CN104789529A - 促进小鼠骨髓造血干细胞体外克隆形成及分化能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为促进小鼠骨髓造血干细胞体外克隆形成及分化能力的方法，在HSC细胞体外克隆形成及诱导定向分化实验中，血清质量是影响HSC扩增及生长状态的重要因素，本研究将原代细胞培养专用血清用于小鼠HSC克隆形成及定向分化实验，并与国内外四种胎牛血清进行了对比。采用免疫磁珠分离骨髓Lin-细胞，并进行集落形成实验，培养至14天，本血清可见疏松型集落形成，其他血清无集落形成。流式分析骨髓Lin-细胞向T细胞分化结果显示，其他血清培养至7天时，细胞死亡及凋亡严重，流式分析无法观察到细胞从DN2向DN4转化过程，而本血清培养至13天和20天时，骨髓Lin-细胞由DN2/DN3阶段逐渐向DN3/DN4阶段转化，动态显示HSC由造血前体细胞逐渐向T淋巴细胞转化的过程，本研究结果与国外相关文献报道一致，表明本血清具有促进HSC扩增及定向分化的生物学效应。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进小鼠骨髓造血干细胞体外克隆形成及分化能力的方法。
背景技术
造血干细胞(HSC)主要存在于骨髓、胚胎肝脏、脐带血及外周血中，是能分化发育成各系血细胞的最原始细胞，具有高度自我更新、扩增和定向分化的潜能。目前，HSC移植是血液系统疾病、肿瘤、先天遗传性等疾病最有效的治疗方法，因此，HSC的相关基础研究为人类干细胞的开拓应用奠定了理论基础。小鼠HSC的实验模型主要有体内造血重建、体外克隆形成及诱导定向分化等方法。在体外克隆形成及诱导定向分化等实验中，血清的质量是影响HSC扩增生长状况的重要因素，此类实验对血清的质量要求较高，采用何种血清培养HSC且成功诱导其定向分化是研究难点之一。
发明内容
针对上述研究领域，本发明提供了一种促进小鼠骨髓造血干细胞体外克隆形成及分化能力的方法，通过该方法可明显促进小鼠骨髓造血干细胞定向分化为T淋巴细胞。
本发明是通过以下技术方案实现的：
原代细胞培养专用血清在诱导骨髓造血干细胞(尤其是小鼠骨髓造血干细胞)定向分化为T细胞中的应用，所述原代细胞培养专用血清是通过以下方法制备得到的：将胎牛脐带血(无菌采集得到)室温静置12h后分离收集血清，将每头份血清依次进行内毒素、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体检测，将检测结果均为阴性的血清混合，0.1μm微孔滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存即可。
一种利用原代细胞培养专用血清诱导骨髓造血干细胞(尤其是小鼠骨髓造血干细胞)定向分化为T细胞的方法，步骤如下：
(1)OP9-DL1细胞用含10％(体积分数)胎牛血清的α-MEM培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×105个/mL，取1ml接种于12孔板中，当细胞融合率达80～90％时，吸弃上清，加入骨髓Lin-细胞(骨髓造血干细胞)，用含20％(体积百分数)原代细胞培养专用血清的IMDM培养基将骨髓Lin-细胞悬起，调整骨髓Lin-细胞终浓度为1×105个/mL，接入培养板中，加入终浓度为5ng/mL的FLT-3L和5ng/mL的IL-7，5％CO2、37℃细胞培养箱中培养；
(2)培养48h后，培养板中的Lin-细胞用移液器吹打后经400目筛网过滤至50mL离心管中，350g离心6min收集细胞沉淀；
(3)用含体积分数20％原代细胞培养专用血清的IMDM培养基悬起细胞沉淀，调细胞浓度为1×105个/mL，取2mL细胞悬液，接入新的OP9-DL1单细胞层，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5％CO2、37℃细胞培养箱中培养；
所述新的OP9-DL1单细胞层是通过以下方法制备得到的：OP9-DL-1细胞用含10％(体积分数)胎牛血清的α-MEM培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×105个/mL，取1ml接种于12孔板中，当细胞融合率达80～90％时，吸弃上清，即得；
(4)每3～4天更换一次新的OP9-DL1单细胞层(更换方式为步骤2、3所述的方法)，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5％CO2、37℃细胞培养箱中培养；培养13～20天，小鼠骨髓Lin-细胞即定向分化为T淋巴细胞，即得T淋巴细胞。
所述骨髓造血干细胞(小鼠骨髓造血干细胞)是通过以下方法得到的：
(一)骨髓单个核细胞的获取：
1)取新鲜处死的动物(小鼠)，分离四肢并剥离表皮后于1×PBS中，剪其双脚后用纱布包裹揉搓除去胫骨及股骨所粘附的肌肉组织；
2)将分离的胫骨及股骨用1×PBS清洗两遍，剪断两端使骨髓腔相通；
3)用注射器将骨髓腔中骨髓冲出，反复冲洗直至骨髓腔变白；
4)将冲出的骨髓细胞悬液过200目钢网，去除残余的骨组织或其他残渣；
5)细胞悬液收集到离心管中，1200rpm，10min，4℃离心，同样条件1×PBS再洗一次；
6)红细胞裂解液裂解红细胞，1×PBS洗一次，离心，细胞沉淀即为骨髓单个核细胞；
(二)免疫磁珠分选Lin-细胞：
1)将上述所获骨髓单个核细胞悬液离心，300g，10min，弃上清；
2)细胞沉淀每107细胞加入40uL PBE缓冲液；
3)每107细胞加入10uL生物素标记的抗体；
4)混匀，4～8℃孵育10min；
5)每107细胞加入30uLPBE缓冲液；
6)每107细胞加入20uL抗生物素磁珠；
7)混匀，4～8℃孵育15min；
8)离心：300g，10min，弃上清；
9)每108细胞加入500uLPBE缓冲液；
10)进行磁珠分选，流出的细胞为Lin-细胞。
本发明采用原代细胞培养专用血清用于小鼠骨髓HSC克隆形成及定向分化实验，并与国内外几种商品化的胎牛血清进行了对比，成功得到了定向分化的T细胞，并发现原代细胞培养专用血清在小鼠骨髓HSC克隆形成和定向分化实验中促细胞增殖的生物学效应均优于其他胎牛血清，提示此类血清的研发在该研究领域具有广泛的应用价值。
附图说明
图1：OP9-DL1细胞的细胞融合率达到80～90％时的示意图。
图2：原代细胞培养专用血清培养的骨髓单个核细胞示意图(200×)，其中，A图、B图、C图、D图分别表示A组、B组、C组、D组的骨髓单个核细胞示意图。
图3：Front胎牛血清培养的骨髓单个核细胞示意图(200×)，其中，A图、B图、C图、D图分别表示A组、B组、C组、D组的骨髓单个核细胞示意图。
图4：原代细胞培养专用血清培养的骨髓Lin-细胞示意图(100×)，其中，A图、B图、C图、D图分别表示A组、B组、C组、D组的骨髓Lin-细胞示意图。
图5：Front胎牛血清培养的骨髓Lin-细胞示意图(100×)，其中，A图、B图、C图、D图分别表示A组、B组、C组、D组的骨髓Lin-细胞示意图。
图6：Front胎牛血清培养的骨髓Lin-细胞向T细胞分化的流式分析示意图(培养7天)。
图7：原代细胞培养专用血清培养的骨髓Lin-细胞向T细胞分化的流式分析示意图，其中，A图：培养13天；B图：培养20天。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例 小鼠骨髓HSC克隆形成及定向分化实验
实验材料：
(1)动物：C57BL/6J小鼠，6周龄，雄性，购自北京华阜康公司。
(2)试剂：
小鼠重组细胞因子SCF；IL-3；GM-CSF；M-CSF；IL-7和FLT-3L购自Pepro Tech公司，按照说明书要求，浓度配制为1ng/μL。
血清：Gibco(美国)胎牛血清；Bovogen(澳大利亚)胎牛血清；Front(美国)胎牛血清；四季青(杭州)胎牛血清；原代细胞培养专用血清(济南劲牛生物科技有限公司制备，制备方法：无菌采集胎牛脐带血，室温静置12h后分离收集血清，将每头份血清依次进行内毒素、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体检测等，将检测结果均为阴性的血清混合，0.1μm微孔滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存即可)。
α-MEM及IMDM培养基(Gbico公司)按说明书配制。
甲基纤维素(sigma公司)，加入双蒸水搅拌溶解，浓度为3％(V/V)，常规高压灭菌。
流式抗体：PE-anti-Mouse CD25(clone：PC61.5)、APC-anti-Human/Mouse CD44(clone：IM7)，均购自eBioscience公司。
免疫磁珠Lin-细胞分选试剂盒购自德国美天旎公司，0.5％PBE缓冲液(PH7.2):由1xPBS和0.5％BSA(Sigma公司)、2mMEDTA(Sigma公司)配制而成。
OP9-DL1细胞来源于OP/OP小鼠，由清华大学肿瘤免疫学实验室提供。
OP9-DL1细胞或共孵育培养基配方：血清(Front胎牛血清)56℃热灭活30min，取50mL血清加入到450mLα-MEM培养基中。
FACSCalibur型流式细胞仪：BD公司。
实验方法：
(一)骨髓单个核细胞的获取：
1)眼球摘除放血法处死小鼠，分离小鼠四肢并剥离表皮后于1×PBS中，剪其双脚后用纱布包裹揉搓除去胫骨及股骨所粘附的肌肉组织。
2)将分离的胫骨及股骨用1×PBS清洗两遍，剪断两端使骨髓腔相通。
3)用1mL注射器将骨髓腔中骨髓冲出，反复冲洗直至骨髓腔变白。
4)将冲出的骨髓细胞悬液过200目钢网，去除残余的骨组织或其他残渣。
5)细胞悬液收集到50mL离心管中，1200rpm，10min，4℃离心，同样条件1×PBS再洗一次。
6)红细胞裂解液裂解红细胞，1×PBS洗一次，离心，细胞沉淀即为小鼠骨髓单个核细胞，镜下细胞计数。
(二)免疫磁珠分选Lin-细胞：
1)将所获小鼠骨髓单个核细胞悬液离心，300g，10min，弃上清。
2)细胞沉淀每107细胞加入40uL PBE缓冲液。
3)每107细胞加入10uL生物素标记的抗体。
4)混匀，4～8℃孵育10min。
5)每107细胞加入30uLPBE缓冲液。
6)每107细胞加入20uL抗生物素磁珠。
7)混匀，4～8℃孵育15min。
8)离心：300g，10min，弃上清。
9)每108细胞加入500uLPBE缓冲液。
10)进行磁珠分选。流出的细胞即为Lin-细胞。
(三)骨髓单个核细胞集落形成实验：
1)分别用含20％(体积分数)Gibco胎牛血清、Bovogen胎牛血清、Front胎牛血清、四季青胎牛血清、原代细胞培养专用血清的2×IMDM培养基将经免疫磁珠分选获取的单个核细胞悬起，调细胞终浓度为2×105个/mL，根据分组加入不同的细胞因子混匀(每组加入的细胞因子情况见下述步骤)，细胞悬液与等体积的3％甲基纤维素混匀。
2)将上述细胞悬液，接种到12孔板中，每孔2mL，细胞终浓度为1×105个/mL。分组：A、con；B、SCF+FLT-3L；C、SCF+IL-3+FLT-3L+GM-CSF；D、SCF+IL-3+FLT-3L+M-CSF；每组2复孔，37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞因子浓度为SCF：20ng/mL；FLT-3L：10ng/mL；IL-3：10ng/mL；GM-CSF：20ng/mL；M-CSF：20ng/mL。
3)每天镜下观察克隆形成情况并拍照。
(四)Lin-细胞集落形成实验
1)分别用含20％(体积分数)Front胎牛血清、原代细胞培养专用血清的2×IMDM培养基将经免疫磁珠分选获取的Lin-细胞悬起，调细胞终浓度为2×105个/mL，根据分组加入不同的细胞因子混匀(每组加入的细胞因子情况见下述步骤)，细胞悬液与等体积的3％甲基纤维素混匀。
2)将上述细胞悬液，接种到12孔板中，每孔2mL，细胞终浓度为1×105个/mL。分组：A、con；B、SCF+FLT-3L；C、SCF+IL-3+FLT-3L+GM-CSF；D、SCF+IL-3+FLT-3L+M-CSF；每组2复孔，37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞因子浓度为SCF：20ng/mL；FLT-3L：10ng/mL；IL-3：10ng/mL；GM-CSF：20ng/mL；M-CSF：20ng/mL。
3)每天镜下观察克隆形成情况并拍照。
(五)骨髓Lin-细胞与OP9-DL1共孵育：
1)在共孵育之前24h，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×105个/mL，取1ml接种于12孔细胞培养板(OP9-DL1常规用含10％体积分数Front胎牛血清的α-MEM培养基培养)中，当细胞融合度达到80％时(图1)，OP9-DL1细胞上清吸弃，进行骨髓Lin-细胞与OP9-DL1共孵育实验。
2)将2x106个经免疫磁珠分选获取的Lin-细胞分别悬浮于含20％(V/V)Front血清的IMDM培养基，及含20％(V/V)原代细胞专用血清的IMDM培养基中混匀，调细胞浓度为1x105个/mL，取2mL细胞悬液，接入上述吸弃上清后的OP9-DL1细胞，加入培养板中，加入FLT-3L(5ng/mL)和IL-7(5ng/mL)，5％CO2、37℃细胞培养箱中培养。
3)培养48h，将培养板中扩增的Lin-细胞用移液器吹打后经400目筛网过滤至50mL离心管中(去除OP9-DL1细胞)，350g离心6min收集细胞沉淀。
4)分别用上述2)两种含不同血清的培养基将细胞悬起，调细胞浓度为1x105个/mL，取2mL细胞悬液，接入新的融合率达80％的OP9-DL1单细胞层，将2mL细胞悬液加入各孔中，并补充FLT-3L(5ng/mL)和IL-7(5ng/mL)。
所述新的OP9-DL1单细胞层是通过以下方法制备得到的：OP9-DL1细胞用含10％(体积分数)胎牛血清(Front胎牛血清)的α-MEM培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×105个/mL，取1ml接种于12孔板中，当细胞融合率达80％时，吸弃上清，即得；
5)每3～4天更换一次新的OP9-DL1单细胞层以扩增Lin-细胞，并加入FLT-3L(5ng/mL)和IL-7(5ng/mL)。
(六)流式细胞仪观察骨髓Lin-细胞向T细胞的分化：
1)将细胞培养板中的骨髓Lin-细胞经400目筛网过滤，收集于流式管内。
2)350g离心6min收集细胞沉淀，混匀，加入10μL大鼠血清，4℃封闭30min。
3)加入0.3μL PE-anti-Mouse CD25和0.3μL APC-anti-Human/Mouse CD44抗体，避光，4℃孵育30min。
4)加入2mL 1xPBS，350g离心6min，洗去未结合的抗体。
5)加入适量1xPBS悬起细胞沉淀，上机检测。
结果：
(一)不同血清对骨髓单个核细胞集落形成能力的影响
图2、图3显示骨髓单个核细胞培养至7天时，镜下观察Gibco胎牛血清、Bovogen胎牛血清、Front胎牛血清、四季青胎牛血清和原代细胞培养专用血清组对集落形成的影响(图2为原代细胞培养专用血清培养组，图3为Front胎牛血清培养组，Gibco胎牛血清、Bovogen胎牛血清和四季青胎牛血清培养组细胞状态与Front胎牛血清培养组相似，图略)，SCF+IL-3+FLT-3L+GM-CSF和SCF+IL-3+FLT-3L+M-CSF组合(C组、D组)中，前四种血清每孔一般可见50个左右集落，集落中细胞数多为50到200个左右，原代专用血清每孔可见80个左右集落，且后者集落比前者大，集落中细胞数多为300个以上，后者集落中细胞与前者相比形态饱满、透明度高、生长状态良好，五种血清组集落类型多为粒系或巨噬系(CFU-GM)。
(二)两种血清对骨髓Lin-细胞集落形成能力的影响
Lin是Lineage(系)的缩写，Lin-细胞是指HSC还没有定向分化为红系、髓系、巨核和淋巴系细胞的造血前体细胞，经免疫磁珠分选试剂盒分离后的Lin-细胞可达95％以上，极大的富集了目的细胞，图4显示，Lin-细胞扩增至14天时，原代培养专用血清组可见细胞集落形成，此集落中细胞较分散，未见明显的血岛样结构，但细胞状态良好。图5显示，Front血清组未形成明显的集落且细胞碎片较多、状态较差。表明原代细胞专用血清对Lin-细胞具有较强的促增殖效应。
(三)骨髓HSC向T细胞分化的流式分析
OP9-DL1细胞具有分泌IL-2、IL-7等细胞因子的功能，可作为骨髓HSC的滋养细胞，本发明采用OP9共孵育体系进一步诱导HSC细胞由造血前体细胞向T细胞方向的转化实验。
采用Front血清配制的培养基进行共孵育实验，骨髓单个核细胞只能培养到7天左右，继续培养细胞停止增殖，死亡或凋亡细胞明显增加，故仅能在第7天进行细胞的流式分析(图6)。
采用原代细胞培养专用血清配制的培养基进行共孵育实验，骨髓单个核细胞状态良好，增殖明显。图7显示，在IL-7和FLT-3L的诱导下，培养至第13天和20天，HSC逐渐由造血前体细胞向T细胞转化(即细胞从DN2/DN3阶段向DN3/DN4转化，DN1：CD44+CD25-，DN2：CD44+CD25+，DN3：CD44-CD25+，DN4：CD44-CD25-)，本研究结果与国外相关文献(参考文献：Wang H,Pierce LJ,Spangrude GJ.Distinct roles of IL-7 and stem cell factor in theOP9-DL1 T-cell differentiation culture system.Exp Hematol 2006；34:1730-40.)报道类似，提示原代细胞培养专用血清与其他胎牛血清相比更适合于HSC的扩增与诱导转化。
Claims (5)
1.原代细胞培养专用血清在诱导小鼠骨髓造血干细胞(HSC)定向分化为T细胞中的应用，其特征在于：所述原代细胞培养专用血清是通过以下方法制备得到的：将胎牛脐带血室温静置12h后分离收集血清，将每头份血清依次进行内毒素、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体检测，将检测结果均为阴性的血清混合，0.1μm微孔滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存即可。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述骨髓HSC为小鼠骨髓HSC。
3.一种利用原代细胞培养专用血清诱导骨髓造血干细胞定向分化为T细胞的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)OP9-DL1细胞用含10％(体积分数)胎牛血清的α-MEM培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×105个/mL，取1ml接种于12孔板中，当细胞融合率达80～90％时，吸弃上清，加入经免疫磁珠分选后的骨髓Lin-细胞，用含20％(体积百分数)原代细胞培养专用血清的IMDM培养基将骨髓Lin-细胞悬起，调整骨髓Lin-细胞终浓度为1×105个/mL，接入培养板中，加入终浓度为5ng/mL的FLT-3L和5ng/mL的IL-7，5％CO2、37℃细胞培养箱中培养；
(2)培养48h后，培养板中的细胞用移液器吹打后经400目筛网过滤至50mL离心管中，350g离心6min收集细胞沉淀；
(3)用含20％原代细胞培养专用血清的IMDM培养基悬起细胞沉淀，调细胞浓度为1×105个/mL，取2ml细胞悬液，接入新的OP9-DL1单细胞层，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5％CO2、37℃细胞培养箱中培养；
所述新的OP9-DL1单细胞层是通过以下方法制备得到的：OP9-DL1细胞用含10％(体积分数)胎牛血清的α-MEM培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×105个/mL，取1ml接种于12孔板中，当细胞融合率达80～90％时，吸弃上清，即得；
(4)每3～4天更换一次新的OP9-DL1单细胞层，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5％CO2、37℃细胞培养箱中培养；培养13～20天，骨髓Lin-细胞即定向分化为T淋巴细胞，即得T细胞；
所述原代细胞培养专用血清是通过以下方法制备得到的：将胎牛脐带血室温静置12h后分离收集血清，将每头份血清依次进行内毒素、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体检测，将检测结果均为阴性的血清混合，0.1μm微孔滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存即可。
4.根据权利要求3所述的用原代细胞培养专用血清诱导骨髓造血干细胞定向分化为T细胞的方法，其特征在于：所述骨髓造血干细胞是通过以下方法得到的：
(一)骨髓单个核细胞的获取：
1)取新鲜处死的动物，分离四肢并剥离表皮后于1×PBS中，剪其双脚后用纱布包裹揉搓除去胫骨及股骨所粘附的肌肉组织；
2)将分离的胫骨及股骨用1×PBS清洗两遍，剪断两端使骨髓腔相通；
3)用注射器将骨髓腔中骨髓冲出，反复冲洗直至骨髓腔变白；
4)将冲出的骨髓细胞悬液过200目钢网，去除残余的骨组织或其他残渣；
5)细胞悬液收集到离心管中，1200rpm，10min，4℃离心，同样条件1×PBS再洗一次；
6)红细胞裂解液裂解红细胞，1×PBS洗一次，离心，细胞沉淀即为小鼠骨髓单个核细胞；
(二)免疫磁珠分选Lin-细胞：
1)将上述所获小鼠骨髓单个核细胞悬液离心，300g，10min，弃上清；
2)细胞沉淀每107细胞加入40uL PBE缓冲液；
3)每107细胞加入10uL生物素标记的抗体；
4)混匀，4～8℃孵育10min；
5)每107细胞加入30uLPBE缓冲液；
6)每107细胞加入20uL抗生物素磁珠；
7)混匀，4～8℃孵育15min；
8)离心：300g，10min，弃上清；
9)每108细胞加入500uLPBE缓冲液；
10)进行磁珠分选，流出的细胞为Lin-细胞。
5.根据权利要求3或4所述的用原代细胞培养专用血清诱导骨髓造血干细胞定向分化为T细胞的方法，其特征在于：所述骨髓造血干细胞为小鼠骨髓造血干细胞。
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