JP2601551B2 - ウイルスを不活性化する方法 - Google Patents
ウイルスを不活性化する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、一般にウイルス不活性化法、特に、生物学
的に活性な治療的タンパク質生成物におけるウイルス不
活性化に関する。
的に活性な治療的タンパク質生成物におけるウイルス不
活性化に関する。
本発明を要約すれば、血液又は細胞培養系から得られ
た精製された生物学的に活性なタンパク質製品に存在す
る脂質被包ウイルス（lipid−enveloped viruses）は、
前記タンパク質製品を不利に沈でんさせたり該タンパク
質製品の生物学的活性に不利な影響を与えないで前記ウ
イルスを不活性化させるのに十分な非イオン化カプリル
酸濃度、pH、温度及びイオン環境で前記製品をカプリル
酸と接触させることにより不活性化させることができ
る。
た精製された生物学的に活性なタンパク質製品に存在す
る脂質被包ウイルス（lipid−enveloped viruses）は、
前記タンパク質製品を不利に沈でんさせたり該タンパク
質製品の生物学的活性に不利な影響を与えないで前記ウ
イルスを不活性化させるのに十分な非イオン化カプリル
酸濃度、pH、温度及びイオン環境で前記製品をカプリル
酸と接触させることにより不活性化させることができ
る。
先行技術 製薬学的製品の安全性は、特にウイルス汚染が起こり
うる場合には（例えば、血液、又は生物学的活性タンパ
ク質を生成するのに予定された細胞培養系由来の生成物
において）常に懸念される事である。都合の悪いこと
に、ウイルスが見出だされる生成物そのものが、多くの
公知の慣用のウイルス不活性化技術に対して不安定であ
りそして極めて影響を受けやすいことが多い。或る場合
には、タンパク質を保護しようとすると、ウイルスも保
護してしまう。
うる場合には（例えば、血液、又は生物学的活性タンパ
ク質を生成するのに予定された細胞培養系由来の生成物
において）常に懸念される事である。都合の悪いこと
に、ウイルスが見出だされる生成物そのものが、多くの
公知の慣用のウイルス不活性化技術に対して不安定であ
りそして極めて影響を受けやすいことが多い。或る場合
には、タンパク質を保護しようとすると、ウイルスも保
護してしまう。
この状況を克服するために、種々の試みがなされた。
例えば、或る種の制御された熱処理又は特定的に選ばれ
た化学剤により生物学的に活性なタンパク質を不活性化
させうることは周知されている。タンパク質の生物学的
活性に不利な影響を及ぼさず又はその量を問題となる程
減少させることなくウイルスを不活性化させるために、
いくつかの熱処理法が開発された。例えば、フェルナン
デス（Fernandez）及びランドブラッド（Lundblad）の
米国特許第4,440,679号（因子VIIIとして知られている
非常に不安定な凝固タンパク質の低温殺菌用の炭水化物
安定剤）及びミトラ（Mitra）及びモーゼン（Mozen）の
米国特許第4,762,714号（pH、温度及び時間の制御され
た条件により免疫グロブリン生成物におけるウイルス不
活性化を示す）参照。因子VIIIは、最初に凍結乾燥する
と、低温殺菌条件（少なくとも60℃で10時間）にさらす
ことができることを示しているリューベンシュタイン
（Reubenstein）の米国特許第4,456,590号及び、トーマ
ス（homas）の米国特許第4,495,278号（凍結乾燥した因
子IXの同様な熱処理）も参照されたい。
例えば、或る種の制御された熱処理又は特定的に選ばれ
た化学剤により生物学的に活性なタンパク質を不活性化
させうることは周知されている。タンパク質の生物学的
活性に不利な影響を及ぼさず又はその量を問題となる程
減少させることなくウイルスを不活性化させるために、
いくつかの熱処理法が開発された。例えば、フェルナン
デス（Fernandez）及びランドブラッド（Lundblad）の
米国特許第4,440,679号（因子VIIIとして知られている
非常に不安定な凝固タンパク質の低温殺菌用の炭水化物
安定剤）及びミトラ（Mitra）及びモーゼン（Mozen）の
米国特許第4,762,714号（pH、温度及び時間の制御され
た条件により免疫グロブリン生成物におけるウイルス不
活性化を示す）参照。因子VIIIは、最初に凍結乾燥する
と、低温殺菌条件（少なくとも60℃で10時間）にさらす
ことができることを示しているリューベンシュタイン
（Reubenstein）の米国特許第4,456,590号及び、トーマ
ス（homas）の米国特許第4,495,278号（凍結乾燥した因
子IXの同様な熱処理）も参照されたい。
ウイルスを不活性化するのに種々の化学的方法も使用
された。例えば、レンバッハ（Lenbach）の米国特許第
4,534,972号（銅フェナントロリン及び関連した化合物
の使用）及び、ホロビッツ（Horowitz）の米国特許第4,
481,189号（トリ−ｎ−ブチルホスフェート及び関連し
て化合物）の使用）を参照されたい。
された。例えば、レンバッハ（Lenbach）の米国特許第
4,534,972号（銅フェナントロリン及び関連した化合物
の使用）及び、ホロビッツ（Horowitz）の米国特許第4,
481,189号（トリ−ｎ−ブチルホスフェート及び関連し
て化合物）の使用）を参照されたい。
血漿製品の製造（グロブリンの沈でん）及び脂質被覆
ウイルス（lipid−coated viruses）の不活性化のため
にすらカプリル酸のようなカルボン酸が使用されたが、
治療的な生物学的に活性なタンパク質の存在下に使用さ
れたのではない［ジェー・エー・サンド（J.A.Sands）
等、アンチ・マイクロバイアル・エージェント・アンド
・ヘモセラピー（Anti Microbial Agents and Chemothe
rapy）、1979年１月、134−136頁参照］。カルボン酸
（カプリル酸ナトリウム）が因子VIIIのウイルス不活性
化のために熱及びアミノ酸との組み合わせとしても使用
された（ナイトウ等の米国特許第4,446,134号参照）。
ホロビッツ等、ボックス・サングィニス（Vox Sang）、
54:14−20（1988）により開示された、血漿誘導体のウ
イルス不活性化のための脂肪酸の逐次の使用、も参照さ
れたい。
ウイルス（lipid−coated viruses）の不活性化のため
にすらカプリル酸のようなカルボン酸が使用されたが、
治療的な生物学的に活性なタンパク質の存在下に使用さ
れたのではない［ジェー・エー・サンド（J.A.Sands）
等、アンチ・マイクロバイアル・エージェント・アンド
・ヘモセラピー（Anti Microbial Agents and Chemothe
rapy）、1979年１月、134−136頁参照］。カルボン酸
（カプリル酸ナトリウム）が因子VIIIのウイルス不活性
化のために熱及びアミノ酸との組み合わせとしても使用
された（ナイトウ等の米国特許第4,446,134号参照）。
ホロビッツ等、ボックス・サングィニス（Vox Sang）、
54:14−20（1988）により開示された、血漿誘導体のウ
イルス不活性化のための脂肪酸の逐次の使用、も参照さ
れたい。
IgG、セルロプラスミン及びIgAに影響を及ぼさないで
カプリル酸による血漿タンパク質のバルクの沈でんが記
載されている［スタインバック・エム及びオードラン・
アール（Steinbuch,M.and Audran,R.）、アーキブス・
オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジック
ス（Arch.Biochem.Biophys）、134、179−294（196
9）］。ヒト、ウマ、ヒツジ及びウサギの血清又は血漿
を、0.06M酢酸塩緩衝液で希釈して約1.7％タンパク質と
し、20℃でpH4.8に調節し、カプリル酸に関して0.174N
（2.5重量％）とした。緩衝液モル濃度（0.06M）及びpH
（pH4.8±0.05）に注意することが高純度IgGにとって重
要である。
カプリル酸による血漿タンパク質のバルクの沈でんが記
載されている［スタインバック・エム及びオードラン・
アール（Steinbuch,M.and Audran,R.）、アーキブス・
オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジック
ス（Arch.Biochem.Biophys）、134、179−294（196
9）］。ヒト、ウマ、ヒツジ及びウサギの血清又は血漿
を、0.06M酢酸塩緩衝液で希釈して約1.7％タンパク質と
し、20℃でpH4.8に調節し、カプリル酸に関して0.174N
（2.5重量％）とした。緩衝液モル濃度（0.06M）及びpH
（pH4.8±0.05）に注意することが高純度IgGにとって重
要である。
スタインバック・エムの前記文献の沈でん法は、IgG
の回収のために0.066M（0.86重量％）の濃度でカプリル
酸を使用して、ハイブリドーマ培養廃培地及びマウスか
らの腹水液に適用された［ルッソ・シー、カレガロ・エ
ル、ランザ・イー、フェロン・エス；ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッヅ、65、269−271（1983）
（Russo,C.,Callegaro,L.,Lanza,E.,Ferrone,S.,J.Immu
nol.Methods,65,269−271（1983）］。同じ方法が、カ
プリル酸0.15M又は2.16重量％に調節された希釈ヒト血
漿に適用された［ハビーブ、エー・エフ・エス・エー及
びフランシス、イー・アール（Habeeb,A.F.S.A.and Fra
ncis,E.R）.,プレパレーティブ・バイオケミストリー
（Prep.Biochem）、14（１）、１−17（1984）］。DEAE
セルロース吸着及び溶出によりコーンの冷エタノール画
分III（Cohn cold ethanol Fraction III）から単離さ
れたIgAは、α−２マクログロブリンの除去のためにカ
プリル酸沈でんにより更に精製された［ペジョディー
ル、エル（Pejaudier,L）.,オードラン、アール（Audra
n,R）・及びスタインバック、エム（Steinbuch,M）.,ボ
ックス・サングィニス（Vox Sang）、23、165−175（19
72）］。沈でんのためのパラメータは、0.9％塩化ナト
リウムに調節された2.0％タンパク質濃度、pH5及び0.07
8M又は1.12重量％となるように室温で加えられたカプリ
ル酸から成っていた。沈でんしたα−２マクログロブリ
ンを遠心分離により除去した。
の回収のために0.066M（0.86重量％）の濃度でカプリル
酸を使用して、ハイブリドーマ培養廃培地及びマウスか
らの腹水液に適用された［ルッソ・シー、カレガロ・エ
ル、ランザ・イー、フェロン・エス；ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッヅ、65、269−271（1983）
（Russo,C.,Callegaro,L.,Lanza,E.,Ferrone,S.,J.Immu
nol.Methods,65,269−271（1983）］。同じ方法が、カ
プリル酸0.15M又は2.16重量％に調節された希釈ヒト血
漿に適用された［ハビーブ、エー・エフ・エス・エー及
びフランシス、イー・アール（Habeeb,A.F.S.A.and Fra
ncis,E.R）.,プレパレーティブ・バイオケミストリー
（Prep.Biochem）、14（１）、１−17（1984）］。DEAE
セルロース吸着及び溶出によりコーンの冷エタノール画
分III（Cohn cold ethanol Fraction III）から単離さ
れたIgAは、α−２マクログロブリンの除去のためにカ
プリル酸沈でんにより更に精製された［ペジョディー
ル、エル（Pejaudier,L）.,オードラン、アール（Audra
n,R）・及びスタインバック、エム（Steinbuch,M）.,ボ
ックス・サングィニス（Vox Sang）、23、165−175（19
72）］。沈でんのためのパラメータは、0.9％塩化ナト
リウムに調節された2.0％タンパク質濃度、pH5及び0.07
8M又は1.12重量％となるように室温で加えられたカプリ
ル酸から成っていた。沈でんしたα−２マクログロブリ
ンを遠心分離により除去した。
コーンの冷エタノール画分III中に存在する免疫グロ
ブリン以外の大部分のタンパク質及びリポタンパク質を
沈でんさせるのにカプリル酸が使用された「スタインバ
ック、エム.,オードラン、アール.,ペジョディール、エ
ル.,ブラトリックス、シー（Blatrix,C）.,プレパレー
ティブ・バイオケミストリー、３（４）、363−373（19
73）］。約2.5％タンパク質の画分IIIの懸濁液を、pH4.
8で0.05N酢酸塩となるように調節しそして室温に至らし
めた。カプリル酸を加えて0.174M又は2.5重量％とし
た。得られる沈でんを捨てた。上澄液はIgG、IgM及びIg
Aに富んでいた。沈でん剤としてカプリル酸を使用する
すべての場合に、pH、温度及びカプリル酸の有効性の理
想的条件の下で水への最大溶解度より相当多い量でカプ
リル酸は存在していることに留意されるべきである。こ
のような量、約0.86−2.5重量％は、普通は不溶性形態
（エマルジョン）にある比較的不溶性のカプリル酸の十
分な量、従って沈でん剤として有用な量を保証するのに
必要である。
ブリン以外の大部分のタンパク質及びリポタンパク質を
沈でんさせるのにカプリル酸が使用された「スタインバ
ック、エム.,オードラン、アール.,ペジョディール、エ
ル.,ブラトリックス、シー（Blatrix,C）.,プレパレー
ティブ・バイオケミストリー、３（４）、363−373（19
73）］。約2.5％タンパク質の画分IIIの懸濁液を、pH4.
8で0.05N酢酸塩となるように調節しそして室温に至らし
めた。カプリル酸を加えて0.174M又は2.5重量％とし
た。得られる沈でんを捨てた。上澄液はIgG、IgM及びIg
Aに富んでいた。沈でん剤としてカプリル酸を使用する
すべての場合に、pH、温度及びカプリル酸の有効性の理
想的条件の下で水への最大溶解度より相当多い量でカプ
リル酸は存在していることに留意されるべきである。こ
のような量、約0.86−2.5重量％は、普通は不溶性形態
（エマルジョン）にある比較的不溶性のカプリル酸の十
分な量、従って沈でん剤として有用な量を保証するのに
必要である。
上述の多数の刊行物にもかかわらず、治療的タンパク
質の生物学的活性又は回収可能な量に不利な影響を与え
ないで実質的にすべての脂質被覆ウイルスを不活性化さ
せるのに、沈でん濃度より低い濃度で且つ単独でカプリ
ル酸を使用する方法は知られていない。注意深く使用条
件を制御することにより、生成物の活性に不利な影響を
与えないで生物学的に活性な治療的生成物中の脂質被覆
ウイルスを不活性化させるのにカプリン酸を使用できる
ことを我々は見出だした。我々の発明の詳細を以下に述
べる。
質の生物学的活性又は回収可能な量に不利な影響を与え
ないで実質的にすべての脂質被覆ウイルスを不活性化さ
せるのに、沈でん濃度より低い濃度で且つ単独でカプリ
ル酸を使用する方法は知られていない。注意深く使用条
件を制御することにより、生成物の活性に不利な影響を
与えないで生物学的に活性な治療的生成物中の脂質被覆
ウイルスを不活性化させるのにカプリン酸を使用できる
ことを我々は見出だした。我々の発明の詳細を以下に述
べる。
我々の方法の利点は、下記の解離反応に従って発生す
る非イオン化カプリル酸の量の正確な制御に基づいてい
る。
る非イオン化カプリル酸の量の正確な制御に基づいてい
る。
CH3（CH2）6COOH CH3（CH2）6COOH-＋H+ カプリル酸 イオン化形態 かくして、不安定な、生物学的に活性な治療的生成物
中の実質的にすべての脂質被覆ウイルスを不活性化させ
る本発明の方法は、非イオン化カプリル酸の量を制御す
ると共に生成物の量、生物学的活性及び治療有効性に不
利な影響を与えないでウイルスの不活性化を確実にする
のに十分な濃度、pH及びイオン環境の下で生成物をカプ
リル酸と接触させる工程を含んで成る。
中の実質的にすべての脂質被覆ウイルスを不活性化させ
る本発明の方法は、非イオン化カプリル酸の量を制御す
ると共に生成物の量、生物学的活性及び治療有効性に不
利な影響を与えないでウイルスの不活性化を確実にする
のに十分な濃度、pH及びイオン環境の下で生成物をカプ
リル酸と接触させる工程を含んで成る。
好ましい態様では、本発明の不活性化方法は、不活性
化されるべき特定のタンパク質の安定性又は量に不利な
影響を与えないで発生したカプリル酸の量を制御するの
にカプリル酸の塩濃度及びpHの選択的な使用を意図す
る。0.068％より多くの又はその最大溶解度である約0.0
7％のカプリル酸を形成させない条件を確実にすること
によりタンパク質の望ましくない損失が回避される。約
0.07％（重量％基準）を越えるカプリル酸濃度は、カプ
リル酸とタンパク質のエマルジョンを生成させることが
あり、そのため望ましくないタンパク質損失をもたら
す。他方、カプリル酸の量は、合理的な時間内に脂質被
覆ウイルスの不活性化を確実にするのに十分（少なくと
も0.001％）でなければならない。驚くべきことに、よ
り低いpH（6.5又はそれより低い）で、カプリル酸が0.0
7−0.001％で存在しているならば、ウイルス不活性化は
殆ど即時に達成される。より高いpHでは、カプリレート
が明からに主たる種である場合には、ウイルスの同じ対
数減少を達成するのにより高い濃度とより長い時間が必
要である。かくして、好ましい態様では、本発明に有用
なカプリル酸濃度は、重量％基準で約0.07−約0.001％
の範囲である。
化されるべき特定のタンパク質の安定性又は量に不利な
影響を与えないで発生したカプリル酸の量を制御するの
にカプリル酸の塩濃度及びpHの選択的な使用を意図す
る。0.068％より多くの又はその最大溶解度である約0.0
7％のカプリル酸を形成させない条件を確実にすること
によりタンパク質の望ましくない損失が回避される。約
0.07％（重量％基準）を越えるカプリル酸濃度は、カプ
リル酸とタンパク質のエマルジョンを生成させることが
あり、そのため望ましくないタンパク質損失をもたら
す。他方、カプリル酸の量は、合理的な時間内に脂質被
覆ウイルスの不活性化を確実にするのに十分（少なくと
も0.001％）でなければならない。驚くべきことに、よ
り低いpH（6.5又はそれより低い）で、カプリル酸が0.0
7−0.001％で存在しているならば、ウイルス不活性化は
殆ど即時に達成される。より高いpHでは、カプリレート
が明からに主たる種である場合には、ウイルスの同じ対
数減少を達成するのにより高い濃度とより長い時間が必
要である。かくして、好ましい態様では、本発明に有用
なカプリル酸濃度は、重量％基準で約0.07−約0.001％
の範囲である。
本発明の第１の利点はその融通性である。低濃度で
は、本発明は低pHで使用して或る種のウイルスを即時に
不活性化させることができる。この方法は、必要に応じ
て、より高いpHで、より高い濃度で及びより長い時間で
不活性化させることも可能とする。これは、問題のタン
パク質がウイルス不活性化中に変質又は破壊されないよ
うに、問題のタンパク質の最も安定なpHで不活性化を選
ぶことも可能とする。かくして、好ましい場合には、カ
プリル酸濃度は、重量／重量％基準で水中約0.07％−約
0.001％の範囲にあり、これは、pHと、以下に更に詳細
に説明するとおり、イオン化形態（即ち、カプリル酸ナ
トリウムの如き）にあるカプリレートの量の両方を制御
することにより制御される。有利なことにはカプリル酸
は、ヒトに対する低くて、害のない毒性を有し、そして
人間の患者に大量に潅流されるアルブミン又は血漿タン
パク質画分（PPF）の安定剤として現在使用されてい
る。本発明の他の利点は、血漿ウイルスの有名な貯蔵所
であるコーン画分IIIペーストから精製されるIgM/IgGの
ようなウイルスを含まない治療的に活性なタンパク質を
確実に入手可能とすることである。基本的利点は、この
方法が、注意深く制御すれば、タンパク質に対して穏や
かであり、そして約pH4.0乃至pH8.0で安定ないかなるタ
ンパク質にも適用できる方法であるということである。
は、本発明は低pHで使用して或る種のウイルスを即時に
不活性化させることができる。この方法は、必要に応じ
て、より高いpHで、より高い濃度で及びより長い時間で
不活性化させることも可能とする。これは、問題のタン
パク質がウイルス不活性化中に変質又は破壊されないよ
うに、問題のタンパク質の最も安定なpHで不活性化を選
ぶことも可能とする。かくして、好ましい場合には、カ
プリル酸濃度は、重量／重量％基準で水中約0.07％−約
0.001％の範囲にあり、これは、pHと、以下に更に詳細
に説明するとおり、イオン化形態（即ち、カプリル酸ナ
トリウムの如き）にあるカプリレートの量の両方を制御
することにより制御される。有利なことにはカプリル酸
は、ヒトに対する低くて、害のない毒性を有し、そして
人間の患者に大量に潅流されるアルブミン又は血漿タン
パク質画分（PPF）の安定剤として現在使用されてい
る。本発明の他の利点は、血漿ウイルスの有名な貯蔵所
であるコーン画分IIIペーストから精製されるIgM/IgGの
ようなウイルスを含まない治療的に活性なタンパク質を
確実に入手可能とすることである。基本的利点は、この
方法が、注意深く制御すれば、タンパク質に対して穏や
かであり、そして約pH4.0乃至pH8.0で安定ないかなるタ
ンパク質にも適用できる方法であるということである。
標準の生化学的取り決めにより且つ本明細書で使用す
る、添字“エート”（“ate"）（即ちカプリレート）
は、解離反応における如く、その酸とそのイオン化形態
との混合物を表す。
る、添字“エート”（“ate"）（即ちカプリレート）
は、解離反応における如く、その酸とそのイオン化形態
との混合物を表す。
CH3（CH2）６−COOH CH3（CH2）６−COO-＋H+ カプリル酸 イオン化形態 カプリル酸のpKaは4.89である［化学及び物理学のCRC
ハンドブック（CRC Handboook of Chemistry and Physi
cs）、56版］ヘンダーソン−ハッセルバルフ（Henderso
n−Hasselbalch）の式： は、種々のpHでの酸とそのイオン化形態の濃度を与え
る。かくして、pHとカプリレート濃度を注意深く制御す
ることにより、カプリル酸の所定の濃度を容易に得るこ
とができる。例えば、カプリル酸濃度が0.07％（0.0035
M）に保されておりそしてイオン化形態（例えばカプリ
ル酸ナトリウム）がpH4.9における0.06％とpH＝８にお
ける2.0％との間で変わるならば、第１図として示され
たカプリル酸の量が生成される。本明細書で使用した、
カプリル酸はこの酸の非イオン化形態（オクタン酸とし
ても知られている）を指す。
ハンドブック（CRC Handboook of Chemistry and Physi
cs）、56版］ヘンダーソン−ハッセルバルフ（Henderso
n−Hasselbalch）の式： は、種々のpHでの酸とそのイオン化形態の濃度を与え
る。かくして、pHとカプリレート濃度を注意深く制御す
ることにより、カプリル酸の所定の濃度を容易に得るこ
とができる。例えば、カプリル酸濃度が0.07％（0.0035
M）に保されておりそしてイオン化形態（例えばカプリ
ル酸ナトリウム）がpH4.9における0.06％とpH＝８にお
ける2.0％との間で変わるならば、第１図として示され
たカプリル酸の量が生成される。本明細書で使用した、
カプリル酸はこの酸の非イオン化形態（オクタン酸とし
ても知られている）を指す。
カプリル酸の実用的且つ好ましい濃度を達成するのは
比較的容易であることを我々は見出だした。これは、pH
4.8における0.1％と約pH＝９における20％との間でカプ
リル酸ナトリウムの濃度を変えて、脂質で覆われたウイ
ルスの即時の不活性化を生じさせることによりなされ得
る。更に好ましくは、カプリレートの総濃度はpH4.8に
おける0.1％と6.5における2.0％との間で線状に増加さ
せるように保って即時のウイルス不活性化を生じさせ
る。別法として、カプリレートは、長い期間（例えば２
−４時間）pH6.5と9.5との間で２％に保ってウイルス不
活性化の適切なカプリル酸濃度を与えることができる。
非イオン化酸形態（カプリル酸）はともかくも脂質エン
ベロープ又はその中に埋め込まれたタンパク質に作用す
ることによりウイルス殺傷の活性剤であることと、解離
反応により、カプリル酸は、イオン化形態（カプリル酸
ナトリウム）の濃度を増加させることにより高いpHでウ
イルスを殺すのに十分高い濃度に保たれうるという前提
がある。タンパク質組成物とウイルス及びバクテリア不
活性化剤との混合物は、普通少なくとも約0.25時間（好
ましくは約0.5−３時間）の期間約２−60℃（好ましく
は約４−20℃）の温度に保持される。上述の如く、本発
明の処理は、処理されるべきタンパク質材料と適合性で
あるpH条件下に普通は行なわれる。かくして、タンパク
質に依存して、混合物のpHは、大抵の生物学的に活性な
タンパク質では一般に約４−10、好ましくは約4.5−8.
5、更に好ましくは約4.8−8.0の範囲にあるべきであ
る。一般に、pH及び温度範囲は組成物中の活性なタンパ
ク質に対する障害が最小であることを確実にするように
選ばれる。当業者は所定のタンパク質に好ましいpH範囲
を熟知している。
比較的容易であることを我々は見出だした。これは、pH
4.8における0.1％と約pH＝９における20％との間でカプ
リル酸ナトリウムの濃度を変えて、脂質で覆われたウイ
ルスの即時の不活性化を生じさせることによりなされ得
る。更に好ましくは、カプリレートの総濃度はpH4.8に
おける0.1％と6.5における2.0％との間で線状に増加さ
せるように保って即時のウイルス不活性化を生じさせ
る。別法として、カプリレートは、長い期間（例えば２
−４時間）pH6.5と9.5との間で２％に保ってウイルス不
活性化の適切なカプリル酸濃度を与えることができる。
非イオン化酸形態（カプリル酸）はともかくも脂質エン
ベロープ又はその中に埋め込まれたタンパク質に作用す
ることによりウイルス殺傷の活性剤であることと、解離
反応により、カプリル酸は、イオン化形態（カプリル酸
ナトリウム）の濃度を増加させることにより高いpHでウ
イルスを殺すのに十分高い濃度に保たれうるという前提
がある。タンパク質組成物とウイルス及びバクテリア不
活性化剤との混合物は、普通少なくとも約0.25時間（好
ましくは約0.5−３時間）の期間約２−60℃（好ましく
は約４−20℃）の温度に保持される。上述の如く、本発
明の処理は、処理されるべきタンパク質材料と適合性で
あるpH条件下に普通は行なわれる。かくして、タンパク
質に依存して、混合物のpHは、大抵の生物学的に活性な
タンパク質では一般に約４−10、好ましくは約4.5−8.
5、更に好ましくは約4.8−8.0の範囲にあるべきであ
る。一般に、pH及び温度範囲は組成物中の活性なタンパ
ク質に対する障害が最小であることを確実にするように
選ばれる。当業者は所定のタンパク質に好ましいpH範囲
を熟知している。
当業者は、前述の混合物の処理中問題のタンパク質の
好適な安定剤も添加するであろう。このタンパク質組成
物はその後処理して添加されたカプリル酸／カプリレー
トを除去することができる。慣用の方法がこの目的を達
成するのに使用できる。例えば、混合物を透析すること
ができ又は問題のタンパク質をアニオン交換樹脂に結合
させそして洗浄して問題のタンパク質のその後の溶出に
より添加されたカプリル酸／カプリレートを除去するこ
とができる。この剤を除去するための他の手段は当業者
には想い浮かぶであろう。
好適な安定剤も添加するであろう。このタンパク質組成
物はその後処理して添加されたカプリル酸／カプリレー
トを除去することができる。慣用の方法がこの目的を達
成するのに使用できる。例えば、混合物を透析すること
ができ又は問題のタンパク質をアニオン交換樹脂に結合
させそして洗浄して問題のタンパク質のその後の溶出に
より添加されたカプリル酸／カプリレートを除去するこ
とができる。この剤を除去するための他の手段は当業者
には想い浮かぶであろう。
我々は、我々のウイルス不活性化処理は、抗体（血漿
由来の及びモノクローナル）、ヒト血清αルブミン、凝
固因子、フィブロネクチン及びトランスフェリンなどの
広範囲の生物学的に活性な治療的タンパク質に対して有
効であることを見出だした。
由来の及びモノクローナル）、ヒト血清αルブミン、凝
固因子、フィブロネクチン及びトランスフェリンなどの
広範囲の生物学的に活性な治療的タンパク質に対して有
効であることを見出だした。
用語の定義 カプリル酸は、上述のとおりの非イオン化形態を意味
する。本明細書で使用した感染力の実質的減少とは、所
定の製剤のウイルス感染力力価が少なくとも４ログ又は
検出できない（N.D.）レベルに減少することを意味す
る。実質的に即時のウイルス不活性化とは、迅速な常用
の方法を使用してウイルス力価が測定されうる前にウイ
ルス不活性化が起こる（例えば、それはN.D.（検出不
可）である）ことを意味する。生物学的活性に不利な影
響を与えないでというのは、カプリル酸との接触が、問
題の生物学的に活性なタンパク質について慣用の方法を
使用して測定して元の生物学的活性の約30％未満の損失
しか生じないことを意味する。生物学的に活性なタンパ
ク質の量に不利な影響を与えないでというのは、カプリ
ル酸との接触が、元のタンパク質の量（ウイルス不活性
化処理前の量）の約40％未満の損失しか生じないことを
意味する。これは約10％未満であることが好ましい。本
明細書で使用した、脂質被包ウイルスとは、その核酸が
脂質を含むカプシドによりカプセル被包されているウイ
ルスを意味する。これらは当業者には周知されておりそ
して脂質被包（又は被覆）ウイルスという表現も周知さ
れている。治療的とは哺乳動物に投与されたとき医学的
に有利な作用を与えることができることを意味する。
する。本明細書で使用した感染力の実質的減少とは、所
定の製剤のウイルス感染力力価が少なくとも４ログ又は
検出できない（N.D.）レベルに減少することを意味す
る。実質的に即時のウイルス不活性化とは、迅速な常用
の方法を使用してウイルス力価が測定されうる前にウイ
ルス不活性化が起こる（例えば、それはN.D.（検出不
可）である）ことを意味する。生物学的活性に不利な影
響を与えないでというのは、カプリル酸との接触が、問
題の生物学的に活性なタンパク質について慣用の方法を
使用して測定して元の生物学的活性の約30％未満の損失
しか生じないことを意味する。生物学的に活性なタンパ
ク質の量に不利な影響を与えないでというのは、カプリ
ル酸との接触が、元のタンパク質の量（ウイルス不活性
化処理前の量）の約40％未満の損失しか生じないことを
意味する。これは約10％未満であることが好ましい。本
明細書で使用した、脂質被包ウイルスとは、その核酸が
脂質を含むカプシドによりカプセル被包されているウイ
ルスを意味する。これらは当業者には周知されておりそ
して脂質被包（又は被覆）ウイルスという表現も周知さ
れている。治療的とは哺乳動物に投与されたとき医学的
に有利な作用を与えることができることを意味する。
カプリル酸及びカプリレートの濃度、pH、温度、時間
などの変数がウイルス感染力の減少、タンパク質回収率
及びタンパク質の生物学的活性保持にいかに影響を与え
うるかを示すために、本発明の開示の実施例を下記に示
す。
などの変数がウイルス感染力の減少、タンパク質回収率
及びタンパク質の生物学的活性保持にいかに影響を与え
うるかを示すために、本発明の開示の実施例を下記に示
す。
実施例１ エプスタイン−バールウイルス（Epstein−Barrviru
s）（EBV）形質転換ヒトＢリンパ球（A.T.C.C.CRL875
2）により、緑膿菌（Pseudo monas aeruginosa）モノク
ローナルIgM抗体（ヒト）（PsMAb−IgM））を生産し
た。この予め形質転換された細胞は、７つのフィッシャ
ー−デブリン血清型（Fisher−Devlin serotype）の１
つ、Ｆ−４に対して特異的な天然に存在する抗体力価を
持った供与者から得られた。この抗体はそのバクテリア
の表面リポ多糖上の血清型決定基に結合する。Ｆ−４抗
体のための細胞培養回収物を清澄にし、部分的に精製し
そして1NNaOHによりpH8に調節した。室温（R.T.）で、
0.38mg/mlのIgM溶液（総計19mg）を最初にヘルペス・シ
ンプレックス型Ｉ（Herpes Simplex type I）（HSV−
１）ウイルス及び小胞性口内炎ウイルス（vesicular st
omatitis virus）（VSV）と接触させた。然る後2.0重量
％のカプリル酸ナトリウムを加えそして溶液をpH8に再
調節した。これはpH8におけるヘンダーソン・ハッセル
バルフの計算によりカプリル酸0.0014重量％及びイオン
化形態のカプリレート1.9986重量％に相当する。ウイル
ススパイキング（virus spiking）の後、溶液を60分間
保持した。ウイルススパイキングされた予備処理試料
は、この実施例及び後の実施例の対照として使用した。
s）（EBV）形質転換ヒトＢリンパ球（A.T.C.C.CRL875
2）により、緑膿菌（Pseudo monas aeruginosa）モノク
ローナルIgM抗体（ヒト）（PsMAb−IgM））を生産し
た。この予め形質転換された細胞は、７つのフィッシャ
ー−デブリン血清型（Fisher−Devlin serotype）の１
つ、Ｆ−４に対して特異的な天然に存在する抗体力価を
持った供与者から得られた。この抗体はそのバクテリア
の表面リポ多糖上の血清型決定基に結合する。Ｆ−４抗
体のための細胞培養回収物を清澄にし、部分的に精製し
そして1NNaOHによりpH8に調節した。室温（R.T.）で、
0.38mg/mlのIgM溶液（総計19mg）を最初にヘルペス・シ
ンプレックス型Ｉ（Herpes Simplex type I）（HSV−
１）ウイルス及び小胞性口内炎ウイルス（vesicular st
omatitis virus）（VSV）と接触させた。然る後2.0重量
％のカプリル酸ナトリウムを加えそして溶液をpH8に再
調節した。これはpH8におけるヘンダーソン・ハッセル
バルフの計算によりカプリル酸0.0014重量％及びイオン
化形態のカプリレート1.9986重量％に相当する。ウイル
ススパイキング（virus spiking）の後、溶液を60分間
保持した。ウイルススパイキングされた予備処理試料
は、この実施例及び後の実施例の対照として使用した。
PsMAb−IgM Ｆ−４タンパク質収率値は放射免疫拡散
（RID）アッセイによった。機能的活性は特異的リポ多
糖（LPS）結合能力として決定された。その後のIgM Ｆ
−４実施例の研究は、実質的に同様にLPS結合能力を示
した。
（RID）アッセイによった。機能的活性は特異的リポ多
糖（LPS）結合能力として決定された。その後のIgM Ｆ
−４実施例の研究は、実質的に同様にLPS結合能力を示
した。
実施例１の結果を表Ｉに示す。
実施例２ PsMAb−IgM（Ｆ−４）を調製しそして、VSVの他に、
エプスタイン−バールウイルス（EBV）を含めたこと
と、不活性化工程をより低い温度（５℃）で行ったこと
を除いては、実施例１と同様にして処理した。ウイルス
でスパイキングした後、溶液を120分間保持した。
エプスタイン−バールウイルス（EBV）を含めたこと
と、不活性化工程をより低い温度（５℃）で行ったこと
を除いては、実施例１と同様にして処理した。ウイルス
でスパイキングした後、溶液を120分間保持した。
実施例２の結果を表IIに示す。
実施例３ 不活性化のための部分的に精製したIgM溶液が５℃で
ありそして1NHClによりpH4.8に調節したことを除いて
は、実施例１と同様にしてPsMAb−1gM（Ｆ−４）を調製
した。この試料を最初ウイルスと接触させ、然る後0.1
重量％カプリル酸を加えそして1NNaOHによりpH4.8に再
調節した。これはpH4.8におけるヘンダーソン・ハッセ
ルバルフの計算によりカプリル酸0.055重量％及びイオ
ン化形態のカプリレート0.045重量％に相当する。ウイ
ルススパイキングの後、溶液を４℃で60分間保持した。
ありそして1NHClによりpH4.8に調節したことを除いて
は、実施例１と同様にしてPsMAb−1gM（Ｆ−４）を調製
した。この試料を最初ウイルスと接触させ、然る後0.1
重量％カプリル酸を加えそして1NNaOHによりpH4.8に再
調節した。これはpH4.8におけるヘンダーソン・ハッセ
ルバルフの計算によりカプリル酸0.055重量％及びイオ
ン化形態のカプリレート0.045重量％に相当する。ウイ
ルススパイキングの後、溶液を４℃で60分間保持した。
実施例３の結果を表IIIに示す。
実施例４ 緑膿菌外毒素Ａに対して天然に存在する抵抗力価を持
った供与者から得られたEBV形質転換ヒトＢリンパ球
（A.T.C.C.CRL8833により、シュードモナス外毒素Ａ抗
体IgG（ヒト）（MAb ExoA IgG）を生産した。MAb ExoA
IgGの細胞培養回収物を清澄化させそして精製した。５
℃でMAb ExoA IgGをpH6.5で0.5mg/ml（総計25mg）に調
節し、最初にVSVおよびHSV−１ウイルスと接触させた。
然る後2.0重量％のカプリル酸ナトリウムを加えそして1
NHClによりpH6.5に再調節した。これはpH6.5におけるヘ
ンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカプリル酸0.
042重量％及びイオン化形態のカプリレート1.958重量％
に相当する。スパイキングの後、溶液を30分間保持し
た。
った供与者から得られたEBV形質転換ヒトＢリンパ球
（A.T.C.C.CRL8833により、シュードモナス外毒素Ａ抗
体IgG（ヒト）（MAb ExoA IgG）を生産した。MAb ExoA
IgGの細胞培養回収物を清澄化させそして精製した。５
℃でMAb ExoA IgGをpH6.5で0.5mg/ml（総計25mg）に調
節し、最初にVSVおよびHSV−１ウイルスと接触させた。
然る後2.0重量％のカプリル酸ナトリウムを加えそして1
NHClによりpH6.5に再調節した。これはpH6.5におけるヘ
ンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカプリル酸0.
042重量％及びイオン化形態のカプリレート1.958重量％
に相当する。スパイキングの後、溶液を30分間保持し
た。
実施例４の結果を表IVに示す。
実施例５ 結果に示されているように、２つの濃度のカプリル酸
ナトリウムを使用したことを除いては、実施例４と同様
にしてMAb ExoA IgGを調製した。ウイルス不活性化効率
の検討のための試料はpH6.3でありそして５℃で60分間
接触させた。ウイルス種にはVSV、HSV−１、ワクシニア
ウイルス及びシンドビスウイルスが包含される。
ナトリウムを使用したことを除いては、実施例４と同様
にしてMAb ExoA IgGを調製した。ウイルス不活性化効率
の検討のための試料はpH6.3でありそして５℃で60分間
接触させた。ウイルス種にはVSV、HSV−１、ワクシニア
ウイルス及びシンドビスウイルスが包含される。
実施例５の結果を表Ｖに示す。
ND 検出できない（検出の下限＜1.5） Ａ＊ 試料はカプリル酸ナトリウム1.0重量％を受け取
りそして1NHClでpH6.3に再調節された。これはpH6.3に
おけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカプ
リル酸0.033重量％及びイオン化形態のカプリレート0.9
67重量％に相当する。
りそして1NHClでpH6.3に再調節された。これはpH6.3に
おけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカプ
リル酸0.033重量％及びイオン化形態のカプリレート0.9
67重量％に相当する。
Ｂ＊＊ 試料はカプリル酸ナトリウム2.0重量％を受け
取りそして1NHClでpH6.3に再調節された。これはpH6.3
におけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカ
プリル酸0.065重量％及びイオン化形態のカプリレート
1.935重量％に相当する。
取りそして1NHClでpH6.3に再調節された。これはpH6.3
におけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカ
プリル酸0.065重量％及びイオン化形態のカプリレート
1.935重量％に相当する。
実施例６ ２つの非脂質被覆ウイルスであるウシパルボウイルス
（Bovin Parvovirus）（BPV）及びポリオIIをカプリル
酸と反応させて、脂質被覆ウイルスの不活性化と対照的
に有効性のないことを証明した。Ps MoAb IgM（Ｆ−
４）を調製し、そして不活性化温度が５℃でありそして
ウイルスがBPVであることを除いては、実施例１と同様
にして化学的に処理した。IgG試料を最初にBPVウイルス
及びポリオIIウイルスと接触させ、然る後カプリル酸ナ
トリウムを2.0重量％となるように加えそして1NHClでpH
6.3に再調節した。これはpH6.3におけるヘンダーソン・
ハッセルバルフの計算によりカプリル酸0.065重量％及
びイオン化形態のカプリレート1.935重量％に相当す
る。ウイルススパイキングの後、溶液を120分間保持し
た。
（Bovin Parvovirus）（BPV）及びポリオIIをカプリル
酸と反応させて、脂質被覆ウイルスの不活性化と対照的
に有効性のないことを証明した。Ps MoAb IgM（Ｆ−
４）を調製し、そして不活性化温度が５℃でありそして
ウイルスがBPVであることを除いては、実施例１と同様
にして化学的に処理した。IgG試料を最初にBPVウイルス
及びポリオIIウイルスと接触させ、然る後カプリル酸ナ
トリウムを2.0重量％となるように加えそして1NHClでpH
6.3に再調節した。これはpH6.3におけるヘンダーソン・
ハッセルバルフの計算によりカプリル酸0.065重量％及
びイオン化形態のカプリレート1.935重量％に相当す
る。ウイルススパイキングの後、溶液を120分間保持し
た。
実施例６の結果を表VIに示す。
実施例７ イー・ジェー・コーン（E.J.Cohn）の冷エタノール精
製法に上澄液IV−４からヒト血清アルブミンを単離し
た。このアルブミンをpH6.0で0.5mg/mlの濃度（総計25m
g）に調節した。４℃でこのアルブミン溶液を小胞性口
内炎ウイルス（VSV）と接触させ、然る後カプリル酸ナ
トリウムを1.0重量％となるように加え、1NHClによりpH
6.0に再調節した。これはpH6におけるヘンダーソン・ハ
ッセルバルフの計算によりカプリル酸0.062重量％及び
イオン化形態のカプリレート0.938重量％に相当する。
ウイルススパイキングの後、溶液を60分間保持した。
製法に上澄液IV−４からヒト血清アルブミンを単離し
た。このアルブミンをpH6.0で0.5mg/mlの濃度（総計25m
g）に調節した。４℃でこのアルブミン溶液を小胞性口
内炎ウイルス（VSV）と接触させ、然る後カプリル酸ナ
トリウムを1.0重量％となるように加え、1NHClによりpH
6.0に再調節した。これはpH6におけるヘンダーソン・ハ
ッセルバルフの計算によりカプリル酸0.062重量％及び
イオン化形態のカプリレート0.938重量％に相当する。
ウイルススパイキングの後、溶液を60分間保持した。
実施例７の結果を表VIIに示す。
実施例８ 不安定な凝固因子II、VII、IX及びＸに富んだヒト血
清タンパク質を、イー・ジェー・コーンの冷エタノール
精製法の流出液Ｉからのアニオン交換吸着により調製し
た。溶出した凝固因子を、更に精製しそしてpH6.8で1.7
3mg/mlのタンパク質濃度に調節した。カプリル酸ナトリ
ウムを2.0重量％の濃度となるように加え、1NHClにより
pH6.8に再調節した。これはpH6.8におけるヘンダーソン
・ハッセルバルフの計算によりカプリル酸0.022重量％
及びイオン化形態のカプリレート1.978重量％に相当す
る。４℃で２時間のインキュベーションの後、凝固タン
パク質を、セファデックスＧ−50を使用してサイズ排除
クロマトグラフィーにより化学反応体から分離した。機
能的凝固活性に基づく収率の結果を表VIIIに示す。
清タンパク質を、イー・ジェー・コーンの冷エタノール
精製法の流出液Ｉからのアニオン交換吸着により調製し
た。溶出した凝固因子を、更に精製しそしてpH6.8で1.7
3mg/mlのタンパク質濃度に調節した。カプリル酸ナトリ
ウムを2.0重量％の濃度となるように加え、1NHClにより
pH6.8に再調節した。これはpH6.8におけるヘンダーソン
・ハッセルバルフの計算によりカプリル酸0.022重量％
及びイオン化形態のカプリレート1.978重量％に相当す
る。４℃で２時間のインキュベーションの後、凝固タン
パク質を、セファデックスＧ−50を使用してサイズ排除
クロマトグラフィーにより化学反応体から分離した。機
能的凝固活性に基づく収率の結果を表VIIIに示す。
実施例９ 凍結沈でん物からのヒト因子VIIIの精製中捨てられた
タンパク質画分から、フィブロネクチンに富んだタンパ
ク質を単離する。フィブロネクチンは、pH6.9で1.34mg/
ml（全体で33.5mg）のタンパク質濃度に調節した。カプ
リル酸ナトリウムを2.0重量％の濃度となるように加
え、1NHClによりpH6.9に再調節した。これはpH6.9にお
けるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカプリ
ル酸0.014重量％及びイオン化形態のカプリレート1.986
重量％に相当する。５℃で１時間のインキュベーション
の後、フィブロネクチンを、セファデックスＧ−50を使
用してサイズ排除クロマトグラフィーにより化学反応体
から分離した。試料をカプリル酸処理の前後の酵素結合
免疫吸着剤アッセイ（Enzyme−linked immunosorbent a
ssay）によりアッセイしそして高速タンパク質液体をク
ロマトグラフィー（FPLC）により構造変化を分析した。
実施例９の結果を表IXに示す。
タンパク質画分から、フィブロネクチンに富んだタンパ
ク質を単離する。フィブロネクチンは、pH6.9で1.34mg/
ml（全体で33.5mg）のタンパク質濃度に調節した。カプ
リル酸ナトリウムを2.0重量％の濃度となるように加
え、1NHClによりpH6.9に再調節した。これはpH6.9にお
けるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカプリ
ル酸0.014重量％及びイオン化形態のカプリレート1.986
重量％に相当する。５℃で１時間のインキュベーション
の後、フィブロネクチンを、セファデックスＧ−50を使
用してサイズ排除クロマトグラフィーにより化学反応体
から分離した。試料をカプリル酸処理の前後の酵素結合
免疫吸着剤アッセイ（Enzyme−linked immunosorbent a
ssay）によりアッセイしそして高速タンパク質液体をク
ロマトグラフィー（FPLC）により構造変化を分析した。
実施例９の結果を表IXに示す。
実施例10 α１金属結合グロブリンとしても知られているトラン
スフェリンを、イー・ジェー・コーンの冷エタノール精
製法からの画分IV−１から単離した。このトランスフェ
リンをpH6.8で3.35mg/ml（総計105mg）に調節した。カ
プリル酸ナトリウムを2.0重量％の濃度となるように加
えそして1NHClによりpH6.8に調節した。これはpH6.8に
おけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカプ
リル酸0.022重量％及びイオン化形態のカプリレート1.9
78重量％に相当する。５℃で60分間のインキュベーショ
ンの後、トランスフエリンをセファデックスＧ−50を使
用してサイズ排除クロマトグラフィーにより化学反応体
から分離した。試料をカプリル酸処理の前後にRIDによ
りアッセイして収率を決定しそしてFPLCにより製造変化
を分析した。実験10の結果を表Ｘに示す。
スフェリンを、イー・ジェー・コーンの冷エタノール精
製法からの画分IV−１から単離した。このトランスフェ
リンをpH6.8で3.35mg/ml（総計105mg）に調節した。カ
プリル酸ナトリウムを2.0重量％の濃度となるように加
えそして1NHClによりpH6.8に調節した。これはpH6.8に
おけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカプ
リル酸0.022重量％及びイオン化形態のカプリレート1.9
78重量％に相当する。５℃で60分間のインキュベーショ
ンの後、トランスフエリンをセファデックスＧ−50を使
用してサイズ排除クロマトグラフィーにより化学反応体
から分離した。試料をカプリル酸処理の前後にRIDによ
りアッセイして収率を決定しそしてFPLCにより製造変化
を分析した。実験10の結果を表Ｘに示す。
実施例11 新鮮な凍結ヒト血漿の溶解したプールから遠心分離に
より凍結沈でん物を回収した。抗血友病因子（AHF）と
しても知られている凝固因子VIIIをこの凍結沈でん物か
ら回収しそして精製した。精製したAHF溶液をpH7.2で1.
7単位/ml（総計46.2AHF単位）のAHF濃度に調節した。５
℃でカプリル酸ナトリウムを2.0重量％の濃度となるよ
うに加えそして1HNClによりpH7.2に調節したるこれはpH
7.2におけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によ
りカプリル酸0.0087重量％及びイオン化形態のカプリレ
ート1.9913重量％に相当する。５℃で２時間のインキュ
ベーションの後、AHFに富んだタンパク質をセファデツ
クスＧ−50を使用してサイズ排除クロマトグラフィーに
より化学反応体から分離した。機能的因子VIII凝固活性
に基づく収率結果を表XIに示す。
より凍結沈でん物を回収した。抗血友病因子（AHF）と
しても知られている凝固因子VIIIをこの凍結沈でん物か
ら回収しそして精製した。精製したAHF溶液をpH7.2で1.
7単位/ml（総計46.2AHF単位）のAHF濃度に調節した。５
℃でカプリル酸ナトリウムを2.0重量％の濃度となるよ
うに加えそして1HNClによりpH7.2に調節したるこれはpH
7.2におけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算によ
りカプリル酸0.0087重量％及びイオン化形態のカプリレ
ート1.9913重量％に相当する。５℃で２時間のインキュ
ベーションの後、AHFに富んだタンパク質をセファデツ
クスＧ−50を使用してサイズ排除クロマトグラフィーに
より化学反応体から分離した。機能的因子VIII凝固活性
に基づく収率結果を表XIに示す。
実施例12 画分IIIから精製されたヒト血漿由来の免疫グロブリ
ンＭ（IgM−pd）を検討してウイルス破壊の際の低pH（p
H4.8）の役割を解明した。画分IIIペーストを、コーン
−オンクレイ冷エタノール分別法（Cohn−Oncley cold
ethanol fractionation method）により正常なヒト血漿
から処置した。画分IIIペーストを、pH4.0で0.05M酢酸
ナトリウム中に20℃で混合することにより懸濁させた。
不溶性タンパク質を遠心分離及び過により除去した。
IgM−pdに富んだ清澄化した液pH4.8に調節した。５℃
でこのIgM−pd溶液をVSVと接触させた。組織培養（T.
C.）培地試料を対照としてVSVと接触させた。ウイルス
スパイキングの後、試料を８時間以下の間隔で感染力に
ついて試験した。実施例12の結果を表XIIに示す。
ンＭ（IgM−pd）を検討してウイルス破壊の際の低pH（p
H4.8）の役割を解明した。画分IIIペーストを、コーン
−オンクレイ冷エタノール分別法（Cohn−Oncley cold
ethanol fractionation method）により正常なヒト血漿
から処置した。画分IIIペーストを、pH4.0で0.05M酢酸
ナトリウム中に20℃で混合することにより懸濁させた。
不溶性タンパク質を遠心分離及び過により除去した。
IgM−pdに富んだ清澄化した液pH4.8に調節した。５℃
でこのIgM−pd溶液をVSVと接触させた。組織培養（T.
C.）培地試料を対照としてVSVと接触させた。ウイルス
スパイキングの後、試料を８時間以下の間隔で感染力に
ついて試験した。実施例12の結果を表XIIに示す。
前述の開示及び実施例が与えられているが、当業者は
それを変更することができるであろう。従って、本明細
書に開示された本発明は特許請求の範囲により限定され
るべきであることを意図する。
それを変更することができるであろう。従って、本明細
書に開示された本発明は特許請求の範囲により限定され
るべきであることを意図する。
本発明の主たる特徴及び態様は以下のとおりである。
1.生物学的に活性な治療的タンパク質の溶液中の脂質被
包ウイルスを不活性化させる方法であって、 このタンパク質の量及び生物学的活性に不利な影響を
与えないでウイルスの感染力を実質的に減少させるのに
十分な条件下に前記溶液をカプリル酸と接触させる工程
を含む方法。
包ウイルスを不活性化させる方法であって、 このタンパク質の量及び生物学的活性に不利な影響を
与えないでウイルスの感染力を実質的に減少させるのに
十分な条件下に前記溶液をカプリル酸と接触させる工程
を含む方法。
2.カプリル酸が、水中重量％基準で、約0.07％−約0.00
1％の範囲の量で非イオン化形態にある上記１に記載の
方法。
1％の範囲の量で非イオン化形態にある上記１に記載の
方法。
3.前記感染力を検出できないレベルにまで減少させる上
記１に記載の方法。
記１に記載の方法。
4.処理されたタンパク質の生物学的活性の損失が、もし
あるとしても、元の活性の約30％未満である上記１に記
載の方法。
あるとしても、元の活性の約30％未満である上記１に記
載の方法。
5.カプリル酸濃度及び溶液pHの条件が、添付図面の斜線
を施した領域により定められた条件である上記１に記載
の方法。
を施した領域により定められた条件である上記１に記載
の方法。
6.前記溶液がカプリレートイオンを含みそしてカプリレ
ートイオン濃度及び溶液pHの条件が、カプリル酸の濃度
を水中重量％基準で約0.07％乃至0.001％の間に維持さ
れるような条件である上記１に記載の方法。
ートイオン濃度及び溶液pHの条件が、カプリル酸の濃度
を水中重量％基準で約0.07％乃至0.001％の間に維持さ
れるような条件である上記１に記載の方法。
7.カプリル酸の濃度が、水中重量％基準で0.07％乃至0.
01％の範囲にある上記１に記載の方法。
01％の範囲にある上記１に記載の方法。
8.微生物がHSV−１、VSV、ワクシニア、シンドビス及び
EBVから選ばれた脂質被覆ウイルスである上記１に記載
の方法。
EBVから選ばれた脂質被覆ウイルスである上記１に記載
の方法。
9.生物学的に活性なタンパク質が、抗体、ヒト血清アル
ブミン、凝固因子、フィブロネクチン及びトランスフェ
リンの内の１つ又は２つ以上である上記１に記載の方
法。
ブミン、凝固因子、フィブロネクチン及びトランスフェ
リンの内の１つ又は２つ以上である上記１に記載の方
法。
10.凝固因子が、因子II、VII、VIII、IX及びＸから選ば
れる上記９に記載の方法。
れる上記９に記載の方法。
11.抗体の水性溶液中の脂質被包ウイルスを不活性化さ
せる方法であって、 前記ウイルスの感染力を実質的に減少させるのに十分
な時間及びpHで、重量％基準で約0.07％乃至約0.001％
の範囲の濃度のカプリル酸と前記溶液を接触させる工程
を含む方法。
せる方法であって、 前記ウイルスの感染力を実質的に減少させるのに十分
な時間及びpHで、重量％基準で約0.07％乃至約0.001％
の範囲の濃度のカプリル酸と前記溶液を接触させる工程
を含む方法。
12.前記抗体がIgM抗体であり、溶液のpHが約8.0である
上記11に記載の方法。
上記11に記載の方法。
13.前記抗体が1gG抗体であり、pHが約6.3である上記11
に記載の方法。
に記載の方法。
14.生物学的に活性なヒトモノクローナル抗体の水性溶
液中の脂質被包ウイルスを不活性化させる方法であっ
て、 ウイルス力価を検出できないレベルに減少させるのに
十分な時間、重量％基準で約0.07％乃至約0.001％の範
囲の濃度のカプリル酸と前記ウイルスを接触させること
を含む方法。
液中の脂質被包ウイルスを不活性化させる方法であっ
て、 ウイルス力価を検出できないレベルに減少させるのに
十分な時間、重量％基準で約0.07％乃至約0.001％の範
囲の濃度のカプリル酸と前記ウイルスを接触させること
を含む方法。
15.前記抗体が、緑膿菌バクテリウム（Pseudomonas aer
uginosa bacterium）のリボ多糖分子上の血清型決定基
に結合する抗体である上記14に記載の方法。
uginosa bacterium）のリボ多糖分子上の血清型決定基
に結合する抗体である上記14に記載の方法。
16.前記バクテリウムが、フィッシャー−デブリン免疫
型１乃至７の１つである上記15に記載の方法。
型１乃至７の１つである上記15に記載の方法。
17.前記バクテリウムがフィッシャー免疫型４である上
記16に記載の方法。
記16に記載の方法。
18.前記抗体が、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の
外毒素Ａに結合する抗体である上記14に記載の方法。
外毒素Ａに結合する抗体である上記14に記載の方法。
添付図面は、所定の溶液のpH及びウイルス不活性化時間
に対するカプリル酸の濃度の関係を示すグラフ図であ
る。
に対するカプリル酸の濃度の関係を示すグラフ図であ
る。
Claims (3)
- 【請求項１】生物学的に活性な治療的タンパク質の溶液
中の脂質被包ウイルスを不活性化させる方法であって、 このタンパク質の量及び生物学的活性に不利な影響を与
えないでウイルスの感染力を実質的に減少させるのに十
分な条件下に前記溶液をカプリル酸と接触させる工程を
含む方法。 - 【請求項２】抗体の水性溶液中の脂質被包ウイルスを不
活性化させる方法であって、 前記ウイルスの感染力を実質的に減少させるのに十分な
時間及びpHで、重量％基準で約0.07％乃至約0.001％の
範囲の濃度のカプリル酸と前記溶液を接触させる工程を
含む方法。 - 【請求項３】生物学的に活性なヒトモノクローナル抗体
の水性溶液中の脂質被包ウイルスを不活性化させる方法
であって、 ウイルス力価を検出できないレベルに減少させるのに十
分な時間、重量％基準で約0.07％乃至約0.001％の範囲
の濃度のカプリル酸と前記ウイルスを接触させることを
含む方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/287,368 US4939176A (en) | 1988-12-20 | 1988-12-20 | Viral inactivation process |
| US287368 | 1988-12-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02273175A JPH02273175A (ja) | 1990-11-07 |
| JP2601551B2 true JP2601551B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=23102591
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1326178A Expired - Lifetime JP2601551B2 (ja) | 1988-12-20 | 1989-12-18 | ウイルスを不活性化する方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4939176A (ja) |
| EP (1) | EP0374625B1 (ja) |
| JP (1) | JP2601551B2 (ja) |
| AT (1) | ATE82510T1 (ja) |
| AU (1) | AU618157B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340211C (ja) |
| DE (1) | DE68903558T2 (ja) |
| ES (1) | ES2052872T3 (ja) |
| GR (1) | GR3006561T3 (ja) |
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| US5202246A (en) * | 1989-08-16 | 1993-04-13 | Armour Pharmaceutical Company | Treatment of immobilized matrices for preparation of pharmaceutical and biological products with anti-microbial agents to remove pyrogen-producing organisms and pyrogens |
| AU6428390A (en) * | 1989-08-16 | 1991-04-03 | Rorer International (Overseas) Inc. | Treatment of immobilized matrices with antimicrobial agents to remove pyrogen-producing organisms and pyrogens |
| JPH0671434B2 (ja) * | 1989-09-18 | 1994-09-14 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
| ATE122054T1 (de) * | 1990-03-22 | 1995-05-15 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur herstellung eines intravenös verträglichen immunglobulin-g-präparates. |
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| AUPO410696A0 (en) * | 1996-12-06 | 1997-01-09 | Csl Limited | Inactivation of viruses by incubation with caprylate |
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| CN1330370C (zh) | 2002-02-28 | 2007-08-08 | 尼普洛株式会社 | 稳定的白蛋白制剂 |
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- 1989-12-08 DE DE8989122657T patent/DE68903558T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-08 ES ES89122657T patent/ES2052872T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-08 AT AT89122657T patent/ATE82510T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1989-12-19 AU AU46987/89A patent/AU618157B2/en not_active Expired
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- 1992-12-16 GR GR920402935T patent/GR3006561T3/el unknown
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