CN101024824A - 一种从生物样品中将登革病毒灭活和去除的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从含有登革病毒和至少一种目标生物分子的样品中将登革病毒灭活和去除的方法。其主要特征在于:单独使用有机溶剂或与非离子去污剂联用,进行登革病毒的灭活处理,然后通过阳离子交换层析法将登革病毒与目标生物分子实际上分开。另一方面,本发明还提供了一种基本上不附带传染性登革病毒的人血浆白蛋白的生产方法。本发明的方法可有效地去除登革病毒,以避免外源病毒或其遗传物质输入人体内所可能引发病毒感染或免疫反应的风险。本发明方法简单、经济、高效。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒的灭活和去除方法,尤其是从生物样品中将登革病毒灭活和去除的方法。
背景技术
登革病毒(Dengue virus)属于黄病毒科,形态结构与乙脑病毒相似,但体积较小,约40~50nm,依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型,同一型中不同毒株也有抗原差异。其中2型传播最广泛,各型病毒间抗原性有交叉,与乙脑病毒和西尼罗病毒也有部分抗原相同。病毒在蚊体内以及白纹伊蚊传代细胞(C6/36细胞)、猴肾、地鼠肾原代和传代细胞中能增殖,并产生明显的细胞病变。
登革病毒感染引起登革热。该病流行于热带、亚热带地区,特别是东南亚、西太平洋及中南美洲。我国于1978年在广东佛山首次发现本病,以后在海南岛及广西等地均有发现。
人对登革病普遍易感。潜伏期约3~8天。病毒感染人后,先在毛细血管内皮细胞及单核巨噬细胞系统中复制增殖,然后经血流扩散,引起发热、头痛、乏力,肌肉、骨骼和关节痛,约半数伴有恶心、呕吐、皮疹或淋巴结肿大。部分病人可于发热2~4天后症状突然加重,发生出血和休克。临床上根据上述症状可将登革热分为普通型和登革出血热/登革休克综合征二个类型。后者多发生于再次感染异型登革病毒后,其基本病理过程是异常的免疫反应,它涉及病毒抗原-抗体复合物、白细胞和补体系统,病情较重,病毒率高。
登革病毒经蚊(主要是埃及伊蚊)传播,全球每年有五千万至一亿人感染登革病毒,而此经蚊子传播的疾病还在稳步增长。登革病毒能在含有蛋白的液体(如血液)中持久生存,因而能通过血液或血制品传播。如不加以控制,这将会是一个严重的公共卫生问题。
美国专利5,808,011公开了应用层析法去除朊病毒的方法。美国专利6,468,733公开了应用有机溶剂/去污剂法联合纳米过滤法灭活病毒的方法。美国专利申请10/220,929公开了应用阳离子交换层析法吸附免疫球蛋白的生产方法,而所得的免疫球蛋白组分可能带有病毒因而需要进行病毒灭活处理。上述这些方法都没有经过登革病毒的去除验证,因而从未被应用于登革病毒去除的实际操作中。
经血液传播的病原体(如登革病毒)是血液或血制品生产中令人特别关注的问题。一袋受病原污染的血浆,如果混入大生产的血浆库中就有可能将疾病传播给众多的血制品使用者。因此,有必要提供一种能够有效去除登革病毒的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种从生物样品中将登革病毒灭活和去除的方法。
本发明是一种从含有至少一种目标生物分子的生物样品中将登革病毒灭活和去除的方法。该方法包括如下步骤:(1)应用至少一种有机溶剂有效地灭活登革病毒;(2)通过阳离子交换层析法将登革病毒与目标生物分子实际上分开。
步骤(1)可用的有机溶剂选自磷酸三正丁酯、磷酸三叔丁酯、磷酸三正己酯、磷酸三乙基己酯或磷酸三正癸酯中的一种或多种。
上述步骤(1)的有机溶剂作用是灭活脂包膜病毒,此时有机溶剂可与非离子型去污剂一起联合使用。所述的去污剂选自辛基酚聚氧乙烯醚、辛基-β-硫代毗喃葡萄糖苷或聚氧乙烯山梨醇单油酸酯中的一种或多种。该步骤(1)的优选情况是以重量百分比浓度为0.1%~2.0%的磷酸三正丁酯,联合以重量百分比浓度为0.1%~5.0%的辛基酚聚氧乙烯醚一起使用。优选的病毒灭活条件是在1℃~50℃下处理至少一小时。
上述步骤(2)可通过任何层析树脂实现。该树脂的一些非限制性例子是硅胶、氧化铝、钛多聚阳离子、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及带阳离子基团的多聚体。优选情况是,该阳离子交换层析选用带有羧甲基基团的交联琼脂糖,并且该步骤(2)包括在pH4.0±0.5范围内进行层析柱的预平衡和上样、在pH7.0±0.5范围内进行层析柱的清洗以及在pH9.0±0.5范围内应用含有0.1±0.05M甘氨酸和0.15±0.1M氯化钠的洗脱液将目标生物分子从层析柱上洗脱下来。其中上柱缓冲液可以为乙酸缓冲液,低盐,离子强度小于5mS/cm。
优选的情况是,上述的生物样品是源自人血浆、人血浆的沉淀物或者人血浆的冷沉淀物,而该目标生物分子是免疫球蛋白。人源的免疫球蛋白是经过如下顺序的步骤从人血浆中得到的:(1)在pH7.1±0.1范围内将人血浆进行8±0.5%乙醇的低温沉淀,接着在pH5.85±0.05范围内进行19±0.5%的乙醇沉淀;(2)将所得到的沉淀溶解,并且加入pH3.9的0.8M乙酸钠/4.0M乙酸缓冲液;(3)调节pH至5.1±0.1;(4)加入乙醇至终浓度15±1.0%;(5)在-5℃至-5.5℃范围内温和搅拌1至2小时;(6)通过2,300×g的离心除去沉淀,得到含有免疫球蛋白的上清液。
本发明的上述方法可作如下变化,在有机溶剂灭活病毒步骤之前,该样品可经0.22μm~0.1μm的滤膜预过滤后,再通过35nm的滤膜进行病毒去除过滤。
从免疫球蛋白溶液中将登革病毒灭活和去除的最优选情况如下所述:(1)应用辛基酚聚氧乙烯醚和磷酸三正丁酯联合处理该免疫球蛋白溶液;(2)通过以带有羧甲基基团的交联琼脂糖为树脂的阳离子交换层析法,在pH4.0±0.1范围内进行预平衡和上样、在pH7.0±0.1范围内进行清洗以及在pH9.0±0.1范围内应用0.1±0.05M甘氨酸和0.15±0.05M氯化钠将该免疫球蛋白洗脱,从而将登革病毒与该免疫球蛋白分开。
在此最优选的情况下,辛基酚聚氧乙烯醚和磷酸三正丁酯的重量百分比浓度分别是1±0.1%和0.3±0.1%,而对该免疫球蛋白溶液进行的病毒灭活是在28℃-32℃下处理至少一小时。该病毒灭活也可以进行至少四小时,或更优选的,四至十六小时之间。
另一方面,本发明提供一种不附带传染性登革病毒的人血浆白蛋白的生产方法。该方法包括如下顺序的步骤:(1)将人血浆进行以下pH值和乙醇浓度的低温沉淀,在pH7.1±0.1范围内8±0.5%乙醇、在pH5.85±0.05范围内19±0.5%乙醇、在pH5.86±0.05范围内40±0.5%乙醇以及在pH4.77±0.05范围内40±0.5%乙醇;(2)加入0.032M的辛酸钠,并调节该白蛋白溶液至pH6.8;(3)加热该混合液,并在59℃-61℃下处理至少一小时。
本发明提供了从生物样品中将登革病毒灭活和去除的方法。在本说明书以及权利要求书中,“生物样品”是指生物来源的样品,非限制性的例子是血制品、尿液提取物和细胞分解液。“血制品”是指源于人或动物的血液或血浆产品。其可包含,但不限于,酶、包括凝血因子的酶原、酶抑制物、免疫球蛋白、白蛋白、纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白原、纤维结合蛋白或血浆。
本发明中,“去除”是指病毒颗粒、蛋白、遗传物质或其混合物的去除。
本发明中,“对数降低量”是指病毒降低量的对数值(Log10)。
本发明中,单位M表示mol/L。
本发明所提供的将登革病毒灭活和去除的方法是血浆蛋白生产过程中特定的病毒灭活和去除步骤,这些步骤包括免疫球蛋白工艺的病毒过滤、有机溶剂灭活和离子交换层析去除,以及白蛋白工艺的巴斯德(巴氏)消毒法。
通过本发明的方法,可有效地将有活性的登革病毒、灭活的登革病毒以及登革病毒的RNA从生物样品中去除。这样,可避免外源病毒或其遗传物质输入人体内所可能引发病毒感染或免疫反应的风险。本发明还公开了优选的技术方案,特别是制备不附带登革病毒的免疫球蛋白的方法。此外本发明还提供了不附带登革病毒的血浆白蛋白的制备方法。就登革病毒而言,通过本发明方法处理后的生物制品符合人用安全标准。
本发明的离子交换层析步骤是一个简单、有效而且经济的工艺,可将病毒、有机溶剂或者有机溶剂和去污剂的混合物与生物样品简单地一步分开。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1:免疫球蛋白工艺的登革病毒灭活和去除
步骤1:病毒去除过滤
已初步纯化的免疫球蛋白溶液经过0.22μm或0.1μm的滤膜(Millipore SteritopTM)预过滤以除去病毒聚合物。该免疫球蛋白溶液在室温及80kPa的恒压下,再使用35nm的滤膜(Asahi KaseiPlanova)进行病毒去除过滤。
步骤2:有机溶剂与去污剂处理
将经病毒去除过滤的免疫球蛋白溶液升温至28℃,然后分别加入辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X-100)和磷酸三正丁酯至1%和0.3%的终浓度。对该免疫球蛋白溶液进行的病毒灭活在28℃-30℃下维持处理十六小时。
步骤3:离子交换层析
将经免疫球蛋白工艺循环使用了476次的带有羧甲基基团的交联琼脂糖树脂(Pharmacia CM SepharoseFast Flow)填充到直径为10毫米的层析柱,并使柱床高度为11厘米。该层析柱以0.02M乙酸钠(pH4.0)进行预平衡。以1M盐酸和纯化水分别调节经有机溶剂与去污剂处理的免疫球蛋白溶液至pH4.0及离子强度至1.40mS/cm,然后将该溶液在室温下以40cm/h的线性流速加入到该层析柱。该层析柱在上样后以10倍体积的0.01M甘氨酸(pH7.0)进行清洗。紧接着,应用含有0.1M甘氨酸和0.15M氯化钠的缓冲液(pH9.0)将免疫球蛋白从该层析柱上洗脱下来。
本发明将登革病毒从生物样品中灭活和去除的优选实验已在此完全描述。虽然这里描述的是特定的实验,但是,对于熟练本行业技术的人,本发明的特定细节是可以作多种变化。因而,本发明不得被解释为受这些优选条件所限制。
实施例1中登革病毒的定量
应用上述工艺,以下数据表明了本发明的方法成功地灭活和去除了登革病毒。
在实施例1的每一个工艺步骤前,含有人血浆免疫球蛋白的样品加入了体积比为1∶9-1∶49的登革病毒(由TCID50法所滴定的病毒含量的对数值为7.17~7.61)或者体积比为1∶20-1∶100的猪细小病毒(由TCID50法所滴定的病毒含量的对数值为8.63~9.76)。经过工艺处理后,取样做病毒含量滴定,结果显示在表1。
表1.免疫球蛋白工艺的病毒清除
工艺步骤 | 病毒降低量的对数值 | |
登革病毒 | 猪细小病毒 | |
组分III沉淀 | 2.16 | - |
病毒去除过滤 | ≥5.79 | 0.35 |
有机溶剂处理 | ≥5.05 | - |
层析 | ≥6.93 | 1.04 |
总病毒降低量 | ≥19.93 | 1.04# |
#附注:病毒降低量低于1时不被计算入“总病毒降低量”
在有机溶剂与去污剂处理步骤,加入了体积比为1∶9登革病毒的免疫球蛋白溶液在16小时病毒灭活的不同时段,取样做病毒含量滴定。结果如表2所示,有机溶剂与去污剂处理能迅速灭活登革病毒,该步骤处理1分钟后,已经检测不到活性的登革病毒。
表2.有机溶剂与去污剂灭活登革病毒
有机溶剂处理 | 病毒降低量的对数值 |
1分钟5分钟20分钟1小时16小时 | ≥2.84≥2.84≥2.84≥5.05≥5.05 |
附注:经有机溶剂与去污剂处理,已经检测不到活性的登革病毒;病毒降低量的不同是由于病毒滴定样品体积的不同。
如表1和表2数据所示,登革病毒被成功地灭活。然而,即使被灭活,登革病毒仍然存在于样品中。因此,该免疫球蛋白溶液仍含有非活性的登革病毒颗粒以及其RNA。下述的阳离子交换层析步骤可将非活性的登革病毒颗粒以及其RNA从生物样品中去除。
加入了体积比为1∶20牛腹泻病毒(BVDV,由TCID50法所滴定的病毒含量的对数值为7.22)、登革病毒(DV)、甲型肝炎病毒(HAV,由TCID50法所滴定的病毒含量的对数值为7.25)、艾滋病毒(HIV,由TCID50法所滴定的病毒含量的对数值为7.66)或猪细小病毒(PPV)的免疫球蛋白溶液经阳离子交换层析法处理。在层析柱上样液、流过液和洗脱液中,病毒含量滴定采取细胞病变50%(TCID50)或逆转录定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法,结果如表3和表4所示。
在用于定量检测牛腹泻病毒的TCID50法中,150微升的MDBK细胞利用96孔板培养,加入50微升的每一稀释倍数的样品后,在36±2℃及5%二氧化碳的环境中进行孵放。TCID50法基于阳性对照的细胞病变,应用Spearman Krber方法计算。
至于登革病毒的定量检测,100微升的Vero E6细胞利用96孔板培养一天,加入各50微升的培养液和每一稀释倍数的样品后,在36±2℃及5%二氧化碳的环境中进行孵放。TCID50法基于第五天的阳性对照的细胞病变,应用Spearman Krber方法计算。
而甲型肝炎病毒和猪细小病毒的定量检测,FRHL-4细胞和PK-13细胞分别利用96孔板培养,加入25微升的每一稀释倍数的样品后,在36±2℃及5%二氧化碳的环境中孵放60至80分钟,再加入175微升的培养液。TCID50法基于阳性对照的细胞病变,应用Spearman Krber方法计算。
至于艾滋病毒的定量检测,50微升的C8166细胞利用96孔板培养,加入50微升的每一稀释倍数的样品后,在36±2℃及5%二氧化碳的环境中孵放的十天期间,再分两次加入各50微升的培养液。TCID50法基于第十天的阳性对照的细胞病变,应用Spearman Krber方法计算。
qRT-PCR法的定量检测,首先应用Qiagen公司的QIAampViralRNA Mini试剂盒从样品中提取各双份的牛腹泻病毒、登革病毒和艾滋病毒的RNA。然后就样品和适当的对照,利用病毒特异性的引物和荧光探针进行基于Applied Biosystems公司开发的TaqMan技术的定量逆转录聚合酶链反应。每一样品均进行一式三份的反应,而条件已经优化至可检测50拷贝的牛腹泻病毒和艾滋病毒,以及4.67拷贝的登革病毒。
表3.阳离子交换层析法的病毒降低量
病毒 | 病毒量-TCID50法(Log) | 病毒降低量 | ||
上样液 | 流过液 | 洗脱液 | 上样→洗脱 | |
BVDVDVHAVHIVPPV | 6.366.176.326.117.46 | 4.35≤4.32#4.73≤3.98#7.22 | ≤0.64#≤-0.76#≤2.03#≤2.64#6.42 | ≥5.72≥6.93≥4.29≥3.471.04 |
#附注:表示检测不到活性的病毒;病毒量通过Poisson分布法计算。
本发明详细的qRT-PCR数据在表4显示,这些结果清晰地表明,对比于牛腹泻病毒和艾滋病毒,本发明的阳离子交换层析法可更显著而有效地清除登革病毒。
表4.阳离子交换层析法的病毒降低量
病毒 | 病毒量-qRT-PCR法(Log) | 病毒降低量 |
上样液 | 流过液 | 洗脱液 | 上样→洗脱 | |
BVDVDVHIV | 10.717.5510.07 | 10.116.6610.05 | 9.55<2.52#8.28 | 1.16>5.031.79 |
#附注:表示检测不到病毒;病毒量以检测灵敏度限值(4.67拷贝)计算。
通过上述的检测结果可以看出,免疫球蛋白工艺的各步骤非常有效地灭活和去除登革病毒,累积病毒降低量的对数值不低于19.93。而该工艺仅相当温和地清除猪细小病毒,累积病毒降低量的对数值为1.04。
在上述实施例中,该生物样品是源自人血浆的已初步纯化的免疫球蛋白溶液。下面的实施例描述本发明人如何将该免疫球蛋白从冰冻人血浆中纯化出来。
实施例2:免疫球蛋白的初步纯化
血浆组分II+III是通过冷冻乙醇沉淀法(Cohn et a1.,J.Am.Chem.Soc.1946;68:459-475)从人的冰冻血浆中得到的。首先在pH7.1将人血浆进行8.0%的乙醇沉淀,将所得的上清液在pH5.85进行19.0%的乙醇沉淀,通过2,300×g的离心得到组分II+III。向溶解的组分II+III加入0.8M乙酸钠/4.0M乙酸缓冲液(pH3.9)调节至pH5.1,再加入95%乙醇至终浓度15.0%,并且在-5℃至-5.5℃范围内温和搅拌1.5小时。通过2,300×g的离心除去沉淀,得到含有免疫球蛋白的上清液。
实施例3:不附带传染性登革病毒的人血浆白蛋白的纯化
步骤1:组分IV沉淀
如实施例2所述,上清液II+III通过连续两步的乙醇沉淀(8.0%和19.0%)获得。接着将95%乙醇加入该上清液至终浓度40.0%,并且在-5℃至-5.5℃范围内温和搅拌1小时。通过2,300×g的离心除去组分IV,得到含有白蛋白的上清液IV。
步骤2:巴氏消毒法
应用Millipore公司的30kD超滤膜包将纯化的白蛋白溶液以8体积的纯化水进行渗滤,然后浓缩至白蛋白终浓度为22%。将医药级的辛酸钠加入到该浓缩的白蛋白至终浓度为0.032M,然后调节pH6.8以及白蛋白终浓度为20%。接着,该20%白蛋白溶液以及经无菌过滤并且分装的白蛋白产品在水浴箱内加热至59℃,在59℃至60℃范围内分别作10小时的大体积巴氏消毒和最终巴氏消毒。进行大体积巴氏消毒时,应用不锈钢的机械搅拌器作温和的搅拌。
本发明的另一方面,不附带传染性登革病毒的白蛋白纯化的优选实验已在此完全描述。虽然这里描述的是特定的实验,但是,对于熟练本行业技术的人,本发明的特定细节是可以作多种变化。因而,本发明不得被解释为受这些优选条件所限制。
实施例3中登革病毒的定量
在实施例3的每一个工艺步骤前,将体积比为1∶10-1∶25的登革病毒加入到从冰冻人血浆中所得到的白蛋白溶液。经过工艺处理后,取样做病毒含量滴定,结果显示在表5。在10小时巴氏消毒处理的不同时段,取样做登革病毒含量滴定。
如表5所示,白蛋白工艺的各步骤非常有效地灭活登革病毒,累积病毒降低量的对数值不低于10.12。
表5.白蛋白工艺的登革病毒清除
工艺步骤 | 登革病毒降低量的对数值 |
组分IV沉淀大体积巴氏消毒最终巴氏消毒 | ≥5.18≥4.61≥4.94 |
总病毒降低量 | ≥10.12* |
*附注:由于“大体积巴氏消毒”在机理上与“最终巴氏消毒”相似,因而只有后者才被计算入“总病毒降低量”。
巴氏消毒法能迅速灭活登革病毒,该步骤处理5分钟后,已经检测不到活性的登革病毒。表6显示,在巴氏消毒处理的不同时段,登革病毒降低量的数据。
表6.巴氏消毒法灭活登革病毒
巴氏消毒处理 | 登革病毒降低量的对数值 | |
最终 | 大体积 |
5分钟20分钟1小时10小时 | ≥3.64≥3.64≥4.94≥4.94 | ≥3.31≥3.31≥4.61≥4.61 |
附注:经巴氏消毒处理,已经检测不到活性的登革病毒;病毒降低量的不同是由于病毒滴定样品体积的不同。
Claims (18)
1、一种从含有至少一种目标生物分子的样品中将登革病毒灭活和去除的方法,其包括步骤:(1)单独使用有机溶剂或与非离子去污剂联用,灭活登革病毒;(2)通过阳离子交换树脂将登革病毒与目标生物分子分开。
2、如权利要求1所述的方法,其中步骤(2)包括在pH 4.0±0.5范围内进行层析柱的预平衡和上样、在pH 7.0±0.5范围内进行层析柱的清洗以及在pH 9.0±0.5范围内应用含有0.1±0.05M甘氨酸和0.15±0.1M氯化钠的缓冲液将目标生物分子从层析柱上洗脱下来。
3、如权利要求1所述的方法,其中所述灭活的温度是28~32℃。
4、如权利要求1所述的方法,其还包括在灭活前将样品经0.22μm~0.1μm的滤膜预过滤,再通过35nm的滤膜进行病毒去除过滤。
5、如权利要求1~4任一项所述的方法,其中所述的阳离子交换树脂选自硅胶、氧化铝、钛多聚阳离子、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及带阳离子基团的多聚体。
6、如权利要求1~4任一项所述的方法,其中所述的有机溶剂选自二烃基磷酸盐、三烃基磷酸盐、磷酸三正丁酯、磷酸三叔丁酯、磷酸三正己酯、磷酸三乙基己酯和磷酸三正癸酯中的一种或多种。
7、如权利要求1~4任一项所述的方法,其中所述的非离子型去污剂选自辛基酚聚氧乙烯醚、辛基-β-硫代毗喃葡萄糖苷和聚氧乙烯山梨醇单油酸酯。
8、如权利要求1所述的方法,其中所述的样品是选自血浆、血清、血浆的沉淀物、血清的沉淀物、血浆的冷沉淀物以及血清的冷沉淀物。
9、如权利要求1所述的方法,其中步骤(1)使用磷酸三正丁酯和辛基酚聚氧乙烯醚灭活登革病毒。
10、如权利要求9所述的方法,其中所述的磷酸三正丁酯的重量百分比浓度是0.3±0.1%,所述的辛基酚聚氧乙烯醚的重量百分比浓度是1±0.1%。
11、如权利要求1、2、4、9或10所述的方法,其特征在于目标生物分子为免疫球蛋白。
12、如权利要求11所述的方法,其中所述的目标生物分子为人源的免疫球蛋白。
13、如权利要求9所述的方法,其特征在于病毒灭活的条件是在28-32℃下处理至少一小时。
14、如权利要求13所述的方法,所述病毒灭活处理时间不少于4个小时。
15、如权利要求14所述的方法,所述病毒灭活处理时间为4~16个小时。
16、一种基本上不附带传染性登革病毒的人血浆白蛋白的生产方法,其特征在于包括如下顺序的步骤:(1)在pH 7.1±0.1范围内将人血浆进行8±0.5%的乙醇沉淀;(2)将所得到的上清液在pH 5.85±0.05范围内进行19±0.5%的乙醇沉淀;(3)将所得到的上清液在pH 5.86±0.05范围内进行40±0.5%的乙醇沉淀;(4)将所得到的上清液在pH 4.77±0.05范围内进行40±0.5%的乙醇沉淀;(5)将所得到的沉淀溶解并通过渗滤得到20%的白蛋白溶液;(6)加入0.032M的辛酸钠,并调节该白蛋白溶液至pH 6.8;(7)加热该混合液,并在59-61℃下处理至少一小时。
17、如权利要求16所述的方法,其中步骤(7)的处理时间为10小时。
18、如权利要求16所述的方法,其中所述的渗滤为超滤。
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