JPH02273175A - ウイルスを不活性化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般にウィルス不活性化法、特に、生物学的
に活性な治療的タンパク質生成物におけるウィルス不活
性化に関する。

本発明を要約すれば、血液又は細胞培養系から得られた
精製された生物学的に活性なタンパク質製品に存在する
脂質被包ウィルス（１１ｐｉｄ−ｅｎｖｅｌ。

ｐａｄ　ｖｉｒｕｓｅｓ）は、前記タンパク質製品を不
利に沈でんさせたり該タンパク質製品の生物学的活性に
不利な影響を与えないで前記ウィルスを不活性化させる
のに十分な非イオン化カプリル酸濃度、ｐＨｓ温度及び
イオン環境で前記製品をカプリル酸と接触させることに
より不活性化させることができる。

先行技術 製薬学的製品の安全性は、特にウィルス汚染が起こりう
る場合には（例えば、血液、又は生物学的活性タンパク
質を生成するのに予定された細胞培養系由来の生成物に
おいて）常に懸念される事である。都合の悪いことに、
ウィルスが見出だされる生成物そのものが、多くの公知
の慣用のウィルス不活性化技術に対して不安定でありそ
して極めて影響を受けやすいことが多い。成る場合には
、タンパク質を保護しようとすると、ウィルスも保護し
てしまう。

この状況を克服するために、種々の試みがなされた。例
えば、成る種の制御された熱処理又は特定的に選ばれた
化学剤により生物学的に活性なタンパク質を不活性化さ
せうろことは周知されている。タンパク質の生物学的活
性に不利な影響を及ぼさず又はその量を問題となる程減
少させることなくウィルスを不活性化させるために、い
くつかの熱処理法が開発された。例えば、フェルナンデ
ス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）及びランドブラッド（Ｌｕｎ
ｄｂｌａｄ）の米国特許第４．４４０．６７９号（因子
■として知られている非常に不安定な凝固タンパク質の
低温殺菌用の炭水化物安定剤）及びミトラ（Ｍｉｔｒａ
）及びモーゼン（Ｍｏｚｅｎ）の米国特許第４．７６２
，７１４号（ｐＨ１温度及び時間の制御された条件によ
り免疫グロブリン生成物におけるウィルス不活性化を示
す）参照。因子■は、最初に凍結乾燥すると、低温殺菌
条件（少なくとも６０℃で１０時間）にさらすことがで
きることを示しているリューベンシュタイン（Ｒｅｕｂ
ｅｎｓ　ｔｅ　ｉｎ）の米国特許第４．４５６．５９０
号及び、トーマス（ｈｏｍａｓ）の米国特許第４．４９
５．２７８号（凍結乾燥した因子■の同様な熱処理）も
参照されたい。

ウィルスを不活性化するのに種々の化学的方法も使用さ
れた。例えば、レンバッハ（Ｌｅｎｂａｃｈ）の米国特
許第４．５３４．９７２号（銅フェナントロリン及び関
連した化合物の使用）及び、ホロビッツ（Ｈｏｒｏｖｉ
ｔｚ）の米国特許第４．４８１．１８９号（トリーｎ−
ブチルホスフェート及び関連して化合物）の使用）を参
照されたい。

血漿製品の製造（グロブリンの沈でん）及び脂質被覆ウ
ィルス（１ｉｐｉｄ−ｃｏａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓｅｓ）
の不活性化のためにすらカプリル酸のようなカルボン酸
が使用されたが、治療的な生物学的に活性なタンパク質
の存在下に使用されたのではない［ジェー・ニー・サン
ド（Ｊ、Ａ、５ａｎｄＳ）等、アンチ・マイクロバイア
ル・エージェント・アンド・ヘモセラピー（Ａｎｔｉ　
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒａｐｙ）、１９７９年１月、１３４−１３６
頁参照］。カルボン酸（カプリル酸ナトリウム）が因子
■のウィルス不活性化のために熱及びアミノ酸との組み
合わせとしても使用された（ナイトウ等の米国特許第４
゜４４６．１３４号参照）。ホロビッツ等、ボックス・
サングイニス（Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ）、５４：１４−２０
（１９８８）により開示された、血漿誘導体のウィルス
不活性化のための脂肪酸の逐次の使用、も参照されたい
。

ＩｇＧ、セルロプラスミン及びＩｇＡに影響を及ぼさな
いでカプリル酸による血漿タンパク質のバルクの沈でん
が記載されている［スタインパック・エム及びオードラ
ン・アール（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈ、Ｍ、　ａｎｄＡｕｄ
ｒａｎ、Ｒ，）、アーキブス・オブ・バイオケミストリ
ー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ）、１３４．１７９−２９４（
１９６９）１゜ヒト、ウマ、ヒツジ及びウサギの血清又
は血漿を、０．０６Ｍ酢酸塩緩衝液で希釈して約１゜７
％タンパク質とし、２０℃でｐＨ４，８に調節し、カプ
リル酸に関して０．１７４Ｎ（２，５重量％）とした。

緩衝液モル濃度（０，０６Ｍ）及びｐＨ（ｐＨ４，８±
０．０５）に注意することが高純度１ｇＧにとって重要
である。

スタインパック・エムの前記文献の沈でん法は、ＩｇＧ
の回収のために０．０６６Ｍ（０，８６重量％）の濃度
でカプリル酸を使用して、ハイブリドーマ培養廃培地及
びマウスからの腹水液に適用された［ルッソ・シー、カ
レガロ・エル、ランプ・イー、フェロン中ニス；ジャー
ナル拳オブ侭イムノロジカル・メソッヅ、６５．２６９
−２７１（１９８３ＸＲｕ５ｓｏ、Ｃ，、Ｃａｌｌｅｇ
ａｒｏ、Ｌ、、　Ｌａｎｚａ、Ｅ、。

Ｆｅｒｒｏｎｅ、　Ｓ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ、６５＋　２６９−２７１（１９８３）］。

同じ方法が、カプリル酸０．１５Ｍ又は２．１６重量％
に調節された希釈ヒト血漿に適用された［ハビーブ、ニ
ーｅエフ・ニス・ニー及び７ランシス、イー◆アール（
Ｈａｂｅｅｂ、Ａ、Ｆ、Ｓ、Ａ、　ａｎｄ　Ｆｒａｎｃ
ｉｓ、　Ｅ、Ｒ）　、　、プレパレーティブ・バイオケ
ミストリー（Ｐｒｅｐ　、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ）、ｌ　４
（１）、ｌ−１７（１９８４）］。ＤＥＡＥセルロース
吸着及び溶出によりコーンの冷エタノール画分■（Ｃ□
ｈｎ　ｃｏｌｄｅｔｈａｎｏｌ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｍ
）から単離されたＩｇＡは、ａ　−２マクログロブリン
の除去のためにカプリル酸沈でんにより更に精製された
［ペジＨディール、エル（Ｐｅｊａｕｄｉｅｒ、Ｌ）　
、＋オードラン、アール（Ａｕｄｒａｎ、Ｒ）　・及び
スタインバック、エム（Ｓｔｅｉｎｂｕａｈ、Ｍ）、　
、ボックス・サングイニス（Ｖｏｗ　Ｓａｎｇ）、２３
．１６５−１７５（１９７２）］。沈でんのためのパラ
メータは、０．９％塩化ナトリウムに調節された２、０
％タンパク質濃度、ｐＨ５及び０゜０７８Ｍ又は１．１
２重量％となるように室温で加えられたカプリル酸から
成っていた。沈でんしたｔｔ　−２マクログロブリンを
遠心分離により除去した。

コーンの冷エタノール画分■中に存在する免疫グロブリ
ン以外の大部分のタンパク質及びリポタンパク質を沈で
んさせるのにカプリル酸が使用された［スタインバック
、エム０．オードラン、アール０．ペジョディール、エ
ル６、ブラトリックス、シー（Ｂｌａｔｒｉｘ、Ｃ）、
　、プレパレーティブ・バイオケミストリー　３　（４
）、３６３−３７３（１９７３）］。約２．５％タンパ
ク質の画分■の懸濁液を、ｐ）（４，８で０．０５Ｎ酢
酸塩となるように調節しそして室温に至らしめた。カプ
リル酸を加えて０．１７４Ｍ又は２．５重量％とした。

得られる沈でんを捨てた。上澄液はＩｇＧ％　ｒｇＭ及
び夏ｇＡに富んでいた。沈でん剤としてカプリル酸を使
用するすべての場合に、ｐＨ，温度及びカプリル酸の有
効性の理想的条件の下で水への最大溶解度より相当多い
量でカプリル酸は存在していることに留意されるべきで
ある。このような量、約０．８６−２．５重量％は、普
通は不溶性形態（エマルジーン）にある比較的不溶性の
カプリル酸の十分な量、従って沈でん剤として有用な量
を保証するのに必要である。

上述の多数の刊行物にもかかわらず、治療的タンパク質
の生物学的活性又は回収可能な量に不利な影響を与えな
いで実質的にすべての脂質被覆ウィルスを不活性化させ
るのに、沈でん濃度より低い濃度で且つ単独でカプリル
酸を使用する方法は知られていない。注意深く使用条件
を制御することにより、生成物の活性に不利な影響を与
えないで生物学的に活性な治療的生成物中の脂質被覆ウ
ィルスを不活性化させるのにカプリル酸を使用できるこ
とを我々は見出だした。我々の発明の詳細を以下に述べ
る。

我々の方法の利点は、下記の解離反応に従って発生する
非イオン化カプリル酸の量の正確な制御に基づいている
。

ＣＨｓ（ＣＪ）ｓｃＯＯＨＣＨｓ（ＣＨｘ）ｓＣＯＯＨ
−＋　Ｈ”カプリル酸　　　　イオン化形態 かくして、不安定な、生物学的に活性な治療的生成物中
の実質的にすべての脂質被覆ウィルスを不活性化させる
本発明の方法は、非イオン化カプリル酸の量を制御する
と共に生成物の量、生物学的活性及び治療有効性に不利
な影響を与えないでウィルスの不活性化を確実にするの
に十分な濃度、ｐＨ及びイオン環境の下で生成物をカプ
リル酸と接触させる工程を含んで成る。

好ましい態様では、本発明の不活性化方法は、不活性化
されるべき特定のタンパク質の安定性又は量に不利な影
響を与えないで発生したカプリル酸の量を制御するのに
カプリル酸塩濃度及びｐＨの選択的な使用を意図する。

０．０６８％より多くの又はその最大溶解度である約０
．０７％のカプリル酸を形成させない条件を確実にする
ことによりタンパク質の望ましくない損失が回避される
。

約０．０７％（重量％基準）を越えるカプリル酸濃度は
、カプリル酸とタンパク質のエマルジョンを生成させる
ことがあり、そのため望ましくないタンパク質損失をも
たらす。他方、カプリル酸の量は、合理的な時間内に脂
質被覆ウィルスの不活性化を確実にするのに十分（少な
くとも０．００１％）でなければならない。驚くべきこ
とに、より低いｐＨ（６，５又はそれより低い）で、カ
ブリルａｍが０．０７−０．００１％で存在しているな
らば、ウィルス不活性化は殆ど即時に達成される。

より高いｐＨでは、カブリレートが明らかに主たる種で
ある場合には、ウィルスの同じ対数減少を達成するのに
より高い濃度とより長い時間が必要である。かくして、
好ましい態様では、本発明に有用なカプリル酸濃度は、
重量％基準で約０．０７−約０．００１％の範囲である
。

本発明の第１の利点はその融通性である。低濃度では、
本発明は低ｐＨで使用して成る種のウィルスを即時に不
活性化させることができる。この方法は、必要に応じて
、より高いｐＨで、より高い濃度で及びより長い時間で
不活性化させることも可能とする。これは、問題のタン
パク質がウィルス不活性化中に変質又は破壊されないよ
うに、問題のタンパク質の最も安定なｐＨで不活性化を
選ぶことも可能とする。かくして、好ましい場合には、
カプリル酸濃度は、重量／重量％基準で水中約０．０７
％−約０．００１％の範囲にあり、これは、ｐＨと、以
下に更に詳細に説明するとおり、イオン化形！ＩＡ（即
ち、カプリル酸ナトリウムの如き）にあるカブリレート
の量の両方を制御することにより制御される。有利なこ
とにはカプリル酸は、ヒトに対する低くて、害のない毒
性を有し、そして人間の患者に大量に潅流されるアルブ
ミン又は血漿タンパク質画分（ＰＰＰ）の安定剤として
現在使用されている。本発明の他の利点は、血漿ウィル
スの有名な貯蔵所であるコーン画分■ペーストから精製
されるＩ　ｇＭ／　Ｉ　ｇＧのようなウィルスを含まな
い治療的に活性なタンパク質を確実に入手可能とするこ
とである。基本的利点は、この方法が、注意深く制御す
れば、タンパク質に対して穏やかであり、そして約ｐＨ
４，０乃至ｐＨ８，０で安定ないかなるタンパク質にも
適用できる方法であるということである。

標準の生化学的取り決めにより且つ本明細書で使用する
、添字“エート“（“ａｔｅ”）（即ちカブリレート）
は、解離反応における如く、その酸とそのイオン化形態
との混合物を表す。

ＣＨ３（ＣＨＩ）＠−ＣＯＯＨＣＨｓ（ＣＨｘ）ｓ−Ｃ
ｏｏ−＋Ｈ”カプリル酸　　　　イオン化形態 カプリル酸のｐＫａは４．８９である【化学及び物理学
のＣＲＣハンドブック（ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ
　Ｃｈｅｍｔｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ）、５
６版ｌへンダーソンー／％−７セルバルフ（Ｈｅｎｄｅ
ｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ）の式：は、種々の
ｐＨでの酸とそのイオン化形態の濃度を与える。かくし
て、ｐＨとカブリレート濃度を注意深く制御することに
より、カプリル酸の所定の濃度を容易に得ることができ
る。例えば、カプリル酸濃度が０．０７％（０，００３
５Ｍ）に保たれておりそしてイオン化形態（例えばカプ
リル酸ナトリウム）がｐＨ４，９における０、０６％と
ｐＨ−８における２、０％との間で変わるならば、第１
図として示されたカプリル酸の量が生成される。本明細
書で使用した、カプリル酸はこの酸の非イオン化形態（
オクタン酸としても知られている）を指す。

カプリル酸の実用的且つ好ましい濃度を達成するのは比
較的容易であることを我々は見出だした。

これは、ｐＨ４，８における０、１％と約ｐＨ−９にお
ける２０％との間でカプリル酸ナトリウムの濃度を変え
て、脂質で覆われたウィルスの即時の不活性化を生じさ
せることによりなされ得る。更に好ましくは、カブリレ
ートの総濃度をｐＨ４。

８における０、１％と６．５における２、０％との間で
線状に増加させるように保って即時のウィルス不活性化
を生じさせる。別法として、カブリレートは、長い期間
（例えば２−４時間）ｐＨ６。

５と９．５との間で２％に保ってウィルス不活性化の適
切なカプリル酸濃度を与えることができる。

非イオン化酸形態（カプリル酸）はともかくも脂質エン
ベロープ又はその中に埋め込まれたタンパク質に作用す
ることによりウィルス殺傷の活性剤であることと、解離
反応により、カプリル酸は、イオン化形態（カプリル酸
ナトリウム）の濃度を増加させることにより高いｐＨで
ウィルスを殺すのに十分高い濃度に保たれうるという前
提がある。タンパク質組成物とウィルス及びバクテリア
不活性他剤との混合物は、普通少なくとも約０．２５時
間（好ましくは約０．５−３時間）の期間約２−６０℃
（好ましくは約４−２０℃）の温度に保持される。上述
の如く、本発明の処理は、処理されるべきタンパク質材
料と適合性であるｐＨ条件下に普通は行なわれる。かく
して、タンパク質に依存して、混合物のｐＨは、大抵の
生物学的に活性なタンパク質では一般に約４−１０、好
ましくは約４゜５−８．５、更に好ましくは約４．８−
８．０の範囲にあるべきである。一般に、ｐＨ及び温度
範囲は組成物中の活性なタンパク質に対する障害が最小
であることを確実にするように選ばれる。当業者は所定
のタンパク質に好ましいｐＨ範囲を熟知している。

当業者は、前述の混合物の処理中問題のタンパク質の好
適な安定剤も添加するであろう。このタンパク質組成物
はその後処理して添加されたカプリル酸／カブリレート
を除去することができる。

慣用の方法がこの目的を達成するのに使用できる。

例えば、混合物を透析することができ又は問題のタンパ
ク質をアニオン交換樹脂に結合させそして洗浄して問題
のタンパク質のその後の溶出により添加されたカプリル
酸／カプリレートを除去することができる。この剤を除
去するだめの他の手段は当業者には想い浮かぶであろう
。

我々は、我々のウィルス不活性化処理は、抗体（血漿由
来の及びモノクローナル）、ヒト血清ａルブミン、凝固
因子、フィブロネクチン及びトランスフェリンなどの広
範囲の生物学的に活性な治療的タンパク質に対して有効
であることを見出だした。

用語の定義 カプリル酸は、上述のとおりの非イオン化形態を意味す
る。本明細書で使用した感染力の実質的減少とは、所定
の製剤のウィルス感染力力価が少なくとも４０グ又は検
出できない（Ｎ　、Ｄ　、）レベルに減少することを意
味する。実質的に即時のウィルス不活性化とは、迅速な
常用の方法を使用してウィルス力価が測定されうる前に
ウィルス不活性化が起こる（例えば、それはＮ、Ｄ、（
検出不可）である）ことを意味する。生物学的活性に不
利な影響を与えないでというのは、カプリル酸との接触
が、問題の生物学的に活性なタンパク質について慣用の
方法を使用して測定して元の生物学的活性の約３０％未
満の損失しか生じないことを意味する。生物学的に活性
なタンパク質の量に不利な影響を与えないでというのは
、カプリル酸との接触が、元のタンパク質の量（ウイル
ス不活性化魁理前の量）の約４０％未満の損失しか生じ
ないことを意味する。これは約１０％未満であることが
好ましい。本明細書で使用した、脂質被包ウィルスとは
、その核酸が脂質を含むカプシドによりカプセル被包さ
れているウィルスを意味する。これらは当業者には周知
されておりそして脂質被包（又は被覆）ウィルスという
表現も周知されている。

治療的とは哺乳動物に投与されたとき医学的に有利な作
用を与えることができることを意味する。

カプリル酸及びカブリレートの濃度、ｐＨ，温度、時間
などの変数がウィルス感染力の減少、タンパク質回収率
及びタンパク質の生物学的活性保持にいかに影響を与え
うるかを示すために、本発明の開示の実施例を下記に示
す。

実施例１ エプスタイン−バールウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａ
ｒｒｖｉｒｕｓ）（Ｅ　Ｂ　Ｖ　）形質転換ヒトＢリン
パ球（Ａ、Ｔ。

Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ８７５２）により、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄ
。

ｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）モノクローナルＩ
ｇＭ抗体（ヒトＸＰｓＭＡｂ−１ｇＭ））を生産した。

この予め形質転換された細胞は、７つのフィッシャー−
デブリン血清型（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｄｅｖｌｉｎ　５ｅｒ
ｏｔｙｐｅ）の１つ、Ｆ−４に対して特異的な天然に存
在する抗体力価を持った供与者から得られた。この抗体
はそのバクテリアの表面リポ多糖上の血清を決定基に結
合する。Ｆ−４抗体のための細胞培養回収物を清澄にし
、部分的に精製しそして１ＮＮａＯＨによりｐＨ８に調
節した。室温（Ｒ，Ｔ、）で、０．３８ｍｇ／ｍ（ｌの
１ｇＭ溶液（総計１９ｍｇ）を最初にヘルペス・シンプ
レックス型Ｉ　（Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ　ｔｙ
ｐｅ　Ｉ　）（Ｈ３Ｖ−１）ウィルス及び小胞性口内炎
ウィルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ
　ｖｉｒｕｓ）（Ｖ　Ｓ　Ｖ　）と接触させた。然る後
２．０重量％のカプリル酸ナトリウムを加えそして溶液
をｐＨ８に再調節した。これはｐＨ８におけるヘンダー
ソン・ハッセルバルフの計算によりカプリル酸０．００
１４重量％及びイオン化形態のカブリレー）１．９９８
６重量％に相当する。ウィルススパイキング（ｖｉｒｕ
ｓ　ｓｐｉｋｉｎｇ）の後、溶液を６０分間保持した。

ウィルススパイキングされた予備処理試料は、この実施
例及び後の実施例の対照として使用した。

ＰｓＭＡｂ−１ｇＭ　　Ｆ−４タンパク質収率値は放射
免疫拡散（ＲＩＤ）アッセイによった。機能的活性は特
異的リボ多糖（ＬＰＳ）結合能力として決定された。そ
の後のＩｇＭＦ−４実施例の研究は、実質的に同様にＬ
ＰＳ結合能力を示した。

実施例１の結果を表Ｉに示す。

表Ｉ Ｒ，Ｔ、　　　０　　１９　　　１００　　　１００　
　　　５．２５　　　７．０６０　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｎ、Ｄ、　　　　Ｎ、Ｄ。

１２０　　１９．２　　１０１　　　　９８　　　　　
Ｎ、Ｄ、　　　　Ｎ、Ｄ。

Ｎ、Ｄ、　：検出できない（検出の下限＜１．５）実施
例２ ＰｓＭＡｂ　−Ｉ　ｇＭ（Ｆ　−４）を調製しそして、
ＶＳｖの他に、エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ
）を含めたことと、不活性化工程をより低い温度（５℃
）で行ったことを除いては、実施例１と同様にして処理
した。ウィルスでスパイキングした後、溶液を１２０分
間保持した。

実施例２の結果を表■に示す。

表■ ５℃　　　０　　　１９　　　１００　　　　　　７．
５　　　　７．９６０　　　−　　　　　　　　　　　
　５．７５　　　３．７１２０　　　１９．４　　１０
２　　　　　　５．ＯＮ、Ｔ。

Ｎ、Ｔ、　：試験しなかった 実施例３ 不活性化のための部分的に精製した１ｇＭ溶液が５℃で
ありそしてＩＮＨｃＩによりｐＨ４，８に調節したこと
を除いては、実施例１と同様にしてＰｓＭＡｂ−１ｇＭ
（Ｆ−４）を調製した。この試料を最初ウィルスと接触
させ、然る後０．１重量％カプリル酸を加えモして１Ｎ
ＮａＯＨによりｐＨ４。

８に再調節した。これはｐＨ４，８におけるヘンダーソ
ン・ハッセルパルフの計算によりカプリル酸０゜０５５
重量％及びイオン化形態のカブリレート０．０４５重量
％に相当する。ウィルススパイキングの後、溶液を４℃
で６０分間保持した。

実施例３の結果を表■に示す。

表■ ０　　　９．５　　１００　　　　　　６．７５　　　
７．５３０　　　　　　　　　　　　　　　　３．２５
　　　６．０６０　　　１０．３　　１０８　　　　　
　　Ｎ、Ｄ、　　　　５．５Ｎ、Ｄ、　：検出できない
（検出の下限＜１．５）実施例４ 緑膿菌外毒素Ａに対して天然に存在する抗体力価を持っ
た供与者から得られたＥＢＶ形質転換ヒトＢりンパ球（
Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ８８３３により、シュードモナ
ス外毒素Ａ抗体ＩｇＧ（ヒト）５℃ （ＭＡｂ　　ＥｘｏＡ　　ＩｇＧ）を生産した。ＭＡｂ
ＥｘｏＡ　　ＩｇＧの細胞培養回収物を清澄化させそし
て精製した。５℃でＭＡｂ　　ＥｘｏＡ　　ＩｇＧをｐ
）１６　。

５で０．５ｍｇ／ｍｆｆ（総計２５ｍｇ）に調節し、最
初にｖＳｖおよびＨＳＶ−１ウイルスと接触させた。然
る後２．０重量％のカプリル酸ナトリウムを加えそして
ＩＮＭＣＩによりｐＨ６，５に再調節した。これはｐＨ
６，５におけるヘンダーソン・ハッセルバル７の計算に
よりカプリル酸０．０４２重量％及びイオン化形態のカ
ブリレート１．９５８重量％に相当する。スパイキング
の後、溶液を３０分間保持した。

実施例４の結果を表■に示す。

表■ ５℃　　　０　　　　２５　　　１００　　　　７．５
　　　　７．０３０　　　　２６　　　１０４　　　　
　　Ｎ、Ｄ、　　　　　Ｎ、Ｄ。

Ｎ、Ｄ、　：検出できない（検出の下限＜１．５）実施
例５ 結果に示されているように、２つの濃度のカプリル酸ナ
トリウムを使用したことを除ｌ／＼では、実施例４と同
様にしてＭＡｂ　　ＥｘｏＡ　　ＩｇＧを調製した。ウ
ィルス不活性化効率の検討のための試料はｐＨ６，３で
ありモして５°Ｃで６０分間接触させた。ウィルス種に
はＶＳＶ、Ｈ５Ｖ−１，ワタシニアウイルス及びシンド
ビスウイルスカく包含される。

実施例５の結果を表Ｖに示す。

表Ｖ ＮＤ　　検出できない（検出の下限＜１．５）Ａ＊　試
料はカプリル酸ナトリウム１．０重量％を受は取りそし
てＩ　ＮＭＣＩでｐＨ６，３に再調節された。これはｐ
Ｈ６，３におけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計算
によりカプリル酸０゜０３３重量％及びイオン化形態の
カブリレート０゜９６７重量％に相当する。

Ｂ＊＊　試料はカプリル酸ナトリウム２．０重量％を受
は取りそしてＩＮＨｃＩでｐＨ６，３に再調節された。

これはｐＨ６，３におけるヘンダーソン・ハッセルバル
７の計算によりカプリル酸０゜０６５重量％及びイオン
化形態のカブリレート１゜９３５重量％に相当する。

実施例６ ２つの非脂質被覆ウィルスであるタシパルボウイルス（
Ｂｏｖｉｎ　Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）（Ｂ　Ｐ　Ｖ）及
びポリオ■をカプリル酸と反応させて、脂質被覆ウィル
スの不活性化と対照的に有効性のないことを証明した。

Ｐｓ　ＭｏＡｂ　Ｉ　ｇＭ（Ｆ　−４）を調製し、そし
て不活性化温度が５°ＣでありそしてウィルスがＢＰＶ
であることを除いては、実施例１と同様にして化学的に
処理した。ＩｇＧ試料を最初にＢＰＶウィルス及びポリ
オ■ウィルスと接触させ、然る後カプリル酸ナトリウム
を２．０重量％となるように加えそしてＩ　ＮＨＣｌで
ＰＨ６，３に再調節した。これはｐＨ６，３におけるヘ
ンダーソン・ハッセルバルフの計算によりカプリル酸０
．０６５重量％及びイオン化形態のカブリレート１．９
３５重量％に相当する。ウィルススパイキングの後、溶
液を１２０分間保持した。

実施例６の結果を表■に示す。

表■ ５℃　　　　０　　　　　　　２．７５３０　　　　　
　　　３．７５ ６０　　　　　　　３．０ ３．５　　　６．０ ３．２５ ３．２５　　　６．２５ ３．５　　　６．５ 実施例フ イー・ジェー・コーン（Ｅ、Ｊ、Ｃｏｈｎ）の冷エタノ
ール精製法の上澄液ＩＶ−４からヒト血清アルブミンを
単離した。このアルブミンをｐＨ６，０で０゜５　ｍ　
ｇ　／　ｍ　Ｑの濃度＜ｍ計２５ｍｇ）に調節した。４
℃でこのアルブミン溶液を小胞性口内炎ウィルス（ＶＳ
Ｖ）と接触させ、然る後カプリル酸ナトリウムを１．０
重量％となるように加え、ｌＮＨＣｌによりｐＨａ、ｏ
に再調節した。これはｐＨ６におけるへンダーソン・ハ
ッセルバルフの計算によりカプリル酸０．０６２重量％
及びイオン化形態のカブリレート０．９３８重量％に相
当する。ウィルススパイキングの後、溶液を６０分間保
持した。

実施例７の結果を表■に示す。

表■ ４℃　　　Ｏ２５１００６，７５ ６０２４，７５９９Ｎ、Ｄ。

Ｎ、Ｄ、　：検出できない（検出の下限＜１．５）実施
例８ 不安定な凝固因子■、■、■及びＸに富んだヒト血清タ
ンパク質を、イー・ジェー・コーンの冷エタノール精製
法の流出液Ｉからのアニオン交換吸着により調製した。

溶出した凝固因子を、更に精製しそしてｐＨ６，８で１
．７３ｍｇ／ｍ＜１のタンパク質濃度に調節した。カプ
リル酸ナトリウムを２．０重量％の濃度となるように加
え、ｌＮＭＣＩによりｐＨ６，８に再調節した。これは
ｐＨ６，８におけるヘンダーソン・ハッセルバルフの計
算によりカプリル酸０．０２２重量％及びイオン化形態
のカブリレート１．９７８重量％に相当する。４℃で２
時間のインキュページ扉ンの後、凝固タンパク質を、セ
ファデックスＧ−５０を使用してサイズ排除クロマトグ
ラフィーにより化学反応体から分離した。機能的凝固活
性に基づく収率の結果を表■に示す。

表■ ５°ＣＯ未処理　１．８２　０．１７　１．５９　２゜
０９１２０　　　処理　　１．８９　０．１９　１．６
０　２．１２％ 機能的収率　　　１０４　　１１２　　１０１　　１０
１実施例９ 凍結法でん物からのヒト因子■の精製中捨てられたタン
パク質画分から、フィブロネクチンに富んだタンパク質
を単離する。フィブロネクチンは、ｐＨ６，９で１．３
４ｍｇ／ｍ１２（全体で３３．５ｍ客）のタンパク質濃
度に調節した。カプリル酸ナトリウムを２．０重量％の
濃度となるように加え、ｌ　ＮＨＣｌによりｐＨ６，９
に再調節した。これはｐＨ６，９におけるヘンダーソン
ーハッセルバル７の計算によりカプリル酸０．０１４重
量％及びイオン化形態のカブリレート１．９８６重量％
に相当する。５℃で１時間のインキュページコンの後、
フィブロネクチンを、セファデックスＧ−５Ｏを使用し
てサイズ排除クロマトグラフィーにより化学反応体から
分離した。試料をカプリル酸処理の前後に酵素結合免疫
吸着剤アッセイ（Ｅｎｚｙｍａ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍ
ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）によりアッセイし
そして高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬ
Ｃ）により構造変化を分析した。実施例９の結果を表■
に示す。

表■ ５℃　　　　０　　　　　３３．５　　　１００６０　
　　　３２゜７　　　　９７．８実施例１Ｏ σ１金属結合グロブリンとしても知られているトランス
フェリンを、イー・ジエー・コーンの冷エタノール精製
法からの画分子Ｖ−１から単離した。

このトランスフェリンをｐＨ６，８で３．３５ｍｇ／ｍ
ｆｆ（総計１０５ｍｇ）に調節した。カプリル酸ナトリ
ウムを２．０重量％の濃度となるように加えそしてｌ　
ＮＨＣｌによりｐＨ６，８に調節した。

これはｐＨ６，８におけるヘンダーソン・ハッセルバル
フの計算によりカプリル酸０．０２２重量％及びイオン
化形態のカブリレート１．９７８重量％に相当する。５
℃で６０分間のインキュベーションの後、トランスフェ
リンをセファデックスＧ−５０を使用してサイズ排除ク
ロマトグラフィーにより化学反応体から分離した。試料
をカプリル酸処理の前後にＲＩＤによりアッセイして収
率を決定しそしてＦＰＬＣにより構造変化を分析した。

実験ｌＯの結果を表Ｘに示す。

表Ｘ ５℃　　　０　　　　　１０５　　１００　　　　　　
Ｎ、Ｄ、　　　Ｎ、０゜６０　　　　　１０８　　１０
３　　　　　　Ｎ、Ｄ、　　　Ｎ−Ｄ。

Ｎ、Ｄ、　：検出できない 実施例１１ 新鮮な凍結ヒト血漿の溶解したプールから遠心分離によ
り凍結法でん物を回収した。抗血友病因子（ＡＨＦ）と
しても知られている凝固因子■をこの凍結性でん物から
回収しそして精製した。精製したＡＨＦ溶液をｐＨ７，
２で１．７単位／ｍＱＣ総計４６．２ＡＨＦ単位）のＡ
ＨＦ濃度に調節した。

５℃でカプリル酸ナトリウムを２．０重量％の濃度とな
るように加えそしてＩＮＨｃＩによりｐＨ７。

２に調節したるこれはｐＨ７，２におけるヘンダーソン
・ハッセルバル７の計算によりカプリル酸０．００８７
重量％及びイオン化形態のカプリレート１．９９１３重
量％に相当する。５℃で２時間のインキュベーションの
後、ＡＨＦに富んだタンパク質をセファデックスＧ−５
０を使用してサイズ排除クロマトグラフィーにより化学
反応体から分離した。機能的因子■凝固活性に基づく収
率結果を表ＸＩに示す。

表■ ５℃　　　　　０　　　　　　４６．２　　　　　１０
０１２０　　　　　　２７．２　　　　　　５９実施例
１２ 画分■から精製されたヒト血漿由来の免疫グロブリンＭ
（ＩｇＭ−ｐｄ）を検討してウィルス破壊の際の低ｐＨ
（ｐＨ４，８）の役割を解明した。画分■ペーストラ、
コーン−オンクレイ冷エタノール分別法（Ｃｏｈｎ−Ｏ
ｎｃｌｅｙ　ｃｏｌｄ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｆｒａｃＬｉ
ｏｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）により正常なヒト血漿か
ら処置した。画分■ペーストを、ｐＨ４，０で０．０５
Ｍ酢酸ナトリウム中に２０℃で混合することにより懸濁
させた。不溶性タンパク質を遠心分離及び濾過により除
去した。ＩｇＭ−ｐｄに富んだ清澄化したｔ戸液ｐｄ４
．８に調節した。５℃でこのＩｇＭ−ｐｃｔ溶液をｖＳ
ｖと接触させた。組織培養（Ｔ、Ｃ，）培地試料を対照
としてｖＳｖと接触させた。ウィルススパイキングの後
、試料を８時間以下の間隔で感染力について試験した。

実施例１２の結果を表ＸＩに示す。

表ｘｎ ５°０　　　　０　　　　　　６．７５　　　　　８．
０２　　　　　　　６．７５　　　　　　　Ｎ、Ｔ。

６　　　　　　７．２５　　　　　　　Ｎ、Ｔ。

８　　　　　　＞６．５　　　　　　７゜５Ｎ、Ｔ、　
：試験しなかった 前述の開示及び実施例が与えられているが、当業者はそ
れを変更することができるであろう。従って、本明細書
に開示された本発明は特許請求の範囲により限定される
べきであることを意図する。

本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。

１、生物学的に活性な治療的タンパク質の溶液中の脂質
被包ウィルスを不活性化させる方法であって、 このタンパク質の量及び生物学的活性に不利な影響を与
えないでウィルスの感染力を実質的に減少させるのに十
分な条件下に前記溶液をカプリル酸と接触させる工程を
含む方法。

２、カプリル酸が、水中重量％基準で、約０゜０７％−
約０．００１％の範囲の量で非イオン化形態にある上記
１に記載の方法。

３、前記感染力を検出できないレベルにまで減少させる
上記１に記載の方法。

４、旭理されたタンパク質の生物学的活性の損失が、も
しあるとしても、元の活性の約３０％未満である上記１
に記載の方法。

５、カプリル酸濃度及び溶液ｐＨの条件が、添付図面の
斜線を施した領域により定められた条件である上記ｌに
記載の方法。

６、前記溶液がカプリレートイオンを含みそしてカプリ
レートイオン濃度及び溶液ｐＨの条件が、カプリル酸の
濃度を水中重量％基準で約０．０７％乃至０．００１％
の間に維持されるような条件である上記ｌに記載の方法
。

７、カプリル酸の濃度が、水中重量％基準で０゜０７％
乃至０．０１％の範囲にある上記ｌに記載の方法。

８、微生物がＨ５ｖｉｌ、ｖＳｖ、ワクシニア、シンド
ビス及びＥＢＶから選ばれた脂質被覆ウィルスである上
記ｌに記載の方法。

９、生物学的に活性なタンパク質が、抗体、ヒト血清ア
ルブミン、凝固因子、フィブロネクチン及びトランスフ
ェリンの内の１つ又は２つ以上である上記ｌに記載の方
法。

ｌＯ９凝固因子が、因子■、■、■、■及びＸかも選ば
れる上記９に記載の方法。

１１、抗体の水性溶液中の脂質被包ウィルスを不活性化
させる方法であって、 前記ウィルスの感染力を実質的に減少させるのに十分な
時間及びｐＨで、重量％基準で約０．０７％乃至約０．
００１％の範囲の濃度のカプリル酸と前記溶液を接触さ
せる工程を含む方法。

１２、前記抗体がＩｇＭ抗体であり、溶液のｐＨが約８
．０である上記１１に記載の方法。

１３、前記抗体がＩｇＧ抗体であり、ｐＨが約６゜３で
ある上記１１に記載の方法。

１４、生物学的に活性なヒトモノクローナル抗体の水性
溶液中の脂質被包ウィルスを不活性化させる方法であっ
て、 ウィルス力価を検出できないレベルに減少させるのに十
分な時間、重量％基準で約０．０７％乃至約０．００１
％の範囲の濃度のカプリル酸と前記ウィルスを接触させ
ることを含む方法。

１５、前記抗体が、緑膿菌バクテリウム（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）のリポ多糖分子上の血清型決定基に結合する抗体で
ある上記１４に記載の方法。

１６、前記バクテリウムが、フィッシャー−デブリン免
疫型ｌ乃至７の１つである上記１５に記載の方法。

１７、前記バクテリウムがフィッシャー免疫を４である
上記１６に記載の方法。

１８、前記抗体が、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素Ａに結合する抗体であ
る上記１４に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、所定の溶液のｐＨ及びウィルス不活性化時
間に対するカプリル酸の濃度の関係を示すグラフ図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的に活性な治療的タンパク質の溶液中の脂質
   被包ウィルスを不活性化させる方法であって、 このタンパク質の量及び生物学的活性に不利な影響を与
   えないでウィルスの感染力を実質的に減少させるのに十
   分な条件下に前記溶液をカプリル酸と接触させる工程を
   含む方法。 ２、抗体の水性溶液中の脂質被包ウィルスを不活性化さ
   せる方法であって、 前記ウィルスの感染力を実質的に減少させるのに十分な
   時間及びｐＨで、重量％基準で約０．０７％乃至約０．
   ００１％の範囲の濃度のカプリル酸と前記溶液を接触さ
   せる工程を含む方法。 ３、生物学的に活性なヒトモノクローナル抗体の水性溶
   液中の脂質被包ウィルスを不活性化させる方法であって
   、 ウイルス力価を検出できないレベルに減少させるのに十
   分な時間、重量％基準で約０．０７％乃至約０．００１
   ％の範囲の濃度のカプリル酸と前記ウィルスを接触させ
   ることを含む方法。