 불구하고, 비-동종반응성 T 세포, 기성품을 조작한 T 세포 치료법을 만드는 것은 입양 세포 치료 분야에서 상업적인 니즈가 충분한 분야이다.
본 발명은 조작된 T 세포를 생성하는 방법 및 결과물로 나온 T 세포 조성물에 관한 것이다. 일 실시 양태에서, T 세포는 동종반응성이 없으며(non-alloreactive) 외인성 TCR 및/또는 CAR를 발현한다. 이러한 T 세포는 "기성 제품" T 세포 치료에 유용하며 환자 자신의 T 세포를 사용할 필요가 없다. 따라서, 현재의 방법은 비용-효율적이고 노동이 덜 들어가는 T 세포 면역 요법을 제공한다. 또한, 이들 T 세포를 이용한 면역 치료법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 배아 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 조혈모세포 또는 조혈전구세포, 또는 본원에 기술되고 당 업계에 공지된 줄기 또는 전구세포와 같은 덜 분화된 세포로부터 T 세포를 생산하는 새로운 3차원 세포 배양 시스템에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 상기 시스템은 무 혈청 배지를 이용하는 것을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 상기 신규한 시스템은 T 세포, 또는 보다 구체적으로, 항원-특이적 T 세포 또는 시험관 내에서(in vitro) 양성 또는 음성 선택을 겪는 T 세포를 생산하는 스트로마 세포 및 줄기 또는 전구세포를 포함하는 3차원 세포 응집체의 배양에 있어서 신경 세포 발달에 적합한 무 혈청 배지를 사용한다. 본원의 일 실시 양태에서, 3D 세포 응집체는 줄기 또는 전구세포를 T 세포로 시험관 내 분화시키기에 충분한 시간 동안 인슐린을 포함하는 무 혈청 배지에서 배양한다. 구체적으로, 상기 T 세포는 양성 선별을 겪으며, 상기 양성 선별은 특정 항원에 대해 높은 결합력(avidity)을 갖는 T 세포를 제공한다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 3차원 (3D) 세포 응집체 및 배지로 구성되는 세포 배양 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 3D 세포 응집체는 하기를 포함한다: a) 스트로마 세포의 선택적 집단; 및/또는 b) 줄기 또는 전구세포의 선택적 집단. a) 또는b)가 특정 실시예에서 배제되거나 실질적으로 배제될 수 있다는 점을 구체적으로 고려할 수 있다. 특정 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 세포, 특히 스트로마 세포는 노치 리간드(Notch ligand)를 발현시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 노치 리간드는 외인성(exogenous)이다. 구체적으로, 상기 노치 리간드는 내생성(endogenous)이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 배지는 외부로부터 첨가되는 노치 리간드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 외부로부터 첨가되는 노치 리간드는 고체 지지체에 붙어 있거나 고정되어 있을 수 있다. 예를 들어, 구체적으로, 상기 스트로마 세포는 세포에 형질주입 또는 형질도입에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 (또는 이전에 이미 도입되어 있는) 노치 리간드를 암호화하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 가진다. 특정 실시예에서, 상기 배양 조성물은 노치 리간드를 포함하지 않거나, 외부로부터 첨가되는 노치 리간드를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 용어 "노치 리간드"는 온전한(전체-서열), 부분적인(절단된형태), 또는 (conservative mutations 와 같은 하나 이상의 돌연변이를 포함하는)변형된 노치 리간드 뿐만 아니라, 적어도 하나 이상의 전체-서열 노치 리간드 활성 또는 기능을 유지하는 단편 또는 다른 종으로부터 유래한 노치 리간드를 포함한다. 또한 노치 리간드를 모방하는 펩타이드를 포함한다. 노치 리간드는 "표준 노치 리간드(canonical Notch ligand)"또는"비표준(non-canonical Notch ligand)"일 수 있다. 표준 노치 리간드는 전형적으로 델타/Serrate/LAG-2(DSL) 도메인 및 다수의 텐텀 배열된 표피생장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)-유사 반복 서열이 따라 붙는 N-말단(NT) 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 특징으로 한다. 상기 DSL 도메인은 NT 도메인 옆에 함께 있고, 델타 및 OSM-11-d유사 단백질(델타 and OSM-11-like proteins, DOS) 모티프를 포함하는 처음 두 개의 FGF 반복 서열은 일반적으로 노치에 결합하는 표준 리간드를 필요로 한다. 몇몇 표준 리간드의 세포내 도메인은 노치 신호전달과 독립적인 역할을 하는 C-말단의 PSD-95/Dlg/ZO-1-ligand(PDZL) 모티프를 포함한다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) DSL 리간드는 DOS 모티브가 없지만 노치 신호전달을 활성화시키기 위해 DOS-단독 리간드와 협력하도록 되어 있다. 예시적인 표준 노치 리간드는 델타-유사 리간드 4(델타-like ligand 4, DLL4), 델타-유사 리간드 1(델타-like ligand 1, DLL1), 재그 1(Jagged 1, JAG1), 재그 2(Jagged 2, JAG2), 델타-유사 리간드 3(델타-like ligand 3, DLL3), 및 X-델타 2(X-델타 2)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 유사한 표준 리간드의 예시는 추가적인 실시예예에서 고려된다.
비-표준 노치 리간드는 DSL 도메인(델타/Serrate/LAG-2)이 없고, 구조적으로 다양하며, 다양한 분비 단백질뿐만 아니라 인테그랄- 및 GPI- 연결 막 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 "노치 리간드 단편" 또는 "표준 노치 리간드 단편"이 언급될 때, 상기 단편은 노치와 결합하는 단편인 것으로 생각된다. 비-표준 노치 리간드의 예시로는 컨택틴-1(Contactin-1), NOV/CCN3, 컨택틴-6(Contactin-6), 페리오스틴/OSF-2(Periostin/OSF-2), DLK2/EGFL9, Pref-1/DLK1/FA1, DNER, 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), MAGP-1/MFAP2, 트롬부스폰딘-3(Thrombospondin-3), MAGP-2/MFAP5, 트롬부스폰딘-4(Thrombospondin-4) 및 네트린-1(Netrin-1)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 배지는 비타민을 더 포함한다. 구체적으로, 상기 배지는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의 다음 물질(및 이들의 어떠한 범위의 유도 물질)을 포함한다: 비오틴(biotin), DL 알파 토코페롤 아세테이트(DL 알파 tocopherol acetate), DL 알파 토코페롤(DL 알파 tocopherol), 비타민 A, 염화콜린(choline chloride), 판토텐산칼슘(calcium pantothenate), 판토텐산(pantothenic acid), 엽산(folic acid), 니코틴아미드(nicotinamide), 피리독신(pyridoxine), 리보플라빈(riboflavin), 티아민(thiamine), 이노시톨(inositol), 비타민 B12, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 염. 구체적으로, 상기 배지는 비오틴, DL 알파 토코페롤 아세테이트, DL 알파 토코페롤, 비타민 A, 염화콜린, 판토텐산칼슘, 판토텐산, 엽산, 니코틴아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 이노시톨 및 비타민 B12를 포함하거나 필수구성으로 한다. 구체적으로, 상기 비타민은 비오틴, DL 알파 토코페롤 아세테이트, DL 알파 토코페롤, 비타민 A, 또는 이들의 조합 또는 이들의 염을 포함하거나 필수구성으로 한다. 구체적으로, 상기 배지는 단백질을 더 포함한다. 구체적으로, 상기 단백질은 알부민 또는 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin), BSA의 분획, 카탈라아제, 인슐린, 트랜스페린(transferrin), 슈퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase), 또는 이들의 조합을 포함한다. 구체적으로, 상기 배지는 하나 이상의 하기 물질을 포함한다: 코르티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민, 글루타티온, L-카르니틴, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 아셀렌산나트륨(sodium selenite), 또는 트리오도-I-티로닌(triodo-I-thyronine), 또는 이들의 조합. 구체적으로, 상기 배지는 하나 이상의 하기 물질을 포함한다: B-27® 보충제(B-27® supplement), 제노-프리 B-27® 보충제(xeno-free B-27® supplement), GS21TM 보충제, 또는 이들의 조합. 구체적으로, 상기 배지는 아미노산, 단당류, 무기 이온을 포함하거나, 추가로 포함한다. 구체적으로 상기 아미노산은 아르기닌, 시스틴, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 글루타민, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신, 또는 발린, 또는 이들의 조합을 포함한다. 구체적으로, 상기 무기 이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 질소, 또는 인, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 염을 포함한다. 구체적으로, 상기 배지는 하나 이상의 하기 물질을 추가로 포함한다: 몰리브덴, 바나듐, 철, 아연, 셀레늄, 구리, 또는 망간, 또는 이들의 조합. 특정 실시예에서, 상기 배지는 여기에 개시된 하나 이상의 비타민 및/또는 하나 이상의 단백질, 및/또는 하나 이상의 하기 물질을 포함하거나 필수구성으로 한다: 코르티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민, 글루타티온, L-카르니틴, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 아셀렌산나트륨(sodium selenite), 또는 트리오도-I-티로닌(triodo-I-thyronine), B-27® 보충제(B-27® supplement), 제노-프리 B-27® 보충제(xeno-free B-27® supplement), GS21TM 보충제, 아미노산(아르기닌, 시스틴, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 글루타민, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신, 또는 발린), 단당류, 무기 이온(나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 질소, 및/또는 인) 또는 이들의 염, 및/또는 몰리브덴, 바나듐, 철, 아연, 셀레늄, 구리, 또는 망간.
본 발명의 특정 양태에서 상기 배지는 기초 배지로서, AIM V, X-VIVO-15, NeuroBasal, EGM2, TeSR, BME, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, Improved MEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle MEM, αMEM, DMEM, Ham, RPMI-1640, 및 Fischer's 배지, 및 이들의 조합 등과 같이 동물 세포를 배양하는 데 사용되는 배지를 사용하여 준비될 수 있으나, 상기 배지는 동물 세포를 배양하기 위하여 사용되는 것이라면 특별히 이에 한정되지 않는다. 특히, 상기 배지는 제노-프리(xeno-free) 또는 화학적으로 정의된 배지일 수 있다.
상기 배지는 혈청을 포함한 배지 또는 무 혈청 배지, 또는 제노-프리 배지일 수 있다. 이종 동물 유래 성분에 의한 오염을 방지하는 관점에서, 혈청은 줄기세포와 동일한 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 무 혈청 배지는 처리되지 않거나 정제되지 않은 혈청이 없는 배지를 의미하며, 따라서 정제된 혈액-유래 성분 또는 동물 조직-유래 성분(성장인자 등)이 있는 배지를 포함할 수 있다.
상기 배지는 혈청 대체물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 혈청 대체물은 바람직하게 알부민(지질이 풍부한 알부민, 소 알부민, 재조합 알부민 또는 인간화 알부민, 식물성 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해물과 같은 알부민 대체물), 트랜스페린(또는 기타 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 이들의 등가물을 포함하는 물질일 수 있다. 상기 혈청 대체물은, 예를 들어, 국제공개특허 No. 98/30679에 개시된 방법으로 제조될 수 있다(그 전체가 명세서에 포함됨). 그렇지 않으며, 보다 편리하게 상업적으로 이용 가능한 물질을 이용할 수 있다. 상기 상업적으로 이용 가능한 물질은 넉아운 혈청 대체물(knockout Serum Replacement, KSR), 화학적으로 정의된 지질 농축물(Gibco), 및 글루타맥스(Glutamax, Gibco)를 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 배지는 세포 분화에 적합한 무 혈청 배지일 수 있다. 예를 들어, 상기 배지는 B-27® 보충제, 제노-프리 B-27® 보충제(thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation.250.html에서 구매 가능), NS21 보충제(Chen et al., J Neurosci Methods, 2008 Jun 30; 171(2): 239-247, incorporated herein in its entirety), GS21TM 보충제(available at world wide web at amsbio.com/B-27.aspx), 또는 3D 세포 응집체로부터 T 세포를 생산하기에 유효한 농도로 이들을 혼합한 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 배지는 하기 중 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 비오틴; DL 알파 토코페롤 아세테이트; DL 알파 토코페롤; 비타민 A(아세테이트)와 같은 비타민; 소혈청알부민(BSA) 또는 사람 알부민, 무 지방산 프랜션 V(fatty acid free Fraction V); 카탈라아제; 인간 재조합 인슐린; 인간 트랜스페린; 슈퍼옥사이드 디스무타제와 같은 단백질; 코르티코스테론; D-갈락토오스; 에탄올아민 HCl; 글루타티온(환원형); L-카르니틴 HCl; 리놀레산; 리놀렌산; 프로게스테론; 푸트레신 2HCl; 아셀렌산나트륨; 및/또는 트리오도-I-티로닌과 같은 다른 성분.
보다 구체적으로, 상기 배지는 외부적으로 첨가되는 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함할 수 있다. 상기 배지는 또한 하나 이상의 외부적으로 첨가되는 지방산 또는 지질, 아미노산(비-필수아미노산 등), 비타민, 성장인자, 사이토카인, 항산화제, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 및/또는 무기염을 포함할 수 있다.
상기 하나 이상의 배지 성분은 적어도, 최대, 또는 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 180, 200, 250 ng/L, ng/ml, μg/ml, mg/ml, 또는 이로부터 파생가능한 범위의 농도로 첨가될 수 있다.
상기 사용된 배지에는 적어도 하나의 외부적으로 첨가되는 약 0.1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 더 바람직하게는 1 ng/mL 내지100 ng/mL, 또는 적어도, 최대, 또는 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 180, 200, 250 ng/L, ng/ml, μg/ml, mg/ml, 또는 이로부터 파생가능한 범위의 농도의 사이토카인을 보충할 수 있다. 바람직한 사이토카인은 FLT3 리간드(FLT3L), 인터루킨 7(IL-7), 줄기세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), IL-2, IL-4, IL-6, IL-15, IL-21, TNF-알파, TGF-베타, 인터페론-감마, 인터페론-람다, TSLP, 티모펜틴(thymopentin), 플레오트로핀(pleotrophin) 및/또는 미드카인(midkine)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 상기 배양 배지는 FLT3L 및 IL-7 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 더 바람직하게, 상기 배양 배지는 FLT3L 및 IL-7를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 3D 세포 응집체는, 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 라미닌, 및 피브로넥틴 및 이들의 조합, 예를 들어 MatrigelTM, 및 용해된 세포막 조제물과 같은, 정의되거나 정의되지 않은 외인성 세포외기질을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 3D 세포 응집체는 외인성 매트릭스 또는 스캐폴드를 포함하지 않을 수도 있다.
다른 배양 조건이 바람직하게 정의될 수 있다. 예를 들어 상기 배양 온도는 20 내지 40℃일 수 있고, 예를 들어 적어도, 최대, 또는 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40℃ (또는 이로부터 파생가능한 범위)일 수 있으나, 상기 온도는 이 범위보다 높거나 낮을 수도 있다. CO2 농도는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10% (또는 이로부터 파생가능한 범위)일 수 있고, 예를 들어 약 2% 내지 10%, 예를 들어 약 2 내지 5%, 또는 이로부터 파생가능한 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도 또는 약 1, 5, 8, 10, 20%, 또는 이로부터 파생가능한 범위일 수 있다.
상기 기질세포와 줄기 또는 정구세포는 어떠한 비율로도 존재할 수 있으며, 예를 들어 약 100:1, 80:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 및/또는 1:100, 또는 이로부터 파생가능한 범위일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 스트로마 세포는 쥐의 스트로마 세포주, 인간 스트로마 세포주, 1차 스트로마 세포의 선택된 집단, 시험관 내(in vitro)에서 다능성 줄기세포로부터 분화된 스트로마 세포의 선택된 집단, 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 스트로마 세포는 상기한 방법의 출발 물질로 사용된 줄기 또는 전구세포와 동일한 집단으로부터 분화된 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 스트로마 세포는 인간 세포로부터 분화된 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 스트로마 세포는 인간 다능성 줄기세포로부터 분화된 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 스트로마 세포는 인단 또는 비-인간 HSPC 또는 PSC 세포로부터 분화된 것이다.
보다 구체적으로, 상기 스트로마 세포 또는 이의 전구체는 유전적으로 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, 스트로마 세포는 외인성 인간 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)를 발현시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 스트로마 세포는 외인성 항원-특이적 보조자극 분자, 사이토카인, 항원, 또는 세포외기질 단백질, 또는 T 세포 분화, 증식 또는 기능을 조절하는 생리활성 분자 또는 유전자와 같은 어떠한 T 세포 조절자도 발현시킬 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 스트로마 세포(또는 전구체)는 항원 또는 HLA 분자를 발현하도록 조작된 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포 응집체는 종양 세포 또는 종양 항원을 포함하거나 추가로 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포 응집체는 외인성 주조직 적합성 복합체(MHC)를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 MHC는 인간의 MHC이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포 응집체는 외인성 항원-특이적 보조자극 분자, 사이토카인, 항원 또는 세포외기질 단백질, 또는 T 세포 분화, 증식 또는 기능을 조절하는 생리활성 분자 또는 유전자와 같은 어떠한 T 세포 조절자도 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 스트로마 세포(또는 전구체)는 항원 또는 HLA 분자를 발현하도록 조작된 것이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 줄기 또는 전구세포는 배아줄기세포, 조혈모세포 또는 조혈전구세포, 골수, 재대혈, 말초혈액, 흉선에서 분리한 세포 중에서 선택되거나, 또는 실험실 내(in vitro)에서 배아줄기세포(ESCs) 또는 유도 다능성 줄기세포(iPSC)로부터 분화된 세포일 수 있다. 1차조직 또는 ESC 또는 iPSC로부터 나온 줄기 또는 전구세포는 인간 또는 비-인간 동물(예, 마우스)에서 유래한 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 줄기 또는 전구세포는 유전적으로 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 줄기 또는 전구세포는 외인성 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 또는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR), 또는 둘 다를 발현시키는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 줄기 또는 전구세포는 외인성 불변 NKT세포(invariant natural killer T cell, iNKT)-관련 TCR를 발현시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 줄기 또는 전구세포는 외인성 항원-특이적 TCR을 발현시키거나, T 세포의 분화, 증식 또는 기능을 조절하는 유전자의 외인성 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기에 개시된 배양 조성물 또는 방법에 사용되는 줄기 또는 전구세포 또는 스트로마 세포는 사전에 동결된 세포일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 세포는 전혀 동결된 적이 없는 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 세포는 적어도, 최대, 또는 정확히 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50회 (또는 이로부터 파생가능한 범위)로 계대 배양될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 스트로마 세포, 상기 줄기 또는 전구세포 또는 이로부터 생산되는 T 세포와 같은 세포 집단은 적어도, 약, 또는 최대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 103, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105,1 x 106, or 2 x 106 세포 (또는 이로부터 파생가능한 범위)를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 줄기 또는 전구세포는 1 내지 200,000개이다.
본 발명의 일 양태는 또한 줄기 또는 전구세포로부터 T 세포의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기를 포함하는 3차원(3D) 세포 응집체를 배양하는 단계를 포함하며: (a) 노치 리간드(Notch ligand)를 발현시키는 스트로마 세포의 선택적 집단; (b) 줄기 또는 전구세포의 선택적 집단; 상기 3D 세포 응집체는 인슐린을 포함하는 무 혈청 배지에서 줄기 또는 전구세포를 T 세포로 시험관 내(in vitro) 분화시키기에 충분한 시간 동안 배양되는 것을 특징으로 한다. 상기 배양 조성물은 배양 조성물 및 배양 배지에 대한 성분으로서 본원에 기재된 임의의 실시 양태를 포함 할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 사용되는 세포는 배양 조성물에 사용하기에 적합한 것으로서 본원에 기재된 임의의 줄기 또는 전구세포 또는 스트로마 세포일 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 특정 표현형을 갖는 T 세포를 제조하기 위한 방법으로 변형될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 다음의 표현형을 갖는 T 세포를 제조하기 위한 것이다: CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 항원-특이적 T 세포, 상피내림프구 T 세포, 또는 CD45+, CD11b+, CD11b-, CD15+, CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-, CD14+, CD14-, CD11a+, CD11a-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+, CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-, CD20+, CD20-, CD24+, CD24-, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+, CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-, CD38+, 및/또는CD38- 또는 이들의 조합인 세포. 예를 들어, 상피내림프구(intraepithelial lymphocytes, IEL)는 스트로마 세포에서 동족 항원을 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 3D 세포 응집체를 형성하기 위해 줄기 또는 전구세포 및 스트로마 세포의 원심분리를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 3차원(3D) 세포 응집체를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 3D 세포 응집체는 외인성 노치 리간드를 발현시키는 스트로마 세포의 선택적 집단; 및 줄기 또는 전구세포의 선택적 집단을 포함한다. 배지 조성물의 임의의 대체물은 전술한 바와 같다.
보다 구체적으로, 상기 배양은 3D 세포 응집체를 형성하기 위한 원심분리를 포함할 수 있다. 상기 배양은 적어도, 최대, 또는 정확히 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48시간, 일 또는 주 또는 이로부터 파생가능한 범위의 시간 동안 수행될 수 있으며, 어떠한 시간 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 추가적인 구체예에서, 상기 배양은 세포 계대 배양을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 시험관 내에서 분화된 T 세포로부터 내생적으로 발현되는 TCRs을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 T 세포를 프라이밍하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 항원제시세포로 프라이밍 될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 항원제시세포는 종양 항원을 제시한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 3D 세포 응집체로부터 나온 T 세포를 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계 또는 3D 세포 응집체로부터 나온 T 세포를 추가로 분화시키는 단계를 포함하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 3D 세포 응집체로부터 나온 T 세포는 대립유전자형질배제(allelic exclusion)를 통해 내인성 TCR을 발현시키니 않는다. 다른 구체예에서, 상기 3D 세포 응집체로부터 나온 T 세포는 외인성 TCR 또는 CAR를 발현시킨다.
본 발명은 상기한 세포 배양 조성물을 배양하여 T 세포를 생산하는 단계를 포함하는 T 세포 생산 방법을 제공할 수 있다. 본 발명은 상기 전구세포는 외인성 항원-특이적 TCR 또는 CAR를 발현하는 것인 항원-특이적 T 세포를 생산하는 방법으로 추가적으로 정의될 수 있는 전술한 바와 같은 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 T 세포를 생산하는 방법을 제공하거나 상기 어떠한 배양 방법은 3D 세포 응집체로부터 T 세포를 생산할 수 있다. 본 발명의 특정 양태의 방법은 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 테트라머 또는 항-TCR 항체를 이용한 항원-특이적 T 세포, 변형된 항원을 이용한 CAR T 세포, 형광 마커를 이용한 형질도입된 T 세포, 또는 이들의 조합의 숫자를 검출하거나, 선택하거나, 이들의 수를 증가시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 상피내림프구(intraepithelial lymphocytes)는 CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, 또는 이들의 조합이다. 본 발명의 일 구체예에서, CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, 및/또는 CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa와 같은 상피내림프구는 제외된다.
본 발명은 기체에서 T 세포의 수를 증가시키는 방법 또는 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 개체에 유효량의 R 세포 또는 항원-특이적 T 세포를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 T 세포는 본 명세서에 개시된 방법으로 제조되거나 본 명세서에 개시된 T 세포이고, 예를들어 외인성 TCR을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 본원에 개시된 세포-표면 마커를 갖는다.
상기 개체는 동물, 바람직하게 마우스, 비-인간 영장류, 또는 사람일 수 있다. 보다 구체적인 양태에서, 상기 개체는 자가면역 질환, 암, 감염, 면역 결핍, 또는 이들의 조합을 가지거나 가질 위험이 있는 것으로 결정될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 3차원(3D) 세포 응집체로부터 T 세포를 생산하기에 효과적인 농도로 무 혈청 배지에서 3차원(3D) 세포 응집체를 배양하는 단계를 포함하는 자가항원과 반응하지 않는 T 세포를 생산하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 상기 3D 세포 응집체는 하기를 포함하고: (a) 외인성 노치 리간드를 발현시키는 스트로마 세포의 선택적 집단 및 (b) 줄기 또는 전구세포의 선택적 집단; 상기 (a) 또는 (b)의 하나 이상의 세포는 외인성 자가항원을 발현시키고, 상기 3D 세포 응집체는 자가항원과 반응하지 않는 T 세포를 생산하는 것이다. 보다 구체적인 양상에서, 상기 (a) 또는 (b)의 하나 이상의 세포는 외인성 자가-MHC를 발현시키거나 발현시키지 않는다.
본 발명의 일 양상은 상기 기재된 방법에 의해 만들어진 T 세포에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 T 세포는 특정 표현형, 세포 표면 마커, 또는 상기에 개시된 특징을 갖는다.
따라서, 본 발명의 일 양상은 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포 또는 T 세포 집단에 관한 것이며, 상기 T 세포는 상피내림프구 표현형을 갖는다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 TCR-이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, 또는 이들의 조합이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 CD19 CAR를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 외인성 TCR을 추가로 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 CD3+이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 항원-특이적 T 세포, 상피내림프구 T 세포, 또는 CD45+, CD11b+, CD11b-, CD15+, CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-, CD14+, CD14-, CD11a+, CD11a-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+, CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-, CD20+, CD20-, CD24+, CD24-, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+, CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-, CD38+, 또는 이들의 조합인 세포이다. 본 발명의 추가 양상은 분리된 T 세포 또는 T 세포 집단에 관한 것으로서, 상기 T 세포는 외인성 TCR 또는 CAR을 발현시키고, 상기 T 세포는 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 항원-특이적 T세포, 상피내림프구 T 세포, CD45+, CD11b+, CD11b-, CD15+, CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-, CD14+, CD14-, CD11a+, CD11a-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+, CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-, CD20+, CD20-, CD24+, CD24-, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+, CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-, CD38+, 또는 CD38- 또는 이들의 조합인 세포이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 T 세포의 집단이고 상기 T 세포의 집단은 적어도 50%의 세포가 성숙한 나이브 CD8 또는 CD4 단일 양성 세포인 것을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 T 세포는 적어도, 최대, 또는 정확히 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 성숙한 나이브 CD8 단일 양성 및/또는 CD4 단일 양성 세포 (또는 이로부터 파생가능한 범위)를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 외인성 불변 NKT세포(invariant natural killer T cell, iNKT)-관련 TCR을 발현시킨다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 줄기 또는 전구세포로부터 시험관 내에서 분화시킨 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 줄기 또는 전구세포는 배아줄기세포(ESCs), 유도 다능성 줄기세포(iPSC), 인간 중배엽 전구세포, 중배엽 전구세포, 인간 배아 중배엽 전구세포, 조혈모세포 또는 조혈전구세포, 골수에서 분리한 세포, 재대혈에서 분리한 세포, 말초혈액에서 분리한 세포, 흉선에서 분리한 세포, 또는 시험관 내(in vitro)에서 배아줄기세포(ESCs) 또는 유도 다능성 줄기세포(iPSC)로부터 분화된 세포에서 선택되는 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 내인성 TCR은 대립유전자형질배제를 통해 발현이 억제된 것이다.
본 발명의 추가적인 구체예에서, 외인성 핵산을 세포에 주입하거나 게놈 DNA를 편집하기 위하여, 유전자 편집, 상동성 재조합 또는 비-상동성 재조합, RNA-매개 유전자 전달 또는 임의의 통상적인 핵산 전달 방법과 같은 임의의 유전적 변형 조성물 또는 방법이 사용될 수 있다. 유전자 변형 방법의 비제한적인 예에는 CRISPR/CAS9, 징크핑거 뉴클레아제, 또는 TALEN 기술과 같은 유전자 편집 방법을 포함할 수 있다.
유전자 변형은 또한 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 선택 또는 스크리닝 또는 이미징을 돕는 선택가능하거나 스크리닝가능한 마커의 도입을 포함할 수 있다. 바람직하게, 생체 내 이미징 제제 또는 자살 유전자는 외인성으로 발현되거나 개시 세포 또는 자존세포에 추가될 수 있다. 추가의 양상에서, 상기 방법은 이미지-유도형 입양 세포 치료법(image-guided adoptive cell therapy)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 외인성 TCR 및/또는 CAR를 포함하는 시험관 내에서 분화된 T 세포 또는 T 세포 전구체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 TCR 및/또는 CAR를 포함하는 시험관 내에서 분화된 T 세포 또는 T 세포 전구체의 사용이 고려된다. 상기 외인성 TCR은 임의로 정의된 항원 특이성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 목적하는 수혜자에 대한 동종이식편반응(alloreactivity)이 없거나 감소된 것에 기초하여 선택된다 (예시는 특정 바이러스-특이 TCRs, 제노-특이적 TCRs, 또는 암-고환 항원-특이적 TCR을 포함한다). 외인성 TCR이 비-동종반응성인 일 실시예에서, T 세포의 분화 동안 외인성 TCR은 대립유전자형질배제라 불리는 분화 과정을 통해 내인성 TCR 위치의 재배치 및/또는 발현을 억제하고, 결과적으로 T 세포가 비-동종반응성 외인성 TCR만을 발현시켜서 비-동종반응성이 된다. 본 발명의 일 구현예에서, 외인성 TCR의 선택은 반드시 동종이식편반응이 없는 것에 기초하여 이루어질 필요는 없다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 내인성 TCR 유전자는 게놈 편집에 의해 변형되어 단백질을 발현시키지 않는다. CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 방법과 같은 유전자 편집 방법은 본 발명의 기술분야에 알려진 것이며 본 명세서에 개시하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 외인성 TCR을 발현시키는 줄기 또는 전구세포와 관련이 있고 상기 방법, 조성물, 또는 세포는 추가적으로 본원에 개시된 구체적인 사항을 포함한다. 이 경우, 상기 줄기세포 또는 전구세포는 시험관 내에서 분화될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 줄기 또는 전구세포는 CD34+ 세포이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 T 세포는 외인성 TCR 및 추가적인 항원 또는 리간드 인식 수용체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 추가적인 항원 인식 수용체는 상보성결정부-(complementarity determining region, CDR-)기반 한원 인식 수용체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함하고 상기 항원 인식 수용체는 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함하고 상기 항원 인식 수용체는 TCR-알파 및 TCR-베타로부터 발현되는 단백질을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 추가적인 항원 인식 수용체는 TCR 분자가 아닌 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 추가적인 항원 인식 수용체는 키메릭 항원 수용체 분지(CAR)이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 CAR는 종양 항원-특이적 CAR(즉, 종양 항원을 인식하는 CAR)이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 CAR는 바이러스 항원-특이적 CAR(즉, 바이러스 항원을 인식하는 CAR)이다. 본 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 T 세포 분화 동안 대립유전자형질배제를 매개하지만, 환자에게 이식하면 목적하는 항-종양 또는 항-바이러스 반응성은 CAR에 의해 매개되며, 상기 외인성 TCr은 비활성 "승객"이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 1차 항원에 특이적이고 상기 추가 항원 인식 수용체는 2차 항원에 특이적이다. 이는 추가 항원 수용체로부터 부여된 하나의 특이성과 상기 외인성 TCR로부터 부여된 하나의 특이성의 이중 특이성을 갖는 T 세포를 만든다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 1차 및 2차 항원은 환자의 암 세포에 의해 발현되는 암 세포 항원이다. 예를 들어, 임의의 환자는 알려진 암을 가지고 있거나 환자의 암의 항원이 실험적으로 결정되었을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항원은 암과 관련된 기술분야에서 알려져 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항원은 실험적으로 결정된다. 예를 들어, 세포 표면 단백질의 발현, 또는 면역원성 신생항원을 위해 임의의 환자의 암 세포를 분리하거나 분석할 수 있다. 1차 및 2차 항원이 환자의 암 세포에 의해 발현되는 암 항원일 때, 상기 T 세포는 동일한 함 세포에 대한 이중 특이성을 나타낸다. 이것은 항원 중 하나가 항원 하향조절(또는 다른 메커니즘)에 의해 소실될 때 암에 의한 면역 회피를 제한하는 이점이 있다. 대립유전자형질배제를 유도하기 위해 사용되는 상기 외인성 TCR은 따라서 기능적 항-종양 또는 항-바이러스 특이성을 부여하며, 결과적으로 이중 타겟 특이성을 갖는 T 세포를 생성한다. 일 실시예는 CAR가 종양 항원 A에 대한 특이성을 매개하고, 비-동종반응성 TCR이 종양 항원 B에 대한 특이성을 매개하는 (후자는 MHC-제한된 방법으로) 조작된 비-동종반응성 CAR-T 세포이다. 표적 세포 집단에 의해 발현되는 하나 이상의 항원을 타게팅하는 것은 효율성을 증진시키고 저항성 클론의 탈출을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 바이러스-특이적 TCR, 제노-특이적 TCR, 암 세포-특이적 TCR, 박테리아-특이적 TCR, 또는 암-고환 항원-특이적 TCR이다. 상기 외인성 TCR에 결합하는 상기 항원은 본 발명의 기술분야에 알려진 것이거나 이러한 항원을 발현시키는 세포에 대한 T 세포 반응의 분석으로부터 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기T 세포는 수혜자에 대해 동종이계(allogeneic)인 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 환자는 암을 가졌다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 개체의 암을 치료하는 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 암은 폐암, 전립선암, 난소암, 고환암, 뇌암, 피부암, 측색종, 대장암, 직장암, 위암, 식도암, 기관암, 두경부암, 췌장암, 간암, 유방암, 림프종 및 다발성 골수종을 포함하는 림프성 암, 백혈병, 뼈 또는 연조직의 육종, 자궁경부암 및 외음부 암으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 항원 투여 단계를 추가로 포함하며, 상기 항원은 정제되고, 다른 분자에 결합되었을 수 있고, 또는 세포 또는 세포-유사 비히클에 의해 제시될 수 있으며, 상기 항원은 상기 외인성 TCR에 의해 인식되는 것이다. 이것은 투여된 조작 T 세포의 생체 내 증식을 유발하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 T 세포를 환자에 투여하기 전에 활성 조성물에 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, T 세포는 하기 방법에 의해 활성화될 수 있다:
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T 세포의 활성화를 위한 키트는 또한 상업적으로 이용 가능하다. 예시의 키트는 항-비오틴 입자(예. MACSiBead 또는 DYNABEADS®) 및 인간 CD2, CD3, 및 CD28에 대한 비오틴화된 항체를 포함한다. 비오틴화된 항체로 로딩된 항-비오틴 입자는 항원-제시 세포를 모사하고 정제된 T 세포뿐만 아니라 PBMCs로부터의 휴지기 T 세포를 활성화하기 위해 사용된다. T 세포 증식은 배양 및 배양 14일차의 재활성에 의해 이루어질 수 있다. 다른 키트는 직접-접합된 항-CD3/28 마이크로비드; 다합체 항체 복합체를 포함하거나 또는 CD2와 같은 대체 T 세포를 타게팅하는 항체를 사용할 수 있다. T 세포는 또한, 예시적으로 ConA, PHA, 및 PWM과 같은 미토젠(mitogens)에 의해 활성화될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 비-동종반응성이다. 용어 "비-동종반응성"은 수혜자에세 이식되었을 때 면역반응을 일으키지 않는 단백질을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 비활성이며, 이는 임상적으로 유의미한 독성을 일으키지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 환자는 미생물 감염을 가지고 있거나 가질 위험이 있다. 특정 구체예에서, 상기 환자는 미생물 감염 검사를 받았다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 1차 및 2차 항원은 동일한 바이러스 형에 의해 발현되거나 또는 상기 바이러스 형에 감염된 세포에 의해 발현되는 바이러스 항원이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 1차 및 2차 항원은 동일한 박테리아에 의해 발현되거나 또는 상기 박테리아에 감염된 세포에서 발현되는 박테리아 세포 항원이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 1차 및 2차 항원은 동일한 미생물에 의해 발현되거나 또는 상기 미생물에 감염된 세포에 의해 발현되는 미생물 세포 항원이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 NY-ESO-1 특이적 TCR이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 환자에 항원 제시 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항원 제시 세포는 수지상세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항원 제시 세포는 인공적인 항원 제시 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항원 제시 세포는 상기 외인성 TCR 에 의해 인식되는 항원으로 로딩되어 있는 것이다. 항원 제시 세포에 항원으로 로딩하는 방법은 본 발명의 기술분야에 알려져 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항원 제시 세포는 자기 유래인 것이다. 분리된 항원 제시 세포 (치료 대상 환자로부터 분리된 것일 수 있다)는 일반적으로 IL-4 및/또는 GM-CSF와 같은 성숙 제제로 처리된다. 상기 항원 제시 세포는 따라서 항원-로드된 APCs를 생산하기 위하여 항원(예를 들어 상기 외인성 TCR에 특이적인 항원)으로 펄스될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 항원-로드된 APCs는 LPS, 인터페론 감마, TNF-α, IL-1β, IL-6 및/또는 PGE2와 같은 전-염증성 사이토카인과 함께 배양(접촉)된다. 상기 방법은 추가적으로 항원-로드된 APCs를 동결시키는 단계, 항원-로드된 APCs를 해동하는 단계, 및 항원-로드된 APCs를 환자에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 외인성 TCR은 또한 대립유전자형질배제를 지시하고 및/또는 추가적인 항원 또는 리간드 수용체에 의한 형질도입에 관계없이, 줄기 및 전구세포로부터 생성된 조작된 조절자/억제자 T 세포에 대한 항원 특이성 또는 부가 기능을 부여하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 시험관 내 분화된 T 세포는 T 조절세포 가 되도록 조작된다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 T 세포는 FOXP3의 발현을 추가적으로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 T 세포는 FOXP3를 발현시키도록 조작되거나 선택된다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 FOXP3 발현은 필수 구성요소이다. 상기 FOXP3의 발현은 T 세포에 조절 기능을 부여할 수 있다. 따라서, 상기 T 세포는 환자의 자가면역 또는 동종이식편반응을 억제하는데 유용한 억제 T 세포일 수 있다. 본 발명의 예시는 줄기 및 전구세포로 외인성 TCR을 도입하는 것일 수 있으며, 줄기 및 전구세포는 대립유전자형질 배제된 FOXP3 T 조절 세포를 생산하기 위해 조작된 것이다; 이 경우 상기 외인성 TCR은 반드시 감소된 동종이식편반응에 기초하여 선택되지 않아도 된다.
상기 서술한 방법의 임의의 실시예에서, 상기 개체는 자가면역질환, 이식편대숙주병(graft versus host disease, GVHD), 또는 이식 거부 반응을 가지고 있거나, 가질 위험이 있다. 상기 개체는 이러한 질병으로 진단 받은 사람이거나 유전 분석 또는 가족력 분석에 기초하여 이러한 질병의 소인이 있는 것으로 결정된 사람일 수 있다. 상기 개체는 또한 장기이식을 준비하거나 장기이식을 받은 사람일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 자가면역질환, GVHD, 또는 이식 거부 반응을 치료하는 방법이다.
또한 본 발명이 개시한 범위 내에서 조작된 T 세포는 상기 개시한 방법에서 설명한 것과 같다. 따라서, 본 발명의 특정 양태는 외인성 TCR을 포함하는 시험관 내에서 분화된 T 세포와 관련이 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 TCR은 바이러스-특이적 TCR, 제노-특이적 TCR, 암 세포-특이적 TCR, 박테리아-특이적 TCR, 또는 암-고환 항원-특이적 TCR이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 T 세포는 추가 항원 또는 리간드 인식 수용체를 추가로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 TCR 신호전달을 모방하는 조작된 분자이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하고 상기 항원 인식 수용체는 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하고 상기 항원 인식 수용체는 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 추가 항원 인식 수용체는TCR 분자가 아니다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 추가 항원 인식 수용체는 키메릭 항원 수용체(CAR)이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 CAR는 종양 항원-특이적 CAR이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 CAR는 바이러스-항원 특이적 CAR이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 1차 항원에 대해 특이적이고 상기 추가 항원 인식 수용체는 2차 학원에 대해 특이적이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 1차 및 2차 항원은 암의 세포에 의해 발현되는 암 세포 항원이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 1차 및 2차 항원은 바이러스 또는 상기 바이러스에 감염된 세포에 의해 발현되는 바이러스 항원이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 1차 및 2차 항원은 박테리아 세포 또는 상기 박테리아에 감염된 세포에 의해 발현되는 박테리아 세포 항원이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 NY-ESO-1 특이적 TCR이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 T 세포는 FOXP3의 발현을 추가적으로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 T 세포는 FOXP3를 발현시키기 위해 조작되거나 선택된 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 FOXP3 발현은 필수 구성요소이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포는 하기를 포함한다: CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, 자연살해 T 세포, 또는 조절 T 세포, 항원-특이적 T 세포. 본 발명의 일 구현예에서, CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ cells, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, 자연살해 T 세포, 또는 조절 T 세포, 항원-특이적 T 세포는 배제된다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포는 상기한 세포 표면 마커를 포함하거나 상기 세포는 상기한 세포 표면 마커를 발현시키지 않는 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포는 상피내림프구(intraepithelial lymphocytes, IELs)를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 상피내림프구는 CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, 또는 이들의 조합이다. 본 발명의 일 구현예에서, CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, 및/또는 CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa와 같은 상피내림프구는 제외된다.
본 발명의 추가 양상은 외인성 TCR-발현 T 세포를 가진 환자에서 상기 외인성 TCR-발현 T 세포에 제제를 전달하는 방법으로서, 항원에 결합된 제제를 환자에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항원은 상기 외인성 TCR에 의해 인식되는 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 TCR은 비활성이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 제제는 제거제이다. 예를 들어, 상기 제제는 세포 표면에서 제제-항원과 TCR의 접촉에 따라 세포를 제거하는 세포독성 제제일 수 있다. 제거제는, 예를 들어, 메토트렉세이트(methotrexate), 마이노프테린(aminopterin), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진(5-fluorouracil decarbazine); 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine, BSNU), 미토마이신(mitomycin C), 로무스틴(lomustine, CCNU), 1-메틸니트로소우레아(1-methylnitrosourea), 사이클로토스파미드(cyclothosphamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 부술판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C(mitomycin C), 시스-디클로로디아민 플라티늄 시스플라틴(cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP) cisplatin) 및 카보플라틴(파라플라틴)(carboplatin, paraplatin)과 같은 알킬화제제; 다우노마이신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin, adriamycin), 데토루비신(detorubicin), 카라미노마이신(carminomycin), 아이다루비신(idarubicin), 에피루비신(epirubicin), 미토산트론(mitoxantrone) 및 비스안트렌(bisantrene)을 포함하는 안트라사이클린계 항암제; 닥티노마이신(dactinomycin, actinomycin D), 블레오마이신(bleomycin), 칼리케아미신(calicheamicin), 미트라마이신(mithramycin), 및 안트라마이신(anthramycin. AMC)을 포함하는 항생제; 빈카알칼로이드(vinca alkaloids), 빈크리스틴(vincristine)과 빈블라스틴(vinblastine), 프클리탁셀(paclitaxel, taxol), 리신(ricin), 슈도모나스 엑소톡신(pseudomonas exotoxin), 제미타빈(gemcitabine), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 브롬화 에티듐(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 콜키신(colchicine), 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로파놀롤(propranolol), 푸로마이신(puromycin), 프로카바진(procarbazine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 아스파라기나아제(asparaginase), 코르티코스테로이드(corticosteroids), 미토테인(mytotane)(O,P'-(DDD)), 인터페론(interferons)과 같은 항유사분열제(antimytotic agents), 및 이러한 제거제들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가 제거제는 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 칼리케아미신(calicheamicin), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 미토마이신C(mitomycin C), 악티노마이신 D(actinomycin D), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 빈크리스틴(vincristine) 및 블레오마이신(bleomycin)과 같은 화학치료제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 추가적인 양태는 본 명세서에 기재된 조작된 T 세포(즉, 상기 외인성 TCR 을 발현하는 시험관 내에서 분화된 T 세포)를 시험관 내에서 선택 및 분리하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제제-TCR 발현 세포 복합체를 만들기 위해 외인성 TCR에 특이적으로 결합하는 제제를 T 세포를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계 및 상기 조성물로부터 상기 제제-TCR 발현 세포 복합체를 정제하는 단계를 포함한다. 상기 제제는 상기 외인성 TCR에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드-MHC 멀티머, 또는 상기 외인성 TCR을 특이적으로 인식하는 다른 임의의 분자일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 제제는 고체 지지체에 고정되어 있다. 상기 고체 지지체는 비드(예, 마그네틱 또는 세파로즈), 조직 배양 디시와 같은 플레이트, 커버슬립, 또는 어레이일 수 있다. 상기 고체 지지체는 또한 정제 컬럼일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 제제에 특이적으로 결합하는 2차 분자를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 2차 분자는, 예를 들어 1차 항체에 결합하는 2차 항체일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 2차 분자는 고체 지지체에 고정되어 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 조성물로부터 상기 고체 지지체 및 결합된 분자를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 분리는 고체 지지체에 결합되지 않은 분자를 세척하는 단계 및/또는 원심 분리 또는 컬럼 분리와 같은 다른 분리 기술에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 고체 지지체 및 결합된 분자를 1회 이상 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 1차 또는 2차 분자는 형광 분자에 결합된 것일 수 있고, 상기 분리는 유동세포계수법/형광-활성화 세포 분류법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 제제-TCR 발현 세포 복합체로부터 제제를 분리시키는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 다른 T 세포 마커, 예를 들어 CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CCR7/CD197, CD62L, CD27, CD28, 및 CD1a의 추가 또는 배제를 기초로 하는 TCR 발현 세포 정제 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 정제된 TCR 발현 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 정제된 TCR 발현 세포를 동결시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 추가 양태는 상기한 외인성 TCR을 발현하는 시험관 내에서 분화된 T 세포를 만드는 방법과 관련이 있고, 상기 방법은 줄기세포 또는 면역 전구세포로 외인성 TCR 또는 TCR-유도체를 이동시키는 단계; 및 상기 줄기 또는 면역 전구세포를 T 세포 또는 T세포 전구체로 분화시키는 단계를 포함한다. 상기 분화는 본 발명의 기술분야에 알려져 있는 방법 또는 본원에 개시된 분화/배양 방법에 따라 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 줄기 또는 면역 전구세포는 분화 제제와 접촉 이전, 동시에, 및/또는 접촉 후에, 동족체 MHC 및/또는 펩타이드 분자와 접촉시킨 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 줄기 또는 면역 전구세포를 T 세포로 분화시키는 단계는 줄기 또는 전구세포를 노치 리간드를 발현시키는 스트로마 세포와 공동 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 스트로마 세포는 OP9 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 노치 리간드는 델타유사체 1(Delta-like 1, Dll1)이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 노치 리간드는 본 명세서에 개시되어 있거나, 미국특허 7,795,404와 같은 본 발명의 기술분야에서 알려져 있는 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 공동 배양한 줄기 또는 전구세포 및 스트로마 세포를 Flt-3 리간드 및/또는 IL-7 및/또는 줄기세포 인자/키트 리간드 및/또는 트롬보포이에틴에 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 줄기 또는 면역 전구세포를 T 세포로 분화시키는 단계는 3차원(3D) 세포 응집체를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 3D 세포 응집체는 (a) 외인성 노치 리간드(Notch ligand)를 발현시키는 스트로마 세포의 선택적 집단; (b) 줄기 또는 전구세포의 선택적 집단을 포함하고, 상기 배양은 B-27® 보충제, 제노-프리 B-27® 보충제, GS21TM 보충제, 아스코르브산, Flt-3 리간드, IL-7, 또는 이들의 조합을 3차원(3D) 세포 응집체로부터 T 세포를 생산하기에 효과적인 농도로 포함하는 무 혈청 배지에서 배양하는 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 하기에 개시된 하나 이상의 구체예를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 T 세포 집단 또는 세포 조성물은 하기를 포함한다: CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 및/또는 항원-특이적 T 세포. 본 발명의 일 구현예에서, CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ cells, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CD1a+ cells, CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 및/또는 항원-특이적 T 세포는 배제된다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 상피내림프구는 CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, 또는 이들의 조합이다. 본 발명의 일 구현예에서, CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, 및/또는 CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa와 같은 상피내림프구는 배제된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 T 세포 집단 또는 세포 조성물은 적어도 또는 최대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100% (또는 이로부터 파생가능한 범위)의 본원에 개시된 표현형 및/또는 세포 마커를 가지는 살아 있는 세포를 포함한다. 상기 세포는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16주차 (또는 이로부터 파생가능한 범위)의 ATOs로부터 나온 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 T 세포 집단 또는 세포 조성물은 적어도 또는 최대 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9, 1:10, 1:10.5, 1:11, 1:11.5, 1:12, 1:12.5, 1:13, 1:13.5, 1:14, 1:14.5, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 또는 1:50 (또는 이로부터 파생가능한 범위)의 살아있는 세포:본원에 개시된 표현형 및/또는 세포 마커를 가지는 세포의 비율 또는 본원에 개시된 표현형 및/또는 세포 마커를 가지는 세포:살아있는 세포의 비율을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "하나(a/an)"는 하나 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서 "포함하는"와 함께 사용된 용어 "하나(a/an)"은 하나 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 명세서에서 오로지 대체제 및 "및/또는"만을 의미하는 것으로 정의되어 있지 않음에도 불구하고, 명시적으로 대제제만을 언급하거나 대체체가 상호 배타적인 경우를 제외하고는 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되었다. 본 명세서에 사용 된 "또 다른"은 적어도 2 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 논의된 하나 이상의 실시예가 청구 범위에서 구체적으로 배제 될 수 있다.
본 출원 전반에서, 용어 "약"은 값이 장치, 값을 결정하기 위해 사용된 방법, 또는 연구 대상에 존재하는 변화에 대한 고유한 오차의 변동을 포함한다는 것을 의미한다.
용오 "구성하는" 또는 "필수적으로 구성하는"은 본원 명세서의 임의의 구체예에서 "포함하는"을 대체하는 용어일 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내는 상세한 설명 및 특정 예는 본 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변화 및 변경이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한, 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 잘 알려져 있다.
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 추가적으로 본 발명의 특정 양태를 예시하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제시된 특정 실시예의 상세한 설명과 결합하여 하나 이상의 도면을 참조함으로써 더 잘 이해 될 수 있다.
도 1A-1B: 인공 흉선 오가노이드(artificial thymic organoids, ATOs)에서 제대혈(CB) CD34 + HSPCs로부터 인간 T 세포 생성. CB CD34 + HSPCs는 ATOs에서 7 주 동안 분화시켰다. (A) CD3+ T CRαβ+ T 세포의 점진적인 발달을 보여주기 위해 ATOs를 매주 분석한 결과(단핵 세포와 NK 세포를 제외시키기 위해 각각 CD14- CD56- 세포에 게이팅 됨(gated on)). (B) 성숙한 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 발달을 보여주기 위해 CD3+ TCRαβ+ 세포에 게이팅 된 ATOs를 매주 분석한 결과.
도 2A-2B: ATOs에서 제대혈 CD34+ HSPCs로부터 항원-특이적, TCR-조작된 T 세포의 생성, 및 ATOs에서의 인간 MHC 분자의 발현에 의한 양성 선별의 강화. CB CD34 + HSPCs는 HLA-A*02:01의 맥락에서 NY-ESO-1157-165에 특이적인 TCR을 암호화하는 렌티바이러스로 형질전환 되었으며, 6주 동안 ATOs에서 분화되었다. (A) TCR(HLA-A*02:01/NY-ESO-1157-165 테트라머로 검출됨), CD3, CD8, CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현에 의해 입증된 바와 같이, ATOs에서 성숙하고, 나이브하고, 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 생산되었다. 각 패널은 마지막 패널의 순차적인 게이트를 나타내었다. (B) ATO 기질세포 구획에서 HLA-A*02:01를 발현시키기 위해 변형된 ATOs에서의 양성 선별 및 성숙한 항원-특이적 T 세포 생산의 증진.
도 3A-G: ATO 시스템에서 인간 T 세포 발달의 효율성 및 재현성. (a) ATO 모델의 모식도. (b) 지정된 주(week)에 CB CD34+ CD3- HSPCs로부터 T 세포로 분화되는 역학(CD40-CD56- 세포에서 골수 및 NK 세포를 각각 배제하기 위해 게이팅 됨). (c) 두 가지 분류 체계에 근거한 ATO에서의 초기 CD34+ 흉선 T 세포 전구체 표현형의 유지(CD34+ 세포에서 (b)에 나타낸 것과 같이 게이팅 됨). (d) CB HSPCs 및 MS-5 세포(왼쪽) 또는 MS5-hDLL1 세포(예. ATO)(오른쪽)과 함께 생성된 4주차 오가노이드에서 CD3의 면역형광염색. (e) HSPC와 기질 세포 비율이 1:10 내지 1:30일 때 2-5 x 104 HSPC로 시작된 생물학적 복제 CB ATO(n = 18)의 총 세포 증식. (f) 단핵구(CD14+), NK 세포(CD56+), 또는 T 계통 세포(CD7+CD5+) 빈도(총 세포에 게이팅 됨); 및 (g) 6 주차 생물학적 복제 ATOs(n = 18)에서 T 세포 및 전구체의 빈도(CD14-CD56- 세포에 게이팅 됨).
도 4A-C: ATOs에서의 가슴샘림프구증식(thymopoiesis) 및 나이브 T 세포 발달의 개요. 12 주차 CB ATOs와 (a) 전체 CD14-CD56- 및 (b) CD3+TCRαβ+ 세포에 게이팅 된 인간 출생 후 흉선 세포 사이의 T 세포 분화 비교. (C) 12주차 ATOs 또는 흉선(CD3+TCRαβ+ 세포, CD8SP 또는 CD4SP 서브게이트 표시)에 미성숙(CD45RA-CD45RO+) 및 성숙(CD45RA+CD45RO-)한 나이브 T 세포의 생성.
도 5A-F: 다중 HSPC 소스 및 서브 세트로부터 T 세포의 생성. 6주차 ATOs에서 CD34+CD3- HSPC로 시작된 인간의 제대혈(CB), 성체 골수(BM), G-CSF 가동된 말초혈액(mobilized peripheral blood, MPB), 또는 비-가동된 말초혈액(PB)으로부터의 효과적인 T 세포 발달. (a) 전체 CD14-CD56- 세포, 및 (b) CD14-CD56-CD3+TCRαβ+ T 세포에 게이팅 되었다. (c) CD14-CD56-, 또는 (d) CD14-CD56-CD3+TCRαβ+ T 세포에 게이팅 된, 6주차 ATOs에서 CB, BM 및 MPB로부터 농축된 Lin-CD34+CD38- 조혈모세포(HSC) 농축 분획물로부터 T 세포의 분화. (e) CD14-CD56- 세포, 및 (f) CD34+ 세포에 게이팅 된, 성체 BM HSC 및 전구 서브세트(progenitor subsets)로 시작된 3주차 ATOs에서 T 세포 분화.
도 6A-E: ATO-유래 T 세포의 TCR 다양성 및 기능. (a) TCR Vβ 사용의 유동 세포 계측 분석에서 나타낸 바와 같이, CD8SP T 세포에서 7주차 ATOs(n = 5) 또는 인간 흉선(n = 4)으로부터 생리학적 TCR 다양성의 생성. (b) 12시간 동안 PMA/이오노마이신(PMA/ionomycin)으로 처리된 ATO-유래 DP, CD8SP 및 CD4SP 세포에서 인터페론 γ 및 IL-4 생성을 위한 세포 내 염색. (c) 항-CD3/CD28 및 IL-2에 대한 반응으로서 ATO-유래 CD8SP 세포의 증식(CFSE 희석) 및 활성화(CD25의 상향 조절). (d) PMA/이오노마이신에 대한 반응(vs. empty analysis chanel)으로 인터페론 γ 생산에 의해 나타난 바와 같이, 제대혈(CB), 골수(BM), 또는 가동된 말초혈액(MPB)으로부터 HSPC로 시작된 ATO에서 분리된 CD8SP 세포의 상대적인 반응, 및 (e) 항-CD3/CD28 및 IL-2에 대한 반응으로 입력 세포 수에 대한 상대적인 in vitro 증식.
도 7A-G: ATOs에서 TCR-조작된 T 세포의 분화 및 대립유전자배제(allelic exclusion). (a) TCR-형질도입(위) 또는 가짜 형질도입(아래) CB HSPC로 개시된 7주차 ATOs에서 HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165 특이적인 TCR-조작된 T 세포의 효율적인 생성. 플롯은 각 플롯 위에 표시된 순차적인 서브-게이트를 갖는 CD14-CD56- 세포에 게이팅 되었다. (b) HSPC와 기질 세포 비율이 1:20일 때 3 x 104 CB HSPC로 생성된 6주차 TCR-형질도입 ATO에서 가짜 형질도입된 ATO에 비해 총 세포 증식이 향상되었다. (c) HSPC 및 스트로마(stroma) 수를 모두 감소시킴으로써 5주차 TCR-형질도입된 ATOs에서 세포 증식의 증진. ATOs는 HSPC와 기질세포가 1:20 비율일 때 3 x 104 또는 7.5 x 103 TCR- 형질도입된 CB HSPCs로 생성되었다. (d) ATO-유래 TCR-형질도입된 CD8SP T 세포의 세포독성 프라이밍. K562 세포 또는 CD80 및 동족성 펩타이드-MHC(CD3+tetramer+CD8SP에 게이팅 된 T 세포)를 발현하는 K562 인공 APC와의 공동 배양 후 인터페론 γ 생산 및 CD107a 멤브레인 가동화. (e) 항-CD3/CD28 및 IL-2에 대한 반응으로 TCR-형질도입 또는 가짜 형질도입된 ATOs로부터 CD8SP T 세포의 세포 증식. (f) TCR-형질도입(n = 3) 또는 비-형질도입(n = 5) ATO로부터 CD8SP 세포의 TCR Vβ 다양성. Vβ 빈도는, TCR-형질도입된 ATOs(n = 3)로부터 tetramer+CD3+CD8SP 세포에 게이팅 되거나, 또는 비-형질도입된 ATOs(n = 5)로부터 CD3+CD8SP 세포에 게이팅 된 상태에서, 유동세포계수법에 의해 결정되었다. (g) TCR-형질도입된 ATOs로부터 tetramer+CD3+CD8SP 세포에서 형질도입 된 Vβ13.1 사슬에 대한 농축을 나타내는 (f)로부터의 대표적인 유동세포계수법 플롯. 비-형질도입된 ATO 또는 인간 흉선으부터 CD3+CD8SP T 세포를 비교예로 나타내었다.
도 8A-C: MHC-변형된 ATOs에서 TCR-조작된 T 세포의 향상된 양성 선택. (a) ATOs에서 조혈 및/또는 기질 "자가" MHC 발현을 모델링하는 접근법의 모식도. 조혈 HLA-A*02:01 발현은 HLA-형 공여 CB 단위체를 사용하여 이루어졌으며, 기질 발현은 MS2-hDLL1 세포에 HLA-A*02:01을 발현하는 렌티바이러스를 형질도입하여 이루어졌다. 모든 HSPCs는 HLA-A*02:01-제한된 NY-ESO-1 특이적 TCR로 형질도입되었다. (b) ATOs에서 tetramer+CD8SP T 세포의 양성 선택에 대한 기질 및 조혈 "자가" HMC 발현의 상승 효과. 세포는 CD14-CD56-에 게이팅 되었으며, 순차적인 서브게이트는 플롯 위에 표시되었다. (c) CD45RA, CD27 및 CCR7의 상향 조절, 및 CD45RO 및 CD1a의 하향 조절에 의해 나타난 바와 같이, 기질 HLA-A*02:01 발현을 갖는 ATOs에서 TCR-조작된 T 세포의 성숙한 나이브 T 세포 표현형에 대한 향상된 성숙도. 모든 플롯은 tetramer+CD3+CD8SP T 세포에 게이팅 되었다.
도 9A-B: ATO 세포 증식 및 T 세포 분화가 유입된 HSPC 수 및 HSPC:기질세포의 비율과 관련이 있다. (a) 다양한 수의 CD34+CD3-CB HSPCs 및 일정한 기질세포(MS5-hDLL1) 수, 또는 (b) 다양한 수의 HSPCs 및 기질세포로 생성된 6주차 ATOs로부터 세포 증식 및 T 세포 빈도 데이터. 최적의 총 T 세포 및 성숙한 T 세포 증식은 ATO 당 유입된 HSPC 수가 가장 낮을 때(7,500 cells)와 HSPC와 스트로마 세포의 비율이 1:20 내지 1:40일 때 나타났다.
도 10A-G: ATOs에서 T 세포 분화는 재현가능성이 높고, B27 로트(lots), 제노-프리 B27(xeno-free B27), 또는 기질 조사(irradiation)에 영향을 받지 않는다. 단일 CB 샘플에서 생성되고, 4 가지 다른 B27 보충제의 로트(A~D로 표시)와 함께 배양된 6주차 ATOs에서 (a) 총 ATO 세포 유출(output), (b) 골수세포(CD14+) 또는 NK 세포(CD56+) 분화, 또는 (c) B 세포(CD19+) 또는 T 세포 분화는 B27 로트의 변이에 의해 유의미한 영향을 받지 않는다. 각각의 B27 로트에 대한 기술적인 ATO 복제(n = 2~3)를 나타내었다. 모든 ATOs는 HSPC와 스트로마 세포의 비율이 1:20일 때 3 x 104 HSPCs로 설정됨. B27 대신에 제노-프리 B27을 넣었을 때 6주차 ATOs에서 (d) 세포 수 또는 (d) T 세포 분화에 영향을 미치지 않음. 표시된 양만큼 조사(irradiation)한 MS5-hDLL1 세포로 생성된 ATOs는 (f) CD14-CD56- 세포에 게이팅 되거나, 또는 (g) CD3+TCRαβ+ 세포에 게이팅 될 때 T 세포 분화 비교예를 나타내었다.
도 11A-C: 단일층 시스템 대비 ATO에서 향상된 양성 선택. (a) 단일층 공동배양과 비교하여 ATOs에서(즉, MS5-hDLL1를 RB27와 함께 3D 배양할 때) T 세포 양성 선택 및 성숙이 향상되었다. 6주차 단일층 배양(왼쪽)을 3D 오가노이드 배양(오른쪽)과 비교하였으며, OP9-DL1과의 교차 비교를 포함한다. OP9-DL1 단일층 공배양을 위한 표준 배지는 MEMα/20 % FCS이고, ATOs를 위한 표준 배지는 RB27이다. 또한, (DLL1으로 형질전환되지 않은) 모 MS-5 세포주를 사용한 단일층 또는 오가노이드 배양을 나타내었다. 모든 플롯은 플롯 위에 표시된 바와 같이 CD14-CD45- 세포 또는 CD3+TCRαβ+ 서브게이트에 게이팅 되었다. 6주차에 ATOs에 대한 표준 OP9-DL1 단일층 배양에서 관련 세포 집단의 (b) 백분율 및 (c) 증식 배수(fold expansion). 배양은 동일한 CB 단위를 사용하여 병렬로 개시되었고, ATOs는 HSPC와 스트로마 세포의 비율이 1:20일 때 3 x 104 HSPCs로 설정되었다.
도 12A-C: ATOs에서 가슴샘림프구증식 및 나이브 T 세포 표현형의 개요. (a) 6-10주 사이에 ATOs에서 CD3+TCRαβ+CD8SP 및 CD4SP 세포의 점진적 분화. ATOs는 같은 공여 CB HSPCs로부터 병렬 배양하고 지정된 주(week)에 순차적으로 분석하였다. 세포는 CD14-CD56-TCRαβ+CD3+에 게이팅 되었고, 플롯 위에 순차적인 서브게이트(CD8SP 또는 CD4SP)를 표시하였다. (b,c) 인간 흉선에서 대응되는 집단과 비교하여 12주차 ATO-유도 나이브 CD8SP 및 CD4SP T 세포를 특징짓는 추가 마커. 모든 세포는 CD14-CD56-CD3+TCRαβ+에 게이팅 되고, (b) CD8SP 또는 (c) CD4SP 세포에 서브게이팅 되었다.
도 13A-F: 다중 HSPC 소스 및 서브셋으로부터 T 세포의 생성. (a) 인간 재대혈(CB), 성체 골수(BM), G-CSF 가동된 말초혈액(MBP), 또는 비-가동된 말초혈약(BP) HSPCs와 달리 6주차 ATOs에서 CD34+ 세포의 유지. (b) (a)에서 나타난 바와 같이 CD34+ 세포로 게이팅 된, CD34+ T 세포 전구 서브셋의 표현형. (c) (a)에서 나타난 바와 같이 HSPC 소스를 사용한 6주차 ATOs에서 총 세포 및 관련 T 세포의 증식 배수(fold expansion). 증식 배수는 최초 HSPCs의 수와 관련이 있다. ATOs는 HSPC와 스트로마 세포의 비율이 1:20일 때 ATO 당 3 x 104 CD34+CD3- HSPCs를 사용하여 설정되었다. 서로 다른 HSPC 소스에서 나온 조혈모세포(HSC)-풍부(Lin-CD34+CD38-) 분획으로부터 개시되는 6주차 ATOs에서 (d) CD34+ 세포의 유지 및 (e) CD34+ T 세포 전구체의 표현형. (f) 정제된 BM 조혈모세포 및 조혈전구 서브셋으로 개시되는 3주차 ATOs에서 총 세포의 증식 배수. ATOs는 HSPC 와 기질 세포의 비율이 1:15 내지 1:40일 때 각 ATO마다 2-4 x 104의 집단으로 개시되었다. 결과는 HSPCs의 최초 숫자에 대한 상대적인 값이다.
도 14A-B: ARO 시스템에서 인간 T 세포의 효율성 및 재현성. (a) 6주차에 ATOs에서 세포 유형별 빈도. 위: 단핵구(CD14+), NK 세포(CD56+), B 세포(CD19+), HSPCs(CD34+), 또는 T 리니지 세포(CD7+CD5+)의 빈도(전체 살아 있는 세포에 게이팅 됨). 가운데: T 세포 전구체 및 TCR+ T 세포 빈도(CD14-CD56- 세포에 게이팅 됨). 아래: DP 및 성숙한 CD8 및 CD4 단일 양성(single positive, SP) T 세포의 빈도(CD3+TCRαβ+ 세포에 게이팅 됨). (b) 6주차의 총 세포 수 및 ATO 당 7.5~22.5 x 103 CB HSPCs로부터 생성되는 CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포. 데이터는 11개 생물학적 반복실험으로 나타내었다(에러 막대는 표준편차를 나타냄).
도 15A-D: 다중 HSPC 소스 및 서브셋으로부터 T 세포의 생성.
(a) CB, 신생아의 흉선, BM, 또는 MPB로부터 분리된 7500 CD34+CD3- 세포에서 생성된 ATOs에서 12주 동안의 T 세포 분화 역학. 각 조직마다 3회 반복 실험 후 T 세포 전구체 및 성숙한 T 세포 빈도의 평균 및 표준편차를 나타내었고 데이터는 2회 반복 실험의 대표값이다. (b) (a)에서 나타낸 ATOs로부터 나온 총 세포 및 CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포의 수. (c) 6주차에 ATOs에서 성체 BM HSPC (CD34+lin-) 및 전구체(LMPP 및 CLP) 서브셋의 T 세포 분화 가능성(게이트 나타냄). (d) (c)에서 나타낸 ATOs로부터 나온 총 세포 및 CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포의 수. 각각 3회 반복 실험 후 평균 및 표준편차를 나타내었고, 데이터는 3회 반복 실험의 대표값이다.
도 16A-F: ATO-유래 T 세포의 TCR 다양성 및 기능. (a) TCR Vβ 패밀리 발현의 빈도를 유동세포계수법으로 분석한 결과로 나타낸 바와 같이, 7주차 ATOs(n=5) 또는 인간 흉선(n=4)로부터 나온 CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포에서 TCR 다양성의 생성. (b) TCR Vβ 및 (c) TCR Vβ CDR3 부위의 심층 시퀀싱에 의한 ATOs, 흉선, 및 말초혈액(PB) 나이브 T 세포로부터 나온 CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포의 TCR 클로노타입 다양성. 개별 클로노타입의 빈도를 나타내었다. 데이터는 3회 반복 실험의 대표값이다. (d) 6시간 동안 PMA/이오노마이신 처리한 ATO-유래CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포에 의한 다기능 사이토카인의 생산. 데이터는 3회 반복 실험의 대표값이다. (e) 항-CD3/CD28 및 IL-2에 대한 반응 5일 후 ATO-유래CD3+TCRαβ+CD8SP 세포의 증식(CFSE 희석) 및 활성(CD25 및 4-1BB의 상향조절). 데이터는 2회 개별 실험의 대표값이다. (f) 7일 및 14일 후 항- CD3/CD28 및 IL-12에 대한 반응으로 시작 세포 수에 대한 ATO-유래CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포의 후기-ATO 증식. 3회 반복 실험 후 평균 및 표준편차를 나타내었고, 데이터는 3회 반복 실험의 대표값이다.
도 17A-F: ATOs에서 TCR-조작된 T 세포의 분화 및 대립유전자배제. (a) 일반적인 T 세포 발달을 나타내는 TCR-형질도입된 CB ATOs 로부터 나온CD3+TCRαβ+tetramer+ T 세포에서 CD8α 및 CD8β의 공동 발현 및 CD56 및 CD16 발현의 부족. (b) 7.5~18 x 103 시작 CB HSPCs로 생성되는, 6주 또는7주차에 TCR-형질도입 대 가짜-형질도입된 ATO에서 HSPCs 의 시작 숫자에 상대적인 총 세포 유출 및 세포 생산량의 향상. 반복 실험의 평균 및 표준편차를 나타냄(가짜 n=3, TCR n=8, **p=0.002). (c) 인공 항원제시세포(aAPCs)에 의한 ATO-유래 TCR 조작된 T 세포의 세포독성 프라이밍. CD80 및 무관한 펩타이드(MART126-35) 또는 동족 펩타이드(NY-ESO1156-165)를 제시하는 HLA-A*02:01 단일 체인 트라이머를 발현시키는 K562 세포 또는K562 aAPCs에 대한 반응으로 CD3+tetramer+CD8SP T 세포의 사이토카인 생산 및CD107a 멤브레인 가동화. 데이터는 3회 반복 실험의 대표값이다. (d) 무관한 aAPCs (MART1) 또는 동족 aAPCs (NY-ESO-1)에 대한 72시간 동안의 반응으로 ATO-유래 CD3+tetramer+CD8SP T 세포의 증식(CFSE 희석) 및 활성(CD25 상향조절). 데이터는 2회 반복 실험의 대표값이다. (e) 7일 및 14일 후에 항-CD3/CD28및IL-2또는IL-7/IL-15에 대한 반응으로 시작 세포 숫자에 상대적인 TCR 형질도입된 ATOs로부터 ATO-유래 CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포의 후기-ATO 증식. 3회 반복 실험 후 평균 및 표준편차를 나타내었고, 데이터는 3회 반복 실험의 대표값이다. (f) 형질도입되지 않은 ATOs (n=5)와 비교하여 TCR-형질도입된 ATOs(n=3)로부터 나온 CD3+TCRαβ+tetramer+CD8SP 세포에서 내생적 TCR Vβ의 대립유전자배제를 유세포계수법으로 나타낸 결과. 에러 막대는 표준편차를 나타낸다.
도 18A-F: ATO-유래 TCR-조작된 T 세포에 의한 항원-특이적 종양 세포 살해. (a,b) ATO-유래 TCR-조작된 T 세포의 항원-양성 종양 세포에 대한 시험관 내(in vitro) 세포독성. HLA-A*02:01/NY-ESO-1157-165-특이적 TCR-형질도입된 ATOs로부터 나온 CD8SP T 세포는 항-CD3/28 +IL-2로 36시간 동안 활성화되었고, K562 세포, 무관한 펩타이드(MART126-35) 또는 동족 펩타이드 (NY-ESO1156-165) (각각 K562-MART-1 및 K562-ESO)를 제시하는 HLA-A*02:01 단일 체인 트라이머로 형질도입된 K562 세포, 또는 HLA-A*02:01+ NY-ESO-1+ U266 다발성 골수종 세포주와 함께 공동 배양되었다. (a) 9시간 째에 유동세포계수법으로 결정된 초기(아넥신 V+ DAPI-) 또는 후기(아넥신 V+ DAPI+) 세포사멸 종양 세포의 백분율. 이펙터:타겟(E:T) 비율은 공동 배양 시작 시에 tetramer+ T 세포 백분율에 기조하여 계산하였다. 데이터는 2회 반복 실험의 대표값이다. (b) (a)에서 나타낸 세포독성 분석에 특이적인 세포 사멸. 총 아넥신 V+ 세포는 T 세포를 받지 않은 웰에서 자발적(비-특이적) 세포 사멸에 대해 조정되었다. (c) 장기간의 T 세포의 후기-ATO 활성/증식에 따른 항원 특이성 유지. TCR-형질도입된 ATOs에서 분리된 CD8SP T 세포는 항-CD3/28 및 IL-12와 함께 14일 동안 증식되었고, (a)에 나타낸 세포독성 분석을 수행하였다. 비교예로서 동일한 조건에서 TCR-형질도입된 말초혈액 CD8+ 공여 T 세포를 이용하여 14일 동안 수행한 분석 결과를 나타내었다. (d-f) ATO-유래 TCR-형질도입된 T 세포에 의한 시험관 내(in vivo) 종양 조절. TCR-형질도입된 ATOs로부터의 CD8SP T 세포는 (c)에 상술한 바에 따라 14일 동안 활성화/증식 되었다. (d) 3일 먼저 2.5 x 105 루시퍼라아제-형질도입된 K562-ESO 또는 K562-MART 종양 세포를 이식한 NSG 마우스 피하에 5.7 x 106 T 세포(테트라머 염색에 의한 4.5 x 106 항원-특이적 T 세포 포함) 또는 PBS를 정맥주사하였다. (e) ATO CD8SP에 대한 K562-ESO 대 K562-MART1 종양 세포의 반응. 지정된 시점에 생물발광을 기록하였다. 그룹단 2~3마리의 마우스에 대한 평균 및 표준편차를 나타내었다(PBS n=2, K562-ESO와 함께 TCR-형질도입된 ATOs T 세포 n=3, 또는 K562-MART1 n=2) (**p=0.00033, ****p=0.000066). (f) (d) 및 (e)에 기술한 분석으로부터 선택된 생물발광 이미지. 중간 줄은 종양이 성장한 ATO CD8SP T 세포로 처리된 총 3 마리의 K562-ESO 운반 마우스 중 유일한 마우스를 나타낸다.
도 19: ATOs는 고체 조직-유사 구조를 형성한다. CB HSPCs및MS5-hDLL1(즉, ATO)(왼쪽), MS-5 모세포(중간), 또는MS5-hDLL1 세포 단독(오른쪽)으로 생성된 6주차 3D 배양의 조직 구조를 나타내는 헤마토톡신 및 에오신(Hematoxylin and eosin) 염색 결과. 배율은 각각 100X (윗줄) 또는400X (아랫줄)임.
도 20A-B: ATO 당 HSPCs의 시작 갯수는 HSPC당 세포 생산량에 영향을 미치지만, 전체 세포 생산 또는 T 세포 분화에는 영향을 미치지 않는다. (a) 갯수가 변하는 CD34+CD3- CB HSPCs (ATO 당 0.3-30 x 103) 및 갯수가 일정한 MS5-hDLL1 스트로마 세포(ATO 당 1.5 x 105)로 생성되는 6주차 ATO에서 유입 HSPC 당 총 세포 개수 및 생산량. 더 큰 ATOs(30 x 103 HSPC및6 x 105 스트로마 세포를 1:20 비율로 사용함)로 생성된 비교예는 오른쪽에 나타내었다. (b) (a)에 나타낸 ATOs에서 T 세포 전구체 및 성숙한 T 세포 빈도. 3회 반복한 ATOs의 평균 및 표준편차를 나타내었고, 데이터는 2회 반복 실험의 대표값이다.
도 21A-K: ATOs에서 T 세포 분화는 재현성이 높고 B27 로트 변화, 제노-프리 B27 또는 스트로마 조사의 영향을 받지 않는다. (a) T-세포 리니지커밋먼트(T-lineage commitment), (b-c) T 세포 분화, 또는 (d) 단일 CB (ATO당 7.5 x 103 CD34+CD3- HSPCs)에서 생성되고, 4 가지 다른 B27 보충제의 로트(A~D로 표시)를 이용하여 배양된 6주차 ATOs에서의 총 세포 수에 대한 B27로트 변화의 효과는 유의미하지 않았다. 각 B27 로트에 대하여 반복한 ATOs(n=2-3) 를 나타내었다. B27 대신 제노-프리 B27을 대체하였을 때 6주차 ATOs에서 (e) T 세포 분화 또는 (f) 총 세포 수에 대한 영향은 유의미하지 않았다. ATO 생성 전에 MS5-hDLL1 스트로마 세포를 20-80 Gy로 조사하였을 때 (g-i) T 세포 분화, 또는 (j) 총 세포 및CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포 수에 대한 영향은 적었다. 3회 반복한 ATOs의 평균 및 표준편차를 나타내었고, 데이터는 2회 개별 실험의 대표값이다. (h)의 유세포 플롯은 (g)에 나타낸 CD3+TCRαβ+ 게이트로부터의 세포를 나타낸다. (k) 6주차에 기계적인 파괴에 의해 ATOs로부터 수확한 세포는 >99% 인간 조혈 CD45+ 세포(위), 및 <0.5% GFP+ 스트로마(아래)의 현탁액으로 나타난다. 인간 및 쥐 세포의 빈도는 8회의 ATOs 반복 실험으로 나타내었다.
도 22: ATO 대 단일층 배양 시스템에서 향상된 양성 선택. 6주차에 OP9-DL1 단일층 배양 대 ATOs에서 단핵구(CD14+), NK 세포(CD56+), B 세포(CD19+), HSPCs (CD34+), 또는 T 리니지 세포(CD7+CD5+)의 빈도, 및 T 세포 전구체 및 T 빈도 세포 유형 (순차적인 게이트는 각 그래프에 표시됨). 단일층 배양과 ATO 배양에 대해 동일한 CB 단위체를 사용하여 배양을 개시하였다. 데이터는 3회 반복 실험의 대표값이다.
도 23A-B: ATOs에서 가슴샘림프구증식 및 나이브 T 세포 표현형의 개요. (a) 신생아의 흉선과 비교하여 CB ATOs에서 HLA-DR+ 세포의 빈도(CD45+ 세포에 게이팅 됨). (b) 다중 HLA-DR+ 항원 제시 세포(APC) 집단은 6주차 ATOs에서 나타난다. 각 플롯 위에 순차적인 게이트를 나타내었다. HLA-DR+ 집단은 단핵구(CD14+), 과립구(CD66b+), B 세포(CD19+), HSPCs(CD34+), 플라스마사이토이드 DC(CD303+CD123+), CLEC9A+ DC(CD141+CLEC9A+), 및CD1c+ DC(CD1c+CLEC9A-)를 포함한다. 신생아의 흉선의 비교 분석 결과를 짝지어 나타내었다. (a) 및 (b)의 데이터는 3회 반복 실험의 대표값이다.
도 24A-B: 3주차 ATOs에서 LMPP및CD24- CLP 로부터 T 세포 커밋먼트의 빠른 시작은 (a) DP의 빠른 출현 및 (b) CD34+CD7+ 전구체로 위탁된 T 세포에 의해 발혀졌다. (b)의 데이터는 (a)에 나타난 바와 같이 CD34+ 세포에 게이팅 되었다. 데이터는 2회 반복 실험의 대표값이다.
도 25A-E: ATO-유래 T 세포의 TCR 다양성 및 기능 검증. (a) RAG1및RAG2 는 인간의 흉선세포와 비슷하게, ATO-유래 CD3+CD4+CD8+ (DP)에서 발현되었으나 성숙한 CD3+CD8SP T 세포에서는 발현되지 않았다. RAG1및RAG2에 대한 정량적 RT-PCR은 FACS 분류된 ATO-유래 T 세포 및 신생아 흉선-유도된 T 세포 집단에서 B2M의 발현에 대하여 상대적으로 나타내었다. 3회 반복 실험의 평균 및 표준편차를 나타내었다. (b) 7주차 ATOs(n=5) 또는 인간 흉선(n=4)에서 분리된 CD3+TCRαβ+CD4SP T 세포에서 TCR 다양성의 생성을 TCR Vβ 패밀리 발현의 빈도를 유세포계수법 분석으로 나타냄. (c) 6시간 동안 PMA/이오노마이신으로 처리한 12주차 ATO-유래 CD4SP T 세포에 의한 사이토카인 생산. 데이터는 2회 반복 실험의 대표값이다. (d) 항-CD3/CD28 및 IL-2에 대한 반응으로 5일 후에 재대혈(CB) 및ATO-유래 (12주차) CD4SP T 세포의 증식(CTV 희석) 및 활성(CD25의 상향조절). 데이터는 2회 개별 실험의 대표값이다. (e) 7일 및 14일 후에 항-CD3/CD28 및 IL-2에 대한 반응으로 나타난 시작 세포 수에 상대적인 ATO-유래 CD4SP T 세포의 후기-ATO 증식. 3회 반복 실험의 평균 및 표준편차를 나타내었다.
도 26A-D: ATOs에서 TCR-조작된 T 세포의 분화 및 대립유전자 배제. (a) ATO-유래 TCR-조작된 T 세포는 증식과 재자극에도 불구하고 일반적인 T 세포 표현형을 유지한다. HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165 특이적 TCR로 형질도입된 CB HSPCs에서 생성된 ATOs로부터의 CD8SP T 세포는 항-CD3/28 비드 + IL-2으로 활성화되고, IL-2에서 증식되며, 14일째에 항-CD3/28 비드로 재자극되었다. CD8α 및 CD8β의 보존된 표면 공동 발현은 유동세포계수법으로 확인하였다. 데이터는 2회 반복 실험의 대표값이다. (b) TCR-형질도입된 CB ATOs로부터의 CD3+TCRαβ+tetramer+CD8SP T 세포의 유동세포 Vβ 분석. 데이터는 5회 반복 실험의 대표값이다. (c) HLA-A*02:01/MART126-35 특이적 TCR을 이용하여 ATOs에서 TCR-형질도입된 CB HSPCs로부터 TCR-조작된 T 세포의 생성. 6주차의 분화를 나타내었다(총 CD14-CD56- ATO 세포에 게이팅 되었고, 각 플롯 위에 순차적인 게이트를 나타냄). 데이터는 2회 반복 실험의 대표값이다. (d) CD80 및 MART126-35 또는NY-ESO1156-165 펩타이드를 제시하는 HLA-A*02:01 단일 체인 트라이머를 발현시키는 인공 항원 제시 세포(aAPCs)에 의한 MART1-특이적 및NY-ESO-1-특이적 ATO-유래 TCR-조작된 T 세포의 항원-특이적 프라이밍. 6시간째에 CD107a 멤브레인 가동화 및 세포내 IFNγ 염색을 나타내었다.
도 27A-B: MHC-변형된 ATOs에서 TCR-조작된 T 세포의 향상된 양성 선택.
(a) 단일 공여체, 및 표준 또는 HLA-A*02:01-형질도입된 MS5-hDLL1 스트로마 세포로부터 TCR-형질도입된 CB HSPCs으로 생성되는 6주차 ATOs에서 TCR-조작된 CD3+TCRαβ+tetramer+CD8SP T 세포의 향상된 생산. 순차적인 게이트는 각 플롯의 위에 나타내었다. (b) (a)에 나타낸 바와 같이, MHC-변형된 ATOs에서 성숙한 나이브 T 세포 표현형에 대한 TCR-조작된 T 세포의 정상 성숙. 세포는 CD3+Vβ13.1+tetramer+CD8SP T 세포로 게이팅 되었다. 데이터는 3회 반복 실험의 대표값이다.
도 28A-C: 변형되지 않은 인간 스트로마 세포주 HS27a는 T 세포 분화를 지지하지 않는다. 인간 스트로마 세포주(HS27a)를 벡터-매개된 노치 리간드 발현 없이 ATO 시스템에서 사용하였다. 3가지 다른 재대혈 샘플로부터 나온 CD34+ HSPC로 실험하였다: (a) E37, (b) E43, (c) E68. 4주차에 어떤 재대혈 공여자도 노치 신호전달(Notch signaling)이 없는 상태에서 CD5+CD7+ T 세포 확진 세포를 생성할 수 없었다. 표시된 데이터는 별도로 표시하지 않는 한 CD45+CD56-CD14-에서 게이팅 된 것이다.
도 29A-F: 인간 스트로마 세포주 HS27a에서 노치 리간드 발현은 ATOs에서 T 세포 분화를 지지한다. 렌티바이러스 형질도입을 통해 hDLL1를 발현시키도록 조작된 HS27a로 만들어진 ATOs로부터 얻은 데이터를 나타내었다. 도 28에 나타낸 것과 동일한 3가지 재대혈 샘플로부터 나온 CD34+ HSPCs: (a,b) E37, (c,d) E43, 및 (e,f) E68. HS27a-hDLL1 ATOs를 사용한 데이터는 양성 대조군으로서 MS5-hDLL1 스트로마를 사용하여 얻은 데이터와 비교하였다. 4주차에, 3가지 재대혈 공여자 모두 HS27a-hDDL1 및 MS5-hDLL1 ATOs에서 CD5+CD7+ T 세포로 분화 결정된 세포를 생산하였다. 표시된 데이터는 별도로 표시하지 않는 한 CD45+CD56-CD14-에서 게이팅 된 것이다.
도 30: 4주차 HS27a-DLL1 ATOs에서 생성된 대부분의 CD8+ 세포는 CD3또는TCRab를 발현시키지 못했다. MS5-hDLL1 ATOs 및 HS27a-DLL1 ATOs를 비교한 데이터를 나타내었다.
도 31A-C: HS27a-hDLL1 ATOs는 성숙한 T 세포의 분화를 지지할 수 있다. MS5-hDLL1 ATOs 및 HS27a-hDLL1 ATOs(4주차)에서 T 세포 분화는 3가지 다른 재대혈 개체군을 사용하여 나타내었다: (a) E37, (b) E43, (c) E68. 데이터는 오른쪽 패널의 추가 CD3+TCRab 게이팅과 함께 CD45+CD56-CD14-에서 게이팅 되었다.
도 32A-B: 5주차 ATOs에서 (hESC로부터 생성된) 사람 배아 중배엽 선구(human embryonic mesoderm progenitors, hEMP) 세포로부터 T-세포 분화. (a)는 CD56-CD14- 게이팅 된 T 세포 개체군이고, (b)는 아랫줄에 나타낸 추가 게이트와 함께 CD56-CD14- 게이팅된 세포를 나타냄.
도 33A-B: ATOs에서 hEMP로부터 T-세포 분화의 역학. (a)는 3주, 5주 및 7주차에 나타난 게이트된 개체군이고, (b)는 CD3+TCRab 세포가 CD8ab+라고 나타나는 7주차의 분화를 더 자세히 분석한 것이다.
도 34A-B: hES-유래 hEMP는 성숙한 나이브 형질을 갖는 T 세포를 생산한다. 5주차 ATOs에서 (a) TCRab+CD3+ 개체군은 CD4+ 및 CD8+ 세포 및 DP 세포로 구성된다는 것을 나타냄. (b) CDSP8 및 (c) CDSP4 세포의 추가 분석.
도 35A-B: hEMP-유래 T 세포에서 성숙 마커의 발현. (a)는 5주차의 CD8SP 세포를 분석한 결과이고, (b)는 5주차의 CD4SP 세포를 분석한 것이다.
도 36: T 세포 생성은 다중 hESC 세포주를 통해 재현 가능하다. 3가지 서로 다른 hESC로부터 생성된 hEMP는 ATO 시스템에서 T 세포를 생성한다.
도 37: ATO 시스템을 이용하여 iPSCs로부터 T 세포 생성. 이 도면은 iPSC 세포주(HLA.A02.02, 건강한 공여자로부터 얻은 피부 섬유아세포)가 ATO 시스템에서 T 세포를 생성한다는 것을 나타낸다. 데이터는 6주차로부터 얻은 것이다.
도 38A-B: ATOs에서 직접적으로 응집되는 미분화 hESC는 T 세포를 생성할 수 있다. (a) 5주차 ATO 및 (b) 7주차 ATO로부터 생성된 T 세포 개체군을 나타냄.
도 39: JAG1 를 발현시키는 스트로마 세포를 이용하여 ATO 시스템에서 hEMP로부터 성숙한 T 세포의 생성.
도 40: hEMP로부터 ATO 시스템에서 생산되는 T 세포는 다양한 TCR Vb 레파토리를 나타낸다. 5 주째에 hEMP로부터 ATOs (CD8SP)에서 생성된 T 세포의 TCR Vb 패밀리 사용에 대한 유동세포 분석 결과. 결과는 흉선세포에서 TCR Vb 패밀리 이용과 비교하였다.
도41A-B: hESC-유래 T 세포는 항-CD3/CD28 및 IL2에 대한 반응으로 증식 및 CD25 상향 조절을 나타낸다. hESC(5주차)로부터 ATOs에서 생성된 CD8 SP T 세포는 시험관 내에서 기능적으로 실험하였다. (a) 분리된 세포는 CTV(Cell tracker Violet)로 염색하였고, CD3/CD28 활성화 비드에 5일 간 반응시켰다. 세포는 CTV의 희석과 CD25의 활성와 및 발현에 의해 나타난 바와 같이 다중 세포 분열을 겪었다. (b) 분리된 세포는 PMA/이오노마이신으로 6시간 동안 실험하였고, 세포내 염색은 세포독성 사이토카인(IFNg, IL2, TNFa)의 생성을 나타내었다.
도 42: ATO 시스템에서 hESC로부터 조작-T 세포의 생성을 나타낸 모식도. H1 hESC가 GFP를 발현시키는 opt1G4 벡터 (NY-ESO TCR)로 형질도입되었다. 상기 H1 NY-ESO TCR hESC 세포주는 GFP+ 세포를 분리하고, 증식시킴으로써 생성된다. 다음으로 상술한 T 세포 분화 유도하기 위한 프로토콜과 동일한 방법을 수행하였다.
도 43A-B: NY-ESO TCR 조작된 T 세포의 특징. (a) 3주차 및 (b) 5주차의 FACS 데이터를 나타내었다. 형질도입하지 않은 hESC(H1) 및TCR-형질도입된 hESC의 데이터를 나타내었다. ATOs에서 hESC로부터 생성되는 조작된 T 세포는 GFP 및 테트라머의 발현, 및 T 세포 분화에 대한 마커(DP, CD3+/TCR+ CD8SP)의 발현으로 특징지어진다.
도 44A-B: (a) 조작된 hESC-유래 CD8SP T 세포는 성숙한 나이브 표현형을 나타내며, (b) 성숙 마커는 조작된 ES 유래 T 세포에서 발현되었다는 것을 알 수 있었다.
도 45는 분리된 NY-ESO TCR CD8SP 세포가 ATO 5일 후(5주차) CD3/28 또는 aAPC 자극에 따라 활성화된다는 것을 보여준다.
도 46은 분리된 NY-ESO TCR CD8SP 세포가 자극에 대한 반응으로 세포독성 사이토카인(IFNg, IL2, TNFa)을 생산한다는 것을 보여준다.
도 47은 인공 항원 제시 세포(K562)에 대한 반응으로 조작된 hESC-유래(hEMP) T 세포의 특이적 활성화를 증명한다. 분석 결과 동족체(NY-ESO)를 발현하는 aAPC에 반응하여 세포 독성 사이토 카인(IFNg, IL2, TNFa) 및 탈과립(CD107a)이 생성되었지만, 무관한 펩타이드(MART-1)는 생성되지 않았다.
도 48은 TCR-형질도입된 ES-유래 T 세포가 항-CD3/CD28에 대한 반응으로 강력한 증식을 보여준다는 것을 나타낸다.
도 49는 완전한 B27(Comp)와 비교하여, 단일 성분(인슐린(-ins), Vit A, 항산화제(AO))이 결여되었거나, 제노바이오틱이 없는(xenobiotic free, xeno free) B27 보충제의 다양한 양태를 이용한 데이터를 나타낸다. ATO 배양은 CD34+CD3- 재대혈 HSPC로 개시되었고, 6주차에 분석하였다. 전체 세포 수 및 CD5+CD7+ T 세포 전구체인 배양 %를 나타내었다.
도 50은 완전한 B27(Comp)와 비교하여, 단일 성분(인슐린(-ins), Vit A, 항산화제(AO))이 결여되었거나, 제노바이오틱이 없는(xenobiotic free, xeno free) B27 보충제의 다양한 양태를 이용한 데이터를 나타낸다. 데이터는 T-세포 커밋먼트에 인슐린이 필수적이고, 비타민 A 및 항산화제가 세포 유출을 촉진한다는 것을 나타낸다.
도 51는 이어진 실험에서 사용된 2차 생성 CD19-표적 CAR의 디자인을 도시한 것이다.
도 52는 CAR-형질도입된 CB ATOs의 FACS 분석 결과로서, ATOs에서 CAR 발현(즉, GFP+)이 CD3-TCRab- 및 CD3-TCRgd-인 T-리니지 세포(CD5+ 및 CD7+)에 크게 제한을 받는다는 것을 나타낸다.
도 53는 CAR-형질도입된 CB ATOs의 FACS 분석 결과로서, ATO-유래 CAR-T 세포가 display 비전형적인 T 세포 분화, 즉, CD5+CD7+CD3-TCRab-CD4-CD8-를 나타낸다는 것을 보여준다. 가짜 형질도입된 ATOs를 비교예로 나타내었다.
도 54는 CB ATO-유래 CAR-T 세포가 나이브 T 세포 표현형 (CD45RA+)을 나타내고, 표현형적으로 성숙하다(CD27+CCR7+)는 것을 보여준다.
도 55는 CB ATO-유래 CAR-T 세포가 CD2 및 세포내 CD3e를 발현시킨다는 것을 보여준다.
도 56A-B: ATO-유래 CB CAR-T 세포는 CD4-CD8- (DN)이거나, CD8遜 호모다이머(homodimers)를 발현시키고(a), IELs (및 NK 세포)와 관련된 CD56 및 CD16를 발현시킨다(b).
도 57는 ATOs에서 CAR-T 세포 작용제(agonist) 선택의 가설적 모델을 나타낸다.
도 58은 TCR 동시 형질도입에 의한 CB ATO CAR-T 세포에서의 CD3/TCR 복합체 발현(그러나 CD4 또는 CD8 발현이 아님)의 회복을 입증한다.
도 59는 CB ATO-유래 CAR+TCR+T 세포에서의 기능적 TCR 재구성을 나타낸다.
도 60은 CB ATO-유래 CD19 CAR-T 세포의 기능 분석 결과를 나타낸다. CD19+ 세포(CD19 벡터, Nalm6 및 Raji 세포로 형질도입된 K562)에 대한 반응으로 CAR-T 세포의 사이토카인 분비 및 활성화(추가 활성화제/부자극 추가 없이 분석함).
도 61은 CB ATO-유래CAR-T 세포의 세포독성 분석 결과를 나타낸다. CD19+ 타겟은 Nalm6이고 CD19- 컨트롤은 are K562(비-형질도입)이다.
도 62는 CB-ATOs에서 IEL-유사CD8aa CAR-T 세포의 생산은 (아마도 작용제 선택을 통하여) 다른 보조활성화(coactivation) 및 CAR 컨스트럭트의 scFv 도메인을 통해 관찰된다는 것을 보여준다.
도 63는 인간 ES 세포로부터 나온 ATO-유래 CAR-T 세포가 ATOs에서 CAR-T 세포를 생성할 수 있다는 것을 보여준다. 세포는 CD45+로 게이팅 되었다. 형질도입되지 않은 H1 hESC 또는 CAR-형질도입된 hESC로부터 생성된 hEMP로부터 나온 1-4주차 ATOs에서 분석하여 나타내었다.
도 64는 인간 ES 세포로부터 나온 ATO-유래 CAR-T 세포가 비전형적인 T 세포 분화를 나타낸다는 것을 보여준다. 세포는 CD45+로 게이팅 되었다. 형질도입되지 않은 H1 hESC 또는 CAR-형질도입된 hESC로부터 생성된 hEMP로부터 나온 1-4주차 ATOs에서 분석하여 나타내었다.
도 65는 인간 ES 세포로부터 나온 ATO-유래 CAR-T 세포가 CD8베타를 발현시키지 않는다는 것을 보여준다. 표시된 시점에 두 가지 실험(657및659)으로부터 나온 데이터를 나타내었다. 세포는 형질도입되지 않은 H1 hESC 또는 CAR-형질도입된 hESC로부터 생성된 hEMP에서 생성되었고, CD45+에 게이팅되었다.
도 66A-B는 인간 ES 세포로부터 나온 ATO-유래 CAR-T 세포가 PMA/이오도마이신에 대한 반응으로 사이토카인을 생산한다는 것을 보여준다. (a)에서 인터페론 감마 및 TNF 알파를, (b)에서 인터페론 감마 및 IL-12에 대해 세포내 염색함으로써 활성화를 나타낸다. 데이터는 5주차 ATOs에서 나온 것이다.
도 67은 인간 ES 세포로부터 나온 ATO-유래 CAR-T 세포가 CD19+ 타겟 세포(Cd19+K562, Nalm6, RAJI 세포)에 대한 반응으로 사이토카인 및 탈과립(degranulate)을 생성하지만, 모 (Cd19-) K562 세포는 생성하지 않는다는 것을 보여준다. 데이터는 5주차 hESC-ATOs로부터 얻었고, 세포는 CD7+CD45RA+로 게이트 되었다.
도 68은 ATO(MS5-DLL1) 및 단일층(OP9-DLL1) 시스템은 모두 CD34+ T 세포 선구체(progenitors)의 유지 및 CD5+CD7+ T 세포 전구체(precursors)에 대한 커밋먼트를 가능하게 한다는 것을 보여준다. 3가지 다른 CB 샘플(E37, E43, E68)에서 유래한 4주차 CB-ATOs를 나타내었다.
도 69는 ATO 및 OP9-DLL1 시스템은 모두 CD5및CD7의 발현에 의해 나타나는 바와 같이 T-세포 리니지에 대한 세포의 커밋먼트를 가능하게 한다는 것을 보여준다. 그러나, ATO 시스템은 CD4+CD8+ 이중 양성 세포(DP)의 생성에 있어서 훨씬 뛰어나다. 3가지 다른 CB 샘플(E37, E43, E68)에서 유래한 4주차 CB-ATOs를 나타내었다.
도 70은 강한 집단의 CB-ATO 시스템에서 DP및CD8SP인 TCRab+CD3+ 세포의 견고한 개체군의 강력한 생성을 나타내지만 OP9-DLL1 단일층 시스템에서는 그렇지 않다는 것을 보여준다. 3가지 다른 CB 샘플(E37, E43, E68)에서 유래한 4주차 CB-ATOs를 나타내었다.
도 71은 도 70에 제시한 데이터의 수치 표시를 나타낸다.
예시적인 실시예의 설명(Description of Illustrative Embodiments)
I. 도입
수혜 환자(recipient patient)에게 동종(allogenic)일 수 있는 비-동종반응성 T 세포(non-alloreactive T cells)를 생산하는 조성물 및 방법이 대하여 개시되어 있다. 이는 해당 기술분야에서 상당히 개선된 기술로서 비용면에서 효과적이고 노동 집약적인 치료법을 제공하며, T 세포 요법이 불가능한 개인에 대한 면역 요법을 제공한다. 또한, 조작된 T 세포의 생산을 위한 신규 조성물 및 방법이 제공된다.　이러한 조성물 및 방법은, 부분적으로, 고도로 표준화된 무- 혈청 성분 및 스트로마 세포주를 사용하여 인간 HSPC로부터 강력하고 재생 가능한 T 세포 분화를 용이하게 하는 인공 흉선 오가노이드 (artificial thymic organoid, ATO) 3D 배양물을 포함하는 세포 배양 조성물의 발견에 기초하여 제공되었다. 일 실시예에서, ATOs에서의 T 세포 분화가 내인성 흉선림프구증식(thymopoiesis)을 매우 유사하게 모방하고, 단층 공동 배양과는 달리, 다양한 TCR 레퍼토리 및 안티젠-나이브 표현형(antigen-naive phenotype)을 갖는 기능성(functional) CD3 + TCRα + CD8 + 및 CD4 + T 세포의 효율적인 양성 선택(positive selection)을 서포트한다는 것이 확인되었다.
비제한적인 예(non-limiting example)로서, 상기 세포 배양 조성물은 적어도 NY-ESO-1 암 관련 항원과 같은 항원에 특이적인 TCR로 형질도입된 형질도입된 HSPC로부터 유래된, 나이브하고 대립유전자가 형질배제되며 TCR-조작된 (naive, allelically-excluded, TCR-engineered) 항원 특이적 T 세포의 생성에 사용될 수 있다.
추가 실시예에서, ATO에서의 양성 선택(positive selection)은 자가조혈모세포(autologous hematopoietic cells)에 대한 자가-MHC(self-MHC)에 의해 유도되고 또한 체외에서(in vitro) 양성 선택을 모델링하거나 강화시키기 위해 자가-MHC의 스트로마 세포 발현에 의해 조작될 수 있다는 것이 형질전환TCR 시스템(transgenic TCRsystem)으로 입증되었다.
따라서 ATO와 같은 3D 세포 배양 조성물은, 단순하며 기성화되고(off-the-shelf) 고도로 표준화된 종단 간(end-to-end) T 세포 개발 모델을 제공하며 이는 조혈(hematopoiesis), 면역 재생(immune regeneration), 숙주면역(host immunity), 및 세포면역요법(cellular immunotherapy)과 관련된 다양한 연구를 진행할 잠재력이 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 이 기술에서 중요한 진보를 나타낸다. 인공 흉선 오가노이드 구체예(실시예)는 HSPC로부터의 이전의 T 세포 분화 방법에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 장점에는 다음 중 하나 이상이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다:
ATOs는 조혈모세포와 전구세포(HSPC)로부터 T 세포 분화의 모든 단계를 생성한다. 가장 중요한 것은 성숙한 나이브(naive) T 세포 (CD4SP와 CD8SP)를 포함한다는 것이다.
ATO 에서 HSPC로부터 성숙한 T 세포를 생성하는 능력은 HSPC에서 유전자 (예: TCR 또는 CAR)를 발현함으로써 조작된 T 세포를 생성하도록 ATO 시스템을 변형시킬 수 있게 한다.
ATO 시스템은 스트로마 구획(stromal compartment, MS5)에서 유전자를 발현함으로써 변형될 수 있다.
ATO 배양물은 혈청-프리(serum-free)일 수 있다. 따라 FCS(fetal calf serum)의 롯트 간(lot-to-lot) 변이의 제한이나 FCS 함유 배지의 임상 번역(clinical translation) 문제는 없다.
인간 HSPC의 시험관 내(in vitro) T 세포 분화의 다른 모델과의 비교는, 그 차이점을 설명하고 본원에서 제공된 방법 및 세포의 이점을 입증한다. 예를 들어, OP9-DL1 시스템은 2005 년경부터 인간 HSPC로부터의 T 세포 분화를 위한 골드 스탠다드(gold standard)로 여겨져 왔다. Juan Carlos Zuniga-Pflucker, Toronto, Canada의 연구실에서 개발한 시스템은, 마우스 (Schmitt et al, Immunity, 2002) 또는 인간 (La Motte-Mohs, BLOOD 2005) HSPC T 세포의 결핍 (commitment)을 유도하기 위해 리간드 1 (DLL1 aka DL1)과 같은 노치 리간드 델타(notch ligand Delta)로 형질 도입된 마우스 스트로마 세포주 (OP9)의 단일 층을 사용한다. HSPC는 태아 송아지 혈청(fetal calf serum) 및 사이토카인(cytokines) 을 함유하는 배지에서 OP9-DL1 단층 위에서 공동 배양된다. 이 시스템의 변형(variation)은 DLL1 (OP9-DLL4) 대신 DLL4를 사용한다. DLL4 결과는 DLL1과 크게 다르지 않다.
그러나 OP9-DL1 시스템에는 문제가 있다. 예를 들어, 성숙한 T 세포의 생성은 무시될 수 있다. OP9-DL1 (또는 OP9-DLL4) 모노레이어는 제대혈 (CB) HSPC의 T 세포 결핍(CD7+CD5+/- 세포)의 초기 단계를 유도할 수 있지만, CD8+ 또는 CD4+ 단일 양성 (SP) 성숙 T 세포가 있다면 (LaMotte Mohs, BLOOD 2005 참조) CD4+ CD8+(DP) 단계를 지나친 분화는 극히 비효율적이다. Blood 2005, La Motte-Mohs의 도 4에서 이를 보여준다. 　 Zuniga-Pflucker 그룹 (Awong et al, BMC Immunol 2011)의 보다 최근의 논문은 기껏해야 ~ 2-4 %의 성숙 CD8+세포, 즉 CD8+CD3+CD1a-CD27+ 세포 (Awong의 도 1에서, 8%는 CD8+, 40%는 CD3+CD27+이었다)를 가진 데이터를 보여 주었다.
OP9-DL1 모델에 대해 발표한(공개한) 다른 주요 그룹 은 벨기에 출신이다 (Vandekerckhove, Plum, Tagho에서 다양하게 발표). Zuniga-Pflucker 그룹과 마찬가지로, 벨기에 그룹은 CB HSPC (de Smedt et al Haematologica, 2011)를 사용할 때, 최대 5 % CD3+TCRab+ 세포를 보였으며 SP8 및 SP4가 있다고 하더라도 매우 드물었다. 주목할 것은 이 그룹의 또 다른 논문에서는 사람의 흉선에서 분리된 HSPC로 배양이 시작되었기 때문에 성숙한 T 세포의 빈도가 더 높았다는 것을 보여주었다. 흉선에서, CD34+ HSPC는, T 세포 분화를 위해 흉선 신호에 이미 노출된 프로 -T 세포를 주성분으로 포함하고 따라서 T 세포를 생성하기 위해 프라이밍된다. 도 2A 참조, Van Coppernolle 외., 2009 (흉선에서 유래한 HSPC).
OP9-DL1 시스템에서 성숙한 T 세포의 불량한 분화 (poor differentiation) 의 추가적인 증거로서, Awong et al, 2011의 표 1은 이러한 배양물에서의 수율을 보여준다: 각각의 단일 CD34 + CD38-CB HSPC에서만 0.27-1.16의 TCRab+CD3+ 세포가 생성되었다(n = 6). 이에 비해 ATO 시스템은 CB HSPC 당 1,000-2,000 개의 TCRab + CD3 + 세포를 생성할 수 있다 (Seet et al, 2016).
다른 증거는, OP9-DL1이 HSPC의 다른(CB가 아닌) 임상적 소스(clinical sources)를 사용하여 더욱 악화됨을 보여준다. OP9-DL1을 사용하는 거의 모든 논문은 CB HSPC를 사용하는데, 그 이유는 다른 소스(골수, BM 또는 MPB(mobilized peripheral blood))는 CB보다 비효율적이며 신뢰할 수 없기 때문이다.
Plum 그룹은 OP9-DL1 스트로마(strom)에서 CB와 BM HSPC를 직접 비교 하였다 (De Smedt et al, Hematologica 2011). 그들의 논문 도 2에서 BM HSPC로 개시된(시작된) 배양물은 CB와 비교하여 DP와 TCRab+CD3+ 세포의 빈도가 ~ 10 %인 것을 보여주었다 (BM vs CB에서 각각1-2 % vs 12 % DP와 0.7 % vs 5 % CD3+TCRab+).
비교해 보면, ATO 시스템은 HSP의 모든 소스(BM, MPB, 휴면 PB, 흉선, CB)와 차별화되는 매우 효율적인 방법이다(Seet 외, 2016 참조).
또한, OP9-DL1은 무혈청 배지에서 생존하지 않는다. 발명자들은 3D 응집체 및 RB27 배지에서 OP9DL-1을 사용하여 MS5-DL1로부터 ATO 발견을 재현 할 수 없었다. OP9-DL1은 무 혈청 조건에서 생존하지 못하는 것으로 보인다.
이전에 개발된 태아 흉선 장기 배양 (Fetal Thymic Organ Culture; FTOC)은, 인간의 HSPC로 시딩되고 태아 송아지 혈청 함유 배지에서 공기 유동 인터페이스를 사용하여 성장한, 사람의 태아 흉선의 손상되지 않은 단편으로 구성된 3D 배양이다. 노치 리간드(notch ligand)가 인간 흉선 상피 세포 (human thymic epithelial cells; TEC)에 의해 공급되기 때문에 형질 도입이 필요하지 않다. FTOC 시스템에 대한 대부분의 논문은 이것을 마우스 T 세포 분화에 사용한다(Anderson et al, Annu Rev Immunol. 1996).
또한, FTOCs는, 손상되지 않은 흉선 단편에 남아있는 동종이계 (allogeneic) 인간 T 세포의 존재 때문에 임상 번역(clinical translation)에 적합하지 않다; 추가적으로, 분석(어세이)은 실험적으로 큰 변동성과 정량화의 어려움을 보여준다. 인간 태아 조직의 제한된 이용 가능성은 임상 번역을 완전히 배제하고 FTOC의 실험적 사용조차도 매우 어렵게 만든다. 위와 같은 제한 때문에 FTOC가 OP9-DL1 또는 OP9-DLL4로 대체되었다.
출생 후의 흉선 오가노이드(Postnatal Thymic organoids)는 흉선 미세 환경을 연구하기 위해 Crooks 그룹에 의해 개발되었다(Chung 외, Stem Cells 2014). 이는 인간 TEC 및 출생 후의 흉선에서 유래된 흉선 중간 간질로 형성되고, 단층(모노레이어)으로 10-2일 동안 분리 배양한 다음, 3D 응집체가 형성되도록 제대혈 HSPC 함께 원심 분리된 3D 배양물(3D cultures)로 구성된다. 이 모델은 개념적으로 ATO와 유사하지만, 1. 1 차 흉선 조직의 사용(the use of primary thymic tissue) 2. 혈청 요구량(the requirement for serum) 3. 형질도입을 통한 것이라기 보다는 오히려 TEC로부터의 내인성 노치 리간드 발현에 대한 의존성의 면에서 차이가 있다. 그러나, 출생 후의 흉선 오가노이드는 문제가 있다: 주요한 인간 흉선 조직은 심장 수술 환자에게서 획득되어 드물게 제한된 수의 기관에서만 사용가능하기 때문에 얻기가 매우 어렵다. 또한 흉선 기질(thymic stroma)의 질과 양은 매우 다양하므로 T 세포 분화가 일치하지 않으며 수율이 낮다. 흉선 조직은 CB HSPC에 대해 동종이계(allogeneic)이기 때문에 이 모델은 면역학적 문제를 야기한다. 이러한 모든 이유 때문에 이 모델은 임상적 용도로는 적합하지 않으며 정량 및 재현성 측면에서 실험적으로 사용하기에는 문제가 있다. 하기에서보다 상세하게 논의되는 이유 때문에, 제공된 방법 및 조성물은 이전에 개발된 방법보다 이점을 갖는다.
II. 정의(Definitions)
"외인성 TCR(exogenous TCR)"이란 용어는 시험관 내에서(in vitro) 세포 내로 전달(즉, 유전자 전달/형질 도입/형질 감염 (gene transfer/transduction/transfection) 기술에 의한 방법 의해)되는 TCR 유전자 또는 TCR 유전자 유도체를 의미한다. 외인성 TCR 유전자는 수혜 세포(recipient cell)의 게놈에 삽입된다. 일부 실시예에서, 삽입(insertion)은 무작위 삽입 (random insertion)이다. TCR 유전자의 무작위 삽입은 당 업계에 공지 된 방법에 의해 용이하게 달성된다. 일부 실시예에서, TCR 유전자는 내인성 좌위 (예컨대, 내인성 TCR 유전자 좌위)에 삽입된다. 일부 실시예에서, 세포는 내인성 좌위가 아닌 좌위에 삽입되는 하나 이상의 TCR 유전자를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포는 마커 또는 내성 유전자와 같은 이종 서열을 추가로 포함한다.
"키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)"또는 "CAR"란 용어는 면역 에펙터 세포(immune effector cell)에 임의의 특이성을 부여하는 조작된 수용체를 의미한다. 이러한 수용체는 단일 클론 항체의 특이성을 T 세포에 부여(이식, graft)하는데 사용된다; 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터에 의해 용이하게 코딩 서열을 전달할 수 있다. 수용체는 서로 다른 출처(sources)의 부분으로 구성되어 있기 때문에 키메라라고 한다. 이 분자의 가장 보편적인 형태는 CD3-zeta 트랜스멤브레인(ransmembrane) 및 엔도도메인(endodomain)에 융합된 단일 클론 항체에서 유래한 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 융합체이다; CD28 또는 41BB 세포 내 도메인, 또는 이들의 조합 물을 포함한다. 그러한 분자는 그 표적의 scFv에 의한 인식에 반응하여 신호를 전달하게 된다. 그러한 구조물의 예로는 14g2a-Zeta가 있는데, 이는 하이브리도마(hybridoma) 14g2a (disialoganglioside GD2를 인식 함)에서 유래 한 scFv 융합체이다. T 세포가 이 분자를 발현 할 때 (보통 oncoretroviral vector transduction에 의해 이루어짐), 그들은 GD2를 발현하는 표적 세포 (예: 신경 모세포종 세포)를 인식하고 죽인다. 연구팀은 악성 B 세포를 표적으로 삼기 위해 B-혈통 분자인 CD19에 특이적인 키메라 면역 수용체를 사용하여 T 세포의 특이성을 재조정했다. 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 부분은 가요성 링커에 의해 융합되어 scFv를 형성한다. 이 scFv 앞에는 신호 펩타이드가 있다. 이 scFv 앞에는 소포체 (endoplasmic reticulum)와 후속 표면 발현(subsequent surface expression)으로 초기 단백질을 향하게하는 신호 펩타이드가 있다. 플렉서블 스페이서는 scFv가 항원 결합을 가능하게 하기 위해 상이한 방향으로 배향될 수 있게 한다. 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인은 일반적으로 세포 내로 돌출하고, 원하는 신호를 전송하는 신호전달 엔도도메인의 오리지널 분자(original molecule)에서 유래된 전형적인 소수성 알파 나선이다.
"항원(antigen)"이란 용어는 면역계가 항체를 생성하게 하거나 T 세포가 반응하는 모든 물질을 의미한다. 일부 실시예에서, 항원은 길이가 5 내지 50 개의 아미노산 펩타이드이거나, 적어도 많거나 정확하게 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 임의의 유도 가능한 범위를 포함하는 펩타이드이다.
"수혜자에게 동종이계(allogeneic to the recipient)"라는 용어는 수혜자로터 격리되지 않은 세포을 의미한다. 일부 실시예에서, 세포는 환자로부터 단리(분리, isolation)되지 않는다. 일부 실시예에서, 세포는 유전적으로 매치된 개체(호환가능한(compatible) 유전자형을 갖는 친척(relative)과 같은)로부터 단리되지 않는다.
"불활성(inert)" 이라는 용어는 원치 않는 임상 독성을 일으키지 않는 것을 말한다. 이것은 표적 독성 또는 표적이 아닌 독성(on-target or off-target toxicity)일 수 있다. "불활성(Inertness)"은 알려진 또는 예측된 임상 안전 데이터(clinical safety data)를 기반으로 할 수 있다.
"제노-프리(xeno-free: XF)" 또는 "동물성 성분이 없는 (animal component-free: ACF)" 또는 "동물이 없는(animal free)"이라는 용어는, 배지, 세포 외 기질 또는 배양 조건과 관련하여 사용될 때, 배지, 세포 외 기질 또는 이종 동물 유래 성분이 본질적으로 없는 배지, 세포 외 기질 또는 배양 조건을 의미한다. 인간 세포를 배양하기 위한, 마우스와 같은 비인간 동물(non-human animal)의 임의의 단백질은 이종 성분(xeno components)일 수 있다. 특정 양태에서, 제노-프리(xeno-free) 매트릭스는 본질적으로 임의의 비인간 동물 유래 성분이 없으며, 따라서 마우스 피더 세포(mouse feeder cells) 또는 Matrigel™을 배제된다. Matrigel™은 라미닌(laminin, 주요 구성 요소), 콜라겐 IV, 헤파린 황산 프로테오글리칸(heparin sulfate proteoglycans) 및 엔탁틴/니도젠(entactin/nidogen)을 포함하는 세포외 기질 단백질이 풍부한 종양인EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종(sarcoma)에서 추출한 가용화된 기저막이다.
"정의된 (defined)"이라는 용어는, 배지, 세포 외 기질 또는 배양 조건과 관련하여 사용될 때, 대략 모든 성분의 성질 및 양을 알 수 있는 나타내는 배지, 세포 외 기질 또는 배양 조건을 의미한다.
"화학적으로 정의된 배지(chemically defined medium)"는 거의 모든 성분의 화학적 성질과 그 양을 알고 있는 매체를 의미한다. 이 배지는 합성 배지(synthetic media)라고도 한다. 화학적으로 정의된 배지의 예로는 TeSR ™이 있다.
혈청, 신호 전달 억제제, 동물 성분 또는 피더 세포(feeder cells), 외인성 유전 요소 또는 벡터 요소와 같은 특정 시약 또는 특정 요소가 “실질적으로 없는"substantially free""는 10 % 미만의 요소(element)를 포함하는 경우를 의미하며 "본질적으로 없는(essentially free)"는 1 % 미만의 요소(element)를 포함하는 경우를 의미한다. 그러나 전체 세포 집단의 0.5 % 미만 또는 0.1 % 미만이 외인성 유전 요소 또는 벡터 요소를 포함하는 세포 집단이 더욱 바람직하다.
배양물, 매트릭스 또는 배지가 혈청, 신호 전달 억제제, 동물 성분 또는 피더 세포(feeder cells), 외인성 유전 요소 또는 벡터 요소와 같은 특정 시약이나 요소의"essentially free"라는 것은 배양물, 매트릭스 또는 배지가 각각 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 검출 방법을 사용하여 검출 가능한 수준보다 낮은 수준의 시약을 갖는 경우 또는 이들 물질이 배양물, 매트릭스 또는 매질에 외인성으로 첨가되지 않은 경우이다. 무혈청 배지는 본질적으로 혈청이 없을 수 있다.
"말초 혈액 세포(Peripheral blood cells)"는, 순환하는 혈액 풀에서 발견되는 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함하여 혈액의 세포 구성 요소를 의미한다.
"조혈모세포 및 전구 세포(Hematopoietic stem and progenitor cells)"또는 "조혈 전구 세포(hematopoietic precursor cells)"는 조혈 계통에 커밋(committed)되지만 추가적으로 조혈 분화가 가능하며, 조혈모세포 (hematopoietic stem cells), 다능성 조혈모세포 (multipotential hematopoietic stem cells, hematoblast), 골수계 전구 세포 (myeloid progenitors), 거핵 세포 전구 세포 (megakaryocyte progenitors), 적혈구 전구 세포 (erythrocyte progenitors) 및 림프 성 전구 세포를 포함한다. "조혈 줄기 세포 (Hematopoietic stem cells, HSC)"는 골수성(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵 세포/혈소판, 수지상 세포) 및 림프계 계통(T-세포, B-세포, NK-세포)을 비롯한 모든 혈액 세포 유형을 유발하는 다능성 줄기 세포이다.
조혈모세포 및 전구 세포(hematopoietic stem and progenitor cells)는 CD34를 발현할 수도 있고 발현하지 않을 수도 있다. 조혈모세포는 CD133을 공동 발현(co-express)할 수 있고 CD38 발현에 대해 음성, CD90에 대해 양성, CD45RA에 음성, 계통 마커에 대해 음성 또는 이들의 조합일 수 있다. 조혈 전구 세포(Hematopoietic progenitor/precursor cells)는 CD34(+)/CD38(+) 세포 및 CD34(+)/ CD45RA(+)/lin(-)CD10+ (공통 림프구 전구 세포(common lymphoid progenitor cells)), CD34(+)CD45RA(+)lin(-)CD10(-)CD62L(hi) (림포이드 프라임드 멀티포텐트 전구세포(lymphoid primed multipotent progenitor cells)), CD34(+)CD45RA(+)lin(-)CD10(-)CD123+ (과립구-단핵구 전구세포(granulocyte-monocyte progenitor cells)), CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123+ (공통 골수 전구세포(common myeloid progenitor cells)), 또는 CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123- (거핵구-적핼구 전구세포(megakaryocyte-erythrocyte progenitor cells))를 포함한다.
"벡터(vector)" 또는 "컨스트럭(construct)"(종종 유전자 전달 또는 유전자 전달 "비히클(vehicle)"이라 칭함)은 시험관내(in vitro) 또는 생체 내에서(in vivo) 숙주 세포에 전달될 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 거대 분자, 분자 복합체 또는 바이러스 입자를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 선형 또는 원형 분자일 수 있다.
벡터의 일반적인 유형인 "플라스미드(plasmid)"는 염색체 DNA와 관계없이 복제 할 수 있는 염색체 DNA와는 별개의 염색체외(extra-chromosomal) DNA 분자이다. 특정 경우에, 그것은 원형이고 이중 가닥이다.
"발현 컨스트럭(expression construct)" 또는 "발현 카세트(expression cassette)"는 전사를 지시할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 컨스트럭은 적어도 프로모터 또는 프로모터와 기능적으로 동등한 스트럭쳐(structure)를 포함한다. 인핸서(enhancer) 및/또는 전사 종결 신호와 같은 추가 요소가 더 포함될 수 있다.
"외인성(exogenous)"이라는 용어는, 세포 또는 생물체에서 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때, 인공적 수단에 의해 세포 또는 생물체에 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또는, 세포와 관련하여, 인공적 수단에 의해 분리되고 이후 다른 세포 또는 유기체에 도입된 세포를 의미한다.
외인성 핵산은 다른 유기체 또는 세포로부터 유래될 수 있거나, 또는 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가 복제물 (additional copies)일 수 있다. 외인성 세포는 다른 유기체 또는 동일한 유기체로부터 유래할 수 있다. 비제한적 예(non-limiting example)로서, 외인성 핵산은 자연 세포와 다른 염색체 위치에 있거나, 그렇지 않으면 자연계에서 발견되는 것과는 다른 핵산 서열이 측면에 위치한다.
"에 상응한다 (corresponds to)"라는 용어는 폴리뉴클레오타이드 서열이 기준(reference) 폴리뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부와 상동성(즉, 동일함(is identical), 엄격히 진화적으로 관련되는 것은 아님 (not strictly evolutionarily related))이 있거나, 또는 폴리펩티드 서열이 기준 폴리펩티드 서열과 동일한 것을 의미한다. 반대로, " 에 상보적인(complementary to)"이라는 용어는 상보적 서열이 기준 폴리뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부와 상동임을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열 "TATAC"은 기준서열 "TATAC"에 상응하고 기준서열 "GTATA"에 상보적이다.
특정 단백질을 "암호화하는(encodes)" "유전자(gene)", "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)", "코딩 영역(coding region)", "서열(sequence)", "세그먼트(segment)", "단편(fragment)" 또는 "도입 유전자(transgene)"는 전사되는 핵산 분자이며 적절한 조절 서열의 조절 하에 놓여질 때 시험관 내 또는 생체 내에서(in vitro or in vivo) 선택적으로 유전자 생성물, 예를 들어 폴리 펩타이드로 번역된다. 코딩 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 때, 핵산 분자는 단일 가닥 (즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥 일 수 있다. 코딩 영역의 경계는 5 '(아미노) 말단의 개시 코돈 및 3'(카복시) 말단의 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 유전자는 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전사 종결 서열은 일반적으로 유전자 서열의 3 '에 위치 할 것이다.
"세포"라는 용어는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 다세포 생물의 조직 구조 단위인 생체를 지칭하며, 세포 구조를 외부와 격리시키는 막 구조로 둘러싸여 있으며, 자기 복제 능력, 유전 정보 및 그것을 발현하기 위한 메커니즘을 가지고 있다. 본원에서 사용된 세포는 자연 발생 세포 또는 인위적으로 변형된 세포 (예: 융합 세포, 유전적으로 변형된 세포 등)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "줄기 세포 (stem cell)"는 자기-복제 (self-replication) 및, 다능성(pluripotency) 또는 다능성(multipotency)을 가질 수 있는 세포를 의미한다. 일반적으로 줄기 세포는 손상된 조직을 재생할 수 있다. 줄기 세포는 배아줄기(ES)세포 (embryonic stem (ES) cells), 유도만능줄기 세포(induced pluripotent stem cells) 또는 조직줄기세포(조직 특이적 줄기 세포 또는 체세포 줄기 세포라고도 함) 일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
"배아줄기(ES)세포(Embryonic stem (ES) cells)"는 초기 배아에서 유래된 다능성 줄기 세포이다. ES 세포는 1981년에 처음으로 확립되었으며, 1989 년부터 녹아웃 마우스 생산에도 적용되었다. 1998 년에 인간 ES 세포가 확립되어 현재 재생 의학에 사용 가능한 상태이다.
ES 세포와 달리 조직 줄기 세포는 제한된 분화능을 가지고 있다. 조직 줄기 세포는 조직의 특정 위치에 존재하며 미분화된 세포내 구조 (intracellular structure)를 가지고 있다.　따라서 조직 줄기 세포의 다능성은 일반적으로 낮다.
　조직 줄기 세포는 핵/세포질 비율이 높고 세포내 소기관이 거의 없다. 대부분의 조직 줄기 세포는 낮은 다능성(pluripotency), 긴 세포주기, 그리고 개체의 라이프 이상의(beyond the life of the individual) 증식(proliferative) 능력이 있다. 조직 줄기 세포는 진피계, 소화계, 골수계, 신경계 등과 같이 세포 유래 부위(sites)를 기준으로 분류된다. 진피 조직의 조직 줄기 세포는 표피 줄기 세포, 모낭 줄기 세포 등을 포함한다. 소화계의 조직 줄기 세포는 췌장 (공통) 줄기 세포, 간 줄기 세포 등을 포함한다. 골수계의 조직 줄기 세포는 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 등을 포함한다.　신경계의 조직 줄기 세포는 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포 등을 포함한다.
일반적으로 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭되는 "유도다능성줄기세포(Induced pluripotent stem cells)"는, 재프로그래밍 인자 (reprogramming factors)로 지칭되는 특정인자를 도입함으로써, 비다능성 세포, 전형적으로 성체 체세포 (adult somatic cell), 또는, 섬유아세포, 조혈 세포, 근육 세포, 신경 세포, 표피 세포 등과 같은 말단 분화 세포 (terminally differentiated cell)로부터 인위적으로 제조된 다능성 줄기 세포의 유형을 지칭한다.
"다능성(Pluripotency)"은 하나 이상의 조직 또는 장기를 구성하는 모든 세포로, 특히 세 가지 배엽층(germ layers 중 하나 (내장 위, 위장관, 폐)로 분화 할 수 있는 줄기 세포를 의미한다: 내배엽 (내부 위장층(interior stomach lining), 위장관, 폐), 중배엽 (근육, 뼈, 혈액, 비뇨 생식기) 또는 외배엽 (표피 조직 및 신경계). 본원에서 사용된 "다능성 줄기 세포"는 세 가지 배엽층 중 임의의 것에서 유래된 세포, 예를 들어 전능 세포 (totipotent cells) 또는 유도된 다능성 세포(induced pluripotent cells)의 직계 자손(direct descendants)으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다.
핵산 분자와 관련하여 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 2 개 이상의 핵산 분자 (예를 들어, 전사될 핵산 분자, 프로모터 및 인핸서 요소)가 핵산 분자가 핵산분자의 전사를 허용하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 　펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 분자와 관련하여 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란 2 개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 분자가 단일 폴리펩타이드 사슬, 즉 융합체(the fusion)의 각 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분 중 하나 이상의 특성을 갖는 융합 폴리펩타이드를 생성하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 융합 폴리펩타이드는 특히 키메라(chimeric), 즉, 이종 분자(heterologous molecules)로 구성된다.
Ⅲ. T 세포 수용체 (TCR) 및 외인성 TCR 생성 방법(T Cell Receptor (TCR) and Methods for Generating exogenous TCRs)
T 세포 수용체 또는 TCR은 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 펩타이드로서 항원 단편(fragments)을 인식하는 T 림프구 (T 세포)의 표면에서 발견되는 분자이다. TCR은 두 개의 서로 다른 단백질 사슬 (즉, 헤테로다이머)로 구성됩니다. 인간의 T 세포의 95 %에서, TCR은 알파 (α; 본원에서 "a"로도 지칭됨) 및 베타 (β - 본원에서 "b"로도 지칭됨) 사슬로 구성되는 반면, 5 %의 T 세포에서, TCR은 감마 및 델타 (γ/δ) 사슬로 구성된다. 이 비율은 개체 발생(ontogeny) 동안과 질병 상태에서(in diseased states) 뿐만 아니라 다른 종에서(in different species) 변화한다.
TCR이 항원성 펩티드 및 MHC (펩타이드/ MHC)와 결합할 때, T 림프구는 신호 전달(signal transduction), 즉 관련 효소, 보조 수용체, 특수화된 어댑터 분자 및 활성화거나 방출된 전사 인자에 의해 매개되는 일련의 생화학적 이벤트를 통해 활성화된다. TCR은, 일반적으로 불변 CD3 사슬 분자를 갖는 복합체의 일부로 표현되는 매우 가변적인 알파 (α) 및 베타 (β) 사슬로 구성된 이황화물-결합 막-닻형 이종이량체 단백질 (disulfide-linked membrane-anchored heterodimeric protein) 이다. 비록 소수의 T 세포가 γδ (또는 gd)로 불리는 가변 감마(γ- 본원에서 "g"로도 지칭됨) 및 델타 (δ- 본원에서 "d"로도 지칭됨) 사슬에 의해 형성되는 다른 수용체를 발현하지만, 이 수용체를 발현하는 T 세포를 α:β (또는 αβ 또는 ab) T 세포라고 한다.
각 사슬은 두 개의 세포외 도메인으로 구성된다: 역평행 β 시트를 형성하는 면역글로블린상과(Immunoglobulin superfamily, IgSF) 도메인의 양쪽 모두에 해당하는, 가변 (V, Variable) 영역 및 불변 (C, Constant) 영역. 가변 영역은 펩타이드/ MHC 복합체에 결합하는 반면, 불변 영역은 세포막에 인접하고, 이어서 막 횡단 영역 및 짧은 세포질 꼬리가 있다. TCR α 사슬과 β 사슬 모두의 가변 도메인은 3 개의 초가변(hypervariable) 또는 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, CDR)을 갖는 반면, β 사슬의 가변 영역에는 추가의 초가변 영역 (HV4)이 있으며, 이는 일반적으로 항원과 접촉하지 않으므로 CDR로 간주되지 않는다.
잔기는, CD3 신호 전달 복합체에 근접한 것으로 생각되는 β- 사슬 골격 영역 및 α 및 β 사슬의 계면에서, TCR의 두 영역에 위치한다. 비록 알파 사슬의 CDR1이 항원 펩타이드의 N 말단 부분과 상호 작용하는 것으로 나타나고, 반면 β 사슬의 CDR1은 CDR의 C 말단 부분과 상호 작용하는 나타났지만, CDR3은 가공된 항원(processed antigen)을 인식하는 주요 CDR이다. CDR2는 MHC를 인식하는 것으로 여겨진다. β- 사슬의 CDR4는 항원 인식에 관여하는 것으로 생각되지 않지만, 초항원(superantigens)과 상호 작용하는 것으로 나타났다. TCR 도메인의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하는 짧은 연결 서열로 구성되며, 이 연결은 두 사슬 사이의 연결 고리를 형성한다.
TCR이 IgSF 단백질의 멤버라는 것은 항체 및 BCR과 비교될 수 있음을 의미한다. 유사성 측면에서, TCR은, 중쇄가 결정화 가능한 분획 (Fc)이 없는 것을 제외하고는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체의 절반(half an antibody)과 유사하다(참고: 개체발생적으로(ontogenically) TCR 알파는 VJ 재조합을 거치므로 경쇄와 유사하다; TCR 베타는 VDJ 재조합을 거치므로 중쇄와 같다.)
따라서 TCR은 개체발생적으로(ontogenically) 항체의 항체-결합 단편(antibody-binding fragments) 중 하나와 유사하다. 두 개의 TCR 서브 유닛은 함께 꼬여 있다. 항체가 고유의 백혈구상의 Fc 수용체에 결합하기 위해 Fc 영역을 사용하는 반면, TCR은 이미 세포막에 도킹되어 있다. 그러나 짧은 세포질 꼬리(short cytoplasmic tail)로 인해 신호 전달 자체를 매개할 수 없기 때문에, TCR은, 항체가 신호 전달을 시작하기 위해 FcR에 결합해야 하는 것처럼, 그 자리에서 신호 전달을 수행하는 CD3과 제타 (zeta)가 필요하다. 이러한 방식으로 T 세포에 대한 MHC-TCR-CD3 상호 작용은 골수 백혈구에 대한 Ag-Ig-FcR 상호 작용 및 B 세포에 대한 Ag-Ig-CD79 상호 작용과 기능적으로 유사하다.
항원 특이적 TCR을 생성시키는 방법은 당 업계에 공지되어있다. 예를 들어, 방법은 1) 관심있는 단백질 (예를 들어, 종양 항원, 시퀀싱 데이터로부터의 신생 항원 등)으로부터 유래된 공지 또는 예측된 HLA-제한 펩타이드 에피토프의 합성; 2) TCR 서열이 추출될 T 세포 풀(예 : 종양 -AG 특이 적 T 세포의 경우 종양 침윤 림프구)에 대한 항원제시세포(확장용) 또는 테트라머(직접 분류용)를 통해 이들을 제시; 3) 항원 특이적인 T 세포에 대한 선택 또는 스크리닝(예: 테트라머 결합에 기초한 항원 특이적인 T 세포를 분류하는 FACS); 4) TCR 유전자 (즉, TCR의 알파 및 베타 사슬 또는 감마 및 델타 사슬)의 클로닝 (RT-PCR을 통한) 및 시퀀싱; 클로닝 및 시퀀싱은 집단 또는 단일 세포 수준에서 수행 될 수 있다; 및 5) 예를 들어 이러한 시퀀스를 갖는 말초 혈액 T 세포를 형질도입(transducing)하고 동족 펩타이드 -MHC 복합체를 발현하는 표적 세포에 대한 반응성을 평가하여 TCR 클로닝의 기능을 테스트함으로써 TCR 특이성을 확인 및 분석. 반응성은 대개 사이토카인(cytokine) 생산 (예를 들어, 인터페론 감마)에 기초하여 측정된다.
Ⅳ. 세포 배양 조성물 및 방법(Cell Culture Compositions and Methods)
인공 흉선 오가노이드(artificial thymic organoids, ATO)와 같은 3D 배양 조성물은, 시험관 내에서(in vitro) 줄기 세포에서 인간 T 세포 생성을 위한, 최적화되고 효율적이며 재현성 높은 기성 용액 (off-the-shelf solution)이다. T 세포 분화에 대한 기존의 실험 모델과는 달리, 3D 배양 조성물의 특정 측면(certain aspects)은 무-혈청 조건을 사용하고, 인간 흉선 조직 또는 독점적 스캐폴드 머티리얼(proprietary scaffold materials)의 사용을 피하고, 양성 선택 및 줄기세포로부터 완전 기능성의 성숙한 인간 T 세포의 강력한 생성(robust generation) 을 용이하게 한다. 생체 외 T 세포 개발을 위한 상용 플랫폼으로서, 3D 배양 조성물은 경쟁 기술에 비해 효율, 재현성, 확장성, 비용 및 인력 절감을 제공한다. 비제한적 상업적 응용(Non-limiting commercial applications)에는 인간 T 세포 발생의 시험관 내(in vitro) 실험 모델링 및 다양한 줄기 세포 공급원으로부터 조작된 T 세포 면역 요법 (immunotherapies) 의 생체 외 (in vitro) 생산이 포함될 수 있다.
특정 실시예에서, 인간 줄기 및/또는 전구 세포 (HSPC)로부터 기능성 T 세포의 시험관 내(in vitro) 생성을 위해 최적화된 3 차원 (3D) 배양 시스템이 제공될 수 있다. 생성된 세포 3D 구조는 인공 흉선 오가노이드(artificial thymic organoids, ATO)라고 불릴 수 있다.
특정 실시예에서, 이 시스템은 FLT3 리간드 (FLT3L), 인터루킨 7 (IL-7), B27 및 아스코르브산을 함유하는 최적화된 배지의 존재 하에서, Notch 리간드를 발현하는 스트로마 세포(stromal cells)를 갖는 인간 HSP의 3D 구조에서의 응집체를 포함할 수 있다. 공기 - 액체 계면에서의 배양을 가능하게 하는 조건도 존재할 수 있다. 조혈 세포와 스트로마 세포 간의3D 세포-세포 상호 작용과 함께 용해성 인자 (사이토카인, 아스코르브산, B27 성분 및 스트로마 세포 - 유도 인자)로부터 ATO 내의 조합 시그널링(combinatorial signaling)이 인간 T 계통 커밋먼트(lineage commitment), 양성 선택 및 기능적이고 성숙한 T 세포로의 효율적인 분화를 촉진시키는 것으로 결정되었다.
특정 실시예에서, 개발된 바와 같이, 인간 제대혈, 골수 또는 G-CSF 동원된 말초 혈액(mobilized peripheral blood)로부터 분리된CD34 + HSPCs와 함께 인간 DLL1 (이하, MS5-hDLL1)로 형질 도입된 MS-5 뮤린 스트로마 세포주의 응집을 포함하는 3D 배양 조성물 (예: ATO 생산)의 방법이 제공 될 수 있다. 최대 1x106 HSPCs는 MS5-hDLL1 세포와 최적화된 비율로 혼합된다 (일반적으로 1:10 HSPCs to stromal cells).
예를 들어, 응집은 혼합된 세포 현탁액의 원심 분리 ("압축 응집") 이후 세포가 없는 상층액(cell-free supernatant)의 흡인(aspiration)에 의해 이루어 진다. 특정 실시예에서, 세포 펠릿은 5~10 ㎕의 분화 배지에서 슬러리로서 흡인되어(be aspirated as a slurry) 0.4 ㎛의 나일론 트랜스 웰 배양 인서트 상에 액적으로서 옮겨지고, 이는 웰의 분화 배지에 부유되어, 인서트의 바닥이 는 배지와 접촉하고 상단은 공기와 접촉하도록 허용한다.
예를 들어, 분화 배지는 RPMI-1640, 5 ng/ml 인간 FLT3L, 5 ng/ml 인간 IL-7, 4 % 세럼-프리 B27 보충물 및 30 uM L-아스코르브산으로 구성된다. 배지는 배양물 인서트 주변으로부터(from around the culture inserts) 3-4일마다 완전히 교체될 수 있다. 배양의 처음 2 주 동안, 세포 응집체는 AT로 자가- 조직(self-organize) 할 수 있으며 조기 T 세포 계통 커밋먼트(early T cell lineage commitment)와 분화가 일어난다. 특정 측면에서, ATO는 최적의 T 세포 분화를 가능하게 하기 위해 적어도 6 주 동안 배양된다. ATOs로부터 조혈 세포를 회수하는 것은 피펫팅 (pipetting)으로 ATOs를 분해함으로써 달성된다. 이 프로토콜의 변형은 구체적으로 효능에 다양한 영향을 미치는 대체 성분의 사용을 허용한다.
기본 배지 RPMI는 상업적으로 이용 가능한 몇 가지 대체물(예: IMDM)로 대체될 수 있다.
사용된 스트로마 세포주는 이전에 기술된 쥐 골수 세포주 (Itoh et al, 1989) 인 MS-5이지만, 유사한 마우스 스트로마 세포주 (예: OP9, S17), 인간 스트로마 세포주 (예: HS-5, HS-27a), 일차 인간 스트로마 세포 또는 인간 다능성 줄기세포-유래 스트로마 세포로 대체될 수 있다.
스트로마 세포주는 인간 DLL1 cDNA를 코딩하는 렌티 바이러스로 형질 도입된다. 그러나 노치(Notch) 리간드 유전자뿐만 아니라 유전자 전달 방법은 다양할 수 있다. 다른 노치(Notch) 리간드 유전자는 DLL4, JAG1, JAG2 등을 포함한다.
노치 리간드는 또한 미국 특허 제 7795404 호 및 제 8377886 호에 기술된 것을 포함하며, 이들은 본원에 참고로 포함된다. 노치 리간드는 델타 1, 3 및 4 및 재기드(Jagged) 1,2를 추가로 포함한다.
HSPC의 유형 및 출처는 골수, 제대혈, 말초혈, 흉선 또는 다른 주요 공급원; 또는 인간 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)에서 유래 한 HPSC를 포함할 수 있다.
사이토카인(Cytokine) 조건은 다양할 수 있다: 예로, FLT3L 및 IL-7의 수준은 T 세포 분화 동역학(kinetics)을 변화시키기 위해 변화될 수 있다; 줄기 세포 인자 (SCF/KIT 리간드), 트롬보포이에틴(thrombopoietin, TPO), IL-2, IL-15와 같은 다른 조혈 사이토카인이 첨가될 수 있다.
유전자 변형은 또한 항원 특이적 T 세포를 생성하고 양성 및 음성의 선택을 모델링하기 위해 특정 성분에 도입 될 수 있다. 이러한 변형의 예는 다음과 같다: 항원 특이적, 대립적으로 배제된 나이브 T 세포 (antigen-specific, allelically excluded naive T cells)의 생성을 위한 항원 특이적 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 렌티 바이러스 벡터로 HSPC의 형질 도입; 특수화된 림프구(specialized lymphoid) 세포로의 직접적 계통 커밋먼트(direct lineage commitment)를 위한 유전자를 가진 HSPC의 형질 도입. 예를 들어, ATOs에서 기능성 iNKT 세포를 생성하기 위하여 불변의 자연 살해 T 세포 (iNKT) 관련 TCR을 이용한 HSPC의 형질 도입; ATO에서 TCR 조작된 또는 조작되지 않은 T 세포 모두의 양성 선택 및 성숙을 향상시키기 위해 인간 MHC 유전자를 이용한 ATO 스트로마 세포주 (e.g., MS5-hDLL1)의 형질 도입; 및/또는ATO에서 CAR T 세포의 양성 선택을 향상시키기 위해 항원 + 보조 자극 분자 (antigen plus costimulatory molecules) 또는 사이토카인을 이용한 ATO 간질 세포주의 형질 도입.
Ⅴ. 세포 배양 조건(Cell Culture Conditions)
세포 배양 조건은 본원에 기술된 3D 세포 응집체의 배양 및 T 세포의 생산 및/또는 이의 양성/음성 선택을 위해 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 선택된 집단의 출발 세포(starting cells)는 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 개의 세포 또는 그 중에서 유도할 수 있는(derivable) 임의의 범위를 포함 할 수 있다. 상기 출발 세포 집단은 적어도 약 10, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 세포/ml 또는 그 중에서 유도할 수 있는 임의의 범위의 파종 밀도(seeding density)를 가질 수 있다.
B. 배양 용기(Culture Containers)
3D 세포 응집체 또는 이의 자손 세포(progeny cells)를 배양하는데 사용되는 배양 용기는 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양 용 접시, 멀티 접시, 마이크로 플레이트, 마이크로 슬라이드 플레이트, 멀티 슬라이드 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CellSTACK® Chamber, 배양 백, 롤러 병 등을 포함할 수 있다. 줄기 세포는, 배양 니즈(needs)에 따라, 적어도 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 800 ml, 1000 ml, 1500 ml 또는 그 중에서 유도할 수 있는 임의의 범위의 부피에서 배양될 수 있다. 일 실시예에서, 배양 용기는 생물학적 활성 환경을 지지하는 임의의 장치 또는 시스템으로 지칭될 수 있는 생물 반응기 일 수 있다. 　생물 반응기는 적어도 약 2,4,5,6,8,10,15,20,25,50,75,100,150,200,500 리터의 부피를 가질 수 있고, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 입방 미터 또는 그로부터 유도할 수 있는 임의의 범의의 볼륨을 가질 수 있다.
배양 용기는 세포 접착성 또는 비접착성일 수 있으며 목적에 따라 선택 될 수 있다. 세포 접착성 배양 용기는 혈관 표면의 세포에 대한 접착성을 향상시키기 위해 세포외 매트릭스 (ECM)와 같은 세포 접착을 위한 임의의 기질로 코팅 될 수 있다. 세포 접착을 위한 기질(substrate)은 줄기 세포 또는 피더 세포(사용되는 경우)를 부착시키는 임의의 물질일 수 있다. 세포 접착을 위한 기질은 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 라미닌 및 피브로넥틴 및 이들의 혼합물, 예를 들어 마트리겔 (MatrigelTM) 및 용해된 세포막 준비물 (lysed cell membrane preparations)을 포함한다.
C. 매트릭스 구성 요소(Matrix components)
다양한 정의된 매트릭스 성분이 배양 방법 또는 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 참고로 인용되는Ludwig et al. (2006a; 2006b)에 기술된 것처럼, 재조합 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴 (vitronectin)을 조합하여, 다능성 세포 성장을 위한 고체 지지체를 제공하는 수단으로서, 배양 표면을 코팅할 수 있다.
　　매트릭스 조성물은 세포에 대한 지지체를 제공하기 위해 표면 상에 고정화 될 수 있다. 매트릭스 조성물은 하나 이상의 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 및 수성 용매를 포함할 수 있다. 용어 "세포 외 기질 (extracellular matrix)"은 당업계에 공지되어있다. 그 구성 요소는 다음 단백질 중 하나 이상이 포함된다: 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), 테나신(tenascin), 엔탁틴(entactin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 엘라스틴(elastin), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 피브릴린(fibrillin), 메로신(merosin), 앵코린(anchorin), 콘드로넥틴(chondronectin), 링크 프로테인(link protein), BSP(bone sialoprotein), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오폰틴(osteopontin), 에피넥틴(epinectin), 히알루로넥틴(hyaluronectin), undulin(운둘린), 에필리그린(epiligrin) 및 카리닌(Kalinin)이 있다.
다른 세포 외 기질 단백질은 문헌 [Kleinman et al., (1993)]에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용된다. "세포외 매트릭스"라는 용어는 미래에 발견될 수 있는 현재 알려지지 않은 세포외 매트릭스를 포함하며, 이는 세포 외 매트릭스로서의 그 특성이 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있기 때문이다.
일부 측면에서, 매트릭스 조성물 중의 총 단백질 농도는 약 1 ng/mL 내지 약 1 mg mL 일 수 있다. 일부 실시예에서, 매트릭스 조성물 중의 총 단백질 농도는 약 1㎍/mL 내지 약 300㎍/mL이다. 보다 바람직한 양태에서, 매트릭스 조성물 중의 총 단백질 농도는 약 5㎍/mL 내지 약 200㎍/mL이다.
세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질은 천연 기원일 수 있고 인간 또는 동물 조직으로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, ECM 단백질은 유 전적으로 조작된 재조합 단백질이거나 자연적으로 합성된 것일 수 있다. ECM 단백질은 전체 단백질이거나 펩타이드 단편(fragments)의 형태로, 천연 또는 조작될 수 있다. 세포 배양을 위한 기질에 유용할 수 있는 ECM 단백질의 예는 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴(fibronectin) 및 비트로넥틴 (vitronectin)을 포함한다. 일부 실시예에서, 매트릭스 조성물은 합성적으로 생성된 피브로넥틴 또는 재조합 피브로넥틴의 펩타이드 단편(fragments)을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 기질 조성물은 적어도 피브로넥틴 및 비트로 펙틴의 혼합물을 포함한다. 일부 다른 실시예에서, 기질 조성물은 바람직하게는 라미닌을 포함한다.
기질 조성물은 단일 유형의 세포외 매트릭스 단백질을 포함하는 것이 바람직하다. 일부 실시예에서, 기질 조성물은 특히 전구 세포 배양과 함께 사용하기 위해 피브로넥틴을 포함한다. 예를 들어, 적절한 기질 조성물은, Becton, Dickinson & Co. Franklin Lakes, NJ (BD) (Cat # 354008), Dulbecco 인산염 완충 식염수 (DPBS)에서의 5㎍ / mL 내지 200㎍ / mL의 단백질 농도로 판매되는 인간 피브로넥틴과 같은, 인간 피브로넥틴을 희석함으로써 제조될 수 있다. 특정 예에서, 기질 조성물은 RetroNectin®과 같은 피브로넥틴 단편 (fibronectin fragment)을 포함한다. 　 RetroNectin®은, 중심 세포 결합 도메인 (III 형 반복(type III repeat), 8,9,10), 고친 화성 헤파린 결합 도메인 II (III 형 반복, 12,13, 14), 및 인간 피브로넥틴의 택일적으로 접합 된 IIICS 영역 내의 CS1 부위를 포함하는, ~ 63 kDa 단백질 (574 아미노산)이다.
일부 다른 구체 예에서, 기질 조성물은 라미닌을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 기질 조성물은 라미닌 (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)을 희석함으로써 제조될 수 있다; Cat # L6274 및 L2020) Dulbecco 인산염 완충 식염수 (DPBS)에서의5㎍/ml 내지 약 200㎍/ml의 단백질 농도.
일부 실시예에서, 기질 조성물은, 기질 또는 그 구성요소 단백질이 인간 기원에만(only of human origin) 있다는 점에서, 제노-프리(xeno-free)이다. 이는 특정 연구 응용 분야에 필요할 수 있다. 예를 들어, 인간 세포를 배양하기 위한 제노-프리 기질(xeno-free matrix)에서, 인간 기원의 기질(매트릭스) 성분이 사용될 수 있으며, 임의의 비인간 동물 성분은 배제 될 수 있다. 특정 양태에서, MatrigelTM은 배양 조성물로부터 기질로서 배제될 수 있다. . MatrigelTM은 마우스 종양 세포에 의해 분비된 젤라틴성 단백질 혼합물이며, BD Biosciences (New Jersey, USA)에서 시판 중이다. 이 혼합물은 많은 조직에서 발견되는 복잡한 세포외 환경과 유사하며 세포 배양을 위한 기질로서 세포 생물 학자에 의해 빈번하게 사용되지만 원치 않는 이종 항원 또는 오염 물질을 도입 할 수 있다.
Ⅵ. 선택 가능하거나 스크리닝 가능한 마커(Selectable or Screenable Markers)
특정 실시예에서, 외인성 핵산을 함유하는 세포는 발현 벡터 또는 외인성 핵산에 마커를 포함시킴으로써 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 동정될 수 있다. 그러한 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 허용하는 세포에 확인 가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로 선택 마커는 선택을 허용하는 속성을 부여하는 선택 마커일 수 있다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 허용하는 것이고, 음성 선택 마커는 그 존재가 선택을 방해하는 것일 수 있다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로 약물 선택 마커의 포함은 형질 전환체(transformants) 의 클로닝과 동정을 돕는다. 예를 들어, 네오마이신(neomycin), 퓨로마이신 (puromycin), 하이그로마이신 (hygromycin), DHFR, GPT, 제오신(zeocin) 및 히스티디놀(histidinol)에 대한 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 조건의 구현에 기초한 형질 전환체의 판별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커 이외에, 비색 분석(colorimetric analysis)에 기초하는 GFP와 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함하는 다른 유형의 마커도 또한 고려된다. 대안으로, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (thymidine kinase, tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (chloramphenicol acetyltransferase, CAT)와 같은 음성 선별 마커로서 스크리닝 가능한 효소가 이용될 수 있다. 당업자는 FACS 분석과 함께 면역 마커를 사용하는 방법을 알고 있을 것이다. 사용된 마커는, 유전자 산물을 코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한은, 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선택 및 스크리닝 가능한 마커의 추가의 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.
선택 가능한 마커는, 형질감염 또는 외래 DNA를 세포 내로 도입시키는 것을 의미하는 다른 프로시져(procedure)의 성공을 나타내기 위해, 실험실 미생물학, 분자 생물학 및 유전 공학에 사용되는 리포터 유전자 유형을 포함할 수 있다. 선택 가능한 마커는 종종 항생제 내성 유전자이다;외래 DNA를 도입하는 과정을 거친 세포는 항생제를 함유하는 배지에서 성장하고, 성장할 수 있는 세포는 도입된 유전 물질을 성공적으로 흡수 및 발현한다. 선택 가능한 마커의 예는 다음과 같다: 제네틴(geneticin)에 대한 항생제 내성을 부여하는 Tn5의 Abicr 유전자 또는 Neo 유전자(Abicr gene or Neo gene from Tn5).
스크리닝할 수 있는 마커(Screenable marker)는 리포터 유전자를 포함 할 수 있는데, 이는 연구원이 원하는 세포와 원치 않는 세포를 구별 할 수 있게 한다. 본 발명의 특정 실시예에서는, 특정 세포 계통 (specific cell lineages) 을 나타내기(indicate) 위하여 리포터 유전자를 이용한다. 예를 들어, 리포터 유전자는 발현 요소 내에 있을 수 있고, 동시 발현을 위한 심실- 또는 심방- 선택 유전자의 코딩 영역과 통상 연관되는 심실- 또는 심방- 선택 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다. 리포터는 특정 계통(specific lineage)의 세포가 약물이나 다른 선택 압력하에 놓이지 않거나 그렇지 않으면 세포 생존력을 위험에 빠뜨리지 않고 격리되도록 허용한다.
이러한 리포터의 예로는 세포 표면 단백질 (예: CD4, HA 에피토프), 형광 단백질, 항원 결정기 및 효소 (예: β-갈락토시다아제)를 코딩하는 유전자가 있다. 세포를 함유하는 벡터는, 예를 들어, 세포 표면 단백질에 대한 형광 태그 항체(fluorescently-tagged antibodies) 또는 벡터 인코딩 효소(vector encoded enzyme)에 의해 형광 생성물로 전환될 수 있는 기질을 사용하여 FACS에 의해 단리(분리)될 수 있다.
특정 실시예에서, 리포터 유전자는 형광 단백질이다. 거의 모든 가시 광선 스펙트럼에 걸친 형광 방출 스펙트럼 프로파일을 특징으로 하는 광범위한 형광 단백질 유전 변이 (fluorescent protein genetic variants)가 개발되었다(비 제한적인(non-limiting) 예는 표 1 참조).
오리지널(original) 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) 해파리 녹색 형광 단백질의 돌연변이 유발 노력(Mutagenesis efforts)으로 인해 파란색에서 노란색으로 변하는 새로운 형광 프로브가 생겨 났으며 생물학적 연구에서 가장 널리 사용되는 생체 내 리포터 분자 중 일부이다. 　주황색과 적색 스펙트럼 영역에서 방출되는 더 긴 파장의 형광 단백질은 마린 아네모네(marine anemone), 디스코소마 스트리아타(Discosoma striata), 및 클래스 산호충강(class Anthozoa)에 속하는 산호초(reef corals)에서 개발되었다. 또 다른 종은 청록색 cyan), 녹색, 황색, 주황색 및 진한 적색 형광 방출을 갖는 유사한 단백질을 생산하기 위해 채광되어 왔다. 형광 단백질의 밝기와 안정성을 향상시키기 위한 개발 연구가 진행되고 있어 전반적인 유용성이 향상될 수 있다.
[표 1]
형광 단백질 물성(Fluorescent Protein Properties)
Figure pct00002
Figure pct00003
Ⅶ. 외인성 유전자 편집 (Exogenous Gene Editing)
특정 실시예에서, 조작된 뉴클레아제는 본원에서 사용된 임의의 세포, 특히 배양 방법 또는 조성물에서 스트로마 세포 또는 줄기 세포 또는 전구 세포와 같은 출발 세포의 유전자 변형을 위한 외인성 핵산 서열을 도입하는데 사용될 수 있다.
게놈 편집 또는 조작된 뉴클레아제를 이용한 게놈 편집(genomic editing with engineered nucleases, GEEN)는 인위적으로 조작된 뉴클레아제 또는 "분자 가위(molecular scissors)"를 이용하여 게놈으로부터 DNA가 삽입, 교체 또는 제거되는 유전 공학의 한 유형이다. 뉴클레아제는 게놈의 원하는 위치에서 특정 이중 가닥 브레이크 (DSB)를 생성하고, HR (homologous recombination)과 NHEJ (nonhomologous end-joining)의 자연 과정(natural processes)에 의해 유도된 브레이크(break)를 리페어하기 위해 세포의 내생 메커니즘(endogenous mechanisms)을 이용한다.
비제한적으로 설계된 뉴클레아제 (Non-limiting engineered nucleases)에는 다음이 포함된다: 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc finger nucleases, ZFNs), 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALENs), CRISPR/Cas9 시스템, 및 조작된 메가뉴클레아제 재조합 호밍 엔도뉴클레아제(engineered meganuclease re-engineered homing endonucleases). 당업계에 공지된 임의의 조작된 뉴클레아제는 방법 및 조성물의 특정 양태의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
일반적으로 유전자 분석에서 유전자 기능 또는 단백질 기능을 이해하기 위해서는 서열 특이적인 방식으로 그 기능을 감시하고 그 생물에 미치는 영향을 모니터링 해야 한다. 그러나 일부 생물체에서는 부위 특이적 돌연변이 유발 (site-specific mutagenesis)을 수행하는 것이 어렵거나 불가능하므로 짧은 RNA 간섭 (siRNA)으로 관심 유전자를 억제 (silencing)하는 것과 같은 더 간접적인 방법을 사용해야 한다. 그러나 siRNA에 의한 유전자 파괴는 다양하고 불완전 할 수 있다. ZFN과 같은 뉴클레아제를 이용한 게놈 편집은 조작된 뉴클라아제가 DNA 결합 특이성(DNA-binding specificity)을 변형할 수 있으므로 원칙적으로 게놈의 모든 표적 위치를 절단할 수 있으며, 통상적인 RNA에 의해 특이적으로 표적화할 수 없는 유전자에 대한 내인성 서열(endogenous sequences)의 변형을 도입할 수 있다. 또한, 두 개의 ZFN이 표적의 일부분을 인식하는데 필요하고 인접한 시퀀스로 직접 이어지기 때문에, ZFN과 TALEN의 특이성은 향상된다.
미생물 종에서 흔히 발견되는 메가뉴클레아제는 매우 긴 인식 서열 (> 14bp)을 갖는 특유의 특성을 지니고 있어 자연적으로 매우 특이적이다. 이것은 게놈 편집에서 부위-특이적 (site-specific) DSB를 만들기 위해 악용될 수 있다; 그러나 문제는 가능한 모든 표적 서열을 커버하기에는 충분하지 않은 메가뉴클레아제가 알려져 있거나 알려질 수 있다는 것이다. 이 과제를 극복하기 위해 돌연변이 유발 및 고처리량 스크리닝 방법(high throughput screening methods)을 사용하여 독특한 서열을 인식하는 메가뉴클레아제 변종을 만들었다. 다른 사람들은 다양한 메가뉴클레아제를 융합시키고 새로운 서열을 인식하는 하이브리드 효소를 만들 수 있었다. 그러나 다른 사람들은 합리적으로 설계된 메가뉴클레아제라는 이름으로 명명된 방법으로 서열 특이적 메가뉴클레아제를 디자인하기 DNA 상호 작용 아미노산(the DNA interacting aminoacids)을 변형시키려고 시도하였다(미국 특허 제 8,021,867 B2 호, 본원에 참고로 포함됨).
메가뉴클레아제(Meganuclease)는 ZFN과 같은 방법에 비해 세포 독성을 줄이는 이점이 있다. 이는 더 엄격한 DNA 서열 인식 때문일 것이다; 그러나, 가능한 모든 서열에 대한 서열 특이적 효소의 구축은, ZFN 및 TALEN가 이용하는 방법의 조합 가능성으로부터 이익을 얻지 못하기 때문에, 값 비싸고 시간 소모적이다. 따라서 장점과 단점이 있다.
메가뉴클레아제(meganucleases)와 대조적으로, ZFNs와 TALENs의 개념은 비특이적인 DNA 절단 효소에 더 많이 기초를 둔다. 그런 효소는 징크 핑거 (zinc finger)와 전사 활성제 유사-이펙터(transcription activator-like effectors, TALEs)와 같은 펩타이드를 인식하는 특정 DNA 서열에 연결될 수 있다. 한 가지 방법은 DNA 인식 부위와 절단 부위가 서로 분리된 엔도뉴클레아제 (endonuclease)를 발견하는 것이었는데, 이는 제한 효소에서 공통적이지 않은 상황이다. 일단이 효소가 발견되면 그것의 절단 부분이 분리될 수 있는데, 이는 인식 능력이 없기 때문에 매우 특이적이지 않을 수 있다. 이 부분은 매우 높은 특이성을 가져오는(야기하는) 서열 인식 펩타이드와 연결될 수 있다. 이러한 특성을 갖는 제한 효소의 예는 FokI이다. 또한 FokI는 핵산 분해 효소를 갖기 위해 이량체화 (dimerization)가 필요하다는 이점이 있으며, 이는 각 뉴클레아제 파트너가 고유한 DNA 서열을 인식할 때 특이성이 급격히 증가한다는 것을 의미한다. 이 효과를 높이기 위해, FokI 뉴클레아제는 헤테로다이머(heterodimer)로만 작용하고 증가된 촉매 활성을 가질 수 있도록 조작되었다. 헤테로다이머(heterodimer)가 작용하는 뉴클레아제는 원치않는 호모다이머(homodimer) 활성의 가능성을 피하고 따라서 DSB의 특이성을 증가시킨다.
ZFN과 TALEN의 뉴클레아제 부분은 비슷한 성질을 가지고 있지만, 이들 뉴클레아제의 차이점은 DNA 인식 펩타이드에 있다. ZFN은 Cys2-His2 징크 핑거와 TALE상의 TALEN에 의존한다. 이들 펩타이드 도메인을 인식하는 DNA는 둘 다 그들의 단백질 조합에서(in combinations in their proteins). 자연적으로 발견되는 특징을 가지고 있다. Cys2-His2 아연 핑거는 전형적으로 3 bp 떨어져 반복에서 발생하며 전사 인자와 같은 다양한 핵산 상호 작용 단백질 (nucleic acid interacting proteins)에서 다양한 조합으로 발견된다. 한편, TALE은 아미노산과 인식된 뉴클레오타이드 쌍 사이의 1:1 인식비 (one-to-one recognition ratio)를 가지면서 반복적으로 발견된다. 징크 핑거와 TALE 모두 반복적인 패턴으로 발생하기 때문에 다양한 조합을 시도하여 다양한(광범위한) 서열 특이성을 만들 수 있다. 아연 핑거(zinc fingers)는 모듈 조립 (아연 핑거가 트리플릿 시퀀스와 관련되어 연속적으로 부착되어 필요한 서열을 커버하는), OPEN (저-엄격성 선택(low-stringency selection)의 펩타이드 도메인 vs. 트리플릿 뉴클레오타이드 이어서 고-엄격성 선택(high-stringency selection) 의 펩타이드 조합vs. 박테리아 시스템에서의 최종 타겟) 및 다른 방법들 중 징크 핑거 라이브러리의 박테리아 원-하이브리드(one-hybrid) 스크리닝이 부위 특이성 뉴클레아제(site specific nucleases)의 제조에 사용되어 왔다.
Ⅷ. 외인성 유전자 전달 (Exogenous Gene Delivery)
특정 실시예에서, 배양 방법 또는 조성물에서 본원에서 사용된 임의의 세포, 특히 시작 세포(starting cells), 예컨대 스트로마 세포 또는 줄기 세포 또는 전구 세포의 유전자 변형을 위한 외인성 핵산 서열을 포함하도록 벡터를 제조할 수 있다. 이들 벡터 및 전달 방법의 성분의 세부 사항은 하기에 개시된다.
A. 벡터(Vector)
통상의 기술자는 표준 재조합 기술 (예를 들어, Maniatis et al., 1988 및 Ausubel et al., 1994, 둘 모두 참조로 본 명세서에 포함됨)을 통해 벡터를 제조 할 수 있을 것이다.
벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 표적화된 세포에 유익한 성질을 제공하는 다른 성분 또는 기능을 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분은 예를 들어 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분 (세포 유형 또는 조직 특이적 결합을 매개하는 성분을 포함함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수(uptake) 후 세포 내 폴리뉴클레오타이드의 위치에 영향을 미치는 성분(핵 위치 확인을 매개하는 물질과 같은); 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치는 성분을 포함한다.
이러한 성분은 또한 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현하는 세포를 검출 또는 선별하는데 사용될 수 있는 검출 가능한 및/또는 선택 마커와 같은 마커를 포함 할 수 있다. 이러한 성분은 벡터의 자연적인 특징 (예를 들어, 결합 및 흡수를 매개는 성분 또는 작용성을 갖는 특정 바이러스 벡터의 사용)으로 제공될 수 있거나, 벡터는 그러한 기능을 제공하도록 변형될 수 있다. 이러한 벡터의 매우 다양한 것이 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 이용 가능하다. 벡터가 숙주 세포에서 유지되면, 벡터는 자율 구조(autonomous structure)로서 유사 분열 동안 세포에 의해 안정적으로 복제되거나, 숙주 세포의 게놈 내에 혼입되거나, 숙주 세포의 핵 또는 세포질에서 유지될 수 있다.
B. 조절 요소(Regulatory Elements)
벡터에 포함된 진핵 발현 카세트는 특히 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 진핵 생물 전사 프로모터, 중간 서열을 포함하는 접합 신호 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 포함한다(5 '에서 3'방향으로).
ⅰ. 프로모터/인핸서(Promoter/Enhancers)
"프로모터"는 개시 및 전사 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열(control sequence)이다. 그것은, 핵산 서열의 특이적 전사 (the specific transcription a nucleic acid sequence)를 개시하기 위해, RNA 중합효소 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전요소를 포함할 수 있다. “작동 가능하게 위치된(operatively positioned)," "작동 가능하게 연결된(operatively linked)," "조절 하에(under control)," 및 " 전사 조절 하에(under transcriptional control)"라는 어구는 프로모터가 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하기 위해 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 (functional location) 및/또는 방향(orientation)에 있음을 의미한다.
프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위(start site)를 위치시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이것의 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스(box)이지만, TATA 박스가 없는 일부 프로모터에서, 예를 들어 포유동물 말단 데옥시뉴클레오타이드전달효소(mammalian terminal deoxynucleotidyl transferase) 유전자 및 후기 유전자(late genes)에 대한 프로모터와 같은 경우에, 개시 자리 자체 위에 놓인(overlying) 개별요소(discrete element)는 초기화 위치(the place of initiation)를 픽스(fix)하는데 도움을 준다. 부가적인 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 다수의 프로모터가 개시 자리(start site)의 하류(downstream)에 기능적 요소를 포함하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 개시 자리의 30 110 bp 상류 영역(region 30 110 bp upstream) 에 위치한다. 프로모터의 "제어 하에 (under the control of) "코딩 서열을 가져 오기 위해, 하나는 선택된 프로모터의 "하류(downstream)"의(즉, 3'의) 전사 해독틀(transcriptional reading frame)의 전사 개시 자리 (transcription initiation site)의 5' 말단(5'end)에 위치시킨다. "상류(upstream)" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진한다.
프로모터 요소 (promoter elements) 사이의 간격(spacing)은 종종 유연하므로, 요소가 서로 반전되거나(inverted) 이동할 때 프로모터 기능은 보존된다. tk 프로모터에서, 활성(activity)이 감소하기 전에 프로모터 요소 사이의 간격은 50 bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소 (individual elements)는 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 작용할 수 있는 것으로 보인다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스형 조절 서열(cis-acting regulatory sequence)을 지칭하는 "인핸서 (enhancer)"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는 코딩 단편 (coding segment) 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5* 비번역 (non-coding) 서열을 단리(분리)함으로써 수득 될 수 있는 바와 같이, 프로모터는 핵산 서열과 본질적으로(natural) 관련된 것일 수 있다. 　그러한 프로모터는 "내인성 (endogenous)"이라고 할 수 있다. 유사하게, 인핸서는 그 서열의 하류 또는 상류에 위치한 핵산 서열과 본질적으로(natural) 관련된 것일 수 있다. 그렇지 않으면(Alternatively), 자연 환경에서 핵산 서열과 보통(normally) 관련이 없는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에 코딩 핵산 세그먼트(coding nucleic acid segment)를 위치시킴으로써 특정 이점을 얻을 수 있다. 　재조합 또는 이종 인핸서는 또한 자연 환경에서 핵산 서열과 보통(normally) 관련이 없는 인핸서를 의미한다. 그러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 바이러스 또는 원핵 또는 진핵 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "자연적으로 발생(naturally occurring)" 하지 않은 프로모터 또는 인핸서, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. 예를 들어, 재조합 DNA 구축에 가장 일반적으로 사용되는 프로모터는 락타마아제(lactamase)(페니실리나아제 (penicillinase)), 락토오스 및 트립토판 (trp) 프로모터 시스템을 포함한다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 (synthetically) 생산하는 것 이외에, 서열은 본원에 개시된 조성물과 관련하여 PCR ™을 포함하여 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 제조될 수 있다 (각각 미국 특허 제 4,683,202 호 및 제 5,928,906 호 참조로 본 명세서에 포함). 　또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 소기관 (non-nuclear organelles) 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열이 또한 사용될 수 있음이 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포 소기관, 세포 유형, 조직, 기관 또는 유기체에서 DNA 세그먼트(segment)의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/ 또는 인핸서를 이용하는 것이 중요 할 것이다. 분자 생물학 분야의 당업자는 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 사용을 일반적으로 알고 있다 (참조예로서 Sambrook 등 1989 참조). 사용된 프로모터는, 도입된 DNA 단편의 높은 수준의 발현을 지시하기 적절한 조건 하에서 구성적이고, 조직 특이적이고, 유도성 및/또는 유용성이 있을 수 있으며, 이는 재조합 단백질 및 / 또는 펩타이드의 대규모 생산에 유리하다. 프로모터는 이종 또는 내인성 (heterologous or endogenous)일 수 있다.
또한, (예를 들어, epd.isb-sib.ch/에서 월드 와이드 웹을 통한 진핵 생물 프로모터 데이터 베이스(Eukaryotic Promoter Data Base) EPDB에 따라) 임의의 프로모터/인핸서 조합을 사용하여 발현을 유도할 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른(another) 가능한 실시예이다. 진핵 세포는 적절한 세균성 중합 효소가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가적인 유전자 발현 컨스트럭(genetic expression construct)의 일부로서 제공되는 경우, 특정 박테리아 프로모터로부터의 세포질 전사를 서포트(support)할 수 있다.
프로모터의 비제한적인 예(Non-limiting examples)는 SV40 초기 또는 후기 프로모터 (early or late promoters), CMV (cytomegalovirus) 전초기 프로모터 (immediate early promoters), RSV (Rous Sarcoma Virus) 초기 프로모터; 예를 들어 베타 액틴 프로모터와 같은 진핵 세포 프로모터(Ng, 1989; Quitsche et al., 1989), GADPH 프로모터(Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), 메탈로티오네인(etallothionein) 프로모터 (Karin et al., 1989; Richards et al., 1984); 및 최소 TATA 박스 근처의 (near a minimal TATA box) 사이클릭 AMP 반응 요소 (response element) 프로모터, 혈청(serum) 반응 요소 프로모터 (sre), 포르볼 에스터(phorbol ester) 프로모터 (TPA) 및 반응 요소 프로모터 (tre)와 같은 연결된(concatenated) 반응 요소 프로모터가 포함된다. 또한 인간 성장 호르몬(human growth hormone) 프로모터 서열 (예를 들어,Genbank, accession no. X05244, 뉴클레오티드 283-341에 기재된 인간 성장 호르몬 최소 (minimal) 프로모터) 또는 마우스 유방 종양 프로모터 (ATCC, Cat. No.에서 입수 가능)를 사용할 수 있다. ATCC 45007). 특정 예(specific example)는 포스포글리세레이트 키나아제 (phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터 일 수 있다.
ⅱ. 프로테아제 절단 부위/자가-절단 펩티드 및 내부 리보솜 결합 부위 (Protease cleavage sites/self-cleaving peptides and Internal Ribosome Binding Sites)
적절한 프로테아제 절단 부위 및 자가 절단 펩타이드는 당업자에게 공지되어있다 (예를 들어, Ryan et al., 1997; Scymczak et al., 2004 참조). 프로테아제 절단 부위의 예로는 포티바이러스(potyvirus) NIa proteases (예: 타바코 에치 바이러스(tobacco etch virus) 프로테아제), 포티바이러스(potyvirus) HC 프로테아제, 포티바이러스 P1 (P35) 프로테아제, 바이오바이러스(byovirus) Nla 프로테아제, 바이오바이러스(byovirus) RNA-2로 암호화된(RNA-2- encoded) 프로테아제, 아프타바이러스(aphthovirus) L 프로테아제, 엔테로바이러스(enterovirus) 2A 라이노바이러스(rhinovirus) 2A 프로테아제, 피코르나(picorna) 3C 프로테아제, 코모바이러스(comovirus) 24K 프로테아제, 네포바이러스(nepovirus) 24K 프로테아제, RTSV(rice tungro spherical virus) 3C형 (3C-like) 프로테아제, PY/IF (parsnip yellow fleck virus) 3C 형 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa (factor Xa) 및 엔테로키나아제(enterokinase). 높은 절단 엄격도(high cleavage stringency) 때문에, TEV (tobacco etch virus) 프로테아제 절단 부위가 사용될 수 있다.
전형적 자가-절단(self-cleaving) 펩타이드("시스형 가수 분해 요소(cis-acting hydrolytic elements)", CHYSEL라고도 칭함; deFelipe (2002) 참조)는 포티 바이러스(potyvirus) 및 카디오바이러스(cardiovirus) 2A 펩타이드로부터 유도된다. 특정 자가-절단 펩타이드는 FMDV (foot-and-mouth disease virus), 마비염 A 바이러스(equine rhinitis A virus), Those
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asigna 바이러스 및 porcine teschovirus로부터 유래된 2A 펩타이드로부터 선택될 수 있다.
다시스론성(polycistronic) 메시지에서 코딩 시퀀스의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호를 사용할 수도 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호 (Exogenous translational control signals)가 제공될 필요가 있다. 당업자는 이를 쉽게 결정하고 필요한 신호를 제공 할 수 있다. 개시 코돈은 전체 삽입물 (entire insert)의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 해독틀을 갖는(with the reading frame) "프레임 내 (in-frame) "이어야 한다는 것은 잘 알려져 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성 일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소를 포함시킴으로써 향상 될 수 있다.
특정 실시예에서, 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosome entry sites, IRES) 요소의 사용은 다중 유전자(multigene) 또는 폴리시스트론성(polycistronic) 메시지를 생성하는데 사용된다. 　IRES 요소는 5'메틸화된 Cap 의존성(5'methylated Cap dependent) 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하여 내부 사이트에서 번역을 시작할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 　피코르나바이러스(picornavirus) 계열(소아마비와 뇌 심근염)의 두 멤버(two members)로부터의 IRES 요소와 포유류 메시지(mammalian message)로부터의 IRES (Macejak and Sarnow, 1991)가 기술되어 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988).
IRES 요소는 이종의 개방형 해독틀(open reading frame)과 연결될 수 있다.
다중 개방형 해독틀은 함께 전사될 수 있으며 각각은 IRES에 의해 구분되어 다시스트론성 메시지(polycistronic messages)를 생성할 수 있다. IRES 요소에 의해 각각의 개방형 해독틀(오픈 리딩 프레임)은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 하나의 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 다수의 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다 (참조 문헌으로서 각각 미국 특허 제 5,925,565 호 및 제 5,935,819 호 참조).
iii. 다중 복제 사이트 (Multiple Cloning Sites)
벡터는 다중 제한 효소 자리(multiple restriction enzyme sites)를 포함하는 핵산 영역인 다중 복제 사이트(MCS)를 포함할 수 있으며, 이들 중 어느 것도 벡터를 다이제스트(digest)하기 위한 표준 재조합 기술과 함께 사용될 수 있다 (예를 들어, Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, 및 Cocea, 1997] 참조). "제한 효소 절단"은 핵산 분자의 특정 위치에서만 기능하는 효소로 핵산 분자를 촉매 분해 (catalytic cleavage)하는 것을 의미한다. 이러한 제한 효소의 대부분은 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 효소의 사용은 당업자에게 널리 이해된다. 종종, 벡터는 외인성 서열이 벡터에 연결될 수 있도록 MCS 내에서 절단하는 제한 효소를 사용하여 선형화되거나 단편화된다. 　"연결(Ligation) "은 서로 인접하거나 연속하지 않을 수 있는 두 개의 핵산 단편(two nucleic acid fragments) 사이에 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bonds)을 형성하는 과정을 의미한다. 제한 효소 및 연결 반응을 포함하는 기술은 재조합 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
ⅳ. 스플라이싱 부위(Splicing Sites)
대부분의 전사된 진핵 RNA 분자는 1차 전사체 (primary transcripts)에서 인트론을 제거하기 위해 RNA 스플라이싱을 거친다. 게놈 진핵 서열을 함유하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사체의 적절한 프로세싱을 보장하기 위해 공여체 (donor) 및/또는 수여체(acceptor) 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다 (예를 들어, Chandler et al., 1997, 본원에 참조로 포함됨).
ⅴ. 종결신호 (Termination Signals)
벡터 또는 컨스트럭(constructs)은 적어도 하나의 종결 신호를 포함 할 수 있다. "종결 신호 (termination signal)" 또는 "종결자 (terminator)"는 RNA 중합 효소에 의한 RNA 전사체의 특이적 종결에 관여하는 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 실시예에서, RNA 전사체의 생성을 종결시키는 종결 신호가 고려된다. 원하는 메시지 레벨을 얻기 위해서는 생체 내에서(in vivo) 종결자(terminator)가 필요할 수 있다.
진핵 생물 시스템 (eukaryotic systems)에서, 종결자 영역(terminator region)은 또한 폴리아데닐화 부위 (polyadenylation site)를 노출시키기 위해 새로운 전사체 (transcript)의 부위 특이적인 절단(site-specific cleavage)을 허용하는 특정 DNA 서열을 포함 할 수 있다. 이것은 전문화된 내인성 중합 효소 (specialized endogenous polymerase)가 전사체의 3' 말단에 약 200 A 잔기 (polyA)의 스트레치(stretch)를 추가함을 의미한다. 이 폴리A(polyA) 꼬리로 변형 된 RNA 분자는 보다 안정적으로 보이고, 보다 효율적으로 번역된다. 따라서, 진핵 생물과 관련되는 다른 실시예에서, 종결자는 RNA의 절단을 위한 신호를 포함하고, 종결자 신호는 메시지의 폴리아데닐화(polyadenylation)를 촉진한다. 종결자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소(polyadenylation site elements)는 메시지 레벨을 향상시키고 카세트로부터 다른 서열로의 리드 써로우(read through)를 최소화하도록 작용할 수 있다.
고려된(contemplated) 종결자(Terminators)는 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 임의의 공지된 종결자를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 소 성장 호르몬 종결자(bovine growth hormone terminator) 과 같은 유전자 종결 서열 또는, SV40 종결자와 같은 바이러스성 종결 서열 (viral termination sequences)을 포함한다. 특정 실시예에서, 종결 신호는 서열 절단 (truncation)에 기인한 것과 같이, 전사 가능 또는 번역 가능한 서열의 결핍(lack)일 수 있다.
ⅵ. 폴리아데닐화 신호(Polyadenylation Signals)
발현, 특히 진핵 발현(eukaryotic expression)에서, 전형적으로 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 수행하기 위한 폴리아데닐화 신호를 포함할 것이다. 폴리아데닐화 신호의 성질은 성공적인 수행에 결정적인 것으로 여겨지지 않으며, 임의의 서열이 사용될 수 있다. 일 실시예는, 편리하고 다양한 표적 세포에서 잘 기능하는 것으로 알려진SV40 폴리아데닐화 신호 또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(bovine growth hormone polyadenylation signal)을 포함한다.
폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 전달을 촉진시킬 수 있다.
ⅶ. 복제원점(Origins of Replication)
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 이는 하나 이상의 복제 위치의 원점 (종종 "ori"로 지칭 됨), 예를 들어, 전술한 바와 같은 EBV의 oriP에 상응하는 핵산 서열 또는 유전적으로 복제가 개시되는 특이적인 핵산 서열인 분화 프로그래밍에서 유사하거나 상승된 기능을 갖는 유전적으로 조작된 oriP를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 기재된 다른 염색체 외 복제 바이러스 (extra-chromosomally replicating virus) 또는 자율 복제 서열 (autonomously replicating sequence, ARS)의 복제원점이 사용될 수 있다.
C. 벡터 전달(Vector Delivery)
배양 조성물 또는 방법의 출발 세포(starting cells)에 외인성 핵산을 유전적으로 변형시키거나 도입하는 것은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 알려진 것과 같이 세포의 형질 전환을 위하여 핵산을 전달하기 위한 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 　그러한 방법은 다음과 같다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다: 인젝션에 의한 엑소 비보(ex vivo)형질주입(transfection) (Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989)과 같은 DNA의 직접전달(미국 특허 제 5,994,624 호, 제 5,981,274 호, 제 5,945,100 호, 제 5,780,448 호, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859); 마이크로 인젝션 (Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 제 5,789,215 호 참조); 전기천공법(미국 특허 제 5,384,253 호 참조; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984); 인산 칼슘 침전 (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); DEAE 덱스트란 사용 다음에 폴리에틸렌 글리콜을 사용(Gopal, 1985); 직접 음파 로딩(direct sonic loading) (Fechheimer et al., 1987); 리포좀 매개 형질주입 (Nicolau와 Sene, 1982; Fraley 등, 1979; Nicolau 등, 1987; Wong 등, 1980; Kaneda 등, 1989; Kato 등, 1991) 및 수용체 매개 형질주입(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988); microprojectile bombardment (PCT 출원 번호 WO 94/09699 및 95/06128; 미국 특허 제 5,610,042 호, 제 5,322,783 5,563,055 호, 제 5,550,318 호, 제 5,538,877 호 및 제 5,538,880 호에 기재되어 있으며, 각각 본 명세서에 참고로 포함됨); 탄화 규소 섬유로 교반 (Kaeppler et al., 1990; 미국 특허 제 5,302,523 호 및 제 5,464,765 호 (각각 본원에 참고로 인용 됨)); 아그로 박테 리움 매개 형질 전환 (미국 특허 제 5,591,616 호 및 제 5,563,055 호); PEG에 의한 원형질체의 형질 전환 (Omirulleh 등, 1993; 미국 특허 제 4,684,611 호 및 제 4,952,500 호, 각각 본원에 참고로 인용됨); 건조/ 억제(desiccation/inhibition) 매개된 DNA 흡수 (Potrykus et al., 1985) 및 그러한 방법의 임의의 조합. 이러한 기술의 적용을 통해 세포, 세포, 조직 또는 유기체는 안정적으로 또는 일시적으로 변형될 수 있다.
ⅰ. 리포좀 -매개 형질 주입(Liposome Mediated Transfection)
특정 실시예에서, 핵산은 예를 들어 리포좀과 같은 지질 복합체에 포획 될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포 구조이다. 다중층 리포좀(Multilamellar liposomes)은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질층을 갖는다. 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 그들은 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 닫힌구조(closed structures)가 형성되기 전에 자기 재배치(self rearrangement)를 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용질을 포획한다 (Ghosh and Bachhawat, 1991). 또한 Lipofectamine (Gibco BRL) 또는 Superfect (Qiagen)와 복합체를 이루는 핵산이 고려된다(contemplated). 사용된 리포좀의 양은 사용되는 리포좀뿐만 아니라 리포좀의 성질(nature)과 사용되는 세포에 따라 달라질 수 있는데, 예를 들어, 1 내지 1,000 만(10 million) 세포 당 약 5 내지 약 20 ㎍ 벡터 DNA가 고려될 수 있다.
체외에서의 리포좀 매개 핵산 전달 및 외래 DNA (foreign DNA) 의 발현은 매우 성공적이었다 (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). 배양된 병아리 배아(cultured chick embryo), HeLa 및 간암(hepatoma) 세포에서 리포좀 매개 전달 및 외래 DNA의 발현 가능성도 입증되었다(Wong et al., 1980).
특정 구체예에서, 리포좀은 HVJ (hemagglutinating virus)와 복합체를 형성 할 수 있다. 이것은 세포막과의 융합을 촉진하고 리포좀 캡슐화된 DNA의 세포 진입을 촉진시키는 것으로 나타났다 (Kaneda et al., 1989). 다른 구체예에서, 리포좀은 핵 비 히스톤 염색체(nuclear non histone chromosomal) 단백질 (HMG1)과 복합체화되거나 함께 이용될 수 있다 (Kato et al., 1991). 또 다른 구체예에서, 리포좀은 HVJ 및 HMG1모두와 복합체화되거나 함께 사용될 수 있다. 다른 구체 예에서, 전달 비히클(delivery vehicle)은 리간드 및 리포좀을 포함 할 수 있다.
ⅱ. 전기천공법 (Electroporation)
특정 실시예에서, 핵산은 전기천공법(electroporation)을 통해 세포 내로 도입된다. 전기천공법(Electroporation)은 세포와 DNA의 현탁액을 고전압 전기 방전에 노출시키는 것을 포함한다. 수용체 세포(Recipient cells)는 기계적 외상 (mechanical wounding)으로 변형되기 쉽다. 또한, 사용된 벡터의 양은 사용 된 세포의 성질(nature)에 따라 변할 수 있으며, 예를 들어, 1 내지 1,000 만 세포 당 약 5 내지 약 20 ㎍ 벡터 DNA가 고려 될 수 있다.
전기천공법(electroporation)을 이용한 진핵 세포의 형질 주입(Transfection)은 아주 성공적이었다. 마우스 프리(pre) B 림프구는 인간 카파(kappa) 면역 글로불린 유전자 (Potter et al., 1984)로 형질 주입되었으며, 쥐 간세포 (rat hepatocytes)는 이 방식으로 클로람페니콜아세틸전달효소(chloramphenicol acetyltransferase) 유전자 (Tur Kaspa et al., 1986)를 이용하여 형질 주입되었다.
ⅲ. 인산 칼슘 (Calcium Phosphate)
다른 실시예에서, 핵산은 인산 칼슘 침전(calcium phosphate precipitation)을 사용하여 세포에 도입된다. 인간 KB 세포는 이 기술을 사용하여 아데노바이러스(adenovirus) 5 DNA (Graham and Van Der Eb, 1973)로 형질 주입시켰다. 또한 이 방법으로 네오마이신 마커 유전자 (Chen and Okayama, 1987)로 마우스 L (A9), 마우스 C127, CHO, CV1, BHK, NIH3T3 및 HeLa 세포를 형질 주입시켰고 쥐의 간세포를 다양한 마커 유전자 (Rippe et al., 1990)로 형질주입시켰다. .
iv. DEAE-덱스트란(DEAE-Dextran)
또 다른 실시예에서, 핵산은 DEAE -덱스트란을 사용 후 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 세포 내로 전달된다. 이러한 방식으로, 리포터 플라스미드를 마우스 골수종 및 적혈구 백혈병(mouse myeloma and erythroleukemia) 세포에 도입시켰다 (Gopal, 1985).
Ⅸ. 세포 배양 응용 (Cell Culture Applications)
본원에 기재된 배양 조성물은 하기 예시된 바와 같이 상업적 또는 임상적 어플리케이션을 갖는 T 세포를 생산하는데 사용될 수 있다.
방법은 면역 요법을 위한 줄기 세포에서 항원 특이적 T 세포의 시험관 내(in vitro) 생산을 위해 제공 될 수 있다. 특정 항원에 반응하도록 유전자 조작된 T 세포의 사용은 암 및 전염병에 대한 입양세포치료 (adoptive cell therapy)에 대한 연구적 접근 방법으로 유망하다. 조작된 T 세포 전략은 항원 특이성을 전달하기 위해 T 세포 수용체 (TCR) 및 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptors, CAR)로의 형질 도입; 전이된 T 세포의 효능 또는 안전성을 향상시키기 위한 유전자 변형 (예: 저해 신호 하향조절(downregulating inhibitory signaling), 바이러스 공동 수용체 삭제(deleting viral co-receptors), 자살 유전자(suicide genes) 도입 등)을 포함한다.
현재까지, 조작 된 T 세포의 조사 치료법(investigational therapies)은 말초 혈액 T 세포를 사용했다. 이 접근법은 몇 가지 악성 및 전염성 질환의 임상 시험에서 효능을 입증했지만 다음과 같은 이유로 문제가 남아 있다. 첫째, 입양적으로(adoptively) 전이된 T 세포는 시간이 지남에 따라 생체 내에서(in vivo) 감소하여 결국 종양 또는 바이러스 특이적 면역이 소실된다. 둘째, 효과적인 생체 내 유전자 전달을 촉진하기 위해서는 생체 외 (ex vivo) 활성화 및 T 세포의 증식(expansion)이 필요하며, 이는T 세포 고갈과 면역력 저하를 초래할 수 있다. 셋째, TCR 조작된 T 세포의 경우, 형질 전환 및 내인성 TCR 사슬의 미스페어링(mispairing)은 항원 인식 또는 표적 외 독성/자가 면역(off-target toxicity/autoimmunity)저하가 있는 하이브리드 수용체를 유발할 수 있다(또는 CAR T 세포의 경우에는, 고도로 활성화된 T 세포상의 TCR의 잔류 발현(residual expression)은 또한 표적 외의 독성을 유발할 수 있다).
ATOs를 이용한 줄기 세포로부터의 조작된 T 세포 (engineered T cells)의 새로운 생성(de novo generation)은 다음과 같은 방법으로 조작된 T 세포 치료법의 한계를 극복 할 수 있는 잠재력을 가지고 있다:
1) TPC 또는 CAR 유전자를 HSPC(pre-thymic)에 도입하면 T 세포의 발달 (대립유전자 배제(alleleic exclusion))에서 내인성 TCR 유전자자리(loci)의 재배치를 억제하여 형질 전환 항원 수용체만을 발현하는 T 세포를 생성함으로써 TCR 사슬 미스페어링 또는 패신저 TCR 발현(passenger TCR expression)으로부터의 표적 외 독성; 그리고 2) HSPC는 나이브 (naive) 하고 비소실된 표현형(non-exhausted phenotype)을 갖는 항원 특이적 T 세포를 생성할 수 있는 잠재력이 있으며, 따라서 입양 치료 (adoptive therapy)를 위한 T 세포의 질과 수명을 향상시킨다. 또한, 대립유전자가 배제된(allelically-excluded), 항원 특이적 T 세포의 생성은 내인성 공여체 TCR 발현 (endogenous donor TCR expression)으로부터 이식편대숙주질환 (GVHD)의 위험이 없는 동종 이계의 공여체(allogeneic donors) 에서 사용될 수 있는 기성제품(off-the-shelf) 항원 특이적 T 세포 라이브러리를 개발할 기회를 창출한다. 이러한 장점에도 불구하고 현재 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 항원 특이적 T 세포를 개발하는 상업적 접근법은 없다.
ATO 시스템이 그럴듯하게 사용될 수 있는 임상적 적용의 구체적인 예는 다음과 같다:
입양 세포 항-종양 또는 항-바이러스 면역 요법 (adoptive cellular anti-tumor or anti-viral immunotherapy)을 위한 HSPC로부터의 자가 TCR 및/또는 CAR-조작된 T 세포의 시험관 내 (In vitro) 생산. 자가 조직 HSPC(소스 Autologous HSPC sources)는 제대혈, 골수 및 동원된 말초 혈액 (mobilized peripheral blood)을 포함한다.
시험관 내에서(In vitro) iPSC를 포함하여 인간만능줄기세포(인간다능성줄기세포)에서 자가 (autologous) TCR- 및/또는 CAR-조작된 T 세포의 생산.
시험관 내에서(In vitro) HSPC 또는 다능성 줄기 세포에서 동종이계(allogeneic) (HLA-일치된 또는 HLA-수정된) TCR- 또는 CAR- 조작된 T 세포를, 입양세포 치료용 기성제품으로 상업적 스케일로 생산. 전술 한 바와 같이, TCR 및/또는 CAR로 형질도입된 전-흉선(pre-thymic) HSPC로부터 생성된 대립형 배제 T 세포 (allelic exclusion T cells)는 내인성 TCR을 발현하지 않으며, 동종이계 수혜자(allogeneic recipients)에게 이식될 때 표적 외 (off-target) GVHD의 위험을 전달해서는 안된다.
　 이 목적을 위해 사용된 줄기 세포는 동종이계의 숙주 (예: HLA-일치된 HSPC를 사용하거나 HLA 유전자자리 또는 NK 세포 리간드의 유전자 변형을 통해 동종 면역 인식을 감소시킴으로써)에서 자손 T 세포 이식을 향상시키기 위해 추가로 선택되거나 유전자 조작될 수 있다.
ATO 유래 T 세포의 생체 내 기능을 향상시키기 위해 TCR 및/또는 CAR의 도입 유무에 관계없이 줄기 세포에서 비-항원 (non-antigen) 수용체 유전자의 변형. 예로는 PD-1, TIM-3 또는 LAG-3와 같은 보조 억제 수용체의 유전자 불 활성화 또는 녹다운; 억제성 신호 전달 경로, 예컨대 TGFβ; 또는 바이러스 진입 공동 수용체 (viral entry co-receptors), 예컨대 CCR5를 포함한다.
T 세포 발달 및 기능에 대한 약제 학적 또는 생물학적 화합물의 효과를 모델링(예를 들어 약물 독성 분석)하 위한 흉선 유기물로서 3 차원 배양물 집합체 (3D culture aggregates)의 사용. 이것은 환자 특유의 약물 유전체 또는 질병 특이적 상호 작용 (patient-specific pharmacogenomic or disease-specific interactions)을 모델링하기 위해 자가 환자 세포를 이용한 ATO의 사용으로 확대될 수 있다.
방법 및 조성물은 T 세포 발생을 연구하기 위한 연구 툴의 사용을 위해 제공될 수 있다. 전술 한 바와 같이, ATO와 같은 3D 세포 응집체는 줄기 세포 및 전구 세포 및 조혈모세포 (HSPC) 및, 줄기 세포 (ESC) 및 유도만능줄기세포 (iPSC)를 포함한 인간 다능성 줄기 세포를 포함하는 다수의 줄기 세포 공급원으로부터의 인간 T 세포 발생 연구에 대한 강력한 도구이다.
T 세포 발달을 모델링하기 위해 실험실에서 현재 행해지는 실험 방법은 몇 가지 중요한 한계가 있다:
OP9-DL1 및 유사한 스트로마 세포 기반 모노레이어 시스템은 HSPCs의 "피더 레이어 (feeder layer)"로서 노치 리간드 (전형적으로 쥐 Dll1 또는 Dll4)로 형질 도입된 불멸화된 (immortalized) 쥐 골수 세포주를 사용한다. OP9-DL1에서 인간 HSPCs의 시험관 내(in vitro) 공동 배양은 T 세포 계통(lineage)에 대한 커밋먼트(commitment)를 초래하지만, T 세포의 양성 선택은 크게 손상되어 이러한 시스템에서 성숙한 기능성 T 세포의 뚜렷한 결핍을 야기한다. 스트로마 세포 공동 배양 시스템은 또한 노동 집약도가 높으며 효율성과 재현성은 태아 송아지 혈청(fetal calf serum)을 포함한 여러 변수에 의존한다.
태아 흉선 조직 배양법 (Fetal thymic organ culture, FTOC)은 HSPC에서 시험관 내(in vitro)에서 T 세포를 연구하기 위한 미세 환경으로서 조혈 세포가 고갈된 쥐 또는 인간 태아의 흉선 조직을 그대로 또는 재결합하여 사용한다. 이러한 방법은 고도로 노동 집약적이며, 낮은 효율의 T 세포 생성을 가져오고, 정량 분석을 위한 제한된 능력을 제공하며, 조직 연령(tissue age) 및 품질 (quality)로 인해 높은 실험적 다양성을 나타내고, 일차적인 흉선 조직 (primary thymic tissue)에 대한 접근성에 의해 제한된다.
스캐폴드-기반 오가노이드는 일반적으로 생체 물질 매트릭스에 시딩된 일차 흉선 스트로마 세포(primary thymic stromal cells) 또는 유사한 세포 유형 (예: 피부 섬유아세포)을 사용한다. 이러한 시스템은 효율성 및 확장성이 낮고 재현성이 낮으며 독점적인 스캐폴드 물질(proprietary scaffold materials)의 사용 가능성이 제한되어 있다.
생체 내(in vivo) 인간 T 세포 발생의 이종 (쥐) 모델 (Xenogeneic (murine) models)은 T 세포 분화의 효율에서 매우 가변적이고, 양적으로 불충분하며, 많은 접근법(many approaches)은 또한 인간 태아 흉선, 간 및 골수 세포 또는 단편(fragments)을 면역 결핍 마우스(immunodeficient mice)로 이식하는 것을 필요로 한다.
이러한 접근법과 달리 ATO는 1 차 조직 또는 태아 송아지 혈청의 사용으로 인한 생물학적 다양성을 줄이기 위해 "기성품 (off-the-shelf)" 성분 및 무-혈청 조건(serum-free)을 사용한다; 그리고 독점적인 스캐폴드 재료의 사용을 피한다. 중요한 것은 ATOs가 크게 향상된 양성 선택을 지원하여 시험관 내에서 (in vitro) 성숙한 T 세포 및 T 세포 양성/음성 선택 (positive/negative selection)을 연구할 수 있다는 것이다. 따라서, ATO는 시험관 내에서 T 세포 발생(development)을 연구하기 위한 툴로서 상업화될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 또한 암 또는 다른 치료적으로 관련이 있는 항원 (therapeutically relevant antigens)에 대한 새로운 항원-특이적 TCR을 개발하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 　예를 들어, ATO 유래 T 세포는 공지된 방법을 사용하여 종양-관련 항원 또는 신생 항원에 대한 반응성에 기초하여 선택될 수 있고 항원-특이적 TCR 서열은 공개된 방법을 사용하여 이러한 반응 T 세포 (responding T cells)로부터 동정된다.　우리는 ATO가 최소한의 음성 선택 또는 음성 선택이 없는 T 세포의 생성을 제공할 수 있다고 가정했기 때문에, 자가-항원에 대한 높은 결합력을 갖는 TCR이 생성되어 내인성 " thymus-educated " T 세포 풀(pool)과는 다른 새로운 TCR 레퍼토리를 제공할 수 있다. 두 번째 방법은 ATO에서 T 세포가 발생하는 동안 종양 관련 항원을 도입하는 것이며, 이는 ATO 내에서 발생하는 반응성 T 세포 클론의 아고니스트(agonist) 선택 (및 IEL 유사 분화)을 유도해야 한다. 이들 세포 및 이들의 TCR 서열은 표준 방법에 의해 동정 될 수 있다. 단리된 TCR 서열은 입양 면역요법 (adoptive immunotherapy)을 위해 본원에서 기술된 하류 어플리케니션(downstream applications) 및 방법에서 또한 사용될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 또한 배아 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 증식(expanding)시키기위한 방법 및 조성물을 포함할 수 있다.
　 US 20060205072, US 7344881, US 20060205071, US 20020076747 및 US 20030044978 (본원에 참고로 인용 됨)에 기재된 방법과 같은 당업계에 공지된 방법이 본 발명의 조성물 및 방법에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 또한 ES 세포, HSPCs/PSC 및/또는 CD34+ 세포와 같은 세포의 증식능을 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 포함할 수 있다. 예시적인 화합물은 생체 외 (ex vivo)에서 CD34 + 세포의 증식(expansion)을 달성하는 HSC835 (Novartis에 의해 시판됨)를 포함한다. 다른 화합물은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 8,927,281 호에 기재되어 있다.
Ⅹ. 출발 세포의 공급원(Source of Starting Cells)
다능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 또는 전구 세포와 같은 출발 세포는 선택된 T 세포 계통을 따라 분화하기 위한 특정 조성물 또는 방법에 사용될 수있 다. 스트로마 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포와 공동 배양하는데 사용될 수 있다.
A. 스트로마 세포(Stromal Cells)
스트로마 세포는 모든 기관 예를 들어 골수, 흉선, 자궁 점막 (자궁 내막), 전립선 및 난소에 존재하는 결합 조직 세포이다. 그들은 그 기관의 실질 세포의 기능을 지원하는 세포이다. 섬유아세포 (간엽 스트로마 세포/ MSC라고도 알려져 있음)와 혈관 주위 세포는 스트로마 세포의 가장 일반적인 유형이다.
스트로마 세포와 종양 세포 사이 상호 작용은 암 성장과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 국소적 사이토카인 네트워크 (예: M-CSF, LIF)를 조절함으로써, 골수 스트로마 세포가 인간의 조혈 및 염증 과정에 관여한다고 기술되어 왔다.
골수, 흉선 및 다른 조혈 기관의 스트로마 세포는 세포-세포 리간드- 수용체 상호 작용 및, 사이토카인 및 케모카인을 비롯한 용해성 인자의 방출을 통해 조혈 및 면역 세포의 발생을 조절한다. 이 조직의 스트로마 세포는 줄기 세포 유지 관리, 계통의 지정 (lineage specification) 및 커밋먼트 (commitment), 이펙터 세포 유형으로의 분화를 조절하는 니치(niches)를 형성한다.
스트로마는 비-악성 숙주 세포(non-malignant host cells)로 구성된다. 스트로마 세포는 또한 조직-특이적 세포 유형(tissue-specific cell types), 경우에 따라 종양이 증식 할 수 있는 세포외 기질을 제공한다.
B. 조혈모세포와 전구 세포( Hematopoietic Stem and Progenitor Cells)
조혈모세포 및 전구 세포의 의학적 잠재력으로 인해 배아 줄기 세포에서 조혈모세포를 분화하는 방법을 개선하기 위한 많은 연구가 이루어져왔다. 인간 성인에서, 주로 골수에 존재하는 조혈모세포는 혈액 계의 모든 세포로 분화하는 조혈모세포 (CD34+) 전구 세포의 이종 집단을 생성한다. 성인 인간에서는 조혈 전구 세포 (hematopoietic progenitors)가 번식하고 분화되어 매일 수천억 개의 성숙한 혈액 세포가 생성된다. 조혈 전구 세포 (Hematopoietic progenitor)는 제대혈에도 존재한다. 시험관 내에서(In vitro), 인간 배아 줄기 세포는 조혈 모세포로 분화될 수 있다. 조혈 전구 세포는 또한 후술하는 바와 같이 말초 혈액의 샘플로부터 증식되거나 농축될 수 있다. 조혈 세포는 인간 기원 (human origin), 쥐 기원 또는 다른 포유 동물 종 기원일 수 있다.
조혈모세포의 분리는 세포 선별기, 항체가 코팅된 자기 비드 (magnetic beads)를 이용한 자기 분리, 충진된 칼럼을 포함한 임의의 선택 방법을 포함한다; 친화성 크로마토 그래피; 단클론 항체에 결합되거나, 보체 및 세포 독소(이에 한정되지 않음)를 포함하는 단클론 항체와 함께 사용되는 세포 독성제 (cytotoxic agents); 및 플레이트 (plate)와 같은 고체 매트릭스에 부착된 항체 를 이용한 "패닝 (panning)" 또는 임의의 다른 편리한 기술.
분리 또는 분리 기술 (separation or isolation techniques)의 사용은 물리적 차이 (밀도 구배 원심 분리 및 역류 원심 분리), 세포 표면 (렉틴 및 항체 친 화성) 및 생체 착색 특성 (미토콘드리아 결합 염료 rho123 및 DNA- 결합 염료 Hoechst 33342)에 기초한다. 다만 이에 한정되는 것은 아니다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 다양한 정도의 정교성 예를 들어, 복수의 컬러 채널, 낮은 각도 및 둔각의 빛 산란 검출 채널, 임피던스 채널 등을 가질 수 있는 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) 또는 MACS (Magnetic-activated cell sorting)를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
선행 기술에서 이용된 항체 또는 세포 유형 순도 (예를 들어, 유동 세포 계측법)를 평가하기 위해 사용된 기술은 확인 가능한 약제(identifiable agents)와 접합될 수 있다. 이는 효소, 자성 비드, 콜로이드성 자기 비드, 합텐 (haptens), 형광 크로마토그래피, 금속 화합물, 방사성 화합물, 약물 또는 합텐 (haptens)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 항체에 접합될 수 있는 효소는 알칼리성 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 우레아제 및 β- 갈락토시다제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 항체에 접합될 수 있는 형광 색소는 플루오 레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate), 테트라 메틸로다민 이소티오시아네이트 (tetramethylrhodamine isothiocyanate), 피코에리트린 (phycoerythrin), 알로피코시아닌(allophycocyanins) 및 텍사스 레드(Texas Red)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 항체와 결합할 수 있는 추가 형광 크로마토그래피는 Haugland, Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994)를 참조. 항체에 접합(컨쥬게이트)될 수 있는 금속 화합물은 페리틴(ferritin), 콜로이드달 골드(colloidal gold), 특히 콜로이드달 슈퍼파라마그네텍 비드 (colloidal superparamagnetic beads)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체에 접합될 수 있는 합텐은 비오틴(biotin), 디옥시게닌(digoxygenin), 옥사졸론(oxazalone) 및 니트로페놀(nitrophenol)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 항체에 접합되거나 삽입될 수 있는 방사성 화합물은 당업계에 공지되어 있으며, 제한되는 것은 아니지만 테크네튬 99m (99TC), 125I 및 임의의 방사성 핵종(14C, 3H 및 35S를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님)을 포함하는 아미노산을 포함한다.
정확한 분리를 허용하는 양성 선택을 위한 다른 기술로, 예컨대 친화도 컬럼(affinity columns) 등이 사용될 수 있다. 이 방법은 비-표적(non-target) 세포 집단의 약 20 % 미만, 바람직하게는 약 5 % 미만의 잔류량으로 제거를 허용해야 한다. 세포는 광산란 특성뿐만 아니라 다양한 세포 표면 항원의 발현을 기반으로 선택될 수 있다. 정화된 줄기 세포(purified stem cells)는 FACS 분석에 의해 낮은 측면 산란(low side scatter) 및 낮은 ~ 중간 순방향 산란 프로파일 (low to medium forward scatter profiles)을 갖는다. 사이토스핀 제제(Cytospin preparations)는 성숙한 림프 세포와 성숙한 과립구 사이의 크기를 갖는 농축된 줄기 세포(enriched stem cells)를 보여준다.
예를 들어, Sutherland et al. (1992)의 방법과 미국 특허 제 4,714,680 호에 기술된 것을 사용하여 배양 전에 CD34+ 세포에 대한 접종 집단(inoculation population)을 풍부하게 하는 것이 가능하다. 예를 들어, 세포는 혈통 특이적인 마커 (lineage specific markers)를 발현하는 세포를 제거하기 위해 음성 선택의 대상이 된다. 　예시적인 양태에서, 세포 집단은 비-CD34+ 조혈 세포 (non-CD34+ hematopoietic cells) 및/또는 특정 조혈 세포 서브 세트 (hematopoietic cell subsets)의 고갈에 대해 음성 선택을 행할 수 있다. CD2, CD4 및 CD8과 같은 T 세포 마커; CD10, CD19 및 CD20과 같은 B 세포 마커; 단구(monocyte) 마커 CD14; NK 세포 마커 CD2, CD16 및 CD56 또는 임의의 혈통 관련 마커를 포함하는 다양한 분자의 세포 표면 발현에 기초하여 음성 선택이 수행 될 수 있다.　예를 들어 MACS 또는 칼럼 분리를 통해 다른 세포 유형의 분리에 사용될 수 있는 항체의 칵테일(예: CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 및 CD235a)과 같은 다양한 분자의 세포 표면 발현에 기초하여 음성 선택을 수행할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 계통 음성(lineage-negative)(LIN-)은 리니지 커미티드 셀(lineage committed cells)과 관련된 적어도 하나의 마커가 없는 세포를 지칭한다. 예를 들어 T 세포 (CD2, 3, 4 및 8과 같은), B 세포 (CD10, 19 and 20과 같은), 골수 세포 (CD14, 15, 16 및 33과 같은), 자연 살해 ("NK") 세포 (예: CD2, 16 및 56), RBC (글리코포린 A와 같은), 거핵구 (CD41), 비만 세포, 호산구 또는 호염기구 또는 CD38, CD71 및 HLA-DR과 같은 다른 마커를 포함한다.
바람직하게는 혈통 특이적인 마커(lineage specific markers)는 CD2, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD33, CD38, HLA-DR 및 CD71 중 적어도 하나를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 더욱 바람직하게는, LIN은 적어도 CD14 및 CD15를 포함할 것이다. 추가의 정제는 예를 들어 c-kit + 또는 Thy-1 +에 대한 양성 선택에 의해 달성 될 수 있다. 추가 농축은 당업계에 공지된 방법에 의해 미토콘드리아 결합 염료인 로다민 12의 사용 및 로다민+ (rhodamine+) 세포에 대한 선택에 의해 얻어질 수 있다. 고도로 농축된 조성물은 CD34+, 바람직하게는 CD34+LIN-, 가장 바람직하게는 CD34+Thy-1+LIN- 인 세포의 선택적 단리에 의해 수득될 수 있다. 줄기 세포가 고도로 풍부한 개체군 및 그들을 얻는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, PCT/US94/09760; PCT/US94/08574 및 PCT /US94/10501에 개시되어있다.
전용 계통(dedicated lineage)의 세포를 초기에 제거함으로써 세포를 분리하기 위한 다양한 기술이 사용될 수 있다. 　단일 클론 항체는 특정 세포 계통 및 또는 분화 단계와 관련된 마커를 확인하는 데 특히 유용하다. 항체는 고체 지지체에 부착되어 미정제 분리(crude separation)를 허용 할 수 있다. 사용되는 분리 기술은 수집되는 분획의 생존력을 최대로 유지해야 한다. 상이한 효능의 다양한 기술이 "비교적 가공되지 않은(relatively crude)" 분리를 얻기 위해 사용될 수 있다. 그러한 분리에 의할 때, 보유할 세포 집단과 함께 남아있는 바람직하지 않은 세포가 존재하는 총 세포의 10 % 이하, 통상적으로 약 5 % 이하, 바람직하게는 약 1 % 이하이다. 사용된 특정 기술은 분리 효율, 관련 세포 독성, 용이성 및 성능 속도 및 정교한 장비 및 / 또는 기술 스킬에 대한 필요성에 의존할 것이다.
전구 세포의 선택은 세포에 특이적인 마커만으로 달성될 필요는 없다. 음성 선택 및 양성 선택의 조합을 사용함으로써, 농축된 세포 집단 (enriched cell populations can be obtained)을 수득 할 수 있다.
B. 혈액 세포의 출처(Sources of Blood Cells)
조혈모세포 (Hematopoietic stem cells, HSC)는 일반적으로 골수에 있지만 혈액 내로 밀어 넣을 수 있다. 이 과정은 말초 혈액에서 많은 수의 HSC를 임상적으로 채취하는데 사용된다. 선택되는 동원 제제 (mobilizing agent) 는 과립구 콜로니- 자극 인자 (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)이다.
말초 혈액에서 순환하는 CD34+ 조혈 모세포 또는 전구 세포는 G-CSF와 같은 조혈 성장 인자의 외부 투여 후 동요하지 않는 상태 또는 동원 (mobilization) 후에 분리반출법(apheresis) 기술에 의해 수집 될 수 있다. 동원 후 채취 한 줄기 세포 또는 전구 세포의 수는 섭동하지 않은 상태에서 채취 한 세포 수보다 크다. 본 발명의 특정 측면에서, 세포 집단의 근원은 생체 내에서 (in vivo) 조혈모세포(조혈줄기세포) 또는 전구 세포를 풍부하게 할 필요가 없기 때문에 외래적으로 적용되는 인자에 의해 세포가 동원되지 않은 대상이다..
본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 세포 집단은 인간 세포, 비인간 영장류 세포, 설치류 세포 (예: 마우스 또는 래트), 소 세포, 양 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 및 고양이 세포 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 비 - 인간 영장류 세포는 붉은 털 원숭이 세포를 포함한다. 세포는 동물, 예를 들어 인간 환자로부터 수득 될 수 있거나, 세포주로부터 유래 될 수 있다. 세포가 동물로부터 수득되는 경우, 세포는 그대로, 예컨대 분리되지 않은 세포 (즉, 혼합된 집단)로서 사용될 수 있다; 예를 들어, 변형에 의해 처음 배양 시에(in culture first) 확립되었을 수 있다. 또는 예비 정제 방법(preliminary purification methods)을 거쳤을 수도 있다. 예를 들어, 세포 집단은 세포 표면 마커의 발현에 기초한 양성 또는 음성 선별에 의해 조작될 수 있다; 시험관 내 또는 생체 내에서 하나 이상의 항원으로 자극될 수 있다; 시험관 내 또는 생체 내에서 하나 이상의 생물학적 변형제로 처리 될 수 있다; 또는 이들 중 일부 또는 전부의 조합을 포함 할 수 있다.
세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC), 혼합된 개체군, 비장 세포, 골수 세포, 종양 침윤 림프구, 백혈구 제거술 (leukapheresis)로 얻은 세포, 생검 조직 (biopsy tissue), 림프절 (예를 들어 종양에서 배수되는 (draining) 림프절)등을 포함하는 전혈 또는 그 분획물을 포함한다. 적절한 공여체 (donors)는 면역화된 공여체, 면역화되지 않은 (나이브) 공여체, 처리된 또는 처리되지 않은(treated or untreated) 공여체를 포함한다. "처리된 (treated)" 공여체는 하나 이상의 생물학적 변형자(biological modifiers)에 노출된 공여체이다. "처리되지 않은(untreated)" 공여체는 하나 이상의 생물학적 변형자(biological modifiers)에 노출되지 않았다.
예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 당업계에 공지된 방법에 따라 기술된 바와 같이 수득될 수 있 다. 이러한 방법의 예는 Kim et al. (1992); Biswas et al. (1990); Biswas et al. (1991)에 기술되어 있다.
세포 집단으로부터 전구 세포를 얻는 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 전구 세포는 hSCF, hFLT3 및/또는 IL-3 (Akkina 등, 1996)과 같은 다양한 사이토카인을 사용하여 증식되거나, CD34+ 세포는 MACS 또는 FACS를 사용하여 농축될 수 있다. 상기 언급 한 바와 같이, 음성 선택 기술은 또한 CD34+ 세포를 풍부하게 하는데 사용될 수 있다.
또한 피험자로부터 세포 샘플을 얻은 다음 원하는 세포 유형에 맞게 세포 샘플을 풍부하게 하는 것도 가능하다. 예를 들어, PBMC 및/ 또는 CD34+ 조혈 세포(hematopoietic cells)는 본원에 기술된 바와 같이 혈액으로부터 분리될 수 있다. 세포는 또한 원하는 세포 유형의 세포 표면상의 에피토프에 결합하는 항체와의 단리 및/또는 활성화와 같은 다양한 기술을 사용하여 다른 세포로부터 분리될 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 수용체 참여(receptor engagemen)에 의해 세포를 활성화시키지 않고 특정 세포 유형을 선택적으로 풍부하게 하기 위해 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하는 음성 선택을 포함한다.
골수 세포는 장골, 대퇴골, 경골, 척추, 갈비뼈 또는 기타 골수 공간(medullary spaces)에서 얻을 수 있다. 골수는 환자에게서 꺼내 져서 다양한 분리 및 세척 과정을 통해 격리될 수 있다. 골수 세포를 단리하기 위한 예시적인 절차는 하기 단계를 포함한다: a) 골수 현탁액을 세 부분으로 원심 분리하고 중간 분획 또는 버피 코트 (buffycoat)를 수집하는 단계; b) 단계 (a)로부터의 버피 코트 분획을 분리 유체(separation fluid), 일반적으로 Ficoll (Pharmacia Fine Chemicals A의 상표)에서 한번 더 원심 분리하고, 골수 세포를 함유하는 중간 분획을 수집하고; 및 c) 재반출 가능한 골수 세포의 회수를 위해 단계 (b)로부터 수집 된 분획을 세척하는 단계.
B. 다능성 줄기 세포(Pluripotent Stem Cells)
본원에 기술된 조성물 및 방법에 적합한 세포는 조혈모세포(hematopoietic stem)일 수 있고 전구 세포는 체외에서 다능성 줄기 세포의 분화로부터 조제될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 세포는 ATO에 직접 시딩된 다능성 줄기 세포(배아 줄기 세포 또는 유도된만능줄기세포)이다. 추가 실시예에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용되는 세포는 PSC의 유도체 또는 자손인데, 예를 들어 중배엽 전구 세포, 혈장 내피 전구 세포 또는 조혈 전구 세포 (hematopoietic progenitors)이나 이에 제한되는 것은 아니다.
"다능성 줄기 세포 또는 만능줄기세포 (pluripotent stem cell)"라는 용어는 3 개의 모든 배엽층, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽 세포를 생성할 수 있는 세포를 의미한다. 이론적으로 다능성 줄기 세포가 신체의 어떤 세포로 분화될 수 있지만, 다능성의 실험적 결정은 전형적으로 다능성(만능) 세포를 각 세포 층의 여러 세포 유형으로 분화하는 것에 기초한다. 일부 실시예에서, 다능성 줄기 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 배아 줄기 (ES) 세포이다. 다른 실시 양태에서, 다능성 줄기 세포는 체세포를 재프로그램함으로써 유도된 유도된 다능성 줄기 세포(유도만능줄기세포)이다. 특정 구체 예에서, 다능성 줄기 세포는 체세포 핵 전달에 의해 유도된 배아 줄기 세포이다.
배아 줄기 (ES) 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리에서 유래된 다능성 세포이다. ES 세포는 발달중인 배아의 외부 trophectoderm 층(layer)을 제거한 다음 비-성장 세포 (non-growing cells)의 피더 층 (feeder layer)에서 내부 대량 세포를 배양하여 분리할 수 있다. 적절한 조건 하에서, 증식 및 미분화 ES 세포의 콜로니가 생성된다. 콜로니를 제거하고 개별 세포로 분리 한 다음 신선한 피더 층에 다시 옮길 수 있다. 재분화된 세포는 계속 증식하여 미분화된 ES 세포의 새로운 콜로니를 생성할 수 있다. 그런 다음 새로운 콜로니를 제거하고 분리하고 다시 채취하여 성장시킬 수 있다. 미분화 된 ES 세포를 "계대 배양 (subculturing)" 또는 "패시징 (passaging)"하는 이러한 과정은 미분화된 ES 세포를 함유하는 세포주를 생산하기 위해 여러 번 반복 될 수 있다 (미국 특허 제 5,843,780 호, 6,200,806 호, 7,029,913 호). "1 차 세포 배양"은 배반포 (blastocyst)의 내부 세포 덩어리와 같은 조직으로부터 직접 얻은 세포 배양이다. "계대 배양 (subculture)"은 1 차 세포 세포배양으로부터 유래된 임의의 배양이다.
마우스 ES 세포를 얻는 방법은 잘 알려져 있다. 한 가지 방법으로, 마우스의 129 균주로 부터의 이식 전 배반포를 마우스 항혈청으로 처리하여 영양외배엽(trophoectoderm)을 제거하고, 태아 송아지 혈청을 함유하는 배지에서 화학적으로 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 피더 세포 층에서 배양한다. 발생하는 미분화된 ES 세포의 콜로니를 태아 송아지 혈청의 존재하에 마우스 배아 섬유 아세포 피더 층에서 계대 배양하여 ES 세포의 개체군을 생성시킨다. 일부 방법에서, 마우스 ES 세포는 혈청 함유 배지에 사이토카인 LIF (cytokine leukemia inhibitory factor)를 첨가함으로써 피더 레이어가 없는 경우에 증식될 수 있다(Smith, 2000). 다른 방법들에서, 마우스 ES 세포는 뼈형성 단백질(bone morphogenetic protein) 과 LIF (Ying et al., 2003)의 존재 하에 무-혈청 배지에서 배양할 수 있다.
인간 ES 세포는 이전에 기술된 방법 (Thomson et al., 1995; Thomson et al., 1998; Thomson and Marshall, 1998; Reubinoff et al, 2000)을 사용하여 배반포에서 얻을 수 있다. 5 일(day-5) 인간 배반포를 토끼 항 - 인간 비장 세포 항혈청(rabbit anti-human spleen cell antiserum에 노출시킨 다음 기니아 피그(Guinea pig) 보충물을 1 : 5로 희석한 것에 노출하여 영양외배엽 세포(trophectoderm cells)를 용해시키는 방법이 있다. 손상되지 않은 내부 세포 덩어리에서 용해된 영양외배엽(trophectoderm) 세포를 제거한 후, 내부 세포 덩어리를 감마-불활성화 마우스 배아 섬유 아세포(gamma-inactivated mouse embryonic fibroblast)의 피더 층 및 태아 소 혈청 존재 하에서 배양한다. 9 일 내지 15 일 후, 내부 세포 덩어리(mass)로부터 유래된 세포 덩어리(clumps)는 화학적으로 (즉, 트립신에 노출 시키거나) 또는 기계적으로 해리시키거나 태아 소 혈청 및 마우스 배아 섬유아세포의 피더 층을 함유하는 새로운 배지에서 재전위될(replated) 수 있다. 추가의 증식에 따라, 미분화된 형태(undifferentiated morphology)를 갖는 콜로니가 마이크로 피펫에 의해 선택되고, 기계적으로 덩어리(clumps)로 해리되고, 재전위된다 (replated)(미국 특허 제 6,833,269 호 참조). ES-유사 모폴로지 (ES-like morphology)는 핵:세포질 비율(nucleus to cytoplasm ratio)이 매우 높고 두드러진 핵소체(prominent nucleoli)를 갖는, 소형 콜로니로 특징 지어진다. 결과 ES 세포는 간단한 트립신처리법(trypsinization) 또는 마이크로피펫(micropipette)에 의한 개체 콜로니(individual colonies)의 선택에 의해 일상적으로(routinely) 패시징(passaging, 계대배양)될 수 있다. 일부 방법에서 인간의 ES 세포는 기본 섬유아세포 성장 인자 (Amit et al., 2000)의 존재 하에서 섬유아세포의 피더 층(feeder layer)에서 ES 세포를 배양함으로써 혈청없이 성장시킬 수 있다. 다른 방법으로, 인간 ES 세포는 기본 섬유 아세포 성장 인자 (Xu 등, 2001)를 함유하는 "컨디셔닝 된"배지의 존재 하에 MatrigelTM 또는 라미닌과 같은 단백질 매트릭스상에서 세포를 배양하여 피더 세포 층 없이 성장시킬 수 있다. 배지는 섬유아세포와 공동 배양하여 미리 컨디셔닝한다.
붉은 털 원숭이(Rhesus monkey)와 비단원숭이(common marmoset) ES 세포를 분리하는 방법도 알려져 있다(Thomson, and Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson and Odorico, 2000).
ES 세포의 또 다른 공급원은 ES 세포주이다. 다양한 마우스 세포주 및 인간 ES 세포주가 공지되어 있으며 이들의 성장 및 번식을 위한 조건이 정의되었다. 예를 들어, 마우스 CGR8 세포주는 마우스 변종 129 배아(mouse strain 129 embryos)의 내부 세포 덩어리로부터 확립되었고, CGR8 세포의 배양물은 피더 층 없이 LIF의 존재 하에 성장할 수 있다. 추가 예로서, 인간 ES 세포주 H1, H7, H9, H13 및 H14는 Thompson et al. 에 의해 확립되었고 또한, H9 계열의 서브 클론 H9.1 및 H9.2가 개발되었다.
ES 세포의 공급원(source)은 배반포(blastocyst), 배반포의 내부 세포 배양으로부터 유래된 배아, 또는 확립된 세포주의 배양물로부터 얻어진 세포 일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "ES 세포(ES cells)"는 배반포의 내부 세포 질량 세포(inner cell mass cells), 내부 질량 세포의 배양물로부터 수득된 ES 세포 및 ES 세포주의 배양 물로부터 수득된 ES 세포를 지칭 할 수 있다.
유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem, iPS) 세포는 ES 세포의 특징을 가지나 분화된 체세포의 재프로그램에 의해 얻어지는 세포이다. 유도만능줄기세포는 다양한 방법으로 얻어졌다. 한 방법으로 레트로바이러스 형질도입(retroviral transduction)을 이용하여 성인 인간 피부 섬유아세포(adult human dermal fibroblasts)에 전사 인자 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4를 형질주입시켰다 (Takahashi et al., 2007). 형질주입(또는 형질감염)된 세포를 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)가 보충된 배지에서 SNL 피더 세포 (LIF를 생산하는 마우스 세포 섬유아세포 세포주)에 도말한다. 약 25 일 후에, 인간 ES 세포 콜로니와 유사한 콜로니가 배양물에 나타난다. ES 세포와 같은 콜로니를 추출하고 bFGF의 존재 하에 피더 세포에서 증식시켰다.
세포 특성에 따라, ES 세포-유사 콜로니의 세포가 만능줄기 세포로 유도된다. 유도만능줄기세포는 형태학적으로 인간 ES 세포와 유사하며 다양한 인간 ES 세포 마커를 발현한다. 또한, 인간 ES 세포의 분화를 초래하는 것으로 알려진 조건 하에서 성장시킬 때, 유도만능 줄기세포는 그에 따라 분화된다. 예를 들어, 유도만능줄기세포는 신경 조직 및 신경 마커를 갖는 세포로 분화 될 수 있다.
또 다른 방법으로는 인간 태아 또는 신생 섬유 아세포 (human fetal or newborn fibroblasts)에 렌티 바이러스 형질 도입 (Oct et al., 2007)을 사용하여 Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 4 가지 유전자를 형질주입시킨다. 주입(감염) 후 12-20 일에, 인간 ES 세포 형태를 가진 콜로니가 보인다. 콜로니를 골라 증식시킨다. 콜로니를 구성하는 유도 만능줄기세포는 인간 ES 세포와 형태학적으로 유사하고, 다양한 인간 ES 세포 마커를 발현하며, 마우스에 주입 한 후 신경 조직, 연골 및 장 상피(gut epithelium)를 갖는 기형 종(teratomas)을 형성한다.
마우스로부터 유도만능줄기세포를 제조하는 방법 또한 공지되어 있다(Takahashi and Yamanaka, 2006). iPS 세포의 유도는 일반적으로 Sox 계통의 적어도 하나의 구성원과 Oct 계의 적어도 하나의 구성원에 대한 노출 또는 노출을 필요로 한다. Sox와 Oct는 ES 세포의 동일성을 규정하는 전사 조절 계급(transcriptional regulatory hierarchy)의 핵심이라고 여겨진다. 예를 들어, Sox는 Sox-1, Sox-2, Sox-3, Sox-15 또는 Sox-18 일 수 있다. Oct은 Oct-4 일 수 있습니다. 추가 인자는 Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc와 같은 추가 인자는 재프로그램 효율을 증가시킬 수 있다. 재조합 인자(reprogramming factors)의 특정 세트는 Sox-2, Oct-4, Nanog 및 선택적으로 Lin-2을 포함하는 세트 일 수 있고; 또는 Sox-2, Oct4, Klf 및 선택적으로 c-Myc를 포함할 수 있다.
ES 세포와 같은 IPS 세포는 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4 (Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute Bethesda MD), TRA-1-60 및 TRA-1-81 81 (Andrews et al., 1987) 항체를 사용하여 면역 조직 화학 염색이나 유동 세포 계측법으로 확인하거나 확인할 수 있는 특징적인 항원을 가지고 있다. 배아 줄기 세포의 다능성 (pluripotency)은 8-12 주령의 수컷 SCID 생쥐의 뒷다리 근육에 약 0.5-10 X 106 세포를 주사함으로써 확인될 수 있다. 세 가지 배엽층(three germ layers) 각각에 적어도 하나의 세포 유형을 나타내는 기형 종(Teratomas)이 발생한다.
XI. 분화 세포의 유전적 변형(Genetic Alteration of Differentiated Cells)
특정 구체예에서, 세포는 분화 전 또는 후에 세포의 유전자 조작에 의한 하나 이상의 유전자 변형을 포함하도록 제조 될 수 있다 (US 2002/0168766). 외인성 핵산 또는 폴리뉴클레오티드가 인공 조작의 임의의 적합한 수단에 의해 세포 내로 전달되거나 세포가 원래의 자손 인 경우 세포는 "유전적으로 변형된(genetically altered)", "유전자 변형된(genetically modified)"또는 "트랜스 제닉 (transgenic)"이라고 한다. 폴리뉴클레오티드를 물려받은 변형된 세포. 예를 들어, 제한된 발달 계통 세포 (restricted developmental lineage cells) 또는 말단 분화 세포로 진행하기 전이나 후에 텔로머라아제 역전사 효소를 발현하도록 유전적으로 세포를 변형시킴으로써 세포를 복제 잠재력을 증가시키도록 가공 할 수 있다 (US 2003/0022367).
특정 실시예에서, 외인성 핵산 컨스트럭(exogenous nucleic acid construct)을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커, 예컨대 선택 가능 또는 스크리닝 가능한 마커를 포함시킴으로써 시험관 내 또는 생체 내에서(in vitro or in vivo) 동정될 수 있다. 이러한 마커는 세포에 식별 가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유하는 세포를 용이하게 동정하거나 또는 조직 특이적 프로모터를 사용하여 분화된 심장 세포를 풍부하게 하거나 식별하는 것을 돕는다. 예를 들어, 심근 세포 분화의 측면에서, 심장 트로포닌 I (cTnI), 심장 트로포닌 T (cTnT), 혈청 미오신 중쇄 (sarcomeric myosin heavy chain, MHC), GATA-4, Nkx2.5, N-카데린(N-cadherin), β1-아드레노셉터(β1-adrenoceptor), ANF, MEF-2 계열의 전사 인자 (MEF-2 family of transcription factors), 크레아티닌 키나아제 MB (CK-MB), 미오글로빈(myoglobin) 또는 ANF (atrial natriuretic factor)의 프로모터와 같은 심장 특이적인 프로모터가 사용될 수 있다.
뉴런 분화의 측면에서, TuJ-1, Map-2, Dcx 또는 시냅신(Synapsin)을 포함하나 이에 한정되지 않는 뉴런 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 간세포 분화 측면에서, ATF, Cyp3a4, ASGPR, FoxA2, HNF4a 또는 AFP를 포함 하나 이에 한정되지 않는 최종 내배엽- (definitive endoderm-) 및/또는 간세포-특이적 프로모터가 사용될 수 있다.
일반적으로 선별 마커(selectable marker)는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 마커이다. 양성 선별 마커(positive selectable marker)는 마커의 존재가 선택을 허용하는 것이고, 음성 선별 마커 (negative selectable marker)는 선별이 불가능한 마커이다. 양성 선별 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로 약물 선택 마커를 포함시키면 형질전환체 (transformants)의 복제 및 동정을 돕는다. 　예를 들어 블라스티딘(blasticidin), 네오마이신(neomycin), 퓨로마이신(puromycin), 하이그로마이신(hygromycin), DHFR, GPT, 제오신(zeocin) 및 히스티디놀(histidinol)에 저항성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 구현에 기초한 형질 전환체의 판별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커 이외에, 비색 분석 (colorimetric analysis)에 근거한 GFP와 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함하는 다른 유형의 마커도 또한 고려된다. 대안으로, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (chloramphenicol acetyltransferase, CAT)와 같은 스크리닝 가능한 효소가 이용될 수 있다. 당업자는 FACS 분석과 함께 면역 마커를 사용하는 방법을 알고 있을 것이다. 사용된 마커는 유전자 산물을 코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선택 가능하고 스크리닝 가능한 마커의 추가의 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.
XII. 질병 및 상태의 치료 (Treatment of Disease and Conditions)
그러한 질병 (such disorders)에 대해 양성 반응을 보인 환자, 질병의 증상이 하나 이상인 사람, 또는 그러한 상태 또는 관련 상태로 진행할 위험이 있는 것으로 간주되는 사람에 대해서는 방법을 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 본원에 기재된 및/또는 당업계에 공지된 질병의 염증성 또는 자가 면역 요소(inflammatory or autoimmune component)를 치료하는 데 사용된다.
본원의 특정 측면은 암의 치료 및/또는 암 항원의 사용에 관한 것이다. 치료될 암 또는 항원은 당업계에 공지된 임의의 암 또는 예를 들어 상피암 (예를 들어, 유방, 위장관, 폐), 전립선 암, 방광암, 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암), 결장암, 난소 암, 뇌암, 위암, 신장 세포 암, 췌장암, 간암, 식도암, 두경부암 또는 대장암과 관련된다. 일부 실시 양태에서, 치료될 암 또는 항원은 하기 암 중 하나에 속한다: 부신피질암종(adenocortical carcinoma), 무증상골수이형성(agnogenic myeloid metaplasia), AIDS- 관련 암 (예컨대, AIDS- 관련 림프종),, 항문암(anal cancer), 맹장암(appendix cancer), 성상세포종(astrocytoma) (예, 소뇌 및 대뇌(erebellar and cerebral)), 기저세포암종(basal cell carcinoma), 담관암(bile duct cancer)(예를 들어, 외인성(extrahepatic)), 방광암(bladder cancer), 골육종 (골육종 및 악성 섬유성 조직 구종), 뇌종양(예를 들어 신경 교종, 뇌 줄기 교종, 소뇌 또는 대뇌 성상 세포종 (예 : 유선 성상 세포종, 미만 성상 세포종, 퇴행성 (악성) 성상 세포종), 악성신경교종, 상의세포종(ependymoma), 올리고덴글리오마(oligodenglioma), 수막종(meningioma), meningiosarcoma, 두개인두종(craniopharyngioma), 혈관아세포종(haemangioblastomas), 수아세포종(medulloblastoma), 원시신경외배엽종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumors), 시상하부교종(visual pathway and hypothalamic glioma, and glioblastoma), 유방암(breast cancer), 기관지선종/유암종(bronchial adenomas/carcinoids), 칼시노이드 종양(carcinoid tumor)(예, 위장 칼시노이드 종양(astrointestinal carcinoid tumor)), 알수없는 원발성의 암종(arcinoma of unknown primary, 중추신경계림프종(central nervous system lymphoma, cervical cancer), 대장암(colon cancer), 결장 직장암(colorectal cancer), 만성골수증식성질환(chronic myeloproliferative disorders), 자궁내막암(endometrial cancer)(예, 자궁암(uterine cancer)), 척수내 종양(ependymoma), 식도암(esophageal cancer), EFT(Ewing's family of tumors), 안암(e.g., 안구 흑색 종 및 망막 아세포종), 담낭암, 위암 (위) 암, 위장 칼시노이드 종양, GIST(gastrointestinal stromal tumor), 배아 세포 종양 (예를 들어, extracranial, extragonadal, 난소), 임신성 영양 융모성 종양, 두경부암, 간암((e.g., hepatic carcinoma and heptoma), 식도암(hypopharyngeal cancer), 아일릿 셀 칼시노마(islet cell carcinoma (endocrine pancreas)), 후두암, 백혈병, 구강 및 구강암, 구강암, 간암, 폐암 (예, 소세포폐암, 비소세포성폐암, 폐샘암종, 및 폐편평암종), 림프 종양 (예 : 림프종), 수모세포종 (meduloblastoma), 난소암, 중피종(mesothelioma), 전이성 편평 상피암, 구강암, 다발성 내분비 신 생물 증후군, 골수 이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성질환 (myelodysplastic/myeloproliferative diseases), 비강 및 부비동암, 비인두암, 아세포종, 신경내분비암, 구강인두암, 난소암(예, 난소상피암, 난소암세포종, 난소저악성종양(low malignant potential tumor)), 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 복막암, 인두암, 갈색 세포종, 파인베라종, 원시신경외배엽종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumors), 뇌하수체 종양, 흉막과 폐의 모세포종(pleuropulmonary blastoma), 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종 (microglioma), 폐림프관평괄근종 (pulmonary lymphangiomyomatosis), 직장암, 신장암, 신장 골반및요관암 (횡문근 세포 암), 횡문근 육종, 타액선 암, 피부암 (예를 들어, 비 흑색 종 (예를 들어, 편평 세포 암종), 흑색 종 및 메르켈 세포 암), 소장암, 편평세포암, 고환암, 후두암, 흉선종 및 흉선 암, 갑상선암, 결절 경화증, 요도 암, 질암, 외음부암, 윌름스 종양(Wilms'tumor), PTLD(이식 후 림프 증식성 장애(Post-transplant lymphoproliferative disorder)), 모반증과 관련된 비정상적인 혈관증식(abnormal vascular proliferation associated with phakomatoses), 부종(뇌종양과 관련된 것과 같은) 또는 메이그 증후군(Meigs' syndrome)
본 발명의 특정 측면은 자가 면역 상태의 치료 및/또는 자가 면역 관련 항원의 사용에 관한 것이다. 치료될 면역 질환 또는 항원은 당업계의 공지된 임의의 자가면역 조건과 관련된 항원일 수 있다. 예를 들어, 당뇨병, 이식거부(graft rejection), GVHC, 관절염 (급성 관절염, 만성 류마티스 관절염과 같은 류마티스성 관절염, 통풍 또는 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 급성 면역 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, II 형 콜라겐 유도 관절염, 감염성 관절염, 라임 관절염, 증식 성 관절염, 건선 관절염과 같은 류마티스 관절염 관절염, 스틸 병 (Still's disease), 척추 관절염 및 유년기에 발병하는 류마티스 관절염, 골관절염, 관절염 증후군, 변형 관절염, 다발성 관절염 프리마리아, 반응성 관절염 및 강직성 척추염), 염증성 과증식성 피부 질환, 건선, 건선염, 건초열 및 욥의 증후군과 같은 아토피성 질환을 포함하는 아토피 (atopy including atopic diseases such as hay fever and Job's syndrome), 접촉성 피부염을 포함한 피부염, 만성 접촉 성 피부염, 박리 성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기 성 접촉 성 피부염, 포진 성 피부염, 천식 피부염, 지루성 피부염, 비 특이성 피부염, 1 차 자극 접촉 피부염, 아토피성 피부염, x-링크된 하이퍼 IgM 증후군 (x-linked hyper IgM 증후군), 알레르기성 안구내 염증성 질환, 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기와 같은 두드러기 (만성자가 면역 두드러기 포함), 근염, 다발성 근염/피부 근염, 청소년 피부 근염, 독성 표피 괴사, 경피증 (전신성 피부 경화증 포함), 전신경화증, 스피노-옵티칼 (spino-optical) MS(multiple sclerosis)와 같은 다발성 경화증, 1차진행성 MS(PPMS), 및 RRMS(relapsing remitting MS), 진행성 전신 경화증, 죽상 동맥 경화증, 동맥 경화증, 경화증 전파증(sclerosis disseminate), 운동성 경화증(ataxic sclerosis), 시속척수염(neuromyelitis optica, NMO), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD) (예 : 크론 병, 자가 면역 매개 위장병, 궤양성 대장염과 같은 대장염, 궤양 성 결장염, 현미경 적 결장염, 콜라겐 성 대장염, 폴립 대장염, 괴사 성 장염 및 전측성 대장염, 자가 면역 염증성 장 질환), 장 염증, 괴저성 농피증, 홍반 결절, 원발성 경화성 담관염, 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)을 포함하는 호흡 곤란 증후군, 수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 　 자가 면역 혈액 질환, 류마티스 척추염, 류마티스성 활액막염, 유전성 혈관 부종, 수막염과 같은 뇌 신경 손상, 헤르페스 임신 (herpes gestationis), 천포창 임신 (pemphigoid gestationis), 음낭염(pruritis scroti), 자가 면역 조기 난소 부전 (autoimmune premature ovarian failure), 자가 면역 상태로 인한 갑작스러운 청력 상실, 아나필락시스 및 알레르기 성 및 아토피성 비염과 같은 IgE 매개성 질환, 라스무센 (Rasmussen) 뇌염과 같은 뇌염, 변연계 및/또는 뇌간 뇌염(limbic and/or brainstem encephalitis), 전방 포도막염, 급성 전방 포도막염, 육아 종성 포도막염, 비과민성 포도막염, phacoantigenic 포도막염, 후천성 포도막염 또는 자가 면역 포도막염과 같은 포도막염, 만성 또는 급성 사구체 신염과 같은 신 증후군 (nephrotic syndrome) 유무에 무관한 사구체 신염 (GN), 　 면역 매개 된 GN, 막성 GN (막성 신 병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신 병증, 유형 I 및 유형 II를 포함하는 멤브레인 또는 멤브레인 증식성 GN (MPGN), 급속진행사구체신염, 증식성 신염, 자가면역다발성내분비기능상실(autoimmune polyglandular endocrine failure), 귀두염 (balanitis including balanitis circumscripta plasmacellularis, balanoposthitis), 원심성환상홍반(rythema annulare centrifugum), 고정이색소성홍반(erythema dyschromicum perstans), 다형삼출성홍반증후군(eythema multiform), 환상육아종(granuloma annulare), 광택태선(lichen nitidus), 경화성위축성태선(lichen sclerosus et atrophicus), 만성단순태선및양진(lichen simplex chronicus), 극상태선(lichen spinulosus), 편평태선(lichen planus), 층판비늘증(lamellar ichthyosis), 표피박리각화다각증(epidermolytic hyperkeratosis), 각화증(premalignant keratosis), 괴저성농피증(pyoderma gangrenosum), 알러지 반응 (allergic conditions and responses, allergic reaction), 알레르기 성 또는 아토피 성 습진을 포함한 습진, 만성적인 습진, 한포진, 수포성 습진(vesicular palmoplantar eczema), 기관지 천식과 같은 천식 및 자가 면역 천식, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 포함하는 증상, 임신 중 태아 A-B-O 혈액형과 같은 외래 항원에 대한 면역 반응, 만성 폐 염증성 질환, 자가 면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스 대뇌염, 소아 낭창, 비 신장 루푸스 (non-renal lupus), 신장 외 루푸스 (extra-renal lupus), 원판성 루푸스 등과 같은 루푸스, 원반 모양 홍 반성 루푸스, 탈모 루프스, 피부 SLE와 같은 전신성 홍 반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus ,SLE) 또는 급성 피부 SLE, 신생아 루퍼스 증후군 (NLE), 및 소아 인슐린 의존성 진성 당뇨병 (IDDM)을 비롯한 청소년 발병 형 (I 형) 당뇨병, 성인 발병 당뇨병 (II 형 당뇨병) 및 자가 면역 당뇨병 등이 있다. 또한, 다음에 의해 매개되는 급성 및 지연 성 과민성과 관련된 면역 반응이 고려된다; 사이토카인 및 T-림포사이트, 유육종증, 림프절 육아 종증을 포함한 육아 종증, 베게너 육아 종증, 무과립구증, 혈관염, 대 혈관염(including polymyalgia rheumatica and gianT cell (Takayasu's) arteritis), 중 - 혈관염 (카와사키 병 및 결절성 다발 동맥염 / 결절 동맥 주위염 포함), 미세 혈관염, 면역 혈관염, CNS 혈관염, 피부 혈관염, 과민 혈관염, 전신성 괴사 성 혈관염과 같은 괴사 성 혈관염, Churg-Strauss 혈관염 또는 증후군 (CSS) 및 ANCA 관련 소 혈관염, 일시적인 동맥염, 재생 불량성 빈혈,자가 면역성 재생 불량성 빈혈, Coombs 양성 빈혈 등의 ANCA 관련 혈관염, 다이아몬드 블랙 팬 빈혈, 용혈성 빈혈 또는자가 면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 애디슨 병,자가 면역 호중구 감소증, 범 혈구 감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 수태와 관련된 질병, CNS 염증성 질환, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 패혈증, 외상 또는 출혈에 이르는 여러 장기 손상 증후군, 항원 - 항체 복합체 매개 질환, 항 사구체 기저막 질환, 항 인지질 항체 증후군, 알레르기 성 신경염, 베체트 질병/증후군, 캐슬 만 증후군, 굿파 슈어 (Goodpasture's) 증후군, Reynaud 증후군, Sjogren 증후군, Stevens-Johnson 증후군, 수포와 피부 천포창과 같은 유사천포창, 천포창(pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus, pemphigus mucus-membrane pemphigoid, 및 pemphigus erythematosus 포함), 자가면역질환(autoimmune polyendocrinopathies,), 면역 복합체 신염과 같은 면역 복합체 장애, 항체 매개 성 신염, 다발성 신경 병증, 만성 신경 병증, 예컨대 IgM 다발성 신경 병증 또는 IgM 매개성 신경 병증, 만성 또는 급성 ITP를 포함하는 특발성 혈소판 감소성 자반병 (ITP)과 같은 자가 면역 또는 면역 매개 혈소판 감소증, 하시모토 병, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 갑상선 기능 항진증 (갑상선 기능 항진증), 갑상선 기능 항진증 (갑상선 기능 항진증) 등의 갑상선염을 포함하는 자가 면역 내분비 계 질환, 특발성 갑상선 기능 저하증, 그레이브 병, 자가 면역 다발성 증후군 (또는 다모 내피 병증 증후군)과 같은 다발성 증후군, 램버트-이튼 근 기능 항진 증후군 (Lambert-Eaton myasthenic syndrome) 또는 이튼-램버트 증후군 (Eaton-Lambert syndrome)과 같은 신경 학적 이상 종양 증후군을 포함한 종양 형성 증후군, 스티프-맨 또는 스티프-퍼슨(stiff-man or stiff-person) 증후군, 뇌척수염, 예컨대, 알러지성 뇌척수염 및 실험적 알러지성 뇌척수염(EAE), 실험적 자가면역 뇌척수염, 중증 근무력증, 예컨대, 흉선종-연관 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근긴장증, 눈간대경련 또는 안구간대경련-근간대경련 증후군(OMS), 및 감각신경병증, 다초점성 운동신경병증, 쉬한 증후군(Sheehan's syndrome), 자가면역성 간염, 만성 간염, 루포이드 간염, 거대 세포 간염, 만성 활동 간염 또는 자가면역 만성 활동 간염, 림프성 간질성 폐렴(LIP), 폐색성 세기관지염(비-이식) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군, 버거 병(IgA 신증), 특발성 IgA 신증, 선형 IgA 피부병, 급성 열성 호중성 피부병, 각질하 농포병, 일과성 가시세포분리 피부병, 간경화, 예컨대, 원발성 담즙성 간경변 및 폐렴성 간경변, 자가면역성 장염 증후군, 소아 지방변증 또는 만성 소화 장애증, 복강 스프루 (글루텐 장염), 내화성 스프루, 특발성 스프루, 저온 글로블린 혈증, 근 위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭 병), 관상 동맥 질환, 자가면역성 귀 질환, 예컨대, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 청력 상실, 다발성 연골염, 예컨대, 난치성 또는 재발성 다발성 연골염, 폐포 단백증, 코간 증후군/비 영양성 간질 각막염, 벨 마비(Bell's palsy), 스위트병, 스위트 증후군, 자가면역 빨간 코, 대상 포진 관련 통증, 아밀로이드증, 비-암성 림프구증, 단일클론성 B 세포 림프구 증가증 (예: 양성 단일클론성 간질 병증 및 의미미결정 단일클론성 간질 병증(MGUS)을 포함하는 원발성 림프구 증식, 말초 신경 병증, 부신생물증후근, 이온통로병증, 예컨대, 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기적 마비, 및 CNS의 이온통로병증, 자폐증, 염증성 근병증, 국소 또는 분절성 또는 국소 분절성 사구체 경화증 (FSGS), 내분비 안과 질환, 포도막염, 맥락 망막염, 자가면역성 간질환, 섬유근통, 다발성 내분비 장애, 슈미트 증후군, 부신염, 위 위축, 선행성 치매, 탈수 초성 질환, 예컨대, 자가면역 탈수 초성 질환 및 만성 염증성 탈수 초성 다발성 신경 병증, 드레슬러(Dressler) 증후군, 탈모증, 전두 탈모, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동 장애, 수지경화증 및 모세 혈관 확장증), 남성 및 여성의자가 면역 불임, 예컨대, 항-정자성 항체, 혼합 결합 조직 질환에 기인한 불임, 샤가스 병, 류마티스 열, 재발성 낙태, 농부 폐, 다형 홍반, 포스트-심장절개 증후군, 쿠싱 증후군, 애조가의 폐, 알레르기성 육아 종성 혈관염, 양성 림프성 혈관염, 알포트 증후군, 폐포 염, 예컨대, 알레르기 성 폐포염 및 섬유화 폐포 염, 간질 성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 기생충 질병, 예컨대, 리슈만 편모충 증, 키파노모니아 증(kypanosomiasis), 주혈 흡충증, 회충증, 아스페르길루스 증, 샘터(Sampter) 증후군, 캐 플란 증후군, 뎅기열, 심내막염, 내심근 섬유증, 분산성 간질 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭포 섬유증, 내안구염, 지속 유기성 홍반, 적혈구 태아염, 호산 구성 막염, 슐멘 증후군, 펠티 증후군, 플라 파리시스(flariasis), 섬모체염, 예컨대, 만성 뇌염, 이형성 뇌염, 홍채 모양체 염(급성 또는 만성), 또는 푹스(Fuch's) 섬모체염, 헤노크-숀 레인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 감염, SCID, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 에코 바이러스 감염, 패혈증, 내독소 혈증, 췌장염, 갑상선 항진증, 파보 바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 예방 접종 후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 유행성 이하선염, 에반 증후군, 자가 면역성 생식선 부전증, 시 덴햄 무도병, 연쇄 구균성 신염, 폐색성 현전혈관염, 갑상선 중독증, 척수매독, 맥락막염, 거대 세포 다발근육 통증, 만성 과민성 폐렴, 건성 각결막염, 전염성 각결막염, 특발성 신염 증후군, 미세변화성 신증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 이식 기관 재관류, 망막 자가 면역증, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성기도/폐 질환, 규폐증, 아프타(aphthae), 아프타스성 구내염, 동맥 경화성 장애, 아스페르니오제네스(asperniogenese), 자가 면역성 용혈, 보크 병, 저온성 글로불린 혈증, 듀프리으렌 구축(Dupuytren's contracture), 수정체 과민성 안내염(endophthalmia phacoanaphylactica), 알러지성 장염, 나성 결절 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 열성 류마티즘(febris rheumatic), 햄맨-리치 병, 감각 신경성 난청, 발작성 혈색소뇨증(Haemoglobinuria paroxysmatica), 성선 기능 저하증, 회장염, 백혈구 감소증, 단핵구증 감염증, 트래버스(traverse) 골수염, 주요 특발성 점액 수종, 신염, 안염 증후군, 과립 육아종, 췌장염, 급성 다발성 신경근염, 괴저성 농피증, 퀘르베인 (quervain) 갑상선염, 후천적 스패닉 위축(acquired spenic atrophy), 비-악성 흉선종, 백반, 독성-쇼크 증후군, 식중독, T 세포의 침윤을 수반하는 증상, 백혈구-부착 결핍증, 사이토카인 및 T-임파구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민증과 관련된 면역 반응, 백혈구 누출과 관련된 질환, 다발성 장기 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 알러지성 신경염, 자가 면역 다내분비성 병증, 난소염, 일차적 점액부종, 자가 면역성 위축성 위염, 교감성 안념, 류마티스성 질환, 혼합 결합 조직 질환, 신장 증후군, 췌도 염, 다내분비성 장애, 자가 면역성 다낭 증후군 Ⅰ 형, 성인-발병 특발성 부갑상선 기능 항진증(AOIH), 심근 병증, 예컨대, 확장성 심근 병증, 후천성 표피 수포증(EBA), 혈색소 침착증, 심근염, 신 증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비-다발성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골, 정면, 상악 또는 접형동 축농증, 호산구 관련 장애, 예컨대, 호산구 증가증, 폐 침윤성 호산구 증가증, 호산구성 근육통증 증후군, 로플러 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 호산구성 폐렴, 기관지 폐렴성 아스페르길루스 증, 아스페르길루스증 또는 호산구를 함유하는 육아종, 과민증, 혈청 음성 척추 관절염, 다내분비성 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막(sclera), 상공막, 만성 피부 점막 칸디다증, 브루턴 증후군, 일과성 저감마 글로불린 혈증, 위스 코트-알드리치 증후군, 모세혈관 확장성 운동실조 증후군, 혈관 확장증, 콜라겐 질환과 관련된 자가 면역 질환, 류마티즘, 신경 질환, 림프절염, 혈압 반응 감소, 혈관 장애, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각 과민증, 신장 허혈, 대뇌 허혈 및 혈관 형성을 수반하는 질병, 알러기성 과민성 장애, 사구체 신염, 재관류 손상, 허혈성 재관류 장애, 근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 림프종성 기관기관지염, 염증성 피부병, 급성 염증 성분으로 인한 피부병, 다발성 장기 부전, 수포성 질환, 신장 피질 괴사, 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증성 질환, 안구 및 안와 염증 질환, 과립구 수혈-관련 증후군, 사이토킨-유도 독성, 기면증, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 홍채염, 내분비 과형성, 소화성 궤양, 판막염, 이식편 대 숙주 병, 접촉 과민증, 천식성기도 과잉 반응 및 자궁 내막증.
본 발명의 다른 양태는 미생물 감염의 치료 또는 예방, 및/또는 미생물 항원의 사용에 관한 것이다. 치료되거나 예방되는 미생물 감염 또는 항원은 공지의 모든 미생물 감염과 관련될 수 있으며, 예컨대, 탄저병, 자궁 경부암(인간 유두종 바이러스), 디프테리아, A형 간염, B형 간염, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Hib), 인간 유두종 바이러스(HPV), 인플루엔자(독감), 일본 뇌염(JE), 라임 병, 홍역, 수막 구균, 원두(monkeypox), 유행성 이하선염, 백일해, 폐렴 구균, 소아마비, 광견병, 로타 바이러스, 풍진, 대상 포진(herpes zoster), 천연두, 파상풍, 장티푸스, 결핵(TB), 수두 및 황열이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 질환을 예방하기 위해 개인에게 백신 접종할 수 있는 것일 수 있다.
XIII.실시예
하기 실시 예는 본 발명의 바람직한 실시 양태를 설명하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내므로 그 실시를 위해 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주 될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 그러나, 당업자는 본 개시물에 비추어 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시 예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 여전히 유사하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1 - T 세포 생산을 위한 3D 오가노이드 시스템의 개발
인간 T 세포 성숙을 위한 3D 오가노이드 시스템(off-the-shelf)의 개발
목표는 T 세포 분화 및 선택에서 3D 상호 작용의 역할을 연구하기 위한 표준화 된 인공 흉선 유기체 시스템을 개발하기 위해 OP9-DL1 시스템에 의해 예시 된 바와 같이 노치(Notch) 리간드가 형질도입 된 스트로마 세포주의 능력을 바탕으로 한 것이다. OP9-DL1 세포는 장기간의 배양에서는 안정적이지 않지만, T 세포의 지지력을 유지하고 지방 세포의 형질 전환을 막기 위해 며칠 마다 세포를 바꿔줄 필요가 있다. 3D 배양이 몇 주 동안 안정적으로 유지되어야 하기 때문에 장기간의 손상되지 않은 배양을 허용하는 배지 및 세포 구성 요소를 확인하고자 하였다. 또한, OP9-DL1 시스템의 효능은 태아 송아지 혈청 (FCS) 로트(lots)의 생물학적 변이에 매우 민감하므로 T 세포 분화를 재현할 수 있는 무 혈청 배양 조건을 확인하고자 하였다.
무 혈청 B27 보충제, FLT3L, IL-7 및 아스코르빈산(이하 RB27)이 보충된 RPMI가 OP9-DL1 시스템 내 T 세포 분화를 표준 혈청 조건과 유사한 정도까지 촉진 시켰지만 스트로마 세포 생존율 및 조혈 세포 증식은 저조했다. 대조적으로, MS-5 마우스 골수 스트로마 세포주(bone marrow stromal cell line)는 RB27에서 장기간 생존력을 유지하였지만 예상대로 T 세포 분화를 지지하지는 못했다. 이에, RB27에서 장기간 안정성을 지닌 T 세포 지지 라인(T supportive line)을 만들기 위해 전장 인간 DLL1 cDNA (이하 MS5-hDLL1)를 가진 MS-5 세포를 형질도입 시켰다. DLL1은 DLL1자체로부터 선별되어 인간 흉선에서 발현되는 생리학적으로 적절한 노치 리간드 인 것으로 나타났다. 이러한 조건에서 T 세포 분화를 시험하기 위해, 제대혈 (CB) CD34+ HSPC는 CD3+ 세포를 FACS 고갈시키고 MS5-hDLL1 단층 위에 시딩 하였다. 무 혈청 RB27에서의 MS5-hDLL1 공동 배양은 CB HSPC로부터 T 세포 리니지 커밋먼트(T lineage commitment) 및 초기 T 세포 분화를 지원하였다. 표준 배지 조건에서 OP9-DL1 시스템에 비해 RB27의 조혈 모세포 증식은 MS5-hDLL1에서 더 낮았지만 T 세포 분화의 순도(purity)와 정도(extent)는 시스템 간 유사했다. MS5-hDLL1은 T 세포 전구체의 β 선택을 지원하여 적은 수의 CD3+ TCRαβ+ 세포를 만들었지만, OP9-DL1 시스템에서와 같이 이들은 DP 단계에서 크게 정지되어 손상된 양성 선택을 나타낸다.
다음으로, MS5-hDLL1 / 무혈청RB27을 사용하여 표준화 된 3D 인공 흉선 오가노이드(artificial thymic organoid, ATO) 시스템을 제조하였다. ATO를 만들기 위해 MS5-hDLL1 세포를 T 세포가 고갈된 인간 제대혈 (CD) CD34+ HSPC로 응집시켰다. 접근성과 재현성을 극대화하기 위해 마우스 재조합 흉선 장기 배양 (RTOC)에서 채택된 원심 분리 재조합 접근법을 사용하는 대신 독점적 스캐폴드 물질 또는 외인성 ECM의 사용을 피했다. RTOC의 데이터가 공기 - 액체 계면 배양이 T 세포 성숙을 향상시킨다는 것을 입증했기 때문에, ATO는 상업적으로 이용 가능한 0.4um 트랜스 웰 인서트에 배치되었다. 새로운 스트로마 층(stromal lyers)에 조혈 세포를 연속적으로 전달해야 하는 단층 공동 배양과 달리 ATO는 10 주까지 그대로 배양하였으며, 인서트 주위에서 매주 2 회 배지 및 사이토 카인을 교체하였다. 배치되면 ATO는 응집력 있는 3D 구조를 형성한다. ATO는 2 주까지 광학 현미경 하에서 매우 세포질이었고 10 주까지 외관이 안정하게 유지되었다. 일부 구체 예에서, 구조물은 캡슐화된다.
CB CD34+ CD3- HSPC로 시작된 ATO는 OP9-DL1 또는 MS5-hDLL1 단일 층 공-배양(co-culture)에 비해 T 세포 리니지 분화(T lineage differentiation)의 속도가 가속되었다. 2주차 ATO에서, T 세포 리니지 커밋먼트(T lineage commitment)는 T 세포로 분화 결정된(T-committed) CD34+ CD1a+ CD7+ 초기 흉선 전구체 (ETP) 표현형의 뚜렷한 출현뿐 아니라pro-T1 및 pro-T2 표현형에 의해 나타났다. 예상대로, CD34+ CD1a+ CD7+ ETP 단계 이상의 T 세포 분화는 골수 및 B 세포 성숙을 지지하는 부모 MS-5 세포주로 생성된 유기체에서는 관찰되지 않았다. ATO 내에서, CD34-CD7+ CD5 + CD4- CD8- ("이중 음성", double negative, DN) T 세포 전구체는 2 주째에 세포의 대다수를 차지했으며, 그 후 CD7+ CD4+ CD3- 미성숙 단일 양성 (ISP) 및 CD4+ CD8+ 이중 양성(DP) 집단의 상호 증가로 감소했다. ATO에서의 초기 T 세포 분화는 정돈되어 있고 원래의 사람의 흉선과 매우 유사하다.
다음으로 ATO 내 ß- 선별과 양성 선택의 효율성을 조사했다. ATO DP 전구체는 2 주째에 CD3와 TCRαβ의 표면 발현을 나타냈는데, 이는 6 주까지 증가하여 β- 선택을 통한 성공적인 이동을 나타낸다. ATO에서 CD3+ TCRαβ+ DP 세포의 빈도는 OP9-DL1 및 MS5-hDLL1 단층 세포 배양과 비교하여 모두 높았던 인간 흉선의 빈도와 비슷했다. 중요한 것은 성숙한 CD3+ TCRα+ CD8+ 및 CD4+ single positive (SP) T 세포가 ATO에서 4 주차에 나타났으며, 7주까지 빈도가 증가하면서, ATO의 기능적인 양성 선택과 일치하는 결과를 나타내었다. 7주차 ATO에서 CD3+ TCRα+ CD8+ 및 CD4+ SP 세포의 빈도는 표본이 일치된 OP9-DL1 및 MS5-hDLL1 단층 세포 배양액에서보다 높았다. CD3+ TCRα+ CD8+ 및 CD4+ SP 세포가 모두 ATO에서 관찰되었지만, CD8+ 세포 대 CD4+ 세포의 비율은 인간 흉선보다 높았으며, 이는 ATO에서 양성으로 선택된 CD8+ 세포의 상대적 우위를 나타낸다.
마지막으로, CD3+ TCRγ∂+ 세포는 ATO에서 쉽게 확인되었고, 주로 흉선과 유사한 CD8- CD4-였다. 종합적으로 말하자면, 이 데이터는 ATO가 신속하고 강력한 T 세포 분화를 촉진하고, 단층 공동 배양 시스템과 비교하여 성숙한 인간 T 세포의 양성 선택을 크게 개선한다는 것을 입증한다.
ATO에서 TCR 다양성과 기능성, 나이브 T 세포(naive T cells)의 생성
다음으로 ATO에서 생성된 T 세포가 다양한 TCR을 발현하고 기능적으로 성숙 한지 여부를 확인하였다. ATO에서 생성 된 CD3+ CD8 SP T 세포 내에서 TCR Vβ 사슬 분절 사용의 유동세포 계측 분석은 인간의 흉선(thymi)에서 분리된 CD8 SP 세포와 유사한 분포를 나타내었으며, 다양한 폴리클로날 TCR 레퍼토리와 일치한다. 　ATO 유래 CD3+ TCRαβ+ SP T 세포는 또한 CD45RO의 하향 조절 및 CD45RA, CD27 및 CCR7의 상향 조절에 기초한 성숙한 나이브 표현형을 입증 하였다. 주목할 점은 CD3+ TCRαβ+ CD8 및 CD4 SP 세포의 하위 집합은 CD45RO+ CD45RA- 였지만 이들은 CD1α의 발현으로 인해 기억 T 세포보다는 DP 전구체로부터 유래된 미성숙 T 세포로 확인되었는데, CD1α의 발현은 CD45RO와 마찬가지로 흉선 내 성숙과 흉선 퇴출(thymic egress) 전에 하향 조절된다. 다음으로, ATO 유래 T 세포가 항원 자극에 반응하여 활성화 및 클론성 증식(clonal expansion) 능력을 확인하였다. 예상한 바와 같이, 정제 된 ATO 유래 CD8 SP T 세포는 TCR 신호 모방체(TCR-signaling mimetics) PMA / 이오노마이신에 반응하여 인터페론 감마 (IFNg)를 발현하고, CD3/28 결합 및 IL-2에 반응하여 활성화 유도된 증식을 나타내었으며, 이는 CFSE 희석 및 CD25의 상향 조절에 의해 입증되었다. 따라서, ATO는 다양한 TCR 레퍼토리를 가진 기능적이고, 나이브한 T 세포를 생성 할 수 있다.
다양한(multiple) 조혈 조직으로부터 T 세포의 생성
이전의 보고서에 의하면, 가동화된 말초 혈액을 포함한 성인 HSPC 공급원으로부터의 T 세포 성숙은 OP9-DL1 시스템 내에서 매우 비효율적인 것으로 나타났다. 반대로, T 세포의 성숙은 높은 빈도의 림프구로 분화가 결정된 전구체(lymphoid-committed progenitors) 및 T 세포로 분화가 결정된 전구체(T cell-committed progenitors)로 인해 CB 및 출생 후의 흉선으로부터 분리된 CD34+ HSPC로부터 특히 효율적일 수 있다. 이에, 본 발명자들은 말초 혈액, G-CSF 가동화 된 말초 혈액 및 정상 상태의 성인 골수에서 분리된 정제된 CD34+ HSPC로부터 T 세포의 성숙을 돕는 ATO의 능력을 시험 하였다. ATO의 T 세포 성숙이 제대혈과 유사한 효율로 분석된 모든 출처에서 진행되었고 비슷한 수의 성숙 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 생성한다는 것을 발견했다. 또한, 제대혈, 골수 및 가동된 말초 혈액으로부터 조혈 줄기 세포에 대해 고도로 농축된, 정제된 CD34+ Lin- CD38- CD45RA- HSPC는 비슷한 효율로 T 세포를 생성했다. 　따라서 ATO는 임상적으로 관련성이 있는 HSPC의 출처를 개발할 수 있으며 다양한 줄기 세포 및 전구 세포 유형에서 T 세포 리니지의 잠재력과 T 세포 분화를 연구하는 데 유용한 연구 도구로 사용될 수 있다.
ATO의 구조적 측면
ATO에서 T 세포 분화의 구조적 측면을 검사했다. 2 ~ 6 주 사이의 ATO의 연속 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 섹션은 작고 세포질 조직(cellular tissue)과 같은 구조를 보여주었다. CD3에 대한 면역형광염색은 CD3+ 세포가 ATO의 바깥쪽에 우선적으로 밀집된 클러스터를 형성 함을 보여 주었다. 따라서, ATO에서의 T 세포 성숙은 인간 흉선 내에서의 상태와 유사한 다수의 조혈 세포 사이의 세포 - 세포 접촉을 용이하게 하는 세포 구조 내에서 발생한다.
ATO에서 조작된 항원 특이적 T 세포의 분화 및 대립유전자배제(allelic exclusion)
암 관련 또는 바이러스성 펩타이드-MHC (pMHC) 복합체에 대한 특이성을 갖는 TCR의 말초혈액 T 세포에서의 강제 발현은 항 종양 및 항 바이러스 면역 요법에 대한 유망한 접근법이다. HSPC로부터의 항원 특이적 T 세포의 새로운 생성은 말초 T 세포의 TCR 형질 도입에 대한 안전성 및 효능에 상당한 이점을 제공 할 수 있다. 기능성 T 세포가 ATO에서 생성됨에 따라, 시스템이 CD34+ HSPC로부터 TCR-조작된 항원-특이적 T 세포를 생성하는 능력을 갖추었는지 테스트하였다.
건강한 공여자의 제대혈 CD34+ HSPC는 HLA-A*0201에 의해 제시된 암 관련 NY-ESO-1157-165 펩티드에 특이적 이도록 미리 특성화시킨 렌티 바이러스의 TCRαß 구조체로 형질도입 되었다. HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165 테트라머(tetramer)및 형질도입 된 Vβ13.1 절편에 대한 항체를 사용하여 ATO에서의 항원 특이적 세포 분화를 관찰 하였다. ATO에서 3 주째 초기 분석시 테트라머의 양성 세포의 분명한 분화가 있었고, 이들 모두는 Vβ13.1과 표면 CD3에 양성이었다. 흥미롭게도, CD3 및 형질 감염된 TCR의 동시 발현은 CD34-CD7+ CD5+ DN 세포 및 CD4 ISP- 유사 및 DP- 유사 T 세포 전구체에서 처음으로 관찰되었으나, 4-6 주부터는 DP 및 CD8 SP 개체군에 점차적으로 국한되었다. 이는 기능적 TCR이 있는 DN 단계에서 β- 선택의 우회와 일치하며, 상대적으로 보존된 분화 및 적절한 MHC 클래스 I 제한된 양성 선택이 뒤따랐다. 이와 대조적으로, 대조군 ATO로부터의 모의-형질 전환 세포는 DP 단계에서 CD3 및 TCRαβ의 정상 발현을 나타내었고, 이어서 CD8+ 및 CD4+ T 세포 모두의 양성 선별이 나타났다. 이러한 관찰은 형질 전환 TCR에 의한 내인성 TCR α 및 β 유전자좌의 대립유전자 배제와 일치하였다. 실제로, tetramer+ CD3+ CD8 SP 세포의 > 95 %는 형질 전환된 Vβ13.1 분절을 대체 분절을 제외하고 표현했다.
다음으로, ATO 유래의 항원 특이적 T 세포가 기능적으로 성숙한 것을 확인했다. 　모의-형질도입된 (mock-transduced) ATO의 CD8 SP T 세포와 마찬가지로 tetramer+ CD8 SP 세포는 성숙하고, 나이브 CD45RA+ CD45RO-CD1alow CD27+ CCR7+ 표현형으로 분화되었다. 대조군 ATO에서와 같이, 잔류 CD45RO+ 세포는 CD1a 양성이었고, 활성화 / 기억 표현형과는 대조적으로 DP 풀 로부터의 최근 출현과 일치한다. Tetramer+ CD8 SP T 세포 (또는 대조군-형질도입 된ATO로부터의 동등한 TCRαβ+ CD8 SP 세포)를 분류하고 HLA-A*0201, 베타 2- 마이크로 글로불린, CD80 및 NY-ESO-1157-165 (ESO +) 또는 MART-1의 무관한 대조 펩타이드(MART1+)를 동시에 발현하는 K562 기반의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 노출시켰다. 예상대로 항원 특이적 T 세포는 ESO+에 반응하여 인터페론 감마를 생산하고 탈과립 되었지만 (LAMP1 / CD107a의 막 트래피킹으로 표시) MART1+ aAPC는 반응하지 않았다. mock-transduced ATO의 T 세포는 aAPC에 반응하여 유의한 활성화를 겪지 않았다. 항원 특이적 T 세포는 또한 ESO+ aAPC에 반응하여 증식되었다. aAPC에 의해 매개된 시험관 내(in vitro) 증식은 14 일 이상 유지 될 수 있었다. 마지막으로, 항원 특이적 T 세포는 HLA-A*0201+ K562 표적 세포가 NY-ESO-1으로 펄스 되지만 MART1 펩타이드는 펄스로 공격받지 않을 때 항원 특이적인 종양 세포 살해를 입증했다. 종합하여, ATO는 기능적인 항원 특이적 T 세포의 새로운 생성 및 조작을 위한 견고한 시스템을 제공한다.
ATO는 구체적 선택 과정을 연구하고 향상시키기 위해 조작할 수 있음이 입증되었다. 흉선에서의 양성 선택은 발달 중인 흉선 세포와 피질 상피 세포 (cTEC)의 상호 작용을 통해 일어난다. cTEC가 없는 ATO에서, 양성 선별은 자가 조혈 세포에서의 자기 MHC와의 상호 작용에 의해 매개된다는 가설을 세웠다. 이것을 시험하기 위해, HLA-A*0201 양성 및 음성 공여자로부터 제공된 CB HSPC를 HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165 특이적 TCR로 형질 전환시키고, ATO에서 T 세포로 분화 시켰다. 이 모델을 사용하여, 공여자의 HLA-A*0201이 CD8SP세포 비율을 증가시켰으며 CCR7의 상향 조절과 같이 양성 선택 (Positive selection)의 강화와 관련된 질적 변화를 유도함을 발견하였다. 흥미롭게도 ATO내 MS5-hDLL1 스트로마 세포에서 HLA-A*02:01의 이소성 발현은 HLA-A*02:01 음성 공여자의 ATO 내 CD8SP 비율을 완만하게 증가시켰고, HLA-A*02:01 양성 공여자의 HSPC를 갖는 ATO내에서는 크게 증가시켰다. 이것은 양성으로 선택된 항원 특이적 T 세포의 생성을 증진시키기 위해 인간 HLA를 형질 도입에 의해 조작 될 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 동종이형 TCR 과 MHC-형질 전환된 스트로마와 함께 사용되는 ATO는 인간 T 세포에서의 양성 선별에 대한 역학 연구를 위해 정확하게 정의된 시스템을 제공한다.
실시예2- 인간 흉선 오가노이드는 인간 조혈모 줄기 세포로부터 TCR이 조작된 T 세포의 양성 선별 및 대립유전자배제를 유도한다.
조작된 T 세포 치료법은 암 및 만성 바이러스 감염 치료를 위한 전례 없는 기회를 제공한다. 조혈모세포와 전구세포 (HSPC)로부터 직접 조작된 T 세포를 생성하는 능력은 동종반응성(alloreactivity)을 포함하여 말초 혈액 T 세포의 사용과 관련된 주요 치료 한계를 극복할 잠재력을 가지고 있다. 본 명세서에는 제대혈, 골수 및 말초 혈액 HSPC로부터의 유래한 그대로 및 TCR이 조작된 사람 T 세포의 고효율의 시험관 내 (in vitro) 분화 및 양성 선택을 지원하는 임상 관련 인공 흉선 기관 (ATO) 시스템이 기재되어있다. ATO 유래 T 세포는 나이브 표현형, 다양한 TCR 레퍼토리 및 TCR 의존성 활성화 및 증식을 보여주었다. ATO 에서 유래된 TCR이 조작된 T 세포는 또한 나이브 표현형으로 성숙되었으며, 또한 대립 유전자 배제의 유도와 일치하는 내인성 TCR 발현의 거의 완전한 결핍을 보였다. 따라서 ATO는 입양면역치료(adoptive cell therapy)를 위한 비접촉, 비동종 반응성을 갖는 조작된 T 세포의 생성을 위한 간단하고 직접적인 방법을 제시한다.
항원 특이적 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 조작된 T 세포를 이용한 입양 세포 치료는 악성 종양 및 만성 바이러스 감염에 대한 표적 치료 방법을 제공한다. 현재의 전략은 성숙한 순환 T 세포의 유전적 변형 및 생체 외(ex vivo) 증식에 의존한다. 이러한 접근법은 감소된 항원-특이적 반응성 또는 자가 면역의 유도 가능성과 함께 재주입후의 생체 내(in vivo) 활성 감소 및 형질 전환과 내인성 TCR 사슬 간의 오 정렬(mispairing) 등 주요 치료 한계를 보여준다. 게다가 내인성 TCR 발현에 의해 나타나는 동종반응성은 자가 T 세포(autologous T cells)의 사용에 대한 대부분의 접근방법을 제한하게 하여, 궁극적으로 이는 비용 증가, 제한된 생산 능력 및 림프구 감소증에 있어서 환자의 치료가능 자격 미달을 통한 치료 접근성을 제한할 수 있다. 조혈모세포와 전구세포(HSPC)로부터 유래된 조작된 T세포의 시험관 내 생성은 나이브 항원 특이적 T 세포의 신규(de novo) 생성 및 대립 유전자 배제를 통한 내인성 TCR 발현의 억제를 동시에 허용함으로써 이러한 문제를 해결할 수 있다.
흉선에서의 T 세포 성숙(development)의 시공간적인 복잡성 때문에, 시험 관내 T 세포 분화의 방법은 지금까지 인간 T 세포 성숙을 완전히 재현해 낼 수 없었다. 이러한 방법의 주요한 진보는 노치 리간드로 형질도입 된 마우스 스트로마 세포주가, 고전적인 OP9-DL1 공-배양 시스템에서 입증된 바와 같이, 마우스 또는 인간 HSPC로부터 시험관 내 T 세포 분화가 가능하게 해줄 수 있다는 발견이었다. 이 단일 층 (monolayer) 및 단일 층 유사 시스템에서, 인간 HSPC는 T 세포 리니지 커밋먼트(T lineage commitment) 및 초기 T 세포 분화과정을 겪는다. 그러나 생산적으로 재배열 된 TCR을 가진 T 세포 전구세포의 양성 선택은 손상되고 CD8+ 또는 CD4+ 단일 양성(Single Positive, SP) T 세포에 대한 성숙이 최소화된다. 본 발명자 및 다른 사람들은 마우스 또는 인간의 흉선 조직을 사용하는 3차원(3D) 오가노이드 시스템이 시험관 내에서 인간 T 세포의 양성 선별 및 성숙을 개선 시킨다는 것을 보여주었다. 그러나 이러한 시스템은 낮은 세포 생성율, 높은 실험적 가변성 및 1차 흉선 조직에 대한 의존성으로 인해 치료용 T 세포의 생성에 적합하지 않다. 따라서, 본 발명자들은 표준 성분, 재현성 및 증식성과 같은 중요한 번역(translation) 특성을 유지하면서 HSPC로부터 인간 T 세포의 분화 및 양성 선택을 가능하게 하는 인공 오가노이드 시스템의 개발하고자 하였다.
이 실시예에서는 DLL1이 형질 전환된 스토로마 세포주와 혈청이 없는 기성 요소를 기반으로 하는 인공 흉선 오가노이드 (ATO) 시스템의 개발에 대해 기술한다. 단층 시스템과 달리, ATO는 인간 제대혈, 골수 및 말초 혈액의 CD34+HSPC로부터 인간 CD3+TCRαβ+ CD8SP 및 CD4SP T 세포의 시험관 내 분화, 양성 선택 및 성숙을 강력히 보여준다. ATO 유래 성숙 T 세포는 항원 자극에 반응하여 항원 나이브 표현형, 다양한 TCR 레퍼토리 및 활성화/증식을 나타냈다. ATO는 종양 관련 항원 NY-ESO-1에 특이적인 HLA-A*02:01 제한적 TCR로 형질 도입된 HSPC로 부터 항원 특이적 TCR이 조작된 T 세포의 매우 효율적인 분화를 지원했다. ATO 유래의 조작된 T 세포는 나이브 표현형을 나타내었으며 항원 특이적 활성화 및 세포 독성 프라이밍을 거쳤다. 또한, TCR이 조작된 T 세포의 양성 선택은 ATO 스토로마 세포에서 동족 (cognate) 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)의 발현에 의해 더욱 강화되었다. 마지막으로, ATO에서 생성된 TCR-조작 T세포는 성숙 동안 대립배제 유도와 일치하는 내인성 TCR 발현의 거의 완전한 결핍을 나타내었고, 입양 세포 치료를 위해 비동종 반응성의 조작된 T 세포를 생성시키는 직접적이고 효율적인 방법을 제안 하였다.
A. 결과
1. 시험관내 인체 T 세포 분화를 위한 최적화된 인공 흉선 오가노이드 시스템 개발
한 가지 목표는 HSPC로부터의 사람 T 세포의 시험관 내 양성 선별 및 성숙을 지원할 수 있는 임상에 적용 가능한 오가노이드 시스템을 개발하는 것이었다. 일차 흉선 조직의 사용을 피하기 위해, DLL1이 형질도입 된 스트로마 세포주가 3D 오가노이드 배양에서 인간 T 세포의 성숙을 지원하는 능력을 테스트하였다. 본 발명자들과 다른 과학자들은OP9-DL1 시스템에서의 T 세포 분화가 송아지 태아 혈청의 특정 로트(lot) 및 스트로마 세포의 빈번한 변화에 의존적이기 때문에 매우 가변적이라는 사실을 관찰하였기 때문에, 오가노이드 배양 시 T 세포의 분화를 지속적으로 할 수 있는 무혈청 조건을 알아내고자 하였다. 독점적 소유권이 있는 스캐폴드 물질의 사용을 피하기 위해, 본 발명자들은 원심 분리에 의해 스트로마 세포를 HSPC와 응집시키고 공기-액체 계면에서 세포 배양 인서트 상에 놓아 만든 흉선 조직-기반의 오가노이드에서 효과가 있는 것으로 입증된 압축 재응집 기술(compaction reaggregation technique)을 사용 하였다 (도 3A). 이3차원 배양에서, 발명자들은 인간 DLL1 (이하, MS5-hDLL1)으로 형질도입 된 MS-5 마우스 골수 스트로마 세포주가 T 세포가 고갈된 CD34+ 탯줄 혈액(CB) HSPC로부터 인간 T 세포 분화의 강력하게 도와주는 것으로 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 뉴런 및 배아 줄기 세포 배양에 다중 성분 첨가제로 사용하는 B27 및 FLT3L, IL-7 및 아스코르빈산(ascorbic acid)("RB27", 이하 "RB27")이 보충된 RPMI가 MS5 - hDLL1 오가노이드 배양시 인간 T 세포 분화를 강력하게 지속적으로 도와주는 새로운 무혈청 배지라는 것을 확인하였다.
이 최적화된 인공 흉선 오가노이드(ATO) 시스템은 2주까지 CD5+ CD7+ 세포의 우세와 CD4 ISP 및 CD4+ CD8+ (DP) 세포의 출현에 의해 보여지는 바와 같이 CB CD34+ CD3- HSPC의 신속하고 확실한 T 세포 리니지 커밋먼트를 유도하였다(도 3B). 성숙한 CD3+ TCRαβ 세포는 2 주째에 나타났으며 시간이 지남에 따라 증가하여 6 주에 평균 25 %에 이르렀다 (도 3B 및 G). CD3+ TCRαβ 세포는 주로 초기 시점에서 DP 가 우세하였으나 점차적으로 CD8SP로 성숙되었고, CD4SP T 세포는 어느 정도 ATO에서의 양성 선택과 일치하였다.
ATO는 기간이 연장된 배양에서도 초기 전구세포로부터 T 세포 분화를 계속 지속시켰다. 6 주째, 다능성(multipotent) CD34+ CD7- CD1a- 초기 흉선 전구 세포 (ETP) 및 다운스트림(downstream) CD34+ CD7+ CD1a- 및 CD34+ CD7+ CD1a+ T 리니지 전구 세포를 포함한 3 가지 모든 표현형 단계가 존재 하였다 (도 3C). Pro-T1 및 pro-T2 전구체 표현형도 대체분류법(alternative classification schem)에 기초한 CD34+ 분획에서 확인되었다(도 3C). CD19+ B 세포 빈도는 시간이 지남에 따라 감소하였고, NK 세포 및 골수 세포 빈도는 전반적으로 낮았다 (도 3B, F-G). ATO의 조직학적 절편은 CD3에 대해 양성인 클러스터를 이루는 풍부한 림프구 세포(데이터는 나타내지 않음)를 갖는 조밀하고 조직과 유사한 구조를 나타냈다 (도 3D). 입력 HSPC에 대한 상대적인 ATO에서의 세포 증식은 6 주차에서 평균 80 배였고 (도 3E), 상이한 생물학적 CB 단위 사이에서 증식의 변화가 관찰되었지만, 전구세포 및 성숙 T 세포는 모든 샘플 (n = 18)에서 일관되게 생성되었다(도 3G). 전체 세포 증식은 또한 출발 세포 수 및 HSPC 대 스트로마 세포의 비율과 반비례 관계에 있으며, 일부 조합에서는 입력 HSPC보다 최대 800배 증가 하였다 (도 9A, B). 기술적인 복제물 (n = 11)과 다른 많은 B27 (n = 4) (도 10A-C)에 걸쳐 세포 증식 및 T 세포 분화 모두의 높은 재현성이 관찰되었다. 임상 적용에 대한 중요성의 면에서, 제노프리(Xeno-free) B27 (인간 혈청 알부민 함유) (도 10D-E) 또는 조사된 스트로마 세포 (도 10F-B)로 보충된 배지를 사용하는 ATO에서 유사한 T 세포 분화가 관찰되었다.
동일한 공여자 CB HSPC를 사용하는 OP9-DL1 단층 배양 시스템과 비교할 때, ATO는 CD3+ TCRαβ T 세포의 현저히 많은 생성을 보여주었다 (도 11A-C). 이전 보고와 마찬가지로, OP9-DL1 단층은 ETP, pro-T 및 CD4 ISP 단계를 통한 효율적인 T 세포 리니지 커밋먼트 (CD7+ CD5+) 및 진행을 지지하였으나 DP, CD3+ TCRαβ 및 성숙 SP 세포의 비효율적인 생성을 보여주었다. 그런데 이들 모두는 ATO에서 쉽게 성숙되었다 (도 11B-C). 실제로, 최적의 양성 선별 및 성숙은 상기 ATO 시스템의 3 가지 구성 요소: 즉 3D 구조, MS5-hDLL1 스트로마 세포 및 RB27 배지 (도11A)를 모두 필요로 한다. MS5-hDLL1과 대조적으로, OP9-DL1은 RB27에서 잘 생존하지 못했으며 오가노이드 배양에서는 T 세포 분화가 잘 되지 못했다. DLL1 발현이 결핍된 모(parental) MS-5 세포주는 단층 또는 3D 배양에 있어서 T 세포의 발생을 도와주지 못했다 (도 11a).
요약하면, ATO는 CD34+ HSPC로부터 강력하고 재현 가능한 T 세포 분화를 도와주는 표준화된 무혈청 오가노이드 시스템를 제공하여, 인간 TCRαβ 및 TCRγδ+ T 세포의 양성 선별 및 성숙을 가능하게 한다.
2.　　　　ATO에서의 흉선 나이브 T 세포 발달의 재현
긴 시간 동안 ATO에서 T 세포 분화를 출생 후의 인간의 흉선과 비교되었다.　12 주 CB ATO는 흉선에 대한 T 리니지로 결정된 세포 (CD5+ CD7+) 및 CD34+ T 세포 전구세포가 비슷한 빈도를 보였으나(도 4A), 반면, 12주차에서 DP 및 SP 빈도는 흉선에서 보다 ATO에서 더 진행된 T 세포 성숙을 나타냈다 (도 4A).　흉선에서와 마찬가지로, ATO의 CD3+ 세포의 대부분은 작지만 일정한 TCRγδ+ 집단을 갖는 TCRαβ이었다 (도4A).　 ATO 유래 CD3+ TCRαβ+ 세포 중, 성숙한 CD8SP 및 CD4SP T 세포의 발생은 6-12 주 사이에 증가 하였다 (도 4B 및 도 12A). 흉선과 대조적으로, ATO는 CD4+ T 세포 발달의 느린 발달 속도를 반영하여 CD8SP T 세포에 비례하여 상대적으로 적은 CD4SP T 세포를 나타냈다. 　CD4+세포는 12 주까지 빈도가 계속 증가하였으며, 가장 먼 시간에서 분석하였다 (도 4B 및 도 12A).
흉선에서와 같이, ATO 유래 CD3+ TCRαβ+ CD8SP 및 CD4SP T 세포는 "미성숙한 나이브" (CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7-CD1Ahi)에서 "성숙한 나이브" (CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CD1alo) 표현형으로 변환되었다 (도 4C 및 도 12 A-C). 이러한 변환은 ATO에서 6-12주 사이에 발생하였고, 12주에서 흉선에서보다 ATO에서 성숙한 나이브 T 세포의 빈도가 더 높았다 (도 4C 및 도 12B-C).　 미성숙 및 성숙한 나이브 서브 세트(subset) 모두 CD12L 및 CD28의 공동 발현과 CD127 및 CD31의 공동 발현이 있었고, CD127 및 CD31은 혈액 중 최근의 흉선 이식 T 세포와 관련이 있었다 (도 12B-C).　활성화 마커 CD25는 ATO 유래 CD8SP T 세포에서는 발현되지 않았지만, CD4SP T 세포의 서브 세트에서 관찰되었다 (도 12B-C).　종합적으로 말하자면, 이 데이터는 인간 흉선과 비교하여 ATO에서 T 세포 분화의 현저한 유사성을 보여 주며, 흉선과 혈액에서 발견되는 것과 유사한 선천적인(bona fide) 나이브 T 세포의 출현은 유사성의 정점을 보여준다.
3. 다양한 HSPC 소스 및 서브 세트로부터 T 세포 분화
전구체와 CD3+TCRαβ+ T 세포의 유사한 빈도를 가진 효율적인 T 세포 분화는 임상적으로 관련된 모든 HSPC 소스(Source), 즉 성인 골수 (BM), G-CSF 가동화 된(mobilized) 말초 혈액 (MPB) 및 비-가동화된 말초 혈액 (PB) 에서 보여진다 (도 5A-B 및 도 13A, B). 총 세포 증식은 또한 HSPC 소스들에 걸쳐 비교가능 하였다 (도 13C). CB, BM 또는 MPB로부터의 고도로 농축된 조혈모줄기세포 (HSC) 분획물 (Lin-CD34+ CD38-)은 유사하게 강력한 T 세포 분화를 나타냈으며 (도 5C-D 및 도 13D-E) 이러한 소스들로부터의 T 세포로의 분화 잠재력은 기존의 림프구로 분화가 결정된 전구세포(lymphoid-committed progenitors)와는 독립적이다.
ATO에서 T 세포 분화는 또한 정제된 림프구 전구 세포로부터 시작된다. 　3 주에, 성인 골수(BM)의 림프구 다능성 전구체 (LMPP) 및 CD24- 공통 림프구 전구 세포 (CLP)는 CD4 ISP 및 DP 단계를 통해 HSC 또는 분획화되지 않은 CD34+ HSPC보다 신속하고 효율적으로 분화되었다 (도 5E-F).　대조적으로, 주로 B 및 NK 세포로의 분화 잠재력을 갖는 CD24+ CLP는 ATO에서 잘 성장하지 못했고 낮은 세포 생성(output)을 보여주었다 (도 13F). 　따라서 AT는 인간 줄기 세포 및 전구 세포 집단으로부터 T 계통으로의 분화 잠재력을 평가하는 도구로 사용될 수 있다.
4. ATO 유래 T 세포의 TCR 다양성 및 기능
다음으로 본 발명자들은 ATO에서 생성된 성숙한 T 세포의 TCR 다양성과 기능을 평가하였다. 일반적인 TCR Vβ 절편에 대한 ATO유래 CD3+TCRαβ+CD8SP T 세포의 유동세포 계측법은 인간의 흉선으로부터 대응되는 CD8SP T 세포의 그것과 현저하게 유사한 다양성을 가짐을 나타냈다 (도 6A). 중요하게도 비전형적인 T 세포 서브 세트 또는 클론성으로 성장한 성숙 T 세포에서 각기 유래한 ATO에서 우세한 것이 무엇인지에 대한 논쟁이 있는 것과 달리, 왜곡된 Vβ 사용 또는 클론 선택이 관찰되지 않았다.
ATO 유래 CD8SP T 세포는 PMA/이오노마이신에 대한 반응으로 강한 IFNγ 및 낮은 IL-4의 생산을 나타내었으며, 세포 독성 표현형과도 일치하였다 (도. 6B). CD4SP 세포는 Th1 및 Th2 분극과 각각 일치하는 IFNγ+및 IL-4+ 세포를 생성 하였다;미성숙 상태일 때와 일치하여, 자극에 반응하는 DP 세포는 거의 없었다 (도 B). ATO 유래 CD8SP 세포는 또한 항 CD3/CD28 항체 및 IL-2에 반응하여 CD25의 증식 및 상향 조절을 나타내었다 (도 6C). 또한, CB, BM, 또는 MPB ATO로부터 생성된 CD8SP 세포는 PMA/이오노마이신에 반응하여 IFNγ의 생산과 같은 유사한 반응을 보였고 (도 6D), 시험 관내 항 CD3/CD28 및 IL-2로 확대 생산하였다 (도 6E). 요약하면 ATO에서 생성 된 성숙한 T 세포는 생리학적 TCR 다양성과 항원 자극에 대한 기능적 반응을 나타냈다.
5. ATO에서 TCR이 조작된 나이브 T 세포의 발생
다음으로 본 발명자들은 HSPC로부터의 TCR이 조작된 T 세포의 시험관내(in vitro) 생성을 위해 ATO를 개조하였다. CB CD34+CD3- HSPC는 NY-ESO-1157-165에 특이적인 HLA-A*02:01에 의해 제한된 TCR의 α 및 β 사슬을 암호화하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입되었다. 6 주 후, TCR을 형질 도입한 ATO는 모의 형질도입 된 대조군과 유사한 CD5+CD7+ T수탁세포 (T-commnited cell)의 빈도를 보였으나, CD3+TCRαβ+ T세포는 현저하게 증가하였으며, 변형 된 Vβ13.1 사슬에 대한 항체 또는 테트라머(tetramer)로 염색하여 보는 바와 같이 대다수는 형질 도입된 TCR을 발현 하였다 (도 7A). CD8SP 세포의 빈도는 모의 형질도입 된 대조군의 테트라머+ 세포와 CD3+TCRαβ+ 세포 사이에서 유사하였으나, 테트라머+ CD8SP 세포는 성숙한 나이브 표현형 (즉, CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+ CD1alo)으로의 성숙 가속화를 보여주었다(도 7A). 비-형질도입 ATO와 마찬가지로, 작동(effector)/기억 표현형으로의 분화는 관찰되지 않았다 (도 7A).
또한, TCR 형질 도입은 ATO (도 7B)에서 총 세포 증식을 증가시켰고, 대부분이 테트라머+ CD3+ T 세포였다. 입력 HSPC에 대한 전체 세포 증식은 전형적으로 TCR 형질 도입된 ATO에서 150배 였지만 (도 7A), ATO 당 시작 HSPC 및 스트로마 세포 수를 제한함으로써 700 배 이상으로 증가시킬 수 있었다 (도 7C). 따라서, 7,500 개의 TCR 형질도입 된 HSPC 개시된 단일 ATO는 대략 5x106 세포를 생성할 수 있으며, 그 중 약 7.5x105 개는 (15 %)는 테트라머+ CD3+ CD8SP 성숙한 나이브T 세포였다(도 7A-C).
TCR 형질도입 된 ATO로 부터 ATO-유래 CD8SP 세포는 각각 동족 펩타이드-MHC 및 CD80을 발현하는 인공 항원 제시 세포에 대한 반응으로 IFNγ 생산 및 CD107a 막 가동화(mobilization)에 의해 각기 측정 된 바와 같이, 항원-특이적 활성화 및 탈과립을 겪었으나, 부모 K562 세포에 대한 반응은 없었다. (도 7D). 또한, TCR- 형질 도입된 ATO로부터의 CD8SP T 세포는 모의-형질도입 된 ATO로 부터의 것과 같은 항 CD3/CD28 및 IL-2에 대한 반응으로 동등한 시험관 내 증식을 보였다 (도. 7E).
ATO 유래의 TCR-조작된 T 세포에서의 Vβ 다양성 분석은 98 % 이상의 테트라머+ CD8SP T 세포가 오직 형질 도입된 Vβ13.1 절편만을 발현한다는 것을 보여주었으며, 이는 TCR-조작된 T 세포의 분화 동안 거의 완전한 내인성 TCR발현에 관한 대립 유전자 배제와 일치하였다(도 7F-G). 따라서 ATO는 HSPC에서 유래한 기능성 TCR-조작 T 세포의 강력한 분화와 TCR이 강화된 세포의 확장 도입을 지원하고, 내인성 TCR 발현이 없는 성숙한 나이브 T 세포의 분화를 촉진시켰다.
6. MHC 변형 ATO에서 TCR이 조작된 T 세포의 향상된 양성 선택
흉선에서의 양성 선택은 T 세포 전구체상의 TCR과 흉선 스트로마 세포와 조혈모 세포에 대한 자가(self)-MHC 사이의 상호 작용에 의해 매개된다. 　따라서, ATO에서 "자가" MHC에 대한 조혈모 세포 또는 스트로마 세포의 발현이 TCR 조작된 T 세포의 양성 선택을 향상시킬 수 있는지 여부를 연구하였다. 　HLA-A*02:01 양성 또는 음성 공여자를 이용하여 ATO 내의 양성 선택에 대한 조혈모세포의 자가 MHC의 발현 효과를 시험하였고, 스트로마 세포 MHC 발현은 HLA-A*02:01로 형질 전환 된 MS5-hDLL1 세포를 사용하여 ATO를 생성시킴으로써 시험되었다(도 8A). 모든 경우에 HSPC는 HLA-A*02:01에 제한된 NY-ESO-1 특이적 TCR로 형질도입 되었으며, 양성 선택의 판독값 으로는 tetramer+CD3+CD8SP T 세포의 빈도가 사용되었다.　 조혈모세포의 HLA-A*02:01 발현은 테트라머+ CD8SP T 세포의 양성 선택에 약간의 효과만을 나타냈다(도 8B).　대조적으로, ATO 스트로마 세포에서의 HLA-A*02:01의 발현은 테트라머+ CD8SP T 세포의 양성 선택을 현저하게 증가시켰고, 공여자 조혈모세포의 HLA-02:01 발현과 시너지 효과를 냈다(도 8B). MHC-변형 ATO에서 TCR-조작된 T 세포는 또한 CCR7의 상향 조절 (도 8C)을 포함하여, 성숙한 나이브 표현형에 대한 보다 큰 성숙을 나타내었고, 양성 선택이 강화된 것과 일치하였다.　요약하면, TCR-형질 도입된 HSPC 및 MHC-형질 도입된 스트로마 세포를 포함하는 ATO는 입양세포 치료를 위한 시험관 내(in vitro)에서 유래된 TCR-조작된 T세포의 양성 선택 및 발달을 향상시키는 간단한 방법이자, 시험관 내(in vitro)에서 인간 T 세포의 양성 선택을 모델링 하기 위한 다목적 시스템이다.
B. 논평
시험관 내에서 흉선세포생산(thymopoiesis)을 충실하게 재구성 할 수 있는 능력은 항원이 없는 상태와 내인성 TCR 발현의 결핍을 포함하는 바람직한 치료적 특성을 가진 조작된 T 세포의 생산을 위한 독특한 기회를 창출한다. ATO 시스템은 표준화된 기성품을 사용하여 HSPC로부터의 흉선세포 생산을 충실하게 재현하여, 흉선 또는 말초 혈액으로부터의 순도가 낮은 T 세포와 매우 유사한 성숙 CD3+ TCRαβ+ CD8SP 및 CD4SP T 세포를 생산한다.
ATO는 OP9-DL1 시스템과 같은 시험관 내 T 세포 분화의 기존 방법과 비교하여 명확한 생물학적 및 변환상의 이점을 제공한다. 첫째, ATO는 단일층 시스템에서 장애가 있는 인간 T 세포의 양성 선별 및 발달을 지원한다. ATO에서 향상된 양성 선택은 동일한 ATO 구성 요소로 설정된 단층 배양이 비효율적인 T 세포 분화를 초래하므로 3D 구조에 의존한다. 이것은 흉선 성분을 사용하는 FTOC 또는 재구성 된 3D 배양물에서 낮은 효율에도 불구하고 양성 선택을 지지하는 것과 일치한다. 3D 상호 작용은 T 세포 전구체와 DLL1 같은 성숙 리간드 또는 자가 MHC와 같은 선택적 리간드 사이의 밸런스 및/또는 접촉 지속 시간을 증가시킴으로써 T 세포 성숙을 지원할 수 있다. 또는 3D 구조는 스트로마 세포와 조혈 세포 사이의 크로스토크(crosstalk)를 촉진하거나 2D에서 불가능한 기계적 힘 및/또는 대사 변화를 통해 발달 신호를 T 세포 전구체에 발휘할 수 있다.
종래 방법에 비해 ATO 시스템의 또 다른 주요 이점은 골수 및 휴지기(resting) 또는 가동된(mobilized) 말초 혈액을 포함하는 임상적으로 관련이 있는 성인 HSPC 소스로부터 T 세포 분화가 매우 효율적이라는 점이다. OP9-DL1 시스템을 이용한 연구에서는 CB, BM 또는 MPB16-19의 TCRαβ+ T 세포의 비효율적인 성숙을 보였고, 말초 혈액 HSPC를 위한 데이터는 보고되지 않았다. OP9-DL1에 대한 개선된 T 세포 성숙은 흉선 미세 환경에 의한 이들 전구체 집단의 프라이밍과 일치하는 출생 후의 흉선-유래 CD34+ 세포로 보고되었지만, 인간 흉선(thymi)은 치료적 변환(therapeutic translation)을 위한 HSPC의 비실용적인 소스로 남아있다.
또한 ATO 시스템은 기술적 단순성, 재현성 및 잠재적인 확장성을 제공한다. 무혈청 배지의 사용은 단일 층 시스템에서 태아 송아지 혈청에서 관찰된 현저한 가변성을 피하고 단순한 배지 변경으로 배양 기간 동안 (최대 12 주) ATO를 유지할 수 있는 능력은 세포를 신선한 스트로마 세포로, 단일 층 시스템에서 요구된다. 기성 성분의 사용과 특히 원발성 스트로마 세포(primary stromal cells) 또는 독점적 인공 스캐폴드 재료의 사용과 함께 ATO 생산과 제노프리 시약 및 스트로마 세포 방사선 조사(irradiation)를 결합하는 능력은 ATO의 입양세포치료(adoptive therapy)에 사용하는 T세포 생성을 위한 임상 등급 플랫폼으로의 변환(translation)을 용이하게 한다. 시스템의 단순성은 또한 인간 T 세포 성숙 및 양성 선택의 모델링에 관심 있는 실험실에서 본 방법을 직접 채택 할 수 있게 한다.
여기에 설명된 것처럼 ATO 시스템은 HSPC로부터 TCR 조작된 나이브 T 세포의 시험관 내 생성을 위한 매우 효율적인 방법이다. 인간 HSPC에서 TCR 조작된 T 세포의 분화는 OP9-DL1 시스템에서 입증되었지만, CD8SP 세포의 발달이 제 기능을 하지 못하게 되고(전형적으로 배양물의 0-2 %만 나타냄) 흉선 - 유래CD34+ 세포를 사용하여 얻은 효율이 가장 높았다. 대조적으로, ATO는 CB HSPC로부터의 TCR- 조작 T 세포의 강한 양성 선택을 지지하였으며, 유사한 결과는 MPB HSPC (도시 생략)를 사용하여 관찰되었다. ATO에서 성숙한 나이브T 세포 표현형은 향상된 생체 내 생존과 입양된 T 세포의 활성이 덜 활성화 된 표현형과 상관 관계가 있음을 보여주는 연구에 근거하여 ATO 유래 조작된 변형 말초 혈액 T 세포의 뚜렷한 장점 일 수 있다. 스트로마 세포에서 동족(cognate) MHC의 발현에 의해 ATO에서 조작된 T 세포의 향상된 양성 선택은 ATO 유래 조작된 T 세포의 품질 및 수율을 증가시키는 추가 수단을 제공한다.
T 세포 분화를 통한 형질도입 된 TCR의 ATO에서의 존재는 내인성 TCR 유전자좌의 거의 완전한 대립유전자배제를 중재하며, 이식된 마우스 및 인간 HSPC를 사용한 생체 내 연구와 일치한다. 조작된 말초 혈액 T 세포에서 잠재적으로 동종반응성 내인성 TCRs의 발현은 현재 자가 조직 T 세포의 노동 집약적인, 개별화 된 생산을 필요로 하는, 확장 가능한 기존의 양성 T 세포 요법의 개발에 대한 주요 장벽이다. 동종으로 조작된 T 세포 요법을 개발하기 위한 전략은 유전자 편집 도구를 사용하여 내인성 TCR / CD3 발현을 방해하거나 바이러스 특이적 T 세포를 TCR로 형질도입 시키는 것을 포함한다. 그러나 이러한 두 가지 접근법은 유전자 변형 T 세포의 광범위한 조작과 증식을 필요로 하며 잠재적으로 생체 내 기능을 손상시킨다. 나이브, 대립유전적으로 배제되어 조작된(allelically-excluded engineered) T 세포의 새로운(de novo) 생성을 위한 ATO의 사용은 입양세포치료(adoptive cell therapy)를 위해 비 동종반응성(non-alloreactive) T 세포를 생산하는 매우 효율적인 대체 전략을 제시한다.
C. 실험방법
1. 인간 CD34+CD3- HSPC의 분리
신생아 제대혈은 캘리포니아주립대학교 로스앤젤래스(이하 UCLA)에서 출산 이후 폐기된 제대 및 태반 유닛 으로부터 얻었다. 골수(BM)는 UCLA의 동종 골수 기증자 수확물에서 버려진 재료를 통해 건강한 성인 기증자에게서 얻거나 올셀즈 주식회사 (AllCells Inc.) (알라메다, 캘리포니아)에서 구입하였다. G-CSF 가동화된 말초 혈액은 UCLA에서 동종 이식 줄기 세포 이식 기증을 위한 혈장 교환술을 받은 건강한 성인 기증자로부터 동의 하에 얻어졌다.　 비-가동화 말초 혈액은 UCLS/CFAR 바이러스 연구소(UCLA CFAR Virology Core)를 통해 건강한 성인 기증자에게서 얻어졌다. 모든 조직 샘플은 UCLA IRB 승인 절차 또는 면제 하에 얻었다. 모든 샘플은 피콜-파크(Ficoll-Paque) (GE 헬스케어 라이프 사이언스, 피츠버그, 펜실베니아) 구배 원심 분리법으로 단핵 세포를 농축시켰고, 이어서, CD34 마이크로비드 키트 울트라 퓨어 (밀테니, 어번, 캘리포니아)를 사용하여 자성보조세포선별 (MACS)에 의한 CD34+ 세포의 양성 선별을 하였고, 이어서 CD34+ 세포 농축 분획은 달리 언급하지 않는 한 MACS 이후에 동결 보존되었다. 사용하기 전에, 세포를 해동시키고 잔류 T 세포는 형광활성세포분류기(FACS)에 의해 CD34+ CD3- 세포를 분류하여 없앴으며, 이는 즉시 ATO에 시딩(seeding) 되거나 하기 기술된 바와 같이 형질 도입되었다. 일부 실험에서, HSC는 ATO에 시딩 하기 전에 Lin- CD34+ CD38- 세포를 위해 FACS에 의해 농축되었다. TCR 형질 도입 실험에 사용된 HSPC는 HLA-A*02:01+ CB 유닛 에서 유래되었다. UCLA 면역 유전학 센터에서 서열 특이적 올리고 뉴클레오타이드 (SSO) 비드를 사용하여 고해상도 HLA-A2 검사를 수행했다.
2. 인간 골수 전구세포 서브세트의 분리
CD34+ HSPC는 위와 같이 신선한 골수 흡인물(aspirates)로부터 농축되었고, CD45의 양성 발현 및 하기 마커(총 HSPC (CD 34+), HSC (CD34+ CD38- CD45RA-), LMPP (CD34+ CD38+ CD45RA+ CD10+ CD24- CD24Lhi), CD24-CLP (CD34+ CD38+ CD45RA+ CD10+ CD24-) 및 CD24+ CLP (CD34+ CD38+ CD45RA+ CD10 CD24+))와 결합된 리니지 마커 (CD3, CD14, CD19, CD56 및 CD235a; Lin-)의 결핍된 발현에 기초한 줄기/전구세포 집단에 대한 FACS에 의해 즉시 분류되었다.
3. 인간 흉선세포(thymocytes)의 분리
출생 후의 인체 흉선은 로스앤젤러스 아동 병원(Los Angeles Children 's Hospital, CHLA)에서 심장 수술을 받은 환자의 버려진 폐기물로부터 IRB 면제 하에 얻었다. 흉선 단편을 RPMI에서 정교하게 절단하고, 흉선 세포를 현탁액으로 넣기 위해 피펫팅(pipetting)하여 파쇄하고, 이어서 70㎛ 나일론 여과기를 통과시켰다. 당일이나 다음 날에 신선한 상태의 세포를 분석하였다. 흉선 및 ATO 유래 T 세포 전구세포의 유동세포 계측법에 의한 분석은 다음과 같은 표면 표현형을 사용했다. 조기 흉선 전구 세포 (ETP, CD34+ CD7- CD1a-), CD1a-pro-T (CD34+ CD7+ CD1a-) 및 CD1a+pro-T (CD34+ CD7+ CD1a+) 또는 CD5- pro-T (pro-T1; CD34+ CD7+ CD5-) 및 CD5+ pro-T (pro-T2; CD34+ CD7+ CD5+). 흉선 및 ATO 유래 T 세포 및 전구세포는 다음의 표현형과 결합하여 CD14-CD56-로 정의된다: 총 T 계통 세포 (CD7+ CD5+), 이중 음성 (DN; CD4- CD8-), 미성숙 CD4 단일 양성 (CD4 ISP, CD5 + CD4+ CD3-) 이중 양성 (DP; CD4+ CD8+), CD8SP (CD3+ TCRαβ+ CD8+ CD4-), CD4SP (CD3+ CD8+ TCRαβ-CD4+) 미성숙 나이브 (CD8SP 또는 CD4SP 였던 CD45RA- CD45RO+), 성숙한 나이브 (CD8SP 또는 CD4SP 였던CD45RA+ CD45RO-). CD1a, CD27, CD28 및 CCR7에 대한 공동 염색에 의해 미성숙 및 성숙한 나이브 표현형을 확인하였다.
4. 세포 주(Cell lines)
상기 MS-5-마우스 스트로마 세포주는 선물로 얻었다. MS5-hDLL1을 생성하기 위해, MS-5 세포는 인간 DLL1 및 GFP를 암호화하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입하였다. 최고 5 %의 GFP 발현 세포를 FACS로 분류하고 DMEM / 10 % FCS로 계대배양 하였다. 안정한 발현은 수주의 배양 후 GFP 발현에 대한 유동세포 계측법에 의해 확인되었고, DLL1 발현은 qRT-PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. MS5-hDLL1-A2.1 세포는 인간 HLA-A*02:01 렌티 바이러스 벡터 (캘리포티아 공과대학, David Baltimore 박사로부터의 선물)로 MS5-hDLL1 세포를 형질도입 시킨 후, 인간 HLA-A2 (BB7.2)(바이오레전드, 샌디에고, 캘리포니아)를 인식하는 항체를 사용하여 형질 도입된 세포를 FACS로 분류하여 얻었다. OP9-DL1 세포주 (마우스 Dll1 발현)는 Juan Carlos Zuniga-Pflucker (토론토 대학교) 박사의 선물이었으며 0.1 % 젤라틴 코팅된 플라스크에서 MEMα (써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)/20% FBS에서 계대되었다. K562 세포주는 ATCC로부터 얻었다. K562-CD80/HLA-A*02:01/ NY-ESO-1 aAPC 세포주는 Antoni Ribas 박사 (UCLA)의 선물이었다.
5. 인공 흉선 오가노이드(ATO) 배양
MS5-hDLL1 (또는 MS5 또는 OP9-DL1, 언급된 바와 같음) 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고 PBS 에 RPMI 1640 (Corning, Manassas, VA), 4% B27 보충제 (써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), PBS에 녹인 30 μM L-아스코르 빈산 2- 인산 세스퀴마그네슘 염 수화물 (시그마 알드리치, 세인트 루이스, 미주리), 1 % 페니실린/스트렙토 마이신 (제미니 바이오-프로덕트, 웨스트 새크라멘토, 캘리포니아), 1% 글루타맥스 (써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), 5 ng/ml rhFLT3L 및 5 ng/ml rhIL-7 (펩로텍, 로키 힐, 뉴저지)로 구성된 무혈청 ATO 배양 배지 ("RB27")에 재현탁 시켰다. RB27은 매주 새로 신선하게 만들었다. 4% 제노프리(Xenofree) B27은 표시된 실험들에서 B27로 대체하였다.
실험에 따라, 1.5 - 6×105 MS5-hDLL1 세포는 1.5 ML 에펜도르프 튜브에서 ATO 당 3×102 - 1×105개의 정제된 CD34+ CD3- 세포 (또는 표시된 바와 같이 다른 HSPC 개수)와 결합하고 스윙 버킷 원심 분리기에서 4℃에서 5 분 동안 300g에서 원심분리 하였다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠렛을 짧은 보텍스(Brief vortexing)로 재현탁 시켰다. 각각의 ATO에 대해 0.4 μm 밀리셀 트랜스웰 인서트 (EMD 밀리포어, 빌레리카, 매사추세츠, Cat. PICM0RG50)를 웰 당 1 ml의 RB27이 들어있는 6-웰 플레이트에 넣었다. ATO를 넣기 위해 인서트를 꺼내어 플레이트의 가장자리에 놓아 과도한 배지를 배출시켰다. 세포 슬러리를 ATO 당 5-8㎕로 조정하고, 20㎕ 피펫 팁으로 끌어 올리고, 피펫 팁의 말단부에 방울을 형성하여 세포 인서트 위에 부드럽게 놓았다. 세포 인서트를 1 mL RB27을 함유하는 웰에 다시 넣었다. 배지는 세포 인서트 주위로부터 흡인에 의해 매 3-4 일마다 완전히 교체하였고, 이어서 신선한 RB27/사이토카인 1 ㎖로 대체되었다. ATO 20 주차까지 이 방식으로 배양되었다. 지시된 시간에, 각 웰에 FACS 완충제 (PBS/0.5 % 소 혈청 알부민/ 2mM EDTA)를 첨가하고 1 ml "P1000" 피펫으로 피펫팅 하여 ATO를 간단히 분해하여 ATO 세포를 수확하고, 이어서 70 μm 나일론 여과기를 통과시켰다. 일부 실험에서 MS5-hDLL1 세포의 단일 세포 현탁액에 ATO에서 사용하기에 앞서 표시된 투여량으로 γ선을 조사하였다.
6. T 세포 단일층 공배양(co-cultures)
OP9-DL1 단일층 배양은 상술한 바와 같이 설정 하였다.　간략하게, OP9-DL1세포를 사용하기 1-2 일 전에 0.1 % 젤라틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 시딩(seeding)하여 70-80% 컨플루언스(confluence)를 달성하도록 하였다. 　배지는 단층에서 흡인되었으며 1x104-1.5x104　정제된 CD34+CD3- HSPC를 MEMα, 20 % FBS, 30 μM L-아스코르빈산, 5 ng/ml rhFLT3L 및 5 ng/ml rhIL-7로 구성된 배지 2 ml에 있는 스트로마 단일층 위에 놓았다. 일부 실험에서, MS-5 또는 MS5-hDLL1로 OP9-DL1을 대체하고, RB27을 배양 배지로 대체하였다.　세포를 수확하고, 70 μm 나일론 여과기로 여과하고, 다시 채취하여 4-5일에 한번씩 새로운 스트로마 세포 단일층으로 옮겼다.　합류 할 때, 세포는 새로운 기질 층을 함유하는 다수의 웰로 분할되었다.　배양은 최대 10 주 동안 유지되었다.
7. 렌티바이러스 벡터 및 형질 도입
인간 DLL1의 암호화 서열의 전체길이는 인간 범용 참조 RNA 세트(human universal reference RNA set) (애질런트 테크놀러지, 산타클라라, 캘리포니아)에서 3 세대 렌티 바이러스 벡터 pCCL-C-MNDU3-X-IRES-eGF(UCLA, 도날드 콘박사 제공) 로 RT-PCR에 의해 클로닝 하였다 인간 CD80은 pCCL-c-MNDU3에 유사하게 클로닝 하였다. HLA-A*02:01 렌티 바이러스 벡터 pHAGE6-HGHSS-HLAA2.1-IRES-ZsGreen은 데이비드 발티모어 박사(Caltech)의 선물이었다. HLA-A*02:01/ NY-ESO-1157-165 에 특이적인 TCR의 최적화 된 α 및 β (Vb13.1) 사슬을 갖는 코돈을 암호화하는 3 세대 렌티 바이러스 벡터는 앞에서 기술하였으며, UCLA의 안토니리바스 박사가 제공하였다. 렌티 바이러스 입자의 패키징 및 농축은 전술한 바와 같이 수행하였다.
간단히, Transit 293T (마이러스 바이오, 매디슨, 위스콘신) 를 사용하여 27 시간 동안 293T 세포 (ATCC)에 렌티 바이러스 벡터 플라스미드, pCMV-△R8.9 및 pCAGGS-VSVG를 공동 형질도입 시킨 후, 20 mM 소듐 부티레이트로 8 시간 동안 처리 한 후, 48시간 동안 무혈청 UltraCulture에서 세포 상층액을 생성시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 Amicon Ultra-15 100K 필터 (EMD Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 접선유동여과법으로 상층액을 농축시키고 -80 ℃에서 저장 하였다. HSPC 형질 도입을 위해, 1x105-1x106 개의 FACS 에 의해 분류된 CD34+ CD3- HSPC를 50 ng/ml의 재조합 인간 SCF, FLT3L 및 TPO와 10 ng/ml IL-3 (펩로텍, 로키힐, 뉴저지)를 12-18 시간 동안 보충한 1 ml 의 X-VIVO-15 (론자, 바젤, 스위스)에서20 μg/ml Retronectin (클론텍, 마운틴 뷰, 캘리포니아)으로 코팅한 6-well 비처리 플레이트에 도말하였다. 농도가 높은 렌티 바이러스 상층액을 100의 감염 다중도 (MOI) 조건에서 첨가하였다. 모의-형질 도입된 세포는 벡터를 첨가하지 않고 동일한 조건에서 배양하였다. 형질 도입 후 24 시간 동안 세포를 수확하고, 세척하고, ATO에 시딩(seeding)하였다. 특별히 명시되지 않는 한 TCR-형질 도입된 HSPC는 HLA-A * 02:01+ CB 유닛으로부터 유래된 것이다.
8. 면역조직화학
헤마톡실린과 에오신 (H&E) 이미지의 경우, ATO를 히스토젤(써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)에 끼우고 10 % 중성 완충 포르말린 (써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)에서 밤새 고정시켰다.　 5 μm 단면 및 H&E 염색은 UCLA 중개 병리학 핵심연구소(Translational Pathology Core Laboratory, TPCL)에서 하였다.　면역형광 이미징을 위해, 의료용 칼로 각 ATO 주위에 배양 인서트를 절단하고, Tissue-Tek OCT (VWR 래드노, 펜실베니아)에 멤브레인 및 ATO를 매립하고 드라이 아이스상에서 동결시킴으로써 ATO를 분리 하였다.　 5 μm의 동결 시편은10 % 중성 버퍼 포르말린에 고정하고 4 ℃ 에서 밤새 1:50 의 비율로 희석한 항-CD3 (클론 UCHT1; 바이오레전드, 샌디에고, 캘리포니아)로 염색한 후 AlexaFluor 594-콘쥬게이티드 안티-마우스 IgG (H+L) (잭슨이뮤노리서치, 웨스트 그로브, 펜실베니아)를 실온에서 첨가하여 배양하였다.　 AxioCam MRM 및 AxioVision 소프트웨어 (자이스, 제나, 독일) 가 있는 Zeiss AzioImager M2에서 H & E 및 면역 형광 이미지를 얻었다.
9. 세포 내 사이토카인 염색
ATO의 CD8SP, CD4SP 또는 DP세포를 -CD8 또는 -CD4 항체를 사용하여 FACS로 분리하고, 5% 열-불활성화 된(heat-inactivated) 인간 AB 혈청 (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)을 갖는 200㎕ AIM V (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)의 96-웰 U자형 바닥 플레이트에 도말 하였다. PMA/이오노마이신/ 단백질 수송 억제제 칵테일 또는 대조 단백질 수송 억제제 칵테일 (eBioscience, San Diego, CA)을 각 웰에 첨가하고 밤새 배양 하였다. 세포를 세포 내 염색 완충액 키트 (eBioscience, San Diego, CA)로 고정 및 투과처리화 하기 전에 CD3, CD4 및 CD8 (Biolegend, San Diego, CA) 및 UV455 고정 생존 염료 (eBioscience, San Diego, CA) 및 IFNγ 및 IL-4 (Biolegend, San Diego, CA)에 대한 항체로 세포 내 염색을 수행 하였다.
10. T 세포 활성화 및 증식시험
CFSE 증식 분석을 위해, ATO 유래 CD8SP 또는 CD4SP T 세포를 FACS로 분리하고 제조사의 지시에 따라 5μM CFSE (Biolegend, San Diego, CA)로 표지 하였다. 표지 된 세포를 5 % AB 혈청 및 20 ng/ml rhIL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) 또는 IL-2가 단독으로 보충된 AIM V에서 항 -CD3/CD28 비드 (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)와 함께 배양하고, CD25(Biolegend, San Diego, CA)에 대해 공동염색하고(costained) 5 일째 유동세포 계측법으로 분석하였다. 시험관 내 세포 증식시험을 위해, 1x104 FACS 분리된, ATO 유래 CD8SP T 세포를 20 ng/ml rhIL-2 및 1X 항-CD3/CD28 테트라머 항체 복합체(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)를 보충한 Immunocult XF 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)가 200 μl 들어있는 96- 웰 U자형 바닥 플레이트에 도말 하였다. 필요에 따라 2-3 일마다 신선한 배지 및 사이토카인을 큰 웰로 옮기면서 첨가 하였다. 새로운 -CD3/CD28을 7일과 14일에 첨가하였다. 세포를 혈구계로 매주 계수하였다.
11. 인공 APC (aAPC) CTL 프라이밍 분석
5×104 개의 총 ATO 유래 CD8SP T 세포를 6 주차 TCR-형질 도입된 ATO로부터 분리시키고, CD80 및 HLA-A*02:01/B2M/NY-ESO-1157-165 단일 체인 트라이머 발현하는 K562-유래 aAPC또는 부모 K562 세포를 96웰 U자형 바닥 플레이트에서 5:1의 T 세포: K562 비율로 200㎕ AIM V/5 % 인간 AB 혈청에서 밤새 공배양 하였다. 배양하는 마지막 4시간 동안 단백질 수송 저해제 칵테일 (eBioscience, San Diego, CA)과 함께 CD170a-APC 항체 (Biolegend, San Diego, CA)를 1:50의 최종 희석액으로 웰에 첨가하고, 이어서, 상술한 바와 같이 고정, 투과처리화 및 세포 내 사이토카인 염색하였다.
12. TCR Vβ 표현형 분석
IOTest Beta Mark TCR V 키트 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)와 함께 7 주차 ATO 또는 출생 후의 흉선의 총 세포를 CD3, CD4, CD8 및 TCRγδ에 대해 염색 하였다. CD3+TCRγδ-CD8+ CD4- 세포는 Vβ 분석을 위해 게이팅 하였다. TCR-형질 도입된 ATO의 경우, 6주차 ATO의 총 세포를 APC-컨쥬게이티드 된 HLA-A*02:01/NY-ESO-1157-165 테트라머(MBL International, Woburn, MA) 를 추가로 레이블 하였으며, Vβ 분석을 위해 세포를 CD3+ TCRγδ- tetramer+ CD8+ CD4- 에 대해 게이팅 시켰다.
13. 유동세포 계측법 및 항체
모든 유동세포 계측 염색은 얼음상에서 PBS/ 0.5 % BSA / 2mM EDTA에서 30 분 동안 수행 하였다. FcX (Biolegend, San Diego, CA)를 항체 염색 전에 5 분 동안 모든 샘플에 첨가 하였다. 테트라머 공동 염색을 위해 PE 또는 APC- 접합 테트라머(MBL International, Woburn, MA)를 실온에서 10 분 동안 최종 1:50의 희석액을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 추가로 20 분 동안 항체를 첨가하였다. 분석 전 모든 샘플에 DAPI를 첨가 하였다. 분석은 URIA Broad Stem Cell 연구 센터 Flow Cytometry Core에서 ARIA 또는 ARIA-H 기기 (BD Biosciences, San Jose, CA)의 LSRII Fortessa 및 FACS에서 수행되었다. 모든 분석에 대해 DAPI+ 세포는 게이트 아웃되고, 단일 세포는 FSC-H 대 FSC-W 대 SSC-H 대 SSC-W를 기준으로 게이트 되었다. 표면 및 세포 내 염색에 사용된 항체 클론은 Biolegend (샌디에고, CA)로부터 수득하였다: CD1a (HI149), CD3 (UCHT1), CD4 (RPA-T4), CD5 (UCHT2), CD8 (SK1), CD10 (6H6) , CD25 (CD14), CD34 (581), CD38 (HIT2), CD45 (CD45), CD20 (CD12), CD20 HI30) CD45RA (HI100) CD45RO (UCHL1), CD56 (HCD56), CD107a (H4A3), CD127 (A019D5), CD235a (HI264), CCR7 (G043H7), HLA-A2 (BB7.2), 인터페론 γ ( 4S.B3), IL-2 (MQ1-17H12), IL-4 (MP4-25D2), IL-17A (BL168) TCRαβ (IP26) TCRγδ (B1), TNFα (Mab11) Vβ13.1 (H131 ), 인간 리니지 칵테일 (CD3, CD14, CD19, CD20, CD56); 또는 BD Biosciences (San Jose, CA) : CD7 (M-T701) 및 CD62L (DREG-56).
실시예 3: 인공 흉선 오가노이드는 인간 조혈줄기세포로부터 TCR 조작된 T 세포의 양성 선별 및 대립유전자배제를 유도한다.
조작된 T 세포 치료법은 암 및 만성 바이러스 감염 치료를 위한 전례 없는 기회를 제공한다. 조혈모세포(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC)로부터 직접 조작된 T 세포를 생성하는 능력은 동종반응성(alloreactivity)을 포함하여 말초 혈액 T 세포의 사용과 관련된 주요 치료 한계를 극복할 잠재력을 가지고 있다. 이 예는 제대혈, 골수 및 말초 혈액 HSPC로부터 천연 및 TCR 조작 인간 T 세포의 고효율 시험관 내(in vitro) 분화 및 양성 선택을 지원하는 임상 관련 인공 흉선 오가노이드 (ATO) 시스템을 설명한다. ATO 유래 T 세포는 경미한 표현형, 다양한 TCR 레퍼토리 및 TCR에 의존하는 활성화 및 증식을 나타냈다. ATO 유래의 TCR-조작된 T 세포는 또한 나이브 표현형으로 성숙하였고, 또한 시험관 내 및 생체 내에서 항원 특이적 종양 살상을 보였으며 대립유전자배제 유도와 일치하는 내인성 TCR Vβ 발현이 거의 없었다. 　따라서 ATO는 입양세포치료(adoptive cell therapy)를 위한 나이브 및 잠재적으로 비-동종반응성(non-alloreactive)으로 조작된 T 세포의 생성을 위한 효율적인 방법을 제시한다.
항원 특이적 T 세포 수용체 (TCR) 제공을 위해 조작된 T 세포를 이용한 입양세포치료는 악성 종양 및 만성 바이러스 감염에 대한 표적 치료 효과를 제공한다. 현재의 전략은 성숙한 순환 T 세포의 유전적 변형 및 생체 외(ex vivo) 증식에 의존한다.
이러한 접근법은 감소된 항원-특이적 반응성 또는 자가 면역의 유도 가능성과 함께 재주입후의 생체 내(in vivo) 활성 감소 및 형질 전환; 그리고 내인성 TCR 사슬 간의 오 정렬 등 몇 가지 치료 한계를 보여준다. 게다가 내인성 TCR 발현에 의해 나타나는 동종반응성은 자가 T 세포(autologous T cells)의 사용에 대한 대부분의 접근방법을 제한하게 하여, 궁국적으로 이는 비용 증가, 제한된 생산 능력 및 림프구 감소증에 있어서 환자의 치료가능 자격 미달을 통한 치료 접근성을 제한 할 수 있다. 조혈모세포와 전구세포(HSPC)로부터 유래된 조작된 T세포의 시험관 내 생성은 미접촉 항원 특이적 T 세포의 신규(de novo) 생성 및 대립 유전자 배제를 통한 내인성 TCR 발현의 억제를 동시에 허용함으로써 이러한 문제를 해결할 수 있다.
흉선에서의 T 세포 성숙(development)의 시공간적인 복잡성 때문에, 시험관내 T 세포 분화의 방법은 지금까지 인간 T 세포 성숙을 완전히 재현해 낼 수 없었다. 이러한 방법의 주요한 진보는 노치 리간드로 형질 도입된 마우스 스트로마 세포주가, 고전적인 OP9-DL1 공배양 시스템에서 입증된 바와 같이, 마우스 또는 인간 HSPC로부터 시험관 내 T 세포 분화가 가능하게 해줄 수 있다는 발견이었다. 이 단일 층 및 단일 층 유사 시스템에서, 인간 HSPC는 T 세포 리니지 커밋먼트(T lineage commitment) 및 초기 T 세포 분화과정을 겪는다. 그러나 생산적으로 재배열된 TCR을 가진 T 세포 전구세포의 양성 선택은 손상되고 CD8+ 또는 CD4+ 단일 양성(Single Positive, SP) T 세포에 대한 성숙이 최소화된다. 본 발명자 및 다른 과학자들은 마우스 또는 인간의 흉선 조직을 사용하는 3차원(3D) 오가노이드 시스템이 시험 관내에서 인간 T 세포의 양성 선별 및 성숙을 개선 시킨다는 것을 보여주었다. 그러나 이러한 시스템은 낮은 세포 생산율, 높은 실험적 가변성 및 1차 흉선 조직에 대한 의존성으로 인해 치료용 T 세포의 생성에 적합하지 않다. 따라서, 본 발명자들은 표준 성분, 재현성 및 확장성과 같은 중요한 번역 특성을 유지하면서 HSPC로부터 인간 T 세포의 분화 및 양성 선택을 가능하게 하는 인공 오가노이드 시스템의 개발하고자 하였다.
이 실시예에서는 DLL1이 형질 전환된 스토로마 세포주와 혈청이 없는 기성 요소를 기반으로 하는 인공 흉선 오가노이드 (ATO) 시스템의 개발에 대해 기술한다. 단층 시스템과 달리, ATO는 인간 제대혈, 골수 및 말초 혈액의 CD34+ HSPC로부터 인간 CD3+ TCRαβ+ CD8SP 및 CD4SP T 세포의 시험관 내 분화, 양성 선택 및 성숙을 강력히 보여준다. ATO 유래 성숙 T 세포는 항원 자극에 반응하여 항원 나이브 표현형, 다양한 TCR 레퍼토리 및 활성화/증식을 나타냈다. ATO는 종양 관련 항원 NY-ESO-1에 특이적인 HLA-A*02:01 제한적 TCR로 형질 도입된 HSPC로 부터 항원 특이적 TCR이 조작된 T 세포의 매우 효율적인 분화를 지원했다. 또한, TCR이 조작된 T 세포의 양성 선택은 ATO 스토로마 세포에서 동족(cognate) 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)의 발현에 의해 더욱 강화되었다. ATO 유래의 TCR-조작된 T 세포는 나이브 표현형을 나타내었으며 시험관내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 강력한 종양 살상 능력을 보이며 항원 특이적 활성화를 거쳤다. 마지막으로, ATO에서 생성된 TCR-조작 T세포는 성숙 동안 대립 배제 유도와 일치하는 내인성 TCR 발현의 거의 완전한 결핍을 나타내었고, 입양 세포 치료를 위해 비동종반응성의 조작된 T 세포를 생성시키는 직접적이고 효율적인 방법을 제안하였다.
I. 결과
A. 시험관 내( in vitro ) 인간 T 세포 분화를 위한 최적화된 인공 흉선 오가노이드(ATO) 시스템의 개발
목표는 시험관 내(in vitro)에서 HSPC로부터의 인간 T 세포의 양성 선택 및 성숙을 지원할 수 있는 임상적으로 이식 가능한 오가노이드 시스템의 개발이다. 일차 흉선 조직의 사용을 피하기 위해, 발명자는 DLL1-형질 도입된 스트로마 세포주(stroma cell line)의 3차원 오가노이드 배양에서 인간 T 세포의 성숙을 돕는 능력을 시험하였다. OP9-DL1 시스템에서의 T 세포 분화는 태아 송아지 혈청의 특정 로트(lot)에 따라 매우 가변적이라는 것이 관찰되었으며, 발명자들은 오가노이드 배양에서 지속적으로 T 세포 분화를 보조할 수 있는 무혈청 조건을 밝혀내고자 했다. 독점적인 지지체 물질(proprietary scaffold materials)의 사용을 피하기 위해, 흉선 조직 기반 오가노이드에서 효과적이라고 알려진, 스트로마 세포를 원심분리를 통해 HSPC와 같이 응집시키고 공기-액체 계면에 있는 세포 배양 인서트에 배치시키는 압축 재응집 기술(compaction reaggregation technique)을 사용하였다 (도 3A). 이러한 3차원 배양에서 발명자들은 인간 DLL1으로 형질 전환된 MS-5 마우스 골수 스트로마 세포주(murine bone marrow stromal cell line) (이하, MS5-hDLL1이라 칭함)이 T 세포가 고갈된 CD34+ 탯줄 혈액(cord blood, CB) HSPC으로부터 인간 T 세포 분화를 강하게 보조하는 것을 확인하였다. 게다가 발명자들은 신경 및 배아 줄기 세포 배양에 사용되는 다성분 첨가제인 B27과 FLT3L, IL-7, 그리고 아스코르브산(ascorbic acid)가 첨가된 RPMI (여기서부터 RB27이라 칭함)이 MS5-hDLL1 오가노이드 배양에서 강력한 인간 T 세포 분화를 지속적으로 돕는 새로운 무혈청 배지라는 것을 확인하였다.
2주차에 CD5+CD7+ 세포의 우위, CD4+ CD3- 미성숙 단일 양성(immature single positive, ISP) 세포와 CD4+ CD8+ (DP) 세포의 발현으로 볼 수 있듯이, 이렇게 최적화된 인공 흉선 오가노이드(artificial thymic organoid, ATO) 시스템은 신속하고 강한 CB CD34+ CD3- HSPC으로부터 T 리니지 커밋먼트(T lineage commitment)를 유발할 수 있다. 보다 성숙한 CD3+ TCRαβ+ 세포는 초기인 4주에 나타났으며, 시간이 지남에 따라 증가하며 6주에 평균 약 30%에 도달하였다 (도 3B, 14A). CD3+TCRγδ+ T 세포도 일부 생성되었다 (도 14A). ATO에서 양성 선택과 일관성이 있게, CD3+TCRαβ세포들은 초기 시점에는 대부분 DP였지만 (도 14A) 점진적으로 CD8SP로 성숙되었으며, 적게는 CD4SP T 세포로 성숙되었다.
CD34+ 전구체 세포는 연구된 모든 시점에서 ATO 내에서 검출 가능했으며, 6주에는 여전히 다능 CD34+CD7=CD1a- 초기 흉선 세포 (early thymic progenitor, ETP), 발달 하류 (developmentally downstream) CD34+CD7+CD1a-, CD34+CD7+CD1a+ T-리니지 전구체 (T-lineage progenitor)와 같은 흉선 T 세포 전구 세포의 세가지 표현형 단계를 모두 포함했다 (도 3C). Pro-T1과 proT2 전구체 표현형(progenitor phenotype)도 대안 분류 체계(alternative classification scheme)에 근거하여 CD34+ 분획 내에서 확인되었다. CD19+ B 세포의 빈도는 시간에 따라 감소했으며, NK와 골수 세포(myeloid)의 빈도는 전체적으로 낮았다(도 3B, 14A). ATO의 조직학 절편은 림프구 세포가 풍부한 조밀하고, 조직 같은 구조를 보였으며 (도 19), 림프구 세포 클러스터(cluster)는 CD3 양성이었다 (도 3D).
각 ATO는 보통 6주에 총 2x106 의 세포를 생성하였으나 (도 14B), HSPC당 ATO 세포 수율은 시딩(seeding)된 HSPC의 숫자와 스트로마 세포 대비 HSPC의 비율에 반비례하여 가낭 낮은 비율에서 생성된 HSPC당 4-5,0000 세포의 수율을 보였다. ATO에서 전구체(precursor)와 성숙한 T 세포의 비율은 많은 수(ATO당 6x105)의 스트로마 세포로 구성된 ATO를 제외하고는 초기 HSPC의 숫자와 비율에 따라 비슷했으며 (도 20B), 이는 성숙한 T 세포 발달 장애(impaired mature T cell development)를 보여준다. 따라서, 최적의 HSPC 대비 스트로마 세포 비율인 1:20 (일반적으로 ATO당 HSPC 7500개: 6x105 스트로마 세포)의 작은 ATO를 추후 실험에 사용하였다. 기술적인 반복 (n=11)과 4개의 다른 B27 로트(lot)동안 세포 생성(cell output)과 T 세포 분화의 높은 반복성이 확인되었다 (도 21A-D). 적용의 관련성(translational relevance)의 측면에서, 동등한 수준의 T 세포 분화와 세포 생성(output)이 이종 비 함유(xeno-free) B27 (인간 혈청 알부민 포함) 배지를 사용(도 21E-F)하거나 조사된 스트로마 세포(irradiated stromal cell)를 포함(도 21G-J)하는 ATO에서도 관찰되었다. ATO에서 생성된 조혈 세포(hematopoietic cell)의 회복은 간단한 기계적 파쇄 및 세포 수집에 의해 획득되었으며 >99% CD45+ 조혈 세포와 <0.5% 스트로마 세포를 유발하였다 (도 21K).
동일한 공여자 CB HSPC를 이용한 OP9-DL1 단일층 배양 시스템과 비교하여, ATO는 현저히 우수한 CD3+TCRαβ+ T 세포 생성을 보였다 (도 11A, 22) 이전 연구와 일치하여, OP9-DL1 단일층은 ETP, pro-T and CD4 ISP 단계를 통한 효과적인 T 리니지 커밋먼트(T lineage commitment) (CD7+CD5+)와 진행을 돕지만, ATO에서 이미 모두 발생한 DP, CD3+TCRαβ+와 성숙한 SP 세포의 비효율적인 생산을 유발한다 (도 11A, 22). OP9-DL1이 RB27에서 거의 생존하지 못하고 3차원 배양에서 T 세포 분화에 도움을 주지 못하는 것으로 보아, 실제로 최적의 양성 선별과 성숙은 ATO 시스템의 3가지 요소인 3차원 배양, MS5-hDLL1 스트로마 세포, RB27 배지 (도 11A) 모두를 요구한다. DLL1 발현이 부족한 부모 MS-5 세포주(parental MS-5 cell line)은 단일층 이나 3차원 배양에서 T 세포 발생을 돕지 않았다 (도 11A)
요약하면, ATO는 CD34+ HSPC로부터 강력하고 재현 가능한 T 세포 분화를 돕는, 표준화된 무혈청3차원 시스템을 제공하여 인간 TCRαβ+ T 세포의 양성 선택과 성숙을 허용한다.
B. ATO에서 흉선 나이브 T 세포의 발달 재현
다음으로, ATO에서의 T 세포 분화는 출생 후 인간 흉선(postnatal human thymus)에서의 T 세포 분화와 비교되었다. 12주 CB ATO는 흉선에서와 비슷한 T 리니지 커미트된(T lineage committed) (CD5+CD7+)와 CD34+ 전구 세포 빈도를 보였다. 흉선에서처럼, ATO의 CD3+ T 세포 대부분은 TCRαβ+ 였지만, 쉽게 검출 가능한 TCRγδ+ 집단 또한 일관되게 관찰되었다 (도 4A). ATO에서 유래한 CD3+TCRαβ+ 세포 중에, 성숙한 CD8SP와 CD4SP T 세포는 6-12주 사이에 증가하였다 (도 4B, 도 12A-C) 흉선에서와 대조적으로, ATO는 CD8SP T 세포와 비교하여 비례적으로 적은 CD4SP T 세포를 보였다.
흉선에서와 같이, ATO에서 유래된 CD3+TCRαβ+ CD8SP와 CD3+TCRαβ+ CD4SP T 세포는 미성숙 나이브(immature naive) (CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7- CD1Ahi)에서 성숙 나이브(mature naive) (CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+ CD1alo) 형질로 전이되었다 (도 4C, 12A-C). ATO에서 이것은 6-12주 사이에 발현되었으며, 흉선에서보다 12주 ATO에서 보다 높은 빈도의 나이브 T 세포를 유발하였다 (도 4C, 12B-C). 미성숙 및 성숙한 나이브 서브세트는 모두 CD62L과 CD28을 공동 발현하였고, CD 127과 CD31의 서브세트 공동 발현(subset co-expression)을 보였으며, 후자의 마커는 혈액 내 최근의 흉선 이민 T 세포(recent thymic emigrant T cell)과 관련되어 있다 (도 12B-C). 활성 마커(activation marker) CD25는 ATO에서 유래된 CD8SP T 세포에서는 관찰되지 않았지만, CD4SP T 세포 서브세트(subset)에서는 관찰되었다 (도 12B-C). 종합하여, 이 데이터들은 인간 흉선과 비교하여 ATO에서 T 세포 분화의 현저한 충실도(fidelity)를 보이며, 흉선과 혈액에서 관찰되는 것과 유사한 순수한 나이브 T 세포 (bona fide naive T cell)의 출현까지 가능했다.
ATO에서 성숙한 CD4SP T 세포의 늦은 출현을 감안할 때, 수지상 세포가 ATO에서 발생하며 MHC 2형 발현(MHC class II expression)을 통해 양성 선택을 중재할 수 있다고 가정되었다. 실제로 희귀한 HLA- DR+ 세포는 흉선에서와 비슷한 빈도로 ATO에 존재했다 (도 23A). 이 집단에 대한 추가 분석은 흉선에도 존재하는 단핵 세포(monocyte), B 세포, 플라스마시토이드(plasmacytoid), CLEC9A+와 CD1c+ 수지상 세포(dentritic cell)와 같은 항원을 발현하는 세포를 밝혔다 (도 23B).
C. 여러 HSPC 소스(source) 및 서브세트(subset)으로부터의 T 세포 분화
성인 골수(bone marrow, BM), G-CSF 가동화된 말초 혈액(mobilized peripheral blood, MPB), 비-가동화된 말초 혈액 (non-mobilized peripheral blood, PB)와 같은 모든 임상적으로 적용 가능한(clinically relevant) HSPC 소스로부터 전구세포와 CD3+TCRαβ+ T 세포와 비슷한 빈도와 함께 ATO에서의 효과적인 T 세포 분화가 관찰되었다 (도 3A-B, 15A-B, 13A-B). 이들 소스 및 흉선으로부터의 HSPC는 상이한 T 세포 분화 속도론(kinetics)을 보이지만 (도 15A), T 세포 생성(output)은 HSPC 소스 모두에서 유사했다 (도 3D). CB, BM, 혹은 MPB로부터 고도로 농축된 조혈 줄기 세포(HSC) 프랙션(fraction) (lin-CD24+CD38-)는 비슷하게 강력한 T 세포 분화를 보였다 (도 5C-D, 13D-E).
ATO는 BM에서 추출된 정제된 림프구 전구체 (lymphoid progenitor)으로부터의 T 세포 분화 또한 유발한다 (도 15C-D). 림프구 만능 전구 세포(lymphoid-primed multipotent progenitor, LMPP)와 CD24- 일반 림프 전구 세포(common-lymphoid progenitor, CLP)가 HSC (표시되지 않음) 또는 분획 확인되지 않은(unfractionated) CD34+lin- HSPC보다 더 신속히 분화되었다 (도 24A-B). 반면, 주로 B 세포 및 NK 세포 잠재력(potential)을 갖는 CD24+ CLP는 ATO에서 낮은 T 세포 분화 및 세포 생성(cell output)이 발생하였다 (도 15C-D, 24A). 따라서 ATO는 인간 줄기 세포 및 전구 세포 집단으로부터의 T 리니지 잠재력(T lineage potential)을 평가하는 도구로 사용될 수 있다.
D. ATO 유래 T 세포의 TCR 다양성과 기능
흉선과 유사하게, ATO 유래 DP에서 RAG1과 RAG2가 발현되었다 (도 25A). ATO 유래 CD3+TCRαβ+CD8SP (도 16A)와 CD3+TCRαβ+CD4SP (도 25B) T 세포에서의 TCR Vβ 패밀리(family) 사용에 대한 유세포 분석(flow cytometry analysis)에 따르면 인간 흉선으로부터의 상응하는 T 세포의 것과 현저한 유사한 다양성이 나타났다. 게다가, CD3+TCRαβ+ CD8SP에서의 매우 다양한 TCR 레파토리(repertoire)는 TCR Vα와 Vβ CDR3 영역(region)에 대한 딥 시퀀싱(deep sequencing)에 의해 확인되었으며, 흉선 CD8SP 세포와 PB 나이브 CD8+ T세포에서의 것과 비슷했다 (도 16B-C). 중요한 것은, 치우친 Vα 혹은 Vβ 사용(skewed Vα or Vβ usage)은 관찰되지 않았으며, 이는 ATO에서의 비전형적인(unconventional) T 세포 서브세트 혹은 클론성으로 확장된 성숙한 T 세포(clonally expanded mature T cell)의 우위에 대해 반한다.
ATO 유래 CD8SP T 세포는 PMA/이오노마이신에 반응하여 다기능(polyfuntional) IFNγ, TNFα와 IL-2 생산을 했으며, 이는 anti-CD3/CD28와 IL-2 자극에 반응하여 활발한 증식과 CD25와 4-1BB의 상향조절(upregulation) (도 16E) 뿐만 아니라 세포 독성 표현형(cytotoxic phenotype) (도 16D)와 일관된 것이다. ATO 유래 CD4SP 세포는 IFNγ와 IL-2를 생산하였으며 anti-CD3/CD28와 IL-2에 반응하여 증식하였다 (도 25C-D). ATO로부터 분리된 CD8SP (도 16F)와 CD4SP (도 25E)의 수는 anti-CD3/CD28와 IL-2가 있는 경우 각각 14일동안 ~60배와 ~40배 증가하였다. 요약하면, ATO에서 생성된 성숙 T 세포는 생리학적 TCR 다양성 및 항원 자극에 대한 기능적 반응을 보였다.
E. ATO에서 TCR 조작된 나이브 T 세포의 발생
발명자는 다음으로 HSPC로부터의 TCR 조작된 T 세포의 시험관 내(in vitro) 발생을 위해 ATO를 변형시켰다. CB CD34+CD3- HSPC을 NY-ESO-1157-165 펩타이드에 특이적인 HLA-A*02:01-제한적 TCR(HLA-A*02:01-restricted TCR specific for the NY-ESO-1157-165 peptide)의 코돈 최적화된 α와 β 사슬(codon optimized α and βchains)을 인코딩하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 감염시켰다. 7주차에, TCR 형질 도입된(transduced) ATO들은 모의 형질도입 된(mock-transduced) 대조군과 비슷한 CD5+CD7+ T 리니지 세포 빈도를 보였지만, CD3+TCRαβ+ T 세포를 현저히 증가시켰으며, 이 세포들은 대부분 형질도입 된(transduced) Vβ13.1 사슬에 대한 테트라머 혹은 항체를 이용한 염색을 통해 관찰 된 것과 같이 (도 7A) 형질 전환된 TCR를 발현하였다. CD8SP 세포의 빈도는 CD3+TCRαβ+tetramer+ 세포와 모의 형질도입 대조군(mock-transduced control) CD3+TCRαβ+ 세포 사이에서 유사했지만, tetramer+ CD8SP 세포는 성숙한 나이브 형질(예: CD45RA+ CD45RO- CD27+ CCR7+ CD1alo)으로의 성숙이 가속되었다 (도 7A). 주목할 것은, tetramer+ CD8SP 세포는 NK 세포와 상피 림프구(intraepithelial lymphocytes)와 관계된 CD16 혹은 CD56의 발현 없이 통상적인 CD8αβ T 세포 형질(phenotype)을 보였다 (도 17A).
TCR 형질 도입(TCR transduction)은 또한 ATO으로부터 세포 수율을 현저히 향상시켰으며 (HSPC당 평균 ~450 세포) (도 17B), 획득된 세포는 대부분 CD3+tetramer+ T 세포이었다. 그러므로, TCR 형질 전환된 HSPC 7500개로 개시된 단일 ATO는 보통 ~4x106 세포를 생산했으며, 이 중 7주차에 약 15%(6x105)는 CD3+ tetramer+ CD8SPCD45RA+ 성숙한 나이브 T 세포였다 (도 7A, 17B).
TCR 형질 도입된ATO로부터 유래된 CD8SP 세포는 CD80와 동whr HLA-A*02:01/NY-ESO-1 펩타이드-MHC 단일 체인 트라이머(cognate HLA-A*02:01/NY-ESO-1 peptide- MHC single chain trimer)를 발현하는 인공 항원 발현 세포 (artificial antigen presenting cells, aAPC)에 반응하여 항원 특이적 활성화(IFNγ, TNFα와 IL-2 생산), 탈과립(degranulation) (CD107a 막 가동) (도 17C) 및 증식이 진행되었지만 (도 17ED), 무관한 HLA-A*02:01/MART-1 aAPC(irrelevant HLA-A*02:01/MART-1 aAPC) 혹은 부모(parental) K562 세포에 대해서는 이러한 반응을 보이지 않았다. 게다가, TCR 형질 도입된(transduced) ATO로부터 추출된 CD8SP T 세포는 anti-CD3/CD28 및 IL-2 또는 IL-7/IL-15에 반응하여 강한 확장을 보였다 (도 17E). 또한, Tetramer+ 세포는 연장된 팽창과 재활성화(prolonged expansion and reactivation) 후에도 통상적인 CD8αβ표현형을 유지하였다 (도 26A).
ATO 유래 TCR 조작된 T 세포에서의 Vβ 다양성에 대한 유세포 분석(flow cytometry analysis)에 따르면 98% 이상의 tetramer+ CD8SP T 세포가 형질도입 된(transduced) Vβ13.1 세그먼트 만을 발현했으며 (도 7F, 26B), 이것은 ATO에서 TCR 조작된 T 세포의 분화 도중의 거의 완전한 내인성Vβ 발현 대립 배제(near complete allelic exclusion of endogenous Vβ expression)과도 일관된 것이다. 그러므로 ATO는 HSPC에서 유래된 기능성의 TCR 조작된 TCR 조작된 T 세포의 강력한 분화와 TCR 확장된 세포 팽창 도입을 도와주었으며, 내인성 TCR Vβ 발현이 부족한 성숙한 나이브 T 세포의 분화를 증진시켰다.
앞서 언급된 발견이 NY-ESO-1 TCR 이상으로 확장 가능한지 시험하기 위해, ATO는 코돈 최적화 HLA-A*02:01-제한적 MART-1-특이적 TCR(codon-optimized HLA-A*02:01-restricted MART-1-specific TCR)을 사용하여 생성되었다. 이러한 ATO로부터 추출된 CD3+tetramer+CD8SP는 나이브 T 세포 형질을 보였으며 (도 26C), MART-1 aAPC에 반응하여 IFNγ와 CD107a 표면 발현이 증가하였고 NY-ESO-1 aAPC에 대해서는 반응이 없었다 (도 26D).
F. MHC 변형된 ATO에서의 TCR 조작된 T 세포의 증가된 양성 선택
흉선에서의 양성 선택은 T 세포 전구체(precursor) 상의 TCR과 흉선 스트로마(thymic stroma)와 조혈 세포(hematopoietic cell)에서의 자가-MHC 사이의 상호작용에 의해 매개된다. 그러므로, ATO에서 자가 MHC의 증가된 기질 표현(stromal expression)이 TCR 조작된 T 세포의 양성 선택을 증진 시킬 수 있는지 여부에 대해 조사하였다. HLA-A*02:01 양성 HPSC는 HLA-A*02:01-제한적 NY-ESO-1-특이적 TCR (HLA-A*02:01-restricted NY-ESO-1-specific TCR)로 형질도입(transduced) 되었으며 대조군 MS5-hDLL1 스트로마 혹은 HLA-A*02:01으로 형질도입된 MS5-hDLL1과 결합되었다 (도 27A). ATO의 스트로마 세포에서의 HLA-A*02:01 발현은 성숙한 나이브(naive) 형질로의 일반적인 분화는 유지시키면서 (도 27B) tetramer+ CD3+ CD8SP의 양성 선택을 증진시켰다 (도 27A).
G. ATO 유래 TCR 조작된 T 세포의 항원 특이적 종양 제거
발명자들은 이후 ATO 유래 TCR 조작된 T 세포의 항원 특이적 세포 독성을 시험하였다. NY-ESO-1-특이적 TCR 형질 전환된 ATO(NY-ESO-1-specific TCR-transduced ATO)로부터 추출되고 시험관 내(in vitro)에서 36시간 활성화되어 추출된 CD8SP T 세포는 NY-ESO-1 발현 세포주(cell line) (HLA-A*02:01/NY-ESO-1 pMHC 콤플렉스(complex)로 형질 전환된 K562세포 NY-ESO-1 항원이 내생적(endogenously)으로 발현된 HLA-A*02:01+ U266 다발성 골수종 세포주(multiple myeloma cell line))의 세포 사별을 강하게 유도했지만, 관련이 없는 HLA-A*02:01/MART-1 pMHC를 발현하는 모계(parental) K562 세포나 K562 세포에 대해서는 거의 활성을 나타내지 않았다 (도 18A-B). 또한, 항원 특이적인 세포 동성은 장기간 (14일) 시험관 내(in vitro) 팽창 이후에 보관된 이후에도 보존이 되었으며, 이는 통상적인 T세포 표현형(phenotype)의 보유(retention)과도 일치한다 (도 18C). 세포 독성은 동일 기간 동안 팽창된 TCR 형질 전환된(transduced) PB CD8+ T 세포의 것과 유사했다 (도 18C). 이 결과들과 일관되게, 확장된 ATO 유래 TCR 조작된 T 세포들은 동족체(cognate) (K562-ESO)를 발현하며 관련이 없는 (K562-MART1) pMHC 항원을 발현하지 않는 K562 종양이 피하 이식된 NSG 생쥐에서 질병 부하(disease burden)을 유의미하게 조절할 수 있었다 (도 18D-F).
II. 논평
시험관 내(in vitro)에서 흉막 형성(thymopoiesis)를 충실하게 재구성 할 수 있는 능력은 항원 나이브(naive) 상태와 내인성(endogenous) TCR 발현 부족을 포함하여 바람직한 치료 특성을 지니는 조작된(engineered) T 세포 생산을 위한 유일한 기회를 만들어낸다.
표준화된 기성품(standardized, off-the-shelf components)를 사용하여 여기서 입증한 것처럼, ATO 시스템은 효율적으로 정상 단계의 T 세포 커밋먼트(commitment)와 HSPC로부터의 분화를 시작하고 유지할 수 있었으며, 흉막(thymus)와 말초 혈액(peripheral blood)에서의 나이브(naive)한 통상적인 T 세포를 밀접하게 모사한 성숙한 CD3+TCRαβ+ CD8SP와 CD3+TCRαβ+ CD4SP T 세포 생성까지도 가능했다.
ATO는 시험관 내(in vitro) T 세포 분화와 관련된 기존 기술 대비 명백한 생물학적 그리고 적용상(translational)의 이점을 제공한다. 우선, ATO는 단일층(monolayer)에서는 안되었던 인간 T 세포의 양성 선택 및 성숙을 돕는다. 동일한 구성 요소로 만들어진 단일층(monolayer)에서의 비효율적인 T 세포 분화가 발생하는 것으로 보아, ATO에서의 증가된 양성 선택은 3차원 구조에 의존한다. 이는 효율성은 낮지만 흉선 선분을 사용하는 FTOC 또는 재응집된(re-aggregated) 3차원 배양에서 관찰된 양성 선택과 일치합니다. 3차원 상호작용은 T 세포 전구체(precursor)와 발달 리간드(developmental ligand) 또는 자가 MHC(self MHC)와 같은 선택적 리간드(ligand)사이 접촉의 정도(valence) 및/또는 기간(duration)를 증가시킴으로써 T 세포 발생을 향상시킬 수 있다. 대안적으로, 3차원 배치는 스트로마 세포(stromal cell)과 조혈 세포(hematopoietic cell) 사이 크로스토크(crosstalk)를 용이하게 하거나 2D에서는 달리 가능하지 않은 기계적 힘 및/또는 대사 변화를 통해 T 세포 전구체(precursor)에의 발달 신호를 발휘할 수 있다.
기존 기술 대비 ATO 시스템의 또 다른 중요한 진보는 제대혈(cord blood), 골수(bone marrow), 혹은 휴지기나 가동된 말초 혈액(resting or mobilized peripheral blood)을 포함하는 임상적으로 적용 가능한(clinically relevant) HSPC의 성인 공급원으로부터의 고효율 T 세포 분화이다. 현재의 단일층(monolayer) 시스템은 CB, BM, 혹은 MPB로부터의 TCRαβ+ T 세포의 비효율적인 발달만을 유발시켰다. 휴지기 말초 혈액(resting peripheral blood) HSPC에 대한 데이터는 보고된 바 없다.
조작된 세포의 뚜렷한 이점을 제공한다. ATO 스트로마 세포(stromal cell)에서의 동족체(cognate) MHC의 발현으로 인한 TCR 조작된 나이브T 세포의 향상된 양성 선택은 성숙한 ATO 유래 항원 특이적 T 세포 수율을 증가시키는 추가 수단을 제공한다.
T 세포 분화를 통한 형질 전환된 TCR의 ATO에서의 존재는 내인성(endogenous) Vβ TCR 로시(loci)의 거의 완벽한 대립유전자 배제(allelic exclusion)을 중개하며, 이는 이식된 쥐 및 인간 HSPC에 대한 생체 내(in vivo) 연구와 일치하는 것이다. 조작된 말초 혈액(peripheral blood) T 세포에서의 잠재된 동종 반응성(alloreactive) 내인성(endogenous) TCR의 발현은 확장 가능하며 기성의 입양T 세포 치료(off-the-shelf adoptive T cell therapy)의 개발에 있어서 주요 장해물이며, 노동 집약이고 개인화된 자가 이식 조작된(autologous engineered) T 세포의 생산을 필요로 한다. 동종 이식 조작된(allogenic engineered) T 세포 치료법 개발을 위한 전략은 유전자 조작을 통한 내인성(endogenous) TCR/CD3 발현 방해 혹은 바이러스 특이적 T 세포의 TCR 형질 도입(transduction)을 포함하지만, 그러한 방법들 모두 유전자 변형 T 세포의 광범위한 조작 및 확장을 요구로 하며 생체 내(in vivo) 후속 기능을 잠재적으로 손상시킨다. 따라서, 나이브하며, 대립적으로 배재된(allelically-excluded) 조작된 T 세포의 신규 생성(de novo generation)을 위한 ATO의 사용은 입양 세포 치료(adoptive cell therapy)를 위한 비-동종 반응성(non-alloreactive) T 세포 생성을 위한 매우 효율적인 대안적인 전략을 제시한다.
ATO 시스템은 기술적인 단순성, 재현성 및 잠재적 확장성도 제공한다. 무혈청 배지(serum-free medium)의 사용은 단일층(monolayer) 시스템에서 태아 송아지 혈청(fetal calf serum)에서 관찰된 현저한 가변성을 피할 수 있으며, 간단한 배지(medium) 변경으로 배양 기간(최대 20주)동안 ATO를 손상시키지 않는 능력은 단일층(monolayer) 시스템에서 요구되는 세포를 자주 새로운 스트로마 세포(stromal cell)으로 교체 해야하는 것을 방지해준다. T 세포의 순도 높은 집단(population)은 기계적 해리(mechanical dissociation)를 통해 ATO으로부터 쉽게 수집되며 이후 추가적으로 0.5% 미만의 오염된 스트로마 세포(stromal cell)을 제거하는 표준 방법으로 정제될 수 있다. 기성품 사용, 특히 1차 스트로마 세포(primary stromal cell)과 독점적인 스캐폴드 재료(proprietary scaffold material)의 회피는 ATO 생산과 이종 비 함유(xeno-free) 시약 및 스트로마 세포 조사(stromal cell irradiation)를 융합할 수 있는 능력과 함께 ATO를 입양 치료(adoptive therapy)를 위한 T 세포 제작을 위한 임상 수준의 플랫폼으로 전환시키는 것을 단순화 시킬 것이다. 본 시스템의 간편함은 추후 인간 T 세포 발달 및 양성 선택에 대한 모델링에 관심 있는 연구실들에서 본 방식을 직접적으로 채택하는 것을 용이하게 한다.
III. 실험방법
A. 인간 CD34+CD3- HSPC의 분리
신생아 제대혈은 캘리포니아주립대학교 로스앤젤래스(이하 UCLA)에서 출산 이후 폐기된 제대 및 태반 유닛으로부터 얻었다. 골수(BM)는 UCLA의 동종 골수 기증자 수확물에서 버려진 재료를 통해 건강한 성인 기증자에게서 얻거나 올셀즈 주식회사 (AllCells Inc.) (알라메다, 캘리포니아)에서 구입하였다. G-CSF 가동화된 말초 혈액은 UCLA에서 동종 이식 줄기 세포 이식 기증을 위한 혈장 교환술을 받은 건강한 성인 기증자로부터 동의 하에 얻어졌다.　비-가동화 말초 혈액은 UCLS/CFAR 바이러스 연구소(UCLA CFAR Virology Core)를 통해 건강한 성인 기증자에게서 얻어졌다. 모든 조직 샘플은 UCLA IRB 승인 절차 또는 면제 하에 얻었다. 모든 샘플은 피콜-파크(Ficoll-Paque) (GE 헬스케어 라이프 사이언스, 피츠버그, 펜실베니아) 구배 원심 분리법으로 단핵 세포를 농축시켰고, 이어서, CD34 마이크로비드 키트 울트라 퓨어 (밀테니, 어번, 캘리포니아)를 사용하여 자기 보조 세포 선별 (MACS)에 의한 CD34+세포의 양성 선별을 하였고, 이어서 CD34+세포 농축 분획은 달리 언급하지 않는 한 MACS 이후에 동결 보존되었다. 사용하기 전에, 세포를 해동시키고 잔류 T 세포는 형광활성세포분류기(FACS)에 의해 CD34+CD3- 세포를 분류하여 없앴으며, 이는 즉시 ATO에 파종되거나 하기 기술 된 바와 같이 형질 도입되었다. 일부 실험에서, HSC는 ATO에 파종하기 전에 Lin-CD34+CD38- 세포를 위해 FACS에 의해 농축되었다. TCR 형질 도입 실험에 사용된 HSPC는 HLA-A*02:01+ CB 유닛 에서 유래되었다. UCLA 면역 유전학 센터에서 서열 특이적 올리고 뉴클레오티드 (SSO) 비드를 사용하여 고해상도 HLA-A2 검사를 수행했습니다.
B. 인간 골수 전구 세포 서브세트의 분리
CD34+ HSPC는 위와 같이 신선한 골수 흡인물로부터 농축되었고, CD45의 양성 발현 및 하기 마커(총 HSPC (CD 34+), HSC (CD34+CD38-CD45RA-), LMPP (CD34+CD38+CD45RA+CD10+CD24-CD24Lhi), CD24-CLP (CD34+CD38+CD45RA +CD10+CD24-), 및 CD24+CLP (CD34+CD38+CD45RA+CD10CD24+))와 결합된 계통 마커 (CD3, CD14, CD19, CD56 및 CD235a; Lin-)의 결핍된 발현에 기초한 줄기/전구세포 집단에 대한 FACS에 의해 즉시 분류되었다.
C. 인간 흉선 세포 (thymocytes)의 분리
출생 후의 인체 흉선은 로스앤젤러스 아동병원(Los Angeles Children 's Hospital, CHLA)에서 심장 수술을 받은 환자의 버려진 폐기물로부터 IRB 면제 하에 얻었다. 흉선 단편을 RPMI에서 정교하게 절단하고, 흉선 세포를 현탁액으로 넣기 위해 피펫팅(pipetting)하여 파쇄하고, 이어서 70㎛ 나일론 여과기를 통과시켰다. 당일이나 다음 날에 신선한 상태의 세포를 분석하였다. 흉선 및 ATO 유래 T 세포 전구세포의 유동세포 계측법에 의한 분석은 다음과 같은 표면 표현형을 사용했다. 조기 흉선 전구 세포 (ETP, CD34+CD7-CD1a-), CD1a-pro-T (CD34+CD7+CD1a-) 및 CD1a+pro-T (CD34+CD7+CD1a+) 또는 CD5- pro-T (pro-T1; CD34+CD7+CD5-) 및 CD5+ pro-T (pro-T2; CD34+CD7+CD5+). 흉선 및 ATO 유래 T 세포 및 전구세포는 다음의 표현형과 결합하여 CD14-CD56-로 정의된다: 총 T 계통 세포 (CD7+CD5 +), 이중 음성 (DN; CD4-CD8-), 미성숙 CD4 단일 양성 (CD4 ISP, CD5 + CD4+ CD3-) 이중 양성 (DP; CD4+CD8+), CD8SP (CD3+ TCRαβ+ CD8+ CD4-), CD4SP (CD3+ CD8+ TCRαβ-CD4+) 미성숙 나이브 (CD8SP 또는 CD4SP 였던CD45RA-CD45RO+), 성숙한 나이브 (CD8SP 또는 CD4SP 였던CD45RA+CD45RO-). CD1a, CD27, CD28 및 CCR7에 대한 공동 염색에 의해 미성숙하고 성숙한 나이브 표현형을 확인하였다.
D. 인간 1차 T 세포의 분리
상술한 바와 같이 흉선 T 세포는 흉선 세포 준비물(prepratations)부터 분리하고, 말초 혈액 및 제대혈 CD8+T 세포는 상기한 단핵 세포 분획으로부터 분리하였다. 모든 소스로부터의 CD8+T 세포 분리는 CD8+T 세포 분리 키트 (밀테니)를 사용한 CD8SP T세포에 대한 자기 비드 농축에 의해 분리된 것이다. 일부 실험에서는 흉선 T 세포를 CD4 ISP 또는 DP 전구세포를 제거하기 위해 FACS로 더 정제하고, PB T세포는 나이브 T 세포(CD45RO-CCR7 +)를 얻기 위해 정제된다.
E. 세포주 (Cell lines)
상기 MS -5- 마우스 스트로마 세포주는 선물로 얻었다. MS5-hDLL1을 생성하기 위해, MS-5 세포는 인간 DLL1 및 GFP를 암호화하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입하였다. 최고 5 %의 GFP 발현 세포를 FACS로 분류하고 DMEM / 10 % FCS로 계대배양하였다. 안정한 발현은 수주의 배양 후 GFP 발현에 대한 유동세포 계측법에 의해 확인되었고, DLL1 발현은 qRT-PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. MS5-hDLL1-A2.1 세포는 인간 HLA-A*02:01 렌티 바이러스 벡터 (캘리포티아 공과대학, David Baltimore 박사로부터의 선물)로 MS5-hDLL1 세포를 형질 도입시킨 후, 인간 HLA-A2 (BB7.2)(바이오레전드, 샌디에고, 캘리포니아)를 인식하는 항체를 사용하여 형질 도입된 세포를 FACS로 분류하여 얻었다. OP9-DL1 세포주 (마우스 Dll1 발현)는 Juan Carlos Z
Figure pct00006
iga-Pfl
Figure pct00007
cker (토론토 대학교) 박사의 선물이었으며 0.1 % 젤라틴 코팅된 플라스크에서 MEMα (써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)/20% FBS에서 계대 되었다. K562 세포주는 ATCC로부터 얻었고 RPMI/10 % FCS에서 배양하였다. K562 aAPC는 K562 세포를 인간 CD80 및 HLA-A*02:01 / B2M / NY-ESO-1 157-1650　전체와 또는 MART-1 26-35 단일 체인 트라이머(SCTs; 캘리포니아 공과대학의 데이비드 볼티모어박사의 선물)를 암호화하는 렌티 바이러스 벡터를 형질 도입함으로써 생성되었다. K562 대상 세포는 SCT 중 하나로 형질 도입하여 만들어졌다. K562 생체내 표적세포는 반딧불이의 루시퍼라제(luciferase) 렌티바이러스 벡터 (UCLA, 도날드 콘박사의 선물) 와 SCT에 의한 순차적 형질 도입에 의해 만들었다. K562 형질 도입체는 사용 전 FACS로 분류했다. U266 다중 골수종 세포주는 존 츄트 박사(UCLA)의 선물이며 RPMI/10% FCS에서 배양하였다.
F. 인공 흉선 오가노이드(ATO) 배양
MS5-hDLL1 (또는 MS5 또는 OP9-DL1, 언급된 바와 같음) 세포를 트립신화에 의해 수확하고 PBS 에 RPMI 1640 (코닝, 매나싸스, 버지니아), 4% B27 보충제 (써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), PBS에 녹인 30 μM L-아스코르 빈산 2- 인산 세스퀴마그네슘 염 수화물 (시그마 알드리치, 세인트 루이스, 미주리), 1 % 페니실린/스트렙토 마이신 (제미니 바이오-프로덕트, 웨스트 새크라멘토, 캘리포니아), 1% 글루타맥스 (써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), 5 ng / ml rhFLT3L 및 5 ng / ml rhIL-7 (펩로텍, 로키 힐, 뉴저지)로 구성된 로 구성된 무혈청 ATO 배양 배지 ("RB27")에 재현탁시켰다. RB27은 매주 새로 신선하게 만들었다. 4% 제노프리(Xenofree) B27은 표시된 실험들에서 B27로 대체하였다.
실험에 따라, 1.5 - 6×105 MS5-hDLL1 세포는 1.5 ML 에펜도르프 튜브에서 ATO 당 3×102 - 1×105개의 정제된 CD34+CD3- 세포 (또는 표시된 바와 같이 다른 HSPC 개수)와 결합하고 스윙 버킷 원심 분리기에서 4℃에서 5 분 동안 300g에서 원심분리하였다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠렛을 짧은 보텍스(Brief vortexing)로 재현탁시켰다. 각각의 ATO에 대해 0.4 μm 밀리셀 트랜스웰 인서트 (EMD 밀리포어, 빌레리카, 매사추세츠, Cat. PICM0RG50)를 웰 당 1 ml의 RB27이 들어있는 6-웰 플레이트에 넣었다. ATO를 넣기 위해 인서트를 꺼내어 플레이트의 가장자리에 놓아 과도한 배지를 배출시켰다. 세포 슬러리를 ATO 당 5-8㎕로 조정하고, 20㎕ 피펫 팁으로 끌어 올리고, 피펫 팁의 말단부에 방울을 형성하여 세포 인서트 위에 부드럽게 놓았다. 세포 인서트를 1 mL RB27을 함유하는 웰에 다시 넣었다. 배지는 세포 인서트 주위로부터 흡인에 의해 매 3-4 일마다 완전히 교체하였고, 이어서 신선한 RB27/사이토카인 1 ㎖로 대체되었다. ATO 20 주까지 이 방식으로 배양되었다. 지시된 시간에, 각 웰에 FACS 완충제 (PBS / 0.5 % 소 혈청 알부민/ 2mM EDTA)를 첨가하고 1 ml "P1000"피펫으로 피펫 팅하여 ATO를 간단히 분해하여 ATO 세포를 수확하고, 이어서 70 μm 나일론 여과기를 통과시켰다. 일부 실험에서 MS5-hDLL1 세포의 단일 세포 현탁액에 ATO에서 사용하기에 앞서 표시된 투여량으로 γ선을 조사하였다.
G. T 세포 단일층 공배양(co-cultures)
OP9-DL1 단일층 배양은 이전에 기술한 바와 같이 설정 하였다.　간략하게, OP9-DL1세포를 사용하기 1-2 일 전에 0.1 % 젤라틴이 코팅 된 12-웰 플레이트에 시딩(seeding)하여 70-80% 컨플루언스(confluence)를 달성하도록 하였다. 　배지는 단층에서 흡인되었으며 1x104-1.5x104　정제된 CD34+CD3- HSPC를 MEMα, 20 % FBS, 30 μM L-아스코르빈산, 5 ng / ml rhFLT3L 및 5 ng / ml rhIL-7로 구성된 배지 2 ml에 있는 스트로마 단일층 위에 놓았다. 일부 실험에서, MS-5 또는 MS5-hDLL1로 OP9-DL1을 대체하고, RB27을 배양 배지로 대체하였다.　세포를 수확하고, 70 μm 나일론 여과기로 여과하고, 재채취하여4-5일에 한번씩 새로운 스트로마 세포 단일층으로 옮겼다.　합류 할 때, 세포는 새로운 기질 층을 함유하는 다수의 웰로 분할되었다.　배양은 최대 10 주 동안 유지되었다.
H. 렌티바이러스 벡터 및 형질 도입
인간 DLL1의 암호화 서열의 전체길이는 인간 범용 참조 RNA 세트(human universal reference RNA set) (애질런트 테크놀러지, 산타클라라, 캘리포니아)에서 3 세대 렌티 바이러스 벡터 pCCL-C-MNDU3-X-IRES-eGF(UCLA, 도날드 콘박사 제공) 로 RT-PCR에 의해 클로닝 하였다 인간 CD80은 pCCL-c-MNDU3에 유사하게 클로닝하였다.
HLA-A*02:01/NY-ESO-1157-165 (1G4 TCR 클론에서 유래됨) 에 특이적인 TCR의 최적화 된 α 및
Figure pct00008
(Vb13.1) 사슬을 갖는 코돈을 암호화하는 3 세대 렌티 바이러스 벡터는 앞에서 기술하였으며, UCLA의 안토니리바스 박사가 제공하였다. 코돈에 최적화된 HLA-A*02:01/MART-126-35 특이적 TCR (F5 TCR 클론에서 유래됨)은 UCLA의 도날드 콘박사가 제공하였다. HLA-A*02:01 및 HLA-A*02:01/B2M/NY- ESO-1157-165 또는 HLA-A*02:01/B2M/ MART-126-35 단일 체인 트라이머에 대한 코딩 서열은 캘리포니아 공과대학 데이빗 볼티모어 박사가 제공하였고 pCCL-c-MNDU3-X-IRES-mStrawberry에 서브클로닝(sub-cloned)되었다. 렌티 바이러스 입자의 패키징 및 농축은 전술 한 바와 같다. 간단히, Transit 293T (마이러스 바이오, 매디슨, 위스콘신) 를 사용하여 17 시간 동안 293T 세포 (ATCC)에 렌티 바이러스 벡터 플라스미드, pCMV-
Figure pct00009
R8.9 및 pCAGGS-VSVG를 공동 형질도입 시킨 후, 20 mM 소듐 부티레이트(sodium butyrate)로 8 시간 동안 처리 한 후, 48시간동안 무혈청 UltraCulture에서 세포 상층액을 생성시켰다. Amicon Ultra-15 100K 필터 (EMD 밀리포어, 빌레리카, 매사추세츠) 를 사용하여 4000g에서 4 ℃ 40분 동안 접선유동여과법을 이용하여 상층액을 농축시키고 -80 ℃에서 앨리컷(aliquot)하여 저장하였다. HSPC 형질 도입을 위해, 1x105-1x106 개의 FACS 에 의해 분류된 CD34+CD3-HSPC를 50 ng/ml의 재조합 인간 SCF, FLT3L 및 TPO와 10 ng/ml IL-3 (펩로텍, 로키힐, 뉴저지)를 12-18 시간 동안 보충한1 ml 의 X-VIVO-15 (론자, 바젤, 스위스)에서20 μg/ml Retronectin (클론텍, 마운틴 뷰, 캘리포니아)으로 코팅한 6-well 비처리 플레이트에 도말하였다. 농도가 높은 렌티 바이러스 상층액을 100의 감염 다중도 (MOI) 조건에서 첨가하였다. 모의-형질 도입된 세포에는 벡터를 첨가하지 않고 동일한 조건에서 시딩(seeding)하였다. 24 시간 동안 세포를 형질 도입 후 수확하고, 세척하고, ATO에 시딩(seeding)하였다. 말초 혈액 T 세포의 형질 도입을 위해, 건강한 공여자의 CD8+T 세포를 CD8+T 세포 분리 키트 (밀테니)를 사용하는 자성 음성 선별법으로 분리하고 항CD3/CD28 비드(써모피셔 사이언티픽)로 AIM V/5 % 인간 AB에서 활성화/증식 시키고, 20 ng/ml IL-2로 앞에 기술한 바와 같이 형질전환에 4일간 앞서 처리 하였다. 이후 형질 도입된 T 세포는 사용 전에 IL-2 (20 ng / ml)에서 계속 증식시켰다.
I. 면역조직화학
헤마톡실린과 에오신 (H&E) 이미지의 경우, ATO를 히스토젤(써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕) 에 끼우고 10 % 중성 완충 포르말린 (써모피셔 사이언티픽, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)에서 밤새 고정시켰다.　 5 μm 단면 및 H&E 염색은 UCLA 중개 병리학 핵심연구소(Translational Pathology Core Laboratory, TPCL)에서 하였다.　면역 형광 이미징을 위해, 의료용 칼로 각 ATO 주위에 배양 인서트를 절단하고, Tissue-Tek OCT (VWR 래드노, 펜실베니아)에 멤브레인 및 ATO를 매립하고 드라이 아이스상에서 동결시킴으로써 ATO를 분리 하였다.　 5 μm의 동결 시편은 10 % 중성 버퍼 포르말린에 고정하고 4 ℃ 에서 밤새 1:50 의 비율로 희석한 항-CD3 (클론 UCHT1; 바이오레전드, 샌디에고, 캘리포니아)로 염색한 후 AlexaFluor 594-콘쥬게이티드 안티-마우스 IgG (H+L) (잭슨이뮤노리서치, 웨스트 그로브, 펜실베니아)를 실온에서 넣어 배양하였다.　 AxioCam MRM 및 AxioVision 소프트웨어 (자이스, 제나, 독일) 가있는 Zeiss AzioImager M2에서 H & E 및 면역 형광 이미지를 얻었다.
J. T 세포의 사이토카인 분석
ATO의 성숙한 CD8SP 또는 CD4SP 세포는 CD8+ 또는 CD4+ 분리 키트 (Miltenyi)를 사용하여 자성 음성 선별법으로 분리하고 CD45RO+ 세포 (미성숙 나이브 T 세포 및 CD4ISP 전구세포 포함)를 추가로 없애기 위해 FACS로 분류하였다. 정제된 T 세포 집단을 5 % 인간 AB 혈청 (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)을 갖는 200㎕ AIM V (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)의 96-웰 U자형 바닥 플레이트에 도말 하였다. PMA/ 이오노마이신/ 단백질 수송 억제제 칵테일 또는 대조 단백질 수송 억제제 칵테일 (eBioscience, San Diego, CA)을 각 웰에 첨가하고 6 시간 동안 배양 하였다. 세포를 세포 내 염색 완충액 키트 (eBioscience, San Diego, CA)로 고정 및 투과처리화 하기 전에 CD3, CD4 및 CD8 (Biolegend, San Diego, CA) 및 UV455 고정 생존 염료 (eBioscience, San Diego, CA) 및 IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4 또는 IL-17A (Biolegend, San Diego, CA)에 대한 항체로 세포 내 염색을 수행 하였다.
K. T 세포 활성화 및 증식시험
CFSE 증식 분석을 위해, ATO 유래 CD8SP 또는 CD4SP T 세포를 상술한 바와 같이 음성 선택 MACS (상술한 CD4SP T 세포의 추가 FACS 정제)에 의해 분리시키고 제조사의 지시에 따라 5μM CFSE (Biolegend, San Diego, CA)로 표지 하였다. 표지 된 세포를 5 % AB 혈청 및 20 ng/ml rhIL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)가 보충된 AIM V에서 항 -CD3 / CD28 비드 (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)와 함께 배양하고, CD25 또는 4-1BB (Biolegend, San Diego, CA)를 사용하고 5 일째 유동세포 계측법으로 분석하였다. 일부 실험에서는 Cell Trace Violet (CTV; ThermoFisher) 대신 CFSE를 제조사의 프로토콜에 따라 라벨링 하였다. 시험관 내 세포 증식 분석을 위해, 상기와 같이 분리 된 5x103-1x104 ATO 유래 CD8SP 또는 CD4SP T 세포를 96- 웰 U자형 바닥 플레이트 200㎕ 중에 플레이팅 하고, 항 -CD3/28 비드로 활성화 / 확대시키고, 20 ng/mL IL-2 또는 5 ng/mL IL-7 및 5 ng/mL IL-15 (Peprotech). 비드를 4 일에 제거하고, 필요에 따라 2-3 일마다 신선한 배지 및 사이토카인을 큰 웰로 옮기면서 첨가 하였다. 혈구계로 세포를 매주 세었다. 일부 실험에서, 세포를 14 일째에 새로운 항 -CD3 / CD28 비드로 다시 자극 하였다.
L. 인공 APC (aAPC) CTL 프라이밍 분석
1×105 개의 총 ATO 유래 CD8SP T 세포는 상기와 같이 MACS에 의해 6 주부터 TCR-형질 도입된 ATO로부터 분리시켜 CD80을 발현하는 K562-유래 aAPC 및 HLA-A*02:01/B2M/NY-ESO-1157-165 또는 HLA-A*02:01/B2M/MART-126-35 또는 부모 K562 세포 중 하나의 단일 체인 트라이머를 96웰 U자형 바닥 플레이트에서 6 시간 동안 4:1의 T 세포: K562 비율로 200㎕ AIM V/5 % 인간 AB 혈청에서 공배양 하였다. 배양 기간 동안 단백질 수송 저해제 칵테일 (eBioscience, San Diego, CA)과 함께 CD170a-APC 항체 (Biolegend, San Diego, CA)를 1:50의 최종 희석비율로 웰에 첨가하였다. 이어서, 세포를 표면 마커에 대해 염색하고, 고정시키고, 투과처리화하고, 전술 한 바와 같이 사이토카인에 대해 세포 내로 염색 하였다.
M. TCR Vβ 표현형 분석
IOTest Beta Mark TCR V 키트 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)와 함께 7 주째 ATO 또는 출생 후의 흉선의 총 세포를 CD3, CD4, CD8 및 TCRγδ에 대해 염색 하였다. CD3+TCRγδ-CD8+CD4- 세포는 Vβ 분석을 위해 게이팅하였고, Vβ 계열의 사용은 FITC+, PE+ 또는 FITC+PE + 세포의 퍼센트 의해 결정되었으며, 이는 튜브 당 3 가지 다른 Vβ 항체를 뜻한다. TCR-형질도입 된 ATO의 Vβ 분석을 위해, 6-7 주 ATO의 총 세포를 표면 항체 염색 10 분 전에 APC-컨쥬게이티드 된 HLA-A*02:01/NY-ESO-1157-165 테트라머 (MBL International, Woburn, MA) 를 추가로 레이블 하였으며, Vβ 분석을 위해 세포를 CD3+TCRγδ-tetramer+CD8+CD4-에 대해 게이팅 시켰다.
N. TCR 레파토리 서열분석
전체 RNA는 RNEASY MICRO KIT (QIAGEN)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 FACS로 40,000 ~ 200,000 ATO 또는 흉선 CD8SP 또는 PB CD45RO-CCR7+ 나이브 CD8+T 세포에서 정제했다. RNA 농도와 품질은 AGILENT RNA 6000 NANO 칩을 사용하여 결정하였다. 재조합 TCR 가변 유전자를 포함하는 타켓 CDNA 라이브러리는 SMARTER PCR cDNA SYNTHESIS KIT (CLONTECH)를 사용하여 다음과 같은 변형을 갖는 5'-RACE에 의해 준비되었다. 첫 번째 가닥의 cDNA는 제조사의 프로토콜을 사용하여 폴리-DT 프라이머 (5'-T30VN-3 ')를 대체하여 3.5-500 ng의 총 RNA로부터 준비되었다. ADVANTAGE 2 PCR 키트 (CLONTECH)를 사용하여 세미 네스티드 PCR (Semi-nested PCR)에 의해 2중 가닥 TCRα 및 TCRβ cDNA 라이브러리를 별도로 준비하였다. 0.5 μL 첫번째 가닥 반응 (=TE에서 1:5 로 희석한 2.5 μL) 을 이용한 TCRα CDNA의 초기 증폭은 제조사의 정방향 유니버설 프라이머 믹스 (Forward Universal Primer Mix)와 TRAC (5'-GCCACAGCACTGTTGCTCTTGAAGTCC-3 '(5’-GCCACAGCACTGTTGCTCTTGAAGTCC-3’ (SEQ ID NO. 1))에 결합하는 한 쌍의 역방향 프라이머를 가지고 이루어졌다. TCRα cDNA의 세미 네스티드 증폭(Semi-nested amplification)은 제조사의 순방향 프라이머 IIA 및 TRAC (5'- X5GGCAGGGTCAGGGTTCTGGAT-3 '(SEQ ID NO. 2)에 - 여기에서 X5는 5-nt 샘플-특이적인 바코드로 딥시퀀싱(deep-sequencing )에 앞서 샘플의 풀링(pooling)을 가능하게 한다 - 결합하는 바코드된 역방향 프라이머로 수행 하였다. TCRβ cDNA의 증폭은 유사하지만 TRBC (5'- CCACCAGCTCAGCTCCACGTG-3 '(SEQ ID NO. 3))에 결합하는 역방향 프라이머로 초기 증폭을 수행하고, 세미 네스티드 증폭(Semi-nested amplification)은 TRBC TRBC (5’- X5GGGAACACSTTKTTCAGGTCCTC-3’ (SEQ ID NO. 4))에 결합하는 바코드된 프라이머로 수행하였다. TCRα 및 TCRβ cDNA 준비물은 DNA Clean and Concentrator-5 키트 (Zymo Research)를 사용하여 세척하였다. 일루미나 어댑터 라이게이션(Illumina adapter ligation)과 2 x 150-bp 쌍-말단 서열분석을 마이섹 서열분석기(Illumina)에서 진행하기에 앞서 최대 10 개의 시료에서 얻은 TCRα 와 TCRβ cDNA 준비물을 풀링(pooling)했다. 샘플 특이적 바코드를 사용하여 역 다중화(de-multiplexing) 한 후, 염기서열 단편(read)들을 BLAT를 이용한 IMGT 데이터베이스에서 다운로드 한 인간 TRAV, TRAJ, TRBV, TRBD 및 TRBJ 시퀀스의 가능한 모든 조합을 포함하는 사용자 정의 참조 데이터베이스에 정렬하였다. 최고의 BLAT 히트는 '-maxAligns = 1 - ignoreIntrons' 옵션을 사용하는 BLAT suite의 pslCDnaFilter 유틸리티를 이용하여 확인하였고, 사용자 정의 펄(Perl) 스크립트를 사용하여 클론 유형 빈도를 계산하였다.
O. 시험관 내 세포독성시험
전술한 바와 같이 CD8SP T 세포를 기계적 파쇄 및 자성 음성 선별법(magnetic negative selection)에 의해 ATO로부터 분리 하였다. T 세포를 항 -CD3 / CD28 비드 (ThermoFisher Scientific) 및 20 ng/ml IL-2로 36 시간 동안 AIM V/ 5% 인간 AB 혈청으로 96웰 둥근 바닥에서 활성화시켰다. 확장된 증식을 위해, 세포를 IL-2에서 14 일 동안 더 배양 하였다. 세포독성 분석을 위해, AIM V/5% 인간 AB 혈청에서 1x105 세포 / 웰로 시작하여 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 웰당 T-세포의 2-폴드 시리얼 희석액을 플레이팅 하였다. HLA-A * 02: 01 / NY-ESO-1157-165 또는 HLA-A * 02: 01 / MART-126-35 단일 체인 트라이머 또는 내인적으로 HLA-A *02:01+U266으로 형질도입 된 K562 표적 세포 express NY-ESO-1을 웰당 5x104 세포에 도말 하였다. 표적 세포의 아폽토시스 세포 사멸은 9 시간에 Annexin V / DAPI 염색에 의해 정량화되었다. 항원 특이적 T 세포의 퍼센트를 테트라머 염색(tetramer staining)으로 측정하고, 각 웰의 이펙터: 표적(E:T)의 비율을 거꾸로 계산하는데 사용 하였다. T 세포 특이적인 세포 사멸은 T 세포를 첨가한 웰로부터 T 세포를 첨가하지 않은 웰에서 아넥신 V + 표적 세포의 퍼센트를 뺀 값으로 계산 하였다.
시험관 내 종양 분석
모든 동물 실험은 UCLA 교육감 동물 실험위원회의 승인 하에 수행되었다. 4-6 주령 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ (NSG) 마우스 (Jackson Laboratory, Maine Bar Harbor)의 피하에 HLA-A * 02: 01 / NY-ESO-1157- 165 또는 MART-126-35 단일 체인 트라이머 및 반딧불이 루시퍼라제로 형질도입 된 2x105 K562 표적 세포(위에서 설명한 바와 같음)가 이식되었다. 루시페린을 복막 내 주사한3 일째에 마우스를 종양생물발광(tumor bioluminescence)을 위해 영상화 하였다. ATO 유래 CD8SP T 세포를 상기와 같이 분리하고 14 일 동안 활성화 및 증식시켰다. 종양 이식 후 3 일째에 5.7x106 (주사한 날에 테트라머 염색을 하여 결정된 항원 특이적 T 세포 4.5x106을 함유함)을 안와 후 정맥(retroorbital vein)을 통해 주입 하였다. PBS를 대조군 마우스에 주입 하였다. 종양생물발광은 적어도 21일 동안 3-4 일마다 반복되었고, 그 후 마우스들은 질병부담기준(disease burden criteria)에 따라 희생되었다.
P. 유동세포 계측법 및 항체
모든 유동세포 계측기 얼룩을 얼음상에서 PBS/ 0.5 % BSA / 2mM EDTA에서 30 분 동안 수행 하였다. FcX (Biolegend, San Diego, CA)를 항체 염색 전에 5 분 동안 모든 샘플에 첨가 하였다. 테트라머 공동 염색을 위해 PE 또는 APC- 접합 HLA-A * 02: 01 / NY-ESO-1157-165 또는 HLA-A*02:01 / MART-126-35 테트라머(MBL International, Woburn, MA)를 얼음 위에서 추가로 20 분 동안 항체를 첨가하기 전에 실온에서 10 분 동안 최종 희석 1:50의 세포에 첨가 하였다. 분석 전 모든 샘플에 DAPI를 첨가 하였다. 분석은 URIA Broad Stem Cell 연구 센터 Flow Cytometry Core에서 ARIA 또는 ARIA-H 기기 (BD Biosciences, San Jose, CA)의 LSRII Fortessa 및 FACS에서 수행되었다. 모든 분석에 대해 DAPI + 세포는 게이트 아웃되고, 단일 세포는 FSC-H 대 FSC-W 대 SSC-H 대 SSC-W를 기준으로 게이트 되었다. 표면 및 세포 염색에 사용된 항체 클론은 Biolegend (샌디에고, CA)로부터 획득되었다:에 CD1a (HI149), CD3 (UCHT1), CD4 (RPA-T4), CD5 (UCHT2), CD8 (SK1), CD10 (6H6) , CD25 (CD14), CD34 (581), CD38 (HIT2), CD45 (CD45), CD20 (CD12), CD20 HI30) CD45RA (HI100) CD45RO (UCHL1), CD56 (HCD56), CD107a (H4A3), CD127 (A019D5), CD235a (HI264), CCR7 (G043H7), HLA-A2 (BB7.2), 인터페론 γ ( 4S.B3), IL-2 (MQ1-17H12), IL-4 (MP4-25D2), IL-17A (BL168) TCRαβ (IP26) TCRγδ (B1), TNFα (Mab11) Vβ13.1 (H131 ), 인간 리니지 칵테일 (CD3, CD14, CD19, CD20, CD56); 및 BD Biosciences (San Jose, CA) : CD7 (M-T701) 및 CD62L (DREG-56).
실시예 4: 다른 스트로마 세포는 ATO 모델 시스템에서 사용될 수 있다.
ATO 시스템이 보다 잘 변환될 수 있게 하기 위하여, 다른 스트로마 세포주는 마우스 기원의 MS5-hDLL1을 대체 할 수 있는 능력에 대해 시험 하였다. HS27a 세포는 인간 골수 세포주이며, 낮은 수준의 성장 인자를 분비하기 때문에 훌륭한 후보 물질이다. 노치 리간드 (hDLL1)를 발현하는 HS27a 세포주는 HS27a 세포에 hDLL1을 형질도입 함으로써 생성되었다. 높은 수준의 hDLL1을 발현하는 세포는 FACS에 의해 정제되고 증식되었다. 노치 시그널링의 부재 하에, ATO 시스템의 HS27a 세포는 T 세포 분화를 지원할 수 없었다 (도 28A-C). MS5 스트로마 세포 이외에 HS27a가 ATO 시스템에서 3 가지 상이한 제대혈 시료 제제로부터 T 세포 분화를 지원할 수 있다는 것이 밝혀졌다 도 29A-C. 도 30에 도시된 바와 같이, HS27a-DLL1 ATO에서 볼 수 있는 CD8+ 세포의 강력한 개체군의 세포 대부분은 CD3 및 TCRab을 발현하지 않기 때문에 종래의 CD8SP 세포가 아니다. 성숙 마커(maturation markers)의 사용은 HS27a-hDLL1 스트로마 세포가 3 가지 상이한 제대혈 제제 (도 31A-C)로부터의 TCRab + CD3+ CD8SP 및 CD4SP 세포의 생성과 성숙한 T 세포의 분화를 지지할 수 있음을 보여준다. 그러나 효율성은 MS5-hDLL1 ATO보다 낮다.
실시예 5: 다른 출처의 줄기 세포와 전구체 세포는 ATO 시스템을 사용하여 T 세포로 분화될 수 있다.
본원에 기술된 ATO 시스템은 인간조혈모세포(상이한 출처로부터)로부터 시험관 내(in vitro)에서 기능적인 나이브 T 세포를 생성하는 효율적이고 견고한 모델이다. 이 시스템은 인간배아줄기세포 (hESC)에서 성숙하고 기능적인 인간 나이브 T 세포를 생성하기 위해 채택되었다. 본 발명자는 초기 중배엽으로 커밋된 전구체(earliest mesoderm committed progenitors) 에 해당하고 모든 중배엽 계통 (평활근, 심근 세포, 조혈 계통, 중간엽 계통)을 야기할 수 있는 인간배아 중배엽전구세포(Embryonic Mesodermal Progenitor, hEMP) 개체군을 확인 하였다. 이 hEMP 집단은 Epcam 마커 (CD326)의 발현 상실 및 CD56의 발현 증가에 의해 정의되며, FACS에 의해 쉽게 단리 될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Evseenko et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2010 Aug 3; 107 (31) : 13742-7] 참조). 간략하게, MEFs (마우스 배아 섬유아세포)에서 배양한 hESC는 80-90 %의 밀도에서 마트리젤(matrigel)로 옮길 수 있다. 일단 옮기면 (0 일), 세포를 액티빈(Activin), BMP4, VEGF, bFGF를 포함하는 배지에서 배양한다. 1-2 일 후, BMP4, VEGF 및 bFGF를 포함하는 새로운 배지가 첨가된다. 3-4 일에 세포는 EPCAM의 소실과 CD56의 증가를 기준으로 분류할 수 있다. ES 유래 ATO 시스템은 hEMP 모집단을 분리하고 이를 MS5-hDLL1 스트로마 세포로 모아서 만들었다. 이 프로토콜은 RPMI-B27 배지 (SCF / IL7 / Flt3L 첨가)를 사용하여 T 세포 분화를 유도하기 전에 EGM2 배지 및 조혈 사이토카인 (SB 및 SFT3)으로 ATO를 공급하는 2 주간의 조혈 유도가 요구된다. hEMP 단계의 3D 응집은 T 세포의 생성을 지지한다는 것이 밝혀졌다. OP9 세포 (ATO 없음)의 hEMP로부터 분화된 분리된 CD34+로부터의 ATO의 생성은 T 세포 분화를 지원하지 않았다 (데이터는 나타내지 않았다). 도 32는 줄기 세포의 선택된 집단으로서 hESCs를 갖는 ATO로부터 유래된 T 세포 집단을 보여준다. 도 33-34에 도시된 바와 같이, ATO 시스템에서 hESC로부터의 T 세포 분화와 CD8ab SP 세포 생성 속도를 보여준다. 도 34 내지도 35에 도시 된 바와 같이, ATO 시스템에서 hESC로부터 생성된 T 세포는 제대혈 세포를 사용하여 관찰된 것과 유사한 성숙한 나이브 표현형의 표지자를 발현한다. 도 36에 도시 된 바와 같이, hESCs의 사용은 여러 줄기세포 소스를 통해 재현 가능하다. 도 37은 ATO 시스템 (4 주차)에서, 3 가지 상이한 hESC 라인으로부터의 T 세포 분화를 나타낸다. ATO 시스템은 iPSC 라인으로부터 성숙한 T 세포가 생성 될 수 있게 한다(도 37). 또한, 상술된 상이한 분화 배지를 사용하여 미분화 된hESC (분리 된 hEMP 대신)의 3D 응집은 T 세포의 생성을 또한 허용 하였다 (도 38). 또한, ATO 시스템에서 다수의 노치(Notch) 리간드가 사용될 수 있다. 도 39에 도시 된 바와 같이, ATO 시스템은 스트로마 세포주가 hDLL1 대신에 hJAG1을 발현할 때 hESC로부터의 T 세포 성숙을 또한 지지 할 수 있다. 또한, ATO 시스템에서 hESC로부터 생성된 T 세포가 다양한 TCR Vb 레퍼토리를 나타냄을 규명 하였다 (도 40). 도 41에 도시된 바와 같이, hESC- 유도 T 세포는 항-CD3 / CD28 및 IL2에 반응하여 증식 및 CD25 상향 조절을 나타낸다. 분리된 세포를 CTV (Cell tracker Violet)로 염색하고 5 일 동안 CD3 / CD28 활성화 비드로 배양 하였다. 세포는 CD25의 발현으로 나타낸 바와 같이 CTV의 희석 및 활성화에 의해 나타낸 바와 같이 다중 세포 분열을 겪었다 (도 41A). 추가의 실험에서, 분리된 세포를 PMA / 이노마이신으로 6 시간 동안 처리하였고, 세포 내 염색은 자극에 반응하여 세포 독성 사이토카인 (IFNg, IL2, TNFa)의 생산을 나타내었다 (도 41B).
다음으로, 외인성 TCR을 발현하도록 조작된 T 세포가 hESC 세포를 출발 물질로 하는 ATO 시스템으로부터 생성될 수 있는지를 확인하고자 하였다. H1 hESC는 GFP를 발현하는 opt1G4 벡터 (NY-ESO TCR)로 형질도입 되었다. H1 NY-ESO TCR hESC 라인은 GFP + 세포를 분리하고 증식하여 만들어 졌다. 이어서, T- 세포 분화를 유도하기 위해 세포를 위에서 기술된 것과 동일한 프로토콜에 적용시켰다. 이것은 도 42에 도시된다. hESC의 ATO에서 생성된 조작된 T 세포는 GFP 및 테트라머의 발현에 의해 모니터링 할 수 있다. 이 세포는 T 세포 분화의 전형적인 방법 (DP, CD3+ / TCR + CD8SP)을 따랐다 (도 43). 5 주차에, 조작된 hESC 유래 CD8SP T 세포는 성숙한 나이브(na
Figure pct00010
ve) 표현형을 나타낸다: CD45 RA +, CD27 +, CD62L +, CD31 + (도 44A-B). ATO에서 hESC (5 주차)로부터 생성된 조작된 CD8 SP T 세포를 시험관 내에서 기능적으로 테스트 하였다. 분리된 세포를 CTV (Cell tracker Violet)로 염색하고 CD3 / CD28 활성화 비드 또는 인공 항원제시세포(artificial antigen presenting cells, aAPC)의 존재 하에 5일 동안 배양하였으며, 상기 인공 항원제시세포는 CD80 및 동종 HLA-A * 02: 01 / NY-ESO-1 펩티드- MHC 단일 체인 트라이머(single chain trimer) 또는 무관한(irrelevant) HLA-A*02: 01/MART-1 aAPC를 발현한다. 세포는 CD3/28 활성화 및 동족 펩티드를 발현하는 aAPC (도 45)에 반응하여 CTV의 희석 및 CD25의 발현으로 나타낸 활성화에 의해 나타난 바와 같이 다중 세포 분열을 수행 하였다. 이 분석에서, 세포는 무관(irrelevant) 펩티드를 발현하는 aAPC의 존재 하에서 생존하지 못했다. 추가 실험에서, 분리된 세포를 PMA / 이오노마이신으로 6 시간 동안 처리하였다. 세포 내 염색은 자극에 반응하여 세포독성 사이토카인 (IFNg, IL2, TNFa)의 생성을 보였다 (도 46). 세포는 또한 CD107a의 발현에 의해 나타낸 바와 같이 탈과립을 겪었다 (도 46). 두 개의 개별 분석에서, 분리된 세포를 CD80 및 동족체 HLA-A*02:01 / NY-ESO-1 펩티드 -MHC 단일 체인 트라이머를 발현하는 인공 항원제시세포 (aAPC) 또는 무관한 HLA- A * 02 : 01 / MART-1 aAPC에서 6 시간 동안 배양하였다. 분석 결과 동종 펩티드를 발현하는 aAPC에 반응하여 세포독성 사이토카인 (IFNg, IL2, TNFa) 및 탈과립 (CD107a)이 생성되었지만 관련성이 없는 것은 생성되지 않았다. 하나의 대표적인 실험이 도 47에 도시되어있다. 다음으로, 분리된 세포의 증식 능력을 시험 하였다. 그들은 4 일 동안 CD3 / CD28 비드로 활성화시키고 5 % 사람AB 혈청 및 IL2 (20ng / ml)로 보충된 AIM V 배지에서 2 주 동안 유지시켰다. 그 결과2 주차에 세포의 20 배 증식을 확인할 수 있다 (도 48).
실시예 6: ATO 배지 보충제(medium supplement)
B27보충제의 성분은 ATO 시스템에 대한 상대적인 기여도를 결정하기 위해 테스트되었다. 아래 표는 B27 보충제의 구성 성분을 보여준다.
Figure pct00011
제대혈 ATO (CD34+ CD3- HSPC로 시작됨)를 설정하여 B27 보충제의 필수 성분을 결정했다. 완제품(표준) B27 ("B27 comp")은 단일 성분을 포함하지 않는 것을 제외하고는 동일한 4 가지 보충제(모두 동일한 제조업체가 제공)와 비교하였다: 비타민 A제거 (B27-Ait), 항산화제 제거(B27-AO), 인슐린 제거(B27- 인슐린), 이물질 성분이 없는 것 (B27 xeno free). 데이터는 6 주차에 두 개의 독립적인 실험에서 나온 것이다. 그래프는 총 세포 출력 (상단)과 T 세포로 분화 결정된 세포(T cell committed cells)의 % (CD5 + CD7+) (하단)를 보여준다. 도 49-50에서 볼 수 있듯이, 인슐린은 ATO 시스템에서 T-세포 커밋먼트(T cell commitment)에 필수적이며, 비타민 A 및 항산화제가 세포증식을 촉진한다는 것이 판명되었다. 또한 B27의 제노-프리 제형(xeno-free formular)은 비 제노-프리 제형 에 비해 ATO에서의 T 세포 분화 및 증식에 대해 유사한 결과를 제공한다. 결론적으로, 인슐린은 ATO에서 T 세포 생산에 필수적이며, 이종 생물은 B27 완료와 동등하며 Vit A와 항산화 물질은 세포 생산을 향상 시키지만 T 세포 분화에는 필수적이지 않다.
실시예 7: 인공 흉선 오가노이드(ATO) 시스템을 이용한 조혈 모세포/전구 세포로부터 CAR-T 세포의 생성
본 실시예에서, 발명자들은 ATO에서의 정상 T 세포 분화에 대한 CAR 시그널링의 영향을 규명하고자 하였으며, ATO 유래 CAR-T 세포의 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 기능 및 항 종양 효능을 규명하고, TCR 대립 유전자 배제를 매개하는 CAR의 능력을 규명하고자 하였다. 이를 위해, CD19- 표적화 된 CAR는 제대혈 CD34+ CD3- HSPC로 형질도입 되었다. 그런 다음 이들 세포를 4-6 주간 ATO 시스템에 적용시켰다.
도 52에 도시된 바와 같이, ATO에서의 CAR 발현은 주로 T-리니지 세포로 제한된다. 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptors, CAR)는 표면 발현 및 신호 전달을 위해 CD3 또는 TCR 서브 유닛에 의존하지 않으므로 여러 세포 계통에서 발현될 수 있다. CD1-특이적인 2 세대 (CD28 / CD3zeta) CAR 및 eGFP를 코딩하는 벡터로 형질도입 된 CD34+ CD3- CB HSPC리니지 생성(output)은 ATO 표준 배지(즉, MS5-hDLL1 스트로마, 5ng / ml FLT3L로 보충된 RB27 배지 및 5 ng/ml IL-7)에서 시험되었다. 간단히 말하면, 7500 개의 형질도입 된 HSPC는 1:20 HSPC:스트로마 세포 배양에서 응집되었고 4 주 동안 상술한 대로 배양되었다. 4 주차에 ATO가 파쇄(disruption) 되었고 전체 인간 세포가 리니지 마커(여기에 표시)를 위해 분석되었다. 과립구 (granulocytes) (CD66b +), B 세포 (CD19 +) 또는 NK 세포 (CD56 +)는 극소수의 eGFP + (CAR +) 단핵구(monocytes ) (CD14 +)를 가지고 있었다. CAR + 세포의 대부분은 T 세포 리니지와 일치하는 CD5 + 및 CD7+이었다. 주목할 점은, CAR + 세포는 CD3, TCRab 및 TCRgd 의 발현은 거의 없음을 보여주었고, 비 통상적인 T 세포 분화를 제안한다.
ATO 유래 CAR-T 세포는 비 통상적인(unconventional) T 세포 분화를 나타낸다. 모의(mock) 또는 CD19 특이적인 2 세대 (CD28 / CD3zeta) CAR로 형질 감염된 CB HSPC로 시작된 4 주차 ATO의 세포를 T 세포 마커에 대해 분석 하였다. CAR로 형질도입 된 세포 (GFP +에 게이팅 된)는 주로 T 리니지(CD5 + CD7+) 이었지만, DN 대 DP에서 SP T 세포 분화의 전형적인 패턴을 나타내지 않았다. 대신 대부분의 세포는 DN 또는 CD8SP (가운데 줄) 였다. 또한, ATO CAR-T 세포에서 CD3 / TCR 표면 발현의 증거는 없었다. 이는 도 53에 도시하였다. 비 통상적인 T 세포 분화에도 불구하고 ATO 유래 CAR-T 세포 (CD19 특이적인 2 세대 (CD28 / CD3zeta) CAR로 형질도입 된 CB HSPC)는 CD45RA + CD45RO-로서 CD27 및 CCR7 의 동시 발현으로 특징 지어지는 정상적인 나이브 T 세포 표현형을 나타냈다(도 54). 이 세포들은 또한 CD62L을 공동 발현 하였다 (표시되지 않음).
ATO 유래 CAR-T 세포는 CD2를 세포 내 CD3으로 발현한다. 도 55에 도시 된 바와 같이, ATO 유래 CAR-T 세포(CD19 특이적인 2 세대 (CD28 / CD3zeta) CAR로 형질도입 된 CB HSPC)는 CD5, CD7, CD2 및 세포 내 CD3를 공동 발현하며 T 리니지 세포로서의 동일성을 확인한다.
ATO 유래 CAR-T 세포는 DN 또는 CD8αα +이다. ATO 유래 CAR-T 세포 (CD19- 특이적인 2 세대 (CD28 / CD3zeta) CAR- 형질도입 된 CB HSPC로부터)는 CD8beta를 발현하지 않았고 (도 56A), 이는 TCR- 형질도입 된 HSPC로부터 생성 된 인간 흉선 또는 ATO- 유래 T 세포 중 하나의 통상적인 T 세포와는 대조적이다. 그들은 또한 CD56 및 CD16을 포함하는 선천적인(innate-like) T 세포의 특징적인 마커를 나타낸다 (도 56B). 종합해보면, ATO 유래 CAR-T 세포는 인간 상피조직 내 림프구(Intraepithelial Lymphocyte, IEL)와 유사하다.
ATO에서의 IEL-유사 CAR-T 세포 분화는 아고니스트(agonist) 선택 (즉, CAR을 통한 강한 시그널링)에 의해 유도되는 것으로 가정되며, 이는 ATO에서 동종 항원과의 상호 작용 및 / 또는 CAR를 통한 강한 신호전달(tonic signaling)을 통해 일어난다. 초기 T 세포 분화 동안 (예를 들어, DN 단계에서) 강력한 시그널링은 발달중인 T 세포가 통상적인 T 세포 분화를 우회하여 IEL 유사 계통에 비 전형적인 분화를 유도하도록 한다(도 57).
ATO 유래 CAR-T 세포는 CAR로 형질도입 되었을 때 TCR을 발현 할 수 있다. ATO에서 배양된 CAR (CD19- 특이적 2 세대 (CD28 / CD3zeta) 및 / 또는 TCR (코돈 - 최적화 된 1G4 TCR))이 공동으로 형질도입 된 CB HSPC을 4주 동안 배양하여 CD3 및 형질도입 된 TCR (테트라머 염색으로 나타남)을 공동 발현하는 CAR + 세포 (GFP +)를 생성 하였다 (도 58). 이는 T 세포로서의 그들의 정체성과 일치한다(CD3 서브 유닛은 TCR 발현에 필요함). 주목할 것은, TCR의 형질도입이 ATO에서 CAR-T 세포의 비 전형적인 IEL- 유사 분화에 영향을 미치지 않는다는 것이다.
형질도입 된 TCR을 공동 발현하는 ATO 유래 CAR-T 세포는 CAR 및 TCR 항원 시그널링에 의해 활성화된다. CAR (CD19- 특이적인 2 세대 (CD28 / CD3zeta) 또는 CAR 및 TCR (코돈 - 최적화 된 1G4 TCR)로 공동 형질도입 된 CB HSPC로부터 생성된 ATO 유래 총 GFP + 세포는 6 주차 ATO에서 분리하였으며, CD19 (CAR 표적) 또는 HLA-A*02:01 / B2M / NYESO1157-165 (TCR 표적 물)의 단일 체인 트라이머(single chain trimer)로 형질도입 된 비특이적 K562 세포, K562 세포와 함께 6 시간 동안 공동 배양 하였다. T 세포 활성화는 인터페론 감마에 대한 세포 내 염색 및 CD107a에 대한 표면 염색에 의해 분석되었다. CAR + TCR 공동-형질도입 된 ATO로부터의 T 세포는 CAR 및 TCR 표적 세포 모두에 반응 하였다 (도 59).
ATO 유래 CD19 CAR-T 세포는 추가적인 활성화 / 보조 자극 없이 CD19 + 세포에 반응하여 기능적이다. CAR (CD19-특이적 2 세대 (CD28 / CD3zeta))로 형질 도입된 CB HSPC로부터 생성된 ATO 유래 총 GFP + 세포를 6 주차 ATO로부터 분리하고, 비특이적 K562 세포, CD5로 변환 된 K562 세포 (CAR 표적), CD19 + 백혈병 세포주 Nalm-6, 또는 CD19 + 림프종 세포주 Raji 와 공동 배양하였다. T 세포 활성화는 인터페론 감마, TNFa 및 IL-2에 대한 세포 내 염색 및 CD107a에 대한 표면 염색에 의해 분석되었다. ATO 유래 CAR-T 세포는 외인성 사이토카인(exogenous cytokines)을 첨가하지 않고 표적 세포에 반응하여 활성화시켰다 (도 60).
도 61은 ATO 유래 CD19 CAR-T 세포가 세포 독성임을 보여준다. CAR (CD19-특이적 2 세대 (CD28 / CD3zeta))로 형질도입 된 CB HSPC로부터 생성된 ATO 유래 총 GFP + 세포를 6 주째부터 분리 하였다. ATO를 비특이적 K562 세포 또는 CD19 + Nalm-6와 함께 9 시간 동안 항온 배양 하였다 (E : T) 비율에 따라 백혈병 세포주를 분석 하였다. 종양 세포주의 아폽토시스(apoptosis)를 annexin V / DAPI 염색으로 측정 하였다.
도 62에 도시된 바와 같이, ATO에서의 IEL-유사 분화 (즉, 아고니스트 선택)는 상이한 CAR 구조체에서 나타난다. CB HSPC 는 상이한 CAR 구조체로 형질도입 되었다: CD19 특이적 1 세대 (CD3zeta), 2 세대 (CD28 / CD3zeta 또는 4-1BB / CD3zeta); 또는 GD2 전용 2 세대 (CD28 / CD3zeta) CAR. ATO의 분화는 6 주차에 평가되었다 (형질도입 된 GFP + 세포에 대한 게이팅). 유사한 IEL-유사 T 세포 분화가 모든 CAR 구조체에서 나타났다.
실시예 8: ATO에서 CAR-형질도입 된 ES 세포로부터 CAR-T 세포로의 분화
인간 ES 세포에서 분화된 ATO 유래 CAR-T 세포는 PMA / 이오노 마이신에 반응하여 사이토카인을 생성한다. 5 주차 ATO의 H1 또는 H1-CAR 유래 CD45 + 세포를 PMA / 이오노마이신으로 6 시간 동안 처리하였다. 활성화는 인터페론 감마와 IL-2에 대한 세포 내 염색으로 보여줄 수 있다.
CD19 특이적인 2 세대 (CD26 / CD3zeta) CAR로 형질 감염된 H1 또는 H1 세포로부터의 T 세포 분화. H1-CAR 라인은 CAR 및 eGFP를 코딩하는 렌티 바이러스로 안정적으로 형질도입 되었다. H1 또는 H1-CAR 세포를 설명한 바와 같이 hEMP 단계로 분화시키고 hEMP를 MS5-hDLL1 세포와 응집시키고 전술 한 바와 같이 분화시켰다 (간단히, EGM2 배지 + TGF 베타 억제에서 1 주, 이어서 1 주 동안 SCF, FLT3L, TPO 및 IL-3를 첨가 한 후, ATF 배양을 위해 SCF, FLT3L 및 IL-3를 사용하여 RB27 에 대한 배지를 6 주 동안 추가로 교체하였다.) CD45 + 세포는 ATO 배양 조건의 개시 이후에 1~4주부터 나타난다. T 리니지 분화는 CD5와 CD7의 동시 발현에 의해 나타난다. CAR로 형질도입 된 인간 ES 세포는 ATO에서 CAR-T 세포를 생성 할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 63).
ATO 배양 조건의 개시 후 1 내지 4 주 후의 H1 또는 H1-CAR 유래 CD45 + 세포는 CB HSPC ATO 유래 CAR-T 세포와 유사하게 T 세포 성숙의 정상 마커가 부재함을 보여준다. DP 단계의 T 세포는 없으며, 대부분의 세포는 DN 단계이다.
H1 및 H1-CAR ATO의 CD4dim 세포는 미성숙 단일양성 CD4 (immature single positive CD4, ISP4) T 세포 전구체 일 가능성이 있다. 도 64에 도시된 바와 같이, 인간 ES 세포에서 유래된, ATO 유래 CAR-T 세포는 비 전형적인 T 세포 분화를 나타낸다. 도 65에 도시 된 바와 같이, 인간 ES 세포로부터의 ATO 유래 CAR-T 세포는 CD8beta 를 발현하지 않는다. ATO 배양조건 개시 후 1 내지 4 주 후의 H1 또는 H1-CAR 유래 CD45 + 세포는 CB HSPC ATO 유래 CAR-T 세포와 유사하게 CD8beta의 부재를 보여준다. 또한, 인간 ES 세포로부터의 ATO 유래 CAR-T 세포가 PMA / 이오노마이신에 반응하여 사이토카인을 생성한다는 것을 확인할 수 있었다(도 66A-B). 5 주차 ATO의 H1 또는 H1-CAR 유래 CD45 + 세포를 PMA / 이오노마이신으로 6 시간 동안 처리하였다. 활성화는 인터페론 감마 및 TNF 알파 (도 66A) 또는 인터페론 감마 및 IL-2 (도 66B)에 대한 세포 내 염색에 의해 나타내어진다. 마지막으로, 인간 ES 세포로부터의 ATO 유래 CAR-T 세포가 표적 세포에 반응하여 사이토카인을 생산하고 탈 과립화 하는 것을 확인하였다(도 67). 4주차 ATO로부터의 H1-CAR 유래의 총 GFP + 세포는 CD19-K562 세포, CD19 또는 CD19 + Nalm-6 또는 RAJI 세포주로 6 시간 동안 형질도입 된 K562 세포와 함께 배양되었다. CD107a에 대한 표면 염색 및 인터페론 감마에 대한 세포 내 염색으로 활성화를 측정 하였다. 분석을 위해 성숙한 표현형 (CD45RA +) CAR-T 세포가 게이트 되었다.
실시예 9: T 세포 분화를 위한 ATO 시스템의 장점
A. TCR로 말초 혈액 T 세포를 형질 전환시키는 표준면역요법에 비해 HSPC / ATO에서 TCR을 발현하는 것의 몇 가지 장점
PB T 세포는 특정 항 종양 TCR을 발현하도록 형질 전환 될 때 기존의 다양한 TCR 레퍼토리를 가지고 있다. 따라서 내인성 TCR 사슬과 형질 전환 TCR의 미스페어링(mispairing)은 자가 세포에서 발생할 수 있다: 이는 감소된 항 종양 특이성, 또는 새로운, 자동 반응성 미스페어링된 TCR(mis-paired TCRs)의 생성을 초래할 수 있다. ATO 유래의 TCR 조작된 T 세포에서 내인성 TCRβ 재배열의 대립유전자배제로 인해, 형질 전환된 TCR 사슬과 내인성 TCR 사슬 사이의 미스-페어링의 위험이 크게 감소되어야 한다.
상술한 바와 같이, ATO에서 조기 T 세포 분화 동안 TCR의 발현은 내인성 TCR β체인의 대립유전자배제를 초래한다 (Seet et al). 이 현상은 동종 HSPC를 사용하여 환자에게 반응하지 않을 T 세포를 생성하는 치료 가능성을 높인다. 반면PB의 동종 T 세포는 다양한 내인성 TCR 레퍼토리가 이식편대숙주 질환(Graft-versus-host disease, GvHD)의 위험을 가지고 있기 때문에 치료에 사용될 수 없다. ATO 시스템에서 유도된 대립유전자배제는 면역 요법을 위한 동종 기증자로부터의 기성 제품(off-the shelf product) 개발을 가능하게 할 수 있다.
B. CAR로 PBT 세포를 형질 전환시키는 표준면역요법에 비해 HSPC / ATO에서 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 것의 몇 가지 장점
CART 세포 치료를 위한 일반적인 접근법은 PB에서 CARs를 발현하는 것이다. 그렇게 생성된 세포는 또한 내인성 발현(endogenous expression)으로부터 다양한 TCR을 발현한다. 반면, HSPC의 CAR 형질 도입은 상피내 림프구 (intra-epthelial lymphocytes, IEL)와 유사한 CD3-TCR- 표현형을 가진 T 세포를 생산한다.
C. HSPC로부터 TCR 조작된 T 세포를 생성하기 위한 OP9-DL1에 대한 ATO의 이점
벨기에 Bart Vandekerckhove 그룹은 OP9-DL1을 이용하여 TCR로 형질 전환된 CD34+ 흉선 프로-T 세포 또는 CD34+ 말초 혈액 (MPB) HSPC로부터 미성숙 T 세포 전구체를 생성했다. 그러나 시스템에서 세포의 1 % 미만은 14 일 (흉선 pro-T) 또는 33 일 (MPB)에 성숙한 CD8+ T 세포였다. 대다수의 TCR-형질 도입세포는 T 세포 성숙을 돕기 위한 OP9-DL1의 빈약한 능력과 일치하여 DP 단계에서 정지되었다. 본 방법은 보다 성숙한 CD8+ T 세포를 생산한다.
D. 인간만능줄기세포(hPSC)에서 T 세포 분화를 위해 OP9-DL1보다 ATO를 사용하는 장점
OP9-DL1 (또는 Dll4)은 종래 hPSC (hESC 또는 hiPSC)로부터 T 세포 분화를 위한 유일한 시스템이었다. OP9-DL1에서 PSC의 세포 수율은 매우 낮고 T 세포 분화는 CB HSPC보다 훨씬 더 나쁘다. 반면, hPSC (hESC 또는 iPSC 모두)와의 T 세포 분화는 ATO 시스템에서 매우 효율적이다. 성숙한 순수 CD8 및 CD4 SP 세포는 CB HSPC보다 PSC에서 더 빨리 생산된다. hPSC에서 성숙한 T 세포를 생산할 수 있다는 것은 hPSC의 유전자 편집(gene editing)을 통해 면역 반응 유전자를 제거하거나 대체 할 수 있는 진정한 기성 제품의 보편적인 제품을 쉽게 만들 수 있음을 의미한다. PSC에서 유래한 단일 T 세포 제품을 여러 잠재적인 환자에게 제공하여 환자 맞춤형 제품을 만드는 데 필요한 시간과 비용의 제한을 극복 할 수 있다. 또한 화학 요법 후의 림프구감소증 환자(lymphopenic patients )에서 충분한 자가 T 세포를 채취하는 문제는 피할 수 있다.
E. ATO 시스템과 OP9-DLL1에서 제대혈로부터 분화된 T 세포의 비교
이전 사례는 CD34+ 제대혈 세포와 MS5 - hDLL1 스트로마를 사용하여 ATO 시스템과 시험관 내 인간 T 세포 분화를 위한 최신 프로토콜 사이의 차이점을 보여준다: OP9 - Dll1 시스템. OP9-DLL1에 대한 ATO 시스템의 우수성에 대한 추가 증거를 제공하기 위해, 3 가지 다른 제대혈 기증자 (E37, E43, E68)의 ATO가 생성되어 OP9-DLL1 스트로마의 분화와 비교되었다. 도 68은 4 주째 두 시스템 모두에서 CD34+ 및 T 세포 전구체가 유지되는 것을 보여준다(도 68). 두 시스템 모두 CD5와 CD7의 발현에 의해 T 세포 리니지에 세포가 투입되는 것을 허용한다. 그러나, ATO 시스템은 CD4CD8 이중양성(Double Positive, DP) 세포의 생성에서 매우 우수하다(도 69). 이미 4 주째에 ATO 시스템은 TCRab + CD3+ 세포의 강력한 개체군을 만들 수 있으며 그 중 일부는 이미 CD8SP 인 것과 대조적으로 OP9-hDLL1은 훨씬 비효율적이며 OP9-hDLL1 시스템에서 생산되는 생존 세포의 양은 치료적 및 상업적 생존력을 위한 충분한 T 세포의 생산을 허용하지 않는다(도 70). 도 70의 데이터의 수치 표현은, 도 71에 나타내었다.
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시물에 비추어 과도한 실험없이 행해질 수있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구체 예로 설명되었지만, 당업자는 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 본 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음을 알 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 동안 화학적으로 및 생리 학적으로 관련있는 특정 제제가 본원에 기재된 약제로 대체 될 수 있다는 것이 명백 할 것이다. 당업자에게 자명한 그러한 모든 균등물 및 변형물은 첨부된 청구 범위에 의해 정의된 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
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Claims (186)

  1. 줄기 또는 전구세포로부터 T 세포의 조성물을 제조하는 방법으로서,
    하기를 포함하는 3차원(3D) 세포 응집체를 배양하는 단계를 포함하고:
    (a) 노치 리간드(Notch ligand)를 발현시키는 스트로마 세포의 선택적 집단;
    (b) 줄기 또는 전구세포의 선택적 집단;
    상기 3D 세포 응집체는 인슐린, 바이오틴, 트랜스페린 및 알부민을 포함하는 무 혈청 배지에서 줄기 또는 전구세포를 T 세포로 시험관 내(in vitro) 분화시키기에 충분한 시간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 줄기 또는 전구세포로부터 T 세포 조성물의 제조 방법으로서,
    하기를 포함하는 3차원(3D) 세포 응집체를 배양하는 단계를 포함하고:
    (a) 노치 리간드(Notch ligand)를 발현시키는 스트로마 세포의 선택적 집단;
    (b) 줄기 또는 전구세포의 선택적 집단;
    상기 3D 세포 응집체는 인슐린을 포함하는 무 혈청 배지에서 줄기 또는 전구세포를 T 세포로 시험관 내(in vitro) 분화시키기에 충분한 시간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 노치 리간드는 외인성 노치 리간드인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 방법은 3D 세포 응집체가 형성되도록 줄기 또는 전구세포, 및 스트로마 세포를 원심분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 외부로부터 첨가되는 아스코르브산을 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 외부로부터 첨가되는 FLT3리간드(FLT3L), 인터루킨 7(IL-7), 줄기세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), IL-2, IL-4, IL-6, IL-15, IL-21, TNF-알파, TGF-베타, 인터페론-감마, 인터페론-람다, TSLP, 티모펜틴(thymopentin), 플레오트로핀(pleotrophin), 미드카인(midkine), 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제2항 내지 제6항에 있어서,
    상기 배지는 비타민을 추가로 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 비타민은 비오틴(biotin), DL-알파 토코페롤 아세테이트(DL alpha tocopherol acetate), DL-알파 토코페롤(DL alpha tocopherol), 비타민 A, 염화콜린(choline chloride), 판토텐산칼슘(calcium pantothenate), 판토텐산(pantothenic acid), 엽산(folic acid), 니코틴아미드(nicotinamide), 피리독신(pyridoxine), 리보플라빈(riboflavin), 티아민(thiamine), 이노시톨(inositol), 비타민 B12, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 염을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 비타민은 비오틴, DL-알파 토코페롤 아세테이트, DL-알파 토코페롤, 비타민 A 또는 이들의 조합, 또는 이들의 염을 포함하는 것인 방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 단백질을 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 단백질은 알부민 또는 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin), BSA의 분획, 카탈라아제, 인슐린, 트랜스페린, 슈퍼옥사이드 디스무타제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 코르티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민, 글루타티온, L-카르니틴, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 아셀렌산나트륨(sodium selenite), 또는 트리오도-I-티로닌(triodo-I-thyronine), 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 B-27® 보충제, 제노-프리 B-27® 보충제(xeno-free B-27® supplement), GS21TM 보충제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 아미노산, 단당류, 무기 이온을 포함하거나, 추가로 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 아미노산은 아르기닌, 시스틴, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 글루타민, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신, 또는 발린, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 무기 이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 질소, 또는 인, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 염을 포함하는 것인 방법.
  17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 몰리브덴, 바나듐, 철, 아연, 셀레늄, 구리, 또는 망간, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3D 세포 응집체는 정의된 외인성 세포외기질을 포함하는 것인 방법.
  19. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3D 세포 응집체는 외인성 기질 또는 스캐폴드를 포함하지 않는 것인 방법.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 노치 리간드를 암호화하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
  21. 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 노치 리간드는 DLL4, DLL1, JAG1, JAG2의 온전한 상태, 일부분, 또는 변형물, 또는 이들의 조합인 방법.
  22. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 배아줄기세포(ESCs), 유도 다능성 줄기세포(iPSC), 인간 배아 중배엽전구세포, 조혈모세포 또는 조혈전구세포, 골수에서 분리한 세포, 재대혈에서 분리한 세포, 말초혈액에서 분리한 세포, 흉선에서 분리한 세포, 또는 시험관 내(in vitro)에서 ESC 또는 iPC로부터 분화된 세포에서 선택되는 것인 방법.
  23. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포와 줄기 또는 전구세포의 비율은 1:5 내지 1:20인 방법.
  24. 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 쥐의 스트로마 세포주, 인간 스트로마 세포주, 1차 스트로마 세포의 선택된 집단, 시험관 내(in vitro)에서 다능성 줄기세포로부터 분화된 스트로마 세포의 선택된 집단, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  25. 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 시험관 내에서 조혈모세포 또는 조혈전구세포로부터 분화된 기질세포의 선택된 집단인 것인 방법.
  26. 제2항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 외인성 인간 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)를 발현시키는 것인 방법.
  27. 제2항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 외인성 항원-특이적 보조자극 분자(costimulatory molecule) 또는 사이토카인을 발현시키는 것인 방법.
  28. 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 외인성 항원을 발현시키는 것인 방법.
  29. 제2항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 사전에 동결되지 않은 것인 방법.
  30. 제2항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 전혀 동결된 적이 없는 것인 방법.
  31. 제2항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 외인성 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 또는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR), 또는 둘 다를 발현시키는 것인 방법.
  32. 제2항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 내인성 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 또는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR), 또는 둘 다를 발현시키는 것인 방법.
  33. 제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 외인성 불변 NKT세포(invariant natural killer T cell, iNKT)-관련 TCR을 발현시키는 것인 방법.
  34. 제2항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 외인성 항원-특이적 TCR, 선택 또는 스크리닝 마커, 생체 내(in vivo) 추적 마커 또는 생체 내 영상화 마커를 발현시키거나, HLA 위치(HLA loci), 자연살해세포 수용체 또는 리간드의 외인성 유전적 변형을 갖는 것인 방법.
  35. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포의 수는 1,000 내지 200,000개인 방법.
  36. 제2항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양은 2 내지 10주 동안 이루어지는 것인 방법.
  37. 제2항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양은 계대 배양을 포함하지 않는 것인 방법.
  38. 제2항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 상피내림프구(intraepithelial lymphocytes, IELs), 테트라머 또는 항-TCR 항체를 이용한 항원-특이적 T 세포, 변형된 항원을 이용한 CAR T 세포, 형광 마커를 이용한 형질도입된 T 세포, 또는 이들의 조합의 수를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  39. 제2항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 상피내림프구(intraepithelial lymphocytes, IELs), 테트라머 또는 항-TCR 항체를 이용한 항원-특이적 T 세포, 변형된 항원을 이용한 CAR T 세포, 형광 마커를 이용한 형질도입된 T 세포, 또는 이들의 조합을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  40. 제2항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 상피내림프구(intraepithelial lymphocytes, IELs), 테트라머 또는 항-TCR 항체를 이용한 항원-특이적 T 세포, 변형된 항원을 이용한 CAR T 세포, 형광 마커를 이용한 형질도입된 T 세포, 또는 이들의 조합의 수를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  41. 제2항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 3D 세포 응집체로부터 나온 T 세포를 필요한 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  42. 제2항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 3D 세포 응집체로부터 나온 T 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  43. 제2항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3D 세포 응집체로부터 나온 T 세포는 대립유전자형질배제(allelic exclusion)를 통해 내인성 TCR을 발현시키지 않는 것인 방법.
  44. 제2항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3D 세포 응집체로부터 나온 T 세포는 외인성 TCR 또는 CAR를 발현시키는 것인 방법.
  45. 제2항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시간 간격은 2 내지 16주인 방법.
  46. 제2항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 양성 선택을 받는 것인 방법.
  47. 제2항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 응집체는 종양 세포 또는 종양 항원을 추가로 포함하는 것인 방법.
  48. 제2항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 T 세포로부터 내생적으로 발현되는 TCR을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 방법은 T 세포를 프라이밍(priming)하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 T 세포는 항원 지시 세포로 프라이밍 되는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 항원 지시 세포는 종양 항원을 지시하는 것인 방법.
  52. 하기를 포함하는 세포 배양 조성물:
    (a) 하기를 포함하는 3차원(3D) 세포 응집체;
    i) 노치 리간드(Notch ligand)를 발현시키는 스트로마 세포의 선택적 집단;
    ii) 줄기 또는 전구세포의 선택적 집단; 및
    (b) 인슐린을 포함하는 무 혈청 배지.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 노치 리간드는 외인성 노치 리간드인 조성물.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    상기 배지는 외부로부터 첨가되는 아스코르브산을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 외부로부터 첨가되는 FLT3리간드(FLT3L), 인터루킨 7(IL-7), 줄기세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), IL-2, IL-4, IL-6, IL-15, IL-21, TNF-알파, TGF-베타, 인터페론-감마, 인터페론-람다, TSLP, 티모펜틴(thymopentin), 플레오트로핀(pleotrophin), 미드카인(midkine), 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 비타민을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 비타민은 비오틴(biotin), DL-알파 토코페롤 아세테이트(DL alpha tocopherol acetate), DL-알파 토코페롤(DL alpha tocopherol), 비타민 A, 염화콜린(choline chloride), 판토텐산칼슘(calcium pantothenate), 판토텐산(pantothenic acid), 엽산(folic acid), 니코틴아미드(nicotinamide), 피리독신(pyridoxine), 리보플라빈(riboflavin), 티아민(thiamine), 이노시톨(inositol), 비타민 B12, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 염을 포함하는 것인 조성물.
  58. 제56항에 있어서,
    상기 비타민은 비오틴, DL-알파 토코페롤 아세테이트, DL-알파 토코페롤, 비타민 A 또는 이들의 조합, 또는 이들의 염을 포함하는 것인 방법.
  59. 제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 단백질은 알부민 또는 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin), BSA의 분획, 카탈라아제, 인슐린, 트랜스페린, 슈퍼옥사이드 디스무타제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  61. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 코르티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민, 글루타티온, L-카르니틴, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 아셀렌산나트륨(sodium selenite), 또는 트리오도-I-티로닌(triodo-I-thyronine), 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  62. 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 B-27® 보충제, 제노-프리 B-27® 보충제(xeno-free B-27® supplement), GS21TM 보충제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  63. 제52항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 아미노산, 단당류, 또는 무기 이온, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 추가로 포함하는 것인 조성물.
  64. 제63항에 있어서,
    상기 아미노산은 아르기닌, 시스틴, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 글루타민, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신, 또는 발린, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  65. 제63항에 있어서,
    상기 무기 이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 질소, 또는 인, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 염을 포함하는 것인 조성물.
  66. 제52항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 몰리브덴, 바나듐, 철, 아연, 셀레늄, 구리, 또는 망간, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  67. 제52항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3D 세포 응집체는 정의된 외인성 세포외기질을 포함하는 것인 조성물.
  68. 제52항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3D 세포 응집체는 외인성 기질 또는 스캐폴드를 포함하지 않는 것인 조성물.
  69. 제52항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 노치 리간드를 암호화하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 조성물.
  70. 제52항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 노치 리간드는 DLL4, DLL1, JAG1, JAG2의 온전한 상태, 일부분, 또는 변형물, 또는 이들의 조합인 조성물.
  71. 제52항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 배아줄기세포(ESCs), 유도 다능성 줄기세포(iPSC), 인간 배아 중배엽전구세포, 조혈모세포 또는 조혈전구세포, 골수에서 분리한 세포, 재대혈에서 분리한 세포, 말초혈액에서 분리한 세포, 흉선에서 분리한 세포, 또는 시험관 내(in vitro)에서 ESC 또는 iPC로부터 분화된 세포에서 선택되는 것인 조성물.
  72. 제52항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포와 줄기 또는 전구세포의 비율은 1:5 내지 1:20인 조성물.
  73. 제52항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 쥐의 스트로마 세포주, 인간 스트로마 세포주, 1차 스트로마 세포의 선택된 집단, 시험관 내(in vitro)에서 다능성 줄기세포로부터 분화된 스트로마 세포의 선택된 집단, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  74. 제52항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 시험관 내에서 조혈모세포 또는 조혈전구세포로부터 분화된 기질세포의 선택된 집단인 것인 방법.
  75. 제52항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 사전에 동결되지 않은 것인 조성물.
  76. 제52항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 전혀 동결된 적이 없는 것인 조성물.
    59. 제52항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 외인성 인간 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)를 발현시키는 것인 조성물.
  77. 제52항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 외인성 항원-특이적 보조자극 분자(costimulatory molecule), 사이토카인, 항원, 또는 세포외 기질 단백질, 또는 T 세포의 분화, 증식 또는 기능을 조절하는 다른 생리활성 분자 또는 유전자를 발현시키는 것인 조성물.
  78. 제52항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 외인성 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 또는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR), 또는 둘 다를 발현시키는 것인 조성물.
  79. 제52항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 외인성 불변 NKT세포(invariant natural killer T cell, iNKT)-관련 TCR을 발현시키는 것인 방법.
  80. 제52항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 외인성 항원-특이적 TCR을 발현시키거나, T 세포의 분화, 증식 또는 기능을 조절하는 유전자의 외인성 유전적 변형을 갖는 것인 조성물.
  81. 제52항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포의 수는 1 내지 200,000개인 조성물.
  82. 제52항 내지 제81항 중 어느 한 항의 세포 배양 조성물을 배양하여 T 세포를 생산하는 단계를 포함하는 T 세포의 생산 방법.
  83. 제82항에 있어서,
    상기 방법은 항원-특이적 T 세포를 생산하는 방법으로 정의되며,
    상기 전구세포는 외인성 항원-특이적 TCR 또는 CAR를 발현시키는 것인 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서,
    상기 방법은 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 상피내림프구(intraepithelial lymphocytes, IELs), 테트라머 또는 항-TCR 항체를 이용한 항원-특이적 T 세포, 변형된 항원을 이용한 CAR T 세포, 형광 마커를 이용한 형질도입된 T 세포, 또는 이들의 조합의 수를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+ 세포, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 상피내림프구(intraepithelial lymphocytes, IELs), 테트라머 또는 항-TCR 항체를 이용한 항원-특이적 T 세포, 변형된 항원을 이용한 CAR T 세포, 형광 마커를 이용한 형질도입된 T 세포, 또는 이들의 조합의 수를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  86. 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하는 분리된 T 세포 또는 T 세포 집단으로서, 상기 T 세포는 상피내림프구 표현형을 갖는 분리된 T 세포 또는 T 세포 집단.
  87. 제87항에 있어서,
    상기 T 세포는 TCR-인 분리된 T 세포.
  88. 제86항에 있어서,
    상기 T 세포는 CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, 또는 이들의 조합인 분리된 T 세포.
  89. 제88항에 있어서,
    상기 T 세포는 CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-인 분리된 T 세포.
  90. 제89항에 있어서,
    상기 T 세포는 CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa인 분리된 T 세포.
  91. 제86항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR는 CD19 CAR를 포함하는 것인 분리된 T 세포.
  92. 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 외인성 TCR을 추가로 포함하는 것인 분리된 T 세포.
  93. 제92항에 있어서,
    상기 T 세포는 CD3+인 분리된 T 세포.
  94. 제86항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ 세포, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ cells, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CD1a+ cells, CD34+CD5+CD7+ 세포, CD34+CD5+CD7- 세포, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 항원-특이적 T 세포, 상피내림프구 T 세포, 또는 CD45+, CD11b+, CD11b-, CD15+, CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-, CD14+, CD14-, CD11a+, CD11a-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+, CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-, CD20+, CD20-, CD24+, CD24-, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+, CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-, CD38+, 또는 CD38- 또는 이들의 조합의 세포인 것인 분리된 T 세포 또는 T 세포 집단.
  95. 분리된 T 세포 또는 T 세포 집단으로서,
    상기 T 세포는 외인성 TCR 또는 CAR을 발현시키고, 상기 T 세포는 CD4+CD8- T 세포, CD4-CD8+ T 세포, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CD1a+ 세포, CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, 자연살해 T 세포, 조절 T 세포, 항원-특이적 T 세포, 상피내림프구 T 세포, CD45+, CD11b+, CD11b-, CD15+, CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-, CD14+, CD14-, CD11a+, CD11a-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+, CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-, CD20+, CD20-, CD24+, CD24-, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+, CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-, CD38+, 또는 CD38- 세포 또는 이들의 조합 세포인 분리된 T 세포 또는 T 세포 집단.
  96. 제86항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 T 세포 집단이고, 상기 T 세포 집단은 적어도 50%의 세포가 성숙한 순수 CD8 또는 CD4 단일 양성 세포인 T 세포.
  97. 제86항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 외인성 불변 NKT세포(invariant natural killer T cell, iNKT)-관련 TCR을 발현시키는 것인 T 세포.
  98. 제86항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 줄기 또는 전구세포로부터 시험관 내에서 분화된 것인 T 세포.
  99. 제98항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 배아줄기세포(ESCs), 유도 다능성 줄기세포(iPSC), 인간 배아 중배엽전구세포, 조혈모세포 또는 조혈전구세포, 골수에서 분리한 세포, 재대혈에서 분리한 세포, 말초혈액에서 분리한 세포, 흉선에서 분리한 세포, 또는 시험관 내(in vitro)에서 ESC 또는 iPC로부터 분화된 세포에서 선택되는 것인 T 세포.
  100. 제86항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내인성 TCR은 대립유전자형질배제(allelic exclusion)를 통해 억제된 것인 T 세포.
  101. 외인성 TCR을 포함하는 시험관 내에서 분화시킨 T 세포 또는 T 세포 전구체를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자의 치료 방법.
  102. 제101항에 있어서,
    상기 T 세포는 외인성 TCR 및 추가 항원 또는 리간드 인식 수용체를 포함하는 것인 방법.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 NKTs로부터의 TCR을 포함하는 것인 방법.
  104. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것인 방법.
  105. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것인 방법.
  106. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하고, 항원 인식 수용체는 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것인 방법.
  107. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하고, 항원 인식 수용체는 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것인 방법.
  108. 제102항에 있어서,
    상기 추가 항원 인식 수용체는 TCR 분자가 아닌 것인 방법.
  109. 제101항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 TCR 신호를 모방한 조작된 분자인 방법.
  110. 제102항 또는 제108항에 있어서,
    상기 추가 항원 인식 수용체는 키메릭 항원 수용체(CAR)인 방법.
  111. 제110항에 있어서,
    상기 CAR는 종양 항원-특이적 CAR인 방법.
  112. 제101항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 1차 항원에 특이적이고, 추가 항원 인식 수용체는 2차 항원에 특이적인 것인 방법.
  113. 제112항에 있어서,
    상기 1차 항원 및 2차 항원은 환자의 암 세포에 의해 발현되는 암 세포 항원인 것인 방법.
  114. 제101항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 바이러스-특이적 TCR, 제노-특이적 TCR, 암 세포-특이적 TCR, 박테리아-특이적 TCR, 또는 암-고환 항원-특이적 TCR인 방법.
  115. 제101항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 수혜자와 다른 개체로부터 얻은 것인(allogenic) 방법.
  116. 제101항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 암 환자인 방법.
  117. 제116항에 있어서,
    상기 방법은 암을 치료하는 방법인 것인 방법.
  118. 제101항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 전립선암, 난소암, 고환암, 뇌암, 피부암, 측색종, 대장암, 직장암, 위암, 식도암, 기관암, 두경부암, 췌장암, 간암, 유방암, 림프종 및 다발성 골수종을 포함하는 림프성 암, 백혈병, 뼈 또는 연조직의 육종, 자궁경부암 및 외음부 암으로부터 선택되는 것인 방법.
  119. 제101항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 항원의 투여 단계를 추가로 포함하며, 상기 항원은 외인성 TCR에 의해 인식되는 것인 방법.
  120. 제119항에 있어서,
    상기 항원은 정제된 것이거나, 다른 분자에 결합된 것이거나, 세포 또는 세포-유사 비히클에 의해 제시되는 것인 방법.
  121. 제101항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 비-동종반응성(non -alloreactive)인 것인 방법.
  122. 제101항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 비활성인 것인 방법.
  123. 구체적으로, 상기 CAR는 바이러스 항원-특이적 CAR 또는 박테리아 항원-특이적 CAR인 것이다.
  124. 제101항 내지 제115항 또는 제119항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 미생물 감염이 있거나, 감염 위험이 있는 것인 방법.
  125. 제124항에 있어서,
    상기 1차 및 2차 항원은 동일한 바이러스 형에 의해 발현되거나 또는 상기 바이러스 형에 감염된 세포에 의해 발현되는 바이러스 항원인 방법.
  126. 제124항에 있어서,
    상기 1차 및 2차 항원은 동일한 박테리아에 의해 발현되거나 또는 상기 박테리아에 감염된 세포에서 발현되는 박테리아 세포 항원인 방법.
  127. 제101항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 NY-ESO-1 특이적 TCR인 방법.
  128. 제101항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 항원 제시 세포를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  129. 제128항에 있어서,
    상기 항원 제시 세포는 수지상세포인 방법.
  130. 제128항에 있어서,
    상기 항원 제시 세포는 인공적인 항원 제시 세포인 방법.
  131. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 제시 세포는 외인성 TCR 또는 CAR에 의해 인식되는 항원으로 로딩되는 것인 방법.
  132. 제128항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 FOXP3의 발현을 추가로 포함하는 것인 방법.
  133. 제132항에 있어서,
    상기 T 세포는 FOXP3을 발현하기 위해 조작되었거나 선택된 것인 방법.
  134. 제133항에 있어서,
    상기 FOXP3 발현은 필수 구성요소인 방법.
  135. 제132항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 자가면역질환, 이식편대숙주병(graft versus host disease, GVHD), 또는 이식 거부 반응을 가지고 있거나, 가질 위험이 있는 것인 방법.
  136. 제135항에 있어서,
    상기 방법은 자가면역질환, GVHD, 또는 이식 거부 반응을 치료하기 위한 것인 방법.
  137. 외인성 TCR을 포함하는 시험관 내에서 분화된 T 세포 또는 T 세포 전구체.
  138. 제137항에 있어서,
    상기 TCR은 바이러스-특이적 TCR, 제노-특이적 TCR, 암 세포-특이적 TCR, 박테리아-특이적 TCR, 또는 암-고환 항원-특이적 TCR인 T 세포.
  139. 제137항 또는 제138항에 있어서,
    상기 T 세포는 추가 항원 인식 수용체를 추가로 포함하는 것인 T 세포.
  140. 제138항 또는 제139항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함하는 것인 T 세포.
  141. 제138항 또는 제139항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함하는 것인 T 세포.
  142. 제139항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하고, 항원 인식 수용체는 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것인 T 세포.
  143. 제139항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 TCR-감마 및 TCR-델타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하고, 항원 인식 수용체는 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것인 T 세포.
  144. 제139항에 있어서,
    상기 추가 항원 인식 수용체는 TCR 분자가 아닌 것인 T 세포.
  145. 제139항 또는 제144항에 있어서,
    상기 추가 항원 인식 수용체는 키메릭 항원 수용체(CAR)인 T 세포.
  146. 제145항에 있어서,
    상기 CAR는 종양 항원-특이적 CAR인 T 세포.
  147. 제145항에 있어서,
    상기 CAR는 바이러스 항원-특이적 CAR인 T 세포.
  148. 제138항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 1차 항원에 특이적이고, 추가 항원 인식 수용체는 2차 항원에 특이적인 것인 T 세포.
  149. 제148항에 있어서,
    상기 1차 및 2차 항원은 암의 세포에 의해 발현되는 암 세포 항원인 것인 T 세포.
  150. 제148항에 있어서,
    상기 1차 및 2차 항원은 바이러스 또는 상기 바이러스에 감염된 세포에 의해 발현되는 바이러스 항원인 것인 T 세포.
  151. 제148항에 있어서,
    상기 1차 및 2차 항원은 박테리아 또는 상기 박테리아에 감염된 세포에 의해 발현되는 박테리아 항원인 것인 T 세포.
  152. 제137항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 NY-ESO-1 특이적 TCR인 T 세포.
  153. 제137항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 FOXP3의 발현을 추가로 포함하는 것인 T 세포.
  154. 제153항에 있어서,
    상기 T 세포는 FOXP3를 발현시키기 위해 조작되었거나 선택된 것인 T 세포.
  155. 제154항에 있어서,
    상기 FOXP3 발현은 필수 구성요소인 T 세포.
  156. 외인성 TCR-발현 T 세포를 가진 환자에서 상기 외인성 TCR-발현 T 세포에 제제를 전달하는 방법으로서,
    상기 외인성 TCR에 의해 인식되는 항원에 접합된 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  157. 제156항에 있어서,
    상기 외인성 TCR은 비활성인 것인 방법.
  158. 제156항 또는 제157항에 있어서,
    상기 제제는 제거제인 방법.
  159. 제137항 내지 제155항 중 어느 한 항의 T 세포를 시험관 내에서(in vitro) 선택 및 분리하는 방법으로서,
    제제-TCR 발현 세포 복합체를 만들기 위해 외인성 TCR에 특이적으로 결합하는 제제를 T 세포를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계 및 상기 조성물로부터 상기 제제-TCR 발현 세포 복합체를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  160. 제159항에 있어서,
    상기 제제는 항체인 방법.
  161. 제159항에 있어서,
    상기 제제는 펩타이드-MHC 멀티머인 방법.
  162. 제159항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제는 고체 지지체에 고정되어 있는 것인 방법.
  163. 제159항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 제제에 특이적으로 결합하는 2차 분자를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  164. 제163항에 있어서,
    상기 2차 분자는 고체 지지체에 고정되어 있는 것인 방법.
  165. 제162항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 조성물로부터 상기 고체 지지체 및 결합된 분자를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  166. 제165항에 있어서,
    상기 방법은 상기 고체 지지체 및 관련 분자를 1회 이상 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  167. 제159항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제 또는 2차 분자는 형광 분자에 결합되어 있는 것인 방법.
  168. 제159항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제-TCR 발현 세포 복합체를 정제하는 단계는 유동세포계수법, FACS(fluorescence activated cell sorting), 비드 및/또는 컬럼을 포함하는 것인 방법.
  169. 제159항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제-TCR 발현 세포 복합체를 정제하는 단계는 다른 T 세포 마커 기반 정제를 포함하는 것인 방법.
  170. 제169항에 있어서,
    상기 다른 T 세포 마커는 CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CCR7/CD197, CD62L, CD27, CD28, 및 CD1a 중 하나 이상인 것인 방법.
  171. 제159항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 제제-TCR 발현 세포 복합체로부터 제제를 분리시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  172. 제159항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 정제된 TCR 발현 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  173. 제159항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 정제된 TCR 발현 세포를 동결시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  174. 하기 단계를 포함하는 제137항 내지 제155항 중 어느 한 항의 T 세포를 만드는 방법:
    (a) 외인성 TCR 또는 TCR-유도체를 줄기 또는 전구세포로 이동시키는 단계; 및
    (b) 상기 줄기 또는 전구세포를 T 세포 또는 T 세포 전구체로 분화시키는 단계.
  175. 제174항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포는 분화 제제와 접촉 이전, 동시에, 및/또는 접촉 후에, 동족체 MHC 및/또는 펩타이드 분자와 접촉시킨 것인 방법.
  176. 제174항 또는 제175항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구세포를 T 세포로 분화시키는 단계는 줄기 또는 전구세포를 노치 리간드를 발현시키는 스트로마 세포와 공동 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  177. 제176항에 있어서,
    상기 스트로마 세포는 OP9 세포, MS5, 또는 HS27 세포인 방법.
  178. 제176항 또는 177항에 있어서,
    상기 노치 리간드는 델타유사체 1(Delta-like 1, Dll1)인 방법.
  179. 제176항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 공동 배양한 줄기 또는 전구세포 및 스트로마 세포를 Flt-3 리간드 및/또는 IL-7에 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  180. 제174항 또는 175항에 있어서,
    상기 줄기 또는 면역 전구세포를 T 세포로 분화시키는 단계는 제2항 내지 제52항 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 것인 방법.
  181. 개체에서 T 세포의 수를 증가시키는 방법 또는 개체의 질병 또는 상태를 치료하는 방법으로서,
    상기 개체에 유효량의 T 세포 또는 항원-특이적 T 세포를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 T 세포는 제2항 내지 제52항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되었거나, 또는 제137항 내지 제155항 또는 제86항 내지 제100항 중 어느 한 항의 T 세포인 것인 방법.
  182. 제181항에 있어서,
    상기 개체는 자가면역 질환, 암, 감염, 면역 결핍, 또는 이들의 조합을 가지고 있거나, 가질 위험이 있는 것인 방법.
  183. 제181항 또는 제182항에 있어서,
    상기 T 세포는 조절 T 세포인 방법.
  184. 제183항에 있어서,
    상기 개체는 자가면역 질환을 가지고 있거나 가질 위험이 있는 것인 방법.
  185. 3차원(3D) 세포 응집체로부터 T 세포를 생산하기에 효과적인 농도로 무 혈청 배지에서 3차원(3D) 세포 응집체를 배양하는 단계를 포함하는 자가항원과 반응하지 않는 T 세포를 생산하는 방법으로서,
    상기 3D 세포 응집체는 하기를 포함하고:
    (a) 노치 리간드(Notch ligand)를 발현시키는 스트로마 세포의 선택적 집단; 및
    (b) 줄기 또는 전구세포의 선택적 집단;
    상기 (a) 또는 (b)의 하나 이상의 세포는 외인성 자가항원을 발현시키고, 상기 3D 세포 응집체는 자가항원과 반응하지 않는 T 세포를 생산하는 것인 방법.
  186. 제185항에 있어서,
    상기 (a) 또는 (b)의 하나 이상의 세포는 외인성 자가-MHC인 방법.
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