JP2012508561A - T細胞を産生するためのシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書で開示されるのは、幹細胞集団からT細胞を産生するためのシステム及び方法である。本明細書で特に例示されるのは、造血幹細胞の試料を用いて、CD4系列からCD4細胞及び/又はT細胞サブタイプを産生する培養系及び方法である。成人の造血前駆細胞/造血幹細胞(HPC)は、免疫細胞のすべての系列への前駆体である。この使い勝手が良い培養系を用いた、機能的なCD4 T細胞の生成における成功は限定的である。また、本明細書で開示されるのは、DL1、インターロイキン−7(IL−7)、及び、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3L)を発現する斬新な間質細胞株である。この改良された培養系は、遅いT細胞成長に関する研究を大幅に促進することができ、かつ、免疫療法の適用を可能にする。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
Description
政府支援のステートメント
本発明は、承認NIHグラントHL59412の下、政府支援でなされた。政府は、本発明に対して一定の権利を有している。
本発明は、承認NIHグラントHL59412の下、政府支援でなされた。政府は、本発明に対して一定の権利を有している。
本願は、2008年9月11日出願の米国仮特許出願第61/096,240号に対する35 USC 119に基づく優先権を主張するものである。
T細胞は、哺乳動物の免疫系の確立において重要な役割を果たす。この免疫系は、慢性感染症あるいは癌に苦しむ患者では、しばしば正常に機能しない(非特許文献1)。感染症及び癌の治療を目的としたT細胞の大量産生は、長年にわたって関心事項となっている。生体外で成長した抗原特異的リンパ球の自家移植は、健康でかつ機能的なT細胞のソース制限に挑戦される(非特許文献2)。同種異系の抗原特異的エフェクターT細胞の養子移植は、このような反応性のあるT細胞の可用性により制限され、そして、移植片対宿主病(GVHD)の問題に直面する(非特許文献3)。従って、生体外において、成人の骨髄(BM)由来のCD34造血前駆細胞/造血幹細胞(HPC)からの抗原特異的T細胞を大量に産生することにより、上述の制限を幾分克服することに役立ち得る。
胸腺器官培養及び上皮細胞の三次元のマトリクスのような、ヒトTリンパ球を産生するための従来から確立された生体外の培養系は、大きな労力を要し、かつ、操作するのが困難である(非特許文献4〜6)。これらの生体外の培養系は、マウス及びヒト起源の胚性幹細胞からの初期のT細胞分化を実証した(非特許文献7,8)。最近、より簡便なT細胞成長培養系が報告されている。すなわち、ノッチリガンドデルタ様1(OP9−DL1)を発現するために操作されたマウス胎児の間質細胞(ここで、分化途上の胸腺細胞に対して均一の二次元の環境を提供する)を使用するものである(非特許文献9)。OP9−DL1培養系は、マウス胎児の肝臓(非特許文献10)、成人の骨髄(BM)(非特許文献11,12)、並びに、ヒト臍帯血及び小児のBM(非特許文献13,14)から分離された前駆体の分化をサポートすることが報告されている。
OP9−DL1培養系を用いて、成人のヒトHPCからの十分に成熟したT細胞を生成することにおける成功は限定的である(非特許文献13,15)。レンチウイルスベクター(LV)で操作されたOP9−DL1(LmDL1)培養系を用いた場合に、成人のBMからのCD34 HPCは、胎児及び臍帯血起源のものより、より遅いT細胞の成長速度を示すことを、我々は最近示している(非特許文献16)。OP9−DL1培養系を用いて、臍帯血起源もしくは生後の胸腺のヒトHPCの中へ、レトロウイルスを媒介としてヒトCD8 T細胞受容体(TCR)を輸送することに関する原理を証明する研究が、実証された(非特許文献17,18)。患者の自身のHPCからヒト白血球抗原(HLA)に合ったT細胞を産生するための成人のT細胞成長系がなかった場合、後者のアプローチは、同種間移植の難問に直面する(非特許文献19)。
本発明は、従来から利用されている生体外の成人のヒトT細胞成長系の少なくとも3つの制約に取り組む。プレT細胞の限定的な増殖、ダブルポジティブ(DP)段階への非効率的な分化、並びに、正の選択及び系列決定の欠如である。本発明者らは、DL1、Flt3−L、及び/又は、IL−7を発現する、操作された間質細胞を用いて、改良されたシステムを開発した。これは、CD34 HPCからのプレT細胞増殖を高めることができる。注目すべきことに、本発明者らは、連続的なIL−7シグナル伝達が、未熟なシングルポジティブ(ISP)胸腺細胞からDP胸腺細胞へのさらなる分化を損ない、従って、成長途上のリンパ球を機能的に未熟な状態にすることを発見した。正の選択のプロセスは、IL−7受容体(IL−7R)及びTCRシグナルによって高度に調節される。興味深いことに、IL−7Rシグナルの除去とさらなるTCR結合により、CD4 T細胞への正の選択及び系列決定が、生体外で起こり得る。さらに、本発明者らは、これらのCD4 T細胞が機能的に成熟していることを本明細書で実証する。成人のヒトHPCからの機能的なCD4 T細胞の生成のための簡便な生体外の培養系の出現により、多くの橋渡しとなる免疫療法の戦略を可能とする。
図1 レンチウイルスベクターに変性されたマウス胎児の間質細胞株
(A)レンチウイルスベクター構成
(B)LmDL1細胞及びLmDLFL7細胞によるIL−7分泌のELISA分析
(C)マウスのデルタ様1(DL1)の表面発現のフローサイトメトリー分析
(D)レンチウイルスベクターで変性された間質細胞株LmDL1−FL及びLmDL1−FL7のFlt3L発現のフローサイトメトリー分析
図2 レンチウイルスベクターで変性されたLmDL1−FL7間質細胞は、初期のTリンパ球のさらなる増殖をサポートする。
(A)IL−7及びFlt3Lで補充したLmDL1上、あるいは、LmDL1−FL7上で培養された成人のBM CD34+ HPCのT細胞成長の動態 成長途上のHPCを、図のように異なる日に共培養からサンプリングし、anti−CD4及びanti−CD8抗体で染色して、フローサイトメトリーで分析した。
(B)IL−7及びFlt3Lで補充したLmDL1上、あるいは、LmDL1−FL7上で培養された成人のBM CD34+ HPCのCD3、及び、TCRαβ発現動態
(C)IL−7及びFlt3Lで補充したLmDL1上、あるいは、LmDL1−FL7上の分化途上のT細胞の増殖曲線
(D)42日目の共培養から2週間、anti−CD3/anti−CD28で刺激した後のT細胞成熟マーカー及び核のKi67のフローサイトメトリー分析 PBMC(未刺激)を対照として用いた。
図3 改良された生体外の培養系からの成熟したCD4(CD8ではない)T細胞の成長
(A)実験計画法 LmDL1−FL7の上で24日間培養し、その後、LmDL1−FL培養に移した成人のBM CD34+ HPCの成長曲線
(B)CD8、CD4、CD3、及び、TCRαβの発現動態のフローサイトメトリー分析
(C)成人のBM CD34+ HPCを、LmDL1−FL7の上で24日間培養し、その後、LmDL1−FL培養に移した。42日目に、これら細胞を刺激し、詳しい分析の前に14日間培養した。成熟マーカー及び核のKi67のフローサイトメトリー分析を行った。上記と同じ状態の下で刺激されたPBMCを対照として用いた。
図4 生体外由来のCD4 T細胞は、限定されたVβレパートリーでは機能的である。
(A)2週間刺激されたT細胞を、PMA及びイオノマイシンで5〜6時間再度刺激し、免疫のエフェクターであるサイトカイン及びタンパク質を検出する抗体で染色した。IL−7の除去の後、LmDL1−FL7/L−mDL1−FL共培養における、2人の独立したドナーからのBM CD34+ HPC由来のTリンパ球は、IFN−γ、IL−4、及び、IL−17を産生することができ、CD25を上方制御するのと同様に、FoxP3を発現した。通常のPBMC、及び、初代単細胞由来のCD4 T細胞クローンが、対照として含まれた。
(B)3人の異なる成人の骨髄CD34+ HPCドナーからの生体外由来のTリンパ球のVβレパートリーは、対照の成人のPBMCと比較して、狭く、かつ、偏っているようだった。
図S1〜3
(S3)フローサイトメトリーの分析は、(OP9FL7上で培養された42日目の)T細胞前駆体が、刺激されたPBMC対照と比較して、高レベルのHLAクラスI、及び、低レベルのHLA DR DQ DPを発現することを示す。
(S2)図S2は、TREC及びRAG2の分析結果である。
(S1)CD3ε分析は、CD8細胞が、対照と同様にT細胞レセプター複合体のCD3ε鎖を発現し、GATA3(CD4系列マーカー)のレベルを低下させ、かつ、分化の未熟な段階において停止を示唆するPU.1を発現することを示す。
成人の骨髄由来の造血幹細胞(HSC)は、機能的な免疫細胞のすべての系列への前駆体である。しかしながら、HSCから成熟したT細胞への十分な分化を導くのに必要な分子のシグナルは、はっきりしないままである。デルタ様1(OP9−DL1)を発現するよう操作されたマウス胚の間質細胞株は、初期のT細胞の分化をサポートするが、成人の骨髄由来のCD34+ HSCから始まるTリンパ球の十分な成熟をサポートしないことが報告されている。胸腺と無関係な成熟したCD4Tリンパ球の生成における成功は限定的である。一実施形態によれば、本発明は、成人のヒトCD34+ HSCから十分に成熟したCD4Tリンパ球への分化を生体外でサポートすることができる、ウイルスベクターで変性された培養系に関する。DL1、インターロイキン−7(IL−7)、及び、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FL)を発現する、操作された間質細胞株は、初期に分化したT細胞の増殖をサポートする。しかしながら、連続的なIL−7シグナル伝達は、未熟なシングルポジティブ(ISP)CD8の段階の間、分化停止へ導く。本発明者らは、IL−7受容体のシグナル伝達の一時的な停止、及び、CD3/CD28シグナルの経路の活性化を通じた併用法によって、この問題を解決した。この修正は、刺激の際にIFN−γ及びTNF−αを含むエフェクターサイトカインを産生することができる、成熟したCD4 T細胞の産生をもたらした。
一実施形態によれば、本発明は、成人のヒトCD34+ 造血幹細胞(HSC)から十分に成熟したCD4 Tリンパ球への分化を生体外でサポートすることができる培養系に関する。
より具体的な実施形態によれば、本発明は、IL−7の存在下でHSCを培養し、かつ、成長過程における時間の一定枠において、これらの細胞をIL−7にさらすことを停止することに関する。さらにより具体的な実施形態では、HSCは、14〜24日間の期間において、(通常はレンチウイルスのようなウイルスベクターでのトランスフェクションによって)IL−7、mDL1、及び、Flt3Lを発現するようなOP−9間質細胞などの細胞と共培養される。14〜30日の間は、これらのHSCは、もはやIL−7へさらされない。これらのHSCは、後にTCR刺激にさらされる。これらのHSCは、十分に成熟した機能的なCD4 T細胞へ成長する。
また、本開示の主題は、対象において抗腫瘍免疫反応を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のT細胞、及び、1又は複数の薬学的に許容できる担体又は添加剤を含む組成物を対象へ投与することを含む。いくつかの実施形態では、抗腫瘍免疫反応は、(a)対象において腫瘍の発生を妨げ、(b)対象において腫瘍の発生を遅らせ、(c)対象において腫瘍が成長する速度を減少させ、(d)対象において腫瘍の再発を妨げ、(e)対象において腫瘍の増殖を抑え、あるいは、(f)それらの組合わせが起こるのに十分である。いくつかの実施形態では、この抗腫瘍免疫反応は、腫瘍の細胞中、あるいは、細胞上に存在する抗原に対する細胞傷害性T細胞反応を含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性T細胞反応は、CD8+ T細胞によって媒介される。
本開示の組成物及び方法は、多成分の抗腫瘍、及び/又は、抗癌治療法の一部としても使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、放射線、化学療法、外科的切除、免疫療法、及び、それらの組合わせよりなる群から選ばれたさらなる抗癌治療を対象に提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、このさらなる抗癌治療は、投与するステップの前、同時的、後、あるいは、それらの組合わせ時に、対象に提供される。いくつかの実施形態では、このさらなる抗癌治療は、投与するステップ前に提供され、この組成物は、アジュバント療法として投与される。
本開示の組成物及び方法は、任意の腫瘍及び/又は任意の癌の予防並びに/又は治療のために使用することができる。いくつかの実施形態では、この癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、胆管癌、結腸直腸癌、胃肉腫、神経膠腫、肺癌、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、頭腫瘍、頸部腫瘤、及び、充実性腫瘍よりなる群から選ばれる。いくつかの実施形態では、癌は肺癌を含む。
本開示の組成物及び方法は、任意の対象における腫瘍及び/又は癌の予防並びに/又は治療のために使用することができる。いくつかの実施形態では、この対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、この哺乳動物はヒトである。
以下の用語は、この技術分野で通常の知識を有する者によってよく理解されると考えられるが、以下の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために明記される。
本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、以下で他に定義されない限り、この技術分野で通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有するように意図される。本明細書で使用された技術への言及は、これらの技術の変形、もしくは、この技術分野の知識を有する者にとって明らかであろう均等技術への置き換えを含め、この分野で一般的に理解されるような技術を指すように意図される。以下の用語は、この技術分野で通常の知識を有する者によってよく理解されると考えられるが、以下の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために明記される。
他に示されない限り、本明細書及びクレームにおいて用いられた、成分量、反応条件などを表わすすべての数は、「about(約)」の用語により、すべての場合において変形されることとして理解される。従って、特段の断りがない限り、本明細書及び添付されたクレームにおいて明記された数値パラメータは、本開示の主題が得ようと探究した所望の性質に依存して変化し得る近似値である。
長年の特許法の慣行に従えば、「a」、「an」、及び、「the」という用語は、クレームを含めて、本明細書で用いられるように1又は複数を指すことを意味する。例えば、「a cell」という表現は、1又は複数の細胞を指すことができる。さらに、本明細書で用いられるように、「another」という用語は、少なくとも第二又は複数を指すことができる。
重量、時間、投与量(例えば細胞の数)の量などのような測定可能な値に言及する場合、本明細書で用いられるような「about(約)」という用語は、具体的な量から、いくつかの実施形態では±20%、いくつかの実施形態では±10%、いくつかの実施形態では±5%、いくつかの実施形態では±1%、また、いくつかの実施形態では±0.1%の変動を包含することを意味し、このような変動は、本開示の方法を行うのに適切である。
本明細書で用いられるように、「comprising(備える)」(及び、「comprise」や「comprises」のようなcomprisingの任意の形)、「having(有する)」(及び、「have」や「has」のようなhavingの任意の形)、「including(含む)」(及び、「includes」や「include」のようなincludingの任意の形)、あるいは、「containing(包含する)」(及び、「contains」や「contain」のようなcontainingの任意の形)の単語は、包括的又は非限定的であり、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。
本明細書で用いられるように、「treatment effective amount(治療で有効な量)」「therapeutically effective amount(治療上有効な量)」、「treatment amount(治療量)」また、「effective amount(有効量)」という表現は、区別なく用いられ、測定可能な反応(例えば、治療されている対象において生物学的にあるいは臨床的に適切な反応)を起こすのに十分な組成物(例えば、薬学的に許容できる担体又は賦形剤中の複数のES細胞、及び/あるいは、他の多能性細胞)の量を指す。例えば、本開示の主題の組成物におけるCD4 T細胞の実際の投薬レベルは、特定の対象に対して所望の免疫反応を達成するように、十分な数のCD4 T細胞を投与するように変えることができる。選択された投薬レベルは、いくつかの因子(投与経路、他の薬又は治療との組み合わせ、治療されている症状の重症度、並びに、治療されている対象の症状及び先の病歴を含むが、これらに限定されない)に依存するだろう。
本明細書で用いられるように、IL−7という用語は、IL−7と少なくとも95、96、97、又は、98パーセントの同一性がある既知のIL−7分子あるいはポリペプチドを意味する。いくつかの異なる種のIL−7シーケンスは当業者に周知である。genbank accession番号の例は、AAI10554、BC110553、AAH47698、及び、BC047698を含む。パーセント同一性は、従来技術及びコンピュータプログラムに従って決定される。例えば、2つのシーケンス間のパーセント同一性は、デフォルトギャップウェイトを用いる、GAP又はBESTFIT(ペプチド)のプログラムによって、あるいは、BLASTX又はBLASTPのコンピュータアルゴリズムによって測定されたように、最適に配列された場合に、特定の同一性を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、同類アミノ酸置換によって異なる。例えば、電荷又は極性のような同様の化学的性質を有するアミノ酸の置換は、タンパク質の性質に作用しないだろう。非限定的な例は、アスパラギンに対するグルタミン、あるいは、アスパラギン酸に対するグルタミン酸を含む。
「癌」及び「腫瘍」という用語は、区別なく本明細書で用いられ、対象における任意の組織の初期の及び転移した充実性腫瘍並びに癌腫の両方を指すことができる。これらは、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢、胆管、小腸、腎臓と、膀胱と、尿路上皮とを含む尿路、頚部と、子宮と、卵巣とを含む女性生殖管(例えば、絨毛膜癌腫、及び、妊娠性絨毛性疾患)、前立腺と、精嚢と、精巣と、胚細胞腫瘍とを含む男性生殖管、甲状腺と、副腎と、脳下垂体とを含む内分泌腺、皮膚(例えば、血管腫及び黒色腫)又は骨か軟組織、血管(例えば、カポージ肉腫)、脳と神経と眼と髄膜(例えば、星状細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュヴァン鞘腫、及び、髄膜腫)を含むが、これらに限定されない。また、「癌」及び「腫瘍」という用語は、緑色腫、形質細胞腫、菌状息肉腫のプラーク及び腫瘍、皮膚T細胞リンパ腫/皮膚T細胞白血病を含む白血病、並びに、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の両方含むリンパ腫のような造血器悪性腫瘍から成長する充実性腫瘍を包含する。本明細書で用いられているように、「癌」及び「腫瘍」という用語は、個々の腫瘍細胞又は前腫瘍細胞と同様に、多細胞腫瘍を指すようにも意図される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、腺腫及び/又は腺癌であり、いくつかの実施形態では、肺腺腫及び/又は腺癌である。
本開示の主題の組成物は、いくつかの実施形態において、薬学的に許容できる担体を含む。対象への投与のために本開示の組成物を調合するため、任意の適切な配合物を用いることができる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容できる担体は、ヒトで用いるために薬学的に許容できる。
例えば、適切な配合物は、対象となるレシピエントの体液と等張の配合物の状態にする酸化防止剤と、緩衝剤と、静菌剤と、殺菌性抗生物質と、溶質とを含み得る水溶性及び非水性の滅菌の注射溶液、並びに、懸濁化剤と増粘剤を含み得る水溶性及び非水性の滅菌の懸濁液を含むことができる。これらの配合物は、単位投与容器又は多重投与量容器(例えば、密封したアンプル及びバイアル)で提供することができ、また、使用直前に、滅菌の液状キャリア(例えば、注射用の水)の追加を必要とするだけの、凍結もしくは凍結乾燥された(lyophilizedともいう)状態で保存することができる。いくつかの例示された成分は、SDS(いくつかの実施形態では、0.1〜10mg/mlの範囲、いくつかの実施形態では、約2.0mg/ml)、及び/又は、マンニトール又は別の糖質(いくつかの実施形態中では、10〜100mg/mlの範囲、いくつかの実施形態では、約30mg/ml)、及び/又は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)である。
問題となる配合物のタイプを考慮すれば、本開示の主題の配合物が、特に上記で言及された成分に加えて、この分野で通常の他の薬剤を含むことができることは理解されるべきである。これらの可能な配合物のうち、滅菌発熱性物質を除去された水溶性及び非水性の溶液を用いることができる。
本開示の主題の組成物は、対象における免疫反応を生成し高めると期待される任意の方法で、その必要のある対象へ投与することができる。本開示の主題の組成物の投与に適した方法は、静脈内(i.v.)、腹腔内(i.p.)、皮下(s.c.)、皮膚下(s.d.)、筋肉内(i.m.)、及び/又は、腫瘍内注射、並びに、吸入を含むが、これらに限定されない。
本開示の主題の方法は、その必要のある対象への本開示の主題の組成物を治療上有効な量で投与することを含む。本明細書の上記で定義されるように、「有効量」は、測定可能な反応(例えば、治療されている対象において高められた細胞崩壊、及び/又は、細胞傷害反応)を起こすのに十分な組成物の量である。
実施例1:単純化されたレンチウイルスベクターで変性された間質培養系における成人のヒトCD34+ 前駆体からの初期のTリンパ球のさらなる増殖
マウスのデルタ様1リガンド(DL1)を発現する、レンチウイルスベクターで変性されたマウス胎児の間質細胞株(LmDL1)が、臍帯血、胎児の胸腺、胎生の肝臓、及び、成人の骨髄からのヒトCD34+ HPCの初期のT細胞分化をサポートすることができることを我々は以前に報告している(非特許文献16)。外因的に加えられた増殖因子と無関係の安定したサイトカイン環境を有する培養系を開発するために、我々は、ヒトFlt3L、あるいは、Flt3L及びIL−7の両方を発現するレンチウイルスベクターを用いて、LmDL1細胞にさらに形質導入して、LmDL1−FL及びLmDL1−FL7細胞株をそれぞれ生成した(図1−A)。48時間の培養後、ELISAを介して、LmDL1−FL7によるIL−7の分泌を測定したところ、10〜14ng/mLの範囲となった(図1−B)。3つのレンチウイルスベクターで形質導入された細胞株すべて(LmDL1、LmDL1−FL、及び、LmDL1−FL7)の上における表面のDL1の発現は、フローサイトメトリーによって示されるようにOP9上の内因性のレベルよりかなり高かった(図1−C)。anti−Flt3L抗体を用いて、LmDL1−FL及びLmDL1−FL7細胞株におけるFlt3Lの表面の高い発現も示された(図1−D)。
マウスのデルタ様1リガンド(DL1)を発現する、レンチウイルスベクターで変性されたマウス胎児の間質細胞株(LmDL1)が、臍帯血、胎児の胸腺、胎生の肝臓、及び、成人の骨髄からのヒトCD34+ HPCの初期のT細胞分化をサポートすることができることを我々は以前に報告している(非特許文献16)。外因的に加えられた増殖因子と無関係の安定したサイトカイン環境を有する培養系を開発するために、我々は、ヒトFlt3L、あるいは、Flt3L及びIL−7の両方を発現するレンチウイルスベクターを用いて、LmDL1細胞にさらに形質導入して、LmDL1−FL及びLmDL1−FL7細胞株をそれぞれ生成した(図1−A)。48時間の培養後、ELISAを介して、LmDL1−FL7によるIL−7の分泌を測定したところ、10〜14ng/mLの範囲となった(図1−B)。3つのレンチウイルスベクターで形質導入された細胞株すべて(LmDL1、LmDL1−FL、及び、LmDL1−FL7)の上における表面のDL1の発現は、フローサイトメトリーによって示されるようにOP9上の内因性のレベルよりかなり高かった(図1−C)。anti−Flt3L抗体を用いて、LmDL1−FL及びLmDL1−FL7細胞株におけるFlt3Lの表面の高い発現も示された(図1−D)。
組換え型ヒトIL−7及びFlt3−Lで補充したLmDL1細胞上、あるいは、LmDL1−FL7細胞上で培養された、高度に精製された(>97%)成人のヒトCD34+ BM細胞を用いることで、いかなる増殖因子を用いることなく、T細胞成長を実証した(図2)。LmDL1−FL7培養は、わずかに高いレベルのCD8発現を有するLmDL1培養のものと同様のT細胞成長過程を示した(図2−A)。CD3及びTCRαβ発現もまた、これら2つの培養系間でわずかに異なった(図2−B)。どちらの系も、50〜60日の過程を通じて、成人のBM CD34+ 細胞からCD3−TCRαβ− SP CD8+ T細胞への成長をサポートした(図2)。しかしながら、我々は、LmDL1−FL7系を用いた場合に、LmDL1系と比較して、プレT細胞増殖が一貫して5倍増加することに注目した(図2−C)。従って、LmDL1−FL7細胞株は、T細胞の分化能を変えることなく、さらなるT細胞前駆体増殖をサポートした。
IL−7を発現させるために、アデノウイルス、レトロウイルス、又は、AAVウイルス、もしくは、裸のDNA(しかし、これらに制限されない)のような他の複数のウイルスベクター(しかし、これらに制限されない)のような、細胞を形質転換する他の方法を活用することができることを、当業者は理解するだろう。さらに、胎児の間質細胞以外の細胞タイプは、共培養する目的としてIL−7を発現させるために操作することができる。あるいは、培地へ手動で供給することにより、IL−7を標的細胞タイプへさらすことができる。
実施例2:LmDL1−FL7細胞株は、BM CD34 HPCから十分に成熟したT細胞の中への分化をサポートしない。
ダブルネガティブ(DN)段階からDP段階への分化途上のT細胞、並びに、CD4及びCD8系列の転換は、プレTCRシグナル伝達と同様にノッチシグナル伝達も必要とする(非特許文献22,23)。これらのDP T細胞は、生存のため、もっぱらTCR下流のシグナルに依存する。つまりこの段階では、これらは、サイトカインに誘導された生存シグナルに対して無反応になる(非特許文献24,25)。我々は、T細胞前駆体はCD3を発現するが、IL−7、Flt3L、及び、ノッチシグナル伝達の共培養において約40日後に死滅することに気づいた(図2−C)。これらの成長途上のT細胞が成熟したSP T細胞になることができるかどうか確かめるために、我々は、42日目においてanti−CD3/anti−CD28マイクロビーズを用いることにより、これらのT細胞にTCRシグナルを提供した(図2−D)。CD3/CD28刺激に続いて、これらの細胞は、その表面上に低レベルのCD8を発現した。成熟したT細胞は、CD3、TCRαβ、及び、共同刺激的な分子であるCD28を発現し、かつ、CD1a(非特許文献26)を欠くため、我々は、成長途上のCD8 SP細胞においてこれらのマーカーを検討した。抗体染色結果は、低レベルのCD3、CD28、検出できないTCRαβ、及び、際立った量のCD1aを示した(図2−D)。これは、これらのCD8 SP細胞が、十分に成熟していなかったことを示唆した。これらの培養細胞は、成熟の徴候を示さず、増殖抗原Ki67のための核染色によって示されるようにTCRシグナルに対して反応しない(図2−D)。共培養の50日目及び60日目から得られた細胞を刺激することでも、同様の結果が得られた(データは示さず)。簡潔に言えば、これらの結果は、LmDL1−FL7細胞で培養されたヒトBM HPCは、機能的なCD8又はCD4シングルポジティブT細胞を成長させないことを示す。
ダブルネガティブ(DN)段階からDP段階への分化途上のT細胞、並びに、CD4及びCD8系列の転換は、プレTCRシグナル伝達と同様にノッチシグナル伝達も必要とする(非特許文献22,23)。これらのDP T細胞は、生存のため、もっぱらTCR下流のシグナルに依存する。つまりこの段階では、これらは、サイトカインに誘導された生存シグナルに対して無反応になる(非特許文献24,25)。我々は、T細胞前駆体はCD3を発現するが、IL−7、Flt3L、及び、ノッチシグナル伝達の共培養において約40日後に死滅することに気づいた(図2−C)。これらの成長途上のT細胞が成熟したSP T細胞になることができるかどうか確かめるために、我々は、42日目においてanti−CD3/anti−CD28マイクロビーズを用いることにより、これらのT細胞にTCRシグナルを提供した(図2−D)。CD3/CD28刺激に続いて、これらの細胞は、その表面上に低レベルのCD8を発現した。成熟したT細胞は、CD3、TCRαβ、及び、共同刺激的な分子であるCD28を発現し、かつ、CD1a(非特許文献26)を欠くため、我々は、成長途上のCD8 SP細胞においてこれらのマーカーを検討した。抗体染色結果は、低レベルのCD3、CD28、検出できないTCRαβ、及び、際立った量のCD1aを示した(図2−D)。これは、これらのCD8 SP細胞が、十分に成熟していなかったことを示唆した。これらの培養細胞は、成熟の徴候を示さず、増殖抗原Ki67のための核染色によって示されるようにTCRシグナルに対して反応しない(図2−D)。共培養の50日目及び60日目から得られた細胞を刺激することでも、同様の結果が得られた(データは示さず)。簡潔に言えば、これらの結果は、LmDL1−FL7細胞で培養されたヒトBM HPCは、機能的なCD8又はCD4シングルポジティブT細胞を成長させないことを示す。
実施例3:IL−7除去後のプレT細胞からDP T細胞までのさらなる分化
上記の結果は、LmDL1−FL7培養系が、ISP T細胞からDP T細胞への分化、及び、T細胞の十分な成熟をサポートしないことを示した。この共培養では、わずかな割合のCD3+ T細胞だけが、低レベルのTCRαβを共発現した。これは、不適当なTCR転位又は処理を示唆した(図2−B)。IL−7受容体シグナル伝達の下向き調節は、これがCD4CD8 DP段階への成熟に必要な転写因子を阻害するため、マウスにおけるプレTリンパ球のさらなる分化に必要である(非特許文献27〜30)。このIL−7シグナル伝達が、DP T細胞においてブロックされているにもかかわらず、これらの細胞は、最小限のIL−7産生細胞を有する胸腺のコンパートメント中に存在する(非特許文献31)。我々はヒトにおけるDP段階への効率的なT細胞分化は、ISP細胞の発現後に、IL−7を除去することにより促進されるかもしれないと仮定した。これを試験するために、我々は、LmDL1−FL7中で成人のヒトBM CD34+ 細胞を24日間培養し、その後、IL−7なしのLmDL1−FLへこれらの細胞を移した(図3−A)。IL−7の除去後、我々は、30日目にDP段階への急速な転換を認めた(図2−A対図3−B)。この転換は、ドナーにより異なるが、何人かのドナーでは、これらの細胞は35日目にDPになった。DP細胞の発現に沿って、CD3及びTCRαβの多数の集団の共発現が検出された。これは、これらの細胞がIL−7の除去直後に正の選択を経たことを示唆した。興味深いことには、この経路に沿ったさらなる分化は、増殖停止及び細胞死に至った(図3−A)。
上記の結果は、LmDL1−FL7培養系が、ISP T細胞からDP T細胞への分化、及び、T細胞の十分な成熟をサポートしないことを示した。この共培養では、わずかな割合のCD3+ T細胞だけが、低レベルのTCRαβを共発現した。これは、不適当なTCR転位又は処理を示唆した(図2−B)。IL−7受容体シグナル伝達の下向き調節は、これがCD4CD8 DP段階への成熟に必要な転写因子を阻害するため、マウスにおけるプレTリンパ球のさらなる分化に必要である(非特許文献27〜30)。このIL−7シグナル伝達が、DP T細胞においてブロックされているにもかかわらず、これらの細胞は、最小限のIL−7産生細胞を有する胸腺のコンパートメント中に存在する(非特許文献31)。我々はヒトにおけるDP段階への効率的なT細胞分化は、ISP細胞の発現後に、IL−7を除去することにより促進されるかもしれないと仮定した。これを試験するために、我々は、LmDL1−FL7中で成人のヒトBM CD34+ 細胞を24日間培養し、その後、IL−7なしのLmDL1−FLへこれらの細胞を移した(図3−A)。IL−7の除去後、我々は、30日目にDP段階への急速な転換を認めた(図2−A対図3−B)。この転換は、ドナーにより異なるが、何人かのドナーでは、これらの細胞は35日目にDPになった。DP細胞の発現に沿って、CD3及びTCRαβの多数の集団の共発現が検出された。これは、これらの細胞がIL−7の除去直後に正の選択を経たことを示唆した。興味深いことには、この経路に沿ったさらなる分化は、増殖停止及び細胞死に至った(図3−A)。
実施例4:CD4 T細胞系列への決定は、IL−7を除去した分化途上のT細胞のTCR刺激で達成することができる。
T細胞系列決定は、サイトカイン及びコレセプターシグナルを必要とする(非特許文献24)。我々は、TCRシグナルを与える場合に、IL−7を除去したDP T細胞が系列決定を受けるだろうと仮定した。CD3及びTCRαβの共発現が、30〜42日目(ドナーにより異なる)の間で検出されたときに、anti−CD3/anti−CD28マイクロビーズでIL−7を除去したT細胞前駆体を刺激した。TCRシグナル伝達の後、Ki67核染色によって示されるように、これらのT細胞は増殖した(図3−C)。さらに、これらのT細胞は、CD3、CD28、及び、TCRαβを含むが、CD1aを含まない、T細胞分化及び成熟マーカーの検出によって示されるように、ISP段階以降に分化した(図3−C、同様に刺激されたPBMCとの比較)。従って、IL−7の継続した存在は、ISP段階以降のさらなるT細胞分化を妨げ、成長途上の成人のヒトT細胞の機能的な成熟を損なう。さらに、これらの生体外由来の成熟したT細胞は、ほとんどがCD4 T細胞だった。IL−7シグナルがCD8+ T細胞の成長に必要なため、IL−7の除去は、中間のCD4+ T細胞への細胞分化に偏り得る。長期に渡るTCRシグナル伝達(あるいは、より高い強度及び長い持続)がCD8+ SPへのコレセプター反転をブロックすることができるように、続くTCRシグナル伝達は、中間のCD4+CD8− 胸腺細胞からCD4+ T細胞への決定を促進することができた(非特許文献20,32)。
T細胞系列決定は、サイトカイン及びコレセプターシグナルを必要とする(非特許文献24)。我々は、TCRシグナルを与える場合に、IL−7を除去したDP T細胞が系列決定を受けるだろうと仮定した。CD3及びTCRαβの共発現が、30〜42日目(ドナーにより異なる)の間で検出されたときに、anti−CD3/anti−CD28マイクロビーズでIL−7を除去したT細胞前駆体を刺激した。TCRシグナル伝達の後、Ki67核染色によって示されるように、これらのT細胞は増殖した(図3−C)。さらに、これらのT細胞は、CD3、CD28、及び、TCRαβを含むが、CD1aを含まない、T細胞分化及び成熟マーカーの検出によって示されるように、ISP段階以降に分化した(図3−C、同様に刺激されたPBMCとの比較)。従って、IL−7の継続した存在は、ISP段階以降のさらなるT細胞分化を妨げ、成長途上の成人のヒトT細胞の機能的な成熟を損なう。さらに、これらの生体外由来の成熟したT細胞は、ほとんどがCD4 T細胞だった。IL−7シグナルがCD8+ T細胞の成長に必要なため、IL−7の除去は、中間のCD4+ T細胞への細胞分化に偏り得る。長期に渡るTCRシグナル伝達(あるいは、より高い強度及び長い持続)がCD8+ SPへのコレセプター反転をブロックすることができるように、続くTCRシグナル伝達は、中間のCD4+CD8− 胸腺細胞からCD4+ T細胞への決定を促進することができた(非特許文献20,32)。
実施例5:改良された生体外の培養系でのCD4 T細胞の機能的な成長
生体外由来のCD4+ T細胞がエフェクターT細胞の機能を示し得るかどうか調査するために、我々は、CD3/CD28で活性化された、42日目のT細胞をPMA及びイオノマイシンで処理した。6〜8時間の後、我々は、細胞内、及び、表面を染色することによって、エフェクターサイトカインであるIFN−γ、IL−17、及び、IL−4の分泌を分析し、さらに、制御T細胞に関連するCD25及びFoxP3発現を評価した。生体外由来のCD4+ Tリンパ球は、2人の異なるドナーから示されたように、IFN−γ、IL−17、及び、IL−4を分泌することができ、また、対照のPBMC由来CD4 T細胞、又は、精製された初期CD4 T細胞クローンに匹敵する、表面CD25、及び、低レベルの細胞内のFoxP3を発現した(図4−A)。これらの結果は、培養状態を極性化することがない場合でさえ、これらの細胞が、様々なCD4エフェクターT細胞のサブタイプに分化するように本質的にプログラムされていることを示唆する(非特許文献33)。
生体外由来のCD4+ T細胞がエフェクターT細胞の機能を示し得るかどうか調査するために、我々は、CD3/CD28で活性化された、42日目のT細胞をPMA及びイオノマイシンで処理した。6〜8時間の後、我々は、細胞内、及び、表面を染色することによって、エフェクターサイトカインであるIFN−γ、IL−17、及び、IL−4の分泌を分析し、さらに、制御T細胞に関連するCD25及びFoxP3発現を評価した。生体外由来のCD4+ Tリンパ球は、2人の異なるドナーから示されたように、IFN−γ、IL−17、及び、IL−4を分泌することができ、また、対照のPBMC由来CD4 T細胞、又は、精製された初期CD4 T細胞クローンに匹敵する、表面CD25、及び、低レベルの細胞内のFoxP3を発現した(図4−A)。これらの結果は、培養状態を極性化することがない場合でさえ、これらの細胞が、様々なCD4エフェクターT細胞のサブタイプに分化するように本質的にプログラムされていることを示唆する(非特許文献33)。
実施例6:生体外で生成したCD4 SP T細胞のVβレパートリーは、狭く、かつ、偏っている。
生体外由来のTリンパ球のTCRの多様性を評価するために、IOTest(登録商標) Beta Mark TCR Vβ レパトワキットを用いて、23のVβファミリーに対してVβレパートリー分析を行った。CD4+ SP T細胞へ成長した42日目のT細胞を、IOTest(登録商標)の抗体パネルで染色した。これらの生体外由来のCD4+ T細胞は、特定のVβファミリーに偏った狭いVβの使用を示した(図4−B)。例えば、ドナー1は、Vb5.1、Vb7.1、Vb13.1、及び、Vb18の中程度に偏った(>10%)使用を示した。ドナー2は、Vb2(15%)、及び、Vb5.2(29%)の偏った使用を示した。ドナー3は、Vb7.2(29%)、及び、Vb4(44%)の非常に偏った使用を示した。生体外由来のTリンパ球のVβレパートリーは、正常な成人のPBMCのものよりさらに制限されたように見えた。
生体外由来のTリンパ球のTCRの多様性を評価するために、IOTest(登録商標) Beta Mark TCR Vβ レパトワキットを用いて、23のVβファミリーに対してVβレパートリー分析を行った。CD4+ SP T細胞へ成長した42日目のT細胞を、IOTest(登録商標)の抗体パネルで染色した。これらの生体外由来のCD4+ T細胞は、特定のVβファミリーに偏った狭いVβの使用を示した(図4−B)。例えば、ドナー1は、Vb5.1、Vb7.1、Vb13.1、及び、Vb18の中程度に偏った(>10%)使用を示した。ドナー2は、Vb2(15%)、及び、Vb5.2(29%)の偏った使用を示した。ドナー3は、Vb7.2(29%)、及び、Vb4(44%)の非常に偏った使用を示した。生体外由来のTリンパ球のVβレパートリーは、正常な成人のPBMCのものよりさらに制限されたように見えた。
実施例1〜6に関する考察
述べられた理論、機序、又は、有意性に縛られるものではないが、本発明者らは、上記に明記された実施例1〜6によって達成された結果に関して、以下の考察を提供する。
OP9−DL1培養系は、臍帯血、及び、胎児の肝臓のHPCからの初期のT細胞の成長をサポートするが、成人のヒトHPCから成熟したT細胞を成長することは示されていない(非特許文献8〜10,13,34)。積み重ねられた研究は、OP9−DL1系がダブルポジティブ(DP)段階への初期のT細胞の分化をサポートすることを明らかにしたのみで、DP段階以降のこれらのT細胞の詳細な特徴づけ、及び、機能的な解析が不足している(非特許文献10,13)。OP9−DL1培養系は、ヒトT細胞成長研究を大幅に促進したが、成人のヒトのHPCから多数の成熟したT細胞を生体外で産生することは困難なままである(非特許文献35)。ここで、本発明者らは、間質培養系であるLmDL1−FL7の変更バージョンを報告する。これは、外因性のサイトカインの必要性がなく、成人のCD34+ HPCからの初期のT細胞のさらなる増加をサポートする。しかしながら、LmDL1−FL7細胞株単独では、成人のヒトCD34+ HPCからの十分なT細胞成長をサポートしない。もっと正確に言えば、分化途上のT細胞は、未熟なシングルポジティブ(ISP)CD8 T細胞段階で停止する。この問題は、図5にまとめられるように、DNからDP及びSP T細胞成長段階への間の共培養条件のさらなる修正によって解決される。
公表されたT細胞成長系はいずれも、成人のヒトCD34+ HPCから、十分に成熟したMHCクラスII拘束性CD4 SP T細胞を誘導することができない(非特許文献10,15,35〜38)。本明細書で記述された培養系は、成人のヒトCD34+ HPCからのCD4 T細胞の分化及び成熟を生体外でサポートすることができる。CD34+ HPCからCD4 T細胞への十分な分化は、IL−7を除去したDP T細胞のCD3/CD28刺激によって促された。活性化の際、これらの生体外で成長したCD4 T細胞は、IFN−γ、IL−7、IL−4を分泌し、かつ、成熟した機能的なT細胞の特徴であるCD25及びFoxP3を発現した。重要なことには、生体外で成長したT細胞の機能的な反応は、低形質のRag変異(これらは、DN3段階で停止して、異常に活性化され、かつ、CD3に無反応である)を担うマウス及びヒトにおいて特徴づけられた、制限を解除された異常CD4 T細胞のものとは異なる(非特許文献39〜41)。
マウスにおける従来の研究は、プロTリンパ球からDP Tリンパ球への効率的な分化を可能にするためには、DN3段階以降の成長途上のTリンパ球において、IL−7受容体のシグナル伝達の下向き調節が必要とされることを示唆した(非特許文献27,28,30,42,43)。LmDL1−FL7共培養において成人のHPCからのCD8+ ISP Tリンパ球の蓄積は、IL−7の連続的なシグナル伝達によるDP段階の前の分化障害を最も反映しやすい。というのは、これらの細胞が、T細胞分化の初期段階での転写因子PU.1の発現を保持するからである(図S1−A)。他のものは、IL−7は、生体外でのT細胞の生存及び増殖を助けるが、マウスにおけるT細胞成長の間、ISPのDP Tリンパ球へのさらなる進行を妨げることを示している(非特許文献27〜29,42,44)。IL−7Rシグナル伝達は、マウスにおけるISPからDPへの転換に必須の、転写因子−1(TCF−1)、リンパ系エンハンサー結合因子1(LEF1)、及び、オーファンホルモン受容体RORγtのような転写因子の発現を阻害することができる(非特許文献28)。我々の結果は、ヒトにおけるT細胞成長でのIL−7Rシグナル伝達の役割は、これがISPからDPへの転換に影響を及ぼすような、マウスにおけるのと同様であることを示す(非特許文献27〜29,42,44,45)。IL−7は、成長途上のT細胞からDP段階への転換を完全にはブロックしない、もっと正確に言えば、TCR刺激に対して反応することができないため機能的でない、うまく分化できないDP T細胞の状態にするようである。DP T細胞の機能的な成熟のIL−7の役割のより進んだ検討が必要である。
本明細書で記述された系の実施形態では、本発明者らは、CD8 T細胞を消費して成熟したCD4 T細胞を得ることができた。OP9間質細胞は、ヒト白血球抗原(HLA)クラスI及びクラスIIを発現しないが、DP T細胞を成熟するために、ヒト胸腺細胞が十分なクラスI及びクラスII HLAの接触を提供し、正の選択を誘発することができる可能性がある(図S1−B)(非特許文献46,47)。実際、ヒトDP T細胞におけるMHCクラスII分子の発現は、それ自身の正の選択に必須である(非特許文献48)。CD4 T細胞への系列決定は、シグナル伝達の動態モデルによって説明することができる。これは、正の選択であるTCRシグナルの後に持続性のTCR刺激を受けた場合に、DP T細胞がCD4 T細胞経路を採用することを提案する。TCRシグナルが停止すれば、DP細胞は、CD8 T細胞経路を採用する(非特許文献20,24)。本明細書で記述されたある系の実施形態において、本発明者らは、anti−CD3/anti−CD28抗体を介した長期に渡るTCRシグナルを用いて、IL−7を除去した分化途上のT細胞前駆体を提供する。これは、CD4系列選択を説明し得る。
実施例に1〜6関する材料及び方法
ヒトCD34+ 細胞及び細胞株
正常なドナーからの成人の骨髄又は動員末梢血のCD34+ 造血前駆体/幹細胞(HPC)、及び、臍帯血CD34+ 細胞は、AllCell Inc.(サンマテオ,カリフォルニア州,USA)、又は、Cambrex(ウォーカーズヴィル,メリーランド州)から購入した。マウス胎児の間質細胞(OP9)は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC,マナッサス,バージニア州)から購入した。操作されたLmDL1及びLmDL1−FL7細胞株は、マウスデルタ様1(DL1)、並びに、DL1及びヒトFlt3LにヒトIL−7をそれぞれ添加したものをコード化するレンチウイルスベクターを用いて、細胞に形質導入することにより生成した。20%のウシ胎仔血清(FBS,Invitrogen/Gibco BRL)、及び、1%のペニシリン−ストレプトマイシン(Mediatech Inc.,マナッサス,バージニア州)で補充したα−MEM(Invitrogen/Gibco BRL,グランドアイランド、ニューヨーク州)中で、これらの間質細胞を維持した。ヒトIL−7 ELISAキットを用いることにより、IL−7サイトカイン分泌を測定した。無細胞上清は、1mlの培地(Ray Biotech,Inc)を含む12ウェルプレート中で48時間(80−90%のコンフルエント)培養された、LmDL1及びLmDLFL7の細胞から得た。model 680 microplate reader(Bio−Rad)で、これらの試料を測定した。DL1及びFlt3Lの表面の発現を、メーカーの指示(Invitrogen)に従って、Alexa Fluor 647結合anti−DL1 Ab(Biolegend)、及び、zenon−alexa 488に結合した、精製anti−Flt3L Ab(Abcam Inc.,ケンブリッジ,マサチューセッツ州)を用いて、フローサイトメトリーによって分析した。
正常なドナーからの成人の骨髄又は動員末梢血のCD34+ 造血前駆体/幹細胞(HPC)、及び、臍帯血CD34+ 細胞は、AllCell Inc.(サンマテオ,カリフォルニア州,USA)、又は、Cambrex(ウォーカーズヴィル,メリーランド州)から購入した。マウス胎児の間質細胞(OP9)は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC,マナッサス,バージニア州)から購入した。操作されたLmDL1及びLmDL1−FL7細胞株は、マウスデルタ様1(DL1)、並びに、DL1及びヒトFlt3LにヒトIL−7をそれぞれ添加したものをコード化するレンチウイルスベクターを用いて、細胞に形質導入することにより生成した。20%のウシ胎仔血清(FBS,Invitrogen/Gibco BRL)、及び、1%のペニシリン−ストレプトマイシン(Mediatech Inc.,マナッサス,バージニア州)で補充したα−MEM(Invitrogen/Gibco BRL,グランドアイランド、ニューヨーク州)中で、これらの間質細胞を維持した。ヒトIL−7 ELISAキットを用いることにより、IL−7サイトカイン分泌を測定した。無細胞上清は、1mlの培地(Ray Biotech,Inc)を含む12ウェルプレート中で48時間(80−90%のコンフルエント)培養された、LmDL1及びLmDLFL7の細胞から得た。model 680 microplate reader(Bio−Rad)で、これらの試料を測定した。DL1及びFlt3Lの表面の発現を、メーカーの指示(Invitrogen)に従って、Alexa Fluor 647結合anti−DL1 Ab(Biolegend)、及び、zenon−alexa 488に結合した、精製anti−Flt3L Ab(Abcam Inc.,ケンブリッジ,マサチューセッツ州)を用いて、フローサイトメトリーによって分析した。
LmDL1間質細胞−CD34+ HPCの共培養
CD34+ HPCを、LmDL1又はLmDL1−FL7細胞のコンフルエントな単層を含む24ウェルプレートに1×105個/ウェルで播種した。これらの共培養を、示されるように、5ng/mlのIL−7(PeproTech,Inc.,ロッキーヒル,ニュージャージー州)、及び、5ng/mlのFlt3L(PeproTech,Inc.)で補充した、20%のFBS、及び、1%のペニシリン−ストレプトマイシンを用いたα−MEMから成る完全培地中で1日目から開始して維持した。2〜3日ごとに、これらの共培養に新しい培地を補充した。単層が分化し始めた時点で、あるいは、成長途上の細胞が、80〜90%のコンフルエントに達する時に、懸濁液中のこれらの細胞を、新たなコンフルエントな間質細胞の単層に移した。激しいピペット操作によってこれらの細胞を移した後、70μmのフィルタ(BD/Falcon,BD Biosciences,スパークス,メリーランド州)でろ過し、室温で10分間、250gで遠心分離した。これらの細胞ペレットを新鮮でコンフルエントな単層に移した。分析のためのT細胞成長の間の指示された時点で、これらの細胞を採取した。
CD34+ HPCを、LmDL1又はLmDL1−FL7細胞のコンフルエントな単層を含む24ウェルプレートに1×105個/ウェルで播種した。これらの共培養を、示されるように、5ng/mlのIL−7(PeproTech,Inc.,ロッキーヒル,ニュージャージー州)、及び、5ng/mlのFlt3L(PeproTech,Inc.)で補充した、20%のFBS、及び、1%のペニシリン−ストレプトマイシンを用いたα−MEMから成る完全培地中で1日目から開始して維持した。2〜3日ごとに、これらの共培養に新しい培地を補充した。単層が分化し始めた時点で、あるいは、成長途上の細胞が、80〜90%のコンフルエントに達する時に、懸濁液中のこれらの細胞を、新たなコンフルエントな間質細胞の単層に移した。激しいピペット操作によってこれらの細胞を移した後、70μmのフィルタ(BD/Falcon,BD Biosciences,スパークス,メリーランド州)でろ過し、室温で10分間、250gで遠心分離した。これらの細胞ペレットを新鮮でコンフルエントな単層に移した。分析のためのT細胞成長の間の指示された時点で、これらの細胞を採取した。
モノクローナル抗体及びフローサイトメトリー
CD4(クローンRPA−T4、PE、FITC、PE−Cy7、及び、パシフィックブルー)、CD8(クローンRPA−T8 PE、FITC、PE−Cy7、及び、パシフィックブルー)、CD3(クローンSK7、PE−Cy7)、TCRαβ(クローンT10B9.1A−31、FITC)を含む、表面染色のために使用された抗体は、BD biosciences(サンホセ,カリフォルニア州)から得られたものである。細胞を、2%のFBSを添加したPBSで最初に洗浄し、4℃で30分間、マウス及びヒト血清でブロックした。各抗体染色については、メーカーの指示により、抗体で細胞をインキュベートした。用いられた各蛍光色素で標識化されたAbについては、適切なアイソタイプコントロールが含まれていた。抗体染色の後、これらの細胞を2回洗浄し、2%のパラホルムアルデヒドで固定した。BD FACSAriaにおいて、BD FACS Diva software(バージョン5.0.1)を用いて、データを得て、Flowjo software(バージョン7.1.3.0,Tree Star,Inc.,パサデナ,テキサス州)を用いて分析した。
CD4(クローンRPA−T4、PE、FITC、PE−Cy7、及び、パシフィックブルー)、CD8(クローンRPA−T8 PE、FITC、PE−Cy7、及び、パシフィックブルー)、CD3(クローンSK7、PE−Cy7)、TCRαβ(クローンT10B9.1A−31、FITC)を含む、表面染色のために使用された抗体は、BD biosciences(サンホセ,カリフォルニア州)から得られたものである。細胞を、2%のFBSを添加したPBSで最初に洗浄し、4℃で30分間、マウス及びヒト血清でブロックした。各抗体染色については、メーカーの指示により、抗体で細胞をインキュベートした。用いられた各蛍光色素で標識化されたAbについては、適切なアイソタイプコントロールが含まれていた。抗体染色の後、これらの細胞を2回洗浄し、2%のパラホルムアルデヒドで固定した。BD FACSAriaにおいて、BD FACS Diva software(バージョン5.0.1)を用いて、データを得て、Flowjo software(バージョン7.1.3.0,Tree Star,Inc.,パサデナ,テキサス州)を用いて分析した。
anti−CD3/anti−CD28ビーズによるT細胞刺激
ナイーブT細胞を刺激するため、メーカーの指示によりanti−CD3/anti−CD28ビーズ(Dynal/Invitrogen,サンディエゴ,カリフォルニア州)を用いて、長期的な刺激のためのプロトコルに従った。これらの細胞及びビーズを混合し、X−vivo 20(BioWhittaker,Cambrex,ウォーカーズヴィル,メリーランド州)培地の中に37℃で2〜3日間、96ウェルプレートへ播種した。3日目に、12.5UのIL−2、5ng/mlのIL−7、及び、20ng/mlのIL15を添加し、さらに11〜12日間、細胞を培養した。上述のように、以下の抗体を用いて、表面染色を行った。CD4(クローンRPA−T4、PE、FITC、PE−Cy7、及び、パシフィックブルー)、CD8(クローンRPA−T8 PE、FITC、PE−Cy7、及び、パシフィックブルー)、CD3(クローンSK7、PE−Cy7)、TCRαβ(クローンT10B9.1A−31、FITC)、CD1a(クローンHI149、APC)は、BD biosciencesから得られたものである。CD28(クローンCD28.2、APC)は、eBioscience Inc.(サンディエゴ,カリフォルニア州)から得られたものである。細胞内染色は、BD biosciencesからの、anti−Ki67(クローンB56、FITC)及びアイソタイプIgG1κを用いて行った。細胞内染色は、anti−Ki67 FITC及びアイソタイプIgG1κ(BD Biosciences)を用いて行った。細胞内染色は、メーカーのプロトコルに従って、BD cytofix/cytopermキットを用いて行った。
ナイーブT細胞を刺激するため、メーカーの指示によりanti−CD3/anti−CD28ビーズ(Dynal/Invitrogen,サンディエゴ,カリフォルニア州)を用いて、長期的な刺激のためのプロトコルに従った。これらの細胞及びビーズを混合し、X−vivo 20(BioWhittaker,Cambrex,ウォーカーズヴィル,メリーランド州)培地の中に37℃で2〜3日間、96ウェルプレートへ播種した。3日目に、12.5UのIL−2、5ng/mlのIL−7、及び、20ng/mlのIL15を添加し、さらに11〜12日間、細胞を培養した。上述のように、以下の抗体を用いて、表面染色を行った。CD4(クローンRPA−T4、PE、FITC、PE−Cy7、及び、パシフィックブルー)、CD8(クローンRPA−T8 PE、FITC、PE−Cy7、及び、パシフィックブルー)、CD3(クローンSK7、PE−Cy7)、TCRαβ(クローンT10B9.1A−31、FITC)、CD1a(クローンHI149、APC)は、BD biosciencesから得られたものである。CD28(クローンCD28.2、APC)は、eBioscience Inc.(サンディエゴ,カリフォルニア州)から得られたものである。細胞内染色は、BD biosciencesからの、anti−Ki67(クローンB56、FITC)及びアイソタイプIgG1κを用いて行った。細胞内染色は、anti−Ki67 FITC及びアイソタイプIgG1κ(BD Biosciences)を用いて行った。細胞内染色は、メーカーのプロトコルに従って、BD cytofix/cytopermキットを用いて行った。
生体外で生成されたCD4+ T細胞のエフェクター機能分析
CD3/CD28で増殖させたCD4 T細胞を、PMA及びイオノマイシン(Sigma−Aldrich,セントルイス,ミズーリ州)で刺激し、IFN−γ、IL−4、及び、IL−17の放出を分析した。簡潔に言えば、これらの細胞を25ng/mlのPMA、及び、1μg/mlのイオノマイシンで1時間インキュベートした後、6μg/mlのモネンシン(Sigma−Aldrich)を添加して、ゴルジを介したサイトカイン分泌を阻害した。4〜5時間のインキュベートの後、これらの細胞を採取した。また、表面染色のための、CD4(クローンRPA−T4、パシフィックブルー)、CD8(クローンSK1、APC−Cy7)、CD3(クローンSK7、PE−Cy7)、CD25(クローンM−A251、PE)、及び、細胞内染色のための、IFN−γ(クローン25723.11、FITC)、IL−4(クローンMP425D2、APC)、FOXP3(クローンPCH101、Alexa647)は、BD Biosciencesから得られたものである。IL17(クローン64CAP17、PE)は、e−Biosciencesから得られたものである。BD FACSAriaを用いて、フローサイトメトリーによってデータを集め、Flowjoを用いて分析した。
CD3/CD28で増殖させたCD4 T細胞を、PMA及びイオノマイシン(Sigma−Aldrich,セントルイス,ミズーリ州)で刺激し、IFN−γ、IL−4、及び、IL−17の放出を分析した。簡潔に言えば、これらの細胞を25ng/mlのPMA、及び、1μg/mlのイオノマイシンで1時間インキュベートした後、6μg/mlのモネンシン(Sigma−Aldrich)を添加して、ゴルジを介したサイトカイン分泌を阻害した。4〜5時間のインキュベートの後、これらの細胞を採取した。また、表面染色のための、CD4(クローンRPA−T4、パシフィックブルー)、CD8(クローンSK1、APC−Cy7)、CD3(クローンSK7、PE−Cy7)、CD25(クローンM−A251、PE)、及び、細胞内染色のための、IFN−γ(クローン25723.11、FITC)、IL−4(クローンMP425D2、APC)、FOXP3(クローンPCH101、Alexa647)は、BD Biosciencesから得られたものである。IL17(クローン64CAP17、PE)は、e−Biosciencesから得られたものである。BD FACSAriaを用いて、フローサイトメトリーによってデータを集め、Flowjoを用いて分析した。
生体外由来のCD4+ T細胞のVβレパートリー分析
生体外で成長したTリンパ球のVβレパートリーは、IOTest(登録商標) Beta Mark TCR Vβ レパトワキット(Beckman Coulter,フラートン,カリフォルニア州)を用いて分析した。24のVβファミリーのための染色は、メーカーのプロトコルに従って行った。
生体外で成長したTリンパ球のVβレパートリーは、IOTest(登録商標) Beta Mark TCR Vβ レパトワキット(Beckman Coulter,フラートン,カリフォルニア州)を用いて分析した。24のVβファミリーのための染色は、メーカーのプロトコルに従って行った。
補足の図に関する材料と方法
抗体
用いられた抗体は、ClatagからのHLAクラスI(クローンTU149、PE)、及び、BD biosciencesからのHLA DR DQ DP(クローンTU39、FITC)であった。
用いられた抗体は、ClatagからのHLAクラスI(クローンTU149、PE)、及び、BD biosciencesからのHLA DR DQ DP(クローンTU39、FITC)であった。
RT−PCR
RNAは、TRI試薬(Sigma−Aldrich)用いて、CD8、CD4単細胞クローン、生体外で成長したDN+ CD8、生体外で成長したCD4 T細胞から採取した。Two−step AMV RT−PCRキット(Gene choice、メリーランド州)を用いることにより、1ugのRNAをcDNAへ逆転写した。以下のプライマーが、PCR反応ために用いられた。GAPDH−F−5’CCG ATG GCA AAT TCG ATG GC 3’、及び、R−5’ GAT GAC CCT TTT GGC TCC CC 3’、PU.1 F−5’ TGG AAG GGT TTC CCC TCG TC 3’、及び、R−5’ TGC TGT CCT TCA TGT CGC CG 3’、CD3e F−5’ TGA AGC ATC ATC AGT AGT CAC AC 3’、及び、R−5’ GGC CTC TGT CAA CAT TTA CC 3’、GATA−3 F−5’ GAC GAG AAA GAG TGC CTC AAG 3’、及び、R−5’ TCC AGA GTG TGG TTG TGG TG 3’である。30サイクルの増幅(95℃で30分間、55℃で30分間、及び、72℃で60分間)の後、PCR産物を2%のアガロース・ゲルで分離した。
RNAは、TRI試薬(Sigma−Aldrich)用いて、CD8、CD4単細胞クローン、生体外で成長したDN+ CD8、生体外で成長したCD4 T細胞から採取した。Two−step AMV RT−PCRキット(Gene choice、メリーランド州)を用いることにより、1ugのRNAをcDNAへ逆転写した。以下のプライマーが、PCR反応ために用いられた。GAPDH−F−5’CCG ATG GCA AAT TCG ATG GC 3’、及び、R−5’ GAT GAC CCT TTT GGC TCC CC 3’、PU.1 F−5’ TGG AAG GGT TTC CCC TCG TC 3’、及び、R−5’ TGC TGT CCT TCA TGT CGC CG 3’、CD3e F−5’ TGA AGC ATC ATC AGT AGT CAC AC 3’、及び、R−5’ GGC CTC TGT CAA CAT TTA CC 3’、GATA−3 F−5’ GAC GAG AAA GAG TGC CTC AAG 3’、及び、R−5’ TCC AGA GTG TGG TTG TGG TG 3’である。30サイクルの増幅(95℃で30分間、55℃で30分間、及び、72℃で60分間)の後、PCR産物を2%のアガロース・ゲルで分離した。
参照
関連する出願を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献の開示は、本明細書の教示と不一致とならない程度にそれらの全体において盛り込まれる。
以下のリストは、上述の参考文献、及び、追加の関連する参考文献の完全な引用を含む。
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上記の実施形態及び構成は、完全でも網羅的でもない。十分に理解されるように、本発明の他の実施形態は、上記に明記された、あるいは、下記に詳細に記述された1又は複数の特徴を、単独で、又は、組み合わせて活用可能である。さらに、本明細書で表され、記述されるように、本発明は、様々な実施形態において、構成成分、方法、プロセス、システム、及び/又は、装置を実質的に含み、それらの様々な実施形態、サブコンビネーション、サブセットを含む。当業者は、本開示を理解した後であれば、いかに本発明を製造し使用するかを理解するだろう。本発明は、様々な実施形態において、本明細書、又は、本明細書の様々な実施形態において、表されない、かつ/あるいは、記述されない事項を欠く場合(例えば、性能の改良のため、容易さを達成するため、かつ/あるいは、実施のコストを下げるために、既存の装置又はプロセスにおいて使用される可能性のあるような事項を欠く場合を含む)でも、装置及びプロセスを提供することを含む。
さらに、本発明の記述は、1又は複数の実施形態、並びに、一定の変形及び修正の記述を含むが、他の変形及び修正は、例えば、本開示を理解した後であれば、当業者の技術及び知識の範囲内にあるようなものであるならば、本発明の範囲内である。許容される程度において他の実施例を含む権利を得るよう意図される。すなわち、クレームされたものに対する、代替の、置換可能な、かつ/あるいは、均等な、構造、機能、範囲、又は、ステップを、このような、代替の、置換可能な、かつ/あるいは、均等な、構造、機能、範囲、又は、ステップが、本明細書で開示されているかを問わず、含む権利を得るよう意図されるが、いかなる特許性のある主題を公にささげる意図はない。
Claims (14)
- 造血幹細胞(HSC)から十分に成熟した機能的なCD4 T細胞を産生する方法であって、該方法は、前記HSCの成長を該機能的なCD4 T細胞に向かわせる培養条件の下、該HSCを培養することを備え、該培養条件は、
少なくとも2週間、IL−7の存在下、該HSCを培養し、かつ、
約2週間から約4週間までの間のある時点で、前記幹細胞をIL−7にさらすことを終了する、
ことを備えることを特徴とする造血幹細胞(HSC)から十分に成熟した機能的なCD4 T細胞を産生する方法。 - 前記方法は、約3週間から約4週間までの間のある時点で、前記幹細胞をIL−7にさらすことを終了することを備えることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、20日間から28日間までの間のある時点で、前記幹細胞をIL−7にさらすことを終了することを備えることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記培養することは、デルタ様1リガンド及びIL−7、並びに/又は、Flt3lを発現するよう操作された、変性された胎児の間質細胞で前記HSCを共培養する備えることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記変性された胎児の間質細胞は、哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記変性された胎児の間質細胞は、マウス、ラット、ウサギ、又は、モルモット起源であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記変性された胎児の間質細胞は、IL−7、又は、前記IL−7と少なくとも95パーセントの同一性を有するポリペプチド分子をコード化するポリヌクレオチドを備えるベクターでトランスフェクトされていることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記ベクターは、ウイルスベクターであることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記ベクターは、レンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 成人の骨髄、及び、薬学的に許容できる担体、賦形剤、又は、希釈剤から培養され、かつ、産生された機能的なCD4 T細胞を備える薬剤組成物。
- 治療上有効な量の請求項10に記載の組成物を、その必要のある患者に対して、投与することによって癌を治療する方法。
- 前記癌は、黒色腫又は白血病であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- デルタ様1リガンド及びIL−7、並びに/又は、Flt3lを発現するよう操作された、変性された胎児の間質細胞の単離細胞試料。
- 前記細胞は、マウス、ラット、ウサギ、又は、モルモットの細胞であることを特徴とする請求項13に記載の単離細胞試料。
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A02 | Decision of refusal |
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