CN102268401A - 一种去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新生牛血清的生产方法，特别是一种能去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法。本方法先后采用膜孔径为0.2-0.4微米、0.1-0.2微米以及0.01-0.05微米的陶瓷复合膜过滤新生牛血清。使用本方法过滤新生牛血清，能截流新生牛血清中的细菌、霉菌、支原体、细菌内毒素、免疫球蛋白等大分子物质，而新生牛血清中的血清白蛋白、小分子肽、氨基酸、微量元素等小分子物质被保留。过滤后的新生牛血清，免疫球蛋白去除率达100％，能够满足细胞生长的营养要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种新生牛血清的生产方法，特别是一种能去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法。
背景技术
新生牛血清是指出生14h之内的未吃初乳的犊牛血清，也有人称之为小牛血清或犊牛血清。新生牛血清具有丰富的营养物质，在细胞培养基中加入适量新生牛血清可以补充细胞生长所需的生长因子、激素、贴附因子等；新生牛血清还具有解毒作用，能解除脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性；此外，新生牛血清还具有抑制胰蛋白酶的作用，可以保护细胞免受机械损伤。因此，新生牛血清对细胞的生长有重要促进作用，是细胞培养基的重要组成部分。
牛血清中的免疫球蛋白(抗体)对细胞会产生毒性作用，如果新生牛血清含有大量免疫球蛋白(抗体)则会严重影响细胞的生长；其次，国内麻疹、风疹、腮腺炎、乙型脑炎、水痘、狂犬病等诸多病毒性疫苗均采用细胞培养法生产，细胞培养液中必须加入一定量新生牛血清，如果新生牛血清中有抗相应病毒的免疫球蛋白(抗体)存在，将会严重影响病毒性疫苗的质量。
目前，在新生牛血清产品生产领域，多数厂家只采取微滤除细菌、除支原体的工艺，所用微滤膜膜孔径为0.1～0.2微米范围。中国专利号92103702.3公开了无支原体新生牛血清生产工艺，在除菌过滤工序后，再使用0.08-0.12微米的滤膜进行过滤。由于微滤膜孔孔径较大，此工艺仅能够去除血清中的细菌、霉菌、支原体等微生物，但不能去除血清中的免疫球蛋白。
牛的胎盘屏障不能通过母源免疫球蛋白，健康新生牛如果不吃初乳，其血清中免疫球蛋白含量很低。但如果有传染因子进入时，新生牛血清中就会出现大量免疫球蛋白。以牛病毒性腹泻/黏膜病(BVDV/MDV)感染为例，母牛在妊娠期感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)时、在出生14h以内的新生牛血清中可以检出BVDV/MDV抗体。据有关调查资料报道，目前国内荷斯坦新生牛血清BVDV/MDV抗体平均阳性率分别达25％和30％。BVDV是细胞培养和生物制品的首要污染因素之一，BVDV与猪瘟病毒(CSFV)同属黄病毒科瘟病毒属，亲缘关系密切，在血清学上有交叉反应，新生牛血清中如有BVDV抗体存在，将严重影响猪瘟疫苗的效价和保护率。中国专利号200510042714.X公开了一种猪瘟疫苗生产用/牛病毒性腹泻病毒抗体阴性新生牛血清生产工艺，采用96孔细胞培养板，筛选出BVDV抗体阴性的粗制血清进行加工生产，此工艺BVDV抗体检测过程操作繁琐、耗材多、对每份血清都需要进行细胞培养检测，工作量大、生产成本高。该工艺对于新生犊牛来源集中、小批量生产新生牛血清尚可实施，而对于目前国内新生犊牛来源分散、需要大批量生产新生牛血清的现实情况，则很难实施。
发明内容
本发明的目的是针对上述方法提出的不足，提供了一种能耗低、操作简便、能去除免疫球蛋白并实现大批量生产的新生牛血清生产方法。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法，其工艺流程包括无菌采血，分离血清，膜过滤，所述膜过滤使用的膜为陶瓷复合膜。
所述陶瓷复合膜膜管由合肥世杰膜工程有限责任公司提供。
所述陶瓷复合膜材质为氧化锆、氧化铝和氧化钛。
所述陶瓷复合膜的性能参数分别为①耐压强度：1.0Mpa；②适用pH值：0-14；③适用温度：-10℃-650℃。
所述膜过滤包括三道过滤工序，按以下先后步骤进行：
①将分离血清后得到的新生牛血清用膜孔径0.2-0.4微米的陶瓷复合膜进行第一次过滤，去除新生牛血清融冻时形成的凝固物；过滤前先将膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度115℃-125℃、压力0.1Mpa-0.15Mpa条件下灭菌20-30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤过程中，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40℃，将第一次过滤收集得到的新生牛血清滤液立即进行第二次过滤；
②第二次过滤用膜孔径0.1-0.2微米的陶瓷复合膜进行过滤，去除牛血清中的细菌、霉菌、支原体等大分子物质；过滤前将膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度115℃-125℃、压力0.1Mpa-0.15Mpa条件下灭菌20-30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤过程中，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40℃，将第二次过滤收集得到的新生牛血清滤液立即进行第三次过滤；
③第三次过滤用膜孔径0.01-0.05微米的陶瓷复合膜进行过滤，去除牛血清中的免疫球蛋白；过滤前将膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度115℃-125℃、压力0.1Mpa-0.15Mpa条件下灭菌20-30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤过程中，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40℃；过滤收集得到的血清滤液即为无免疫球蛋白的新生牛血清，其免疫球蛋白去除率达100％。
第一次过滤优选膜孔径0.2微米的陶瓷复合膜。
第二次过滤优选膜孔径0.1微米的陶瓷复合膜。
第三次过滤优选膜孔径0.05微米的陶瓷复合膜。
该方法在细胞培养用新生牛血清、小牛血清、犊牛血清或胎牛血清生产的应用。
本发明的有益效果是：
1.本发明根据新生牛血清白蛋白和免疫球蛋白两组蛋白质的分子大小存在差异的特点(新生牛血清白蛋白的平均分子量约75-65kD；免疫球蛋白IgG平均分子量为150kD、IgM分子量为1000kD、IgA分子量为400kD)，采用膜孔孔径0.01-0.05微米的陶瓷复合膜过滤新生牛血清，可以将新生牛血清中的白蛋白和免疫球蛋白分离。经陶瓷复合膜过滤后的新生牛血清，去除了对细胞生长有害的免疫球蛋白，保留了对细胞生长有益的血清白蛋白、小分子肽、氨基酸、微量元素等小分子物质。
2.本发明使用陶瓷复合膜过滤，无需对每份血清都进行细胞培养检测，能耗低，操作简便，可实现无免疫球蛋白新生牛血清的大批量生产。
3.本发明所使用的陶瓷复合膜是以无机陶瓷材制备而成的非对称膜，具有耐酸、耐碱、耐高温的特点，膜管能承受高温和高压、通过蒸汽高温高压消毒，能够杀死存在于膜管的细菌及芽孢，可避免过滤血清时由膜管造成的污染。同时，陶瓷复合膜管的抗污染能力强，分离过程中无二次溶出物产生，不会造成血清异物污染。陶瓷复合膜管还具有机械强度大，不会发生膜孔溶涨而导致截留性能的变化，膜再生性能好，清洗后膜通量恢复稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
实施例：
1.新生牛血清采集：
首先对新生牛血清来源的牛群进行健康状况调查，选择无特定病原的黑白花奶牛生下的健康新生公牛(新生公牛不能吃初乳)，通过无菌手术的方法在新生公牛颈静脉采血，将采集到的新生牛血液用大容量冷冻离心机分离血清，将分离得到的牛血清置-20℃冷冻保存备用。
2.新生牛血清过滤：
将冷冻保存的新生牛血清解冻后进行过滤。
①第一次过滤新生牛血清，选取膜孔径0.2微米、膜管面积0.5m2的陶瓷复合膜过滤装置，膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度120℃、压力0.1MPa条件下灭菌30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤时，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40℃；将收集得到的滤液立即进行第二次过滤。
②第二次过滤新生牛血清，选取膜孔径0.1微米、膜管面积0.5m2的陶瓷复合膜过滤装置，膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度120℃、压力0.1MPa条件下灭菌30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤时，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40℃；将收集得到的滤液立即进行第三次过滤。
③第三次过滤新生牛血清，选取孔径0.05微米、膜管面积0.5m2的陶瓷复合膜过滤装置，膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度120℃、压力0.1MPa条件下灭菌30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤时，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40℃；收集得到的滤液为无免疫球蛋白新生牛血清。
3.膜过滤后的新生牛血清产品检测
感官判断：
取新生牛血清样品透光观察新生牛血清液体有无混有异物及判断液体澄明度，衬白色背景观察新生牛血清样品颜色，注意有无溶血。
无菌检验：
(1)需氧菌的检测：抽取8份新生牛血清样品，将新生牛血清接种于含5％鲜兔血酪胨琼脂斜面2支，每支接种新生牛血清0.2毫升，1支置于37℃，1支置于25℃；另用1支葡萄糖蛋白胨水(G.P)，接种0.2毫升，置25℃，均培养5天，观察有无细菌生长。
(2)厌氧菌的检测：抽取8份新生牛血清样品，将新生牛血清接种于厌气肉肝汤1支，接种新生牛血清0.2毫升，置于37℃培养3天，观察有无菌生长。
支原体检测：
抽取8份新生牛血清样品，将新生牛血清接种于改良Frey氏液体培养瓶2管，每瓶含培养液10毫升，接种新生牛血清0.2毫升，放37℃培养，每天观察有无颜色变化。如在5-7天内未见变化再从培养瓶取0.5毫升接种于含培养液30毫升的培养瓶中，37℃培养观察，如此重复3次，若无变化则在最后一次接种的培养管经14天观察，若无颜色变化为无支原体污染血清。
细菌内毒素检测：
抽取3份新生牛血清样品，使用厦门市鲎试剂试验厂生产的内毒素检测试剂盒(终点显色法)检测新生牛血清内毒素含量。
免疫球蛋白含量测定：
抽取3份新生牛血清样品，使用南京建成生物工程研究所提供的血清总蛋白质含量检测试剂盒(双缩脲法)和血清白蛋白含量检测试剂盒(溴甲酚绿法)，分别检测新生牛血清总蛋白质含量和新生牛血清白蛋白含量。血清免疫球蛋白含量＝血清总蛋白质含量-血清白蛋白含量。
牛病毒性腹泻/黏膜病(BVDV/MDV)抗体检测：
抽取3份新生牛血清样品，使用IDEXX公司提供的HerdChek牛病毒性腹泻抗体检测试剂盒(ELISA法)检测牛病毒性腹泻/黏膜病(BVDV/MDV)抗体。
细胞生长曲线峰值检测：
(1)取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数。
(2)将细胞以2×104浓度接种于2个24孔板，分别用含10％新生牛血清血清的DMEM，37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下进行培养。
(3)24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3孔细胞，分别进行计数。计算平均值，连续计数8d。
(4)根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。
细胞倍增时间检测：
按生长曲线计算细胞的倍增时间。取细胞峰值前一天计得的数(Y)、接种细胞数(X)及生长时间(T)计算。
倍增时间＝T/A A＝log2Y/X
细胞克隆率检测：
(1)取对数生长期SP2/0细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，待细胞收缩变圆，用吸管吹打，制成单个细胞悬液。
(2)对细胞计数，并对其倍数稀释。
(3)进一步稀释，使浓度为10细胞/ml。
(4)将细胞接种于两块96孔板，每孔加入0.1ml，分别用含10％小牛血清和胎牛血清的DMEM进行培养。
(5)24h后用显微镜观察各孔细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并进行记录。
(6)对标记孔进行观察并持续培养。
(7)培养两周后，记数含单克隆的培养孔数。
克隆率＝含单克隆培养孔数目/培养24h含单个细胞的培养孔数目×100％
4.膜过滤后的新生牛血清检测结果
外观性状：淡黄色澄明液体、无溶血
无菌检验：无需氧菌和厌氧菌生长
支原体检测：无支原体污染
细菌内毒素检测：细菌内毒素＜0.1Eu/ml
免疫球蛋白含量：免疫球蛋白含量＜0.01mg/ml
牛病毒性腹泻/黏膜病(BVDV/MDV)抗体：阴性
细胞最大浓度：1.86×106
SP2/0细胞倍增时间：3.12h
单克隆效率：50/66×100％＝75.8％
Claims (9)
1.一种去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法，其工艺流程包括无菌采血，分离血清和膜过滤，其特征是：所述膜过滤采用的膜为陶瓷复合膜。
2.根据权利要求1所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法，其特征是：所述膜过滤包括三道过滤工序，按以下先后步骤进行：
①将分离血清后得到的新生牛血清用膜孔径0.2-0.4微米的陶瓷复合膜进行第一次过滤；
②将第一次过滤后得到的新生牛血清用膜孔径0.1-0.2微米的陶瓷复合膜进行第二次过滤；
③将第二次过滤后得到的新生牛血清用膜孔径0.01-0.05微米的陶瓷复合膜进行第三次过滤，所得滤液即为无免疫球蛋白的新生牛血清。
3.根据权利要求2所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法，其特征是：第一次过滤用膜孔径0.2微米的陶瓷复合膜；第二次过滤用膜孔径0.1微米的陶瓷复合膜；第三次过滤用膜孔径0.05微米的陶瓷复合膜。
4.根据权利要求2所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法，其特征是：第一次过滤前先将膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度115℃-125℃、压力0.1Mpa-0.15Mpa条件下灭菌20-30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤过程中，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40℃。
5.根据权利要求2所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法，其特征是：第二次过滤前将膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度115℃-125℃、压力0.1Mpa-0.15Mpa条件下灭菌20-30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤过程中，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40℃。
6.根据权利要求2所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生产方法，其特征是：第三次过滤前将膜管置高温蒸汽压力灭菌锅内，在蒸汽温度115℃-125℃、压力0.1Mpa-0.15Mpa条件下灭菌20-30分钟，待膜管冷却至常温时过滤新生牛血清，过滤过程中，调节回流管阀门控制回流液流量，使膜管进口流体压力与出口流体压力差保持在0.2MPa，流体温度≤40℃。
7.根据权利要求1所述的去除新生牛血清免疫球蛋白的方法，其特征是：所述陶瓷复合膜材质为氧化锆、氧化铝和氧化钛。
8.根据权利要求1所述的去除新生牛血清免疫球蛋白的方法，其特征是：所述陶瓷复合膜的性能参数分别为①耐压强度：1.0Mpa；②适用pH值：0-14；③适用温度：-10℃-650℃。
9.根据权利要求1所述的去除新生牛血清免疫球蛋白的方法，其特征是：该方法在细胞培养用新生牛血清、小牛血清、犊牛血清或胎牛血清生产中的应用。
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