TWI442965B

TWI442965B - 使用低ｐＨ及二價陽離子分離生物巨分子的方法

Info

Publication number: TWI442965B
Application number: TW96141182A
Authority: TW
Inventors: Jonathan Romero; James Chrostowski; Vilmorin Philippe Georges De; Jennifer Yun Case
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 2006-11-01
Filing date: 2007-11-01
Publication date: 2014-07-01
Also published as: JP2010508352A; AU2007351548A1; WO2008127305A3; EP2078039A2; CN101534920A; WO2008127305A2; US9109015B2; CA2666607C; EP2078039A4; CN101534920B; CA2666607A1; AU2007351548B2; TW200835542A; JP5732196B2; US20100145022A1; EP2078039B1; NZ576262A

Description

使用低pH及二價陽離子分離生物巨分子的方法

本發明係關於分離組成物中生物性巨分子之方法。更明確地說，本發明係關於分離含有雜質之組成物中的生物巨分子之方法，該方法包括(a)降低組成物的pH，(b)於組成物中添加二價陽離子，以及(c)分離生物巨分子與雜質。

諸如重組生物巨分子之生物性巨分子(即，生物巨分子)在各種技術陣容中有其重要性。傳統上，已使用許多不同方法純化生物巨分子，此等方法係諸如例如過濾、離心作用、尺寸排阻層析術、親和層析術與上述之組合。純化方法通常係根據區分生物巨分子以及與彼共存於組成物中之一或更多種雜質的特徵而加以選擇。大量生物巨分子具有商業重要性，因此需要可以及時且具有成本效益之方式純化大量生物巨分子的能力。已進行徹底研究提高目前純化技術與純化生物巨分子之方法的效率。適用於小規模製備之純化技術經常不適用於工業規模純化作用。

具有商業重要性的生物巨分子包括例如蛋白質與核酸，例如DNA與RNA。經常以工業規模分離的兩種生物巨分子實例係單株抗體與融合蛋白。此等抗體與融合蛋白在各種診斷與治療領域中相當有價值，而且已用於治療各種疾病，諸如先天與後天免疫不全疾病以及傳染病。

製造經純化抗體的傳統途徑包括硫酸銨沉澱作用、使用辛酸然後離心處理、離子交換層析術(例如DEAE或羧磷灰石)、免疫親和純化作用(例如蛋白質A或蛋白質G)，以及透析。詳見例如Antibodies: A Laboratory Manual ，Harlow與Lane著，Cold Spring Harbor Laboratory (1988)。使用上述方法之組合相當常見，例如使用乙醇分離法，然後藉由離子交換層析術及/或辛酸(CA)沉澱作用自血漿純化抗體。詳見例如McKinney等人於J .Immunol .Methods 96:271-278 (1987)之文獻；美國專利第4,164,495號；第4,177,188號；RE 31,268；第4,939,176號；以及第5,164,487號。此外，已使用發醇作用改善抗體與重組蛋白的回收率及安定性。詳見例如Lydersen等人於Annals New York Academy of Sciences 745:222-31 (1994)之文獻。

已發展各種其他方法分離及/或純化抗體，包括應用酸沉澱作用。詳見美國專利第7,038,017號；7,064,191號；6,846,410號；5,429,746號；5,151,504號；5,110,913號；4,933,435號；4,841,024號；與4,801,687號。不過，許多此等方法會造成原料量大與回收損失及/或工業規模製造抗體的成本高。有限成果已開發調整收獲條件以改善細胞澄清強健性，尤其是當其與切線流動過濾有關時。

自含有哺乳動物或細菌細胞之工業規模生物反應器收獲抗體與重組蛋白通常係使用過濾或離心作用進行。不過，在此等技術實例中，核酸(例如DNA)、宿主細胞蛋白質(HCP)與生長培養基組份經常與重要生物巨分子不當分離。近來在細胞培養中製造更多蛋白的驅動力已迫使生物反應器以更高細胞密度操作，此舉提高諸如DNA、HCP與其他培養基組份之雜質。污染物水準提高致使對於細胞收獲操作(例如，過濾與離心作用步驟)以及下游純化步驟(例如層析術與透析步驟)二者的需求更強烈。增加此等高水準雜質可能使需要進行之純化步驟次數增多，因此降低整體生產產出。

由於上述困難與無效率之故，需要改善生物巨分子之分離策略。

本發明係關於分離含有雜質之組成物中的生物巨分子之方法，該方法包括(a)降低組成物的pH，(b)於組成物中添加二價陽離子，以及(c)分離生物巨分子與雜質。某些具體實例中，(a)之降低pH與(b)之添加二價陽離子係於(c)之分離作用之前發生。

生物巨分子之分離作用可藉由各種方法達成。某些具體實例中，(c)之分離作用係藉由過濾組成物進行，該過濾作用形成透過物流(permeate stream)與阻留物流(retentate stream)。某些使用過濾作用之具體實例中，生物巨分子實質上係於透過物流中，而某些具體實例中，過濾作用係藉由切線流動過濾器進行。其他具體實例中，(c)之分離作用係對組成物進行離心作用而進行，此離心作用形成上澄液與沉澱物。某些使用離心作用之具體實例中，生物巨分子實質上係於上澄液中。

本發明某些方面，(a)中組成物的pH下降至少一個pH單位。本發明某些方面，(a)中組成物之pH係調整至範圍約3.0至約6.5，約3.0至約5.0或約4.0至約4.7內之pH。

本發明某些方面，生物巨分子爲蛋白質。某些具體實例中，此蛋白質為可溶性蛋白質。某些具體實例中，此蛋白質為抗體。某些具體實例中，該組成物包含真核細胞材料。某些具體實例中，該雜質包含蛋白質、脂質、核酸、核醣核酸或其組合物。

各種二價陽離子可用於本發明。某些具體實例中，此二價陽離子係選自Ca²⁺ 、Mg²⁺ 、Cu²⁺ 、Co²⁺ 、Mn²⁺ 、Ni²⁺ 、Be²⁺ 、Sr²⁺ 、Ba²⁺ 、Ra²⁺ 、Zn²⁺ 、Cd²⁺ 、Ag²⁺ 、Pd²⁺ 、Rh²⁺ 與其組合物。某些具體實例中，此二價陽離子係選自Ca²⁺ 、Mg²⁺ 、Cu²⁺ 、Co²⁺ 、Mn²⁺ 或其組合物。某些具體實例中，該組成物包含約1mM至約100mM，或約2mM至約50mM之二價陽離子濃度。

本發明某些方面係有關於分離生物巨分子之方法，其中添加二價陽離子令生物巨分子的回收率提高3%以上。某些具體實例中，生物巨分子回收率提高10%以上。

本發明某些具體實例中，藉由過濾組成物進行分離作用，其中該過濾作用形成透膜壓力；而且其中此透膜壓力於過濾期間實質上保持固定。

本發明某些具體實例中，該組成物的pH降至pH 3.0至5.0；該二價陽離子係選自Ca²⁺ 、Mg²⁺ 、Cu²⁺ 、Co²⁺ 、Mn²⁺ 或其組合物；藉由過濾該組成物進行分離作用；該生物巨分子為抗體。

某些具體實例中，本發明係關於純化含有雜質之組成物中的生物巨分子之方法，該方法包括(a)降低組成物的pH，(b)於組成物中添加二價陽離子，以及(c)分離該組成物中之生物巨分子與雜質。某些具體實例中，本發明係關於澄清含有生物巨分子與雜質之組成物的方法，該方法包括(a)降低組成物的pH，(b)於組成物中添加二價陽離子，以及(c)分離該組成物中之生物巨分子與雜質。

本發明有關分離含有雜質之組成物中的生物巨分子之方法，該方法包括(a)降低組成物的pH，(b)於組成物中添加二價陽離子，以及(c)分離生物巨分子與雜質。本發明之發明人發現試圖分離(藉由過濾作用)工業規模數量抗體與含有初始高密度生物材料之細胞培養的生物反應器時，經過過濾器之透膜壓力降低明顯提高，推測此為高濃度細胞材料導致膜表面積垢之故。過濾器積垢增加轉而對回收之抗體數量造成負面影響，降低澄清產率，並造成透過物流中較高雜質水準。某些情況中，透膜壓力提高到超過過濾器的機械能力之值，因此造成操作於完成之前停止，並導致產物產率大幅降低。

爲了降低過濾器透膜壓力，提高透過物流中的蛋白質回收率，並降低透過物流中之雜質數量，本發明方法於過濾之前降低收獲進料的pH，致使大型細胞與細胞碎屑隨著其他雜質(諸如DNA)沉澱而凝塊。已發現雜質(細胞、細胞碎屑與DNA)凝塊成大型粒子可改善接近過濾器表面之組成物的質量傳遞，因此降低以預定透過物流流量或流速通過過濾器之透膜壓力。此外，降低收獲物流pH造成之雜質共沉澱導致此等雜質更能停留在過濾器上，因此降低透過物流中之雜質水準。

發現降低組成物之pH引發收獲進料中所欲抗體的沉澱作用，造成所欲抗體被該膜留下，並減少透過物流中所欲抗體的數量。本發明方法另外提出於過濾作用之前在pH經調整收獲進料中添加二價陽離子，選擇性地減低抗體的共沈澱，並增加透過物流中回收的抗體數量，同時不影響雜質數量。

本發明方法用於分離組成物中之生物巨分子與雜質。生物巨分子實例係例如抗體、重組蛋白、融合蛋白等，其於存在二價陽離子之低pH時具有相似溶解性質。

應暸解的是，除非內文清楚指明，否則「一」一辭實體係指一或更多種該實體；例如應暸解「一蛋白質」表示一或更多種蛋白質。如此，本文中「一」、一或更多種」或「至少一種」等辭可互換使用。

「分離」與「分離作用」等辭係指分離生物巨分子與該組成物中至少一種其他不要的組份或雜質。「分離」一辭包括「純化」與「澄清」。不需要特定水準生物巨分子分離作用，不過在某些具體實例中，至少50%、70%、80%、90%或95% (w/w)雜質與生物巨分子分離。例如，在某些具體實例中，生物巨分子的分離作用可包括分離該生物巨分子與80%原本存在組成物中之HCP。

「澄清」與「澄清作用」等辭係指自組成物去除大型粒子。例如，應用於細胞培養與生長培養基時，「澄清」一辭係指例如自該細胞培養去除原核與真核(例如哺乳動物)細胞、脂質及/或核酸(例如染色體與細胞質體DNA)。某些具體實例中，本發明方法包括(a)降低組成物的pH，使雜質在組成物內凝塊，(b)於組成物中添加二價陽離子，以及(c)分離組成物中之生物巨分子與雜質。不需要特定雜質凝塊水準，不過在某些具體實例中，至少50%、70%、80%、90%或95% (w/w)雜質凝塊。例如，某些具體實例中，生物巨分子的澄清作用可包括凝結存在組成物中80%哺乳動物細胞。可藉由本技術習知之方法測量凝塊，包括分光攝影，諸如濁度計。

「純化」與「純化作用」等辭係指分離本發明生物巨分子與該組成物中之雜質或其他污染物，不論雜質大小。如此，純化作用一辭包括「澄清」，但其另外包括尺寸小於澄清作用期間所去除的雜質，例如蛋白質、脂質、核酸與其他形式之細胞碎屑、病毒碎屑、污染性細菌碎屑、培養基組份等等。不需要生物巨分子之特定純化水準，不過在某些具體實例中，自生物巨分子純化至少50%、70%、80%、90%或95% (w/w)雜質。例如，在某些具體實例中，生物巨分子之純化作用包括分離生物巨分子與80%原本存在該組成物中之80% HCP。

本文所使用之「生物性巨分子」或「生物巨分子」等辭係指分子質量超過1 kDa之分子，其可自有機體或自細胞培養例如真核(例如哺乳動物)細胞培養或原核(例如細菌)細胞培養分離。某些具體實例中，該辭係指聚合物，例如生物聚合物，諸如核酸(諸如DNA、RNA)、多肽(諸如蛋白質)、醣與脂質。某些具體實例中，「生物巨分子」一辭係指蛋白質。某些具體實例中，「生物巨分子」係指重組蛋白或融合蛋白。某些具體實例中，該蛋白質具有可溶性。某些具體實例中，生物巨分子係抗體，例如單株抗體。

希望本文所使用之「蛋白質」包括單數種「蛋白質」以及複數種「蛋白質」。如此，如本文使用包括但不局限於「肽」、「多肽」、「胺基酸鏈」(或用以指一或更多個胺基酸鏈)等辭包括在「蛋白質」定義內，而且可以使用此等用辭任一者取代「蛋白質」一辭，或與之交換作用。該辭另外包括已經過後轉譯改質作用之蛋白，此等後轉譯改質作用係例如醣化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、以習知保護/阻隔基衍生、蛋白解裂或藉由非天然胺基酸改質。蛋白質亦包括來自例如二聚物、三聚物等多單體的多肽。蛋白質一辭亦包括融合蛋白，例如經由將蛋白質(或蛋白質片段)附接於抗體(或抗體片段)之基因融合方法產生的蛋白質。本發明之融合蛋白實例包括二硫鍵聯雙官能基蛋白質，其係由來自人類IgG1與人類IgE之鍵聯Fe區；以及淋巴毒素β受體免疫球蛋白G1。

可根據本發明方法純化抗體。「抗體」一辭係指多株、單株、多特異性、人類、人乳化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F (ab')2片段、由Fab表現庫所製之片段、抗遺傳(抗Id)抗體(包括例如對於本發明抗體之抗Id抗體)，以及上述任一者之抗原結合片段。某些具體實例中，「抗體」一辭係指單株抗體。「抗體」一辭亦指免疫球蛋白分子與免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有免疫特異結合抗原之抗原結合位置。可以本發明方法純化之免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA與IgY)以及組別(例如，IgG1、IgG2、IgG3與IgG4)或免疫球蛋白分子之亞組。本發明抗體亦包括嵌合、單鏈與人乳化抗體。本發明之抗體實例包括商業化抗體，諸如納他利馬(natalizmab)(人乳化抗-a4整合素單株抗體)、人乳化抗-α V β6單株抗體、人乳化抗-VLA1 IgG1 kappa單株抗體；huB3F6(人乳化IgG1/kappa單株抗體)。

以本發明方法純化之抗體可來自任何動物來源，包括鳥類與哺乳類。較佳情況係，以本發明方法純化之抗體係人類、鼠(例如小鼠與大鼠)、驢、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬或雞。本文所使用之「人類」抗體包括具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體，並包括與人類免疫球蛋白庫或與基因轉殖一或更多種人類免疫球蛋白(而且不表現為內原性免疫球蛋白)之動物分離的抗體。詳見例如Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號。某些具體實例中，該抗體包括但不局限於IgG1、IgG2、IgG3與IgG4抗體，包括商業化抗體，諸如納他利馬(natalizmab)(TYSBARI®, Elan Pahrmaceuticals, San Diego, CA)。

可以本發明方法純化之抗體包括例如原始抗體、完整單株抗體、多株抗體、自至少兩個完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段(例如，與一或更多種抗原結合及/或辨識一或更多種抗原之抗體片段)、人乳化抗體、人類抗體(Jakobovitset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993);Jakobovitset al., Nature 362:255-258 (1993);Bruggermannet al., Year in Immunol. 7:33 (1993)；美國專利第5,591,669號與5,545,807號)、自抗體噬菌體庫分離之抗體與抗體片段((McCaffertyet al., Nature 348:552-554 (1990);Clacksonet al .,Nature 352:624-628 (1991);Markset al., 1.Mol. Bioi. 222:581-597 (1991);Markset al., Bio/Technology 10:779-783 (1992);Waterhouseet aI., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993))。以本發明方法純化之抗體可重組融合於異源多肽之N-或C-末端，或與多肽或其他組成物化學接合(包括共價與非共價接合) 。例如，以本發明方法純化之抗體可重組融合或接合於作為檢測中之標記的分子與效應子分子，諸如異源多肽、藥物或毒素。詳見例如PCT公告WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624；美國專利第5,314,995號與EP 396,387。

某些具體實例中，本發明之生物巨分子或組成物為藥學可接受。「藥學可接受」係指在合理醫療判斷範圍內適於與人類及動物組織接觸，並無過量毒性或與合理利益/風險比相稱之其他症發性的生物巨分子與組成物。

某些具體實例中，生物巨分子係可溶性蛋白。「可溶性」一辭係指蛋白質實質上在細胞主體之親水或水為基底環境中局部化之習性，例如細胞質、胞外質或細胞外培養基。如此，於細胞份化期間，可溶性蛋白質通常實質與宿主細胞之細胞質、胞外質或細胞外成分分離。某些具體實例中，可溶性蛋白質於不存在洗滌劑下為水溶性。熟悉本技術之人士會認可多肽的細胞局部化或蛋白質的細胞份化均不絕對。因此，「實質上局部化」一辭意指蛋白質中有50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%蛋白質係在指定細胞位置，例如細胞質、胞外質或細胞外培養基。

本發明中之「組成物」一辭係指一或更多種本發明生物巨分子之分子與選擇性至少一種雜質的混合物，其中該雜質與生物巨分子並不相同。某些具體實例中，該組成物包含生物巨分子、細胞主體有機體(例如哺乳動物細胞)與足以繁殖宿主有機體並使重要生物巨分子表現之生長培養基。熟悉本技術之人士已習知生長培養基之選擇與使用。某些具體實例中，該生長培養基係細胞培養基。細胞培養基根據正在繁殖之細胞培養種類而改變。某些具體實例中，該組成物包含生長培養基，該生長培養基含有例如無機鹽、醣類(例如，糖，諸如葡萄糖、半乳糖、麥芽糖或果糖)、胺基酸、維生素(例如維生素B群(例如B12)、維生素A、維生素E、核黃素、焦磷酸噻胺與生物素)、脂肪酸以及脂質(例如膽固醇與類固醇)、蛋白與肽類(例如蛋白素、運鐵蛋白、纖維結合素與胎球蛋白)、血清(例如包含蛋白素、生長因子與生長抑制劑之組成物，諸如胎牛血清、初生牛犢血清以及馬血清)、微量元素(例如，鋅、銅、硒與三羧酸中間產物)以及其組合。生長培養基實例包括但不局限於基礎培養基(例如MEM、DMEM、GMEM)、複合培養基(RPMI 1640、Iscoves DMEM、Leibovitz L-15、Leibovitz L-15、TC 100)、無血清培養基(例如CHO、Ham F10與衍生物、Ham F12、DMEM/F12)。生長培養基中所發現昳見緩衝劑包括PBS、Hanks BSS、Earles鹽類、DPBS、HBSS、EBSS。本技術中已詳知培養哺乳動物細胞用之培養基，而且其可得自例如Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis、MO)、HyClone (Logan、UT) 、Invitrogen Corporation (Carlsbad、CA)、Cambrex Corporation (E. Rutherford、NJ)、JRH Biosciences (Lenexa、KS)、Irvine Scientific (Santa Ana、CA)及其他公司。生長培養基中所發現的其他組份包括抗壞血酸鹽、檸檬酸鹽、半胱胺酸/胱胺酸、麩醯胺、葉酸、麩胱甘肽、亞麻油酸、次亞麻油酸、硫辛酸、油酸、棕櫚酸、吡哆醛/吡哆醇、核黃素、硒、焦磷酸噻胺、運鐵蛋白。熟悉本技術之人士會認出在本發明範圍內之生長培養基的修改。

某些具體實例中，組成物另外包含收獲進料。「收獲進料」一辭係指於收獲前一刻存在細胞中之培養基，或於收獲之後立即放置經收獲細胞，並將該等細胞再次懸浮於其中的培養基。收獲進料可包括上述作為生長培養基所列之組成物任一者，或適於再次懸浮經收獲細胞或細胞部分之其他培養基。例如，某些具體實例中，收獲培養基可含有水、緩衝劑、滲透劑、抗降解劑等等。

「雜質」一辭係指該組成物之一或更多種與本發明生物巨分子不同的組份。某些具體實例中，雜質可包含完整哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)或鼠骨髓細胞(NSO細胞))，或部分細胞，例如細胞碎屑。某些具體實例中，雜質包含蛋白質(例如可溶性或不可溶性蛋白質，或蛋白質片段，諸如HCP)、脂質(例如細胞壁材料)、核酸(例如染色體或染色體外DNA)、核醣核酸(t-RNA或mRNA)、或其組合，或任何其他與重要生物巨分子不同之細胞碎屑。某些具體實例中，雜質可源自產生或含有該重要生物巨分子之宿主有機體。例如，雜質可為表現重要蛋白質之原核或真核細胞(例如，細胞壁、細胞蛋白質、DNA或RNA等)之細胞成分。某些具體實例中，雜質非來自該宿主有機體，例如，雜質可能來自細胞培養基或生長培養基、緩衝劑或培養基添加劑。本文所使用之雜質可包括單一不想要成分或數種不想要成分之組合物。

本發明生物巨分子可與包含生長培養基與各種真核細胞(例如哺乳動物細胞)分離。本發明之哺乳動物細胞(包括用於本發明方法之哺乳動物細胞)係可於培養中生長的任何哺乳動物細胞。範例哺乳動物細胞包括例如CHO細胞(包括CHO-K1、CHO DUKX-B11、CHO DG44)、VERO、BHK、HeLa、CVl(包括順式：順式-7)、MDCK、293、3T3、C127、骨髓細胞系統(尤其是鼠類)、PCI2、HEK-293細胞(包括HEK-293T與HEK-293E)、PER C6、Sp2/0、NSO以及W138細胞。亦可使用衍生自前述細胞任一者之哺乳動物細胞。

本發明之生物巨分子可自包含生長培養基與各種原核細胞，例如大腸桿菌、籽芽孢桿菌、鼠傷寒沙門桿菌以及在假單孢菌屬內之各種，例如綠膿桿菌、酵母細胞，例如酵母菌屬、畢赤酵母菌屬、漢遜氏[酵母]菌屬、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、劣殖酵母菌屬、許旺酵母屬(Schwanniomyces)與耶羅維亞酵母屬(Yarrowia)、昆蟲細胞，例如粉夜蛾屬、Lipidotera蛾屬、夜盜屬、果蠅屬與Sf9或植物細胞，例如阿拉伯芥。熟悉本技術之人士可視重要生物巨分子而選擇適當細胞系統。

本發明中，將組成物的pH調整至低於收獲進料之pH 。在未經調整下，本發明之組成物(例如，包含收獲進料者)的pH通常為約6.0至約8.0，約6.5至約7.5，或約6.8至約7.2。某些具體實例中，低於收獲進料pH的任何pH係用於本發明之分離作用。某些具體實例中，組成物pH降低到約1.0至約6.0，約2.0至約5.5，約3.0至約6.5，約3.0至約5.0，約4.0至約5.0，約4.0至約4.7，約4.3至約5.0，或約4.7至約5.0範圍內。某些具體實例中，組成物之pH降低到約4.0至約4.7範圍內。某些具體實例中，該pH可降低至約3.5。就某些生物巨分子來說，低於3.5之pH會造成重要生物巨分子變性或不穩定，因此是不希望發生的情況。雖然不受任何理論限制，但在某些具體實例中，降低收獲進料pH使組成物的一或更多種組份、主要細胞與細胞碎屑凝塊。某些具體實例中，將宿主細胞之DNA凝塊，如此可以更容易及/或更有效率分離重要生物巨分子。某些具體實例中，將宿主細胞蛋白質質凝塊，如此可以更容易及/或更有效率分離重要生物巨分子。某些使用過濾作用分離生物巨分子之具體實例中，聚集之大型粒子減少過濾器孔的積垢，如此使得過濾效率更高、透膜壓力較低，而且產出體積較大。某些具體實例中，本發明有關藉由降低pH分離生物巨分子之方法。

本發明組成物之pH可藉由各種方法調整。某些具體實例中，在該組成物中添加酸以降低pH。適用之酸類包括但不局限於強酸類，諸如過氯酸(HClO₄ )、氫碘酸(HI)、氫溴酸(HBr)、氫氯酸(HCl)、硝酸(HNO₃ )、硫酸(二質子酸)(H₂ SO₄ )，或弱酸類，諸如醋酸(CH₃ CoOH)(例如，冰醋酸)、檸檬酸(C₆ H₈ O₇ )、甲酸(HCoOH)、氫氰酸(HCN)、硫酸氫根離子(HSO₄ -)，或上述任何酸類的組合。某些具體實例中，可藉由使用緩衝劑調整組成物的pH，該等緩衝劑係諸如磷酸鹽緩衝劑(例如磷酸鈉與磷酸鉀)、重碳酸鹽緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑、硼酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑、胺基丁三醇緩衝劑、HEPES緩衝劑及其組合物。

雖然不受何任何理論，本發明某些具體實例中，降低pH有助於聚集大型雜質粒子，因而減少「積垢」，即過濾器之孔阻塞或填塞。過濾器積垢增加會對於透過物流中希望獲得之生物巨分子回收率造成負面影響，導致澄清作用產率低以及透過物流中雜質相對較高。某些情況下，過濾器的積垢提高透膜壓力。過濾器的積垢作用可能使透膜壓力值提高到超過過濾器的機械能力，因此導致過濾器操作在完成之前即停止，並造成產物回收率大幅降低。因此，某些具體實例中，本發明有關藉由降低組成物pH而分離較大數量或體積之組成物中生物巨分子。某些具體實例中，降低pH會提高所回收率生物巨分子的純度與品質。

某些具體實例中，降低組成物之pH導致重要生物巨分子與雜質共沉澱，造成細胞外培養基中的生物巨分子回收率降低。本發明人已發現在某些具體實例中，於pH經調整組成物中添加二價陽離子適於提高重要生物巨分子回收率。「回收率提高」一辭係指本發明方法與純化但不添加二價陽離子之相同方法加以比較。例如，若方法A係本發明方法(但不包括在收獲進料中添加二價陽離子)而且產生100mg重要生物巨分子，方法B係與方法A相同方法(但方法B包括於收獲進料添加二價陽離子)而且產生110mg生物巨分子，則可視為方法B的「回收率提高」10%。某些具體實例中，本發明方法的生物巨分子回收率提高大於3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%或25%。某些具體實例中，本發明方法回收率提高至最高達10%、15%、20%、25%、30%或50%。

本發明中，於組成物中添加二價陽離子。現存各種二價陽離子而且為熟悉本技術之人士習知，其包括例如鈣陽離子(Ca²⁺ )、鎂陽離子(Mg²⁺ )、銅陽離子(Cu²⁺ )、鈷陽離子(Co²⁺ )、錳陽離子(Mn²⁺ )、鎳陽離子(Ni²⁺ )、鈹陽離子(Be²⁺ )、鍶陽離子(Sr²⁺ )、鋇陽離子(Ba²⁺ )、鐳陽離子(Ra²⁺ )、鋅陽離子(Zn²⁺ )、鎘陽離子(Cd²⁺ )、銀陽離子(Ag²⁺ )、鈀陽離子(Pd²⁺ )、銠陽離子(Rh²⁺ )及其組合物。熟悉本技術之人士會明暸陽離子可以鹽形式存在，例如鈣鹽，諸如當置於水溶液中時，CaCl₂ 可產生鈣陽離子。如此，於此處使用時，「添加二價陽離子」一辭不只包括添加陽離子之帶電荷態，亦包括添加於導入本發明組成物時會產生二價陽離子之鹽或其他化合物。某些具體實例中，二價陽離子係Co²⁺ 或Ni²⁺ ，或是其鹽類(例如CoCl₂ 、NiCl₂ 、CaCl₂ 、MnCl₂ 、MgCl₂ 及CuCl₂ )，或此等陽離子或鹽類一或更多者之組合。可預期特定二價陽離子更適合不同生物巨分子。不過，熟悉本技術之人士很容易而且迅速測試許多二價陽離子以決定何者可達到重要生物巨分子之最大回收率。

組成物中二價陽離子之各種濃度適用於本發明。熟悉本技術之人士會明暸各種數量二價陽離子通常少量存在收獲進料(內原性二價陽離子)，而且可根據本發明於收獲進料中添加各種數量之二價陽離子(外來二價陽離子)。某些具體實例中，二價陽離子的濃度包括外來與內原性陽離子二者。不過，就特定目的而言，由於與外來二價陽離子數量相較之下，內原性二價陽離子數量相當少，故二價陽離子濃度可僅考慮外來二價陽離子而加以計算。某些具體實例中，組成物中的二價陽離子存在濃度係該組成物中的約0.01mM至約1M。某些具體實例中，二價陽離子之存在濃度係在該組成物中約0.1mM至約500mM，或約0.5mM至約200mM、約1.0mM至約100mM、約2mM至約50mM、約5mM至約15mM，或約2mM至約20mM。某些具體實例中，二價陽離子之存在濃度約為該組成物中的10mM。雖然不受任何方法限制，但二價陽離子之適當濃度可由實施例14相似之方法測量，該方法當中，將各種濃度二價陽離子添加於包含生物巨分子之pH經調整組成物中，然後測量可回收到生物巨分子最大數量時之最低濃度。熟悉本技術之人士將會暸解針對各種生物巨分子需要不同濃度陽離子。

可各種各種方法分離本發明之生物巨分子與一或更多種雜質。分離生物巨分子與雜質之方法實例包括但不局限於沉澱、免疫沉澱、層析、過濾、離心以及其組合。某些具體實例中，可使用過濾器達成生物巨分子與雜質之分離作用。「過濾作用」或「過濾」一辭係指令組成物通過一或更多個特定孔大小直徑之半滲透膜(或介質)而自該組成物去除懸浮粒子之方法。當用於過濾作用時，「透過物流」一辭係指於過濾期間通過過濾器孔之組成物部分。當使用過濾作用時，「阻留物流」一辭係指過濾期間殘留在過濾器上或未通過過濾器孔之組成物部分。某些具體實例中，於過濾作用之後，本發明生物巨分子實質上係在透過物流中(即，其通過過濾器孔而且將之收集起來)，而雜質(例如細胞碎屑、DNA及/或HCP)實質上在阻留物流中。某些具體實例中，於過濾作用之後，本發明之生物巨分子實質上在阻留物流中，而雜質實質上在滲透物流中。某些具體實例中，「實驗室規模」過濾作用可用以預測工業規模過濾作用之適當條件。

熟悉本技術之人士已知純化特定生物巨分子用之適用過濾器類型、化學性質與模組構造，而且可根據各種因素加以選擇，此等因素係例如待過濾組成物之組份數量與大小、待過濾組成物之體積，以及待過濾組成物之細胞密度與活力。某些具體實例中，可使用諸如膜過濾器、板式過濾器、濾筒、袋式過濾器、加壓葉過濾器、旋轉桶過濾器或真空過濾器。某些具體實例中，使用深度過濾器或橫式過濾器。應用於本發明之交叉流過濾器模組種類包括中空纖維、管式、平板(板框)、螺旋纏繞或渦流(例如旋轉)過濾器幾何形狀。某些具體實例中，使用切線流動過濾器。某些具體實例中，中空纖維、管式與平板膜模組係以切線流動(交叉流)模式作用。可使用之市售過濾器係由不同供應商所製，諸如Millipore Corporation (Billerica, MA)、Pall Corporation (East Hills, NY)、GE Healthcare Sciences (Piscataway, NJ)與Sartorius Corporation (Goettingen, Germany)。

本發明過濾器中之孔直徑可根據分離之生物巨分子種類與存在組成物中之雜質種類而改變。某些具體實例中，過濾器孔直徑可爲直徑0.1μm至1.0μm、0.2μm至0.8μm，或0.2μm至0.65μm。

於過濾期間組成物(諸如收獲進料)經過過濾器的移動產生由膜阻力形成的透膜壓力。當膜表面累積(或極化)細胞材料時，以固定流速流過該膜的阻力增大，因此導致驅動力或透膜壓力提高。若接近該膜表面的細胞材料數量減少，或者若該膜極化程度較小，透膜壓力較可能維持實質固定。熟悉本技術之人士已知計算透膜電位的方法，其包括使用壓力轉換器或轉換計。本發明某些具體實例中，可藉由進料與阻留物流出口壓力之平均值以及透過物流壓力之間的差值計算透膜壓力。圖8顯示示意透膜壓力計算方法。

通常，於過濾pH未經調整組成物(例如收獲進料)期間，由於較多組成物載於過濾器上，故過濾器透膜壓力大幅提高。例如，某些具體實例中，自過濾處理開始(將第一數量之組成物置入過濾器時)至因為過濾器孔被阻塞而使過濾處理結束(通常緊接著進行7-10細胞材料離心處理與3-5滲濾作用)，透膜壓力提高5 psi、7 psi、10 psi、15 psi或20 psi或者更多。例如，如圖12(進料組成物A)與圖13(進料組成物A)可看出，於過濾pH未經調整之收獲進料溶液期間，自將收獲進料載入過濾器開始，透膜壓力提高低於約1 psi，將60升/m2收獲進料載於過濾器上之後，透膜壓力提高大於約10 psi(透膜壓力提高1000%)。如此，指稱透膜壓力之「實質固定」一辭意謂著過濾期間透膜壓力不會提高大於4 psi、3 psi或2 psi。實質固定透膜壓力範例係圖12中之收獲進料B至G以及圖13中之進料組成物B至F。此等組成物各者開始時以及過濾期間之透膜壓力約低於1 psi，過濾此等組成物之過濾器上的透膜壓力並未超過2 psi。因此，圖12中過濾組成物B至G之過濾器與圖13中過濾組成物B至F之過濾器上透膜壓力被視為實質固定。某些具體實例中，本發明有關純化組成物中之生物巨分子的方法，該方法包括(a)降低組成物的pH，(b)於組成物中添加二價陽離子，然後(c)經由膜過濾組成物，該過濾作用形成透膜壓力，其中透膜壓力於過濾期間實質上維持固定。

某些具體實例中，本發明方法減少蛋白質過濾器排斥。可以等式R=(1[C_p /C_R ])例證「蛋白質過濾器排斥」一辭，其中R表示蛋白質過濾器排斥係數，C_p 係重要生物巨分子之即時透過物濃度，C_R 係重要生物巨分子的即時阻留物濃度。某些具體實例中，本發明有關分離組成物中生物巨分子之方法，其包括降低組成物之pH、於組成物中添加二價陽離子，以及過濾生物巨分子，其中在給定體積產出之下，相對於未調整pH及/或未添加二價陽離子之組成物中的生物巨分子，其蛋白質過濾器排斥值較低。詳見圖18。

當分離生物巨分子時，某些具體實例中例如在商業製造處理期間可存在大量組成物(例如收獲進料)。大量對於純化處理存在著若干挑戰。例如，使用大量時，會放大通過過濾器之流速對於分離生物巨分子回收率的少許改變。同樣地，使用大量時，亦會放大提高收獲進料中細胞密度對於產物回收率的影響。如此，使用大量組成物顯示出獨特問題被放大而且分歧比使用較小量時更大。因此，在某些具體實例中，本發明有關分離存在大量組成物中之生物巨分子的方法。「大量」一辭係指與商業及/或工業製造生物巨分子相關之份量。某些具體實例中，「大量」一辭係指10至2000升、20至1000升或50至500升。

某些具體實例中，較有利或希望的是自高密度細胞密度組成物(例如收獲進料)收獲生物巨分子。相對於一般細胞密度組成物，高細胞密度組成物顯示出獨特問題。例如，高細胞密度組成物中存在的雜質數量可能更多，因而增加純化處理期間必須去除之雜質數量。如此，較高細胞密度組成物會更迅速令過濾器積垢，因而抑制組成物之過濾作用。某些具體實例中，高細胞密度組成物需要使用更多過濾器或是具有較大表面積之過濾器。此二需求均會導致過濾作用相關之成本提高及/或產物流失。本發明中，降低組成物之pH，如此去除某些雜質，容許純化較高細胞密度組成物。因此，本發明中某些具體實例有關分離存在高細胞密度組成物中之生物巨分子的方法。「高細胞密度」一辭通常係指收獲進料中每ml哺乳動物細胞中之細胞密度係約1×10⁵ 至3.5×10⁷ ，約1.0×10⁶ 至約1.0×10⁷ ，或約5.0×10⁶ 至約9.0×10⁶ 個細胞。當然，熟悉本技術之人士會認可慣用以不同細胞密度生長之各種細胞。因此，在某些具體實例中「高細胞密度」細胞培養係指所含之細胞密度高於該細胞系統慣常使用密度之細胞培養。

本發明某些具體實例中，本發明方法有關提高過濾處理強健性之方法，該方法包括(a)降低組成物pH; (b)於組成物中添加二價陽離子；以及(c)經由膜過濾組成物。「提高強健性」係指對於既定過濾器使用較廣流速範圍同時不提高透膜壓力、雜質濃度或產物流失率之能力。「提高強健性」一辭亦指以既定過濾器過濾較大量或較高細胞密度收獲進料同時不提高透膜壓力、雜質濃度或產物流失率之能力。

本發明某些具體實例中，該方法係描述成在過濾之前澄清包含生物巨分子之組成物(例如收獲進料)的方法，該方法包括(a)降低組成物pH; (b)於組成物中添加二價陽離子；以及(c)分離生物巨分子與組成物中之雜質。某些具體實例中，澄清組成物與降低濁度有關，濁度係以濁度計測得，諸如Hach 2100AN濁度計(Hach Co., Loveland, Co)。

某些具體實例中，本發明方法包括藉由對組成物施加離心力(即，離心作用)分離生物巨分子與雜質，其中離心作用形成上澄液與沈澱物。某些具體實例中，離心作用形成實質上雜質(細胞或細胞碎屑)之上澄液與濃縮細胞/細胞碎屑沈澱物。使用離心作用時，「沈澱物」一辭係指於離心作用期間沈澱而形成細胞/細胞碎屑團塊的組成物部分。「上澄液」一辭係指離心作用期間未沈澱(或成粒)之組成物部分，例如該組成物中仍維持水相而且實質無細胞之組成物部分。某些具體實例中，於離心作用之後本發明生物巨分子實質上係於上澄液中(即，其仍實質上懸浮於組成物之液態部分)。某些具體實例中，於離心作用之後，本發明之生物巨分子實質上係在沈澱物中(例如，自溶液沈澱出，或是存在離心作用形成之丸粒中)。某些具體實例中，密度梯度係用以分離生物巨分子與雜質。如此，在某些具體實例中，於離心作用之後生物巨分子與雜質二者均留在上澄液中，但密度不同，因此位於離心設備的不同位置。

可使用各種離心設備。某些具體實例中，可藉由圓盤組離心作用達成此離心作用。某些具體實例中，「實驗室規模」過濾作用可用以預測工業規模過濾作用之適當條件。可改變離心作用變數以達到重要生物巨分子之最佳分離作用。例如，某些具體實例中，可使用各種旋轉速度或流速以提高生物巨分子回收率及/或生物巨分子回收之數量。

可以各種順序排定本發明方法步驟。例如，本發明某些具體實例中，於分離生物巨分子與雜質之前降低pH與添加二價陽離子。某些具體實例中，先調整收獲培養基之pH，添加二價陽離子，然後分離生物巨分子與雜質。其他具體實例中，先添加二價陽離子、調整組成物之pH，然後分離生物巨分子。某些具體實例中，可在(a)降低pH)、(b)添加二價陽離子或(c)分離生物巨分子與雜質之間進行一或更多個純化製程。或者，本發明方法步驟(a)、(b)或(c)接連進行，例如於步驟(a)、(b)與(c)之間不發生額外純化製程。不過，當步驟(a)、(b)與(c)接連進行時，可於步驟(a)、(b)與(c)之前或之後進行額外純化製程。

本發明某些具體實例係有關用於分離包含生物巨分子與雜質之生物巨分子期間改善澄清作用之操作強健性的方法，該方法包括(a)降低組成物pH; (b)使雜質凝塊，(c)於組成物中添加二價陽離子；以及(d)分離生物巨分子與組成物中之雜質。「操作強健性」係指就既定分離設備(例如過濾器大小)而言，處理較廣各種細胞負載之分離操作(例如過濾處理)的能力。某些具體實例中，降低pH逆轉因雜質(例如細胞碎屑等)造成之過濾器膜積垢，如此使得過濾作用可在較高體積負載之下以較高產出體積操作。

實施例

茲以特定實例方式更詳細描述本發明。提出下列實例作為例證，而且不希望其以任何方式限制本發明。熟悉本技術之人士很容易認知可改變或修改許多非臨界參數以產生根據本發明之其他具體實例。

實施例1

藉由比較各種pH水準下經培養細胞粒子大小分布，研究pH對於細胞凝塊之影響。自兩個生物反應器收獲細胞培養流體，然後分成三個不同組別，一組控制組與兩組實驗組。使用25%醋酸將實驗組調整至大約pH 4.5或5.75。未調整之控制組約為pH 7.1。然後使用Beckman Coulter, Multisizer III (Fullerton, CA)分析各組別之樣本，並測定平均直徑。結果示於圖1。

實驗結果顯示pH低於5.75時，直徑小於2.5μm之粒子明顯減少，而且2.5至6.0μm之粒子總數增加。

實施例2

藉由在各種pH水準下以Trypan藍染色細胞並以CEDEX細胞分析儀(Flonamics, Madison WI)分析該等細胞，研究pH改變對於細胞凝塊之影響。如實施例1所述，自兩個生物反應器收獲細胞培養流體，然後分成三個不同組別，一組控制組與兩組實驗組。使用25%醋酸將實驗組調整至大約pH 4.5或5.75。未調整之控制組約為pH 7.1。然後添加TB染色液，並使用放大影像分析。結果示於圖2。

TB染料藉由滲透通過以及染色細胞內蛋白而染色死亡細胞。於pH 4.50下之細胞的數據顯示與pH 7.00及5.75相較，每單位面積有更多經染色微粒子。此暗示不到TB染色之死亡細胞，亦有相似大小的蛋白聚集體被染色。此觀察進一步支持蛋白質之沈澱與凝塊係於較低pH下發生之假設。

實施例3

測量pH改變對於上澄液渾濁度之影響。將細胞培養分成許多等份，然後調整成pH 4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、6.0或未調整(pH 7.1)。然後進行沈降速度實驗，並測量形成之上澄液的渾濁度。結果示於圖3。

實驗結果表示上層清液渾濁度隨著pH水準提高而增加。此意謂著在較低pH範圍下，細胞凝塊而且於沈降速度實驗期間被去除。

實施例4

藉由重組中國倉鼠卵巢(CHO)或鼠(NSO)細胞發酵作用產生IgG1與IgG4組單株抗體。在培養製備當中，經由各種振動燒瓶與生物反應器大小將主細胞庫細胞解凍並使之膨脹。該培養製備與製造生物反應器培養基係使用無動物組份製得。所有提出之生物反應器中的溫度、pH與溶解氧水準均受到控制。

實施例5

實施例4之收獲進料係(a)pH未經調整，或(b)調整至pH 4.7。然後令經調整(或未經調整)之收獲進料通過以固定再循環與透過物流速之切線流動過濾模式之微過濾器。計算pH經調整收獲進料與pH未經調整收獲進料二者於過濾處理期間之透膜壓力(見圖11)。圖12與圖13中分別提出IgG1組抗體與IgG4組抗體之透膜壓力測量結果。圖式說明當該收獲進料係用於過濾器時，將收獲進料的pH降至4.7至5.3會形成低而且較固定透膜壓力，然而pH未經調整之收獲進料應用於過濾器時則會導致透膜壓力驟然提高。

雖然不受特定理論限制，但證據暗指降低pH造成細胞材料凝塊增加，形成較大粒子，其較不會干擾微過濾器上之孔。以交叉流模式進行澄清作用，其中將收獲進料導入含微孔膜之微過濾模組，留下之細胞與細胞碎屑係保留並再循環回進料容器，同時無細胞透過物係通過過濾器膜，並加以收集(見圖10示意說明)。以固定流速自該系統取出透過物，並收集在容器中。藉由微過濾作用將希望之蛋白與含高密度生物材料之細胞培養的生物反應器分離之作用係因高濃度細胞材料造成膜過濾器表面積垢而導致通過該微過濾器的透膜壓力降低程度提高。為了減少過濾器透膜壓力降低以增加微過濾操作的強健性以及提高滲透液中之蛋白回收率，於微過濾作用之前將收獲進料之pH降低至4.0-5.0。降低pH致使大型細胞與細胞碎屑隨著雜質(諸如DNA)沈澱而凝塊。雜質(細胞、細胞碎屑與DNA)凝塊成大型粒子改善過濾器表面附近之組成物的質量傳遞，因此降低以預定透過物流量或流速通過過濾器之壓力降低驅動力(見圖3與4)。

實施例6

研究降低pH水準對於宿主細胞蛋白質與DNA之影響。圖5說明pH水準較低會提高自溶液去除宿主細胞蛋白質與DNA之去除率。將細胞培養分成不同等份，然後調整各等份樣本之pH。然後離心處理樣本，並測量宿主細胞蛋白質或DNA之數量。資料顯示在低於5.0之pH情況下，宿主細胞蛋白質減少50%以上，然而在低於5.0之pH情況下，DNA減少90%以上。此等雜質可能沈澱出溶液，並被離心作用去除。

實施例7

研究降低pH對於兩種單株抗體之品質與回收率的影響。圖6顯示低於pH 6.0時此二單株抗體之蛋白回收率減少5%至10%，且低於4.5時抗體A大幅減少。蛋白回收率之戲劇性降低係聚集體水準提高與酸性變體所造成，此處係以單體及主要異構重組水準降低顯示，其表示於低pH時之分子不穩定性。在所觀察pH範圍內，抗體B未觀察到明顯降解。

實施例8

研究降低pH對於中空纖維微過濾作用(MF)效率的影響。圖7顯示微過濾收獲產物品質與雜質與圖5結果一致，在pH低於5.0情況下，宿主細胞蛋白質與DNA分別減少50%與90%。因過濾處理與微過濾單位操作有關之故，經澄清化之渾濁度水準低於圖3初始實驗。結果仍然顯示調整至較低pH水準時細胞培養之渾濁度降低2倍以上。

實驗室規模之MF產率結果示於圖8。結果說明pH 4.5以下之產率流失如初始調整實驗期間所見。另外，於pH 5.5或更高時，觀察到因MF處理期間之膜積垢所致的實質流失。在較低pH水準之細胞培養調整所提供之凝塊效果降低此種阻塞。

實施例9

研究降低pH對於收獲單株抗體的效果。抗體B離心作用結果亦與圖3及圖5之澄清作用結果一致。因調整與離心單位操作形成之添加產物流失之故，實驗室規模離心運作的整體產出數低於初始澄清實驗。又，因實驗室與試驗規模離心作用之間的剪切差異之故，渾濁度水準高於澄清實驗。不過，此二處理產出依澄清實驗期間所見之相同趨勢。離心數據點的變化性提高係改變離心操作條件所致。

實施例10

測量降低pH水準對於實施例4之收獲進料渾濁度的影響。含有MgCl₂ 、CaCl₂ 或NaCl之收獲進料pH係(1)未經調整(pH 6.9-7.2)，(2)調整至pH 6.0、(3)調整至pH 5.0，(4)調整至pH 5.0，(5)調整至pH 4.5，或(6)調整至pH 4.0。使用25% v/v醋酸將收獲進料等份之pH調整至指定pH，令多數細胞凝塊並沈降約2至24小時，並使用濁度計測量澄清上澄液之渾濁度(澄清度)，如此產生資料。上澄液渾濁度大致隨著經調整收獲進料之pH降低而降低，此表示在較低pH值的上澄液較澄清(見圖4)。此種渾濁度降低係在較低pH水準所發生之細胞凝塊程度較高，導致細胞塊更迅速沈降的結果。凝塊與經改良沈降提供更有效率微過濾操作性能(見圖12或圖13)。

實施例11

藉由如實施例4所述收集收獲進料，然後(a)不調整收獲進料之pH，或(b)將收獲進料之pH降至4.7，測量pH調整對於來自收獲進料之DNA污染物回收率的影響。然後令經調整與未經調整收獲進料二者沈降24小時。取得較細胞碎屑上澄液之樣本並針對DNA做試驗。藉由定量聚合酶連鎖反應(QPCR)測定殘留在無細胞收獲中之DNA數量。圖15說明相較於pH未經調整之收獲進料，調整至pH 4.7之收獲進料中的DNA污染物降低約1.5至3個對數。

實施例12

藉由如上述實施例4所述般收集收獲，測定pH調整對於單株抗體(IgG4)與融合蛋白回收率之影響。然後將收獲進料調整至pH 7.0、5.0或4.0，並使之沈降2-24小時。取得較澄清上澄液，並針對蛋白凝集物做試驗。然後藉由蛋白G凝集物鑑定測量存在無細胞收獲進料中之抗體或融合蛋白數量。圖14顯示pH改變對於經調整收獲物流中之產物蛋白凝集物的影響。所顯示資料係IgG4組抗體與融合蛋白之資料。兩種類型蛋白的資料說明當pH自7.0降至4.0時蛋白明顯減少。因pH引發之沈澱作用所致的蛋白數量減少範圍自3%至52%。組成物之蛋白濃度測量方法係以蛋白G偶合HPLC樹脂上之抗體或融合蛋白親和捕獲為基礎。

實施例13

藉由在收獲進料中添加10mM各種二價陽離子，然後將收獲進料之pH降至5.0，研究於pH經調整收獲進料中添加二價陽離子對於蛋白的影響。令形成之收獲進料沈降 2-24小時。取得澄清上澄液，並針對蛋白凝集物進行試驗。比較該凝集物與控制組實驗(無二價陽離子之pH 5.0經調整收獲)。藉由蛋白G凝集物鑑定測量存在無細胞收獲進料中之抗體或融合蛋白數量。圖16說明無任何額外離子的控制組相比，添加二價陽離子通常減少可溶性抗體流失。y軸表示標準化凝集物，其係以(經陽離子處理之經過濾收獲進料中的凝集物)除以(未經陽離子處理之經過濾收獲進料中的凝集物)表示。

實施例14

研究添加於pH經調整收獲進料之二價陽離子各種濃度的影響。更明確地說，將CoCl₂ (或Co²⁺ )添加至於pH經調整收獲進料中之最終濃度為1mM、2mM、5mM、10mM或20mM。然後使用蛋白G鑑定自pH經調整收獲進料回收之產物數量，測定各種CoCl₂ 濃度對於產物回收率的影響。圖17說明約10mM之CoCl₂ 即足以令pH調整後之產物流失最小化(或產生產出回收率最大化)。

實施例15

研究本發明方法對於蛋白質過濾器排斥的影響，其係作為遍及各濃度與滲濾相之通過微孔膜處理的累積體積函數。藉由測量各種時間間隔之阻留物與透過物凝集物，並以等式R=(1-[C_p /C_R ])計算蛋白質過濾器排斥係數，測量該蛋白質過濾器排斥係數。所顯示資料係四個獨立MF 實驗：以空心與實心三角形表示已調整之pH 5.0收獲物流(包括添加10mM CoCl₂ )進行之回合；空心與實心圓圈表示不存在CoCl₂ 之未經調整收獲物流的回合。資料顯示，就所有研究之負載比而言，含10mM CoCl₂ 之pH經調整收獲進料的微過濾逗留係數較低。例如，於60-70L/m2之代表性大規模負載比下，與pH未經調整之接近完全排斥(90-100%)之回合相較，求得之排斥係數～30%。圖6中亦顯示來自每個微過濾回合的整體蛋白質回收率。與使用未經調整收獲進料的回合之20%產率損失相較，含有Co²⁺ 二價陽離子的回合顯示所欲之蛋白質完全回收。

研究本發明方法對蛋白質過濾器排斥的影響，其係作為遍及各濃度與滲濾相之通過微孔膜處理的累積體積函數。藉由測量各種時間間隔之阻留物與透過物凝集物，並以等式R=(1-[C_p /C_R ])計算蛋白質過濾器排斥係數，測量該蛋白質過濾器排斥係數。圖18所示之數據係來自四個獨立微過濾實驗：在C與D中，於pH調整期間在收獲物流中添加10mM CoCl₂ ；於A與B中，不添加CoCl₂ 。將所有收獲進料降至pH 5.0。圖18顯示就所有研究之負載比而言，含10mM CoCl₂ 之pH經調整收獲進料的微過濾逗留係數較低。例如，於60-70L/m² 之代表性大規模負載比下，與接近完全排斥(90-100%)之A與B回合相較，C與D微過濾回合的排斥係數～30%。圖18中亦顯示來自每個微過濾回合的整體蛋白回收率。含有Co²⁺ 二價陽離子的回合(C與D)顯示所欲之蛋白接近完全回收，然而未添加Co²⁺ 之回合則形成20%產率損失。

本發明不受所述特定具體實例範圍限制，希望此等具體實例單純作為本發明個別方面之實例，而且功能相等之任何組成物或方法係在本發明範圍內。實際上，除了本文所示並說明之實例外，熟悉本技術之人士由前述說明與附圖將會暸解本發明各種修改。希望此等修改在附錄申請專利範圍範圍內。

本說明書中提及之所有公告與專利申請案係以如特別且個別顯示待引用參考之個別公告或專利申請案之相同範圍併入本文中。

圖1顯示於pH 4.5、5.75與7.1(未調整)之單株抗體(Mab)細胞培養的粒子大小分布分析。表示於pH 4.5時，直徑小於2.5μm的粒子比例降低，自2.5至6.0μm之粒子總數提高。

圖2表示於pH 4.5(圖2c)、5.75(圖2b)與7.1(圖2a)，以Trypan藍染色細胞之放大影像。此實驗影像表示在較低pH水準下染色作用增加。

圖3顯示細胞培養中之上澄液渾濁度作為pH降低之函數。通常，在較低pH水準下因細胞與粒子凝塊而使渾濁度降低。

圖4表示調整收獲進料之pH對於上澄液渾濁度的影響。y軸表示調整收獲物pH並令凝塊細胞與細胞碎屑沉降之後的上澄液渾濁度。x軸表示收獲材料的各種pH調整值。特別是，該數據係藉由使用25% v/v醋酸或檸檬酸將收獲進料整分調整pH至指定pH，並令細胞塊發生沉降，測量澄清上澄液之渾濁度(澄清度)而產生。圖4中之數據係由含有不同重組蛋白(包括抗體與融合蛋白)之各種收獲物流而產生的。該圖顯示當經調整收獲材料的pH下降時，上澄液渾濁度大致降低，表示於較低pH時上澄液較澄清。此係在較低pH發生之更高程度細胞凝塊導致細胞塊更迅速沉降的結果。此種凝塊與經改善沉降提供接近膜表面之經改善質量傳遞，因此更有效率微過濾操作性能(詳見圖12與圖13)。

圖5表示各種pH水準對於自兩個獨立細胞培養去除宿主細胞蛋白質質(圖5a)與DNA(圖5b)的影響，此細胞培養產生抗體A與B。x軸表示該細胞培養的各種pH調整值。y軸表示殘留在樣本中之宿主細胞蛋白質質或DNA的%。

圖6表示各種pH水準對於兩種不同單株抗體A(圖6a)與B(圖6b)之產物品質與回收率的影響。x軸表示細胞培養之各種pH調整值。就MabA圖(圖6a)而言，方塊表示蛋白質回收率，圓圈表示SEC單體，三角形表示IRC主要異構重組物。就Mab B圖(圖6b)而言，菱形表示蛋白質回收率，X表示SEC單體，圓圈表示IEC主要異構重組物。

圖7表示各種pH水準對於微過濾作用的影響。x軸表示表示細胞培養的各種pH調整值。X表示宿主細胞蛋白質質的濃度百分比，星號表示DNA之濃度，黑色三角形表示渾濁度，淺色三角形表示SEC單體，星號表示IEC異構重組物。

圖8表示各種pH水準對於微過濾後之單株抗體A產率的影響。於pH水準大於5.5的測量因該膜積垢而失效。

圖9表示各種pH水準對於離心作用後分離單株抗體B產率的影響。菱形表示抗體B之回收率，方塊表示宿主細胞蛋白質質濃度，三角形表示DNA濃度，＋號表示渾濁度測量，圓圈(○)表示SEC單體，X表示IEC主要異構重組物。

圖10顯示微過濾系統之示意圖。此系統操作的目的係在層析純化之前去除細胞培養中之細胞與其他碎屑。該澄清作用係使用微過濾器(0.2-0.65μm標稱孔徑)於交叉流離心作用(收獲進料和阻留物流與膜表面同方向流動)進行。此系統包括蠕動泵令進料循環通過微過濾(MF)筒；不過，可使用其他泵，諸如旋轉瓣或隔膜泵。於過濾期間，監測經過時間、透過物流重量以及筒入口、出口與透過物流壓力。於細胞培養經調整培養基濃縮5-7倍後，以緩衝溶液(pH與收獲進料pH相似)進行固定體積透析過濾以回收大部分殘留產物。以固定流速自該系統抽出透過物流，並收集在容器中。該操作溫度可發生在2-26℃之間。該進料容器容納pH未經調整或經調整的收獲進料，並加以攪動以避免細胞沈降。

圖11顯示計算通過該微過濾器之透膜壓力下降(TMP)之方法。該TMP係由在收獲進料、阻留物流與透過物流側所測得之壓力計算。該壓力測量係使用針壓力器、數位壓力計或壓力轉換器進行。

圖12表示pH調整對於微過濾操作性能的影響。y軸表示使用0.65μm孔徑中空纖維過濾器之以psi計微過濾過濾器平均透膜壓力差(TMP);x軸表示載於膜上之收獲進料體積與該膜面積的比率(L/m² )。此等微過濾實驗所使用的收獲材料包含產生糖基化人乳化單株抗體(IgG1)之中國倉鼠卵巢細胞。圖12之圖說顯示各種pH經調整收獲物流以及各種百分比細胞活力之數據。該圖顯示與pH仍介於6.8與7.2之收獲進料過濾作用相較，自中性生物反應器條件降至pH4.7-5.3之未經調整收獲進料的過濾作用使得通過過濾器的整體透膜壓力降低。此數據顯示降低收獲物流pH可以減少固定透過物流量(以高負載下之較低TMP表示)之下的過濾器結垢情況，使得微過濾操作更耐用。

圖13表示與圖12相似但用於其他單株抗體之pH調整對於微過濾操作性能的影響。y軸表示使用0.65μm孔徑中空纖維過濾器之以psi計微過濾過濾器平均透膜壓力差(TMP);x軸表示載於膜上之收獲進料體積與該膜面積的比率(L/m² )。此等微過濾實驗所使用的收獲材料包含產生良好分化人乳化單株抗體之中國倉鼠卵巢細胞。圖 13之圖說顯示各種pH經調整收獲物流以及各種百分比細胞活力之數據。該圖顯示與pH仍介於6.8與7.2之收獲進料過濾作用相較，自中性生物反應器條件降至pH4.7-5.2之收獲進料的過濾作用使得通過過濾器的整體透膜壓力降低。此數據顯示降低收獲物流pH可以減少固定透過物流量(以高負載下之較低TMP表示)之下的過濾器結垢情況。此結果使得微過濾操作更耐用。

圖14表示pH改變與存在不同二價陽離子對於經調整收獲物流中產物蛋白質滴定量之影響。y軸表示產物滴定量，其係根據未添加陽離子之pH 7.0收獲物的滴定量標準化。x軸表示於數種pH值(pH 7、5或4)及數種種類二價陽離子之下的各種生物巨分子收獲物流。融合蛋白的數據顯示於pH 5調整期間添加Co²⁺ 可保存溶液中之融合蛋白或是消除蛋白質與凝塊細胞和細胞碎屑共沈澱的可能。抗體數據顯示於pH 5調整期間添加Mg²⁺ 或Ca²⁺ 可保存溶液中之抗體或消除與凝塊細胞和細胞碎屑共沈澱的可能。

圖15表示收獲pH調整對於含有各種抗體之不同收獲物流的DNA去除的影響。y軸顯示存在澄清收獲物流中每數量抗體(kg)之DNA雜質的數量(μg)。x軸表示收獲/抗體物流未經調整以及以25%醋酸將pH調整pH 4.7二者。對下文所顯示之所有抗體而言，將收獲pH自約7.0調整至4.7有效地引發DNA沈澱，形成DNA雜質水準降低1.5至3個對數之澄清收獲物流。

圖16表示於收獲進料中添加各種陽離子，然後將收獲之pH調整至5的影響。y軸顯示以存在或不存在額外離子之未經調整收獲物流爲基準之蛋白質流失%。圖表左邊第一長條表示在無任何額外二價離子情況下於收獲物pH調整至pH 5.0之後，蛋白質流失14%(因沉澱所致)。其餘長條表示存在各種二價陽離子之額外蛋白質流失(>14%)或蛋白質產物回復(<14%)。該數據顯示存在諸如Ni²⁺ 、Ca²⁺ 、Mg²⁺ 、Mn²⁺ 與Co²⁺ 等各種過渡金屬離子改善蛋白質回收率。

圖17表示CoCl₂ 濃度對於從使用25%醋酸將pH調整至5.0的收獲物流回收蛋白質滴定量的影響。y軸表示於各種CoCl₂ 水準下pH經調整收獲物流中之蛋白質流失%。x軸表示經調整爲pH 5.0之收獲物流中所存在之CoCl₂ 濃度(mM)。該數據顯示當Co²⁺ 離子濃度提高時，因pH引發之沉澱所致之蛋白質產物流失%降低。已顯示融合蛋白之均衡濃度為10mM。

圖18表示本發明方法對於過濾器蛋白質排斥和整體澄清回收之影響。y軸表示滯留係數所界定之即時過濾器蛋白質排斥(R)。x軸表示含關注的生物巨分子之組成物澄清操作期間的體積產出量。顯示四個獨立MF實驗的數據：空心與實心三角形顯示之實驗表示已經過pH5.0調整(包括添加10mM CoCl₂ )之收獲物流；以空心與實心圓圈顯示之實驗表示未添加CoCl₂ 之未經調整收獲物流。數據顯示，對於所有研究的所有載入比例而來，含有 10mM CoCl₂ 之pH經調整收獲進料的MF滯留係數較低。該數據表示與使用未經調整收獲進料損失20%產率相較，含有Co²⁺ 二價陽離子的實驗顯示出完全回收所欲之蛋白質。

Claims

一種分離含雜質組成物中之抗體或融合蛋白的方法，其中該抗體或融合蛋白係表現在哺乳動物的宿主細胞內，且該雜質包括該宿主細胞的細胞成分，該方法包括：(a)降低該組成物之pH；(b)於該組成物中添加二價陽離子；以及(c)分離該抗體或融合蛋白與該雜質，其中(c)之分離作用係藉由對該組成物進行離心作用而予以進行，該離心作用形成上澄液與沉澱物，其中該抗體或融合蛋白實質上在該上澄液中，或其中(c)之分離作用係藉由過濾該組成物而予以進行，該過濾作用形成透過物流(premeate stream)與阻留物流(retentate stream)，其中該抗體融合蛋白實質上係在該透過物流中，及其中(a)和(b)係在(c)之前相繼地以任何順序予以進行。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該融合蛋白包括Fc區。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該形成透過物流與阻留物流之過濾作用係藉由切線流動過濾予以進行。
如申請專利範圍第1項之方法，其中(a)中該組成物之pH降低至選自下列所組成之群組中的pH範圍：i)3.0至6.5；ii)3.0至5.0；和iii)4.0至pH4.7。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該真核細胞的細胞成分包括不溶性蛋白質、脂質、核酸、核醣核酸或其任何組合物。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該二價陽離子係選自Ca²⁺ 、Mg²⁺ 、Cu²⁺ 、Co²⁺ 、Mn²⁺ 、Ni²⁺ 、Be²⁺ 、Sr²⁺ 、Ba²⁺ 、Ra²⁺ 、Zn²⁺ 、Cd²⁺ 、Ag²⁺ 、Pd²⁺ 、Rh²⁺ 與其組合物。
如申請專利範圍第6項之方法，其中該二價陽離子係選自Ca²⁺ 、Mg²⁺ 、Cu²⁺ 、Co²⁺ 、Mn²⁺ 、Ni²⁺ 及其組合物。
如申請專利範圍第7項之方法，其中該二價陽離子係選自Co²⁺ 、Ni²⁺ 及其組合物。
如申請專利範圍第6項之方法，其中於該組成物中添加該二價陽離子形成選自下列所組成之群組中的二價陽離子濃度：i)0.1mM至500mM；ii)1mM至100mM；和iii)2mM至50mM。
如申請專利範圍第9項之方法，其中於該組成物中添加該二價陽離子形成2mM至50mM的二價陽離子濃度。
如申請專利範圍第10項之方法，其中於該組成物中添加該二價陽離子形成2mM至20mM的二價陽離子濃度。
如申請專利範圍第9項之方法，其中該二價陽離子之添加作用使該抗體或融合蛋白之回收率相較於未添加該二價陽離子之回收率提高選自下列所組成之群組中的量：大於3%；和大於10%。
如申請專利範圍第9項之方法，其中(c)中之該分離作用係藉由過濾該組成物而進行，其中該過濾作用形成透膜壓力；且其中於過濾期間該透膜壓力實質上維持固定。
如申請專利範圍第1項之方法，其中(a)將該組成物之pH降至pH 3.0至5.0；(b)該二價陽離子係選自Ca²⁺ 、Mg²⁺ 、Cu²⁺ 、Co²⁺ 、Mn²⁺ 、Ni²⁺ 或其組合物；以及(c)藉由過濾該組成物進行分離作用。
如申請專利範圍第14項之方法，其中該二價陽離子係為Co²⁺ 。
如申請專利範圍第14項之方法，其中該二價陽離子係為Ni²⁺ 。
如申請專利範圍第1至16項中任一項之方法，其中該步驟(a)、(b)和(c)係以(a)-(b)-(c)之順序予以進行。
如申請專利範圍第1至16項中任一項之方法，其中該步驟(a)、(b)和(c)係以(b)-(a)-(c)之順序予以進行。