JPS58500548A - 新規な血液凝固酵素組成物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な血液凝固酵素組成物の製造方法 本発明はもはや患者および医療従事者に対し潜在的に有害でない組成物を得るた め、血液凝固因子酵素、特にプロトロンビシおよび凝固因子■＋　■＋　”ｆ含 む組成物中のビールスの不活性仕方法に関する。特に、本発明はプロトロンビン および因子■、ＩｒおよびＩの混合物である公知の治療用血漿分画であるプロト ロンビン複合体中のビールスの不活性化に関する。

未発明の背景 こ−で使用する「ビールスの不活性化」または「感染性ビールスの実質的不存在 」なる言葉は、以後に記載する方法によって処理した製品中の生物学的に感染性 のビールスの残存力価が、問題のビールスに対する複数の普通の動物宿主への該 製品の治療量の注入が統計学的に有意な宿主頭数において統計学的に有意な感染 の臨床的または血清学的証拠（ｐ＜０．１）をつくらないほど低いことを意味す る。このことは、代替物がもつと汚染された物質である場合には低ビールスカ価 を有する組成物は治療上の有用性を有するので、計装品が滅菌され、または完全 にビールスを含マないことを要するものではない。

ハーゲマン因子、プロトロンビンおよび因子１．■、！！および■はすべて血秦 酵１原である。これらはフィブリノーゲンのフィプリン凝塊への変換を頂点に達 せさせる酵素媒介反応の複雑な流れに参加する。それらのこの流れへの参加は酵 素原を活性タンパク分解酵素へ変換する酵素原の一次的または変態的構造の変化 によって開始される。この麦汁は酵素原の「活性化」と呼ばれる。

簡略イとのため、「血液凝固酵素Ｊとは、酵素的に機能しない酵素原と、活性化 によって得られたそれらの活性型の両方を含む。同様に、こ＼で使用する因子の 名称への言及は、これら酵素の両方の形を含むものと解すべきであり、例えば因 子Ｘは活性化された、および活性化されない因子Ｘと、それらの混合物を含むも のである。時には因子に対して略号「Ｆ」が使用されるであろう。

各血液凝固酵素はその独特の特異性を有し、凝血メカニズムにおいて確立された 役目を果す。例えば活性化された因子■はカルシウムと、タンパク助因子である 因子■の存在において因子Ｉを加水分解し、活性化された因子Ｘを生成する。ト ロンビン（活性化されたプロトロンビン）はタンパク基質であるフィブリノーゲ ンを分裂肱フィブリンモノマーを生成し、それは結局凝塊を生成する。

スチュワードプローワー因子とも呼ばれる因子Ｘは分子量８７゜０００のアルフ ァグロブリンである。プロトロンビシ（因子■）は分子量約６８，０００を有す る糖タンパク質である。ハーゲマン因子（因子店）も糖タンパク質であるが、し かしその分子量は約８２．０００である。

これら因子すべては血液凝固における酵素原および凝固酵素としてそれらの生物 学的役割において共通であり、この役割は抗トロンビンＩ、アルフミン、抗血友 病因子（因子ｖｍ）、ガンマグロブリンまたはフィブリノーゲンのような他の血 漿タンパクは持つていない。プラスミノーゲンはその活性化が凝塊の生成に参加 せず、その代りに存在する凝塊中のフィブリンを分解するのであるから、こ＼で 使用するような意味で血液凝固酵素原ではない。

血液凝固酵素は個々の血漿供出の大プールから公知の方法で商業的に製造される 。それらの製造に使用されるすべての血漿単位は、この目的のために許可された テストシステムを使用して肝炎Ｂ表面抗原の存在についてテストされる。しかし ながらこれら免疫学的テストはすべての肝炎Ｂの潜在的感染性ユニットを検出す るのに十分なほど感受性ではない。さらに、肝炎ビールスは分画操作中に濃縮さ れることがあり得る。このため多量の血漿プール中に含まれるかも知れない検出 不能量のビールスは、それが数倍濃縮されるとき有意に感染性となることがある 。

肝炎Ａおよび肝炎Ｂについての特異的診断テストの発達は、最初二つのどちらに も明らかに免疫学的に関係がない第３のタイプのビールス肝炎全同定することを 可能にした。この伝播病原非Ａ非Ｂ肝炎は病原体へさらすことによってチンパン ジーへこの病気”ｒ伝播することによって確認された。２種以上の非Ａ非Ｂ肝炎 ビールスを指す証拠のいくつかの列がある。これらは明白な急性非Ａ非Ｂ肝炎の 順次発病、疫学および潜伏期間を含む臨床上の徴候の多様性をもった症例を含む 。

特に血液凝固酵素の場合には、製品の注入による肝炎伝播は血漿源を肝炎Ｂにつ いてスクリーニングした場合さえも問題として残る。Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａ ｌ、、”Ｔｈｒｃｒｒｂｏｓ、Ｄｉａｔｈｅｓ、　ＨａｆｆｒＤｒｒ、〔Ｓｔｕ ｔｔｇ、　）３３：６１０−６１６〔１９７５〕参照。さらに肝炎に責任のある ビールス以外の偶発ビールスが製品を汚染し得ることが考えられる。このように これら製剤に発見し得る肝炎を含むすべてのビールスを不活性化する方法に対す る必要性が存在する。

液体血漿または分画を加熱することにより血漿または血漿分画溶液中の肝炎ビー ルスを不活性化するばらばらの報告が存在する。

ＭｕｒｒａｙはＴｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｒｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉ ｃｉｎｅ　３１　（５）：　３４１−３５８（１９５５）において、６０℃にお いて１０時間加熱することによって黄だん発生活性を不活性化することを報告し ている。

この方法はアルブミンおよび血漿タンパク分画（Ｐ　Ｐ　Ｐ　）溶液中の肝炎″ ″活１什ｔ　ｆｃ　Ｔｏ　′。長３使駐訂いれ・、ベルギー特許第８４４，５６ ６号は肝炎ビールスを殺すため液体血漿または血清を５０ないし６０℃において ｌ／２ないし４時間加熱し、次に血漿または血清を分画して免疫グロブリンＧを 得ることを３ｒ＋載する。

西ドイツ公開特許第２９１６７１１号は溶液へアミノ酸および単糖類、オリゴ糖 類、または糖アルコールを添加することにより、水溶液中のプラスミノーゲン、 プロトロンビン、抗トロンビンｍ１因子■および■を熱に対して安定化すること を記載する。溶液は肝炎ビールスを不活性化するため３ｏないし１００℃におい て１分ないし４８時間加熱された。

以上の技術のすべては不利である。ビールスを不活性化することができるが、あ る種の治療的タンパクは、それらが水溶液中で熱的に不安定なため、同様に不活 性化される。このようにそのようなタンパク組成物の感染性の減少は該タンパク の生物学的活性の損失によって達成される。

乾燥フィブリノーゲンまたはアルブミン製剤中のイヌ肝炎ビーｈス＋ａ製剤を６ ０’Ｃにおいて１０時間加熱することによって不活性化することが公知である。

Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　ＩＩＩｎｔｅｒｎａｔｉｏ　−ｎａｌ　Ｃ ｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、　Ａｂｓｔｒａ ｃｔｓ　ｐ、　４７３−４７４（１９６９）参照。

本発明の概要 今や血液凝固酵素またはこれら酵素の混合物を含む組成物中に存在するビールス 、特に肝炎ビールスは、該ビールスが不活性化されるまで該酵素を乾燥状態にお いて加熱することによって該酵素の活性に影響することなく不活性化し得ること が発見された。

得られる新規な組成物は非感染性ビールスを含有し、そして感染性ビールスおよ び変性した血液凝固＃素を実質上含まない。好ましい組成物は感染性肝炎ビール スを実質上含まない。不活性化はタンパクとあらかじめ定めたビールスカ価？含 む乾燥生物学的指示薬の使用によってモニターされる。

関係、他方では温度と時間との関係のプロットである。乾燥状態では、凝固因子 の不活性化を表わす点線不活性化線と、ビールスの不活性化を表わす実線との比 較によって示されるように、ビールス不活性化速度は凝固因子のそれを遥かに上 形る。特に口面はプロトロンビン複合体中の５ｉｎｄｂｉｓ　ビールスの集団は 実質上付ｔｉ１ｍする酵素活性の損失なしに３１時間以内に効果的に不活性化で きることを示している。

本発明の詳細な説明 本発明に従って処理される凝固因子酵素は任意の既知方法で血漿から製造するこ とができる。そのような方法の好ましい例が米国特許第３，５６０，４７５号に 記載されている。他の方法は当業者には明らかであろう。

該酵素は正常ヒト血漿中のそれらの濃度の約３ないし５０倍に精製され、そして 正常ヒト血漿中のタンパクの量の約１％以下を含有する。精製の程度は重要でな い。しがしながらタンパク溶液の限られた量しか投与できず、そしてこの量は凝 固因子の望む量を含んでいないから、精製の少ない製品は比較的低い治療上の有 用性しか持たないであろう。他方、よシ高価な精製は所望の治療上の有用性を得 るには不必要に高価であろう。通常製品はプラスミノーゲン、プラスミン、ガン マグロブリン、抗血友病因子、アルブミンおよびフィブリノーゲンを実質上含ま ないであろう。最適には、酵素は出発血漿がらの還元性単糖類、特にグルコース を実質上含まない程度に十分に純粋である。

酵素組成物はアミノ酸、無害性タンパク、非還元性単糖類、オリゴ糖類および糖 アルコールのような１種または２種以上の通常の安定剤を含んでもよい。代表的 な安定剤はアルブミン、グリシン、プロリン、マンニトールおよびソルビトール を含む。もし組成物が治療的に使用されるものであれば、生理学的に許容し得る 安定剤を生理学的に許容し得る量で使用しなければならない。一般に安定剤は約 ０．５ないし３重量％の範囲の量で存在する。安定剤は凍結乾燥した組成物の溶 解とそしてそのように生成した溶液の透明性を促進する。しかしながら処理すべ き組成物は安定剤を含まないことが好ましく、乾燥状態では酵素単独で顕著な安 定性を示すので、安定剤は不必要である。このように組成物はアミン酸を１．０ モル／ｌ、好ましくは約０．７５モル／ｌ以下、および糖または糖アルコール２ ０ｗ／ｗ％以下、好ましくは糖または糖アルコール約５％以下含有することがで きる。

こ＼に記載する方法によって処理することができる組成物のｐＨは約６．０ない し８，０であシ、そして好ましくは約Ｄ　Ｈ６，５ないし７．５である。凝固酵 素プロトロンビン、ハーゲマン因子、因子Ｉ。

■、ｉおよびＸは実質上池のものを含まないようにさらに精製することかできる 。その言葉がこ＼で使用されるように、酵素組成物が実質上伸の酵素を含まない という時は、混存する酵素が組成物全体重量の約２％以下、または主体酵素の重 量の約１０％以下の量で通常存在する。因子「は公知方法により、例えばヘパリ ンアガロース上のアフィニティークロマトグラフィーにより、因子「の濃度が因 子Ｘまたはトロンビンの濃度の２５ないし５０倍になるように単離体のま＼で普 通製造される。そのような因子「製剤は通常因子国を約２０ないし１２０単位／ 　ｍｅ金含有る。プロトロンビンは公知方法で除去することができる。プロトロ ンビンを実質上含まないそのような組成物をこの方法に使用することかできる。

種々の血液凝固酵素を分離するための他の技術はよく知られている。

２種の広く使用されている治療用製品であるプロトロンビン複合体および活性化 プロトロンビン複合体の中には血液凝固酵素の４種が見出される。プロトロンビ ン複合体は通常プロトロンビンおよび因子■、■およびＸをｄ当り約以下の単位 範囲、′ｊなゎちそれぞれ１〜ｌｏ、３７〜１９ｏ、１５〜１４２および１〜３ ｏ。

好ましくは３．６〜８．９，３７〜１２２，２０〜８１および１〜２５で含有す る。

活性化プロトロンビンは公知の方法で製造し得る。例えば、アイプルらの米国特 許第４，１６０，０２５号または同時出願中の参照文献参照。そのような組成物 は実質上活性化されない凝固酵素？含まないが、しかし通常の状況では酵素原と の混合物中に活性化酵素が見出される。こ−に記載する方法によって未活性化お よび活性化凝固酵素が保存されるばがりでなく、酵素原が熱処理によって活性化 されないことは驚くべきことである。

活性化プロトロンビン複合体（ＦＣＣ）は一般に以下の範囲の含む。

ｎ　１−　１０　３．６−８．９　３．６−５．９■　３７−１９０　３７−１ ２２　３９−８８■ａ　８−　８０　２５−　７８　２５−６０ｘ　ｌ５−１１ ２　２０−８１　５０−８０■前駆体　０−３０　５−２０　５−１２１　１− 　３０　１−　２５　１−１３トロンビン　０．００３　０．００２　０．００ １※　凝固アッセイ（後記）により測定 子　原色体アッセイ（後記）によシ測定明らかに単位／ｍｌ！で表わしたこれら 因子の各自の範囲は、製品の意図する用途によって変えることのできる活性化Ｆ ＣＣの復元容積に依存するであろう。上に与えた範囲は患者へ直接投与のため希 釈または復元した活性化ＦＣＣについてのものである。ことわりのない限シ、因 子ｘａの範囲は以下に記載する凝固法で測定されたものである。

好ましい組成物は、単位／ｄでＦ−ｆｆ約２０ないし１１２単位と、ト」前駆体 ０ないし約３０単位と？含む。

他の好ましい組成物は、単位／Ｗｄ！でＦ−■約３７ないし１９０単位と、Ｆ− ■ａ約２５ないし８０単位を含む。

さらに好ましい組成物は、単位／−でＦ−Ｘ約１ないし１３単位と、Ｆ−１ａ約 ４ないし１０単位と全含む。

同様に有用な製品は因子■ａ、Ｍａおよびｘａを含み、非活性化部分的トロンボ プラスチン時間約２７ないし７０秒を持っている。

第Ｍ、　ｘＩ、ｎ、Ｗ、　誼、Ｘ、ＩＢ、　Ｉ！前駆体、■因子およびトロンビ ンの測定のための分析方法は一般に慣用のものである。こ゛れら定量のすべては 、ことわりのない限シいくつかの共通特徴を有している。第１に各定量法は試験 サンプルの２系列の系統的希釈液と、そして１単位／　ｍｅの与えられた力価を 有する標準液を調製することな含む。試験サンプル中の単位／　ｍｅによる濃度 は、２系列を平均し、標準液について得られた結果をそれらの以前の系統的希釈 によって確立されたそれらのそれぞれの％濃度に対してプロットし、該プロット から希釈した試験サンプル中の％濃度を読み取り、調製した系統的希釈について 試験サシプル濃度を補正し、試験サンプル％濃度を平均し、そして平均値を１０ ０で割って定量した因子の単位／　ｍｅに到達することによって計算することが できる。

０ 第２に、ことわシのない限シすべての定量は３７°Ｃで実施され、そしてすべて の試薬はその温度にあらかじめ加温される。

第３に、単位／　ｍｅによる定量標準液は凍結乾燥したヒト正常血漿、凍結正常 ヒト血漿または正常凝固時間因子活性を代表することを意図した国際標準液（Ｂ ＯＢまたはＷＨＯ）を基準とする。

凍結乾燥した正常ヒト血漿は、新たに採血した正常ヒト血漿の三つの別々のプー ルに対して標準化される。各プールは、経口避始薬、抗炎症剤または関節炎投薬 を服用していない１０人の絶食した正常供血者からの静脈血を採血することによ って調製される。

供血者はまたプロトロンビン時間１１ないし１５秒、活性化部分的トロンボプラ スチン時間３０ないし４５秒、およびフィブリノーゲンレベ／ｌ／　２００ない し４００〜／ｄｆを有していなければならない。血液は３８％クエン酸ナトリウ ム中に血液９容に対し抗凝固剤１容の割合で採取し、混合し、１０００ＲＣＦで １５分間遠心し、その後各面漿上清の等量をプールする。血漿は１時間以内に定 量する。以下で定量した各全因子についての３プールの平均力（ｉｌｌｉを勝手 に１咽位／　ｍｅと設定する。

凍結正常ヒトＪ］１１桑は、プールｋ　ｌ　ｍｅづつプラスチックバイアルへ分 配し、そして−７０°Ｃで凍結することを除き、前記に新たに採血した３ブール のうち任意の一つと同じ方法で調製される。凍結したプールは６０日以内に使用 される。各凍結プールは各全因子を１単位／　ｍｅ含むものと考えられる。以後 上記２方法のいずれかにより確立された標準単位を含有する血漿は、参照または 標準面１ 漿と呼ばれる。

第４に、いくつかの定量において使用される因子欠乏血漿は、特定の因子が先天 的に欠乏している供血者、すなわち正常プール血漿中に存在するものの約５％よ り少ない因子力価を有する供血者から得た血漿である。

第５に、Ｆ−π定量は総および全躯体Ｆ−１を検出する。このことは総Ｆ−ｆｆ のための定量は活性および不活性Ｆ−Ｉ！活性の合計値を測定し、他方Ｆ−ｍ前 駆体定量は実質上活性物質を含まないことを意味する。従ってＦ−ｆｆａは総Ｆ −■がら前駆体活性を差し引くことによって推算することができる。残りの分析 方法、すなわち第■、Ｗ、Ｉ、Ｍおよびπのための分析方法は、すべて活性およ び酵素原因子の合計を測定することに注意すべきである。

しかしながら簡単にするためこれら定量について「総」なる語は使用しない。他 方およびＦ−■定量法と対照的に、トロンビン、■ａおよび１３法は活性因子を 直接定量する。

トロンビンは以下の方法によって測定される。ＮＩＨトロンビン標準ロッ）Ｂ− ３に対して標準化されたウシトロンビシ標準を通常の食塩水中０．００１，０． ００２，０．００３，０．００５および０．０１０／Ｉ／ｍｅに希釈する。この 希釈した標準液２．０　ｍｅをフィブリノーゲン基質０．５−へ加える。混合物 を２８℃でインキュベートする。反応試験管全２分毎にチェックする。最初のフ ィブリンストランドの出現をもって終点とする。試験サンプルは希釈なしで同じ ように定量する。このように復元した試験サンプルの２０ｍ１をフィブリノーゲ ン基質０．５　ｍｅへ加え、そして終点生成を２分２ 毎に観察する。試験サンプルの凝固時間をトロンビン標準液の凝固時間と比較す る。計算は一般に前に記載したように実施する。

第１ａ因子はＹｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　”Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、 ’　８１：２９８（１’９７３）の方法の変法で測定する。参照標準を含むすべ ての試薬はシグマ、ケミカル、カンパニーから重数されている。試験サンプルは Ｙｉｎ　ｅｔ　ａｌ　が使用した緩衝液中に１：８．１：１６および１：３２（ サンプルの部対緩衝液の部）またはその希釈度０．０１単位／　ｍｅにおける第 Ｘａ標準液の凝固時間より長くなるまでの高希釈度へ系統的に２木宛希釈する。

標準第Ｘａ因子は最初同じ緩衝液中へｌ：４に希釈し、そして２木宛ｌ：６４へ 系統的に希釈する。標準Ｆ　−Ｘ　ａのｌ：４希釈液をＦ−１ａｌ単位／献と定 める。標準Ｆ−１ａはこ＼に記載する定量においてｌ：２希釈度において平均凝 固時間１４秒を生ずるものと定義される。各最終希釈液０．１　ｍｌをフィブロ メーターカップ中ヘビペットし、次に凝固を開始させるため０．０２５　ＣａＣ ｌ２０、１　ｍｅおよびウシ血漿−ウサギセファリン溶液０．２　ｒｎＩ！をピ ペットする。各試験管についての凝固時間を測定し、そしてＦ　−１ａ活性を前 に記載したように計算する。

Ｆ−１ａは前記の凝固法の代替法として色原体法によっても測定することができ る。定量結果を「色原体法」であると断わりがない限り、Ｆ　Ｘ　ａは凝固法に よって測定したものと思われたい。

色原体法は殆んどＫｏｓｏｗ　、　”Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ’　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　’　ｌ　：　５６５−５７３（１９７６）に記載されている。これは４０５ ｎｍにおけるその３ 光吸収によって検出し得る色原体を得るように、Ｆ　Ｉ　ａによって特異的に加 水分解された合成基質を使用する。この基質Ｓ−２２２２は０ｒｔｈｏ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ　、　Ｉｎｃ　、より市販されている。標準Ｆ−ｘａはＳ　ｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から得られるが、使用前ＮａＣ１１，３３重 量％な含む０．０５Ｍ）リス緩衝液ｐ　Ｈ８，３中へｌ°４に希釈される。Ｆ− Ｘａｏ、５単位／ｒｎｌン含むｌ：４希釈標準液は定量において４０５ｎｍ　に おける平均光学密度０．２６０を示さなければならない。この定量の実施におい て、サンプルおよび希釈した標準液はトリス緩衝液中に系統的に希釈される。各 希釈液の０゜４−をガラス試験管ヘビペットし、０．５　Ｍ　ＣａＣｊ２　およ び０．１　ＭＮａＣ＋　を含む溶液０．０７５Ｔｎｌおよび１分径ＮａＣｌ　０ ．９重量％を含む０．０５Ｍ）！Ｊス緩衝液ｐＨ８，３中ノＳ−２２２２溶液０ ．５　ｍｅ　ヲピペットする。５０％酢酸０．１　ｄを３分後に加えて反応を停 止し、そして吸収を緩衝液ブランクに対し４０５　ｎｍ　において読み取る。

計算は一般に前に記載したように実施する。

第Ｘ因子はゝゝＴｈｒｏｍｂ、　ｅｔ　Ｄｉａｔｈ　’　２：２４　（１９５８ ）記載のＢａｃｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ　、法の変法で測定するが、ザイッロ過し た雄ウシ血漿の代りに第１因子欠乏血漿を使用し、フィブロメーターを終点検出 のために使用し、そして希釈液はＰｒｏｃｔｏｒ　ｅｔ　ａｔ　１１１ｍ、　Ｊ 。

Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈ、′且（３）＋２１４　（１９６１）記載の塩化ナトリウ ムおよびクエン酸ナトリウム含有ベロナール緩衝液である。ラッセルマムシ毒液 およびセファリンは、それぞれバロース、ウェルカム、アンド、カンパニーおよ びトラベノール、ラボラトリーズ社のハ４ イランド、ティビジョンから得た。計算は一般に前に記載したように実施した。

プロトロンビン（第ｎ因子）は以下の手法で定量される。

Ｔｏｃａｎｔｉｎｓ　、　Ｅｄ、　、　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏａｇｕｒａｔｉｏｎ　 、　Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｒｒｂｏｓｉｓ　。

ｖｏｌ、　１．　ｐｐ−１４４−１４８（１９６４）中のＰｅｃｈｅｔ法によっ て調製した第１因子欠乏血９０．１−を８木の試験管へそれぞれ分配する。

１００％参照血漿は参照血漿をイミダゾール１．７２ｗ／ｖ％緩衝液ｐＨ７，０ 中へ１：１０に希釈することによって調製される。この参照血漿は次に同じ緩衝 液中に１：５．１：１０．１：２０およびｌ：４０にさらに希釈される。各希釈 液の０．１　ｄ部分標品２木宛第ｎ因子欠乏基質を含む試験中ヘビペットされる 。試験管の各２到セツト中へ参照血漿をピペットした直後、ＣａＣｌ２で凍結乾 燥したウサギ脳トロンボプラスチン０．２コをプラスチック先端ピペット？使用 して各試験管へ加える。１５秒混合した後、各試験管を光源の上で２秒に１回前 後に傾け、そして最後のゲル生成までの経過時間を記録する。以上の操作を、イ ミダゾール緩衝液中の１：１００希釈液をｌ：５，１：１０，１：２０およびｌ ：４０希釈液をつくる前につくることを除いて、試験サンプルについて操り返す 。データは前に記載したのと同じ方法で処理される。

ト」は前に引用したＰｒｏｃｔｏｒ　ｅｔ　ａｌの方法と実質的に同じである以 下６方法によって測定される。活性化ＦＣＣ試験サンプルの最小のｌ：２０前希 釈は正常な食塩水中に調製される。参照血漿は前希釈されない。試験サンプルお よび参照血漿のパルビター５ ル緩衝食塩水中への２木宛の１：５，１ｎ１ｏ、１：２０およびｌ：４０希釈液 は、Ｐｒｏｃｔｏｒ　ｅｔ　ａｌに記載の部分的トロンボプラスチン−カオリン ０．１ｄおよび正常Ｆ−ｆｆ活性の５％以下を有するＦ−１ｆ先天的欠乏血１ｊ Ｏ，１−を既に収容している試験管ヘビペットする。３分後、０．０３Ｍ　Ｃａ Ｃ１，０，ＩＷｄ！試験管内容物と混合し、３０秒間インキュベートし、そして 次に各試験管を光源の前で最終ゲル生成があるまで２秒に１回以下傾ける。Ｃａ Ｃｌ２添加からゲル生成までの時間を記録し、そしてデータを一般に前に記載し たように処理する。

Ｆ−■前駆体は、最初の試験サンプルの最小１：２０希釈を普通の食塩水でなく 、Ｆ−１！欠乏基質中につくることを除いて、総Ｆ−■についての前記方法に同 じ方法で定量する。

第■因子は、凝固点をＣ１ｏｔｅｋ器具で測定し、そして希釈液が前に引用した Ｐｒｏｃｔｏｒ　ｅｔ　ａｌが記載した希釈液であることを除き、Ｂａｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ　、、Ｅｄ、、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｂｌｅｅｄｉｎｇ　Ｄ ｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｔｈｅｏｒｙａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　ｐｐ−１９７−１ ９８（１９７１）記載のＥｓｎｏｕｆ　ｅｔ　ａｌ法によって測定される。

第■ａ因子はサンプルを最初ベンズアミジン−セファローズアフィニティーマト リックスで吸着することによって定量される。

ベンズアミジン−セファローズアフィニティーマトリックスは、例えばＳｃｈｍ ｅｒ、”Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、’　３５３　：　８１０−８１４ （１９７２）に記載されている良く知られたアフィニティーゲルである。吸着さ れない分画を０．１　Ｍ　ＮａＨＣＯ３ｐＨ７，８で洗うことによりマトリッ６ クスから除去する。次に０．５　Ｍ　ＮａＣ１および０．３　Ｍベンズアミジン ＨＣＩを含む同じ緩衝液がＦ−■ａを含有する分画を除去するために使用される 。■ａについて後者の分画の定量は、Ｆ−■に使用した同じ定量法および参照に より実施される。

第１因子の定量は、ＣａＣｌ２溶液が０．０３Ｍであり、トラベノール、ラボラ トリーズ社のハイランド、テ′イビジョンから販売されているセファリン−カオ リンを使用し、そして凝固点をＣ１ｏｔｅｋ装置を使用することを除いて、Ｒａ ｐｐａｐｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ　、　、　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１１ｎ　。

Ｍｅｄ、５７：７７１（１９６１）に記載されている。

第１因子は実質上第１因子と同じ方法で測定される。しかしながらこの場合第１ 因子欠乏血漿を使用し、そして定量はプラスチック物品との接触で実施される。

本発明の方法によって処理された活性化ＦＣＣは全体として因子欠乏または阻害 血漿の凝固時間を修正するそれらの能力により、そして特に個々の凝固因子の量 もしくは活性、非活性化部分的トロンボプラスチン時間で示される全体の凝血促 進活性、トロンビン活性および処置した患者に因子■に対する免疫レスポンスを 誘発する物質の実質上不含有、および最適には最終製品中の抗トロンビンＩ約３ 単位／ｄとによって特徴付けられる。活性化および非活性化ＰＣＣの両方ともヘ パリンを約１単位／ｄ以上９通常約１ないし３単位／−を含むことができる。

酵素組成物およびこ＼にさらに記載する生物学的指示薬は乾燥状態で熱処理され なければならない。このことは液体中性溶媒が存７ すべ音ｆｉｔ！Ｊ品は干物蛍配置ソースヵ）ム無道六引ス出で１１イ１１イ＋キ ／在しようがしまいが、それらは本釣５重量％以下を含むべきであることを意味 する。組成物は粉末、ケーキまたは他の適当な形でよい。通常の条件下での組成 物の凍結乾燥は一般に約３．５％以下の水の重量％を持つ製品を製造するが、約 １重量％以下の水を有する組成物を製造するように十分に凍結乾燥することが好 ましい。

血漿凝固酵素はガラスバイアルのような最終容器中へ通常の慣用包装の後に、す なわち無菌口過した（細胞状生物のため）水溶液として容器中に小分けし、凍結 乾燥し、そしてシールした後に最適に処理される。最終的に包装したシールした 容器を熱処理することが好ましい。そのような容器中での不活性化は以下に記載 する生物学的指示薬の使用によって実施される。

熱処理すべき酵素の上には何ら特別のふん囲気を供給することは必要でない。空 気はそれが何ら特別の包装工程の必要をなくすから最も経済的である。しかしな がら最善の結果は残存水分および酸素を滅らすため乾燥窒素で駆逐後真空または 酸素不含ふん囲気をもって可視的に７達成される。

実質上感染性ビールスを含まない組成物の製造のため、または単にビールス力価 を減らすための最適条件は処理される血液凝固製品の性状によるであろう。例え ば、酵素およびビールスの比較不活性化率に影響し得る製品変動は、組成物中の 塩の濃度およびタイプ、ビールス汚染の程度、他のタンパクに対する酵素の相対 的割合、組成物の保有水含量、乾燥前の因子溶液のｐＨ，および単糖類、抗酸化 剤等のような添加剤の溶液中の存在を含む。処理８ ５−ゝｄ我００ｖは士籾子ロソ／−へ〃３りめ尋ご（むるυ）（Ｌ、ｔよし＆ａ 人ざ（変わるので、製品特性に適するように不活性化条件を変えることが好まし い。酵素活性を保存しながらビールス不活性化を最適化するため最も好都合に変 えられる条件は熱処理の時間と温度である。しかしながらこれはプロセスを助け るため製品特性を改変する可能性を排除するものではない。例えば酵素溶液は予 備的精製、例えばある汚染源ビールスを該ビールスに特異的な不溶性抗体へ吸着 し、それによりビールスを不活性化するのに必要な熱処理の程度を減らすように 処理することができる。

不活性化温度はビールスおよび酵素の不活性化の率に正比例する。そのため温度 が高ければ高いほど、ビールスおよび凝固因子酵素の両方の不活性化は速くなる 。この方法はビールスおよび酵素の比較不活性化率は光分れし、そのため凝固因 子酵素を実質上不活性化することなくビールスを不活性化することができる現象 に依存する。このように最適温度はこれら率が最も離れる点、すなわち時間に対 するビールス不活性化のプロットの傾斜と、時間に対する酵素不活性化のプロッ トの傾斜との差が最大である点としてｌｌｕ’ｌｌｋ的に表わすことができる。

しかしながら正味の熱処理時間を諧らすように最大差の点よりも高い温度を使用 することが望ましいであろう。通常約４０ないし８０℃が満足であり、約５０な いし６０℃が好ましく、そして大部分の酵素組成物に対して約６０℃が最適であ る。

熱は適当な加熱装置、たとえば普通のオーブン、赤外線照射、９ 上の温度におけるビールス不活性化のために必要な時間は一般に約５ないし２０ ０時間、通常約ｌＯないし４０時間である。凝固酵素の均一ロットに対しては標 準化した時間を使用することができるが、不活性化が完全がどうかを決定するた めビールス生物活性について組成物を定量することが好ましい。定置すべきビー ルスは組成物を汚染する疑いのあるもの、例えば肝炎Ｂまたは非Ａ非Ｂ肝炎でよ く、またはビールスは生物学的指示薬として使用するためあらかじめ選定された ものでよい。生物学的指示薬は無生命部分が製品を真似し、一方生きている生物 は期待される汚染物を真似するように選択される１種の製品代用品として作用す る。

これまで生物学的指示薬は滅菌剤抵抗性細胞生物またはそのような生物の胞子で あった。これら既知の生物学的指示薬は滅菌剤、例えば水蒸気に透過性の包装に 収容されたある種の細菌、例えばバチルスの耐熱性胞子を含浸した乾燥した吸水 性片として最も普通に入手可能であった。こ−で提供される生物学的指示薬は血 液タンパクと、血清肝炎感染の候捕でない感染性ビールスのあらがじめ定められ た力価を含む。これはビールス肝炎に対する病因剤を使用することができるが、 しかしそれらは感染した供血者からの血漿の注入によって伝播し得るものであっ てはならないことを意味する。例えば肝炎Ｂは血清肝炎病原である。理想的には ビールスは全く肝炎感染の候神ではないであろう。

血液タンパクはビールス不活性化処理を受ける製品中のタンパ０ りの効果を真似する。このように指示薬タンパクは同一性１割合または起源の種 に関して処理される製品中のタンパクと同じでも、異なってもよい。このように 普通に商業的に入手し得る血漿タンパク、例えば免疫グロブリン、アルブミン、 抗血友病因子、抗トロンビンＩ、凝固酵素およびそれらの混合物を使用すること ができる。該タンパクは実質上アルブミンおよびフィブリノーゲンを含まないこ とが望ましい。ＡＨＦを使用する場合、組成物はタンパク２当り約３５国除草位 以上約２００単位までを含有するであろう。好ましい具体例においては指示薬タ ンパクは処理すべき製品中のそれと実質的に同一である。実際好適な指示薬は処 理すべき各血漿タンパクロフトの部分標本からつくることができる。タン／ぐり は好ましくはヒトタンパクであるが、ウシまたはブタ起源も使用することができ る。

ビールスは好ましくは通常ヒトに感染性ではなく、それにより混入コストを低く する。しかしながら研究室作業者の安全のため、そして処理した製品の完全性を 確実にするため、該ビールスはヒトに注入した場合肝炎感染に責任ある候補また は既知病原ではないことが重要である。そのようなビールスは有害であり、そし てそれらの血漿分画製造環境への導入は避けなければならない。ビー／ｌ／スの 濃度はタンパク約０．０１ないしｌｙ中約３ないし８０１ｏｇ、。ブラック形成 単位の範囲であろう。

指示薬は通常ビールヅをタンパクの水溶液中に懸濁し、ガラスまたはプラスチッ ク製の１０または３０ｔｎ！、容器へ充填し、凍結乾燥し、そして真空または窒 素のような不活性カス下シールする。

組成物は後光時水溶性である。

それらは指示薬を処理した組成物のビールスを不活性化するために使用した同じ 条件へさらし、次に生物学的指示薬中に不活性化されないで残っているかも知れ ないビールスを定量する。生物学的指示薬は製品バイアル中に入れ、熱処理する ことが好ましく、これは不活性化条件が実質上同じであることが確実になること 号助ける。

生物学的指示薬に使用するのに適したビールスは細菌、植物および動物ビールス を含む。動物ビールスは好ましくは安全性理由のため通常ヒトに感染性ではない 。またビールスは理想的には生物学的指示薬に使用したタンパクの提供音種に対 しても感染性であってはならない。この理由はそのようなタンパクが提供者の以 前の感染またはワクチン投与の結果として診ビールスに対する抗体で汚染される ことがあり、そして該抗体がビールス培養を妨害することがあるからである。こ −でこの目的のための最良の生物学的指示薬は高度に熱に安定なビールスを使用 する。この点に関しバクテリオファージとして知られる細菌ビールスがすぐれた 選択である。最後に、Ｓゑビールスは容易に培養できなければならない。大部分 の植物および動物ビールスはこの好ましい基準に合致するが、しかしバクテリオ ファージはもっとも容易に、安価に培養される。

例示的ビールスは脳心筋炎ビールス（ＥＭＣ’）、マウス脳せき２ 髄炎ビールス、サル腸内ビールス、およびウシ腸内ビールスのようなピコルナビ ールス；シンドビス、セスリキ森林ビールス、西部ウマ脳炎ビールス、および黄 熱病ビールスを含むトガビールス；ラウス左部肉腫ビールスのようなレトロビー ルス−ニューキャッスル病ヒールスのようなバラミキソビールス；ボリオマビー ルスおよびサルビールス４０を含むバポビールス；ヘルペスシンプレックス、　 偽狂犬病ビールスおよびマレックス病ビールスのようナヘルヘスヒールス、ｅ染 性イヌ肝炎およびアテノビールスのようなアテノビールス族のメンバー；および Ｒ１７，ラムダ、Ｔｌ。

Ｔ２．Ｔ４．Ｔ７およびパイＸ１７４のようなバクテリオファージを含む。ビー ルスの混合物も使用し得る。

処理した製品または生物学的指示薬中のビールスを測定するための適当な方法は 全く慣用的であり、当業者には自明である。そのような一方法はブラック形成試 験である。この方法においては、テストサンプルの生理学的希釈剤中の希釈液が 生きている感受性細胞の固定層へ接触させられ、ビールスが細胞へ吸収される時 間を許容し、細胞を成育媒地ゲル上へ重ね、そして細胞培養物の生存を他の点で 最適化する他の条件が設定される。感染し細胞内で増殖するビールスは寒天上層 によって偏在化される。ビールスは一次的に感染した細胞から隣接した細胞へ広 がり、ブラックと呼ばわる細胞退化の円形区域または焦点を形成する。これらの 焦点は生体染料中性レッドで単層を染色することによって普通可視化される。感 染した細胞の焦点は生体染料を集めることがなく、従３ つて着色した背景に対して透明な区域として現われる。従ってブラックの数はテ ストサンプルの感染性の測定である。

使用し得る他の定量法は感染性宿主に対する感染性のための生体内テストを含む 。そのような方法は良く知られている。肝炎Ｂはこれまでこのビールスを試験管 内で培養することが不可能であるからこの方法で定量しなければならない。通常 の操作は肝炎Ｂ抗体陰性チンパンジーまたはマルモセットに試験すべきサンプル を接種し、数週間インキュベートし、そして次に肝炎Ｂ感染の臨床的および血清 学的証拠を観察する。

処理したサンプル中の正常なビールス抗原に対する免疫アッセイはもしも抗原が 検出不能であるときだけ合理的最終結果が得られ、そして前述のように免疫アッ セイは十分に感受性である。もし両方の要件を満たせば、この処理はビールス外 皮部位を完全に変性するのに十分に厳しかったことになる。このような処理はビ ールスを生物学的に不活性に、従って非感染性にしたものと考えることは一般に 安全である。しかしながら抗原を変性するのに要する条件は多くの場合ビールス を生物学的に不活性化するのに必要な条件よりも遥かに厳しいであろうから、ビ ールスの不活性化が起った点をこのような定量の使用によって決定することは好 ましくない。このように製品の不必要なロスがサンプルが非感染性であると証明 できる前に発生するであろう。

こ＼で記載する方法の特に価値ある特徴は、すべての肝炎ビールスを熱処理によ って不活性化することができるが、しかし酵素４ 活性には有意な低下がないことである。これは肝炎Ａ、肝炎Ｂおよび非Ａ非Ｂ肝 炎を含む。これらビールスは治療用血液凝固酵素組成物の主要な既知汚染源であ る。この方法の利益は、生物学的指示薬として使用するための上記のビールスの 特定個性と、それに前記肝炎ビールスの生体内活性とが酵素活性の同時に匹敵す る低下なしに完全に破−壊し得ることである。しかしながらこ＼に記載する方法 は血液凝固酵素組成物中に存在するすべてのビールスに対し広い適用性を有する 。

こ−に記載する新規方法によって製造された組成物は、それらは生物学的に感染 性のビールスを実質上歯まないが、熱処理された生物学的に非感染性ビールスの 残渣を含まない点において独特なものである。例えば、生体内で非感染性にされ た肝炎汚染酵素組成物は活性ビールスについての慣用的アッセイにおいて免疫競 合的置換によって現行技術水準のもとに検出し得るように、感染性ビールスと一 部なお免疫交差反応性の残渣を含有する。

さらに、この組成物は実質上変性された血液凝固酵素を含まない。変性した血液 凝固酵素は一般に水溶液中の加熱により、またはビールスを不活性化するために 使用する他の技術により、酵素活性が不可逆的に破壊されたものと定義される。

この組成物は変性および活性酵素の全モル数を基準にして約１０モル５未満の変 性酵素を含有するであろう。組成物は好ましくは変性酵素を５モル％以下含有す る。変性した酵素は慣用技術を使用するイムノアッセイによって検出し得る。

５ こ＼に記載した方法によって製造された酵素組成物は治療上有効な濃度に復元し 、患者へ投与することができる。そのような組成物は無菌である。しかしながら 組成物はもしそれらを診断テストに試薬として使用するのであれば無菌である必 要はない。例えば与えられた凝固酵素分含む組成物は該凝固酵素の標準またはコ ントロールとして機能し得る。そのような組成物は普通復元され、そして使用の ためある期間貯蔵され、その間にバクテリアが生育し試薬に影響することがある から、好ましくはアジドのような抗微生物剤が組成物に含有される。その代りに 詮所試薬は無菌口過および包装によって滅菌することができる。

もし血漿またはその成分の還元糖の含量がテヒドロゲナーゼおよびクレアチンフ オスフオリナーゼのような酵素に対して比較的非破壊的なレベルで減らされるな らば、全または脱フィブリン血漿を血液凝固酵素と同じ方法で肝炎ビールス不含 コントロールおよび標準として使用するためにつくることができる。糖は必要で あれば熱処理後に血漿へ加えることができる。

本発明は以下の実施例を参照してもっと十分に理解されるであろう。

実施例１ この実施例は乾燥プロトロンビン複合体の熱安定性を証明する。

この製品は実質上活性化されていない。実質上Ｆｅｋｅｔｅ　らの米国特許第３ ，５６０，４７５号の方法によって製造した市販のプロトロンビン複合体の２０ ツトのそれぞれからの凍結乾燥プロドロ６ ンビン複合体の３０ｍｅ密封バイアルを３木づつ表２に記載の時間および温度で 加熱した。プロトロンビン複合体因子、活性化された因子ｘ（ｘＨ）、活性化さ れた因子ＩＩ（）ロンビン）およびｐＨを前に記載した慣用方法に従って定量し た。サンプル希釈度ｌ：１００におけるキングトン時間をＰｅｐｐｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　ＪｏｕｒｎａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ　３６：５７３ （１９７７）またはＫｉｎｇｄｏｎ　ｅｔ　ａｔ　、、ＡｂｓｔｒａｃｔＡ８６ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉ ｅｔｙ　ｏｆ　Ｈａｍｔｏｌｏｇｙ　。

Ａｔ１ａｎｔａ　（１９７４）によって測定した。このアッセイは非活性化部分 トロンボプラスチン時間テストとしても知られる。タンパク分解活性を２種の合 成色原体プロテアーゼ基質、すなわちオルソダイアグノスティックス社よシ入手 し得るＳ−２１６０（Ｎ−ベンゾイル−フェニルアラニル−バリル−アルギニル −ｐ−ニトロアニリドＨＣＩ）およびＳ−２２３８（Ｄ−フェニルアラニルービ ペコリルーアルギニルーｐ−ニトロアニリドＨＣＩ）を使用して定量した。

（以下余白） ７ 表　２ ４日　７日　４日　７日 ロット５８１Ｍ１３３ Ｆ−４ａ（Ｕ／ｍ／）　０．１　０．１　０．２　０．１　０．２キンク下ン時 間（秒）　１９ｓ　１７５　１４９　１８４　１７７トロンビン（Ｕ／ｍｌ）　 ０．００１　０．００１　０．００１　０．００１　０．００１基質Ｓ−２２３ ８０，０７−０，１０−０，１２ｐＨ７，０７，０７，０７，０７，０ 残存活性％ Ｆ−ｎ　ｌｏｏ　９１　１００　８８　８１Ｆ−１１１００１１１１０２９２７ ８ Ｆ−ｒｔ　１００　８９　８４　８１　７０Ｆ−ｘ　１００　９４　８３　９０ 　７８（以下余白） ８ 表２（続き） Ｆ−Ｘ　ａ　（Ｕ／ｍｅ）　０．２　０゜２　０．１　０．２　０．２キングト ン時間（秒’）　１７０．　１９５　１７２　１５４　１３７トロンビン（ＬＪ ／ｍｆ’）　０．００１　０．００１　０．００１　０．００１　０．００１タ ンパク分解活性 基質Ｓ−２１６００，２０，２０，２０，２０，２基質Ｓ−２２３８０，０７０ ，０６０，０５０，０７０，０６ｐＨ７，０７，０６，９６，９７，０ 残存活性％ Ｆ−ｎ　１００　９７　９０　８９　８４Ｆ−■　１００　９３　１０２　９７ 　９４Ｆ−Ｉ！　１００　９２　９５　７６　８８Ｆ　−４１００１０４９０７ ９８０ （以下余白） ９ ４種の未活性化凝固因子についての平均残存活性％を各温度について４日および ７日目に計算し、次に図面に点線にプロットした。

実施例２ この実施例はプロトロンビン複合体中のビールスの熱不安定性を扱う。シンドビ ス、脳心筋炎（ＥＭＣ）、ポリオｌ型およびアデノ５型ビールスの懸濁液をそれ ぞれプロトロンビン複合体の部分標本中に希釈し、５ｍｅバイアル中へ１　ｍｅ 部分標本に分注し、凍結乾燥し、そして真空包装した。バイアルを７０℃および ６０℃で４０時間まで加熱し、サンプルバイアルを規則的間隔で取り出した。５ ℃１．／）コントロールおよび熱処理バイアルの中味を１　ｍｌの無菌水で復元 し、以下に記載するようにビールス力価について定量した。シンドビスビールス のコントロール濃度は復元したｍｅ当り６ないし７１ｏｇｚｎブラ′ツク形成単 位（ＰＦｔＪ／ｉｆ）であり、ＥＭＣおよびポリオビールスは約４　］００ｇ１ ｏＰ　Ｆ　Ｕ／ｍｌであった。アデノビールス濃度はｄ当り約４．５　Ｘ　ｌｏ ｇ１ｏ組織培養５０％感染性用量（ＴＣＩＤ−５０）であった。

このＴＣＩＤ表ａｔ法は以下のように説明し得る。生物学的定量においては、終 点は通常テスト糸のある割合が反応するがまたは死滅する点の希釈度として決め られる。１００％終点がしばしば使用される。しかしながらその正確性は小さい チャンス変動によって大きく影智される。望ましい終点はテスト糸の半分が反応 し、０ 法は５０％反応値付近の近接して離れた希釈度におけるテスト系の多数を使用し 、そして正確な値を補間することであるＴＣＩＤ５０終点力価の負対数＝ 組成物培養５０％終点は接種した培養物中の細胞の５０％に細胞病理学的変化を もたらすビールス力価を表わす。濃度の測定に＠記技術を適用する場合、最低必 須培地グラ１２％胎児コウシ血清中に対数希釈を用意する。各希釈度の０．２ｍ ｅをミクロタイタープレート中のＢＧＭＫ（バッファロー、グリーン、モンキー 、キドニー）の反復用培養物へ添加する。接種した培養物ｆ５％ＣＯ２のもとて ３６℃でインキユベートシ、顕微鏡で７ないし８日観察する。与えられた希釈度 において培養物中の細胞の死滅％を屈折性の細胞で証明される細胞退化を観察す ることによって測定する。

Ｔ　ＣＩ　Ｄｓｏは上に示したようにして計算される。

ＥＭＣ，ポリオビールスおよびシンドビスビールスのアッセイは前述のようにビ ールス懸濁液の希釈液を調製することによって得られる。ＢＧＭＫ細胞単層は３ ５ｍｒべ）　ＩＪ皿に調製された。細胞へのビールス吸Ｉｌ又は該単層へ懸濁液 ０．２　ｍｅを加えることによって開始された。１時間後、単層を栄養寒天培地 に重ね、そして３７°Ｃにおいて２４ないし７２時間インキュベートした。生成 した１ ブラックを次に細胞を食塩水中１　＋　２０００の中性レッドで染色することに よって可視化した。

シンドビスビールスについての結果をデータへ直線をあてはめることを許容する ため最小自乗法で回帰解析にかけ、図面にプロットした。見られるように、不活 性化率は４７°Ｃにおけるよりも６０°Ｃにおいてかなり高いが、５°Ｃコント ロールには変化が起きなかった。同様な結果は他の３種のビールスＯこついても 得られる。

図面にプロットした実施例１および２の結果の比較は、乾燥したプロトロンビシ 複合体酵素はビールスに比較すると非常に低い割合で熱で不活性化されることを 示す。不活性化率の最大の差は約６０℃において発生する。このときプロトロン ビン複合体の無視できる損失だけがビールスが完全に不活性化される時に発生し た。

実施例３ この期待される実施例は活性化および未活性化プロトロンビン複合体中の肝炎Ｂ の不活性化に関・する。活性化因子の低力価を有する市販プロトロンビン複合体 くプロブレックス分画、ハイランドラボラトリーズ社）の製造ロフトの部分標本 を約３０，０００チンパンジー感染投与量／　１０　ｍｅを得るのに十分な肝炎 Ｂビールス（ＦＤＡ生物学局肝炎支所から得た）と混合した。活性化プロトロン ビン複合体（オートブレックス濃縮物、ハイランドラボラトリーズ社）も同様し こ肝炎Ｂビールスで接種した。分画中のビールスの量は三代肝炎Ｂ抗原（ＨＢＡ ｇ）検出システムの感受性においてまたはその付近で検出可能であった。

２ ビールスとプロトロンビシ複合体とを混合した後、感染した製品をバイアル中へ １０ｍｅ部分標本として分注し、凍結乾燥し、乾ロトロンビン複合体を含むバイ アル２木づつを６０℃に保った水浴中に７２時間浸漬し、ビールスを不活性化し た。感染した製品ヲ含む未処理バイアルはコントロールとして冷蔵庫に貯蔵した 。

６頭のチンパンジー（Ｐａｎ　ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ　）を研究のために選定 した。いずれも以前如何なる種類の肝炎Ｂ研究に使用されたことはなく、血液ま たは血液製剤を投与されたこともなく、すべてどのような臨床的肝炎徴候はなく 、そして許可されたラジオイムノアッセイ操作によってＨＢ５Ａｇ、　ＨＢ５Ａ ｇ　に対する抗体（抗ＨＢｓ）および肝炎コア抗原（抗ＨＢｃ）に対する抗体に 対して陰性であった。

ベースライン値はアラニン了ミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）。

アスパルテートアミノトランスフェラーゼについて各動物からの８週毎の血液サ ンプルから、および完全血液カウントについて２週毎から確立された。チンパン ジーは一旦それらの健康が確立され、そして併発症が存在しないことが決定され れば適当であると判定された。

上で調製した肝炎Ｂ接種製品のバイアルは無菌水中に１０ｍ１’の容積にそれぞ れ復元された。各バイアルの復元した中味はチンパンジーへ静注された。２頭の チンパンジーは２種のコントロールのための受容体として使用された。コントロ ールは無菌水１０ｍｅ中に復元され、熱処理した製品と同じ方法で投与された。

３ チンパンジーは注意深く検疫され、そして肝炎感染の徴候について８ケ月間監視 された。ＨＢ５Ａｇ、抗ＨＢ８．抗ＨＢｃ、　ＡＬＴ、　ＡＳＴ　および肝炎Ａ ビールスに対する抗体が毎週測定された。そして完全血液カウントが接種後２４ 過は２週毎に、その後は２８週および３２週毎に測定された。肝臓は６ケ月まで １ケ月毎に、そしてその後３２週目に生検された。コントロール動物は該ビール スの通常の潜伏期間をもって肝炎を発病したが、熱処理したプロトロンビン複合 体および活性プロトロンビン複合体を注射した４頭のチンパンジーは感染しなか った。

実施例４ この期待される実施例はプロトロンビン複合体中の非Ａ非Ｂ感染性ビールスの不 活性化を証明する。この研究に使用した非Ａ非Ｂ肝炎ビールスのソースはＢｒａ ｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　３：　２５３− ２６９（１９７９）によって記載された。このソースは少なくとも３−の量で静 注したとき肝炎ＡまたはＢ以外の肝炎を起こすことが示された抗血友病因子ロフ ト（ヘモフィル濃縮物ロツ）　０５９ＤＯ５６ＡＡ　’）であった。該ソースの ＡＨＦは製造者の指示書に従って復元し、プロトロンビン複合体の商業ロフト（ プロプレックス濃縮物）中にソース１部対プロトロンビン複合体９部の比で希釈 し、１．０ｒｎＩ！部分標本にバイアルへ注入し、凍結乾燥し、乾燥窒素で掃気 し、シールした。バイアル２木を実施例３と同じ方法で加熱し、コントロールは 貯蔵Ｌｌ。

実施例３において熱処理した材料を投与され、そのため肝炎症４ 候のない４頭のチンパンジーのうち３頭がこの研究において実験対象として使用 された。バイアルは復元され、適当に注射され、検疫され、８ケ月間監視された 。テストおよびテストスケジュールは実質上実施例３と同じである。コントロー ル動物も肝炎の生化学的証拠が明らかになった時チトメガロビールスおよびＥｐ ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒビールスに対する抗体力価について試験した。フントロー ル動物は非Ａ非Ｂ肝炎を発病したと判定されたが、熱処理材料の受容体はいずれ も感染しながった。

実施例５ 肝炎Ａをこの期待実施例に従って不活性化した。肝炎Ａビールスのソースは市販 の肝炎Ａに対するラジオイムノアッセイによって決定された肝炎Ａの急性期にあ る患者の糞サンプルであった。

糞サンプルを食塩水１０Ｗｄ！中にホモジネートシ、次に粒状物を除去するため ｌ、５００Ｇで遠心した。上清を注意深く傾斜し、遠心チューブの底にビールス ペレットが集まるまで超遠心機中５０゜０００Ｇで遠心した。このベレットを免 疫電子顕微鏡分用いて約１０　ｌｏｇ、。粒子／　ｍｌの力価に食塩水中に再懸 濁した。この懸濁液を前３ｅ実施例で使用した市販プロトロンビン複合体ロット の部分標本中に１：５に希釈し、１０ｍｅをバイアル中に分注し、凍結乾燥し、 そして真空下シールした。

材料を実施例４と同じ方法で熱処理し、チンパンジーにテストした。熱処理した プロトロンビン複合体は非感染性であった。

実施例６ ５ この期待実施例は血漿タンパク製品中のビールスの熱不活性化を確認するために 適した生物学的指示薬の製造および使用を記載する。指示薬に使用する代表的な 血漿タンパクはＡＨＦ　ｌ　５国際車位／−および製造者の指示書に従って復元 した時タンパク約０．０５ｙ／ｄを含有する市販のＡＨＦ含有組成物であった。

組成物はＡＨＦに加えてフィブリノーゲンおよび同定されない血漿タンパクを含 むが、しかし検出し得る還元糖は含有しなかった。無菌水のＴ４バクテリオファ ージを復元した組成物がファージ粒約６Ｘｌｏｇ、。／ｍｌ’含有するのに十分 な量で乾燥した無菌ＡＨＦＭ成物へ添加した。組成物１ｒｎＩ！をアンプルへ充 填し、凍結乾燥し、アンプルを窒素気流下シールした。２木のアンプルを因子「 の複数のバイア　Ａ／と並列に６０℃で９０時間熱処理した。その後アンプルの 中味を無菌水１−に溶解し、無菌水中へ１：２ないし１：６４に系列的に希釈し 、各希釈液をＥ、　ｃｏｌｉバクテリアで接種した栄養寒天を含むペトリ皿へ重 ねた。どの希釈度においても４ないし８時間インキュベーション後ブラックが出 現せず、ＡＨＦ組成物中のＴ４ファージの不活性化を示し、そしてそれにより熱 処理が因子■製剤中に存在したかも知れないどんな外米ビールスの不活性化にも 成功であったことを結論した。

実施例７ 安定な肝炎なしの血漿コントロールをこの期待実施例に従ってつくった。肝炎Ｂ ビールスに汚染されていると信じられるヒト血漿プールの２１を酢酸セルロース バッグに入れ、連続的に取り換６ オーられる食塩水２１に対して透析された。この処理は血漿プールノ還元１ａｔ ｋ含量（グルコースおよびフルクトース）、それにアミノ酸、有機酸、ビリルビ ン、クレアチン、クレアチニンおよび尿酸のような他の低分子量溶質含量？除去 した。透析した血漿を口過して不溶物を除き、そして次に約−４０℃に保ったフ ロロカーボン冷凍剤の移動浴中に連続流として通過させた。血漿は小球に直ちに 凍結し、冷凍剤から集めた。冷凍剤は凍結血漿から排出することを許容され、そ の後血漿を真空乾燥した。乾燥ビーズ（約１３０ｙ）を容器に入れ、窒素で掃気 し、容器をシールし、７０℃に保った水浴中に３０時間浸漬した。粉末グルコー ス１．４ｙを注意深く乾燥血漿ビーズと混合し、製品をバイアルに充填し、秤量 し、シールした。乳酸テヒドロゲナーゼおよびクレ了チンホスホリナーゼのよう な診断学的に重要な酵素の活性は殆んど保存された。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．感染性ビールス牙含有する血液＆固酵素組成物を乾燥状態において該ビール スが不活性化されるまで加熱することを特徴とする前記組成物の処理方法。 ２、　ビールスは肝炎Ａ、Ｂまたは非Ａ非Ｂである請求の範囲第１項の方法。 ３、組成物は約５重量％までの水を特徴する請求の範囲第２項の方法。 ４、組成物は約１重量％の水を含有する請求の範囲第３項の方法。 ５、酵素がプロトロンビンである請求の範囲第２項の方法。 ６、酵１が因子■である請求の範囲第２項の方法。 ７、酵素が因子■である請求の範囲第２項の方法。 ８、酵素が因子！である請求の範囲第２項の方法。 ９、酵素が因子Ｉである請求の範囲第２項の方法。 １０、酵素がハーゲマン因子である請求の範、門弟２項の方法。 １１、酵素が活性化した因子■である請求の範囲第２項の方法。 １２、酵素が活性化した因子■である請求の範肝第、２項の方法。 １３　酵素が活性化した因子Ｘである請求の範囲第２功の方法。 １４、酵素が活性化した因子℃である請求の範囲第２項の方法。 １５、酵≠が活性化したハーゲマン因子である請求の範囲第２項の方法。 １６　組成物は実質上因子■からなる請求の範囲第２ｒＩＡの方法。 ８ １７、組成物は実質上トロンビンを含まない請求の範囲第２項の方法。 １８、組成物は実質上プラスミノーゲンを含まない請求の範囲第２項の方法。 １９、組成物は実質上プロトロンビンを含まない請求の範囲第２項の２１、組成 物は実質上抗匍友病因子を含まない請求の範囲第２項の方法。 ２２、組成物は実質上アルブミンを含まない請求の範囲第２項の方法。 ２３、組成物は実質上プラスミノーゲン企含まない請求の範囲第２項の方法。 ２４、組成物は実質上因子■を含まない請求の範囲第２項の方法。 ２５、組成物は実質上抗トロンビン■を含まない請求の範囲第２項の方法。 ２６、組成物は実質上プラスミンを含まない請求の範囲第２項の方法。 ２７、組成物は実質上ガンマグロブリンを含まない請求の範囲第２項の方法。 ２８．２　組成物が約１ないし３重量％のアルブミンを含む請求の範囲第２項の 方法。 ２９、組成物はアミノ酸の安定化量を含む請求の範囲第２項の方法。 ３０、アミノ酸がグリシンまたはプロリンである請求の範囲第２９項９ の方法。 ３１　組成物は非還元性単糖類、オリゴ糖類または糖アルコールの安定化量を含 む請求の範囲第２項の方法。 ３２　組成物は糖アルコールを含む請求の範囲第３１項の方法。 ３３、［ｙルコールがマンニトールまたはソルビトールである請求の範囲第３１ 項の方法。 ３４　組成物は１．０モル／ｌ以下のアミノ酸および２’Ｏｗ／ｗ％以下の非還 元性単糖類、オリゴ糖類または糖アルコールを含有する請求の範囲第２項の方法 。 ３５、組成物は約６，０ないし８．０のｐＨを持つ請求の範囲第２項の方法。 ３６、組成物は活性化したプロトロンビン複合体である請求の範囲第２項の方法 。 ３７　組成物は実質上未活性化プロ）ｏンビン複合体である請求の範囲第２項の 方法。 ３８、組成物は因子ｒ１を含有し、そして実質上池の血液凝固因子な含まない請 求の範旺第２項の方法。 ３９、組成物は単位／ｒｎｅで表わして以下の血液凝固酵素、すなわちプロトロ ンビン約１ないしｌＯ；総置子■約７３ないし１９０．活性化された因子■約８ ないし８０；総置子■約１５ないし１１２；因子■前駆体約０ないし３０；総置 子Ｘ約１ないし３０．活性化因子Ｘ約１ないし２０；およびトロンビン約０．０ ０３以下を含有する請求の動り第２項の方法。 ０ ４０、組成物は組成物が加熱される前に細胞微生物を除去するため無菌口過され る請求の範囲第２項の方法。 ４１、抗バクテリア剤が組成物へ添加される請求の範囲第２項の方法。 ４２、抗バクテリア剤がアジドである請求の範囲第４１項の方法。 ４３、組成物は約４０ないし８０℃で加熱される請求の範囲第２項の方法。 ４４、組成物は約５０ないし７０℃で加熱される請求の範囲第４３項の方法。 ４５、組成物は約５ないし２００時間加熱される請求の範囲第４３項の方法。 ４６、組成物は実質上活性化および未活性化因子■よりなる請求の範囲第２項の 方法。 ４７、ビールスはヒトに非感染性である請求の範囲第４６項の方法。 ４８゜　ビールスはシンドビスビールス、ヘルペスシンプレックス、バクテリオ ファージまたは脳心筋炎ビールスである請求の範囲第４６項の方法。 ４９、血液凝固酵素組成物を乾燥状態において肝炎Ａビールスが不活性化される まで加熱することを特徴とする血液凝固酵素組成物中の肝炎Ａを不活性化する方 法。 ５０、ｆｌ′ｒｌ液凝固酵素組成物を乾燥状態において肝炎Ｂビールスが不活性 化されるまで加熱することを特徴とする血液凝固酵素組成物中の肝炎Ｂを不活性 化する方法。 ５１、血液凝固酵素組成物を乾燥状態において非Ａ非Ｂ肝炎ビールス１ が不活性化されるまで加熱することを特徴とする血液凝固酵素組成物の非Ａ非Ｂ 肝炎を不活性化する方法。 ５２、非感染性ビールスと少なくとも１種の血液凝固酵素を含み、感染性の形の 該ビールスおよび変性された形の該血液凝固酵素を実質上含まない組成物。 ５３、ビールスは肝炎Ａ、Ｂまたは非Ａ非Ｂである請求の範囲第５２項の組成物 。 ５４、総酵素の約１０モル％以下が変性した酵素よりなる請求の範囲第５２項の 組成物。 ５５、酵素はプロトロンビンである請求の範囲第５３項の組成物。 ５６、酵素は因子■である請求の範囲第５３項の組成物。 ５７、酵素は因子■で°ある請求の範囲第５３項の組成物。 ５８、酵素は因子Ｘである請求の範囲第５３項の組成物。 ５９、酵素は因子Ｉである請求の範囲第５３項の組成物。 ６０、酵素はハーゲマン因子である請求の範囲第５３項の組成物。 ６１、酵素は活性化された因子■である請求の範囲第５３項の組成物。 ６２、酵素は活性化された因子誼である請求の範囲第５３項の組成物。 ６３、酵素は活性化された因子Ｘである請求の範囲第５３項の組成物。 ６４、酵素は活性化された因子型である請求の範囲第５３項の組成物。 ６５、酵素は活性化されたハーゲマン因子である請求の範囲第５３項の組成物。 ６６、組成物は因子■を含有し、そして他の血液凝固酵素を実質上含有しない請 求の範囲第４３項の組成物。 ２ ６７、組成物は実質上未活性化プロトロンビン複合体である請求の範囲第５３項 の組成物。 ６８、組成物は活性化されたプロトロンビン複合体である請求の範囲第５３項の 組成物。 ６９、無菌である請求の範囲第５３項の組成物。 ７０、乾燥状態である請求の範囲第５３項の組成物。 ７１、非感染性肝炎Ａビールスと少なくとも１種の血液凝固酵素を含み、感染性 の形の該ビールスおよび変性された形の該血液凝固酵素を実質上含まない組成物 。 ７２、非感染性肝炎Ｂビールスと少なくとも１種の血液凝固酵素を含み、感染性 の形の該ビールスおよび変性された形の該血液凝固酵素を実質上含まない組成物 。 ７３、非感染性肝炎非Ａ非Ｂビールスと少なくとも１種の血液凝固酵素を含み、 感染性の形の該ビールスおよび変性された形の該血液凝固酵素を含まない組成物 。 ７４、血漿から実質上すべての還元糖を除去し、血漿を凍結乾燥し、ビールスが 不活性化されるまで凍結乾燥した血漿を加熱することを特徴とする感染性ビール スを含む血漿がらコントロールまたは標準を製造する方法。 ７５、ビールスを不活性化した後還元糖を添加する請求の範囲第７４項の方法。 ７６、請求の範囲第７４項の方法によって製造された製品。 ３