JPH01311027A - ヒトのアルブミン溶液の安定化方法と、それによって得られた溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、治療用のヒトのアルブミン溶液を、容器、特
に最終容器内で熱処理を行う際に安定化させる方法に関
するものである。

本発明はさらに、上記方法により得られるアルブミン溶
液にも関するものである。

従来の技術 ヒトのアルブミン溶液を製造する際には、製品を最終的
に６０℃で１０時間殺菌する段階が義務付けられている
。この加熱段階は、最終製品中に存在する可能性のある
ヘパチンＢウィルスを不活性化する目的で、１９５０年
代の初期にアメリカ合衆国で導入された。すなわち、当
時の生物原料であるヒトの血液は汚染の危険があったた
め、種々の精製段階を経た後も最終製品中にヘパチンＢ
ウィルスが混入する危険性があったので、加熱段階が義
務付けられたものである。

先ず、以下の説明で引用される各参照文献名を示してお
く。

参考文献 １、　　ＧＥＲＥＴＹ　　ＲＪ、　　ＡＲＯＮＳＯＮ　
　ＯＬ、”Ｐｌａｓｍａ　　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓａ
ｎｄ　ｖｉｒａｌ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　　（血漿誘導
体とウィルス性肝炎）　”　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　
１９８２年、第２２巻、第５号、３４７〜３５１ページ
。

２、　ＨＯＲＯＷＩＴＺ　Ｂ他、”Ｉｎａｃｔｉｖａｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓｅｓ　１ｎＩａｂｉｌｅ　ｂ
ｌｏｏｄ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｆｒ、　Ｐｈｙｓ
ｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ（不安定な血液誘導体におけ
るウィルスの不活性化■。物理的方法）”Ｔｒａｎｓｆ
ｕｓｉｏｎ　１９８５年、第２５巻、第６号、５２３〜
５２７ページ。

３、　ＮＧ　ＰＫ、　ＤＯＢＫＩＮ　ＭＢ、　”Ｐａ５
ｔｅｕｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ−ｈｅｍｏｐ
ｈｉｌｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｍｏｄｅｌ　ｖｉ
ｒｕｓ　１ｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓ　　
（抗血友病因子の殺菌とモデルウィルスの不活性化の研
究）”　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｒｅｓ　１９ｇ５年、第３９巻
、第４号、４３９〜４４７ページ。

４、　Ｃ０ＨＮ　ＥＪ他、”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　
ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ａｎ
ｄ　ｐｌａｓｍａ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ＩＶ：　Ａ　ｓ
ｙｓｔｅｍ　ｆｏｒｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　１
ｎｔｏ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　
ａｎｄｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓａｎｄ
　ｆｌｕｉｄｓ　（血清および血漿蛋白質の調製と性質
■。生物学的組織と生物学的流体の蛋白質成分と脂蛋白
質成分を分画するための分離システム）”Ｊ、Ａｍ、　
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１９４６年、第６８巻、４５９〜４
７５ページ。

５、　ＴＡＹＬＯＲＨＬ他、”Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ
　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍ
ｉｎ　ｆｒｏｍｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ
　（胎盤抽出物からヒトの血清アルブミンを調製するた
めの改良された方法）Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、
　１９５６年、第７８巻、１３５３〜１３５５ページ。

６、　　ＬＩＡＩＩＴＡＵＤ　　Ｊイ也、”Ｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ　　ｄｅ　　Ｉｏａｌｂｕｍｉｎｅｈｕｍ
ａｉｎｅ　’；ａ　ｐａｒｔｉｒ　ｄｅ　ｓａｎｇ　ｈ
ｃ’ｍｏｌｙｓｅ　ｅｘｔｒａｉｔ　ｄｅｐｌａｃｅｎ
ｔａｓ　ｃｏｎｇｅｉｅｓ　Ｉ　−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
　ｄｅ　ｐｒｅｐａｒａ−ｔｉｏｎ　ｅｔ　ｑｕａｌｉ
ｔｅ　ｄｕ　ｐｒｏｄｕｉｔ　（凍結胎盤から抽出され
た溶血血液をもとにしてヒトのアルブミンを調製する方
法Ｉ０生成物の調製技術と品質）”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　１３ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　　（
生物学的標準の国際協会の第１３回国際会議のプロシー
ディング）、ブダペスト１９７３年、パート八と、“Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（蛋
白質の精製）　’　　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、５
ｔａｎｄａｒｄ。

１９７４年、第２７巻、１０７〜１１４ページ。

７、ＴＡＹＯＴ几他、”Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉ
ｅ　１ｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ。

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｅｔ　ｑｕａｌｉｔｅ　ｄｅ　
ｌ’ａｌｂｕｍｉｎｅ　ｈｕｍａｉｎｅｄ’ｏｒｉｇｉ
ｎｅ　ｐｌａｃｅｎｔａｉｒｅ　　（工業的り０７トグ
ラフイー、胎盤起源のヒトのアルブミンの製造ならびに
品質）　　”　Ｒｅｕｎｉｏｎ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏ
ｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅｔ　Ｄｅｒｉｖｅｓ
　Ｓａｎｇｕｉｎｓ　　（［Ｅｌ国際力会議と血液誘導
体）　、Ｔａ１ｌｏｉｒｅｓ　１９８１年−ＥＤ、　　
Ｆｏｎｄａｔｉｏｎ　ＭａｒｃｅｌＭＥＲＩＥＵＸ　　
（マルー＋ｚルメリュ財団＞　１９８２年、４７〜５９
ページ。

アルブミン溶液を介してヘパチンＢが媒介される危険性
をなくす、あるいは減らすための上記殺菌処理の有効性
は、先ず、健康な志願者によって確認された。その後、
チンパンジーに対して行われた研究により、Ａ型でもＢ
型でもないヘパチンウィルスも６０℃での１０時間処理
することによってやはり不活性化できることが＠ｇＨさ
れた。そのデータを得ることがジェレティ（ＧＥＲＥＴ
Ｙ）とアロンソン（ＡＲＯＮＳＯＮ）の論文（参考文献
１）の目的であった。これ以降、モデルウィルスを用い
たイン−ビトロでの様々な研究により、パルボウイルス
などのいくつかのウィルスは熱による不活性化に対して
他のウィルスよりも耐性があるとはいえ、蛋白質溶液を
６０℃で１０時間殺菌することが受容体にウィルスが運
ばれる危険性を減らすのに十分に一般的な方法であると
みなしうろことが判明した（参考文献２．３）。

ヨーロッパ特許公開第０．０５０．０６１号には別の方
法が記載されている。この方法は、血漿蛋白質調製物、
例えばアルブミン調製物の中でヘパチンのウィルスを不
活性化し、高濃度の表面活性剤を用いて必要に応じて内
毒素を除去することからなる。

しかし、この方法には、アルブミン調製物を熱で不活性
化するという利点がない。

今日では、どの国内および国際薬局方にも、アルブミン
溶液の殺菌は６０℃で１０時間行うことが条件とされて
いる。この殺菌は、製造の真の最終段階、すなわち最終
容器内で実行する必要がある。

一般に、この最終容器は中性ガラスのフラスコである。

この殺菌法に関しては、例えば１９８４年のヨーロッパ
薬局方第２版、アメリカ合衆国薬局方第２１版、１９８
６年の日本薬局方を参照のこと。アルブミンは熱に対し
て比較的安定であるが、殺菌の際にゲル化することを完
全に回避するために、適当な安定化剤を用いて保護する
必要がある。今日、−船釣に使用されている安定化剤は
カプリル酸ナトリウムとナトリウムアセチルトリプトフ
ァネートである。これら化合物は、単独で、あるいは組
み合わせて使用される。特に、アメリカ合衆国薬局方第
２１版と１９８６年の日本薬局方では、ナ）　ＩＪウム
アセチルトリプトファネートのみをアルブミン１ｇにつ
き０．１６ミｌＪモルの含有量で使用するか、またはア
ルブミン１ｇにつき０．０８ミリモルのナトリウムアセ
チルトリプトファネートと０．０８ミリモルのカプリル
酸ナトリウムの混合物を使用することが要求されている
。マンデル酸す）　ＩＪウムを単独で、あるいはカプリ
ル酸ナトリウムと組み合わせて使用することもできる（
１９６５年のフランス薬局方第８版を参照のこと）。

これらの安定化剤はアルブミンに対して極めて過剰に添
加される。すなわち、上記のアメリカ合衆国薬局方と日
本薬局方によると、アルブミン１分子につき安定化剤を
１０分子使用している。上記安定化剤はアルブミンに対
して固有の親和性を有するため、アルブミンを熱による
直接的な変性から効果的に保護することができる。逆に
、この安定化剤が存在しない場合には、アルブミンの変
性が不可避であり、アルブミン分子が徐々に凝集し、そ
の結果、蛋白光が発生し、次いで、溶液が完全にゲル化
してしまう。

この蛋白光の発生とゲル化は上記の安定化剤を用いるこ
とによって避けることができるが、殺菌済みのアルブミ
ンが入ったフラスコの幾つかには、目視検査の際に、か
なり多数の小片状の微粒子またはフィラメントまたは表
皮状のものが見られる。

この現象は、最も濃い、すなわち２０％の蛋白質を含む
アルブミン調製物の場合よりも、最も希釈された、すな
わち４％または５％の蛋白質を含むアルブミン調製物の
場合により顕著に現れる。

このような不溶性粒子が検出されると、品質管理の段階
の最終検査において、そのフラスコは廃棄されるので、
経済的な損失となるだけでなく、殺菌の際にこのような
粒子が出現するということは、製品の一部が変性してい
ることを意味するため、ヒトに投与した際に優れた効果
があるかどうかに関して疑問が生じる。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、上記の問題点を解決して、容器、特に
最終容器内で熱処理を行う際にアルブミン溶液を完全に
安定化させて、アルブミン溶液の通常の使用に適したア
ルブミン溶液とすることができるようなヒトのアルブミ
ン溶液の安定化方法を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明の方法は、治療用のヒトのアルブミン溶液を、容
器、特に最終容器内で熱処理を行う際に安定化させる方
法にふいて、標準安定化処方に加えて、トゥイーン（Ｔ
ｗｅｅｎ）　８０　　Ｃアトラス（Ａｔｌａｓ）社のポ
リソルベート８０、ポリオキシエチレンソルビタンオレ
アート〕、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０　　Ｃアト
９２社、ポリオキシエチレンソルビクンラウレート〕、
プル１：）　ニー／り（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）　Ｆ１ａ　
（ガットフォッセ　（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ）社〕、ポ
リエチレングリコールラウレート６００　Ｃユジーヌ　
クールマン（ｔｌｇｉｎｅ　Ｋｕｈｌｍａｎｎ）社、ポ
リオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのコポリマ
ー〕あるいはこれらと等価な全ての試薬の中から選択さ
れた表面活性剤を添加することを特徴としている。

作用 本発明の方法で使用される表面活性化剤は標準安定化処
方とは同じ機能を果たさず、従って標準安定化処方で代
えることはできない。実際、殺菌によって粒子が出現す
るのは、そもそちは標準安定化剤を用いたことが原因で
あったが、本発明ではこれと同じ原因によるのではなく
、あとで説明するように、熱処理の際に、溶液が容器の
壁面と相互作用することによる。

この現象は、従来の中性ガラス、例えばヨーロッパとア
メリカ合衆国の薬局方に記載されているようなＩ型のホ
ウケイ酸ガラス、または表面が無水亜硫酸または硫酸ア
ンモニウムによって中性化された■型のガラスのフラス
コ　（サンーゴバンテ°ジョンケール（ＳＡＩＮＴ−Ｇ
ＯＢＡＩＮ　Ｄ巳５ＪＯＮＱＵＥ［１ＥＳ）　！こおい
て観察されるだけでなく、ポリスチレン（コーニング（
ＣＯＥＮＩＮＧ）社）などのプラスチック材料のフラス
コでも観察される。従って、この現象により、製品とフ
ラスコの壁面の間の変性疏水性相互作用が本当に起こっ
ているものと考えられる。

標準安定化溶液とは、特に、カプリル酸ナトリウム、ナ
トリウムアセテートトリプトファネート、マンデル酸す
）　ＩＪウム、あるいはこれら化合物の２つまたは３つ
の混合物のことを意味する。

等価な試薬とは、好ましくは小さな濃度で容器の壁面で
のアルブミンの変性を防止するとともに、アルブミン溶
液の殺菌の際に不溶性粒子の形成を防止し、最終溶液中
に存在していても溶液の通常の用法では邪魔にならない
あらゆる非イオン性表面活性剤のことを意味する。

本発明と等価なこの非イオン性表面活性剤は、特に、低
濃度で効果的である必要がある。

本発明によれば、表面活性剤の濃度は安定化させる溶液
に対して５〜５０ｍｇ／ｌであることが望ましい。標準
安定化処方の存在下で殺菌後の変性や粒子の出現を防止
するためには、２００〜５０ｇ／ｌの溶液においてアル
ブミン１００分子につき適当な表面活性化剤がそれぞれ
約０．２５〜１分子あれば十分である。

好ましい表面活性化剤は、平均重量分子量が１３２０ド
ルトンのトゥイーン８０である。この表面活性化剤は、
５ｍｇ／Ｉｌを越える濃度、好ましくは１０〜２０ｍｇ
／ｌで使用する必要がある。安定させる溶液に対してト
ゥイーン８０の濃度が１０ｍｇ／　ｉであることは、５
０ｇ／ｌのアルブミン溶液に対して、アルブミン１００
分子につきこの安定化剤が１分子であることに対応する
。

本発明の特別な態様によれば、表面活性剤はアルブミン
の製造の早い段階で添加される。このような場合、表面
活性剤の初期濃度は、この表面活性剤の残留率が殺菌時
に所望の保護効果を保証するのに十分であるようになっ
ている必要がある。

本発明が関係するヒトのアルブミン溶液は、特に、アル
ブミンが蛋白質の主成分であって蛋白質全体の８０％を
越えているヒトの治療に使用される全ての蛋白質溶液で
ある。このようなアルブミン溶液は、特に、１９８４年
のヨーロッパ薬局方第２版に「ヒトのアルブミン溶液」
という名称で、さらには、１９８６年４月１日に編纂さ
れたアメリカ合衆国連邦条例法典に「アルブミン（ヒト
）」および「血漿蛋白質分画くヒト）」という名称で掲
載されている。

本発明が関係するヒトのアルブミン溶液は、特に、ヒト
のアルブミン源から適当な任意の方法で抽出、精製する
ことにより、動物または植物の細胞を培養することによ
り、あるいは巧みな遺伝子技術を利用してヒトのアルブ
ミンを生成させることを目的として変換されたバクテリ
アまたは酵母を培養することにより得られる。ヒトのア
ルブミンを抽出、精製するための適当な方法の中では、
特に、コーン（ＣＯＨＮ）他が記載しているアルコール
を用いた血漿の分画く参考文献４）、ティラー（ＴＡＹ
ＬＯＲ）他が記載しているアルコールと亜鉛を用いた胎
盤血液の分画（参考文献５）、リオトー（ＬＩＡＩＪＴ
ＡＵＤ）他が記載しているアルコーノへカプリン酸す）
　ＩＪウム、アルミンゲルを用いた胎盤血液の分画（参
考文献６）、タイ５（ＴＡＹ［］Ｔ）他が記載している
アルコールとクロマトグラフィーによる胎盤血液の分画
（参考文献７）、アメリカ合衆国特許第４．６７５．３
８４号に記載されているクロマトグラフィーによる血漿
の分画を挙げることができる。

以下、実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明が
以下の実施例に限定されることはない。

実施例１ タイ５（ＴＡＹＯＴ）達の参考文献７に記載の方法によ
って、胎盤血液をアルコールを用いて分画し、クロマト
グラフィーを実行することにより得られた５０ｇ／ｌの
アルブミン溶液の安定性を向上させる実験を行った。セ
ルロースアセテート電気泳動による分析と二次元免疫電
気泳動により測定した上記方法で得られたアルブミンの
蛋白質純度は１００％であった（単一のピークの存在）
。

この実験では、従来の安定化剤であるカプリル酸ナトリ
ウムとナトリウムアセチルトリプトファネートの量をア
メリカ合衆国の薬局方において指定された量よりも多く
して、ナ）　ＩＪウムの割合を１４５ミリ当量／１とし
且つｐＨを７．０に維持した。

予め濾過したアルブミンを容量１００−の複数のＩ型ガ
ラスフラスコに分配し、水浴中で６０℃にて１０時間殺
菌した。各フラスコは殺菌後に空気中で直ちに冷却した
。この殺菌前と後に各フラスコを検査した。全てのフラ
スコで、殺菌前には粒子は全く見られなかった。

第１表 第１表を参照すると、従来の安定化剤は、含有量を極め
て多くしても殺菌したフラスコ内の粒子の発生を止める
ことはできないことがわかる。このことから、従来の安
定化剤によるゲル化防止効果と粒子の形成現象は、２つ
の独立した物理現象であることが認められる。

実施例２ 実施例１と同じ方法で作った胎盤のアルブミンを用いて
、蛋白質１ｇ当たりカプリル酸ナトリウム０．０８ミリ
モルとナトリウムアセチルトリプトファネート０．０８
ミリモルを含む標準安定化処方を用いて安定化させた２
００　ｇ　／　ｆｉ、５０ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌの蛋白質
溶液を調製した。ナトリウムは塩化ナトリウムを用いて
１４５ミ’Ｊ当量／ｌに調整し、ｐＨは７．０に調整し
た。次いで、上記の溶液にトゥイーン８０をそれぞれＯ
ｍｇ／ｆ、５ｍｇ／ｎ、１０ｍｇ／ｌ添加し、濾過し、
容量１００ｍ１のＩ型フラスコに分配し、水浴中で６０
℃にて１０時間殺菌した。どのフラスコにも殺菌前に粒
子は見られなかった。

第２表 第２表から、トゥイーン８０の濃度が１０ｍｇ／　（ｌ
のときに、溶液中のアルブミンの濃度とは無関係に目視
の可能な粒子の形成が完全に防止できるということがわ
かる。

実施例３ コーン（ＣＯＨＮ）法を用いた血漿の分画により得られ
た５０ｇ／ｆｌのアルブミン溶液の安定性を向上させる
実験を行った。アルブミンは、ハイランド（）ＩＹＬＡ
ＮＤ）社から凍結乾燥した形態で供給された。

アルブミン粉末を再び溶液にして蛋白質が５０ｇ／ｌと
なるように調整し、蛋白質１ｇ当たりカプリル酸ナトリ
ウム０．０８ミリモルとナトリウムアセチルトリプトフ
ァネー）０．０８ミ！１モルを含む標準安定化処方を用
いて安定化させた。ナ）　ＩＪウムは塩化ナトリウムを
用いて１４５ミリ当量／ｌに調整し、ｐＨは７．０に調
整した。この溶液の一部を採取してトゥイーン８０をＬ
ｏｎｇ／　１となるように添加した。

得られた２種類の溶液を濾過し、容量１００ｍ１のＩ型
フラスコに分配し、水浴中で６０℃にて１０時間殺菌し
た。どのフラスコでも殺菌前に粒子は見られなかった。

第３表 第３表から、トゥイーン８０が１０ｍｇ／ｌの含有量に
なると、６０℃で１０時間殺菌した５０ｇ／ｌのコーン
法のアルブミン中に目視可能な粒子の形成が完全に防止
されることがわかる。

特許出願人　　アンスチチュ　メリュ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）治療用のヒトのアルブミン溶液を、容器、特に最
   終容器中で熱処理を行う際に安定化させる方法において
   、 標準安定化処方に加えて、トゥイーン８０、トゥイーン
   ２０、プルロニックＦ６８、ポリエチレングリコールラ
   ウレート６００またはこれらと等価な試薬の中から選択
   された表面活性剤を添加することを特徴とする方法。
2. （２）上記表面活性剤を５〜５０ｍｇ／ｌの濃度で使用
   することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. （３）トゥイーン８０を５ｍｇ／ｌよりも大きな濃度、
   特に１０〜２０ｍｇ／ｌの濃度で使用することを特徴と
   する請求項１に記載の方法。
4. （４）安定化させるヒトのアルブミン溶液に、標準安定
   化処方剤を加え、塩化ナトリウムを加えてナトリウムを
   １４５ミリ当量／ｌに調整し且つｐＨを７．０に調整し
   、上記表面活性剤を添加し、得られたアルブミン溶液を
   濾過し、複数のフラスコに分配し、６０℃で１０時間殺
   菌することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に
   記載の方法。
5. （５）上記標準安定化処方剤が、アルブミン１ｇ当たり
   ０．０８ミリモルのカプリル酸ナトリウムと０．０８ミ
   リモルのナトリウムアセチルトリプトファネートとで構
   成されていることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. （６）上記表面活性剤を、アルブミン製造の早い段階で
   添加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. （７）請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により
   得られるヒトのアルブミン溶液。