RU2521232C1 - Способ получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается способа получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний, включающего: исследование образцов доноров и пациентов на наличие инфекционного материала, отбор для отрицательной части референс-панели образцов, не содержащих антитела к вирусу гепатита С (ВГС), поверхностного антигена HBsAg вируса гепатита В (ВГВ), раннего белка р24 и антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ), а также антитела к Treponema pallidum, отбор для положительной части референс-панели образцов, содержащих антитела к ВИЧ, ВГС, HBsAg и Treponema pallidum и введение в отобранные образцы стабилизирующего состава. Изобретение обеспечивает создание такого способа получения референс-панели сывороток, который обеспечивает изготовление отрицательных сывороток панели, не содержащих HBsAg ВГС и антител к Treponema pallidum и к вирусам ВГС и ВИЧ, и позволяет сохранить специфические характеристики всех образцов панели сывороток в течение длительного времени (не менее 18 месяцев) при температуре хранении от 2 до 8°C. 3 з.п. ф-лы, 4 пр., 2 табл.

Description

Способ получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний

Изобретение относится к технологии изготовления референс-препаратов для оценки специфичности результатов серологической диагностики и может быть использовано в медицине и биотехнологии.

Разработка референс-материалов, содержащих известные количества специфических маркеров социально значимых инфекций, имеет наивысший приоритет для контроля качества лабораторной клинической диагностики. В докладе экспертов Комитета ВОЗ по биологической стандартизации, посвященном оценке качества наборов для диагностики гепатитов В и С (ВГВ и ВГС) [1], было детально описано текущее состояние разработок и эффективности применения профильных референс-панелей, проблемы их сертификации и серийного контроля. Отмечено отсутствие научно обоснованных критериев при формировании референс панелей для контроля специфичности результатов серологической диагностики. Отсутствие критериев препятствует сертификации таких панелей в качестве международных стандартов.

Ранее референс-панели формировались по принципу пригодности для оценки чувствительности клинической диагностики отдельного патогена. Основная часть такой панели составлена из реактивных к антигенам инфекционного возбудителя образцов. Например, известен способ формирования референс-панелей для оценки чувствительности клинических исследований отдельно к антигенам вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), ВГВ и ВГС [2] которые изготавливает известная фирма-производитель Boston Biomedica Inc. (BBI), США. Панели BBI сформированы из сывороток, сероположительных к основным белкам HIV-I или ВГС (или содержащих поверхностный антиген HBsAg ВГВ) и имеющих разную концентрацию аналита в образцах.

Эти панели не позволяют контролировать специфичность серодиагностики, т.к. составлены на 80-90% из положительных образцов и содержат только 2-3 отрицательных образца.

Панель для контроля специфичности необходимо на 50-90% формировать из образцов сывороток или плазмы здоровых доноров. Все образцы панели нужно предварительно охарактеризовать минимум по 14 серологическим, биохимическим и молекулярно-биологическим параметрам.

Чтобы использовать референс-панель в качестве национального стандарта, ее состав должен обеспечивать возможность контроля специфичности лабораторной диагностики образцов с содержанием аутоиммунных и человеческих антимышиных антител (НАМА), предупреждать появление ложноположительных результатов вследствие эффектов матрикса и кроссреакций с гомологами аминокислотного сиквенса.

Ввиду отсутствия нормативных требований к референс-панелям, они различаются по количеству и составу образцов. Но как наиболее стабильной субстанции, предпочтение отдано образцам в форме сыворотки крови человека. В качестве одного из аналогов заявляемого технического решения является способ изготовления из плазмы крови референс-сывороток (патент США №4121905, МПК G01N 33/96, опубл. 24.10.1978 г.) [3].

Другим наиболее близким аналогом (прототипом) является также

способ изготовления из плазмы крови референс-сывороток (патент США №4158544, МПК G01N 33/96, опубл. 19.06.1979 г.) [4]. В этих патентах описаны процессы переработки плазмы в дефибринированную сыворотку и изготовления из нее контрольных образцов, стабилизированных добавкой 3-5 алкилен полиолов. Такие композиции сохраняют свои специфические характеристики в течение 4-5 недель при температуре хранения от 2 до 8°C.

Основным их недостатком является введение от 15 до 40% алкилен полиола для повышения стабильности. Добавки органического вещества значительно изменяют вязкость образца и скорости химических реакций, лежащих в основе серологического метода диагностики, что искажает результаты анализа.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого способа получения референс-панели образцов сывороток, который обеспечивал бы более надежный контроль специфичности серологической диагностики социально значимых заболеваний и стабильность специфических характеристик всех образцов панели в течение длительного времени (не менее 18 месяцев) при температуре хранения от 2 до 8°C.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний, регламентируется: исследование образцов доноров и пациентов на наличие инфекционного материала; отбор для отрицательной части референс-панели образцов, не содержащих антитела к ВГС, HBsAg ВГВ, раннего белка р24 и антител к ВИЧ, а также антитела к Т. Pallidum; отбор для положительной части референс-панели образцов, содержащих антитела к ВИЧ, ВГС, HBsAg и Treponema pallidum, и введение в отобранные образцы стабилизирующего состава, согласно изобретению исследование донорского материала на наличие инфекционных маркеров проводят методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и подтверждающими серологическими тестами (иммуноблот, РИБА, СПЕКТР).

При формировании референс-панели сывороток отбирают 14 исследованных образцов здоровых доноров, 2 исследованных образца от здоровых беременных женщин и 2 исследованных образца от больных аутоиммунными заболеваниями с содержанием аутоиммунных антител, а также 4 исследованных образца, содержащих по отдельности HBsAg -поверхностный антиген ВГВ, антитела к ВИЧ, ВГС и Т. pallidum.

Стабилизирующий состав образцов референс-панели сывороток содержит пролин, аргинин, сахарозу, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и бактерицидную добавку при следующем содержании указанных компонентов в сыворотке:

пролин	200-250 мМ
аргинин	150-200 мМ
сахароза	3,0-5,0 мас.%
ЭДТА	1-2 мМ
бактерицидная добавка	0,01-0,015 мас.%

Приготовленные образцы в референс-панели высушивают до остаточной влажности менее 2,0 мас.% путем лиофилизации.

В качестве бактерицидной добавки стабилизирующий состав содержит мертиолят? или гентамицин, или их смесь в равных соотношениях.

Создание референс-панелей, содержащих отрицательные сыворотки и контрольные сыворотки с инфекционными маркерами? облегчает задачу контроля качества диагностики инфекционных маркеров и GLP-валидацию наборов реагентов, контроль качества иммуногенов и контроль кандидатных вакцин.

Способ получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний, осуществляют следующим образом. Способ включает два этапа: изготовление и аттестация сывороток из плазмы крови, а также формирование панели контроля специфичности из аттестованных кандидатов сывороток. Переработка цитратной плазмы в сыворотку. Цитратную плазму заготавливают методом плазмафереза (в количестве 500 мл в неделю от одного донора) и далее:

(a) добавляют хлорид кальция и тщательно перемешивают для получения безцитратной плазмы;

(b) добавляют тромбин к безцитратной плазме и тщательно перемешивают для получения плотного сгустка фибрина;

(c) выполняют 1-3 цикла замораживания - оттаивания для уплотнения сгустка;

(d) инактивация сывороток здоровых доноров путем прогревания при температуре 56°C в течение не менее 3-х часов;

(e) добавление к полученной сыворотке стабилизирующего состава, представленного в примерах 1-3 и не влияющего на вязкость сыворотки;

(f) удаление центрифугированием осадка для получения образцов отрицательной сыворотки;

Пример 1. Стабилизирующий состав.

пролин	200 мМ
аргинин	200 мМ
сахароза	3,0 мас.%
ЭДТА	1 мМ
мертиолят	0,015 мас.%

Пример 2. Стабилизирующий состав.

пролин	250 мМ
аргинин	150 мМ
сахароза	4,0 мас.%
ЭДТА	1,5 мМ
гентамицин	0,01 мас.%

Пример 3. Стабилизирующий состав.

пролин	250 мМ
аргинин	200 мМ
сахароза	5,0 мас.%
ЭДТА	2 мМ
Смесь мертиолята и гентамицина в
соотношении 1:1	0,02 мас.%

Далее свойства стабилизированных сывороток аттестуют по иммунохимическим и биохимическим показателям. Все сыворотки-кандидаты тестируют методом ПЦР на наличие РНК или ДНК ВИЧ, ВГВ, ВГС и Т. pallidum. Все кандидаты показали отрицательный результат.

Перечисленные процедуры или их комбинация должны обеспечить стабильность референс-препаратов на длительный срок, и сохранение специфических свойств в течение времени годности.

На втором этапе из сывороток-кандидатов формируют референс-панель.

Практика использования такой панели в ИФА (96 лунок) определяет оптимальное количество образцов панели - 24 образца. Структура панели включает:

1. Сыворотки доноров или здоровых лиц - 16.

2. Сыворотки неинфицированных беременных - 2.

3. Сыворотки с РФ и аутоиммунными антителами - 2

4. Сыворотка с анти-ВИЧ антителами - 1.

5. Сыворотка с анти-ВГС антителами - 1.

6. Сыворотка с HBsAg - 1.

7. Сыворотка с антипаллидум антителами - 1.

Включение в состав панели сывороток, содержащих реактивные антитела, необходимо для контроля активности специфических антигенов тест-системы, и для выявления кроссреакций.

Срок годности референс-панели определяют тестом ускоренного определения термостабильности. Стабилизированные образцы панели проходят проверку и при длительном хранении при температуре от 2 до 8°C. Введение аминокислот в выше приведенном количестве (примеры 1-3) не изменяет вязкость сывороток.

Дополнительно в соответствии с параметрами технологии изготовления панели сывороток лиофильно высушивают до остаточной влажности не более 2,0 мас.% (хранят при температуре от 2 до 8°C) или используют в жидкой форме (хранят образцы панели при температуре ниже минус 24°C). Конкретный пример получения референс-панели сывороток для контроля специфичности.

Забор образцов плазмы доноров. Плазма анонимных и персонифицированных доноров поступает на производство в гемаконах CPDA емкостью 250 мл, герметично укупоренных.

Каждый образец плазмы, поступающий на производство для изготовления панели, должен иметь паспорт с характеристиками - ИН (индивидуальный номер) донора, объем сыворотки, дату забора крови, предприятие-изготовитель, а также отвечать следующим требованиям: без признаков гемолиза и гиперлипидиемии, прозрачная, цвет - янтарный или светло-желтый. Посторонние механические примеси, взвесь, осадок отсутствуют.

Трансформация плазмы в сыворотку. Технология конвертации плазмы в сыворотку выполняется в строгом соответствии с лабораторной методикой. Из гемакона 250 мл приготавливают 120 мл дефибрированной сыворотки. Сыворотки должны отвечать следующим требованиям: без признаков гемолиза и гиперлипидиемии, прозрачная, цвет - янтарный или светло-желтый, посторонние механические примеси, взвесь, осадок отсутствуют.

Инактивация сывороток здоровых доноров. Флаконы с донорской сывороткой помещают в термостат при температуре 56°C. Фиксируют время начала инактивации. Инкубирование сыворотки проводят 3 часа. После истечения этого времени сыворотку достают из термостата, фиксируют время окончания инактивации. Дату инактивации регистрируют в «Журнале регистрации движения материала».

Для длительного хранения перед использованием сыворотки хранят в морозильной камере Medical freezer MDF 436 (Sanyo), при -35°C. Это обеспечивает сохранение свойств сывороток в течение 5-7 лет.

В каждый флакон с донорской сывороткой добавляют стабилизирующий состав по примеру 1:

пролин	200 мМ
аргинин	200 мМ
сахароза	3,0 мас.%
ЭДТА	1 мМ
мертиолят	0,015 мас.%

Относительная скорость истечения стабилизированного образца сыворотки не превышает скорости истечения сыворотки без добавления стабилизатора более 1, 2 раза.

Фасовка сывороток доноров. Из каждого гемакона в стерильном боксе автоматической пипеткой отбирают 5 аликвот по (0,5±0,05) мл сыворотки в пластиковые пробирки «Эппендорф» емкостью 1,5 мл для контроля биохимических показателей и для исследования вирусных маркеров в ПЦР и ИФА. Пробирки закрывают, на каждой пробирке маркером пишут кодовый номер образца сыворотки. Сыворотки, не соответствующие физиологической нормам по биохимическим показателям, отбраковывают и утилизируют.

Оставшийся объем сыворотки фасуют в стерильные пластиковые флаконы емкостью 10 мл и передают в Коллекцию.

Формирование панели. Для формирования панели из Коллекции набирают сыворотки здоровых доноров, сыворотки беременных, с аутоиммунными антителами и сыворотки, реактивные на антигены T. pallidum, ВИЧ, ВГС и HBsAg ВГВ по описанной выше процедуре. Объем забора составляет 20 мл. Для рабочей модели панели отобрали 33 образца.

Контроль кандидатных сывороток в ПЦР и ИФА. Аликвоту каждой сыворотки-кандидата передают в ИФА лабораторию для исследования сывороток на содержание HBs антигена, антител к T. pallidum, ВГС, ВИЧ-1,2 типов и анти-HBs, анти-НВс, анти-НВе антител. ИФА анализ выполняли на зарегистрированных в РФ в качестве медицинских изделий наборах реагентов для иммуноферментной диагностики. Все сыворотки-кандидаты протестировали методом ПЦР на наличие РНК или ДНК ВИЧ, ВГВ, T. pallidum и ВГС. Все кандидаты показали отрицательный результат.

По результатам тестирования в ИФА и ПЦР из 33 кандидатов отобрали 24 образца, которые включают донорские сыворотки, сыворотки с аутоиммунными антителами и беременных (Таблица 1).

Розлив и лиофильная сушка. Каждый образец разливали по 0,4 мл во флаконы R2, коэффициент вариации погрешности розлива не превышал 0,2%. Флаконы в кассетах загружают на ночь в морозильник -60°C. Утром замороженные флаконы размещают равномерно на полках лиофильной камеры, предварительно охлажденных до минус 35°C. При этой температуре образцы в лиофильной камере выдерживают более 3-х час. В течение 3-х часов вакуум достигает своего минимума, и включается программа нагрева полок от -35°C до +20°C в течение 20-ти часов.

На заключительной стадии при комнатной температуре образцы досушивают с откачкой в течение 6-ти часов. Затем опускают прижимные плиты и запрессовывают пробки во флаконы. Флаконы удаляют из лиофильной камеры, закатывают алюминиевыми колпачками и размещают в хранилище при -20°C.

Таблица 1.
Результаты тестирования образцов референс-панели
№ образца	Результат ПЦР-анализа				Гепатит С					Аутоиммунные антитела			Примечание
					Тест-система	Антигены ВГС
	ВГС	ВГВ	ВИЧ	T. pallidum		CORE	NS3	NS4	NS5	RF mE/ml	ss-DNA mE\ml	ds-DNA
1	отр	отр	отр	отр	DS36	0,037	0,036	0,036	0,036		4,63	7,17
					DS49	0,242
					VB 1319	0,007
2	отр	отр	отр	отр	VB	0,008	0,063	0,691	0,064	3,71	7,73	8,64
					DS36	0,139	0,274	0,366	0,241
					DS49		0,792
					DS55	2,63	7,33	7,96	5,6
					INNOLIA, 223582	negative
3	отр	отр	отр	отр	VB	0,024	0,042	0,052	0,041	4,86	6,15	14,17
					DS36	0,043	0,153	0,066	0,11
					DS49		0,335
					VB	0,039	0,035	0,035	0,035
					Vector	0,024	0,034	0,049	0,051
4	отр	отр	отр	отр	VB	0,014	0,032	0,1	0,071	18,86	8,43	16,24
					DS36	0,102	0,159	0,284	0,144
					DS49		0,526
					VB 1319		0,018
5	отр	отр	отр	отр	VB	0,005	0,055	0,062	0,052	3,13	2,97	3,86
					DS36	0,207	0,275	0,43	0,266
					VB	0,032	0,032	0,033	0,037
					DS49	-	0,507
					VB1319		0,008
					DS55	0,125	0,71	0,5	0,3
					INNOLIA, 223582	Negative
6	отр	отр	отр	отр	VB	0,183	0,044	0,047	0,062	6,27	2,56	6,07
					DS36	0,089	0,349	0,364	0,224
					DS49		0,735
					DS55		0,39	0,4	0,295
					INNOLIA, 223582	Negative
7	отр	отр	отр	отр	VB	0,021	0,058	0,086	0,107	2,43	5,94	9,83
					DS36	0,065	0,338	0,674	0,427
					DS49		0,049
					VB 1319		0,019
					DS55	-	0,185	1,135	0,467
					INNOLIA, 223582	Negative
8	отр	отр	отр	отр	VB	0,138	0,05	0,054	0,059	5,05	11,7	15,21
					DS36	0,208	0,762	1,228	0,92
					DS49	0,012	0,507	1,171	0,604
					VB	0,036	0,036	0,035	0,037
9	отр	отр	отр	отр	DS36	0,036	0,035	0,035	0,037	7,42	6,35	8,55
					DS49		0,01
					VB	0,032	0,036	0,031	0,036
					VB1319		0,005

					Vector	0,127	0,16	0,278	0,262
10	отр	отр	отр	отр	VB	0,02	0,05	0,038	0,049	1,79	5,73	12,62
11	отр	отр	отр	отр	DS36	0,038	0,047	0,076	0,038	2,43	1,73	2,67	ОП HBsAg=0,198 ОП анти-HIV 0,211
					VB	0,02	0,035	0,043	0,055
					DS49		0,242
					VB 1319		0,046
12	отр	отр	отр	отр	VB	0,007	0,039	0,052	0,048	1,15	2,42	3,86
13	отр	отр	отр	отр	VB	0,014	0,039	0,054	0,048	2,75	4,77	6,07	ОП HBsAg=0,046 ОП анти-HIV 0,120
					DS36	0,034	0,043	0,042	0,044
					DS49		0,138
					VB 1319		0,007
					Vector	0,076	1,241	0,624	1,206
14	отр	отр	отр	отр	VB	0,02	0,06	0,104	0,108	1,08	-	31,19
					DS36	0,034	0,036	0,037	0,037
					DS49		0,045
					VB1319		0,009
					Vector	0,155	0,312	0,436	0,422
15	отр	отр	отр	отр	VB	0,017	0,043	0,051	0,042	1,39	-	15,9	ОП HBsAg=0,114 ОП HIV=0,195
					DS36	0,054	0,111	0,151	0,099
					DS49		0,302
16	отр	отр	отр	отр	VB1319		0,007						ОП HBsAg=0,045 ОП HIV =0,109
					VB	0,016	0,056	0,067	0,075	0,54		12,61
					DS36	0,035	0,046	0,05	0,071
					DS49		0,114
					VB 1319		0,007
17	отр	отр	отр	отр	VB	0,034	0,033	0,035	0,038	0,54		11,34	ОП HBsAg=0,156 ОП HIV=0,180
					DS36	0,045	0,046	0,753	0,072
					DS49		0,071
					VB 1319		0,005
18	отр	отр	отр	отр	VB	0,02	0,087	0,093	0,091	0,62		5,81
19	отр	отр	отр	отр	VB	0,01	0,087	0,09	0,088	1,31		11,24	ОП HBsAg=0,04 ОП HIV=0,128
					DS36	0,039	0,127	0,184	0,116
					DS49	0,004	0,158	0,283	0,133
					DS36	0,039	0,127	0,184	0,116
					DS49	0,004	0,158	0,283	0,133
					Vector	0,15	0,201	0,476	0,183
					VB	0,015	0,051	0,072	0,074	1,23	-	14,69
20	отр	отр	отр	отр	DS49	0,004	0,015	0,056	0,013	3,39	5,25	5,79
21	Пол				VB	0,435	0,005	0,008	0,059
					MBU	0,400
					Vector	0,103	0,196	0,244	0,224
22		Пол			DS55	-	0,117	0,28	0,09				ОП HBsAg=0,8
					INNOLIA, 223582	negative
					MBU	отрицат
23			Пол		DS55	0,24	0,635	0,5	0,4				ОП HIV=1,00
24				Пол	MBU-TP								ОП ТР=0,9

Комментарии. При аттестации панели использовали следующие наборы:

VB-БЕСТ анти-ВГС-СПЕКТР, серия 2024, годен до 05.2011 ОПкрит=0,206

Vector-Вектор ИФА ВГС-АТ спектр, экспериментальная серия 5, годен до 10.2010, ОПкрит=0,275

DS36-ДС-ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР-GM, серия 36, ОПкрит=0,236

VBg-БЕСТ анти-ВГС - СПЕКТР, серия 2117, годен до 01.2011, ОПкрит=0,204

DS49-ДС-ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР-GM, серия 49, ОПкрит=0,230

DS-55-ДС-ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР-GM, серия 55, ОПкрит=0,250

MBU-Мелиса ВГС-ДСМ, ОПкрит=0,260

HBsAg-ИФА-БЕСТ, с.33, 24.07.2013

КомбиБест ВИЧ-1,2 АГ/АТ, серия 1298, годен до 18.01.2013

MBU-T.P.-СИФ-ДСМ-суммарный (ЗАО МБС)

ПЦР-анализ ВЕС-РеалБест РНК ВГС, кат.№D-0799

ПЦР-анализ ВЕВ-РеалБест ВГВ ПЦР, кат.№D-0596

ПЦР-анализ ВИЧ-РеалБест ВИЧ ПЦР, кат.№D-0195

ПЦР-анализ T. pallidum - «АмплиСенс® Treponema pallidum-FL», кат. №TB20-100-R0,2.

Испытания стабильности. Стабильность образцов панели в различных условиях хранения в темноте во флаконах определяли по результатам теста термодеградации при температурах: -20°C, +4°C, +37°C и 50°C.

Объединенную выборку лиофилизованных образцов панели контроля специфичности исследуют в тесте ускоренной термодеградации. Образцы выдерживают в условиях контролируемой температуры, извлекают через определенные промежутки времени, растворяют в очищенной воде и анализируют в дублях скрининговыми и подтверждающими методами.

В испытаниях при -20°C не отмечены экспериментально значимые потери титров антител. Средние величины рассчитанных процентов потери активности при других температурах за месяц и за год приведены в Таблице 2. Образцы демонстрируют высокую стабильность. Предсказываемая потеря активности за год при +4°C составляет 0.4%.

Таблица 2.
Прогноз активности образцов панели по стабильности HBsAg на основе заявляемого способа по результатам ускоренных тестов
Температура хранения, град. С	Потеря активности за год, %	Потеря активности за месяц %
-20	0,05	Не отмечено
4	0,4	0,04
37	18	1,5
50	70	6,5

По результатам таблицы 2 рекомендуется использовать регидратированные образцы панели после хранения при 4°C в течение 1 недели. Стабильность жидких образцов панели испытывали в тесте замораживание - оттаивание. Результаты испытаний показали, что специфические свойства кандидатов не изменяются в течение 3-х циклов замораживания - оттаивания.

Предсказанная потеря активности за месяц составляет примерно 1,5% при температуре хранения 37°C, что позволяет кратковременно хранить сыворотки панели при повышенных температурах, например, при транспортировке панели.

Лиофильно высушенные сыворотки панели сохраняют свои специфические характеристики более 2-х лет при температуре хранения 4°C.

Основная предназначение референс-панели - это использование ее для ежедневного и длительного мониторинга качества серологических исследований в клинических диагностических лабораторях (КДЛ). Правильное использование панели как контрольного средства мониторинга качества предполагает ежедневную фиксацию результатов серодиагностики образцов панели с последующей валидацией всех суточных результатов анализов по критерию «специфичность» при условии совпадения результатов по панели с ее паспортными данными [5].

В качестве меры дальнейшего повышения качества клинической лабораторной диагностики предлагается совершенствование панели на основе накопления, сравнения и анализа в уполномоченном национальном органе результатов рутинного применения референс-панели. Задача чрезвычайно усложнена отсутствием международных стандартов. Она может быть решена на национальном уровне при условии параллельного контроля специфичности той же референс-панелью серийно выпускаемых медицинских изделий, зарегистрированных в качестве диагностикумов социально значимых инфекций.

Источники информации

1. WHO Working group. The international reference preparations for testing diagnostic kits used for the detection of HBsAg and anti-HCV antibodies. (WHO Headquarters, Geneva, 6-7 October 2003).

2. BBI product catalog 2003/2004. Quality control products for infectious disease testing. BBI, Boston, USA.

3. Патент США №4121905, МПК G01N 33/96, опубл. 24.10.1978 г.

4. Патент США №4158544, МПК G01N 33/96, опубл. 19.06.1979 г. (прототип).

5. Kirkwood T.B.L Принципы приготовления и утверждения международных и других стандартов и эталонных материалов биологических препаратов. Сер. техн. докл. N37. ВОЗ, Женева, 1990. 14а // J. biol. Standardization.- 1984.- Vol.12. - P.207-224.

Claims (4)

1. Способ получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний, включающий: исследование образцов доноров и пациентов на наличие инфекционного материала, отбор для отрицательной части референс-панели образцов, не содержащих антитела к вирусу гепатита С (ВГС), поверхностного антигена HBsAg вируса гепатита В (ВГВ), раннего белка р24 и антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ), а также антитела к Treponema pallidum, отбор для положительной части референс-панели образцов, содержащих антитела к ВИЧ, ВГС, HBsAg и Treponema pallidum, и введение в отобранные образцы стабилизирующего состава, отличающийся тем, что исследование донорского материала на наличие инфекционных маркеров проводят методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и подтверждающими серологическими тестами (иммуноблот, РИБА, СПЕКТР), референс-панель формируют из 24 образцов сывороток: от здоровых доноров, беременных здоровых женщин, лиц с аутоиммунными антителами и лиц, имеющих положительный результат при исследовании в ПЦР на РНК ВГС и ДНК ВИЧ, ДНК ВГВ и ДНК Treponema pallidum, а стабилизирующий состав образцов референс-панели сывороток содержит пролин, аргинин, сахарозу, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и бактерицидную добавку при следующем содержании указанных компонентов в сыворотке:
пролин 200-250 мМ аргинин 150-200 мМ сахароза 3,0-5,0 мас.% ЭДТА 1-2 мМ бактерицидная добавка 0,01-0,015 мас.%

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для формирования референс-панели сывороток отбирают 16 образцов здоровых доноров, 2 образца от здоровых беременных женщин и 2 образца от лиц с аутоиммунными заболеваниями с содержанием аутоиммунных антител, а также 4 образца, содержащих по отдельности HBsAg - поверхностный антиген ВГВ, антитела к ВИЧ, ВГС и Treponema pallidum.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что приготовленные образцы в референс-панели высушивают до остаточной влажности менее 2,0 мас.% путем лиофилизации.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве бактерицидной добавки стабилизирующий состав содержит мертиолят, или гентамицин, или их смесь в равных количествах.