ES2925261T3

ES2925261T3 - Expansión de células T gamma delta residentes en tejidos no hematopoyéticos y usos de estas células

Info

Publication number: ES2925261T3
Application number: ES16788539T
Authority: ES
Inventors: Adrian Hayday; Oliver Nussbaumer; Richard Woolf
Original assignee: Kings College London; Cancer Research Technology Ltd; Francis Crick Institute Ltd
Current assignee: Kings College London; Cancer Research Technology Ltd; Francis Crick Institute Ltd
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2036-10-31
Also published as: JP2024069306A; AU2016344779B2; RU2018119684A3; CA3003077A1; EP3368658A1; PT3368658T; JP2018533373A; WO2017072367A1; PH12018500926A1; US20180312808A1; IL258985B2; MX2018005207A; JP2022002517A; EP4148124A1; EP3368658B1; IL258985B; MX2022011003A; US20230099491A1; IL258985A; DK3368658T3

Abstract

Esta invención se refiere a la expansión in vitro de células T γδ residentes en tejido no hematopoyético mediante el cultivo de linfocitos obtenidos de tejido no hematopoyético de humanos o animales no humanos en presencia de interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina. -15 (IL-15) y ausencia de señales de activación o coestimulación del TCR, sin contacto directo con células estromales o epiteliales. Se proporcionan métodos de expansión de células T γδ residentes en tejidos no hematopoyéticos, así como poblaciones de células T γδ residentes en tejidos no hematopoyéticos y usos de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Expansión de células T gamma delta residentes en tejidos no hematopoyéticos y usos de estas células

La presente invención se refiere a un método para expandir células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos ex vivo. La expresión "células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos" se refiere a subconjuntos de linfocitos T que residen dentro de tejidos no hematopoyéticos, en lugar de órganos linfoides y sangre. Las células de este tipo incluyen células que no son V82, p. ej., células V81, V53 y V85. La invención también se refiere al uso de estas células en la terapia de células T adoptivas y en la terapia con receptores de antígenos quiméricos, así como su uso en un método de identificación selectiva para moduladores de puntos de control.

Antecedentes de la invención

El creciente interés en la inmunoterapia de células T para el cáncer se ha centrado en la capacidad evidente de subconjuntos de células T CD8+ (1-4) y CD4+ ap (5, 6) para reconocer células cancerosas y mediar en potenciales funcionales protectores del huésped, particularmente cuando son desreprimidos por el antagonismo clínicamente mediado de las vías inhibitorias ejercidas por PD1 (7, 8), CTLA4 (9, 10) y otros receptores (11). A pesar de ello, quedan muchas preguntas. Por ejemplo, parece haber muchos escenarios clínicos importantes en los que la eficacia de tales tratamientos parece deficiente (11); a menudo hay eventos adversos profundos (AEs, por sus siglas en inglés) (12); la capacidad de predecir bien la eficacia o bien los AEs es extremadamente limitada (13); y hay muy poca explicación de las interacciones que permiten que el huésped detecte las células tumorales (la denominada "inmunogenicidad") que necesariamente debe preceder a la activación de las respuestas de células T CD8+ y CD4+ ap específicas de antígeno convencionales.

A este respecto, muchos científicos y médicos están reevaluando el potencial de las células T ^y§, un tercer linaje de linfocitos con receptores generados somáticamente que se conservan tan fuertemente de manera evolutiva como las células T ap y las células B. Básicamente hay dos subgrupos de células T y§ humanas: uno que es dominante en la sangre periférica humana, que, en su mayoría, expresa un receptor de células T (TCR) V82; y otro que es dominante en tejidos no hematopoyéticos, la mayoría expresa un TCR V81, con poblaciones más pequeñas que expresan TCRs que contienen una cadena V53 o V85 o alguna otra cadena que no sea V82 (14).

En la mayoría de los adultos, las células V82 comprenden en estado estacionario solo un componente pequeño y altamente variable de las células T de la sangre (0,01-5 %), pero las células se expanden rápidamente, alcanzando transitoriamente hasta un -25 % de las células CD3+, tras la estimulación de un amplio espectro de agentes, incluyendo numerosas bacterias y parásitos (14). Una base importante para esta respuesta es el reconocimiento mediado por TCR V82 de "fosfofracciones" de bajo peso molecular, que incluyen pirofosfato de hidroxil-metil-but-2-enilo (HMBPP) (15), un intermediario en una vía microbiana crítica de síntesis de colesterol y otros lípidos que se usan para modificar proteínas, p. ej., mediante geranilación o farnesilación. En los primates, esta síntesis se produce a través de la vía del mevalonato, uno de cuyos intermedios, el isopentenil pirofosfato (IPP), se expresa a niveles muy altos en células infectadas y transformadas por virus, y también es una diana del reconocimiento mediado por TCR V82 (16).

Asimismo, la mayoría de las células T V82 expresan altos niveles del receptor de NKG2D que puede activar o coestimular (junto con el TCR) los potenciales citolíticos de las células tras acoplarse a los ligandos de NKG2D, p. ej., p. ej., MICA, MICB y ULBP. Estos ligandos son proteínas del huésped que se regulan positivamente cuando las células se exponen a agentes tales como el estrés oxidativo u osmótico o la luz ultravioleta. Estos agentes promueven la señalización hiperactiva de la vía del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que también está habitualmente desregulada en tumores sólidos humanos (17).

La capacidad de las células T V82 para detectar células transformadas usando sus TCRs y/o NKG2D (18-20), junto con sus potentes capacidades citolíticas y un potencial manifiesto para presentar antígenos a las células T CD8+ (21), han provocado conjuntamente la visión de que las células T V82 podrían ser explotadas clínicamente para administrar inmunoterapia contra el cáncer. Esto puede lograrse mediante la transferencia adoptiva de las células, aspecto sobre el cual el fallo de las células T y§ que van a ser restringidas por MHC limita de manera significativa y beneficiosa la posibilidad de enfermedad de injerto contra huésped (GvHD, por sus siglas en inglés) (22). Con el fin de lograr esto, las células T Vy9V52 y§ residentes en la sangre pueden expandirse ex vivo mediante la adición de citocinas tales como interleucina (IL)-2, junto con agentes activadores de TCR exógenos tales como fosfofracciones (p. ej., BrHPP), o junto con bisfosfonatos clínicamente aprobados (p. ej., ácido zoledrónico) que inhiben la farnesil pirofosfato sintasa en la vía del mevalonato, induciendo de este modo la acumulación del residuo activador de TCR, IPP. Sin embargo, la activación crónica de células Vy9V52 a través de agentes tales como BrHPP puede conducir progresivamente al agotamiento celular y a un potencial disminuido de citotoxicidad.

De manera alternativa, las propias células T y§ del paciente se pueden activar in situ usando bien formas farmacológicamente modificadas de HMBPP, o bien aminobifosfonatos clínicamente aprobados. Según estos enfoques, se han tratado más de 250 pacientes con cáncer, de manera aparentemente segura, pero con únicamente raras incidencias de remisión completa. Una preocupación importante respecto a la eficacia clínica limitada de las células es su tendencia a agotarse irremediablemente por la exposición crónica al antígeno. Una segunda preocupación importante es su aparente ineficacia en la migración dirigida de tumores sólidos y los tejidos que albergan esos tumores (23).

La terapia con células T con receptores de antígeno quimérico (CAR-T) está resultando ser muy prometedora en la clínica para las neoplasias malignas de células B. Sin embargo, con respecto al tratamiento de tumores sólidos, el rendimiento de las células CAR-T hasta la fecha ha estado por debajo de las expectativas que muestran una menor efectividad para inducir respuestas tumorales completas y altas tasas de incidencia de citotoxicidad no tumoral (24). En cuanto a las células T ^y§ de sangre periférica, un obstáculo importante para el éxito de los enfoques CAR-T para tumores sólidos es la probable ineficiencia de las células CAR-T sistémicas para migrar a los sitios de neoplasia maligna y residir allí en un estado funcionalmente eficaz (25). De forma adicional, basándose en células T ap convencionales, las células CAR-T tienen que superar señales inmunosupresoras en el microentorno tumoral, p. ej., las transmitidas a través del receptor PD1.

Puede haber ventajas asociadas con el uso de células T ^y§ para enfoques CAR-T, puesto que pueden transducirse con TCRs específicos de antígenos quiméricos reactivos con tumores, mientras se retiene su capacidad innata de reconocer células transformadas usando receptores tales como NKG2D. Por tanto, pueden influir simultáneamente sobre los efectos mediados por tumores adaptativos (TCR) e innatos (NKG2D). Sin embargo, queda pendiente la cuestión de la aparente ineficacia de las células T ^y§ de la sangre humana al migrar de forma dirigida a los tumores dentro de los tejidos sólidos y mantenerse allí en una forma activa. Esta consideración ha provocado una consideración más detallada de las células T ^y§ que normalmente residen en tejidos no hematopoyéticos.

Tales células T migran a tejidos no hematopoyéticos como parte de su desarrollo y, como tales, son distintas a las células T, p. ej., células T de memoria TCRap+ residentes en tejidos (denominadas células TRM) que se infiltran en el tejido después del cebado sistémico. Las células T ^y§ residentes en tejidos son las más estudiadas en ratones, donde se ha demostrado que son prevalentes en la piel, el intestino y los tejidos reproductivos, entre otros sitios. Se ha demostrado que muchas de estas células albergan potenciales funcionales de tipo innato por los que pueden responder a estímulos a través de la activación del receptor de NKG2D. Los inventores han obtenido recientemente datos que demuestran que la piel y el intestino humanos albergan asimismo grandes compartimentos de células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos con actividades de tipo innato. Y aún así, resulta significativo que el estudio de neoplasias malignas, inflamación, atopia, alergia y otras patologías que se forman dentro de tejidos no hematopoyéticos ha sido un rotundo fracaso en lo que respecta al impacto potencial de estas células T humanas de tipo innato que residen dentro de los tejidos en los que se producen las lesiones patológicas.

Las células T y§ humanas que residen dentro de tejidos no hematopoyéticos están mucho menos estudiadas debido a que su localización hace que las células sean más difíciles de muestrear, y debido a que no se han establecido medios para cultivarlas. De la información relativamente escasa disponible, este subtipo comprende una diversidad de células con potencial citolítico no restringido por MHC, que, debido a que no expresan TCRs que contienen Vy2, son completamente no reactivas con fosfofracciones de bajo peso molecular. Aunque se conocen pocas especificidades de TCR precisas para tales células, los datos disponibles sugieren que las células son reactivas a los autoantígenos, tales como el receptor de proteína C endotelial (EPCR), que está sobreexpresado por células infectadas por citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) y por muchos tumores sólidos (32). Las células T y§ asociadas a tejidos no hematopoyéticos también expresan habitualmente NKG2D (14). Dadas estas propiedades, y la residencia fisiológica de las células dentro de tejidos no hematopoyéticos, tales como la piel y el intestino, la transferencia adoptiva de tales células a pacientes con cáncer podría ser considerablemente más eficaz para dirigirse selectivamente a tumores sólidos y potencialmente a otras inmunopatologías.

Para explotar las células que no son V82 para la inmunoterapia se requiere bien un medio para expandir las células in situ o para recogerlas y expandirlas ex vivo antes de la reinfusión. Se ha adoptado el último enfoque debido a que no se conocen agentes activadores de TCR que tengan la capacidad comprobada de expandir in situ grandes cantidades de células que no son V82. Para superar el desafío de la disponibilidad limitada de tejidos no hematopoyéticos, algunos investigadores han intentado expandir una cantidad muy pequeña de células que no son V82 de la sangre en donde las células que expresan V82 son el subconjunto dominante, suponiendo que estas células son equivalentes a células que no son V82 residentes en tejidos. Las pequeñas cantidades de células T y§ que no son V82 encontradas en la sangre se expanden sustancialmente durante la infección activa por CMV, muestran una reactividad superior hacia el CMV en comparación con las células T V82, y parecen capaces de proteger al feto humano en casos de infección por CMV en el útero. De forma adicional, las células T ^y§ que no son V82 reactivas al CMV aparentemente protegen a los pacientes trasplantados de la reactivación del CMV durante la inmunosupresión, y mediante reactividad cruzada con las células transformadas, disminuyen el riesgo de neoplasias malignas secundarias (26). De manera similar, hay datos que sugieren que las células T y§ desempeñan papeles beneficiosos en el control de la infección por VIH, en cuyo caso las células T y§ que no son V82 se expanden en la sangre en relación con las células T VS2 (24).

Las células que no son V52 residentes en la sangre se han expandido ex vivo mediante la adición de agentes exógenos que activan directamente la señalización de TCR, p. ej., mediante el uso de un agente tal como un anticuerpo anti-CD3, anticuerpo específico de pan y§-TCR o fitohemaglutinina (PHA), o al cocultivar células T estimuladas que no son V52 con células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC, por sus siglas en inglés), en donde el contacto directo entre las células T ^y§ y la aAPC se requiere para la expansión de células T que no son V52 ex vivo (41-44). De manera alternativa, las células se han expandido al promover la señalización del receptor de NKG2D mediante el uso de MICA recombinante inmovilizada (un ligando de NKG2D), por ejemplo como se usó para mantener la proliferación de cultivos de células T ^y§ ex vivo a partir de linfocitos infiltrantes de cáncer epitelial (TlLs, por sus siglas en inglés) (28). En resumen, los métodos actuales de expansión ex vivo de células T ^y§ de sangre que expresan V52 o de células T ^y§ que no son V52 requieren la adición de agentes, promoviendo invariablemente la activación de los receptores TCR y/o NKG2D junto con citocinas complementarias, tales como interleucina-2 (IL-2) (41-44). Esta combinación de señales activadoras de receptores y citocinas refleja el enfoque estándar para cultivar y expandir las células T, ampliamente adoptado por la comunidad. Hasta la fecha, no se ha descrito ningún método para expandir sustancialmente las células T y6 residentes en tejidos no hematopoyéticos. Tal método se describe en este caso.

Sumario de la invención

Como parte de una caracterización fenotípica y funcional de células T de piel humana, los presentes inventores han aislado una población grande y diversa de células T y§ que normalmente residen dentro de tejidos no hematopoyéticos y con propiedades únicas relativas a las células T ap y a las células T ^y§ residentes en la sangre. Los inventores han descubierto que las células muestran respuestas fuertes, independientes del TCR, de tipo innato a los ligandos de NKG2D y a las citocinas. Mientras que los esfuerzos en la expansión de las células T ap primarias han empleado habitualmente el cocultivo con otras células de soporte como fuente de factores de crecimiento beneficiosos (29), los presentes inventores han demostrado de forma inesperada que las células T ^y§ que residen en la piel y otros tejidos no hematopoyéticos se suprimen profunda y específicamente cocultivando estas células en contacto con fibroblastos dérmicos autólogos y potencialmente otros componentes estromales, tales como queratinocitos y células endoteliales. El alivio de tales interacciones permite que las células se expandan rápidamente en grandes cantidades para posibles aplicaciones clínicas.

Adicionalmente, a diferencia de los esfuerzos hasta la fecha para expandir células T ^y§ derivadas de sangre y tumores, los presentes inventores han demostrado que tales células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos pueden expandirse sin la adición deliberada de cualquier agente exógeno que active sus vías de señalización de TCR o NKG2D.

En el presente documento se divulga un nuevo medio para aislar y expandir eficaz y reproduciblemente las células T Y5 de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos, tal como piel e intestino. La expansión se promueve al alterar el contacto de células T que no son V52 derivadas de tejidos no hematopoyéticos con fibroblastos autólogos y potencialmente otros componentes estromales, y se mantiene mediante cultivo en interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-15 (IL-15).

La expansión es altamente selectiva ya que la expansión de las células T ap o de las células T que expresan V52 o de las células NK no se induce por la alteración de sus contactos con fibroblastos autólogos (FIGS. 3A, 3C y 3D). Esta expansión de las células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos mediante la liberación de la modulación de puntos de control mediada por fibroblastos también condujo a la activación "espontánea" de los potenciales efectores de las células (FIGS. 5A y 5B), que son altamente deseables en el contexto de actividad antitumoral. Estos desarrollos permiten que las células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos se expandan en cultivo y se activen para su posible uso como infusiones de células "de forma inmediata" para los pacientes. Al mismo tiempo, el desarrollo de un anticuerpo u otra forma de inhibidor de la modulación de puntos de control de las células T ^y§ residentes en tejidos por los fibroblastos (u otras células estromales o epiteliales) debería permitir que las células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos se activen in situ, por ejemplo en un paciente con cáncer, a través del bloqueo de puntos de control.

La capacidad para obtener y cultivar células T ^y§ de tejidos no hematopoyéticos (p. ej., piel) ha identificado claras diferencias de las células T V81 derivadas de sangre. Por ejemplo, las células T V81 derivadas de la piel muestran marcadores de activación previa de células T, tales como expresión de CD69, positividad de ICOS y TlM3 así como una expresión escasa o nula de la molécula coestimuladora clásica, CD28 (FIG. 10A). Es más, muestran alta expresión de NKG2D. Por el contrario, las células T V81 derivadas de sangre humana no expresan CD69 o TIM3, expresan solo niveles inferiores de ICOS, y también son positivas hasta cierto grado para la expresión de CD28. Por otra parte, la expresión de NKG2D por células T V81 derivadas de sangre es mucho menor en comparación con su expresión por células T V81 derivadas de la piel, y mientras que las células T V81 derivadas de la piel muestran reactividad de tipo innato a ligandos de NKG2D tales como MICA recombinante en ausencia de estimulación del receptor de células T, las células T V81 derivadas de sangre no lo hacen (FIG. 10B). Las células T ^y§ de tejidos no hematopoyéticos como se describe en el presente documento también pueden presentar una expresión aumentada de CCR3, CD39, CD11b, IL-13 y/o CD9 en relación con las células T V81 derivadas de sangre y otras poblaciones de linfocitos.

En un primer aspecto, la invención proporciona un método para expandir células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos in vitro, comprendiendo el método cultivar linfocitos obtenidos a partir de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos en presencia de interleucina-15 (IL-15), en donde los linfocitos no están en contacto directo con células estromales o epiteliales durante el cultivo. Preferentemente, los linfocitos no están en contacto directo con los fibroblastos durante el cultivo.

Las células T y§ residen normalmente en tejido no hematopoyético in vivo.

Preferentemente, el método comprende cultivar los linfocitos obtenidos de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos en presencia de IL-2 e IL-15.

En algunas realizaciones, los linfocitos obtenidos de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos se pueden cultivar en ausencia de activadores o coestimuladores de TCR que inducen la activación de células T. Por ejemplo, los linfocitos se pueden cultivar en ausencia de agonistas de la vía de TCR, p. ej., activadores de CD3, tales como anticuerpos anti-CD3, en presencia o ausencia de activadores de CD28.

No se requiere la adición de tales activadores exógenos de la señalización de TCR para la expansión de las células T Y5 residentes en tejidos no hematopoyéticos usando los métodos de la invención. De esta manera, un medio de expansión de ^y§ adecuado para su uso en métodos de la invención puede estar desprovisto de actividad de activación de células T, por ejemplo, actividad de activación de células T ap o células T y§ de sangre, y puede no activar o coestimular TCRs.

Por ejemplo, el medio de expansión de y§ puede estar libre o sustancialmente libre de agentes o factores que activen la señalización de células T, tales como activadores o coestimuladores de TCR, que incluyen agonistas de la vía de TCR añadidos exógenamente. El medio de expansión de y§ comprende IL-15. En algunas realizaciones, el medio de expansión de ^y§ puede comprender uno o más factores de crecimiento adicionales, tales como citocinas, además de IL-15. Los factores de crecimiento adecuados no presentan actividad de activación de células T. En otras realizaciones, el medio de expansión de ^y§ puede estar desprovisto de factores de crecimiento distintos de IL-15; por ejemplo, el medio de expansión de ^y§ puede consistir en un medio basal complementado con IL-15.

En una realización, los linfocitos obtenidos de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos se pueden cultivar en ausencia de células estromales o epiteliales. Por ejemplo, las células estromales o epiteliales se pueden retirar antes del cultivo. Preferentemente, los linfocitos obtenidos de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos se pueden cultivar en ausencia de fibroblastos. Por ejemplo, los fibroblastos se pueden retirar antes del cultivo.

Los linfocitos se pueden obtener de cualquier tejido no hematopoyético de seres humano o de animales no humanos adecuado, tal como piel, el tracto gastrointestinal (p. ej., colon o íleon), tejido de glándula mamaria, pulmón, hígado, páncreas, tejido adiposo o próstata.

Las células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos son preferentemente células que no son V52, que expresan más habitualmente TCRs que contienen cadenas V51, es decir, células V51. Las células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos también pueden incluir las denominadas células T y§ doble negativas (DN), definidas como que expresan TCRs y§ que no contienen ni cadenas V51 ni V52.

En el presente documento se divulga la etapa de obtención de linfocitos a partir de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos. Por ejemplo, los linfocitos pueden obtenerse a partir de una muestra de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos. Un método puede comprender proporcionar una muestra de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humano y separar los linfocitos de las células no hematopoyéticas de dicha muestra para producir una población de linfocitos que esté sustancialmente libre de células estromales.

En el presente documento se divulga un método para expandir células T ^y§, incluyendo el método (i) proporcionar una población de células T y§ obtenidas de un tejido no hematopoyético; y (ii) cultivar las células T y§ sustancialmente libres de contacto de células estromales para producir una población expandida de células T y§.

La población de células T ^y§ obtenidas de tejidos no hematopoyéticos puede ser una población sustancialmente pura de células T y§.

La población de células T ^y§ obtenidas de tejido no hematopoyético son preferentemente células que no son V52, que expresan más habitualmente TCRs que contienen cadenas V51, es decir, células V51. La población de células T ^y§ también puede comprender células T y§ DN.

La población de células T ^y§ obtenidas de tejido no hematopoyético puede expresar uno o más marcadores de células T y6 residentes en tejidos adicionales, tales como CLA, IL13, CCL1, CD103 y CCR8.

La población de células T y§ obtenidas de tejido no hematopoyético puede comprender células T V51 CCR8+ y§.

Las células T ^y§ se pueden cultivar en ausencia de contacto con células estromales para producir la población expandida de células T ^y§ (es decir, no hay contacto entre las células T ^y§ y las células estromales en el cultivo celular).

Las células T y§ se pueden cultivar en ausencia de señales de activación o de señales coestimuladoras de TCR. La etapa de cultivo se puede realizar en medio acondicionado con células estromales, o en presencia de IL-15. Por ejemplo, las células T y§ se pueden cultivar en un medio de expansión de y§ que comprende IL-2 e IL-15. Un medio de expansión de ^y§ adecuado puede no activar o coestimular TCRs. Por ejemplo, el medio de expansión de ^y§ puede estar libre o sustancialmente libre de agentes o factores que activen la señalización de células T, tales como activadores o coestimuladores de TCR, que incluyen agonistas de la vía de TCR. El medio de expansión de y§ puede comprender IL-2 e IL-15. En algunas realizaciones, el medio de expansión de y§ puede comprender uno o más factores de crecimiento adicionales, tales como citocinas, además de IL-2 e IL-15. Los factores de crecimiento adecuados no presentan actividad de activación de células T. En otras realizaciones, el medio de expansión de ^y§ puede estar desprovisto de factores de crecimiento distintos de IL-2 e IL-15; por ejemplo, el medio de expansión de ^y§ puede consistir en un medio basal complementado con IL-2 e IL-15.

En el presente documento se divulga un método para expandir células T ^y§ que incluye: (i) proporcionar un tejido no hematopoyético, comprendiendo el tejido células no hematopoyéticas y células T y§; (ii) separar las células T y§ de las células no hematopoyéticas para producir una población que incluya células T ^y§ que esté sustancialmente libre de células estromales; y (iii) cultivar la población de la etapa (ii) en ausencia de señales de activación o de señales coestimuladoras de TCR para producir una población expandida de células T y§.

Las células T y§ pueden, por ejemplo, separarse de las células T ap.

La población de la etapa (ii) puede ser una población sustancialmente pura de células T y§.

Las células T y§ en la población de la etapa (ii) pueden comprender células T y§ que no son V82, que expresan más habitualmente TCRs que contienen cadenas V81, es decir, células T y§ V81. Las células T y§ en la población de la etapa (ii) también pueden comprender células T ^y§ DN.

Las células T ^y§ en la población de la etapa (ii) también pueden comprender células T ^y§ que expresan uno o más marcadores de células T ^y§ residentes en tejidos adicionales, tales como CLA. CD103 y CCR8. Las células T ^y§ en la población de la etapa (li) pueden comprender células T y§ CCR8+ V81 .

El cultivo de la etapa (iii) puede estar sustancialmente libre de contacto de células estromales con la población de la etapa (ii) y/o en ausencia de señales de activación o de señales coestimuladoras de TCR. Por ejemplo, el cultivo puede realizarse sin contacto entre células T ^y§ y células estromales.

El cultivo de la etapa (iii) puede ser un medio acondicionado con células estromales o en presencia de IL-2, IL-15 o una combinación de las mismas.

Las células T y§ se pueden cultivar en un medio de expansión de y§ que comprende IL-2 y/o IL-15. Un medio de expansión de ^y§ adecuado puede no activar o coestimular TCRs. Por ejemplo, el medio de expansión de ^y§ puede estar libre o sustancialmente libre de agentes o factores que activen la señalización de células T.

Los activadores o coestimuladores del TCR, por ejemplo, tales como los agonistas de la vía del TCR. El medio de expansión de ^y§ puede comprender uno o más factores de crecimiento adicionales, tales como citocinas, además de IL-2 y/u IL-15. Los factores de crecimiento adecuados no presentan actividad de activación de células T. El medio de expansión de y§ puede consistir en un medio basal complementado con IL-2 y/u IL-15.

Una población expandida de células T ^y§ de acuerdo con el segundo o tercer aspecto puede comprender al menos 5 veces, al menos 1o veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 4o veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces o al menos 10.000 veces más células T y§ que las células T ^y§ obtenidas de tejido no hematopoyético o separadas de células no hematopoyéticas. La población expandida se puede generar en un plazo de 3 días, 5 días, 7 días, 10 días, 14 días, 21 días o 28 días de cultivo. Las células T y§ en la población expandida son preferentemente células T V82'. La población expandida de células T Y& puede comprender al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de las células V81+. La población expandida de células T ^y§ puede ser de al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % positiva para uno, dos o los tres de CCR4, CCR8 y CD103. Por ejemplo, la población expandida puede ser al menos un 10 % positiva para CD103, al menos un 30 % positiva para c CR4 y al menos un 60 % positiva para CCR8.

En el presente documento se divulga una célula T y§ residente en tejidos no hematopoyéticos o una población divulgada anteriormente de la misma obtenida mediante un método divulgado anteriormente.

En el presente documento se divulga un método de identificación selectiva de un modulador de puntos de control de células T ^y6 residentes en tejidos no hematopoyéticos, comprendiendo el método:

(i) cultivar células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos in vitro en contacto directo con células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo o cultivar células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos in vitro en contacto directo con las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) en las que se altera la expresión de un gen de ensayo dentro de las células T ^y§ y/o en las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos); y

(ii) determinar la tasa de proliferación o activación de las células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos en presencia y ausencia del compuesto de ensayo o en presencia y ausencia de alteración de la expresión del gen de ensayo en las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T ^y§, o determinar la tasa de destrucción de células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) en presencia y ausencia del compuesto de ensayo o en presencia y ausencia de alteración de la expresión del gen de ensayo en células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T ^y§,

en donde si la tasa de proliferación o activación de las células T es superior en presencia del compuesto de ensayo que en ausencia del compuesto de ensayo o superior en presencia de alteración de la expresión del gen de ensayo en células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T ^y§ que en ausencia de alteración del gen de ensayo en células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T ^y§ y/o si la tasa de destrucción de células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) es superior en presencia del compuesto de ensayo que en ausencia del compuesto de ensayo o superior en presencia de alteración de la expresión del gen de ensayo en células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T ^y§ que en ausencia de alteración del gen de ensayo en fibroblastos y/o células T y6, entonces es probable el compuesto de ensayo sea un modulador de puntos de control o es probable que el gen de ensayo sea un gen de puntos de control candidato o un regulador del mismo.

La expresión de un gen de ensayo dentro de las células T y§ y/o en las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) puede, por ejemplo, ser alterada por un agente de direccionamiento de ARN, tal como ARN pequeño de interferencia (ARNpi) o a Rn en horquilla corto (ARNhc) o por edición de genes, p. ej., usando el sistema CRISPR/Cas.

En el presente documento se divulga un método para tratar un sujeto mediante terapia con células T adoptivas, en donde el método comprende administrar las células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos obtenidas por un método divulgado anteriormente a sujeto que lo necesite. El sujeto es preferentemente un ser humano.

El sujeto es preferentemente un paciente humano con cáncer o un paciente infectado por virus, p. ej., un paciente infectado por CMV o un paciente infectado por VIH.

En el presente documento se divulgan células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos obtenidas mediante el método del primer, segundo o tercer aspecto de la invención para su uso en un método de tratamiento de un ser humano o de animal no humano mediante terapia de células T adoptivas. Una célula T ^y§ residente en tejidos no hematopoyéticos puede tener una o más de las siguientes propiedades:

(i) presenta el fenotipo CD69alto, ICOSalto, TIM3alto y CD28bajo/ausente

(ii) regula positivamente uno o más de CCR3, CD11b, CD9 y CD39,

(iii) produce IFN-^yen respuesta a un ligando de NKG2D en ausencia de agonistas de TCR,

(iv) produce IL-13 en ausencia de agonistas de TCR,

(v) produce uno o más de IFN-^y, TNF-a y GM-CSF en respuesta a la activación de TCR,

(vi) no produce o sustancialmente no produce IL-17 en respuesta a la activación de TCR,

(vii) crece en medio de cultivo que contiene IL-2 sin factores de crecimiento adicionales,

(viii) presenta una respuesta de células T citotóxicas en ausencia de agonistas de TCR, y/o

(ix) presenta citotoxicidad selectiva para células tumorales sobre células normales.

El ser humano puede ser un paciente humano con cáncer o un paciente infectado por virus, p. ej., un paciente infectado por CMV o infectado por VIH, en donde la infección por CM o VlH está relacionada con MICA.

En el presente documento se divulga un método para tratar un sujeto mediante terapia con receptores de antígenos quiméricos, comprendiendo el método administrar las células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos obtenidas mediante el método del primer, segundo o tercer aspecto de la invención a un sujeto que lo necesite.

El sujeto es preferentemente un ser humano. El sujeto puede ser un paciente humano con cáncer.

En el presente documento se divulgan células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos obtenidas mediante el método divulgado anteriormente para su uso en un método de tratamiento de un ser humano o de animal no humano mediante terapia con receptores de antígenos quiméricos.

El ser humano puede ser un paciente humano con cáncer.

Cada una de las realizaciones descritas anteriormente puede combinarse con una cualquiera o más de cualesquier otras realizaciones.

Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle a continuación.

Breve descripción de las figuras

Las FIGS. 1A-1D muestran que la piel humana comprende una notable población de células T y§ residentes. FIG.

1A: Los linfocitos residentes en la piel se aislaron usando un cultivo celular organotípico publicado por Clark et al. (29), "el protocolo Clark". Dentro de las células CD45+, se usó anti-CD3 para teñir las células T y anticuerpo anti-CD56 para identificar las células NK, CD3-CD56+, respectivamente. Dentro de las células CD3+, se usaron anticuerpos contra el receptor de células T pan y§ para identificar células T y§ residentes en la piel y anti-CD8alfa para identificar proporciones de células T ap positivas para CD4 y CD8 convencionales dentro de la región CD3+, TCR pan ^y§. La FIG. 1B muestra un resumen de estos experimentos para 7-10 donantes usando el protocolo de Clark. Usando este protocolo, los linfocitos dentro de la piel humana todavía están en contacto con los fibroblastos dérmicos, y se complementaron con casi apenas ninguna citocina o con interleucina-2 (IL-2), interleucina-15 (IL-15) o IL-2 e IL-15 que indica que el uso de citocinas no cambia la composición de linfocitos residentes en la piel con la excepción de una población de células T y§ ligeramente mayor al complementar el cultivo con IL-15 o IL-2 e IL-15, validando el protocolo de Clark et al. Las composiciones de linfocitos después de un cultivo de piel organotípico de 3 semanas se muestran usando las citocinas indicadas como un resumen para 4 donantes. FIG.

1C: Las células y§ residentes en la piel comprenden principalmente células T y§ que expresan V81 (76,24 %±17,3), una pequeña población de células positivas T que expresan V82 (3,06 %±6,1) y una población de células positivas pan-Y§ TCR que tiñen negativamente V81 o V82, también denominadas en el presente documento células T ^y§ doble negativas (DN) (20,7 %±13,97). La tinción de control de la sangre de voluntarios sanos muestra la fuerte compartimentalización de células T y§ humanas, ya que dentro de la sangre, la población dominante de células T Y5 expresó la cadena de TCR V82. FIG. 1D: Las células T y§ residentes en la piel muestran marcadores previamente asociados con las células T que se han activado crónicamente, aunque estos marcadores son indicadores distintivos de la residencia tisular en lugar de reflejar necesariamente la activación crónica. Los histogramas muestran la tinción de los marcadores indicados en las células T ^y§ (histograma relleno) frente al control de isotipo apropiado para cada anticuerpo (histograma vacío).

Las FIGS. 2A a 2D muestran que las células T y§ residentes en la piel derivadas directamente de la piel humana a través del protocolo de Clark presentan la denominada respuesta sesgada de TH1 tras la activación por medios convencionales para activar las células T y presentan igualmente una respuesta sesgada de TH1 tras la activación por solo ligandos de NKG2D. FIG. 2A: Las células T y§ residentes en la piel muestran una fuerte expresión del receptor de NKG2D asociado a células NK y activador (histograma relleno, frente al isotipo representado por el histograma vacío). Tras la activación usando MICA recombinante unida a la placa, uno de los ligandos conocidos para los receptores de NKG2D, las células T ^y§ de la piel responden sin ninguna otra estimulación e independientemente de la ligación de TCR ya que la respuesta se suprime en presencia de anticuerpos bloqueantes de NKG2D. Las células se estimularon durante 6 horas en presencia de brefeldina A y 100 unidades de IL-2/ml y posteriormente se analizaron para la desgranulación mediante tinción para CD107a. La producción de TNF-a e iNF-y se analizó mediante permeabilización después de la tinción superficial y la posterior tinción de citocinas intracelulares. El forbol-12-miristato 13-acetato (P) en combinación con ionomicina (I) se usó como control positivo para activar las células T. FIG. 2B: Las células T ^y§ residentes en la piel muestran una respuesta sesgada de TH1. Las células T y§ se recuperaron usando el protocolo de Clark y se estimularon con PMA e ionomicina durante 6 h en presencia de brefeldina A y se tiñeron para citocinas intracelulares. Las células T ^y§ recién aisladas de la piel humana producen TNF-a e IFN-y tras la estimulación, pero solo cantidades pequeñas o indetectables de citocinas, p. ej., IL-4, IL-17A, IL-13, IL-22, que se asocian con células TH2 o TH-17, mientras que las células T CD4+ ap convencionales muestran una variedad mucho más amplia de producción de citocinas. FIG. 2C: De los linfocitos derivados directamente de la piel humana, los niveles variables del receptor de NKG2D se expresan mediante células T ^y§, células T ap convencionales CD8a+ y células NK. Entre estas células, las células NK responden solo a la exposición a ligandos de NKG2D, pero en células T es solo la población de células T y§ la que muestra una respuesta de citocinas tras la estimulación con ligandos de NKG2D en ausencia de cualquier estimulación de TCR (véase la fila superior de la gráfica de puntos de citometría flujo). La respuesta puede bloquearse usando anticuerpos bloqueantes anti-N KG2D solubles que indican que la respuesta está mediada exclusivamente por el receptor de NKG2D. FIG. 2D: Entre las células T ^y§ residentes en la piel, solo las células T Y5 V81 y DN muestran que el potencial de tipo innato se activará mediante MICA recombinante únicamente (indicado por un *). Las células T que expresan V82 encontradas en pequeñas cantidades dentro de la piel no muestran tal respuesta.

Las FIGS. 3A-3D muestran que las células T y§ residentes en la piel responden exclusivamente a la segregación del estroma dérmico con una fuerte activación y proliferación. FIG. 3A: Se aislaron linfocitos residentes en la piel usando el protocolo de Clark. Después de un cultivo organotípico de 3 semanas, los linfocitos de la piel se recogieron y se separaron de cualquier célula de la piel residual incluyendo fibroblastos y se colocaron en pocillos de cultivo tisular a densidades de 1 millón de linfocitos/ml y se complementaron con 100 U/ml de IL-2. Después de 3 semanas adicionales, las células T ^y§ residentes se han expandido intensamente y se han enriquecido dentro del cultivo de linfocitos de piel. Este fuerte fenómeno proliferativo fue exclusivo de las células T ^y§ residentes en la piel, representadas por la mayoría de las células T V81 que proliferaron 127,18 veces en promedio en 3 semanas, mientras que las células T ap convencionales únicamente proliferaron 5,21 veces en promedio; es decir, más de 20 veces menos. FIG. 3B: Las células V81 T residentes en la piel responden a la pérdida de tejido regulando positivamente de manera intensa el marcador Ki-67 (indicativo de ciclado celular) durante 14 días (control de isotipo representado por el histograma vacío bordeado por una línea discontinua; expresión de Ki-67 en la tinción del día 0 representada por el histograma vacío; expresión de Ki-67 en la tinción del día 7 representada por el histograma de color gris claro; expresión de Ki-67 en la tinción del día 14 representada por el histograma vacío). Adicionalmente, las células T V81 residentes en la piel, que en la mayoría son negativas para el receptor alfa de IL-2 (CD25) cuando están en contacto con el estroma dérmico, regulan positivamente CD25 después de la segregación del tejido (control de isotipo: histograma discontinuo, tinción del día 0: histograma de color gris claro, tinción del día 7: histograma de color gris oscuro).

FIG. 3C: Se observan únicamente altas tasas de ciclado celular según lo indicado por la intensidad de fluorescencia media (IFM) de Ki-67 en células T y§ residentes en la piel, representadas por células T V81 , y no se observan ni en células T ap convencionales ni en células NK donde la IFM disminuye realmente durante 14 días. FIG. 3D: Los linfocitos de la piel segregados de las células estromales muestran una población de células T y§ residentes fuertemente enriquecidas después de un cultivo de 3 semanas. Esta población de células T y§ contiene una mayoría de células positivas para V81 (77,49 %±17,04) y células T DN positivas para pan ^y§ TCR (2l,46 %±16,92). La pequeña población inicial de células T V82 observada en linfocitos cutáneos recién recogidos usando el protocolo de Clark, está disminuyendo y casi se pierde (0,6 %±1,204) después de una expansión de 3 semanas de las células T ^y§ de tejido.

Las FIGS. 4A y 4B muestran que las células T y§ residentes en la piel responden a la pérdida de tejido y se mantienen bajo control a través de un mecanismo dependiente de contacto mediante células estromales dérmicas, particularmente fibroblastos. FIG. 4A: Los linfocitos mixtos de la piel se recogieron después del cultivo organotípico como en el protocolo de Clark después de 3 semanas. Después se sembraron linfocitos mixtos en la parte superior de una capa confluente de fibroblastos de piel autólogos y en un transwell para controlar la presencia de inhibidores solubles producidos por fibroblastos. Después de 14 días, se midieron las expansiones calculadas a través del número absoluto de células presentes para las células T ^y§ y las células T ap convencionales. Las células T ^y§ residentes en la piel mostraron una fuerte respuesta proliferativa cuando se separaron del tejido y en presencia de fibroblastos, pero solo cuando no estaban en contacto celular directo con fibroblastos autólogos. Las células T ap convencionales no mostraron tal respuesta en ninguna condición analizada. FIG. 4B: Los linfocitos mixtos obtenidos del cultivo organotípico se sembraron en una monocapa de fibroblastos autólogos (histogramas de color gris claro) o se sembraron en pocillos vacíos (histogramas de color gris oscuro) complementados con IL-2 y se cultivaron durante 7 días. Las células T V81 residentes en la piel (paneles de la izquierda) así como las células T pan y§ TCR+ DN (paneles de la derecha) permanecieron inactivas en presencia directa de fibroblastos pero mostraron una fuerte activación cuando se segregaron del cultivo organotípico dérmico y no en presencia de fibroblastos como se indica por la expresión regulada positivamente (IMF) de CD25, el factor de transcripción T-bet asociado a TH y el marcador de ciclado celular Ki-67 (los histogramas vacíos discontinuos representan el control de isotipo acorde).

Las FIGS. 5A y 5B muestran que expandir las células T y§ de la piel presentan signos de desrepresión y ganancia de fuerte potencial citotóxico. FIG. 5A: Las células T ^y§ residentes en la piel se dejaron expandir durante 14 días después de la separación del cultivo celular organotípico. Las células T y§ se clasificaron luego por citometría de flujo negativamente excluyendo todas las células T convencionales teñidas con un anticuerpo monoclonal pan ap TCR. Después se sembraron 150.000 células T ^y§ clasificadas en una placa de cultivo de 96 pocillos plana por duplicado y se dejaron en cultivo sin complementación con citocinas ni complementación con ningún ligando activador durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para las citocinas producidas usando la matriz de citocinas basado en LUMINEX® de Affymetrix. FIG. 5B: Las células T ^y§ clasificadas negativamente también se sembraron en líneas celulares cancerosas sembradas 1 día antes a una concentración de 10.000 células por pocillo. Como control, se usaron células T ap de piel convencionales clasificadas negativamente. Las células T se sembraron en las relaciones efector: diana indicadas en presencia y ausencia de anticuerpo bloqueante de NKG2D en presencia de IL-2 a 100 U/ml. Las células T y§ residentes en la piel mostraron una destrucción superior, como se muestra por la liberación de citoqueratina 18 (CK18) específica de epitelio escindida por caspasa medida mediante ELISA, de líneas celulares malignas frente a células T ap convencionales. La citotoxicidad estaba al menos parcialmente mediada a través del receptor de NKG2D, como se muestra por su reducción en cultivos que contienen un anticuerpo que bloquea el receptor de NKG2D.

Las FIGS. 6A-6D muestran un análisis de células T ^y§ residentes en tejidos en intestino humano. FIG. 6A: Una adaptación del protocolo de Clark permitió el aislamiento de los linfocitos residentes en el intestino. Los linfocitos intestinales mixtos contienen una gran población de células T y§ residentes en los tejidos que generalmente comprenden principalmente células V81, pero también contienen células T V52 y ^y§ doble negativas. FIG. 6B: Las células T ^y6 aisladas del cultivo organotípico intestinal muestran respuestas similares a las células T ^y§ derivadas de la piel, ya que regulan positivamente Ki-67 con el tiempo una vez que se segregan del estroma intestinal. FIG.

6C: Las células T ^y§ derivadas del intestino responden a estímulos de tipo innato tales como MICA recombinante produciendo IFN-^yy por desgranulación, según lo medido por la regulación positiva de CD107a. FIG. 6D: Las células T ^y6 aisladas del cultivo organotípico intestinal muestran respuestas similares a las células T ^y§ derivadas de la piel y se expanden con el tiempo en el cultivo celular como se observa mediante el enriquecimiento general en cultivos de linfocitos que carecen de contacto con el estroma intestinal.

Las FIGS. 7A y 7B muestran el fenotipo de tejido de células T ^y§ derivadas de la piel expandidas. FIG. 7A: Las células T ^y6 derivadas de la piel se tiñen positivamente para el antígeno de linfocito cutáneo (CLA, por sus siglas en inglés), los receptores CCR4 y CCR8 de la quimiocina de migración dirigida a la piel. FIG. 7B: Los niveles de expresión son diferentes en las células T y§ expandidas derivadas de la piel o la sangre, respectivamente.

La FIG. 8 muestra que la desrepresión de las células T ^y§ derivadas de la piel, sin ninguna estimulación del TCR, da como resultado la producción espontánea de citocinas TH-1 y, curiosamente y a diferencia de las células T y§ activadas por TCR, en la producción de la citocina atópica IL-13. Consistentemente con las células T y§ recién derivadas, las células T ^yS desreprimidas y en expansión producen cantidades insignificantes de citocinas asociadas a TH-2, p. ej., IL-4 e IL-5. Las células T ^y§ derivadas de la piel se dejaron expandir durante 14 días y se clasificaron negativamente excluyendo las células T ap convencionales. 150.000 células T ^y§ mixtas se cultivaron a una densidad de 1 millón de células/ml en una placa plana de 96 pocillos por duplicado para 4 donantes sin ninguna estimulación o complementación de citocinas. Los sobrenadantes se recogieron después de 24 h y se analizaron usando la matriz de citocinas basado en LUMINEX® de Affymetrix.

Las FIGS. 9A a 9C muestran que las células T y§ derivadas de la piel expandidas y clasificadas negativamente muestran una fuerte citotoxicidad frente a diversas líneas celulares tumorales humanas con las que se cocultivan (FIG. 9A: HCT1954, FIG. 9B: HCT116, FIG. 9C: MD231) según lo medido por la liberación de citoqueratina 18 escindida por caspasa por las células diana, usando ELISA.

Las FIGS. 10A y 10B muestran que las células T VS1 derivadas de la piel, frescas, no expandidas, muestran marcadores de activación previa de células T. FIG. 10A: Las células T VS1 derivadas de la piel expresan CD69, ICOS y TIM3 altos y CD28 bajo. Es más, muestran alta expresión del marcado de activación NKG2D. Este fenotipo se mantiene en las células T VS1 derivadas de la piel durante la expansión in vitro. Por contra, las células T VS1 derivadas de la sangre humana carecen de estos signos de activación, no expresan CD69 o TIM3, y expresan únicamente niveles inferiores de ICOS. En comparación con las células T VS1 derivadas de la piel, la expresión de NKG2D en las células T VS1 derivadas de la sangre es mucho menor, mientras que las células T VS1 derivadas de la sangre expresan la molécula coestimuladora CD28. FIG. 10B: Únicamente las células T VS1 derivadas de la piel son reactivas a ligandos de NKG2D tales como MICA recombinante en ausencia de cualquier otro estímulo, tal como un ligando para el receptor de células T. Las células T VS1 o VS2 derivadas de la sangre no muestran dicha respuesta a estímulos de tipo innato. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos con MICA recombinante o anticuerpos anti-CD3 o ambos, según se indica. Las células se cultivaron durante 6 h en 100 U/ml de IL-2 y BFA durante las últimas 4 horas, seguido de tinción con antígeno de superficie, permeabilización y tinción intracelular para IFN-y.

La FIG. 11 muestra que las células T VS1 derivadas de la piel expresan niveles inferiores de CD16 pero muestran una expresión sustancial del receptor de IgG de alta afinidad CD64. Por lo tanto, además de la actividad citotóxica directa, las células T VS1 derivadas de tejido también podrían usarse para aumentar la eficacia de terapias con anticuerpos monoclonales tales como terapias con CD20 o Her2, ya que serían guiadas por los anticuerpos a los lados de neoplasias malignas y metástasis, reconocerían células tumorales opsonizadas y las destruirían a través de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC). Los resultados que se muestran son de un donante representativo (de cuatro).

La FIG. 12 muestra la expansión de células T VS1 en IL-2 (panel izquierdo), IL-15 (panel central) e IL-2+ IL-5 (panel derecho). Los linfocitos derivados de la piel recién aislados se cultivaron en placas de 96 pocillos de fondo plano en medio RPMI que contenía FCS al 10 % y Pen/Estrep al 1 % y se complementaron con IL-2, IL-15 o IL-2+IL-15 respectivamente durante 7 días. Tanto IL-2 como IL-15 así como la combinación de ambas citocinas indujeron la proliferación de células T VS1 como se indica por el cambio en la tinción de KI-67 en comparación con la tinción de isotipo (negativo verdadero) en ausencia de cualquier célula estromal. Ki-67 únicamente tiñe las células que han dejado G0 del ciclo celular y se asocia habitualmente con la proliferación.

La FIG. 13 muestra resultados de citometría de flujo que indican la expresión de CD9, CCR3 y CD39 en la superficie de las células T y§ VS1 expandidas en el día 21. Las células T VS1 derivadas de la piel expandidas mantuvieron altos niveles de marcadores de superficie celular, CCR3, CD39 y CD9 según se indica por (histograma oscuro) frente a la tinción de isotipo equivalente (histograma abierto, negativo verdadero).

La FIG. 14 muestra la expresión de ARNm de CCR3 y CD9 en células T VS1 derivadas de la piel (barras oscuras) y células T VS1 derivadas de la sangre (barras claras). Las células T VS1 derivadas de la piel se expandieron como se divulga en el presente documento, y las células T VS1 derivadas de la sangre se expandieron usando anticuerpos unidos a la placa para el receptor de células T VS (20 pg/ml). Después de la expansión, se aislaron las células T VS1 usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se aisló ARN de 3 donantes para ambos grupos (sangre = gris frente a piel = negro). El ARNm completo se secuenció y los niveles de expresión de los ARNm indicados se normalizaron y el log 2 se transformó. Todos los niveles de expresión se muestran en comparación directa, y en una relación a GAPDH, un gen constitutivo común expresado en altos niveles en la mayoría de las células humanas.

La FIG. 15 muestra la expresión de ARNm de IL-13 en células T VS1 derivadas de la piel (barras oscuras) y células T VS1 derivadas de la sangre (barras claras). Las células T VS1 derivadas de la piel se expandieron como se divulga en el presente documento, y las células T VS1 derivadas de la sangre se expandieron usando anticuerpos de altas dosis unidos a la placa para el receptor de células T VS (20 pg/ml). Después de la expansión, se aislaron las células T VS1 usando FACS y se aisló ARN de 3 donantes para ambos grupos (sangre = gris frente a piel = negro). El ARNm completo se secuenció y los niveles de expresión de los ARNm para IL-13 se normalizaron y el log 2 se transformó. Los niveles de expresión se muestran en comparación directa, y en una relación a GAPDH. Las FIGS. 16A y 16B muestran la producción de citocinas en células T VS1 derivadas de la piel después de la estimulación de TCR con PMA/ionomicina (FIG. 16A) o anti-CD3 (FIG. 16B). Después del aislamiento y la expansión, las células T VS1 derivadas de la piel se purificaron usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se sembraron 150.000 células T VS1 en una placa de fondo plano de 96 pocillos por duplicado para tres donantes y se estimularon con anti-CD3 unido a la placa (5 |jg/ml) o PMA/ionomicina durante 24 horas. Los sobrenadantes se analizaron para cantidades absolutas de citocinas indicadas usando la plataforma de LUMINEX®.

Descripción detallada

Las células T gamma delta (células T y8) representan un pequeño subconjunto de células T que expresan en su superficie un receptor de células T definidor (TCR). Este TCR está compuesto por una cadena gamma (y) y una cadena delta (8).

Hay dos subgrupos principales de células T y8 humanas: uno que es dominante en la sangre periférica y otro que es dominante en tejidos no hematopoyéticos.

La ubicación del tejido no hematopoyético del segundo subtipo de células T y8 humanas hace que sea más difícil de muestrear y no se han establecido medios para cultivar las células. Para satisfacer esta necesidad, la presente invención se refiere a un método de expansión de células T y8 residentes en tejidos no hematopoyéticos, denominadas alternativamente en el presente documento células T y8 nativas en tejidos no hematopoyéticos. Estas células T y8 residen normalmente en tejidos no hematopoyéticos. Las células T y8 residentes en tejidos no hematopoyéticos para uso como se describe en el presente documento pueden originarse o se pueden obtener a partir de un tejido no hematopoyético. Los tejidos no hematopoyéticos pueden contener células no hematopoyéticas y células T ^y8.

El método descrito en el presente documento proporciona un medio de expansión de las células T ^y8 de cualquier tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos que pueda extraerse de un paciente, incluyendo piel, el tracto gastrointestinal (p. ej., colon), tejido de glándula mamaria, pulmón, próstata, hígado, bazo y páncreas. Las células T ^y8 también pueden residir en tejidos de cáncer humano, p. ej., tumores de mama y próstata. En algunas realizaciones, las células T ^y8 pueden ser de tejidos cancerosos humanos. En otras realizaciones, las células T ^y8 pueden ser de tejido no hematopoyético distinto de tejido canceroso humano.

Las células T ^y8 que son dominantes en la sangre son principalmente células T V82, mientras que las células T ^y8 que son dominantes en los tejidos no hematopoyéticos son principalmente células T V81, de modo que las células T V81 comprenden aproximadamente un 70-80 % de la población de células T y8 residentes en tejidos no hematopoyéticos. Sin embargo, algunas células T V82 también se encuentran en tejidos no hematopoyéticos, p. ej., en el intestino, donde pueden comprender aproximadamente un 10-20 % de células T ^y8 (FIG. 6). Algunas células T Y8 que residen en tejidos no hematopoyéticos no expresan ni V81 ni V82 TCR y se han llamado células T y8 doble negativas (DN). Es probable que estas células T ^y8 DN sean mayoritariamente expresivas de V83 con una minoría de células T que expresan V85.

Por lo tanto, las células T ^y8 que habitualmente residen en tejidos no hematopoyéticos y que se expanden por el método de la invención son preferentemente células T que no son V82, p. ej., células T V8l, con la inclusión de una cantidad más pequeña de células T y8 DN.

Como se usa en el presente documento, las células T ^y8 "doble negativas" (células T ^y8 DN) se refieren a células T Y8 que expresan los receptores ^y8 (es decir, tinción positiva para pan-TCR) pero son negativas para los receptores V81 y V82. Las células T y8 DN incluyen aquellas que expresan receptores V8 distintos de V81 y V82 (p. ej., V83, V84, V85 o V88). Una célula puede caracterizarse como positiva para un marcador (p. ej., V81+) si su expresión del marcador es más alta que una célula de control negativo según se determina por los métodos de activación de FACS convencionales.

Un método descrito en el presente documento puede comprender el cultivo de linfocitos obtenidos a partir de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos in vitro.

Los linfocitos se pueden obtener de cualquier tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos adecuado. El tejido no hematopoyético es un tejido distinto de la sangre, médula ósea o tejido del timo. En algunas realizaciones, las células T y8 no se obtienen de tipos particulares de muestras de fluidos biológicos, tales como sangre o líquido sinovial. Ejemplos de tales tejidos no hematopoyéticos de seres humanos o de animales no humanos adecuados incluyen piel o una porción de la misma (p. ej., dermis, epidermis), el tracto gastrointestinal (p. ej., epitelio gastrointestinal, colon, intestino delgado, estómago, apéndice, ciego o recto), tejido de glándula mamaria, pulmón (preferentemente cuando el tejido no se obtiene mediante lavado broncoalveolar), próstata, hígado, bazo y páncreas. Las células T ^y8 también pueden residir en tejidos de cáncer humano, p. ej., mama y próstata. En algunas realizaciones, las células T y8 no se obtienen de tejidos cancerosos humanos. Las muestras de tejido no hematopoyético pueden obtenerse mediante técnicas convencionales, p. ej., por explante (p. ej., biopsia).

Los linfocitos pueden obtenerse por cualquier método adecuado que permita el aislamiento de linfocitos de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos. Uno de estos métodos se expone en Clark et al. (29), que describe un protocolo de explante de piel tridimensional para aislar linfocitos de la piel humana. Un explante puede adherirse a un andamio sintético para facilitar la salida de linfocitos del explante al andamio. Un andamio sintético se refiere a una estructura tridimensional no nativa adecuada para soportar el crecimiento celular. Los andamios sintéticos pueden construirse con materiales tales como polímeros (p. ej., polímeros naturales o sintéticos, p. ej., polivinilpirrolidinas, polimetilmetacrilato, metilcelulosa, poliestireno, polipropileno, poliuretano), material cerámico (p. ej., fosfato tricálcico, aluminato de calcio, hidroxiapatita de calcio), o metales (tantalio, titanio, platino y metales del mismo grupo de elementos que el platino, niobio, hafnio, tungsteno, y combinaciones de aleaciones de los mismos). Factores biológicos (p. ej., colágenos (p. ej., colágeno I o colágeno II), fibronectinas, lamininas, integrinas, factores angiogénicos, factores antiinflamatorios, glicosaminoglicanos, vitrógenos, anticuerpos y fragmentos de los mismos, citocinas (p. ej., interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15), y combinaciones de las mismas) pueden recubrirse en la superficie del andamio o encapsularse dentro del material del andamio para mejorar la adhesión celular, la migración, la supervivencia o la proliferación, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Este y otros métodos pueden usarse para aislar linfocitos de una serie de otros tipos de tejidos no hematopoyéticos, p. ej., intestino, próstata y mama. Otros ejemplos de métodos adecuados incluyen digestión enzimática del tejido y un método "de salida por arrastre" descrito por Carrasco et al. (30) en el que el tejido se corta y se añade IL-2 para que los linfocitos "salgan por arrastre".

Como se ha mencionado anteriormente, puede usarse cualquier tejido no hematopoyético adecuado, tal como piel, el tracto gastrointestinal (p. ej., colon), tejido de glándula mamaria, pulmón, próstata, hígado, bazo y páncreas.

Las células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos son preferentemente obtenidas de tejido humano. Sin embargo, pueden obtenerse de tejido no hematopoyético de cualquier animal no humano adecuado, tal como ratones, ratas, perros, caballos y cerdos.

Una etapa crítica es la separación deliberada, p. ej., después de algunos días o semanas de cultivo, de las células T residentes en tejidos no hematopoyéticos (p. ej., dentro de una población de linfocitos mixtos, que puede comprender, por ejemplo, células T ap, ^y§2 y que no son ^y§2) lejos de las células no hematopoyéticas, (p. ej., células estromales, en particular fibroblastos) del tejido del que se obtuvieron las células T, y el posterior cultivo de las células como linfocitos en citocinas, como se describe a continuación. Esto permite la expansión selectiva y marcada durante los días y semanas siguientes de las células T y§1 y y§ DN derivadas del tejido.

Como se usa en el presente documento, "separación", "separado/a" o "separar" se refieren al acto de romper o prohibir el contacto físico entre poblaciones celulares distintas. La separación puede realizarse, p. ej., pipeteando con fuerza una población mixta de células para romper las asociaciones intermembrana, o induciendo "la salida por arrastre" de una población de células de, p. ej., una matriz tisular, mediante el cultivo con, p. ej., quimiocinas o citocinas, como se describe por Carrasco et al. (30). La separación puede mantenerse durante el cultivo usando un sistema de cultivo transwell o mediante métodos de cultivo similares que eviten el contacto físico entre poblaciones celulares distintas.

Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a una pureza superior al 90 % en número, masa o volumen. "Sustancialmente libre de" se refiere a tener menos del 5 % en número, masa o volumen de un componente determinado. Los linfocitos obtenidos de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos pueden cultivarse durante al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas o al menos 4 semanas.

El método comprende cultivar los linfocitos obtenidos de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos en presencia de IL-2. La concentración de IL-2 es preferentemente de al menos 10 unidades internacionales/ml (UI/ml, o U/ml), al menos 20 U/ml, al menos 30 U/ml, al menos 40 U/ml, al menos 50 U/ml, al menos 60 U/ml, al menos 70 U/ml, al menos 80 U/ml, al menos 90 U/ml o al menos 100 U/ml.

El uso de IL-2 para promover la expansión de las células T ^y§ derivadas de la piel no es obvio puesto que las células expresan niveles muy bajos del receptor de IL-2 de alta afinidad, conocido como CD25 (FIG. 1D). Sin embargo, este receptor está regulado positivamente en subconjuntos discretos de células T y§ por disociación de otros tipos celulares, tales como las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) (véanse las FIGS. 3B y 4B) que hacen que las células sean altamente susceptibles a IL-2.

Como se usa en el presente documento, "IL-2" se refiere a la IL-2 de tipo salvaje (p. ej., nativa o recombinante) o a un agente que actúa como agonista de una o más subunidades del receptor de IL-2 (IL-2R) (p. ej., muteínas de IL-2, análogos de IL-2 de acción prolongada, subunidades de los mismos, complejos receptores de los mismos). Tales agentes pueden favorecer la proliferación de una línea celular dependiente de IL-2, CTLL-2 (33; Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC®) TIB 214). La IL-2 humana madura se presenta como una secuencia de 133 aminoácidos (menos el péptido señal, que consiste en 20 aminoácidos N-terminales adicionales), como se describe en Fujita, et al. (34). Una muteína de IL-2 es un polipéptido en donde se han realizado sustituciones específicas en la proteína interleucina-2 mientras se mantiene la capacidad de unirse a IL-2Rp, tales como las descritas en el documento US 2014/0046026. Las muteínas de IL-2 pueden caracterizarse por inserciones, deleciones, sustituciones y modificaciones de aminoácidos en uno o más sitios en o en los otros residuos de la cadena polipeptídica de IL-2 nativa. De acuerdo con la presente divulgación, cualquiera de dichas inserciones, deleciones, sustituciones y modificaciones dan como resultado una muteína de IL-2 que conserva la actividad de unión a IL-2Rp. Las muteínas a modo de ejemplo pueden incluir sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos.

El ácido nucleico que codifica la IL-2 humana puede obtenerse mediante procedimientos convencionales tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La secuencia de aminoácidos de la IL-2 humana (ID gen 3558) se encuentra en el Genbank con el localizador de acceso NP_000577.2 GI: 28178861. La secuencia de aminoácidos de la IL-2 murina (Mus musculus) (ID gen 16183) se encuentra en el Genbank con el localizador de acceso NP_032392.1 GI: 7110653.

Los linfocitos se cultivan preferentemente en presencia de IL-2 e IL-15, ya que la adición de IL-15 en combinación con IL-2 da lugar a una mayor expansión de las células T y§ proliferativas residentes en tejidos no hematopoyéticos en comparación con la IL-2 sola. La concentración de IL-15 es preferentemente de al menos 10 ng/ml.

La IL-15, al igual que la IL-2, es un conocido factor de crecimiento de células T que puede favorecer la proliferación de una línea celular dependiente de la IL-2, CTLL-2. La IL-15 fue notificada por primera vez por Grabstein et al. (35) como una proteína madura de 114 aminoácidos. El término, "IL-15" como se usa en el presente documento, significa IL-15 nativa o recombinante y muteínas, análogos, subunidades de los mismos, o complejos de los mismos (p. ej., complejos receptores, p. ej., péptidos sushi, como se describe en el documento WO2007/046006), y cada uno de los cuales estimulará la proliferación de las células CTLL-2. En los ensayos de proliferación de CTLL-2, los sobrenadantes de las células transfectadas con el precursor expresado de forma recombinante y las fusiones dentro del marco de las formas maduras de IL-15 pueden inducir la proliferación de las células CTLL-2.

El término, IL-15, como se usa en el presente documento, también significa IL-15 derivada de varias especies de mamíferos, incluyendo, por ejemplo, ser humano, simio, bovino, porcino, equino y murino. Una "muteína" o "variante" de la IL-15, tal como se hace referencia en el presente documento, es un polipéptido sustancialmente homólogo a una secuencia de una IL-15 nativa de mamífero pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de un polipéptido de IL-15 nativa de mamífero debido a una deleción, inserción o sustitución de aminoácidos. Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas de forma conservativa, lo que significa que un determinado residuo de aminoácido se sustituye por un residuo con características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras sustituciones conservativas de este tipo, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas. Las variantes de IL-15 de origen natural también están abarcadas por la invención. Ejemplos de tales variantes son las proteínas que resultan de eventos de corte y empalme de ARNm alternativos o de la escisión proteolítica de la proteína IL-15, en donde se conserva la propiedad de unión de la IL-15. El corte y empalme alternativo del ARNm puede producir una proteína IL-15 truncada pero biológicamente activa. Las variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos terminales N- o C- al expresarse en diferentes tipos de células huésped, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína IL-15 (generalmente de 1 a 10 aminoácidos).

La IL-15 humana puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos descritos por Grabstein et al. (35) o por procedimientos convencionales tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El 19 de febrero de 1993 se realizó un depósito de ADNc de IL-15 humana ante el ATCC® y se le asignó el número de acceso 69245.

La secuencia de aminoácidos de la IL-15 humana (ID gen 3600) se encuentra en el Genbank con el localizador de acceso NP000576.1 GI: 10835153 (isoforma 1) y NP_751915.1 GI: 26787986 (isoforma 2). La secuencia de aminoácidos de la IL-15 murina (Mus musculus) (ID gen 16168) se encuentra en el Genbank con el localizador de acceso NP_001241676.1 GI: 363000984.

Los linfocitos se cultivan en ausencia de IL-6, IL-23 e IL-1B, o en presencia de bajas concentraciones de estas citocinas (p. ej., menos de 20 ng/ml), ya que la adición de esta combinación de citocinas parece reducir la proliferación de las células T y6 residentes en tejidos no hematopoyéticos. Esto es sorprendente, ya que se habría esperado que estas citocinas promovieran la proliferación.

Los linfocitos obtenidos del tejido no hematopoyético pueden cultivarse en ausencia de agentes que activen la señalización de las células T (p. ej., agonistas de la vía del receptor de células T (TCR)). Por ejemplo, los linfocitos obtenidos del tejido no hematopoyético pueden cultivarse en un medio que no favorezca o induzca la proliferación o activación de células T ap y células T y§ residentes en la sangre. Un medio adecuado puede estar libre o sustancialmente libre de agonistas del TCR u otros agentes que activen la señalización de las células T. Por el contrario, el cultivo de células T ^y§ de tejidos hematopoyéticos requiere la presencia de un agente que active la señalización de las células T, tales como el zoledronato (41, 42) o un anticuerpo anti-CD3, tal como OKT3 (43).

Los agentes que activan la señalización de las células T se refieren a compuestos que inducen la proliferación o la activación de las células T, tales como las células T ap y/o las células T y§ residentes en la sangre, mediante la señalización o la coestimulación del TCR. Los moduladores de la señalización de las células T funcionan mediante la activación secuencial de las proteínas tirosina quinasas relacionadas con Src (PTKs), LcK y Fyn, y la proteína quinasa asociada a la cadena zeta (TCR) de 70 kDA (ZAP70). Estas PTKs conducen a la fosforilación de polipéptidos, incluyendo el activador enlazador para células T (LAT), que conduce a la estimulación corriente abajo a través de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), quinasa N-terminal c-Jun (JNK), y el factor nuclear de las células T activadas (NFAT). La coestimulación, por ejemplo a través de CD28 y CD45, puede aumentar la fosforilación y potenciar las vías de señalización del TCR. De este modo, cualquier agente que se dirija a una parte de la vía del TCR o de la coestimulación puede activar la señalización de las células T. Los agentes que activan la señalización de las células T pueden ser solubles o estar unidos a la membrana y pueden, por ejemplo, presentarse en las células, tales como las células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC). Las aAPC adecuadas para activar la señalización de las células T son conocidas en la técnica (44).

En algunas realizaciones, los linfocitos pueden cultivarse en ausencia de agonistas de la vía del receptor de células T añadidos exógenamente, tales como activadores de CD3 y/o CD28 (p. ej., anticuerpos monoclonales anti-CD3 y/o anti-CD28); fitohemaglutinina (PHA); concanavalina A, fosfoantígenos sintéticos, tales como BrHPP (pirofosfato de bromohidrina), 2M3B1PP (2-metil-3-butenil-1-pirofosfato), HMBPP pirofosfato de ((E)-4-hidroxi-3-metil-but-2-enil), o IPP (pirofosfato de isopentenilo); N-bisfosfonatos, tales como zoledronato; CD70 recombinante; anticuerpos monoclonales anti-CD2; anticuerpos monoclonales anti-CD27; anticuerpos anti-pan-TCRY§; anticuerpos monoclonales anti-CD277; o células presentadoras de antígenos artificiales (aAPCs). Los agentes que activan la señalización de las células T también incluyen moléculas unidas a la superficie celular, tales como complejos MHC o HLA asociados a células presentadoras de antígenos (APCs) o APCs artificiales. Los métodos adecuados de activación de las células T mediante la adición exógena de agonistas de la vía del TCR son bien conocidos en la técnica y se resumen en la Figura 1 de Deniger et al. (44).

Por ejemplo, los linfocitos se cultivan en un medio que está libre o sustancialmente libre de agonistas de la vía del receptor de células T añadidos exógenamente. La adición de tales agentes activadores de la señalización del receptor de células T no es necesaria para la expansión de células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos usando el método de la invención. Por el contrario, la expansión de células ^y§ T derivadas del tejido hematopoyético requiere la presencia tanto de IL-2 como de un agente activador de la señalización de los receptores de células T, tal como zoledronato (41,42).

En algunas realizaciones, los linfocitos pueden cultivarse en medios acondicionados de cultivos de células estromales para proporcionar complementos para el crecimiento de células T ^y§.

En algunas realizaciones, las células T ^y§ se pueden cultivar en un medio de expansión de ^y§ que comprende IL-2 e IL-15. Un medio de expansión de y§ adecuado está desprovisto de actividad de activación de células T, por ejemplo, actividad de activación de células T ap o células T ^y§ de sangre, y puede, por ejemplo, estar libre o sustancialmente libre de agonistas o agentes coestimuladores del TCR. En algunas realizaciones, el medio de expansión de y§ puede comprender uno o más factores de crecimiento adicionales, tales como citocinas, además de IL-2 e IL-15. Los factores de crecimiento adecuados no presentan actividad de activación de células T. En otras realizaciones, el medio de expansión de y§ puede estar desprovisto de factores de crecimiento distintos de IL-2 e IL-15; por ejemplo, el medio de expansión de ^y§ puede consistir en un medio basal complementado con IL-2 e IL-15.

Numerosos medios de cultivo basales adecuados para su uso en la proliferación de células T y§ están disponibles, en particular medios completos, tales como AIM-V, medio Iscoves y RPMI-1640 (Life Technologies). El medio puede complementarse con otros factores del medio, tales como suero, proteínas de suero y agentes selectivos, tales como antibióticos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, medio RPMI-1640 que contiene glutamina 2 mM, FBS al 10 %, HEPES 10 mM, pH 7,2, 1 % de penicilina-estreptomicina, piruvato de sodio (1 mM; Life Technologies), aminoácidos no esenciales (p. ej., 100 pM de Gly, Ala, Asn, Asp, Glu, Pro y Ser; 1X MEM aminoácidos no esenciales Life Technologies), y 10 pl/L de p-mercaptoetanol. El medio basal puede complementarse con IL-2 y/o IL-15 a concentraciones convencionales que pueden ser fácilmente determinadas por el experto en la materia mediante experimentación rutinaria.

De manera conveniente, las células se cultivan a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene un 5 % de CO2 en un medio de cultivo adecuado.

Las células T ^y§ pueden cultivarse como se describe en el presente documento en cualquier sistema adecuado, incluyendo fermentadores de tanque agitado, fermentadores de puente aéreo, matraces rotatorios, bolsas o placas de cultivo, y otros biorreactores, en particular biorreactores de fibra hueca. El uso de dichos sistemas es bien conocido en la técnica.

Los métodos y técnicas para el cultivo de linfocitos se conocen bien en la técnica (36-39).

Durante el cultivo, los linfocitos no están en contacto directo con las células estromales o epiteliales. Esto se debe a que el contacto directo de los linfocitos con las células estromales o epiteliales parece inhibir la expansión de las células T y6 residentes en tejidos.

Las células estromales son células del tejido conectivo no hematopoyético de cualquier órgano y respaldan la función de las células del parénquima de ese órgano. Los ejemplos de células estromales incluyen fibroblastos, pericitos, células mesenquimatosas, queratinocitos, células endoteliales y células tumorales no hematológicas. Preferentemente, los linfocitos no están en contacto directo con los fibroblastos durante el cultivo.

Las células epiteliales son células no hematopoyéticas que recubren las cavidades y superficies de los vasos sanguíneos y órganos de todo el cuerpo. Normalmente son de forma escamosa, columnar o cuboidal y pueden estar dispuestas como una sola capa de células, o como capas de dos o más células.

Los fibroblastos y/u otras células estromales o epiteliales están preferentemente presentes durante el cultivo de los linfocitos, ya que los factores secretados por estas células pueden promover la expansión de las células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos, pero no están en contacto directo con los linfocitos, ya que el contacto directo inhibe la expansión de las células T ^y§ no residentes en tejidos hematopoyéticos. Por ejemplo, los linfocitos pueden cultivarse en transwells, que permiten la separación física de los linfocitos y los fibroblastos. Los ejemplos de líneas celulares de fibroblastos que pueden usarse incluyen fibroblastos de prepucio humano (p. ej., BJ (ATCC® CRL-2522™)), fibroblastos de piel normal (p. ej., CCD-1059Sk (ATCC® CRL-2072™)) y fibroblastos de pulmón (p. ej., HEL 299 (ATCC® CRL-137™)).

Usando el protocolo de Clark, los linfocitos residentes en tejidos no hematopoyéticos pueden ser recogidos y separados de las células estromales, tales como fibroblastos dérmicos, p. ej., mediante un pipeteo firme. La recogida de linfocitos puede lavarse además a través de una malla de nylon de 4o pm con el fin de retener los agregados de fibroblastos que puedan haberse liberado durante el proceso. Los linfocitos también pueden aislarse mediante la clasificación celular asociada a fluorescencia o magnética usando, por ejemplo, anticuerpos CD45. Con el fin de minimizar la activación de las células T, también se pueden clasificar únicamente en función de sus propiedades de dispersión frontal y lateral. A continuación, los linfocitos pueden cultivarse aislados de las células estromales (p. ej., fibroblastos) o en su presencia pero sin contacto directo. Por ejemplo, los linfocitos pueden cultivarse en una cesta transwell con una monocapa confluente de fibroblastos en el pocillo de cultivo celular muy por debajo para permitir el intercambio de factores de crecimiento solubles producidos por los fibroblastos, sin permitir ningún contacto directo. De manera alternativa, los fibroblastos pueden cultivarse en una cesta transwell con los linfocitos que crecen en el pocillo de cultivo celular muy por debajo. También se pueden usar medios acondicionados por células no hematopoyéticas (p. ej., fibroblastos) para complementar las expansiones de linfocitos.

Los medios acondicionados contienen factores solubles secretados por células no hematopoyéticas (p. ej., células estromales, tales como fibroblastos). Los medios acondicionados pueden contener o no las células que secretan los factores. Por ejemplo, las células T y§ pueden cultivarse en presencia de células que secretan factores acondicionadores durante el cultivo de células T ^y§. De manera alternativa, las células no hematopoyéticas pueden retirarse de los medios antes del cultivo de células T y§, dejando sus factores secretados en los medios. Los medios acondicionados también incluyen medios que han sido complementados con factores de células no hematopoyéticas que se han preparado previamente (p. ej., como un concentrado o un polvo liofilizado).

Aunque las células estromales o epiteliales están preferentemente presentes durante el cultivo de los linfocitos (pero no están en contacto directo con los linfocitos), pueden retirarse para que los linfocitos se cultiven en ausencia de células estromales o epiteliales, p. ej., en ausencia de fibroblastos.

En algunas realizaciones, tras la expansión de células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos en ausencia de agentes que activen la señalización de las células T, tales como agonistas de la vía del receptor de células T añadidos exógenamente, como se ha descrito anteriormente, las células T y§ expandidas pueden cultivarse además en presencia de uno o más agentes que activen la señalización de las células T, tales como agonistas de la vía del receptor de células T añadidos exógenamente, y/o uno o más factores de crecimiento, tales como las citocinas. Tras la expansión descrita en el presente documento y el cultivo adicional opcional, las células T y§ residentes en tejido no hematopoyéticos pueden aislarse o purificarse aún más, almacenarse, mezclarse con otros reactivos, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables y/o usarse, según sea necesario.

Las células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos producidas por el método de la invención pueden distinguirse de otras células T y§ derivadas de la sangre en que responden al ligando de NKG2D (MICA), que está fuertemente asociado con la neoplasia maligna, en ausencia de cualquier ligando estimulante del receptor de células T, por ejemplo, mediante el aumento de la producción de TNFa, IFN-y y CD107a (FIGS.2A a 2D, 10A y 10B). También ejecutan una respuesta de células T citotóxicas sin sufrir ninguna activación exógena farmacológica o mediada por un ligando del receptor de células T y, por lo tanto, son citotóxicas en ausencia de estimulación (FIG. 3 y FIG. 5). Esto significa que, en comparación con otras células T ^y§, con las células T ap o con las células NK, las células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos producidas por el método de la invención son únicas en su capacidad de responder y proliferar en ausencia de la adición de cualquier agente exógeno que active la señalización del receptor de células T (FIG. 3). Las células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos producidas por el método de la invención también se tiñeron positivamente para CD69 y PD-1, carecían de expresión de CD28, y solo mostraban niveles bajos de CD25 (véase la FIG. 1D). Esta combinación de marcadores no se expresa en las células T ^y§ derivadas de la sangre. Es más, mostraron una mayor expresión de los receptores de migración dirigida tisular, tales como CCR4 y CCR8, en comparación con las células T ^y§ derivadas de la sangre expandidas Vd2 (FIG. 7B). Las células T ^y6 residentes en tejidos no hematopoyéticos producidas por métodos de la invención pueden ser cultivables en presencia de IL2 y/o IL15 sin agonistas del TCR u otros factores de crecimiento. Por ejemplo, una célula T yS residente en tejidos no hematopoyéticos puede crecer en un medio que consiste en un medio RPMI 1640 complementado con IL-2.

Una célula T ^yS residente en tejidos no hematopoyéticos producida por el método de la invención puede tener de este modo una o más de las siguientes propiedades:

(i) presenta el fenotipo CD69alto, ICOSalto, TIM3alto y CD28bajo/ausente

(ii) regula uno o más de CCR3, CD39, CD11b, y CD9

(iv) produce IL-13 en ausencia de agonistas de TCR,

(v) produce uno o más de IFN-y, TNF-a y GM-CSF en respuesta a la activación de TCR,

(viii) muestra una respuesta de las células T citotóxicas en ausencia de agonistas del TCR y/o (ix) presenta una citotoxicidad selectiva para las células tumorales sobre las células normales.

Preferentemente, una célula T yS residente en tejidos no hematopoyéticos producida por el método de la invención produce IL-13 en ausencia de agonistas del TCR y/o produce IFN-^yen respuesta a un ligando de NKG2D en ausencia de agonistas del TCR.

Las células T ^yS obtenidas por el método de la invención pueden usarse en un método de identificación selectiva para un modulador de puntos de control de las células T ^yS residentes en tejidos no hematopoyéticos. La identificación de tales moduladores de puntos de control puede ser útil para desarrollar inmunoterapias contra el cáncer, ya que el modulador de puntos de control es una diana potencial para la terapia contra el cáncer.

Con el fin de determinar si un compuesto de ensayo es un modulador de puntos de control, las células T ^yS residentes en tejidos no hematopoyéticos pueden cultivarse in vitro en contacto directo con células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) en presencia o ausencia del compuesto de ensayo. La tasa de proliferación o el grado de activación de las células T ^yS residentes en tejidos no hematopoyéticos se determina en presencia y ausencia del compuesto de ensayo. Si la tasa de proliferación o el grado de activación es mayor en presencia del compuesto de ensayo que en ausencia del compuesto de ensayo, entonces es probable que el compuesto de ensayo sea un modulador de puntos de control candidato. Esto se debe a que el compuesto de ensayo es capaz de aliviar la inhibición de contacto por las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos).

El compuesto de ensayo se elige en función de su potencial para modular un punto de control para las células T residentes en tejidos.

El aumento aparente de la proliferación de células T ^yS residentes en tejidos no hematopoyéticos podría deberse también a la inhibición de la muerte celular y puede medirse por un aumento del recuento de células T o de sus marcadores y por la reducción de la expresión de marcadores de muerte celular programada. El aumento de la activación puede evaluarse midiendo la liberación de citocinas, tales como IFN-^y, que secretan las células T ^yS residentes en tejidos activados.

De manera alternativa, las células T ^yS residentes en tejidos no hematopoyéticos pueden cultivarse in vitro en contacto directo con células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos), en donde se altera la expresión de un gen de ensayo dentro de las células T yS y/o las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) o ambos tipos de células. La expresión de un gen de ensayo dentro de las células T yS y/o en las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) puede, por ejemplo, ser alterada por un agente de direccionamiento de ARN, tal como a Rn pequeño de interferencia (ARNpi) o a Rn en horquilla corto (ARNhc) o por edición de genes, p. ej., usando el sistema CRISPR/Cas. La tasa de proliferación o el grado de activación de las células T yS residentes en tejidos no hematopoyéticos se determina en presencia y ausencia de alteración de la expresión del gen de ensayo en las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o en las células T yS. Si la tasa de proliferación o activación es mayor en presencia de la alteración de la expresión del gen de ensayo en las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T yS que en ausencia de alteración del gen de ensayo en las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T yS, entonces es probable que el compuesto de ensayo sea un gen de puntos de control candidato.

De manera alternativa, si la tasa de destrucción de las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) es mayor en presencia del compuesto de ensayo que en ausencia del compuesto de ensayo o mayor en presencia de la alteración de la expresión del gen de ensayo en las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T YS que en ausencia de la alteración del gen de ensayo en las células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T ^yS, entonces es probable que el compuesto de ensayo sea un modulador de puntos de control o es probable que el gen de ensayo sea un gen de puntos de control candidato. La tasa de destrucción puede, por ejemplo, medirse mediante la cuantificación de las moléculas liberadas por las células moribundas. Una mayor tasa de destrucción celular en presencia del compuesto de ensayo o en presencia de una alteración de la expresión del gen de ensayo en células estromales o epiteliales (p. ej., fibroblastos) y/o células T yS indica que el punto de control que reprimía la destrucción celular se ha aliviado y, por lo tanto, se puede concluir que es probable que el compuesto de ensayo sea un modulador de puntos de control o que el gen de ensayo sea un gen de puntos de control candidato.

Los ejemplos de líneas celulares de fibroblastos que pueden usarse en cada realización incluyen fibroblastos de prepucio humano (p. ej., BJ (ATCC® CRL-2522™)), fibroblastos de piel normal (p. ej., CCD-1059Sk (ATCC® CRL-2072™)) y fibroblastos de pulmón (p. ej., HEL 299 (ATCC® CRL-137™)).

Con el fin de identificar un compuesto de ensayo como modulador de puntos de control candidato o con el fin de identificar un gen de ensayo como gen de puntos de control candidato, la tasa de proliferación y/o activación de las células T ^y6 en presencia del compuesto de ensayo o en presencia de la alteración del gen de ensayo puede ser de al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces o al menos 5 veces mayor que en ausencia del compuesto de ensayo o en ausencia de alteración del gen de ensayo. El ciclo celular puede medirse por una serie de medios, tales como el número absoluto de células en el día 0 y en el día 7, los niveles de expresión de Ki-67 y CD25 (que son marcadores de ciclado celular) y usando colorantes de cultivo celular, tales como CFSE o CELLTRACE™ violeta. La activación celular puede medirse por la producción de proteínas efectoras tales como IFN-Y. El aumento aparente de la proliferación de células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos podría deberse también a la inhibición de la muerte celular y puede medirse por un aumento del recuento de células T o de sus marcadores y por la reducción de la expresión de marcadores de muerte celular programada.

Las células T ^y§ obtenidas por el método de la invención pueden usarse como medicamento, por ejemplo, para la terapia con células T adoptivas. Esto implica la transferencia de células T y§ obtenidas por el método de la invención a un paciente. La terapia puede ser autóloga, es decir, las células T y§ pueden transferirse de nuevo al mismo paciente del que se obtuvieron, o la terapia puede ser alogénica, es decir, las células T y§ de una persona pueden transferirse a un paciente diferente. Un método de tratamiento puede comprender;

proporcionar una muestra de tejido no hematopoyético obtenida de un individuo donante,

cultivar las células T ^y§ de la muestra como se ha descrito anteriormente para producir una población expandida, y;

administrar la población expandida de células T ^y§ a un individuo receptor.

El individuo donante y el individuo receptor pueden ser iguales o diferentes.

Las células T y§ pueden administrarse al paciente o sujeto que necesite tratamiento mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, las células T ^y§ pueden administrarse al paciente o al sujeto que necesite tratamiento por vía intravenosa o intratumoral.

El paciente o sujeto a tratar es preferentemente un paciente humano con cáncer o un paciente infectado por un virus, p. ej., un paciente infectado por CMV o infectado por VIH.

Como las células T y§ no están restringidas por el MHC, no reconocen como extraño al huésped al que se transfieren, lo que significa que es menos probable que causen la enfermedad de injerto contra huésped. Esto significa que se pueden usar "de forma inmediata" y transferirlas a cualquier receptor, p. ej., para la terapia con células T adoptivas alogénicas.

Como normalmente son residentes en tejidos no hematopoyéticos, las células T V51 y ^y§ DN residentes en tejidos también tienen más probabilidades de alojarse y quedar retenidas dentro de las masas tumorales que sus homólogas sistémicas residentes en la sangre, y es probable que la transferencia adoptiva de estas células sea más eficaz para tratar los tumores sólidos y, potencialmente, otras inmunopatologías asociadas a los tejidos no hematopoyéticos. Un método de tratamiento de un individuo con un tumor en un tejido no hematopoyético puede comprender; proporcionar una muestra de dicho tejido no hematopoyético obtenida de un individuo donante,

administrar la población expandida de células T y§ al individuo con el tumor.

Las células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos obtenidas por los métodos de la invención expresan NKG2D y responden a un ligando de NKG2D (p. ej., MICA), que está fuertemente asociado con la neoplasia maligna. También expresan un perfil citotóxico en ausencia de cualquier activación y, por lo tanto, es probable que sean eficaces para destruir las células tumorales. Por ejemplo, las células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos obtenidas como se describe en el presente documento pueden expresar uno o más, preferentemente todos los IFN-y, TNF-a, GM-CSF, CCL4, IL-13, Granulisina, Granzima A y B, y perforina en ausencia de cualquier activación. Es posible que la IL-17A no se exprese.

Por lo tanto, los hallazgos notificados en el presente documento proporcionan pruebas convincentes de la viabilidad e idoneidad para la aplicación clínica de las células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos obtenidas por el método de la invención como un reactivo inmunoterapéutico "de forma inmediata". Estas células poseen una capacidad de destrucción de tipo innato, no tienen restricción del MHC y presentan una mejor migración dirigida y/o retención dentro de los tumores que otras células T.

Las células T ^y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos obtenidas por el método de la invención también pueden usarse para la terapia CAR-T. Esto implica la generación de receptores de células T (TCR) diseñados por ingeniería genética para reprogramar la célula T con una nueva especificidad, por ejemplo, la especificidad de un anticuerpo monoclonal. El TCR modificado por ingeniería genética puede hacer que las células T sean específicas para las células malignas y, por lo tanto, útiles para la inmunoterapia contra el cáncer. Por ejemplo, las células T pueden reconocer las células cancerosas que expresan un antígeno tumoral, tal como un antígeno asociado al tumor (TAA, por sus siglas en inglés) que no es expresado por las células somáticas normales del tejido en cuestión. De este modo, las células T modificadas con CAR pueden usarse para la terapia de células T adoptivas de, por ejemplo, pacientes con cáncer.

Se ha descrito el uso de células T y§ residentes en la sangre para CAR. Sin embargo, las células T y§ no residentes en tejidos hematopoyéticos obtenidas por el método de la invención son probablemente vehículos particularmente buenos para los enfoques CAR-T, ya que pueden ser transducirse con TCRs específicos de antígenos quiméricos mientras conservan sus capacidades de tipo innato de reconocer células transformadas, y es probable que tengan mejores capacidades de penetración y retención de tumores que las células T y§ residentes en la sangre o las células T ap sistémicas convencionales. Adicionalmente, su falta de presentación de antígeno dependiente del MHC reduce el potencial de la enfermedad de injerto contra el huésped y les permite dirigirse a tumores que expresan bajos niveles de MHC. Del mismo modo, su no dependencia de la coestimulación convencional, por ejemplo, a través del acoplamiento de CD28, mejora el direccionamiento de tumores que expresan bajos niveles de ligandos para los receptores costimuladores.

El cáncer puede caracterizarse por la proliferación anormal de células cancerosas malignas y puede incluir leucemias, tales como leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA) y leucemia linfocítica crónica (LLC), linfomas, tales como linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin y mieloma múltiple, y cánceres sólidos tales como sarcomas, cáncer de piel, melanoma, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer suprarrenal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de la vesícula biliar y de las vías biliares, cáncer de tiroides, cáncer de timo, cáncer óseo y cáncer cerebral.

Las células cancerosas de un paciente con cáncer pueden ser inmunológicamente distintas de las células somáticas normales del individuo (es decir, el tumor canceroso puede ser inmunogénico). Por ejemplo, las células cancerosas pueden ser capaces de provocar una respuesta inmunitaria sistémica en el paciente con cáncer contra uno o más antígenos expresados por las células cancerosas. Los antígenos que provocan la respuesta inmunitaria pueden ser antígenos tumorales o pueden ser compartidos por células normales. Un paciente con cáncer puede mostrar al menos un signo, síntoma o hallazgo de laboratorio identificable que sea suficiente para hacer un diagnóstico de cáncer de acuerdo con los estándares clínicos conocidos en la técnica. Se pueden encontrar ejemplos de dichos estándares clínicos en los libros de texto de medicina, tales como Harrison's Principles of Internal Medicine (40). En algunos casos, el diagnóstico de un cáncer en un individuo puede incluir la identificación de un tipo de célula particular (p. ej., una célula cancerosa) en una muestra de un fluido o tejido corporal obtenido del individuo.

Un paciente, sujeto o individuo adecuado para el tratamiento descrito anteriormente puede ser un mamífero, tal un roedor (p. ej., una cobaya, un hámster, una rata, un ratón), murino (p. ej., un ratón), canino (p. ej., un perro), felino (p. ej., un gato), equino (p. ej., un caballo), un primate, simio (p. ej., un mono o simio), un mono (p. ej., tití o babuino), un simio (p. ej., gorila, chimpancé, orangután, gibón) o un ser humano.

En algunas realizaciones preferidas, el paciente, sujeto o individuo es un ser humano. En otras realizaciones preferidas, se pueden emplear mamíferos no humanos, especialmente mamíferos que se usan convencionalmente como modelos para demostrar la eficacia terapéutica en seres humanos (p. ej., murino, primate, porcino, canino o conejo).

En algunas realizaciones, el paciente, sujeto o individuo puede tener una enfermedad residual mínima (MRD, por sus siglas en inglés) después de un tratamiento inicial contra el cáncer.

El tratamiento puede ser cualquier tratamiento y terapia, ya sea de un ser humano o un animal (p. ej., en aplicaciones veterinarias), en el que se consigue algún efecto terapéutico deseado, por ejemplo, la inhibición o el retraso del progreso de la afección, e incluye una reducción de la velocidad de progreso, una detención en la velocidad de progreso, mejora de la afección, la cura o la remisión (ya sea parcial o total) de la afección, prevenir, retrasar, mitigar o detener uno o más síntomas y/o signos de la afección o la prolongación de la supervivencia de un individuo o paciente más allá de lo esperado en ausencia de tratamiento.

También se incluye el tratamiento como medida profiláctica (es decir, profilaxis). Por ejemplo, un paciente, sujeto o individuo susceptible o en riesgo de que aparezca o reaparezca el cáncer puede tratarse como se describe en el presente documento. Dicho tratamiento puede prevenir o retrasar la aparición o reaparición de la enfermedad en el paciente, sujeto o individuo.

En particular, el tratamiento puede incluir la inhibición del crecimiento del cáncer, incluyendo la remisión completa del cáncer y/o la inhibición de la metástasis del cáncer. El crecimiento del cáncer generalmente se refiere a uno cualquiera de una serie de índices que indican un cambio dentro del cáncer a una forma más desarrollada. De este modo, los índices para medir una inhibición del crecimiento del cáncer incluyen una disminución de la supervivencia de las células cancerosas, una disminución del volumen o la morfología del tumor (por ejemplo, determinada usando tomografía computarizada (TC), sonografía u otro método de formación de imágenes), un retraso en el crecimiento tumoral, una destrucción de la vasculatura tumoral, una mejora del rendimiento en el ensayo de hipersensibilidad cutánea retardada, un aumento de la actividad de los linfocitos T citolíticos y una disminución de los niveles de antígenos específicos del tumor. La reducción de la supresión inmunitaria en tumores cancerosos en un individuo puede mejorar la capacidad del individuo para resistir el crecimiento del cáncer, en particular el crecimiento de un cáncer ya presente en el sujeto y/o para disminuir la propensión al crecimiento del cáncer en el individuo.

Otros aspectos y realizaciones de la invención proporcionan los aspectos y realizaciones descritos anteriormente con la expresión "que comprende" reemplazada por la expresión "que consiste en" y los aspectos y realizaciones descritos anteriormente con la expresión "que comprende" reemplazada por la expresión "que consiste esencialmente en".

Ha de entenderse que la solicitud divulga todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores y de las realizaciones descritas anteriormente entre sí, a menos que el contexto exija lo contrario. De manera similar, la solicitud divulga todas las combinaciones de las características preferidas y/u opcionales, ya sea de manera individual o junto con cualquiera de los otros aspectos, a menos que el contexto exija lo contrario.

Las modificaciones de las realizaciones anteriores, las realizaciones adicionales y las modificaciones de las mismas serán evidentes para el experto tras leer la presente divulgación y como tales, estas se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, "y/o" debe tomarse como divulgación específica de cada uno de los dos rasgos o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" ha de interpretarse como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno de ellos se estableciera individualmente en el presente documento.

Determinados aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras descritas anteriormente.

Métodos

Aislamiento de linfocitos de la piel humana mediante cultivo de explantes tridimensionales

Se estableció un protocolo de explantes tridimensionales de piel, como se describe en otra parte (29). Las matrices Cellfoam de 9 mm x 9 mm x 1,5 mm (Cytomatrix Pty Ltd, Victoria, Australia) fueron esterilizadas en autoclave, luego se incubaron en una solución de 100 mg/ml de colágeno I de cola de rata (BD Biosciences) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de un enjuague en PBS. Las muestras de piel humana adulta se obtuvieron entre 3 6 horas después de la cirugía cutánea. Se eliminó la grasa subcutánea y el tejido cutáneo restante se trituró en fragmentos de aproximadamente 1 mm x 1 mm. Se colocaron aproximadamente cinco fragmentos/explantes de piel y se presionaron sobre la superficie de cada matriz. Cada matriz se colocó en un pocillo separado de una placa de 24 pocillos (Corning) que contenía 2 ml de medio "Skin-T" (medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM; Life Technologies) con un 10 % de suero bovino fetal inactivado con calor (Life Technologies), L-glutamina (292 pg/ml; Life Technologies), penicilina (100 unidades/ml; Life Technologies), estreptomicina (100 pg/ml; Life Technologies), ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico (HEPES; 0,01 M; Life Technologies), piruvato de sodio (1 mM; Life Technologies), medio esencial mínimo con aminoácidos no esenciales (MEM) (1X; Life Technologies) y 3,5 pl/l de 2-mercaptoetanol (Life Technologies). Durante los primeros 7 días de cultivo se añadió anfotericina (2,5 pg/ml; Life Technologies) al medio. Los medios se renovaron tres veces por semana. Para la alimentación, se aspiró 1 ml superior de medio de cada pocillo y se sustituyó por medio fresco. Se añadieron IL-2 e IL-15 desde el inicio del cultivo y en cada cambio de medio hasta el aislamiento de los linfocitos a los 21 días. La IL-2 recombinante humana (Proleukin; Novartis Pharmaceutical UK Ltd) se añadió a 100 Ul/ml. La IL-15 recombinante humana (Biolegend) se añadió a 20 ng/ml. Se establecieron hasta 96 pocillos (cuatro placas de 24 pocillos) en cultivo para cada donante.

Para aislar los linfocitos, las matrices se transfirieron a un tubo de centrífuga de 50 ml (Corning) que contenía 10 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS; Life Technologies) con HEPES 0,01 mM (hasta 12 matrices/tubo). Las matrices se enjuagaron con la suspensión celular usando una pipeta de 10 ml, y la suspensión celular se pasó a través de un filtro de 70 pm (BD Biosciences) a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml (Corning). El "lavado" de las matrices se repitió dos veces más. El medio del pocillo de cultivo también se aspiró y se pasó por un filtro de 70 pm (BD Biosciences) a un tubo de centrífuga nuevo de 50 ml (Corning). Los pocillos se lavaron dos veces más con 1 ml de HEPES/HBSS 0,01 mM y se pasaron por un filtro de 70 pm (BD Biosciences). Posteriormente se aislaron las células por centrifugación (1600 rpm durante 15 minutos). El sedimento se resuspendió en medio "Skin-T". El sedimento celular final se resuspendió en medio "Skin-T" para el posterior análisis de citometría de flujo o estudios funcionales. Cuando se requería el recuento de células, los leucocitos se contaron en esta fase mediante; (1) tinción con azul tripán (0,4 %) (Life Technologies) y hemocitómetro, o (2) contador y analizador de células CASY® Modelo TT (Roche).

Dado que las muestras intestinales primarias eran más propensas a la contaminación, las biopsias adquiridas se lavaron primero en IMDM que contenía un 10 % de FCS, penicilina 500 U/ml, estreptomicina 500 pg/ml, gentamicina 100 pg/ml, Anfotericina B 12,5 pg/ml y metronidazol 5 pg/ml dos veces antes de triturarlas y colocarlas en rejillas. Los cultivos intestinales en rejillas crecieron en medios Gut-T (IMDM, FCS al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml, gentamicina 20 pg/ml, Metronidazol 1 pg/ml. Durante la primera semana de crecimiento también se usó anfotericina B 2,5 pg/ml, similar a la de la piel. El medio contenía IL-2 (100 Ul/ml) e IL-15 (20 ng/ml) y se cambiaba 3 veces por semana. Debido a que la estructura del intestino era más floja que la de la piel, los linfocitos podían ser recogidos después de una semana.

Expansión de células T y5 tisulares

Para la expansión de células T ^y§ derivadas de la piel humana, los linfocitos mixtos recogidos tras 3 o 4 semanas de cultivo en rejilla se lavaron en PBS, se centrifugaron y se volvieron a suspender en el medio 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RP-MI-1640; Life Technologies) con un 10% de suero bovino fetal inactivado con calor (Life Technologies), L-glutamina (292 pg/ml; Life Technologies), penicilina (100 unidades/ml; Life Technologies), estreptomicina (100 pg/ml; Life Technologies), ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico (HEPES; 0,01 M; Life Technologies), piruvato de sodio (1 mM; Life Technologies), medio esencial mínimo con aminoácidos no esenciales (MEM) (1X; Life Technologies) y 10 pl/l de 2-mercaptoetanol (Life Technologies)] a una densidad de 1 x 106/ml y complementado con IL-2 (100 Ul/ml) solo o IL-2 más IL-15 (20 ng/ml). Las células se sembraron a 2 x 105/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos (Corning) o a 2 x 106/pocillo en placas de 12 pocillos (Corning) para su expansión. Las células se controlaron diariamente mediante microscopía, se alimentaron con medios frescos y se añadieron citocinas 3 veces por semana. Cuando la confluencia era completa y los agregados celulares eran visibles, las células se dividieron 1:1 en pocillos y placas adicionales, respectivamente. Las células se cosecharon y se analizaron mediante citometría de flujo o se usaron para ensayos funcionales después de 7, 14 o 21 días, dependiendo del ensayo. Si se necesitaban células T y§ puras, las células se volvieron a suspender en 1 ml de tampón FACS (PBS con un 2 % de suero bovino fetal inactivado con calor y EDTA 0,01 M) y se tiñeron para el receptor de células T ap (Biolegend, clon IP26, 1:50) durante 30 minutos en la oscuridad y en hielo, y todas las células negativas se clasificaron usando un clasificador Aria con DIVA (BD Biosciences).

Cocultivo con fibroblastos

Para cada cultivo en rejilla establecido, se prepararon dos placas de Petri (100x25 mm, Corning) que se rayaron en varios lugares con un escalpelo. Se colocaron trozos de piel triturada sobre los arañazos. Después de 5 a 10 minutos de secado al aire, los trozos de piel se adhirieron normalmente a la placa y se añadieron 10 ml de medio Skin-T. Los medios se cambiaron una vez a la semana y los fibroblastos primarios se recogieron tras el tratamiento con ACCUTASE® (Life Technologies) después de 3 semanas de crecimiento. Los fibroblastos se sembraron en pocillos de 48 a 1x104 o en la cámara inferior de placas de 24 pocillos a 2x104 en el caso de los experimentos transwell. Después de 2 a 3 días, los fibroblastos alcanzaron la confluencia y se iniciaron los experimentos de cocultivo usando RPMI y las citocinas indicadas añadiendo 2x105 de linfocitos cutáneos mixtos en el caso de las placas de 48 pocillos, o 3x105 de linfocitos en el caso de las placas de 24 pocillos, pocillos de fondo y transwells.

Citometría de flujo

La citometría de flujo se realizó usando los siguientes anticuerpos, acoplados a los fluorocromos indicados: Ki-67-BV421, CD3-BV510, V51-PeVio770, TIM-3-PE, CD9-PE, CCR3-BV421, CD39-BV421. También se tiñeron todas las muestras para determinar la viabilidad, usando eFluor770NIR. Los anticuerpos comerciales se adquirieron en Biolegend o Miltenyi. El colorante de viabilidad (IR cercano) era de eBioscience. La tinción con Ki-67 se realizó en células fijadas y permeabilizadas usando el conjunto de tampones de tinción Foxp3 (eBioscience). Una vez finalizado cada experimento, la población celular se lavó en PBS y se dividió por la mitad. Las células se tiñeron con eFluor770 NIR para comprobar su viabilidad y se lavaron, seguido de TrueStain (Biolegend) para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos de tinción. La mitad de la muestra se tiñó para los marcadores de superficie indicados, mientras que la otra mitad se tiñó solo para los marcadores de linaje (CD3, V81) y con el control de isotipo equivalente para los marcadores de superficie usados. Esto significa que se usó el anticuerpo de isotipo de ratón coincidente conjugado con el mismo fluorocromo en la misma concentración. Los controles de isotipo no se unen a ningún antígeno humano conocido y, por lo tanto, indican una unión inespecífica o falsos positivos. Esto también se conoce como verdaderamente negativo. Cada histograma (oscuro) se muestra en comparación con su correspondiente control de isotipo (líneas discontinuas abiertas). Los resúmenes de los datos indican el porcentaje de células que se tiñeron de forma positiva para el marcador indicado en comparación y, por tanto, a un nivel superior al del isotipo. El análisis de los datos de citometría de flujo se realizó en FlowJo (versión 10.1).

Secuenciación de ARN

Las células T V81 de la piel humana y las células T V81 de la sangre humana (después de la expansión iniciada por el receptor de células T) se clasificaron (FACS), se centrifugaron y el sedimento celular se volvió a suspender en tampón RLT. El ARN se preparó usando el kit RNA-Micro-plus (QIAGEN). Las bibliotecas de ARN se generaron usando el kit KAPA Stranded RNA-seq con RiboErase (HMR) (KAPA BIOSYSTEMS). Se realizó una secuenciación de extremos emparejados en HiSeq 2500 (Illumina) usando química de ejecución rápida (longitud de lectura: 100 bp). Las lecturas de extremos emparejados de 101 pares de bases se alinearon y cuantificaron usando RSEM (v1.2.11) con Bowtie2. Las lecturas se alinearon con el transcriptoma humano, los valores de recuento se han transformado en log2 y se normalizaron por cuantiles.

Cuantificación de atocinas

Las células T V81 de la piel humana se estimularon con PMA e ionomicina o con mAb anti-CD3 unido a la placa (OKT3, 5 |jg/ml) durante 24 horas. Después se tomaron sobrenadantes y se analizaron con ProcartaPlex Human Cytokine & Chemokine Panel 1A (34 plex) de eBioscience. Los ensayos se analizaron con un Luminex FlexMap3D (Luminex Corp). Los datos se analizaron en Microsoft Excel, se muestra la media de 3 donantes (realizada por duplicado). Las barras de error indican la desviación típica.

Expansión de células T ^y5 derivadas de la sangre

Las células T ^y§ derivadas de la sangre dentro de las PBMCs solo pueden expandirse si se estimulan con ligandos del TCR (en el caso de V82, p. ej., IPP, HMBPP, bifosfonatos) (41, 42) o con complementación de anticuerpos para reticular el receptor TCR (mAbs) o la quinasa CD3 asociada al TCR (43). El mismo efecto de la reticulación del TCR también puede lograrse usando, lectinas tales como PHA. En ausencia de la adición de tales agentes estimulantes del TCR, las células T ^y§ de las PBMCs sobreviven durante varios días pero no se expanden y permanecen en su composición inicial de subconjuntos de células T con pequeñas variaciones.

La sangre de voluntarios sanos se usó para aislar las PBMCs mediante la estratificación de la sangre entera en Ficoll, seguido de una centrifugación a 400 g durante 20 minutos para separar los glóbulos rojos, el plasma sanguíneo y los monocitos/linfocitos blancos. Los glóbulos blancos se recogieron cuidadosamente a través de una tira y se lavaron cuatro veces en PBS frío. Las células se volvieron a suspender en medio RPMI-1640 (Life Technologies) con 10 % de suero fetal bovino inactivado con calor (Life Technologies), L-glutamina (292 jg/ml; Life Technologies), penicilina (100 unidades/ml; Life Technologies), estreptomicina (100 jg/ml; Life Technologies), ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico (HEPES; 0,01 M; Life Technologies), piruvato de sodio (1 mM; Life Technologies), medio esencial mínimo con aminoácidos no esenciales (MEM) (1X; Life Technologies) a una densidad de 1 x 106/ml y complementado con IL-2 (100 Ul/ml). Las células se transfirieron a una placa de 24 pocillos que se recubrió con un anticuerpo monoclonal pan ^y§ TCR (20 jg/ml, clon B1, Biolegend) 90 minutos antes de la transferencia de las células. Las células se cultivaron durante 14 días, los medios se cambiaron cada 2-3 días y se añadieron citocinas frescas. Al alcanzar la confluencia, las células se dividieron 1:1. En estas condiciones, después de 14 días, la población menor original de células T ^y6 está normalmente muy activada a través de su TCR (como indica la regulación positiva de CD69 y CD25) y se enriquece en gran medida con células T V82 principalmente, pero también con células T V51 (hasta un 30 % de todas las células T y§). Las células T V51 pueden aislarse posteriormente mediante FACS para el análisis funcional, fenotípico o genético.

Resultados

Las células T y5 humanas son abundantes en la piel, expresan un TCR que no es V52 y participan en la respuesta de vigilancia del estrés linfoide humano

Usando el protocolo de Clark (29), se usan muestras de piel humana residual complementadas con IL-2 e IL-15 para permitir el crecimiento de linfocitos residentes en tejidos en el transcurso de 3 semanas obteniendo una población de linfocitos con una promedio de 240.000 células por rejilla. En consonancia con informes anteriores (29), se pudo identificar distintos subconjuntos de linfocitos residentes en la piel, con la mayoría de las células expresando un TCR ap convencional, en su mayoría del tipo "TRM" residente en tejidos. En general, el 59,9 % (±8,6) de las células CD45+ eran CD4+, y el 18,3 % (±2,8) de las células T ap CD8+ con una fracción de células NK del 8,7 % (±3,6). De forma adicional, se descubrió una población sustancial de células T ^y§ (media de 8,513 % de células CD45+, ± 6,564 %) en nuestros donantes (FIGS 1A y 3D). Esta representación de subconjuntos de linfocitos tras el cultivo organotípico fue altamente reproducible en aproximadamente 100 donantes, y fue comparable con las muestras de piel recién digeridas, difiriendo solo en un ligero aumento de la población y§, pero de utilidad práctica, ofreciendo poblaciones de linfocitos mucho mayores y más puras en comparación con los protocolos de digestión de tejidos convencionales. De acuerdo con la bibliografía relativa a la compartimentación tisular de las células T ^y§ humanas basada en su cadena delta TCR, la mayoría de las células T y§ de la piel humana expresaban una cadena de TCR V81 emparejada con varias cadenas ^yidentificadas por citometría de flujo. Esto contrasta con la mayoría de las células T ^y§ de sangre periférica, que muestran un único heterodímero TCR específico de una cadena V82 unida a Vy9 y estaban prácticamente ausentes en las muestras de piel humana. Sin embargo, es importante señalar que un subgrupo sustancial no expresaba ni V81 TCR ni V82 TCR, evocando el nombre de células T y§ "doble negativas" (FIG. 1C).

Las células T y§ residentes en la piel cultivadas de este modo mostraron un fenotipo de memoria no diferenciado terminalmente que carecía de expresión de CD45RA y expresaba niveles variables de la molécula coestimuladora CCR7. Por paralelismo con las células T sistémicas convencionales, la fuerte expresión de la proteína de superficie CD69 junto con la expresión del receptor de muerte programada 1 (PD-1); niveles bajos a ausentes del receptor a de la IL-2 (CD25); y la falta de la molécula coestimuladora CD28 dibujan la imagen de células T previamente activadas o crónicamente activadas (FIG. 1D). En consonancia con su localización tisular, las células V81 y DN muestran la expresión de marcadores de migración tisular y cutánea, tales como CLA, CCR4, CCR8 e integrina aE (CD103 ) (véase la FIG. 7). Este conjunto de marcadores de migración dirigida tisular podría resultar beneficioso en un entorno de inmunoterapia. De forma adicional, las células T y§ residentes en la piel muestran altos niveles de expresión del receptor activador NKG2D (FIG. 2A), lo que implica un posible papel de estas células en la respuesta de vigilancia del estrés linfoide. Los ligandos de NKG2d , tales como MICA, MICB y ULBPs, respectivamente, son regulados positivamente por las células en respuesta al daño del ADN, la activación del receptor EGF y el estrés oxidativo y, por lo tanto, pueden permitir a las células T que expresan NKG2D identificar y erradicar las células estresadas o transformadas, manteniendo de este modo la homeostasis de los tejidos. En línea con este principio, se descubrió que las células T ^y§ residentes en la piel expandidas por el método de la invención se activan tras la exposición a ligandos recombinantes para el receptor de NKG2D (MICA, ULBP2) demostrando desgranulación según se mide por la regulación positiva de la proteína de membrana asociada a los lisosomas CD107a (FIG. 2A). Este rasgo de tipo innato fue exclusiva de las células T V81 y ^y§ DN, ya que otras células T residentes en tejidos (FIG. 2C) y las células T ^y§ sistémicas carecían de esta respuesta (FIG. 10B).

En general, las células T V81 y y§ DN activadas residentes en la piel ejecutaron un programa de citocinas proinflamatorias con sesgo TH1 (tinción positiva para IFN-y, TNF-a y GM-CSF) cuando fueron activadas por PMA/ionomicina o por ligandos de NKG2D, p. ej., la proteína MICA recombinante (FIGS. 2A y 2B), afirmando de este modo las respuestas de tipo innato de las células. De hecho, las respuestas a MICA fueron casi completamente abrogadas suprimidas al bloquear el receptor de NKG2D mediante un anticuerpo (FIGS. 2B y 2C).

Se sabe que las células T y§ secretan IL-17 en determinados entornos de enfermedad, tales como la psoriasis y en algunos tipos de tumores. Las células T ^y§ expandidas por el método de la invención producen un nivel bajo o nulo de IL-17 incluso tras una activación extensa (FIGS. 2B y 8). En cambio, las células T ap residentes en tejidos que expresan CD4 produjeron IL-17 tras la activación del TCR (FIG. 2B). Por lo general, las células T ap mostraron un repertorio de citocinas mucho más diverso en respuesta a la PMA/ionomicina en comparación con las células T V81 y D^{n y}§, que se limitaron a un programa sesgado TH1 asociado a la protección del huésped.

La separación del tejido provoca la activación y proliferación masiva de las células T ^y5 de tejido humano

Con el fin de seguir estudiando las células T ^y§ de tejido humano y su biología, se transfirieron linfocitos cutáneos mixtos a pocillos de cultivo celular y los complementaron con IL-2 para mantener la viabilidad en el tiempo. Cabe destacar que, se descubrió rápidamente que, por segregación de las células estromales y epiteliales presentes en el cultivo organotípico, las células T V81 mostraban únicamente signos de activación y proliferación sin ningún otro estímulo añadido. En menos de 7 días, las células T V81 y y§ DN regulaban de forma única y masiva el factor nuclear Ki-67 y aumentaban la expresión superficial del receptor a de IL-2 (CD25) (FIGS. 3B y 4B). Sorprendentemente, a lo largo de 3 semanas y únicamente en presencia de iL-2, las células T V81 y y§ DN derivadas del tejido superaron a todos los demás subconjuntos de células T, hasta representar el 65 % de todos los linfocitos de la piel, aumentando su número en una promedio de 127,18 veces, mientras que los linfocitos T ap solo se multiplicaron 5,21 veces (p=0,0124) según lo medido por el número absoluto de células (FIG. 3A). La IFM del factor nuclear asociado al ciclado celular KI-67 aumentó de 2664,5(± 1876,1) a 8457,7(±4574,2) en 14 días en las células T V81 y DN ^y§, mientras que en las células T ap, la IFM disminuyó de 592,8(±390,5) a 284,7(±140,1) en el mismo transcurso de tiempo (FIG. 3C). Este fenómeno de crecimiento selectivo de células T ^y§ residentes en la piel podría respaldarse aún más usando IL-15 recombinante adicional, que aumentó la viabilidad y el número total de linfocitos.

Las células T ^y5 de la piel son suprimidas activamente por los fibroblastos de forma dependiente del contacto

La sorprendente expansión de las células T V51+ y y§ DN descrita en el párrafo anterior nunca se produjo en los sistemas de cultivo organotípico en los que había un amplio crecimiento de fibroblastos. Por lo tanto, se cultivó fibroblastos autólogos para comprobar directamente si su cocultivo con células T V81 y ^y§ DN inhibiría la expansión de las células T. Después de un cultivo en rejilla de 3 semanas, se sembraron linfocitos cutáneos mixtos en pocillos que estaban vacíos o que contenían una monocapa confluente de fibroblastos previamente establecida, y en cada caso se complementó el medio con IL-2 exógena, para mantener el crecimiento de las células T. De forma adicional, se usó transwells que impedían que los linfocitos T entraran en contacto directo con los fibroblastos dentro de los mismos pocillos, pero les permitía ser influenciados por cualquier factor soluble producido por los fibroblastos. En 14 días de cocultivo, las células T V81 y y§ DN empezaron a proliferar en los pocillos en los que no había fibroblastos y en los que se impedía que las células T entraran en contacto directo con los fibroblastos. Como en el caso anterior, la proliferación de células T ap fue baja en todas las condiciones. Claramente, cuando se permitió a las células T el contacto directo con los fibroblastos, la tasa de crecimiento durante dos semanas de las células T V81 y ^y§ DN se redujo considerablemente, de 22,6 (EEM 8,07) veces en los pocillos sin contacto con los fibroblastos a 3,3 (EEM 0,17) veces (FIG. 4A). Esta inhibición mediada por el contacto se confirmó además por la ausencia de regulación positiva de CD25, Ki-67 y el factor de transcripción T-bet en V81 en el transcurso de 7 días en comparación con los linfocitos cultivados solos (FIG. 4B). Alguna forma de control del sistema inmunitario mediado por el tejido parece ser fundamental para mantener la homeostasis del tejido, ya que sin ello existiría la posibilidad de una inflamación persistente. La regulación supresiva de las células T V81 y y§ DN por los fibroblastos estromales parecía ser un ejemplo de dicho control.

En resumen, el fenotipo de las células T V81 y ^y§ DN residentes en la piel y sus sorprendentes potenciales funcionales son el reflejo de células T preactivadas que normalmente son mantenidas bajo control por sus fibroblastos dérmicos vecinos a través de un mecanismo dependiente del contacto que aún no se ha caracterizado. La inactivación de ese mecanismo liberando a las células T del contacto con los fibroblastos permite de forma selectiva la sorprendente expansión de las células T V81 y y§ DN, mientras que otras células T de la piel no se ven afectadas.

La liberación de la inhibición mediada por el contacto provoca una respuesta citotóxica de atocinas con sesgo TH1 por las células T V51 de la piel

Los linfocitos mixtos derivados de la piel se expandieron durante 14 días y se usó la clasificación celular asociada a la fluorescencia para separar las células T ap de las células T ^y§, lo que permitió obtener purezas de hasta el 90 %. Esas células altamente enriquecidas se depositaron en pocillos de cultivo celular a concentraciones de 150.000 células/pocillo en medio RPMI con un 10% de FCS, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes 24 horas más tarde y se evaluó la presencia de un amplio intervalo de citocinas efectoras mediante una matriz basada en LUMINEX®. De forma totalmente inesperada, la expansión de las células T y§ (provocadas únicamente por su separación de los fibroblastos) produjo espontáneamente grandes cantidades de citocinas asociadas a TH1, tales como IFN-^y(12.383,46 ± 16.618,90 pg/ml), GM-CSF (4.316,73 ± 4.534,96 pg/ml) y las quimiocinas proinflamatorias CCL4 (14.877,34 ± 10.935,64 pg/ml) y CCL3 (1.303,07 ± 757,23 pg/ml) (FIG. 5A).

Adicionalmente, las células produjeron grandes cantidades de IL-13 espontánea, asociada a las respuestas atópicas, durante la expansión y en contraste con las células T y§ recién aisladas derivadas de la piel y activadas por el TCR; otras citocinas se produjeron a niveles mucho más bajos o no se produjeron en absoluto, p. ej., la IL-17A (FIG. 8). Los altos potenciales efectores de las células pudieron incrementarse aún más tras la estimulación con MICA recombinante (ligando de NKG2D), con reticulación anti-CD3, o con PMA/ionomicina. Para evaluar el potencial citotóxico de las células T ^y6 expandidas contra las células diana malignas, se usó líneas celulares transformadas establecidas en experimentos de cocultivo de 24 horas. Las células T V51+ y ^y§ DN mostraron una actividad citotóxica muy elevada hacia las células Hela (cuello uterino) y Caco2 (colon), de forma dependiente de la dosis, muy superior a la de las células T ap de tejido convencionales (FIG. 5B). Adicionalmente, la citotoxicidad mediada por las células y§ pudo ser fuertemente inhibida mediante el bloqueo del receptor de NKG2D usando anticuerpos monoclonales solubles, lo que indica que este receptor está implicado, al menos en parte, en la vigilancia de los tumores por células T y§ derivadas de la piel humana desreprimidas. Es más, se confirmó el potencial citotóxico de estas células usando otras dianas: HCT1954, MDAMB231 (ambos carcinomas de mama) y ^hC^t116 (colon) (FIG. 9).

Células T y5 residentes en tejidos en el intestino humano

También se identificó una población de células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos que expresan un receptor de células T V51 en cultivos en rejilla derivados del colon humano (FIG. 6). En 3 donantes, se pudo expandir estas células usando los mismos métodos que se emplearon 15 para las células de la piel, en un espacio de tiempo de 4 a 5 semanas. Durante la expansión, las células T V51+ y y§ DN derivadas del colon mostraron un patrón similar de regulación positiva de Ki-67 tras su aislamiento del cultivo celular organotípico rico en fibroblastos. Del mismo modo, las células T V51+ y ^y§ DN residentes en el colon fueron fuertemente estimuladas por el suministro de ligandos para el receptor de NKG2D. Se ha informado anteriormente de que las células T y§ derivadas de la sangre están bien equipadas para ejecutar la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos a través de la expresión de c D16 demostrando una citotoxicidad mejorada dirigida contra un linfoma de linaje B positivo para CD20 cuando se combina con rituximab. De manera similar, la leucemia linfocítica crónica (LLC) y las células de cáncer de mama positivas para HER2 fueron destruidas con mayor eficacia cuando se dirigieron con anticuerpos monoclonales (31). Con el fin de evaluar el potencial de las células T V51 derivadas de la piel para dirigirse a células diana opsonizadas por anticuerpos, se comprobó los niveles de expresión de los tres receptores Fc asociados a IgG1 CD16, CD32 y CD64. Las células T V81 derivadas de la piel expresan niveles inferiores del receptor Fc CD16 pero muestran buenos niveles de expresión para el receptor IgG de alta afinidad CD64 (FIG. 11). Por lo tanto, las células T V81 derivadas de los tejidos pueden estar bien equipadas para ser usadas como adyuvantes de las terapias con anticuerpos monoclonales, tales como las terapias con CD20 o Her2, ya que serán guiadas por el anticuerpo hacia los lados de los tumores malignos y la metástasis, reconocerán las células tumorales opsonizadas y destruirán las dianas mediante ADCC.

REFERENCIAS

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para expandir in vitro células T y§ residentes en tejidos no hematopoyéticos, comprendiendo el método cultivar linfocitos obtenidos de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos en presencia de interleucina-15 (IL-15), en donde los linfocitos no están en contacto directo con las células estromales o epiteliales durante el cultivo, y en donde los linfocitos se cultivan en ausencia de un agonista de la vía de los receptores de células T añadido exógenamente.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los linfocitos no están en contacto directo con los fibroblastos durante el cultivo.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el método comprende cultivar los linfocitos obtenidos de tejido no hematopoyético de seres humanos o de animales no humanos en presencia de IL-2.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende cultivar linfocitos en ausencia de señales de activación o de coestimulación del TCR.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los linfocitos se cultivan en ausencia de células estromales o epiteliales.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde las células estromales o epiteliales se retiran antes del cultivo.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5,

donde los linfocitos se cultivan en ausencia de fibroblastos.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,

donde los fibroblastos se retiran antes del cultivo.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los linfocitos se cultivan en un medio de expansión de y§ que comprende IL-2 e IL-15.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el medio de expansión de ^y§ no activa ni coestimula los receptores de células T.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los linfocitos se han obtenido de la piel, el tracto gastrointestinal (p. ej., colon), tejido de glándula mamaria, pulmón, hígado, páncreas o próstata.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células T y§ son células que no son V52, tales como células V51 o células T ^y§ doble negativas (DN).