JPS5916668B2 - 血清学的検査試験法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、補体結合反応に基づく新規な血清学的検査法
に関する。

３５異物が非経口的に取り入れられた場合、生体はし
ばしば防御反応をおこし、いわゆる抗体ができる。

抗体の形成をおこさせる物質は抗原として知られている
。これらは通常蚕白質またはその減成物、類脂体および
多糖類の混合物、例えば細菌、ウィルス、血球および毒
素である。形成された抗５ 体は、抗原が細胞傷害作用
を持つている場合には免疫体とも言われるが、非常に特
異的な反応によつて抗原と結合する。それゆえに抗体が
存在すると、対応する抗原に対する生物の特異的な耐性
ができる。・ｏ その高度の特異性のために、抗体を対
応する抗原の同定に用いることができる。

ある免疫体が生物中に存在することが証明されれは、高
度の確実性をもつてその生物が対応する抗原にさらされ
たと結論することができる。抗体を検出する方法は、５
原則として非常に簡単で、体液、例えば血液を抗原に
接触させることである。もし抗原−抗体反応が起つたな
らば、これは抗体が存在する証拠である。抗原にさらさ
れたという証拠が、抗原がもはやその生物に存在しない
場合でも、それに対応すワ る抗体によつて得られると
いうことが特に重要である。溶解素群に属する抗体の検
出は、しばしばいわゆる補体結合反応によつて行われる
。

溶解素は、あらゆる正常血清中に存在する非特異的成分
いわ、ゆる補体の存在下に、それらを対応する抗原と接
触させて証明された特異な溶菌性、ウィルス撲滅性、細
胞崩解性または溶血性をもつた抗体である。補体がなけ
れば、特異的抗体は不活性のままである。溶解素はその
作用を現わすためには２つの物質、抗原と補体、と結合
しなければならないから、アンボセプトル（アンボセプ
ター、両疫体または・双受体）として知られている。赤
血球に特異なアンボセプトルは、特に溶血素と呼ばれる
。補体あるいは補体系（にあるいはびと略す）は不安定
な血清機能であつて、今日知られている限りでは、少く
とも１０血清酵素因子からなり、５６℃に半時間加熱す
るか室温に放置するとその活性を失う。

加熱により補体系Ｃ′を不活性化できることは血清学的
反応方法の根本的な部分である。抗体をもつている患者
の血清を５６℃に３０分間加熱すると、対応する抗原と
反応を起さずに混合することができる。抗原と抗体（こ
の場合は溶解素、言いかえればアンボセプトル）との反
応は、補体を含む系、例えば新鮮な、加熱しない血清を
加えると起る。抗原とアンボセプトルとの反応の補体依
存性は、いわゆる溶血系で特に印象的に証明することが
できる。

溶血系とは赤血球とこれらの赤血球に対して特異なアン
ボセプトル、即ち溶血素との系を意味する。実際に、使
用する溶血素は溶血素成分のみを含み、抗原／抗体／補
体反応に必要な他のいかなる反応体も含まない、言いか
えれば補体系Ｃ′を不活性化するのに十分長く５６℃に
加熱した血清である。使用する赤血球は一般に羊の赤血
球であつて、これに特異な溶血素は羊の赤血球に感作さ
れた補体不活性化された兎の血清である。赤血球懸濁液
をまず溶血素溶液に加えると血清中に赤血球懸濁液が得
られる。これを補体を含む血清、一般に血球の無い新鮮
なモルモツトの血清に加えると溶血反応が起る。即ち補
体を加えると羊の赤血球の膜は破壊され血液色素は溶液
に入つて行く。溶血系と補体（以下に於て補体とは常に
補体を含む新鮮な血清を意味する）との反応は、それ故
に補体の存在を定量的にも定性的にも示す純呈色反応で
ある。補体が存在する場合にのみ（時々起る、後に述べ
る自然の場合は別として）、赤血球を含んたはじめは無
色ないし淡黄色の溶液は血液色素を取り込む。赤色の強
さは、或限度内において、補体の活性量に依存する。補
体が大量存在するか高度に活性化されている場合には溶
血反応すなわち血球上の溶液が短時間に濃く着色するが
、補体が少量しか存在しないか活性が低い場合は、同じ
溶血系は同じ時間にほんの少量の溶血反応しか受けない
。溶血系はそれ故に補体を必要とする反応の適当な指標
であり、即ちそれは他の抗原とそれに対応する抗体との
反応、特に溶血反応ほど出現の明白でない抗原／アンボ
セプトル／補体反応の検出の指標系として役立つ。

原理は非常に簡単であり、抗体の存在を試験したい血清
であつて、その中の補体が不活性化されている血清（普
通、試験血清あるいは患者血清という）をその対応する
抗原と一緒にし、次いで補体を加える。試験血清が用い
た抗原に対する特異な抗体を含んでいない場合は、加え
た補体は使い尽くされず、従つて補体はまだ他の抗原／
補体反応に用いることができる。それ故に、もし試験系
即ち試験血清および抗原が溶血系をも含むときは（この
溶血系は、インキユベートした後、他の成分に加える）
、溶血反応が起り溶液は着色する。溶血反応が起ること
は陰性の試験結果、即ち与えられた抗原に対する特異な
抗体が存在しない証拠とみなされる。しかしながら、も
し試験血清が与えられた抗原と補体の存在下に反応する
抗体を含んでいるときは、補体は殆んどまたは全く溶血
反応に用いられず、溶血反応は存在しないかまたは弱め
られる。試験血清、抗原、溶血系および補体からなる系
に溶血反応がないことは陽性の試験結果、言いかえれば
試験血清は与えられた抗原に対応する抗体を含んでいる
ことを示すものとみなされる。上記試験法は血清検査室
において２補体結合反応２として確立され、その対応す
る抗体によつて病原体を検出するのに広く用いられてい
る。

補体結合反応は特に梅毒の診断に重要になつたばかりで
なく、ブルセラ症、包虫、淋疾、百日咳、レプトスピラ
症、足および口の疾患、おたふくかぜ、天庖癒、鼻硬化
症、馬鼻痕、結核、トキソプラズマ病、旋毛虫症および
ウイルスおよびその他の疾患の診断に殆んど同程度に用
いられている。上記補体結合反応の原理は非常に簡単で
はあるが、下記梅毒試験の例から見られるように実施は
実際には非常に複雑である。この試験は一般に別別に貯
蔵されなければならない５つの反応体または反応体の溶
液が必要である：１）患者の血清（Ｐ）。

血液（一般に静脈血）を試験管に入れ、管壁から血餅を
ガラス棒または長い白金針で剥離し、ガラス管を一夜約
２〜５℃に放置して得られる。血清は普通容易にピペツ
トで採取することのできる澄明な液体として分離する。
新鮮に採取された血液は、直ちに強く冷却し遠心分離し
てはならない。というのは血清はそうすれば溶血反応に
非特異的な抑制を表わしやすいからである。ピペツトで
採取された血清は、補体を不活性化するために半時間約
５６℃に加熱する。それは一般にその５倍容量の、出来
る限り無菌にした０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈す
る。２）羊の赤血球（Ｅ）。

生理的食塩水で洗浄し、一般に２〜４％懸濁液として用
いられる。生理的食塩水の代りに、洗浄に用いられるも
のとしては、コルマ一（ＫＯｌｍｅｒ）またはオスラー
ストラウスーマイエル（０ｓ１ｅｒ−Ｓｔｒａｕβ−Ｍ
ｅｉｅｒ）溶液のような同様な溶液が用いられる。懸濁
液の濃度は種々な方法、特にヘマトクリツト（Ｈａｅｍ
ａｔＯｃｒｉｔ）測定法により調整される。

３）溶血素（Ａ）。

前もつて羊の血球にさらされた兎の血清で、溶血系（Ｅ
Ａ）を完結するのに用いられる。その血清は０で述べた
ように補体不活性化されたものである。溶血素の溶血力
価は少くとも１：１０００でなければならない。溶血力
価とは、与えられた羊の血球量が、ある標準条件のもと
に、十分なまたは過剰量の補体の存在下で、丁度完全に
溶血されるモルモツトの血清の希釈度を意味する。力価
は一般に３７℃に６０分間保温した。．５ｍｔの溶血素
希釈液（順次増大する希釈）、０．５ｍ１の補体希釈液
、０．５耐の２％羊赤血球懸濁液および希釈剤（生理的
食塩水、コルマ一塩溶液、イーグル（Ｅａｇｌｅ）溶液
あるいはベロナール（ＶｅｒＯｎａｌ）緩衝液）の系で
決められる。溶血素は好ましくは少くとも１：４０００
の力価を持つていなければならない、言いかえれば１：
４０００に希釈した場合、標準条件下でなお完全な溶血
反応を起さなければならない。試験に用いられる溶血素
の量は、１時間後に溶解を起す溶血素の量の４倍である
。４）補体（８）。

新鮮なモルモツトの血清であり、それは使用する直前に
、例えば生理的食塩水で希釈される。必要な補体の量は
３′ＹＣ′示したと同様な一連の希釈法によつて決めら
れ、種々の量の補体が適当に調整された量の羊の赤血球
（Ｅ）および溶血素囚の入つた試験管の試験系列に加え
られ各試験管の内容は希釈剤によつて同一全容（一般に
３ｍ１）に希釈され３７てＣで６０分間インキユベート
される。この方法は完全な溶血を生ずるのに必要な補体
の最少量を決めるのである。実際に使われる量はこの量
の約２倍である。５）抗原（Ａｇ）。

梅毒の補体結合反応に用いらるもので、一般にカルジオ
ライピン抗原または初ライテル（Ｒｅｉｔｅｒ）抗原で
ある。

カルジオライピンは牝牛の心臓から得られる燐脂質であ
つて、梅毒の病原体に応じて作られる抗体と抗原−抗体
複合体を形成する。カルジオライピンを用いることがで
きるのは、与えられた抗原に応じて作られた抗体が、も
との毒性抗原とだけでなく構造的に非常に似ている抗原
例えばその毒性作用が何らかの化学反応によつて弱めら
れた抗原とも抗体一抗原反応をうけるという事実に基づ
いている。抗体の特異性は、その点では絶体的でなく、
このことは危険性の高い、得ることが困難な抗原に対す
る抗体の存在を、代りの抗原を用いて試験することがで
きるので実際上非常に重要なことである。使用できるカ
ルジオライピン抗原は、例えば０．０８７５％のレシチ
ンと０．３％のコレステロールを含むカルジオライピン
の０．０１７５（！）アルコール溶液からなり、市販さ
れている。

一般にそれを約１：１００から約１：２００に希釈して
用いる。カルジオライピンの他の製品も用いることがで
きる。ライテル抗原は培地に増殖し起高周波音で活性化
され保存されたスピローヘータからなり、これもまた市
販されており１：２から１：８の間に希釈して用いられ
る。

３）最後に、希釈剤の在庫が血清検査室になければなら
ない。

既に上述したように生理的食塩水が用いられる（０．９
％または溶血反応に高度の耐性を持つた羊の赤血球が用
いられる場合は０．８５％）。生理的食塩水の代りに、
塩化ナトリウムにさらに硫酸マグネシウムを含むコルマ
一溶液、または塩化ナトリウムにさらにＫ／Ｎａリン酸
緩衝を含むイーグル緩衝液、またはオスラーストラウス
ーマイエル溶液または同様な溶液もまた用いられる。補
体結合反応のような酵素反応は２価のカチオンを補因子
として必要とするから、マグネシウムおよび／またはカ
ルシウムイオンを含む溶液を用いるのが一般に有利であ
る。希釈した溶液は安定化するために一般にフエノール
（例えば０．３重量（Ｆｆ））が添加される。補体結合
反応を用いる血清学的試験は実際に行）のは非常にむつ
かしい。

先づ第一に反応体の活トが１つのバツチから他のバツチ
に非常に変動し、貯蔵中にその活性が種々な速度で急速
に失われるからであり、第二に反応物の活性を互に調整
しなければならないからである。このような活性の調整
が必要なことは明らかであり、例えばもし試験系統に患
者の抗体および抗原間の反応を解放するのに必要なより
もはるかに多くの補体が含まれていると、すべての場合
に急速な溶血反応が起り、試験はそのため敏感でなく無
意味でさえある。逆に、補体の存在が不十分の場合は試
験は過敏となり、うその陽性結果が得られる。溶血系へ
の補体の濃度の調整と同じことが溶血系の２つの成分の
濃度の調整に適用される。赤血球懸濁液はまた溶血素希
釈に対して調整されなければならない。試験に用いる溶
血素溶液は普通それが過剰の補体が存在する場合に完全
に溶血反応するのに必要な最小濃度の約２倍を持つよう
に調整される。下記において、明記しない限り、常に反
応体は上記したように調整された量で集められることを
意味する。反応体の混合物は簡単にするために上記で示
したその成分の省略語で表現する。例えば″ＥＡＫ″は
羊の赤血球（Ｅ）、羊の赤血球に対して感作された溶血
素溶液（４）、および適当に調整された濃度の補体（５
）の混合物を表わす。溶液Ｅ，Ａ，ＰおよびＡｇは普通
約０．２５ｍ１である。本試験即ち患者の血清検査を行
うために、ＰＫ−Ａｇ系が試験管内に作られ３７℃で３
０分間インキユベートされる。

本試験のこの第一段階を一般に７結合２と言う。溶血系
ＥＡが次いで加えられ、出来たＰＥＡＫＡｇ系は再び３
７℃にインキユベートされる。第二次のインキユベート
時間は一般にまた３０分であるが正確な濃度比によつて
変動する。疑わしい場合は、本試験の第二段階に必要な
培養時間は、自動抑制されていない健康な被検者の血清
で行なつた比較実験によつて決めることができる。溶血
系（ＥＡ）はＰＫＡｇ系に加えられる前に３７℃にイン
キユベートすることにより感作される。本試験と同様で
、抗原を用いないで行なわれる他の試験はいわゆる血清
対照である。

溶血反応がおこらないかあるいは弱められるのは自動抑
制を持つた血清を用いた時だけであるからＰＥＡＫ系で
行われる血清対照は、患者の血清の自動抑制傾向をしら
べるものである。さらに予備培養試験を系（Ｅ）および
（ＥＡ）力巾然の溶血反応の徴候を示すかどうかを決め
るために行わねばならない。そして徴候を示せば補体結
合反応に用いられない。いわゆる系対照もまたＥＡＫ系
が溶血反応をうけることを保証するために行わなければ
ならない。溶血反応の程度の測定は既知の方法で視覚的
または光学測定的に行れる。多くの溶液（本試験用の６
種の溶液、血清対照用に５種の溶液）から実験系を作る
必要があることは、補体結合反応を行うことを、どの場
合よりも複雑にする。

というのは種々の反応体の濃度および活性をお互いに調
整する必要があるからである。多数の別々のピペツト操
作を試験で行うことは実験誤差を生ずることはよく知ら
れている。補体結合反応を行う方法を簡単にすることは
、本試験および対照試験（ＰＥＡＫＡｇ，ＰＥＡＫ，Ｅ
ＡＫ，ＥＡ，Ｅ）がどの場合でも反応体の別々の取出し
を必要とするため、これまでできなかつた。しかしなが
ら、何故いくつかの反応体を一つに組合せた溶液で供給
することができなかつたかというまた他の理由がある。
それは反応体の安定性がお互に非常に違うために、組合
せた溶液中で違つた反応体の正確な調整は限られた期間
しか保てないからである。そのうえ、反応体が一つの溶
液に存在するときはお互いに反応するのである。それ故
に、臨床医家あるいは血清検査室に、種種の反応体の活
性を複雑に調整しなくても、補体結合反応を行える確実
な簡単な方法を提供するという課題がおこつた。本発明
は、次の反応体の少くとも２つを互いに反応させる血清
学的検査用の、すぐに使用できる迅速試験用包装を用い
れば特に好適に実施できる新規な血清学的検査法に関す
る：１．患者の血清、 ２．赤血球、 ３．溶血素、 ４．補体および、 ５．抗原、または３）に属さない抗体。

本発明方法で好適に使用される迅速試験用包装には、３
から５の反応体の少くとも２つの固体で、貯蔵された形
で、そして試験を行うのにお互いに適当に調整された量
で入つている。

お互いにその濃度または活性が調整された大量の溶血素
、補体および抗原（所望により抗体）が、デイープフリ
ーズ（Ｄｅｅｐ−Ｆｒｅｅｚｉｎｇ）または凍結乾燥に
よつて保存された迅速試験用包装中に、貯蔵中その活性
が重要な相対的変化を少しもうけることなく、分けて貯
えられるどとがわかつた。

また、迅速試験用包装中に保存された反応体の活性の損
失はわずかであることもわかつた。補体結合反応を行う
新しい方法の開発は、これに関連してこの方法が３から
５の反応体の少くとも２つが固体形で保持され、適当に
調整された量で一緒に用いられる点で特に重要である。

この方法は次のように行われる：補体結合反応の本試験
および比較試験のために赤血球を除いて、反応に必要な
すべての適当に調整された量の反応体をインキユベート
する。次いで既知の方法によつて他の反応体の量に調整
された赤血球の量をその混合物に加え、混合物を再びイ
ンキユベートする。インキユベート時間はおのおのの場
合約１０分間から２時間、好ましくは２５〜６５分間で
ある。本試験における従来の方法と新しい方法との主な
違いは、新しい方法では最初にインキユベート（ ′結
合○されるのはＰＫＡｇ系ではなくＰＡＫＡｇ系である
ことである。インキユベートによるＥＡ系の感作はそれ
故省略される。血清対照試験における従来の方法と新し
い方法との主な違いは、新しい方法ではＰＡＫ系が最初
にインキユベートされるのであつてＰＫ系ではない。勿
論上記方法は従来通り貯蔵されたまたは新鮮に作られた
反応体でも行える。前記の迅速試験用包装は、本発明に
係る新規な血清学的試験を行なうのに非常に適している
。

この包装について以下に更に詳細に説明する。前記反応
体３から５のための迅速試験用包装は一般に容器と封緘
キヤツプからなり、そのどちらも種々な形状をしている
。しかし、容器および望ましくは封緘キヤツプも、用い
る反応体溶液に対して化学的に不活性でなければならな
い。例えば、医薬品の包装に用いられる普通のプラスチ
ツクの栓または密閉キヤツプで封緘したガラス容器が適
当である。容器はまた反応体を別々に貯えるためのいく
つかの内部の空所を持つている。新しい迅速試験用包装
の好ましい具体形は、一回たけ使用しまた試験用反応容
器としても役にたつ使い捨ての包装として設計される。

この場合、新しい迅速試験用包装は、好ましくは普通に
補体結合反応に用いられる試験管の形で、ガラスまたは
他の透明な物質で出来ており、個々の試験を行うのに適
当な量の反応体を含むものである。新しい迅速試験用包
装中の反応体は固体形で、特に−２１℃以下の温度で凍
結乾燥またはデイープフリーズされて保存される。凍結
乾燥された反応体が特に適当であり、−３０℃以下、望
ましくは−５５℃以下の温度で急速に凍結された反応体
のデイープフリーズされた溶液もまた同じである。凍結
された後、反応体溶液は−２１℃以下、好ましくは−４
０℃以下そして特に−５５℃以下の温度で貯蔵されなけ
ればならない。もし新しい迅速試験用包装中の反応体が
デイープフリーズされて保存されている場合には、使用
する前に例えば室温に置くことによつて融解し、普通の
方法で作られた溶液と同じ方法で、なお足りない溶液を
それに加えて用いられる。

もし新しい迅速試験用包装中の反応体が凍結乾燥で保存
されている場合は、溶媒例えば生理的食塩水を加えるか
過剰の溶媒量の他の反応体を加えることによつて溶液と
させられる。個々の反応体を凍結乾燥する場合は、不活
性担体、例えば人間のアルブミンを加えるとよい。

個個の反応体が凍結乾燥されている場合は、補体結合反
応が従来の方法で行れるときに必要なような大量の溶媒
の溶液を用いる必要はない。多くの場合、反応体のより
濃厚な溶液を用いることができ、それによつてより合理
的な乾燥ができる。その場合、凍結乾燥された反応体、
即ち反応体の濃厚溶液を凍結乾燥して得た残渣は、例え
ば蒸留水を加えて反応体のすぐに使用できる溶液を作る
のに必要とされるよりも無機塩類のような付随する物質
の含量は低い。それ故溶媒を凍結乾燥した反応体に加え
る場合には、これらの反応体とともに存在する付随物質
の量、特に無機塩類の量を考慮する必要がある。もし新
しい迅速試験用包装のすべての反応体が凍結乾燥の形で
保存されているときは、迅速試験用包装を発送する場合
、反応体とともに存在する付随物質の比率に濃度を調整
した希釈剤をまた加えるとよい。本発明方法で好適に使
用される迅速試験用包装に入つている反応体は一般にす
べて凍結乾燥されているかすべてデイープフリーズされ
ているかであるが、反応体の一部がデイープフリーズさ
れ他が凍結乾燥された混合包装形を用いることに原則と
して異議はない。

凍結乾燥の場合は一般に漕液に必要な塩類を試験用の溶
媒に入れることが望ましい。

なぜならば補体結合反応に対して凍結乾燥した反応体の
安定性が不十分であることは、大いに塩類の存在特に吸
湿性のアルカリ土類金属塩類の存在によることが観察さ
れたからである。もしこれらの塩類が凍結乾燥された反
応体から十分に除かれていれば、反応体の安定性は非常
に増大する。反応体が凍結乾燥によつて保存されている
場合は、個々の溶液を、それらを融解し混合したときに
、できた溶液が比較的低塩化ナトリウム含量、例えば０
．８５重量％を持つように調整するのがよい。

その場合、赤血球が溶血反応に対して耐性が増加するこ
とは、赤血球懸濁液を捨てないで或程度まで補正するこ
とができる。溶血反応に対して正常な感受性をもつた赤
血球を使う場合には、般に全塩化ナトリウムの濃度を０
．９０％であるようにすることが望ましく、もしデイー
プフリーズされた溶液が低塩化ナトリウム濃度をもつと
きは、濃塩化ナトリウム液を加えてこの値に調整するこ
とができる。反応体は新しい迅速試験用包装中にお互い
に隔離されていることが好ましい。

これは例えば反応体の溶液を迅速試験用包装の違つた場
所でデイープフリーズまたは凍結乾燥することによりで
きるがまた、最初に１つの反応体の溶液を凍結し、それ
を例えば生理的食塩水で覆い、この分離層を凍結し、最
後にこの凍結された層を他の反応体溶液で覆うことによ
つてもできる。これは反応体が重要な程度にまで混合し
ないような方法で行われなければならない。種々の反応
体を別々に貯蔵することはまた反応体の一部を迅速試験
用包装の封緘キヤツプ中に保存し（保存という語は以下
凍結乾燥かまたはデイープフリーズの意味で用いる）次
いで試験用包装に必要な反応体の残りを例えば包装の底
に保存することによつてできる。反応体を別々に保つこ
とのできる方法は他にもある。個々の反応体を別々に貯
蔵することは、試験用包装を長期間、使用に適するよう
にしておくことが必要なときに重要である。もし迅速試
験用包装が比較的短時間内、例えば２〜３日以内あるい
は作つてから１週間までに使用されるときは、分離貯蔵
は一般に不必要である。反応体がすべて一緒に貯えられ
たとき迅速試験用包装が使用に適するように保たれる時
間の長さは、個々の場合に決められなければならない。
殆んどの場合、試験用包装中の個々の反応体は、貯蔵中
に反応が起らないようにお互いに別々に貯蔵することが
有利であるが、特に凍結乾燥した物質の残留湿量を確実
に低く保つ注意が払われるならば、凍結乾燥された反応
体を混合することに異議はない。

残留湿度は一般に１重量％より小さく望ましくは０．５
重量％より小さくなければならない。反応体が個々に凍
結乾燥された場合は、また室温以下の温度で、望ましく
は約５℃以下で貯蔵することが有利である。凍結乾燥品
でも、殊に数年間貯蔵しようと思うときには約−２１℃
以下の温度で貯えることが特に有利である。新しい迅速
試験用包装中の個々の反応体の濃度または活性はお互い
に原則として（定性的に）補体結合反応を行う従来方法
について上記したと同じ方法で調整される。

しかし、反応体の力価の定量的調整については、従来法
に用いられた比率とは違つた比率が特に望ましい。試験
に用いる溶血素の量は普通の量よりも少くとも約２５％
多いことが望ましい。それは一般にインキユベートを３
７℃で６０分間行つた場合丁度溶解を起す溶血素の量の
５〜１６倍で、望ましくは約６〜１０倍である。補体は
補体単位よりも１０〜２５％多い量で用いられる。所望
ならば、この方法はまた従来法に用いられる反応体の普
通の比率（試験量）で、特にインキユベート時間が約３
０〜１００分で行われる。最適のインキユベート時間は
容易に決めることができる。新しい迅速試験用包装は反
応体ＡＫ，ＫＡｇ，ＡＡｇ、およびＡＫＡｇを含んでい
る。

既に上述したように、殆んどの場合反応体を別々に貯蔵
するのが有利である。このことは一緒に貯蔵した場合非
特異的な反応をうける特別な傾向のあるＫおよびＡｇを
貯蔵する場合に特にあてはまる。一方、反応体のＡＫお
よびＡＡｇの組合せは一般にデイープフリーズする時で
も全く十分に一緒に貯蔵することが出来る。但しそれは
約９ケ月以上置いてはいけない。しかしながら、反応体
を一緒に貯蔵する場合はその保持する品質は個々の場合
に試験しなければならない。反応体ＡＫＡｇ（あるいは
ＡＫ抗体）の組合せ即ち赤血球および患者の血清を除い
た補体結合反応を行うのに必要なすべての反応体を含む
組合せは特に重要である。

ＡＫＡｇの組合せを貯蔵することのできるいろんな方法
、即ちすべての反応体をＡ／Ｋ／Ａｇのように別々に貯
蔵するとか、その成分の１つを他の２つから分離して部
分的に別別に貯蔵するとかの方法がある。反応体を部分
的に分離して貯蔵するには、ＡＫ／ＡｇおよびＡＡｇ／
Ｋの取合せが適当である。ＫＡｇ／Ａの取合せは一般に
ＫおよびＡｇの非特異的反応のために不可能である。勿
論個々の場合において、特別な抗原の場合に適当な予備
試験の結果Ｋ（５Ａｇがお互いに両立して貯蔵されるこ
とが示されれば行うことができる。同じことが普通は不
可能なすべての３つの成分の貯蔵の場合にもあてはまる
。しかも、既に上述したように、お互いに両立しない反
応体を別々に凍結乾燥した後に一緒に貯蔵することがで
きる。反応体ＡＫＡｇの組合せを含む本発明の望ましい
具体形における貯蔵の種々な取合せのうち、ＡＫＡｇの
取合せおよびＡ／Ｋ／Ａｇの取合せが特に重要である。
実際土、迅速試験用包装の使用者は一般に２つの変形、
即ち１つは本試験用で反応体Ａ，ＫおよびＡｇを含んで
おり、他の１つは比較試験用でその反応体の２つたけを
含んだものが提供される。

２つの型の迅速試験用包装中の反応体は同じバツチから
取られることが望ましい。

ここでまた成分ＡおよびＫが試験管に入つている本発明
の具体形が非常に有利である。包装の製造は、反応体の
入つたただ一つの型の試験管が必要なたけであるという
ことによつて非常に簡単になる。この反応体ＡおよびＫ
の入つた試験管は、本試験用包装を製造するための抗原
の入つたキヤツプまたは比較試験用包装を製造するため
の空のキヤツプで封緘される。抗原がキヤツプに入つた
、３つのすべての反応体を含む試験用包装は、勿論比較
試験用にも使えるが、これは抗原の不必要な損失となる
。迅速試験用包装を製造する際には、抗原の入つたキヤ
ツプをＡおよびＫの入つた試験管の４０％製造するのが
よい。もし数人の患者の血清を同時に検査しなければな
らないときは、本試験および血清対照のための数個の試
験用包装を、種々の試験系がつくられそしてインキユベ
ートされる試験管台に対に立てる。

勿論、試験用包装を数個の平行試験のために台に供給し
、数個の平行試験を行う個々の試験系を例えば点滴盤の
形で厳密に連結する。その場合、くぼみのいくつかは反
応体Ａ，ＫおよびＡｇを含み、他はＡおよびＫたけであ
る。これまでは、患者の血清中に対応する抗体があるこ
とによつて或る抗原を検出する新しい試験用包装の用途
についてのみ記載した。

補体の消費による特異的抗原一抗体複合体の生成を検出
する基本的な原理は、勿論逆の過程にも用いることがで
きる。即ち、もしその抗原に対する特異的な抗体が用い
られれば、抗原自体を患者の血清中に検出することがで
きる。この方法は特に血清肝炎（オーストラリア抗原）
に適用できる。この場合の試験用包装は試験用抗原の代
りに試験用抗体、例えば溶血素に加えてオーストラリア
抗原に特異なアンボセプトルを含む。本発明方法で好適
に使用される迅速試験用包装はまた一つの封緘キヤツプ
の下に数室があつて、例えばその一つの室は本試験を行
うのに使われ、他の一つは血清対照を行うように設計す
ることができる。

その場合、各室は例えば試験を行うのに必要な反応体の
それぞれの部分を含み、各それぞれの部分の反応体は勿
論別々に保持されなければならない。本発明方法で好適
に使用される試験用包装は単一の抗原の代りに抗原の組
合せを含むことができる。

これは数種の病原体にいわゆるスクリーニング試験を行
う簡単な方法を提供する。比較試験を行うために、既に
上述した成分に加えて、別々に貯えられ、保存された試
験陽性の患者の血清、弱陽性の患者の血清または試験陰
性の患者の血清を含む試験用包装を使うのが有利である
。

本発明方法で好適に使用される迅速試験用包装は、応用
血清学の分野における特別な進歩を構成している。

それは、広範囲の使用者に非常に多くの血清学的検査を
行なうことをはじめて可能にした。新しい迅速試験用包
装を用いた場合、補体結合反応に基づく試験は、今日一
般の医学業務で行われている検基室のほとんどの試験よ
りもはるかに実施することは難しくはない。スクリーニ
ング、即ち多数の患者に対する用心のための慣習試験、
をそれ故に、現在までそれに必要な方法が複雑なために
殆んど考えられなかつた程度に可能にする。特に、本発
明方法で好適に使用される迅速試験用包装は、大きな診
断検査室に容易に近づけない地域における診断の便宜を
改良することができる。また診断検査室自体にとつても
、反応体を計り分けたりその活性を調整したりするむつ
かしい、時間を取る操作が製造業者によつて機械的に行
われることができ、消費者即ち血清検査室はこの時間を
取る作業の負担が軽減されるので、この新規な包装は重
要な進歩を提供するものである。特に血清学的仕事を行
つている検査室にとつて、いくつかの試験用包装を一つ
のユニツトに組合せて、数人の患者の血清を並んで試験
することができることは非常に重要である。本発明方法
で好適に使用される迅速試験用包装の具体形の代表例を
添付図面に示す。

第１図は、ブラスチツクキヤツプ２で封緘された容量約
１０ＣＣのガラス容器１からなる迅速試験用包装の横断
面である。

第１図の迅速試験用包装には羊の赤血球に特異な溶血素
３とモルモツトの補体４が入つており、共にデイープフ
リーズされている。溶血素３と補体４は、補体を入れて
デイーブフリーズするときに試験用包装を斜めに保ち、
次に溶血素を入れてデイープフリーズするときにそれを
反対方向に傾けることによつてお互いに別別に保持され
ている。溶血素は、既知の方法で羊の血球に感作されつ
いで補体不活性化された兎の血清である。溶血素（０．
１ＴＩＩ０は１：２５０に希釈し１：４０００の力価を
示した。モルモツトの補体（同じく０．１ｍ０は１：９
に希釈し、１：９０の力価を示した。補体は１：９０の
力価（０．５ｍ１の試料で、２％赤血球懸濁液を用いて
測定した）を示したので、１：９０に希釈した補体の０
．１ｍ１は２補体単位、即ち完全な溶解に必要な最小量
の２倍に相当する。

１：４０００の力価の溶血素を用いたので（力価は０．
２５ｍ１の溶液に基づく、即ち０．２５ｍ１の赤血球懸
濁液と一緒にして標準化するのに用いられる０．５１１
１の溶血系をつくる）、１：２５０に希釈した補体の０
．１ｍ１は約６．４溶血素単位、即ち３７℃で１時間イ
ンキユベ゛一トした場合丁度溶解させる溶血素の量の約
６．４倍に相当する。

第２図は、キヤツプ２で封緘された容器１からなる第１
図の包装と同じであるが、溶血素３および補体４に加え
て抗原５が入つている迅速試験用包装を示す。

抗原５は他の反応体３および４と別に、包装の内部に向
つて開いている封緘キヤツプの空いた所に、デイープフ
リーズされた形で保有されている。溶血素３および補体
４は第１図と同じようにお互いに別々に保有されている
。溶血素と補体の量およびその濃度と活性の比率は第１
図のそれに相当する。抗原５（０．５ｍ０は市販のカル
ジオライピン抗原１：１５０であつた。本発明方法で好
適に使用される迅速試験用包装のもう１つの例は、取合
せは第２図のそれと同様であるが、上記のように希釈し
た溶血素０．１ｄの代りに、０．５５ｍ１０）０．８５
％生理的食塩水で１：６．５に希釈した同じ溶血素溶液
の０．１ｍ１を用いた。

第３図は、本発明方法で好適に使用される迅速試験用包
装の試験を行う反応容器の形を示す。それは同様な空所
のあるキヤツプ２と基本的に同一のキヤツプ７を持つた
ガラス試験管６からなつている。試験管は、その底に０
．１ｍ１の補体（希釈および力価は上記と同じ）が−３
５℃に凍結されて入つている。補体は０．５５ｍ１の０
．８５％生理的食塩水８でおおわれる。生理的食塩水は
次いで０．１ｍ１の溶血素（希釈および力価は上記と同
じ）でおおわれる。０．５ｍ１の抗原（ライテル抗原１
：８）がキヤツプ７の空所に凍結される。

迅速試験用包装には保護ガスとして窒素が入つている。
第４図は、第２図と同様であるが、反応体が包装の底に
仕切り９で分けられて入つている迅速試験用包装を示す
。

参照数字３から５は第１図から第３図におけると同じ意
味である。第５図は、本発明方法で好適に使用される迅
速試験用包装のアンプルの形を示す。

それには０．１ｍ１の溶血素１：５０と、０．８ｍ１の
０．８５（ｆｌ）生理的食塩水と共に０，１ｍ１の補体
１：９と、０．５ｍ１のカルジオライピン抗原１：１５
０と０．８５（ｆ）生理的食塩水の溶液との混合物１０
が入つている。第６図は、２つの反応体がお互いに別々
に封緘キマツプの空所に貯蔵されている本発明方法で好
適に使用される迅速試験用包装を示す。即ち、封緘キヤ
ツプには、０．１ｍ１の溶血素１：５０＜１５０．４ｍ
１０）０，８５％生理的食塩水とのデイープフリーズさ
れた溶液１１と、０．１ｍ１の補体１：９と０．４ｍ１
の０．８５％生理的食塩水との他のデイープフリーズさ
れた溶液１２が入つている。試験管６には０．５ｍ１の
市販ライテル抗原１：８と０．８ｍ１の０．８５０！）
食塩水との溶液が入つている。第７図は、点滴盤に結合
した本発明方法で好適に使用される迅速試験用包装を示
す。ポリメタアクリレート盤１４の各穴１３が迅速試験
用包装を構成している。各穴には第１図のように配置し
た別々に貯蔵された反応体が入つている。第８図は、第
４図と同様であるが、凍結乾燥し溶血素１５と凍結乾燥
した補体１６が入つている迅速試験用包装を示す。

凍結乾燥は、０．１ｍ１の補体（希釈および力価は上記
と同じ）を０．００２５９の人間アルブミンの０．５ｍ
１水溶液に取り、仕切り９によつて包装内に形成された
室に入れることによつて行つた。これに相当する方法０
．１ｍ１の溶血素溶液（希釈および力価は上記と同じ）
で、他の室を用いて行つた。凍結乾燥それ自体は既知の
方法で、約−５０℃の初期温度で行つた。上記の迅速試
験用包装の反応体の量は、個々の試験を行うのに正規に
望ましい量である。

しかしながら補体結合反応に於ては、個々の反応体の量
が互に調整されているならば、反応体の絶体量は重要で
はない。それ故個々の試験は原則としてすべての反応体
のいくらかの倍数で行うことができる。微量試験用の迅
速試験用包装（すべての反応体の総量が０．１ｍ１まで
の）は、それ故に原則として第１図から第８図のそれと
同じであるが、例えば反応体の量は１／２０である。例
えば第９図に示したような皿型をした平らな時計ガラス
が特に微量規模で試験を行うのに適当である。皿１７は
直径約２ｃ！ｎで、溶血素補体および抗原が、その溶液
が補体結合反応を行うのにお互いに適当に調整された量
のデイープフリーズされた雫１８から２０として入つて
いる。皿はプラスチツクの接着テープ片２１でおおわれ
ている。点滴盤はまたこの目的に非常に適している。迅
速試験用包装中の反応体の量を規模によつて減らすこと
ができると同様に、より多い量を包装中に用いることが
できる。第１０図は、５０ｍ１の溶血素２２（希釈１：
１２５０、力価１：４０００）と５０ｍ１の補体２３（
希釈１：４５、力価１：９０）がプラスチツクの栓２４
で封緘されたガラス試薬びん２５に入つた迅速試験用包
装を示す。

すべての包装例は、第８図の包装を除いてデイーブフリ
ーズされた形の反応体が入つている。

補体結合反応を行う新しい方法および迅験試験用包装の
取扱い方を第３図に示した迅速試験用包装について次に
実施例を説明する。本試験を行うために、本発明方法で
好適に使用される試験用包装をデイープフリーザ一から
取出し、３７℃で水浴に浸して解かす。

解かすとＡＫＡｇの溶液となりそれに０．２５ｗ１１の
患者の血清（得る方法は上記参照）を加える。できたＰ
ＡＫＡｇの溶液を次いで３７℃で半時間インキユベート
する。結合反応は、患者の血清が抗体、この場合は梅毒
抗体を含んでいるときに起る。補体は抗原一抗体複合体
をつくるのに使われてしまう。この段階の操作は、溶血
素が結合反応中に既に存在しているという点で従来の補
体結合反応を行う方法の対応する段階と、相異している
。半時間培養した後、０．２５ＴＩ１１の２％の羊の赤
血球懸濁液をその系に加え、その系を再び３７℃でイン
キユベートする。この第二次段階のインキユベート時間
もまた半時間であるが、これは反応体のお互いの正確な
調整いかんによつており、この調整は供給者によつて個
々の包装について行れるので、供給者の手で正しいイン
キユベート時間についての指示を包装に施さなければな
らない。時間は一般に３０分間であるが、健康な被検者
からの非抑制血清と比較試験によつて決められる。第二
次インキユベートした後、結果即ち調合物の溶血反応の
程度は、既知の方法で視覚的または光学測定的に評価さ
れる。比較試験は血清学的検査を行うのに実際に必須で
ある。

上記した比較試験は本発明による個々の試験用包装で非
常にすばらしく行うことができる。対照試験もまた新し
い方法によつて次のように行われる：血清対照（自動抑
制試験）を行うには、個々の試験用包装をデイープフリ
ーザ一から取出し、抗原が入つている封緘キヤツプを取
除く。

試験管の内容を次に３７℃で水浴中で融解し液体溶液Ａ
Ｋをつくる。本試験と同量の患者の血清をこの溶液に加
え、溶液を生理的食塩水を加えて本試験と同容量にする
。反応条件を本試験とできるたけ同一に保つために、で
きたＰＡＫ系を次に３７℃で半時間インキユベートし、
次いで本試験と同じように赤血球懸濁液を加えた後第二
次インキユベートを行う。結果の解釈は従来の血清対照
試験と同じように行われる。系ＥＡＫにおける系対照は
血清対照と同じ原理で行われる。

抗原の入つたキヤツプを取除くが患者の血清は加えない
。系ＥＡおよびＥにおける対照試験が残つている。

勿論、赤血球懸濁液Ｅはインキユベート状態下で自然の
溶血反応を試験することは全く容易であるが、本発明に
よる個々の試験用包装はこれは不必要である。インキユ
ベート状態下で溶血反応の徴候を少しでも示してはなら
ない系ＥＡを試験するには、抗原の入つた封緘キヤツプ
を取除き、試験管の内容を５６℃で水浴中で融解し、こ
の温度に２０分間保つ。残つた溶液Ａは室温にまで冷し
、赤血球懸濁液を加え、その系を次いで３７℃で約３０
分間インキユベートする。ＥＡ系の試験は、自然の溶血
反応即ち補体なしの溶血反応はこの系では非常に希れで
あるから、一般に省略することＺＯができる。

溶血素に痕跡の補体が混在しているかどうかを試験する
ＥＡ系についての試験は、溶血素は勿論製造業者によつ
て試験されているから必要ではない。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第６図および第８図〜第１０図は迅速試験用包
装の断面図であり、第７図は同包装の一部切欠き斜視図
である。 図面中、１は容器、２，７はキヤツプ、３，１５，２２
は溶血素、４，１６，２３は補体、５は抗原、６は試験
管、８は生理的食塩水、９は仕切り、１０は溶血素、補
体、抗原および生理的食塩水の混合物、１１は溶血素の
生理的食塩水溶液、１２は補体の生理的食塩水溶液、１
３は穴、１４は盤、１７は時計皿、１８，１９，２０は
雫状反応体、２１は接着テープ片、２４は栓、２５は試
薬びんを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 患者の血清（１）、赤血球（２）、溶血素（３）、
   補体（４）および抗原または（３）に属さない抗体（５
   ）からなる反応体を互いに反応させることからなる補体
   結合反応に基づく血清学的検基法であつて、反応体（３
   ）の存在下で反応体（１）を反応体（４）および反応体
   （５）と反応させた後、反応体（２）を反応系に添加す
   ることを特徴とする方法。