CN103341187B - 一种终端灭活病原微生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种终端灭活病原微生物的方法，它包括如下步骤：a、取容器包装的生物制品，真空冷冻干燥，充入气体，密封，得终产品；b、干热灭活。本发明提供的方法能有效灭活非脂包膜病毒，特别是对细小病毒的灭火效果优良，灭活时间短，克服了传统终端干热灭活方法的缺陷。

Description

一种终端灭活病原微生物的方法
技术领域
本发明涉及一种灭活病原微生物的方法，具体地，提供了一种终端灭活病原微生物的方法。
背景技术
生物制品，是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的制品。血液制品属于生物制品范围，主要指以健康人血液为原料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备的生物活性制剂，包括人血白蛋白、人胎盘血白蛋白、静脉注射用人免疫球蛋白、肌注人免疫球蛋白、组织胺人免疫球蛋白、特异性免疫球蛋白、乙型肝炎、狂犬病、破伤风免疫球蛋白、人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人纤维蛋白原、抗人淋巴细胞免疫球蛋白等。血液制品用于治疗和被动免疫预防，在医疗急救、战伤抢救及某些特定疾病的预防和治疗上，血液制品有着其他药物不可替代的重要作用。
由于血液制品来源于人血浆，通常由多人份血浆混合后经特定分离纯化技术制备而成，理论上经血液传播的疾病也可经血液制品传播，目前，常见的血液制剂携带并传播的病毒主要有HBV、HCV、HIV和HTLV-1、CMV、EBV、HAV、细小病毒等。
为了提高血液制品的安全性，根据相关指导原则要求，血液制品生产工艺要具有一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法。血液制品病毒灭活方法分为物理灭活方法和化学灭活方法，物理灭活方法通常有巴氏消毒法、干热法、γ射线辐照法、短波紫外线法，化学方法通常有有机溶剂/去污剂（S/D）处理法、低pH值孵放法、辛酸灭活法、光化学法。化学灭活方法仅对脂包膜病毒有较好的效果，而对非脂包膜病毒的效果微乎其微，且化学灭活方法中需要添加一种或多种生化试剂，其长期安全性还须验证。（宋清爽等，“血液制品病毒灭活及去除工艺进展”，生物技术通讯，2012年04期）。大多数生物制品大都采用真空冷冻干燥的方法制成终制品，干热灭活法是较为可行的终端灭活方式。
现有的终端干热灭活方法是在真空条件下，对真空冷冻干燥品进行干热灭活，该方法对HBV等脂包膜病毒有良好的灭活效果，但对高度耐热的非脂包膜病毒的灭活效果不佳，尤其是对细小病毒的灭活效果较差，如，Roberts等的研究结果表明，在相同处理条件下，不同的非脂包膜病毒对热表现出不同的抗性：经80干热处理PPV即使经72h处理，也仅能灭活2.2log的病毒；Kim等报道，对FⅧ浓缩剂进行100水浴30min处理，仅使PPV（猪细小病毒）的滴度下降了1.90log；项庆军等，“最终干热处理对凝血因子浓缩剂中非包膜病毒的作用”，国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册，1995年06期中指出，将CPV（人细小病毒）加到经SD灭活过的高纯度FⅧ中冻干后，残余水份﹤2%的情况下真空干热，80℃72hr或90℃10hr仅灭活2.1log。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的终端灭活病原微生物的方法。
本发明终端灭活病原微生物的方法，它包括如下步骤：
a、取容器包装的生物制品，真空冷冻干燥，充入气体，密封，得终产品；
b、干热灭活。
生物制品，是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的制品，如，血液制品。
干热灭活，即冻干后的制剂经加热处理、干热杀灭病原微生物的方法。
a步骤所述气体是惰性气体或者非惰性气体。
所述惰性气体是氦气、氖气、氩气、氪气、氙气或者氡气；所述非惰性气体是氮气、NO、NO2、CO、CO2、水蒸气、空气、去氧空气、去氢空气、去氢氧空气、氧气、氢气、O3、甲烷、乙炔、乙醇、甲醚、乙醚、丙烷或者丁烷。
所述氮气是纯度为99.999%的氮气。
a步骤中，充入气体的量以容器内压强计为0.4～1atm。优选地，充入气体的量以容器内压强计为0.4～0.9atm。进一步优选地，充入气体的量以容器内压强计为0.65～0.85atm。
b步骤所述的干热灭活的温度为0～130℃，处理时间为0～200h。
所述温度为60～110℃时，处理时间为30min～150h。
优选地，所述温度为80℃时，处理时间为18～140h；所述温度为100℃时，处理时间为30～120min。
进一步优选地，所述温度为80℃，处理时间为36～72h；所述温度为100℃时，处理时间为60～90min。
本发明终端灭活病原微生物的方法，可以有效灭活非脂包膜病毒，特别是对细小病毒的灭活效果非常优良，是现有灭活方法效率的10～1000倍，可显著提高生物制品的安全性，并且，处理时间短，可缩短高温灭活病毒时间10%～50%，大大降低生产成本，具有良好的工业应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图180℃干热（干燥箱）灭活PPV动力学曲线
图2100℃干热（水浴）灭活PPV动力学曲线
具体实施方式
实验材料：
材料1：PPV病毒：AV30株，中国国家兽医微生物菌种保藏管理中心提供,基础滴度10.0LogTCID50/ml,-70℃保存。培养用细胞：F81细胞（中国科学院细胞库）。PPV病毒滴定方法：96孔细胞病变法，测定病毒50%细胞病变效应(TCID50/0.1ml)，结果按Karber法计算滴度。基础滴度≥106。
材料2：制品常用试剂或缓冲液配方中材料：枸橼酸钠0-25mmol/l；NaCl10-150mmol/l；氨基酸为甘氨酸、组氨酸、赖氨酸或其盐、精氨酸或其盐，甘氨酸一般1-10%；可溶性钙盐1-5mmol/l，白蛋白（BSA）0.5%-5%。
以下生物制品或材料参考刘隽湘主编，《输血疗法与血液制剂》，人民卫生出版社，1996年版记载或引用的方法制备：
材料3：人凝血因子Ⅷ中间品，按照加拿大ArmandFrappier血液分离中心报告的“改良甘氨酸沉淀法”制备中间品，白蛋白和/或氨基酸为稳定剂。
材料4：人凝血因子Ⅷ中间品，按照英国牛津丘吉尔医院血浆蛋白分离实验室和Elstree血液制品实验室“肝素-酸沉法”制备中间品，白蛋白和/或氨基酸为稳定剂。
材料5：人凝血因子Ⅷ中间品，按照法国Burnouf等报告用DEAE-FractgelTSK650M制备高纯度Ⅷ浓制剂的方法，制备中间品，白蛋白和/或氨基酸为稳定剂。
材料6：人凝血因子Ⅷ中间品，制备方法:用含3-10IU/ml肝素钠水溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀，离心过滤，S/D灭活，DEAE-SepharoseFastFlow或DEAE650M柱吸附、洗涤、洗脱、超滤浓缩配制中间品，白蛋白和/或氨基酸为稳定剂。
材料7：人纤维蛋白原（Fg）中间品，制备方法为Blomback方法：取冷沉淀充分溶解，采用Al(OH)3凝胶吸附、过滤后S/D灭活脂包膜病毒、PEG或甘氨酸沉淀、超滤纯化为人纤维蛋白原（Fg）原液，氨基酸和/或白蛋白为稳定剂配制成人纤维蛋白原（纯度≥90%，蛋白浓度≥40mg/ml）。
材料8：人纤维蛋白原（Fg）中间品，按照E.JChon发表的“血清与血浆蛋白的制备与性质”记载的方法（简称Chon’s低温乙醇法）制备：取Chon’s低温乙醇工艺FI沉淀，充分溶解，采用Al(OH)3凝胶吸附、过滤后S/D灭活脂包膜病毒、低温乙醇再沉淀、超滤纯化为人纤维蛋白原（Fg）原液，氨基酸和/或白蛋白为稳定剂配制成人纤维蛋白原中间品（纯度≥90%，蛋白浓度≥40mg/ml）。
材料9：人凝血酶原复合物（PCC）中间品，制备方法：取冷上清，采用DEAE-SephadexA50凝胶吸附、洗涤、洗脱过滤后S/D灭活脂包膜病毒、再次用DEAE-SepharoseFastFlow柱凝胶吸附（DEAE-SepharoseFastFlow）、洗涤、洗脱、超滤纯化为人凝血酶原复合物（PCC）原液，氨基酸和/或白蛋白为稳定剂配制成人纤维蛋白原中间品（比活≥0.5IU/ml，蛋白浓度≈30mg/ml）。
材料10：人凝血酶原复合物（PCC）中间品，制备方法：取冷上清，采用DEAE-SephadexA50凝胶吸附、洗涤、洗脱过滤后S/D灭活脂包膜病毒、再次用DEAE-SephadexA50凝胶吸附、洗涤、洗脱、超滤纯化为人凝血酶原复合物（PCC）原液，氨基酸和/或白蛋白为稳定剂配制成人凝血酶原复合物中间品（比活≥0.5IU/ml，蛋白浓度≈30mg/ml）。
以上生物制品或材料如不立即使用，于-70℃超低温保存。
实施例1本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料3，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，穿刺胶塞充入高纯氮气（99.999%），平衡至压强为1atm，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用25℃干热（干燥箱）处理200h。
实施例2本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料4，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，穿刺胶塞充入水蒸气至压强为0.4atm，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用130℃干热（干燥箱）处理1min。
实施例3本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料4，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，穿刺胶塞充入高纯氮气（99.999%）至压强为0.9atm，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用60℃干热（干燥箱）处理150hr。
实施例4本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料4，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，穿刺胶塞充入氢气至压强为0.65atm，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用110℃干热（干燥箱）处理30min。
实施例5本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料4，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，穿刺胶塞充入CO2至压强为0.851atm，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用60℃干热（干燥箱）处理150min。
实施例6本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取材料4人凝血因子Ⅷ中间品，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，原位充入氢气至压强为1atm，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用110℃干热（干燥箱）处理120min。
实施例7本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料5品，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，穿刺充入氩气至压强为0.4atm，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用80℃干热（干燥箱）处理36h。
实施例8本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料6，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，原位通过无菌管道直接通入高纯氮气（99.999%）至压强为0.65atm，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用80℃干热（干燥箱）处理48h。
实施例9本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料4，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，原位通过无菌管道直接通入高纯氮气（99.999%）至压强为0.9atm，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用80℃干热（干燥箱）处理72h。
实施例10本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料7，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，穿刺胶塞通入高纯氮气至压强为0.85atm，压塞密封，轧盖，测定水分≤2%。
（2）采用100℃干热（水浴箱）处理120min。
实施例11本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（2）取瓶装材料8，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，原位通过无菌管道直接通入乙炔气至压强为1atm，压塞密封，轧盖，测定水分≤2%。
（3）采用100℃干热（水浴箱）处理120min。
实施例12本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（2）取瓶装材料8，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，原位通过无菌管道直接通入压缩空气至压强为0.85atm，压塞密封，轧盖，测定水分≤2%；
（3）采用100℃干热（水浴箱）处理120min。
实施例13本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料9，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，原位通过无菌管道直接通入压缩空气至压强为0.65atm，压塞密封，轧盖，测定水分≤2%；
（2）采用100℃干热（水浴箱）处理120min。
实施例14本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料4，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，穿刺胶塞通入NO2至压强为0.9atm，压塞密封，轧盖，测定水分≤2%。
（2）采用100℃干热（干燥箱）处理60min。
实施例15本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）取瓶装材料4，真空冷冻干燥，0.05mbar真空下，穿刺胶塞充入高纯氮气（99.999%）至压强为1atm时停止，压塞密封，测定水分≤2%。
（2）采用100℃干热（水浴箱）处理90min。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）以猪细小病毒（PPV）为模型病毒，按10%（w/w）接入量与材料9PCC中间品混匀，真空冷冻干燥，取冻干后样品分为A、B组，A组为真空组，B组本发明方法组。
A组：在柜内0.05mbar真空下压塞密封，轧盖，样品测定水分≤2%；
B组：0.05mbar真空下，穿刺胶塞通入高纯氮气，微型电子压力计检测瓶内压强为1atm时停止，压塞密封，轧盖，测定水分≤2%。
（2）采用100℃干热处理，0min、30min、60min和90min分别取样，降温后置-70℃待测定PPV滴度，计算病毒滴度降低值=加热前滴度-加热后滴度，单位以logTCID50/0.1ml表示。
2、处理结果
处理后PCC的PPV滴度检测结果详见表1：
表1PPV滴度降低值
LogTCID50/0.1ml本试验病毒最低检测限：≤0.50LogTCID50/0.1ml。
如表1所示，在不同处理时间点，本发明方法（B组）处理后样品的细小病毒滴度降低值是现有方法（A组）的10倍以上；本发明方法（B组）处理后30min的病毒滴度降低值，与现有方法（A组）处理60min的病毒滴度降低值相当，说明达到相同的灭活效果，本发明方法所需要的时间的显著短于现有方法。
实验结果说明，本发明方法可以更有效的灭活细小病毒，并且，灭活时间短。
实验例2本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）以猪细小病毒（PPV）为模型病毒，按10%（w/w）接入量与材料4人凝血因子Ⅷ中间品混匀，真空冷冻干燥，取冻干后样品分为A、B组，A组为真空组，B组本发明方法组。
A组：在柜内0.05mbar真空下压塞密封，轧盖，样品测定水分≤2%；
B组：0.05mbar真空下，穿刺胶塞通入高纯氮气，微型电子压力计检测瓶内压强为0.85atm时停止，压塞密封，轧盖，测定水分≤2%。
（2）采用80℃不同时间干热（干燥箱）处理，0hr、18hr、36hr、72hr分别取样，降温后置-70℃待测定PPV滴度，计算病毒滴度降低值=加热前滴度-加热后滴度，单位以logTCID50/0.1ml表示。
2、处理结果
PPV滴度降低值结果见表2和图1：
表280℃不同时间干热（干燥箱）PPV滴度降低值
LogTCID50/0.1ml本试验病毒最低检测限：≤0.50LogTCID50/0.1ml。
如表2和图1所示，在不同的处理时间点，本发明方法（B组）处理后样品的细小病毒滴度降低值是现有方法（A组）的316～1000倍；本发明方法（B组）处理18h的病毒滴度降低值，与现有方法（A组）处理72h的病毒滴度降低值相当，说明达到相同的灭活效果，本发明方法需要的时间仅为现有方法的1/4。
实验结果说明，本发明方法可以更有效的灭活细小病毒，并且，灭活时间短。
实验例3本发明灭活病原微生物的方法
1、处理方法
（1）以猪细小病毒（PPV）为模型病毒，按10%（w/w）接入量与材料4人凝血因子Ⅷ中间品混匀，真空冷冻干燥，取冻干后样品分为A、B组，A组为真空组，B组本发明方法组。
A组：在柜内0.05mbar真空下压塞密封，轧盖，样品测定水分≤2%；
B组：0.05mbar真空下，穿刺胶塞通入高纯氮气，微型电子压力计检测瓶内压强为0.4atm时停止，压塞密封，轧盖，测定水分≤2%。
（2）A、B两组样品分别采用100℃不同时间干热（水浴）处理，0min、30min、60min、90min分别取样，降温后置-70℃待测定PPV滴度，计算病毒滴度降低值=加热前滴度-加热后滴度，单位以logTCID50/0.1ml表示。
2、处理结果
PPV滴度降低值见表3和图2：
表3100℃不同时间干热（水浴）PPV滴度降低值
LogTCID50/0.1ml本试验病毒最低检测限：≤0.50LogTCID50/0.1ml。
如表3和图2所示，在不同处理时间点，本发明方法（B组）处理后样品的细小病毒滴度降低值是现有方法（A组）的218～2238倍；本发明方法（B组）处理后60min的病毒滴度降低值，高于现有方法（A组）处理90min的病毒滴度降低值，说明达到相同的灭活效果，本发明方法所需要的时间显著短于现有方法。
实验结果说明，本发明方法可以更有效的灭活细小病毒，并且，灭活时间短。
综上，本发明病原微生物可以有效灭活非脂包膜病毒，如，细小病毒，可以提高生物制品的安全性，并且，灭活时间短，生产成本低，应用前景良好。

Claims (10)

1.一种终端灭活非脂包膜病毒的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、取容器包装的生物制品，真空冷冻干燥，充入气体，密封，得终产品；
b、干热灭活。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：a步骤所述气体是惰性气体或者非惰性气体。
3.根据权利要求2所述的方法：其特征在于：所述惰性气体是氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气或者氡气；所述非惰性气体是NO、NO2、CO、CO2、水蒸气、空气、去氧空气、去氢空气、去氢氧空气、氧气、氢气、O3、甲烷、乙炔、乙醇、甲醚、乙醚、丙烷或者丁烷。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述氮气是纯度为99.999％的氮气。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：a步骤中，充入气体的量以容器内压强计为0.4～1atm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：充入气体的量以容器内压强计为0.4～0.9atm。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：充入气体的量以容器内压强计为0.65～0.85atm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：b步骤所述干热灭活的温度为60～110℃时，处理时间为30min～150h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述温度为80℃时，处理时间为18～140h；所述温度为100℃时，处理时间为30～120min。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述温度为80℃，处理时间为36～72h；所述温度为100℃时，处理时间为60～90min。
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