KR20170010750A - 단백질 추출 방법들 - Google Patents

Abstract

생물학적 샘플들로부터 DNA-응축 단백질들을 추출하기 위한 방법들이 제공된다.

Description

단백질 추출 방법들{PROTEIN EXTRACTION METHODS}

여기에 개시되는 실시예들은 단백질 제제들로부터 DNA-응축 단백질들의 추출을 위한 방법들에 관한 것이다.

DNA 응축 단백질들의 추출 및 특성화를 위한 방법들이 기재되어 있다. 하나의 이러한 방법은 2.5M과 같이 높은 농도의 염화나트륨에 대한 샘플의 노출을 수반한다. 다른 방법은 16시간까지의 기간들 동안에 pH 1.0 또는 그 이하와 같은 낮은 pH에 대한 노출을 수반한다. 염화나트륨과 낮은 pH의 결합들은 이들의 작용의 메커니즘들이 서로 대항적인 것으로 이해되기 때문에 이용되지 않고 있는 것 같다. 각 기술로 계면활성제들의 사용이 크기 배제 크로마토그래피에 의한 후속하는 처리와 함께 기재되어 있다.

본 발명은 제제로부터 DNA-응축 단백질을 추출하기 위한 방법들 및 키트들을 제공한다.

일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은 제제(preparation)로부터 DNA-응축 단백질(compaction protein)을 추출하기 위한 방법들을 제공하며, 상기 방법은 상기 제제를 약 0.1 내지 약 1.0의 pH에서 유기 양이온, 중성염 및 비이온성 계면활성제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 혼합물을 약 30분부터 약 150분까지의 기간 동안 배양하는 단계를 포함하며; 추출물을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계를 포함하고, 상기 추출물을 (1) 보이드 배제(void exclusion) 모드로 음이온 교환크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 수행하기 위해 적합한 전기양성의 입자들, 또는 (2) 약 5,000달톤(Dalton)의 배제 한계(exclusion limit)를 갖는 실질적으로 하전되지 않은 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 입자들을 포함하는 입자 충진 칼럼에 적용하는 단계를 포함하며, 상기 입자 충진 칼럼은 입자간 부피(interparticle volume)를 가지고, 상기 적용되는 추출물의 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않으며, 상기 적용하는 단계 후, 후속하여 완충제로 상기 샘플을 상기 칼럼 아래로 변위시키는 단계 및 상기 칼럼의 배제된 부피에 대응되는 피크(peak) 내의 DNA-응축 단백질들을 수집하는 단계를 포함한다.

도 1은 보이드 배제 모드로 동작하는 전기양성의 입자들의 칼럼에 의해 초기 추출물의 분별을 나타내는 크로마토그램을 도시한다. 피크는 그레이로 추출된 히스톤 단백질들을 함유하는 점을 강조한다.

일부 실시예들에 있어서, 원하는 단백질을 함유하는 생물학적 제제(biological preparation)로부터 DNA-응축 단백질(compaction protein)들을 추출하기 위한 방법들이 제공되며, 상기 방법들은 추출물 샘플을 제공하도록 상기 제제를 양이온성 유기 화합물, 약 1M 내지 약 3M의 농도로 중성염 및 비이온성 계면활성제의 결합과 약 0.1부터 약 1.0까지 범위의 pH에서 약 30분 내지 약 2시간 동안 접촉시키는 단계를 구비하는 초기 추출(extraction) 단계; 상기 추출물 샘플을 보이드 배제(void exclusion) 모드로 분별을 수행하기 위해 적합한 전기양성의 입자들로 충진된 칼럼, 또는 5,000달톤(Dalton)의 배제 한계(exclusion limit)를 갖는 실질적으로 하전되지 않은 다공성 입자들로 충진된 칼럼에 적용하는 단계를 구비하는 이후의 최종 추출 단계를 포함하고, 여기서 상기 칼럼으로 들어가는 지점에서 적용되는 샘플의 부피는 상기 칼럼의 입자간 부피보다 작거나 같고, 상기 적용하는 단계 후에 후속하여 완충제로 상기 샘플을 상기 칼럼 아래로 변위시키며, 상기 칼럼의 배제된 부피에 대응되는 피크(peak) 내의 추출된 DNA-응축 단백질들을 수집하는 단계를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 제제로부터 DNA-응축 단백질을 추출하기 위한 방법들이 제공되며, 상기 방법은 상기 제제를 유기 양이온, 중성염 및 비이온성 계면활성제와 약 0.1 내지 약 1.0의 pH에서 접촉시키는 단계, 혼합물을 약 30분부터 약 150분까지의 기간 동안 배양하는 단계, 추출물을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계, 상기 추출물을 (1) 보이드 배제 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위해 적합한 전기양성의 입자들, 또는 (2) 약 5,000달톤의 배제 한계를 갖는 실질적으로 하전되지 않은 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피 입자들을 포함하는 입자 충진 칼럼에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 입자 충진 칼럼은 입자간 부피를 가지며, 적용되는 추출물의 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않고, 상기 적용하는 단계 후에 후속하여 완충제로 상기 샘플 상기 칼럼 아래로 변위시키고, 상기 칼럼의 배제된 부피에 대응되는 피크 내의 추출된 DNA-응축 단백질들을 수집하는 단계를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 양이온은 구아니디늄(guanidinium), 에타크리딘(ethacridine), 메틸렌 블루(methylene blue), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 알렉시딘(alexidine), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine), 세틸트리메틸암모늄(cetyltrimethylammonium), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 에타크리딘 또는 메틸렌 블루의 농도는 영(zero)이 아닌 양으로부터 0.05%(부피 대 중량)까지, 0.01% 내지 0.1%, 0.02% 내지 0.05% 및 0.03% 내지 0.10%로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 구아니디늄의 농도는 0.5M 내지 1.5M, 0.8M 내지 1.2M 및 0.9M 내지 1.1M으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 중성염은 약 1M부터 약 3M까지의 농도 범위로 존재한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 중성염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.

일부 실시예들에 있어서, 비이온성 계면활성제는 트윈(Tween) 20, 트윈 40, 트윈 60 및 노니뎃(Nonidet) NP40으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 약 0.05%w/v부터 약 0.25%w/v까지의 농도 범위로 존재한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 DNA-응축 단백질은 하나 또는 그 이상의 히스톤 단백질들을 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 세포 배양 상청액(cell culture supernatant), 체액, 조직 균질액(homogenate) 및 분별 프로세스로부터의 부분(fraction)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시예들에 있어서, 원하는 비-히스톤(histone) 단백질은 자연 단백질 또는 재조합 단백질이다.

일부 실시예들에 있어서, 원하는 비-히스톤 단백질은 항체, IgG, IgM 및 비-항체 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시예들에 있어서, 양이온성 유기 화합물은 상기 초기 추출 단계로부터 생략될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 크로마토그래피 최종 추출 단계가 생략될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법들을 수행하도록 구성되는 키트(kit)들이 제공된다.

DNA 응축 단백질들의 추출은 강한 자기 연관 및 DNA와의 상호작용들 때문에 어렵다. 추출을 위한 시약들이 판매되고 있지만, 효율적인 추출을 유지하기 위해 요구되는 방법들이 지나치게 존재하는 실제의 양들을 너무 적게 추산하는 점이 발견되었다. 뉴클레오솜(nucleosome)들과 같은 보다 복합적인 구조체들로부터 히스톤들과 같은 DNA 응축 단백질들을 완전히 해리시키는 것에 명백하게 실패하는 점 이외에도, 알려진 추출 조건들은 또한 추출의 긴 과정에 걸쳐 히스톤들을 저하시키며, 과소 추산을 악화시킨다. 현재의 추출 방법들에 의해 개별적으로 채용되는 높은 염 및 낮은 pH에서 전하 반발에 의해 전하 억제의 주요 메커니즘들이 상호 대항적이고, 함께 이용될 때에 특정한 범위들을 제외하면 심지어 보다 큰 히스톤 함량의 과소 추산을 야기할 수 있는 점이 발견되었다. 현재의 히스톤 추출 방법들의 다른 문제는 추출 환경이 생리적 환경으로 다시 변화될 경우, 상기 히스톤들도 동시에 추출되지 않은 샘플 내에 존재하였던 만큼 검출할 수 없게 되는 점이다. 이는 알려진 히스톤 검출 방법들이 히스톤 항원 부위들을 노출시키기 위해 뉴클레오솜들과 같은 히스톤을 함유하는 구조체들의 일시적인 불안성에 의존하는 점이 원인인 것으로 보이며, 이는 결국 현재의 추출 방법들이 상기 샘플이 상기 추출 환경 내에 머무르는 동안에 이들 항원 부위들만의 노출을 구현할 수 있는 점을 나타낸다.

세포 배양에 의해 생성된 원하는 재조합 단백질을 함유하는 제제들 내의 모든 오염시키는 숙주 단백질들의 양을 나타내도록 사용되고 여겨지는 숙주 단백질 분석들이 히스톤들을 포함하여 DNA 응축 단백질들을 정확하게 검출할 수 없는 점이 예기치 않게 발견되었다. 실험 데이터는 전체 숙주 단백질을 드러내는 것으로 추정되는 숙주 단백질 분석들이 히스톤 함량 20,000-폴드(fold) 이상으로 히스톤 함량을 너무 적게 추산하는 점을 보고하고 있다(P. Gagnon 등의 "J. Chromatogr. A"(1340 (2014) 68-78)). 히스톤 제거를 위한 정제 방법들이 이러한 능력에 대해 평가되거나 선택될 수 없고, 인간 치료를 위한 최종 생성물들이 안전하지 않은 오염물 부하들을 함유할 수 있기 때문에 이는 생물 약제학들 상의 정제에서 실질적인 문제를 나타낸다.

정확한 히스톤 정량화의 문제는 분석 보정 기준들까지 확장된다. 천연 소스들로부터 히스톤들의 효과적인 추출을 구현하는 것의 어려움으로 인하여, 일부 공급자들은 상기 히스톤들이 뉴클레오솜들 내의 DNA와 연관되지 않도록 히스톤의 하나의 종을 과발현시키는 세포 배양 프로세스들을 개발하였다. 이는 천연의 히스톤을 함유하는 샘플들의 조성으로부터 자체가 벗어나는 점을 나타내며, 분석 오류의 잠재적인 원인을 나타내고, 이러한 "보정" 용액들이 단일의 히스톤 종, 통상적으로 H3만을 함유하는 사실에 의해 더 심화된다. 이는 세포들로부터 세포질로 발현되거나 분비되는 히스톤들이 천연 히스톤들과 동일한 번역 후 변형들을 겪지 않는 정도까지의 오류의 다른 원인을 나타낸다.

히스톤 추출의 보다 효과적인 방법이 여기에 개시되며, 상기 방법은 히스톤을 함유하는 제제를 약 0.1 내지 약 1.0의 pH에서 30분 내지 2시간 동안 양이온성 유기 화합물, 약 1M 내지 약 3M의 농도로 중성염, 약 0.01% 내지 약 0.25%의 농도로 비이온성 계면활성제를 포함하는 요소들 및 조건들의 결합과 접촉시키는 단계; 이후에 상기 샘플을 보이드 배제 모드로 음이온 교환 크로마토그래피을 수행하기 위해 적합한 전기양성의 입자들로 충진된 칼럼, 또는 약 5,000달톤의 배제 한계를 갖는 실질적으로 하전되지 않은 다공성 입자들로 충진된 칼럼에 적용하는 단계를 포함하고; 여기서, 상기 칼럼으로 들어가는 지점에서 적용되는 샘플의 부피는 상기 칼럼의 입자간 부피보다 작거나 동일하며; 상기 칼럼의 배제된 부피에 대응하는 피크 내의 상기 추출된 히스톤 단백질들을 수집하는 단계를 포함한다. 이는 pH 1이나 2.5M의 NaCl, 혹은 0.1%의 상기 비이온성 계면활성제 NP40 또는 앞서의 모두 혹은 임의의 농도로 구아니딘(guanidine) 자체와의 결합에 의존하는 추출 방법들보다 높은 히스톤들의 회수를 가져온다. 예기치 않게, 개시되는 방법에 의해 추출된 히스톤들은 생리적 조건들에 대한 완충제 제형(formulation)의 반전에 따라 DNA 및 다른 크로마틴(chromatin) 구성 성분들로 재조립되지 않는다. 이는 단지 낮은 pH와 같은 알려진 추출 방법들과 기본적으로 대조되며, 여기서 생리적 조건들로의 낮은 pH에서 추출된 샘플의 회복은 상기 히스톤 성분이 추출되지 않은 샘플 내에서 저조하게 검출되도록 한다. "생리적 조건들"이라는 용어는 본 문에서 약 6.5 내지 약 7.5의 pH 및 약 12㎝ 당 밀리지멘스(mS/㎝) 내지 약 16mS/㎝의 전도도를 언급하는 것으로 이해된다. 이론에 의해 제한되지 않고, 이러한 제한을 회피하는 개시되는 방법의 능력이 크로마토그래피 분리의 최종 단계 동안에 아직까지 확인되지 않은 재조립을 촉진시키는 요소로부터의 상기 히스톤을 함유하는 부분의 분리로부터 야기될 수 있는 것으로 여겨진다. 보이즈 배제 모드로 음이온 교환 크로마토그래피가 상기 최종 추출 단계에 이용되는 경우, 잔류하는 DNA가 주요한 재조립을 촉진시키는 성분이 될 수 있고, 상기 전기양성의 입자들의 표면에 대한 결합에 의해 제거될 수 있는 것으로 나타난다. 어떠한 메커니즘이든지 추출 후(post-extraction) 재조립을 방지하는 여기서의 방법의 능력은 상기 추출된 샘플이 후속되는 면역 분석법들을 방해하지 않는 생리적 조건들에 있게 하는 반면, 낮은 pH 추출은 통상적으로 또한 낮은 pH에서 적용되는 검출 항체를 요구하며, 이는 상기 검출 항체를 손상시키거나 그 항원 결합 운동력을 억제하여 신호를 감소시킬 수 있다. 상기 최종 크로마토그래피 분리의 다른 이점은 추출된 샘플들이 상기 최초 샘플의 염 농도 또는 pH의 적당한 변화들에도 불구하고 기본적으로 동일한 결과들을 가져오게 할 가능성이 있는 점이며, 이는 낮은 pH와 같은 알려진 추출 방법들과 대조적이고, 여기서 염 농도의 변화들은 후속되는 분석에 의해 얻어지는 값들의 실질적으로 거짓 변화에 기여한다. 상기 최종 크로마토그래피 분리의 다른 이점은 모든 추출된 샘플들이 이들의 초기 샘플 pH 및 전도도에 관계없이 동일한 조건들에 머무를 가능성이 있는 점이며, 여기서 샘플들의 관련된 시리즈들 사이의 조건들의 균일성은 이러한 시리즈의 샘플들 중에서 히스톤 값들의 보다 우수한 전체적인 정확성과 비교 가능성에 기여하는 것으로 이해된다. 이러한 이점은 다른 시간들에서 분석될 수 있는 샘플들 사이의 보다 나은 일관성과 재현성을 가능하게 하고, 또한 개시되는 방법이 키트(kit) 포맷으로 실행되는 것을 가능하게 하는 상기 최종 크로마토그래피 분리를 위한 표준화된 완충제의 사용까지 확장된다. 특히 상기 크로마토그래피 매체들이 전기양성일 때 구현되는 다른 이점은 상기 추출 방법이 후속되는 면역 분석법을 방해할 수 있는 산성의 오염물들의 큰 비율을 선택적으로 제거하는 점이다. 시사된 바와 같이, 이는 상대적으로 정제된 상태로 상기 추출된 히스톤들을 남기며, 개시되는 방법이 정량적 분석들을 위한 샘플들의 제조를 위해서나, 천연에서 생성되는 히스톤 분포들을 정확하게 나타내는 조성으로 보정 기준들의 정제를 위해서나, 다른 목적들을 위한 샘플들의 정제를 위해서 이용될 수 있는 점을 입증한다. 낮은 pH 및 상승된 염 농도에 대한 상대적으로 짧은 기간의 샘플 노출로부터 유래되는 개시되는 방법의 다른 이점은 낮은 pH와 같은 알려진 추출 방법들에 비하여 전체적인 분석 시간을 감소시키는 점이다. 낮은 pH 및 상승된 염 농도에 대한 상대적으로 짧은 기간의 샘플 노출로부터 유래되는 개시되는 방법의 다른 이점은. 히스톤 함량의 과소 추산 및 결과들의 제어되지 않는 변동성의 증가를 야기하는 추출된 히스톤들의 검출능 또한 감소시키기 때문에 낮은 pH에서 추출의 만성적인 문제인 상기 추출된 히스톤들에 대한 손상을 감소시키는 점이다.

예시적인 일 실시예에 있어서, 추출되는 샘플의 pH는 약 15%v/v의 체적 비율로의 200mM의 염산과 같이 상기 조건을 구현하기에 충분한 산의 첨가에 의해 약 0.1 내지 약 1.0까지 감소될 수 있다. 염화나트륨은 2M의 최종 농도까지 첨가된다. 상기 양이온성 유기 화합물 구아니딘은 0.25M의 최종 농도까지 첨가된다. 상기 비이온성 계면활성제 노니뎃(Nonidet) NP40은 0.1%의 최종 농도까지 첨가되고, 혼합물은 실온에서 1시간 동안 배양된다. 고체들은 여과 또는 원심분리와 같은 임의의 편리한 방법에 의해 제거된다. 칼럼은 세파덱스(Sephadex) G25와 같은 사이즈 배제 기반의 완충 교환 크로마토그래피(buffer exchange chromatography) 매체로 충진되며, 이는 이후에 pH 7.0의 50mM의 헤페스(Hepes), 100mM의 NaCl로 평형화된다. 정화된 샘플은 적용되는 샘플의 부피가 상기 칼럼으로 들어가면서 충진 층(packed bed)의 입자간 부피를 초과하지 않도록 상기 칼럼에 적용된다. 추가 완충제가 상기 샘플이 상기 칼럼을 통해 이송되게 하도록 상기 칼럼에 적용된다. 상기 추출된 히스톤들을 함유하고 평형화 완충제 내에서 용리되는 첫 번째 피크가 수집된다.

다른 예시적인 실시예에 있어서, 추출되는 샘플의 pH는 약 15%v/v의 체적 비율로의 200mM의 황산과 같이 상기 조건을 구현하기에 충분한 산의 첨가에 의해 약 1까지 감소될 수 있다. 염화나트륨은 3M의 최종 농도까지 첨가된다. 상기 양이온성 유기 화합물 구아니딘은 0.2M의 최종 농도까지 첨가된다. 상기 비이온성 계면활성제 트윈-20은 0.1%의 최종 농도까지 첨가되고, 혼합물은 실온에서 1시간 동안 배양된다. 고체들은 여과 또는 원심분리와 같은 임의의 편리한 방법에 의해 제거된다. 칼럼은 우노스피어(UNOsphere) Q와 같은 음이온 교환 크로마토그래피 매체로 충진되고, 이후에 pH 8.0의 50mM의 트리스(Tris)로 평형화된다. 정화된 샘플은 적용되는 샘플의 부피가 상기 칼럼으로 들어가면서 상기 충진 층의 입자간 부피를 초과하지 않도록 상기 칼럼에 적용된다. 추가 완충제가 상기 샘플이 상기 칼럼을 통해 이송되게 하도록 상기 칼럼에 적용된다. 상기 추출된 히스톤들을 함유하고, 평형화 완충제 내에서 용리되는 첫 번째 피크가 수집된다. 예를 들면, 도 1과 다음의 실험예 7을 참조하기 바란다. 실험 데이터는 산성의 단백질들의 부존재 및 DNA를 함유하는 뉴클레오솜 잔류물들의 분명한 부존재 모두에 대하여 명목상으로 하전되지 않은 다공성 입자들로 충진된 칼럼을 사용하는 접근보다 높은 히스톤 회수 및 히스톤 순도의 훨씬 높은 레벨을 생성하는 점을 나타낸다.

또 다른 예시적인 실시예에 있어서, 추출되는 샘플의 pH는 약 15%v/v의 체적 비율로의 200mM의 황산과 같이 상기 조건을 구현하기에 충분한 산의 첨가에 의해 약 0.1 내지 약 1.0까지 감소된다. 염화나트륨 1M의 최종 농도까지 첨가된다. 상기 양이온성 유기 화합물 에타크리딘은 0.025%(w/v)의 최종 농도까지 첨가된다. 상기 비이온성 계면활성제 NP40은 0.1%의 최종 농도까지 첨가되고, 혼합물은 실온에서 1시간 동안 배양된다. 고체들은 여과 또는 원심분리와 같은 임의의 편리한 방법에 의해 제거된다. 칼럼은 누비아(Nuvia) Q와 같은 음이온 교환 크로마토그래피 매체로 충진되고, 이는 이후에 pH 7.0의 50mM의 헤페스로 평형화된다. 정화된 샘플은 적용되는 샘플의 부피가 상기 칼럼으로 들어가면서 상기 충진 층의 입자간 부피를 초과하지 않도록 상기 칼럼에 적용된다. 추가 완충제가 상기 샘플이 상기 칼럼을 통해 이송되게 하도록 상기 칼럼에 적용된다. 상기 추출된 히스톤들을 함유하고, 평형화 완충제 내에서 용리되는 첫 번째 피크가 수집된다. 정화된 샘플은 적용되는 샘플의 부피가 상기 칼럼으로 들어가면서 상기 충진 층의 입자간 부피를 초과하지 않도록 상기 칼럼에 적용된다. 추가 완충제가 상기 샘플이 상기 칼럼을 통해 이송되게 하도록 상기 칼럼에 적용된다. 상기 추출된 히스톤들을 함유하고, 평형화 완충제 내에서 용리되는 첫 번째 피크가 수집된다.

또 다른 예시적인 실시예에 있어서, 추출되는 샘플의 pH는 약 0.8%v/v의 체적 비율로의 200mM의 황산과 같이 상기 조건을 구현하기에 충분한 산의 첨가에 의해 약 0.1 내지 1.0까지 감소된다. 염화나트륨은 1.5M의 최종 농도까지 첨가된다. 상기 양이온성 유기 화합물 메틸렌 블루는 0.025%(w/v)의 최종 농도까지 첨가된다. 상기 비이온성 계면활성제 NP40은 0.1%의 최종 농도까지 첨가되고, 혼합물은 실온에서 1시간 동안 배양된다. 고체들은 여과 또는 원심분리와 같은 임의의 편리한 방법에 의해 제거된다. 칼럼은 우노스피어(UNOsphere) Q와 같은 음이온 교환 크로마토그래피 매체로 충진되고, 이는 이후에 pH 7.0의 50mM의 헤페스, 100mM의 NaCl로 평형화된다. 정화된 샘플은 적용되는 샘플의 부피가 상기 칼럼으로 들어가면서 상기 충진 층의 입자간 부피를 초과하지 않도록 상기 칼럼에 적용된다. 추가 완충제가 상기 샘플이 상기 칼럼을 통해 이송되게 하도록 상기 칼럼에 적용된다. 상기 추출된 히스톤들을 함유하고, 평형화 완충제 내에서 용리되는 첫 번째 피크가 수집된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 양이온성 유기 화합물은 클로르헥시딘, 벤잘코늄 클로라이드, 알렉시딘, 트리스(2-아미노에틸)아민 또는 폴리에틸렌이민, 혹은 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 또는 잠재적으로 에타크리딘, 메틸렌 블루, 다우노마이신, 독소루비신 및/또는 구아니딘을 포함하여 전술한 것들의 결합이 될 수 있다. 어떤 특정한 이론에 제한되지 않고, 실험 데이터는 이들 화합물들 상의 양성의 전하가 뉴클레오솜들의 DNA 성분과의 이들의 상호작용을 향상시킬 수 있고, 이에 따라 DNA와 DNA-응축 단백질들의 상호작용을 경쟁적으로 약화시키는 점을 제시한다. 구아니딘의 경우, 이의 추출을 향상시키는 효과들은 카오트로프(chaotrope)로서 그 작용에 의해 더 매개될 수 있다. 에타크리딘의 경우, 다우노마이신, 독소루비신 및/또는 메틸렌 블루, 이들의 추출을 향상시키는 효과들이 DNA 구조체들 내로의 이들의 삽입하는 능력에 의해 더 매개될 수 있고, DNA의 부분적인 꼬이지 않음을 야기하며, 이에 따라 DNA와 히스톤들과 같은 DNA-응축 단백질들의 상호작용을 약화시킨다.

일부 실시예들에 있어서, 초기 샘플 조성은 pH, 전도도, 염의 종들, 세포 배양 배치들 성분들, 또는 원하는 재조합 단백질의 특성들에 대해 제한되지 않을 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 일련의 샘플들에 걸쳐 초기 샘플 조성은 이전의 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 정제 단계로부터의 부분들과 같은 하나 또는 그 이상의 변수들에 의해 체계적으로 변화될 수 있고, 염의 함량, 또는 pH, 또는 다른 변수의 증가 또는 감소뿐만 아니라 각기 잠재적으로 단백질들의 다른 하위 세트들을 함유하는 것에 의해 하나와 다른 하나 사이에서 변화될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 일련의 샘플들 중에서 초기 샘플 조성은 하나의 샘플로부터 다음의 것에 존재하는 단백질들의 하위 세트들에 대해 변화될 수 있지만, 상기 조건들은, 예를 들면 상기 샘플들이 사이즈 배제 크로마토그래피 단계로부터 유래되었을 때에 실질적으로 변하지 않을 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 크로마토그래피 단계에 대해 사용되는 완충제 또한 상기 최종의 추출된 샘플이 머무르는 완충제가 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 최종 완충제는 완충시키는 성분만을 함유할 수 있고, 다른 것들 중에서 방부제(preservative)들 또는 내동제(cryoprotectant)들과 같은 추가적인 염들 또는 다른 성분들이 결핍될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 최종 완충제 조건들은 상당히 생리적 조건들을 시뮬레이션할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 동일한 완충제가 관련된 세트 내의 모든 샘플들을 처리하는 데 사용될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 동일한 완충제가 관련되지 않은 세트들에 걸쳐 모든 샘플들을 처리하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 초기 추출 pH는 약 0.1 내지 1.0이 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 추출 pH는 상기 샘플에 대한 200mM의 염산, 또는 황산, 또는 다른 산, 혹은 산들의 결합의 첨가에 의해 구현된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 추출 pH는 상기 샘플에 대한 15%v/v의 비율로 약 200mM의 산의 첨가에 의해 구현된다. 일부 실시예들에 있어서, 첨가되는 산의 체적 비율은 5% 내지 50%, 또는 10% 내지 25%, 또는 12.5% 내지 17.5%가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 산의 농도는 100mM, 또는 200mM, 또는 300mM, 또는 보다 낮거나, 중간이거나 보다 높은 농도가 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 산의 부피 및 농도는 목표 pH를 구현하는 산의 가장 적은 양까지 조정될 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 목표 pH는 0.1 내지 1.0, 또는 0.2 내지 0.9, 또는 0.3 내지 0.8, 또는 0.4 내지 0.7, 또는 0.5 내지 0.6의 범위, 또는 다른 범위나 중간 값이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 다른 산이나 산들의 결합이 유사한 전체 농도로, 또는 상기 샘플의 완충 효과들을 극복하기에 필요한 경우에 보다 높은 농도로, 또는, 상기 목표 pH를 구현하는 것으로 나타날 경우에는 보다 낮게, 또는 다른 비율로 적용될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 추출 동안의 중성염의 농도는 1M, 또는 2M, 또는 3M, 또는 1M 내지 3M, 또는 1.5M 내지 2.5M, 또는 1.75M 내지 2.25M, 또는 1.8M 내지 2.2M, 또는 1.9M 내지 2.1M의 범위, 또는 다른 범위나 중간 값이 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 중성염은 NaCl 또는 KCl, 혹은 이들이 결합, 또는 다른 중성염이 될 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 염은 액체 농축물로서 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 중성염은 고체로서 첨가될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 양이온성 유기 화합물은 구아니딘 설페이트(guanidine sulfate) 또는 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride) 또는 구아니디늄 아세테이트(guanidinium acetate)와 같은 유리 염기로서나 산으로서 첨가되는 구아니디늄 이온이 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 최종 추출 혼합물 내의 구아니디늄 이온들의 농도 2M 이하의 영이 아닌 양이 될 것이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 농도는 0.05M, 또는 0.1M, 또는 0.15M, 또는 0.2M, 또는 0.25M, 또는 0.5M, 또는 1.0M, 또는 1.5M가 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 구아니디늄 농도는 1.5M 내지 0.05M, 또는 1M 내지 0.1M, 또는 0.5M 내지 0.15M, 또는 0.4M 내지 0.2M의 범위, 또는 다른 범위나 중간 농도가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 양이온성 카오트로프(cationic chaotrope)는 액체 농축물로서 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양이온성 카오트로프는 고체로서 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 구아니디늄 이온들이 존재하지 않을 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 양이온성 유기 화합물은 0.025%(w/v), 또는 0.01%, 또는 0.1%의 농도, 또는 0.01% 내지 0.1% 혹은 중간 값의 농도로 에타크리딘 또는 메틸렌 블루가 될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 노니뎃(Nonidet) NP40, 또는 트윈(Tween)-20, 또는 트윈-40, 또는 트윈-60일 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제 농도는 0.01%, 또는 0.025%, 또는 0.05%, 또는 0.075%, 또는 0.1%, 또는 0.25%, 또는 0.5%, 또는 1% 내지 0.01%, 또는 0.5% 내지 0.05%, 또는 0.25% 내지 0.025%, 또는 0.2% 내지 0.02%, 또는 0.15% 내지 0.05%, 또는 0.125% 내지 0.075%, 또는 1.1% 내지 0.9%의 범위, 또는 다른 범위나 중간 값이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤(Triton) 또는 브리즈(Brij), 또는 다른 종들과 같은 NP40 이외의 종들이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO 또는 옥타글루코시드(octaglucoside)와 같은 쌍성이온성 계면활성제로 대체될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는세틸트리메틸암모늄 브로마이드와 같은 음이온성 계면활성제로 대체될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 초기 추출 기간은 15분, 또는 30분, 또는 60분, 또는 120분, 또는 150분, 또는 180분, 또는 그 이상이 될 수 있다. 실험 데이터는 히스톤들의 열화가 1시간 이상의 간격들에서 일어나지만, 비록 보다 긴 간격들에서 보다 심각해지지만 여전히 2시간에서도 상당히 작은 점을 제시한다. 30분의 간격은 합당한 최소 추출 기간으로서 1시간을 제시하는 60분 보다 낮은 분명한 값들의 결과로 되는 경향이 있지만, 중간의 기간이 일부 경우들에서 바람직할 수 있는 가능성을 남긴다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 30분 내지 150분, 또는 45분 내지 90분, 또는 50분 내지 70분의 범위, 또는 다른 간격이나 중간 값을 산정하는 것은 신중할 수 있다. 데이터는 샘플 조성이 가장 효과적인 기간에 영향을 미칠 수 있고, 가장 긴 기간 동안 죽은 세포들을 함유하였던 샘플들은 이들이 다시 나타나는 상황들에 있을 것이기 때문에 가장 긴 산에 대핸 노출 간격들을 가장 요구할 수 있고, 여기서 원하는 단백질 생성물이 세포외 크로마틴(chromatin)과 상호작용하는 가장 큰 기회를 가질 것이며, 분리에 저항하는 응집체들의 형성을 가져오는 점을 나타낸다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 추출의 최종 단계에 대해 사용되는 크로마토그래피 매체들은 음이온 교환 크로마토그래피의 기술을 실행하는 데 사용되는 경우와 같은 전기양성의 다공성 입자들을 포함할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 음이온 교환 매체들이 R. Nian 등(J. Chromatography A(1282 (2013) 127-132))에 기재된 바와 같이 보이드 배제 모드로의 음이온 교환 크로마토그래피의 기술을 유지하는 이들의 알려진 능력에 따라 특히 선택될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 음이온 교환 매체는 우노스피어(UNOsphere) Q(바이오-라드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories))가 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 음이온 교환 매체는 누비아(Nuvia) Q(바이오-라드 라보라토리즈)가 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 음이온 교환 매체는 캅토(Capto) Q(GE 헬스케어(Healthcare)) 또는 상기 기술을 실행하기에 적합한 다른 음이온 교환체가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 부피는 상기 칼럼으로 들어가는 경우에 상기 칼럼의 입자간 부피 보다 작아질 것이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 부피는 상기 칼럼의 입자간 부피 보다 1% 작을 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 부피는 상기 입자간 부피 보다 5% 이하, 또는 10% 이하, 또는 20% 이하, 또는 50% 이하, 또는 90% 이하, 또는 99% 이하가 될 수 있거나, 영이 아닌 양보다 작은 샘플 부피까지의 임의의 감소가 될 수 있지만, 샘플 부피는 대체로 상기 입자간 부피를 초과하지 않아야 한다.

상기 최종 추출 단계에 대해 보이드 배제 모드로 음이온 교환 매체가 사용되는 일부 실시예들에 있어서, 이러한 단계를 수행하기 위해 선택되는 평형화 완충제는 가장 낮은 전도도에서 알칼리성 pH를 채용함에 의해 유리할 수 있고, 여기서 원하는 비-히스톤 단백질은 존재하는 경우에 가용성으로 남고, 상기 음이온 교환 매체에 의해 유지되지 않는다. 보이드 배제 모드로 음이온 교환 매체가 보정 기준들로서 히스톤들을 정제하기 위해 또는 다른 목적들을 위해 사용되고, 원하는 비-히스톤 단백질이 존재하지 않는 일부 실시예들에 있어서, 히스톤들이 안정하게 남고 상기 음이온 교환 매체에 의해 유지되지 않는 가장 낮은 전도도에서 알칼리성 pH를 채용하는 것이 유익할 수 있다. 이에 따라, 상기 pH는 8.0, 또는 9.0, 또는 9.5, 또는 10.0, 또는 그 이상이 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 염들이 존재하지 않을 것이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 완충시키는 종들은 가장 낮은 전도도를 상기 완충제에 부여하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들면, 쌍성이온성 완충제들은 통상적으로 무시할 수 있는 전도도를 완충제 자체들에 부여하며, 존재하는 임의의 전도도는 이들의 pH를 조절하는 데 사용되는 반대 이온들에 기인할 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자에게는 상기 pH가 높아질수록 상기 전도도가 낮아지고, 히스톤 단백질들의 추출과 일치하여 상기 샘플로부터 제거될 것인 산성의 종들의 다양성을 크게 하는 점이 분명해질 것이다. 이들이 상기 히스톤 성분에 의한 전하 반발을 최소화하면서 상기 교환체의 전기양성의 표면에 대한 DNA 결합을 선호할 것이기 때문에 이들 조건들이 DNA를 함유하는 뉴클레오솜 잔류물들을 가장 잘 제거할 것인 점이 동일하게 분명해질 것이다. 달리 말하면, 이러한 조건들은 특히 DNA의 제거에 대하여 가장 높은 히스톤 순도를 산출할 것이다. 이는 목적이 보정 기준들로서 이용을 위한 고도로 정제된 히스톤들을 얻거나, 이들이 특성화될 수 있도록 정제된 히스톤들을 얻는 것인 경우에 유리한 것으로 예상될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자는 어떤 양들이 요구되던지 정제된 히스톤들을 얻기 위한 추출 기술의 규모를 어떻게 조절하는 가를 알 수 있을 것이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기의 최종 단계에 대해 사용되는 크로마토그래피 매체들은 완충 교환 크로마토그래피의 기술을 실행하기 위해 사용되는 경우와 같은 크기 배제 크로마토그래피 입자들을 포함할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 완충 교환 매체는 약 5,000D의 질량을 갖는 가상적인 구상 단백질(globular protein)에 대응되는 배제 한계를 구현할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 완충 교환 매체는 세파덱스(Sephadex) G25가 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 매체들의 입자 크기 분포는 제조업자에 의해 수행되는 입자 크기 조절에 따라 변경되며, 세파덱스G25의 경우에, 예를 들면 가장 작은 입자 크기 분포는 초미세로 알려진 G25의 등급과 관련될 것이고, 약간 큰 입자 크기 분포는 미세로 알려진 G25의 등급과 관련될 것이며, 약간 큰 입자 크기 분포는 중간으로 알려진 G25의 등급과 관련될 것이고, 약간 큰 입자 크기 분포는 거친 것으로 알려진 G25의 등급과 관련될 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 약 5,000D의 배제 한계를 갖는 다공성 입자들은 다른 중합체들, 예를 들면 트리스아크릴(Trisacryl) GF05로 구성될 수 있고, 이는 세파덱스에 사용되는 덱스트란(dextran) 중합체에 비하여 아크릴아미드(acrylamide) 중합체로부터 만들어지는 것으로 이해된다. 일부 실시예들에 있어서, 보다 높은 히스톤 회수가 세파덱스 G10와 같은 보다 낮은 배제 한계를 갖는 크기 배제 매체들로 구현될 수 있다. 일반적인 사실상, 이러한 매체들에 의해 제공되는 분별의 용량과 품질은 가장 작고 가장 좁은 입자 크기 분포에 대응되는 등급으로 가장 높을 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 부피는 상기 칼럼으로 들어가는 경우에 상기 칼럼의 입자간 부피보다 작을 적이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 부피는 상기 칼럼의 입자간 부피의 1% 보다 작을 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 부피는 상기 입자간 부피보다 5% 이하, 또는 10% 이하, 또는 20% 이하, 또는 50% 이하, 또는 90% 이하, 또는 99% 이하일 수 있거나, 보다 작은 영이 아닌 양까지의 임의의 감소가 될 수 있다.

크기 배제 매체가 상기 최종 추출 단계에 대해 사용되는 일부 실시예들에 있어서, 이러한 단계를 수행하기 위해 선택되는 평형화 완충제는 전체적인 히스톤 추출 효율을 감소시키지 않고 넓은 범위의 조건들을 구현할 수 있다. 상기 pH는 4부터 10까지의 범위가 될 수 있고, 전도도는 1mS/㎝ 이하로부터 50mS/㎝ 또는 그 이상까지의 범위가 될 수 있으며, 상기 완충제는 계면활성제들 또는 다른 첨가제들을 함유할 수 있다.

상기 최종 추출 단계가 전기양성의 크로마토그래피 매체 또는 크기 배제 크로마토그래피 매체로 수행되고, 개시되는 방법들을 수행하기 위한 목적이 히스톤들의 정량적 분석을 위해 샘플들을 제조하는 데 이용되는 일부 실시예들에 있어서, 상기 칼럼 단계를 평형화시키기 위해 선택되는 완충제는 후속하는 면역 분석법의 요구들을 수용하도록 조제될 것이다. 해당 기술 분야의 숙련자에게는 다른 센서들을 채용하는 면역 분석법들이 최적의 성능을 구현하도록 다른 화학적 환경들을 요구하며, 이들 요구들을 수용하는 개시되는 방법들의 능력이 이에 따라 이들의 유연성과 적용의 범주를 증가시키는 점이 이해될 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 예를 들면 개시되는 방법들이 보정 기준들로서 히스톤들을 추출하기 위해 이용되는 경우, 상기 최종 추출 단계에 대해 선택되는 완충제는 히스톤을 안정화시키는 완충제라 되도록 선택될 수 있거나 및/또는 특히 냉동되거나 동결되는 조건들 하에서의 저장 동안에 조제될 수 있다.

정의들

용어들은 여기의 실시예들이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 설시된다.

"DNA 응축 단백질(compaction protein)"은 DNA 응축 단백질들의 하나 또는 그 이상의 종들과의 상호작용들의 결과로 DNA의 긴 분절들이 접혀지거나, 꼬이거나, 고차로 꼬이기 때문에 작은 영역 내에 있을 수 있도록 하는 방식으로 게놈 DNA와 상호작용하는 단백질의 종들을 언급한다.

"히스톤(histone)"은 진핵(eukaryotic) 유기체 내에서 발견되는 DNA 응축 단백질들의 종들의 그룹을 언급한다. 히스톤들은 일반적으로 히스톤 H1, H2A, H2B, H3 및 H4로 구성되는 5가지 종들이다.

"뉴클레오솜(nucleosome)"은 DNA 응축 단백질들과 DNA의 상호작용에 의해 생성되는 이차 구조체를 언급하며, 이에 따라 상기 이차 구조체는 DNA의 응축을 매개한다. 뉴클레오솜들은 일반적으로 2개의 각각의 히스톤들 H2A, H2B, H3 및 H4을 포함하는 코어 히스톤 8량체(octamer)로 구성되며, 여기서 DNA는 상기 코어의 주위에 약 1.5배로 감긴다. 뉴클레오솜 내의 히스톤들과 DNA의 연관은 이들이 세포 용해, 해리 또는 구조적 변화로부터 상기 DNA 및 상기 히스톤 성분들 모두를 안정화시키도록 강하며, 면역 분석법들에 대해 검출 가능한 히스톤들을 만들기 위한 화학적으로 엄격한 추출 과정에 대한 요구 사항을 가져온다.

"뉴클레오솜 어레이(nucleosome array)"는 그 자체가 히스톤 H1과 연관되는 링커(linker) DNA의 절편에 의해 선형 배열로 연결되는 2 또는 그 이상의 뉴클레오솜들을 언급한다.

"크로마틴(chromatin)"은 게놈 DNA 및 연관된 DNA 응축 단백질들과 다른 구성체들을 언급한다. 크로마틴은 세포 사멸에 따라 즉시 퇴화되기 시작하며, 양한 크기들의 뉴클레오솜 어레이들, 단일 뉴클레오솜들, 히스톤들 및 DNA의 형성을 가져온다.

"입자간 부피(interparticle volume)"는 크로마토그래피 칼럼과 같은 3차원 공간 내에 충진된 입자들로부터의 공간을 언급한다. 상기 입자간 부피는 보다 통상적으로 칼럼의 보이드 부피, 또는 칼럼 보이드, 또는 간단히 보이드를 언급한다. 상기 입자간 부피라는 용어는 보이드 부피가 때때로 단백질들이 확산 질량 수송의 비효율로 인해 절대 접근을 구현하지 못하는 입자의 깊은 내부 부피, 또는 단순히 얕게 위치하는 공극들을 언급하는 데 사용되기 때문에 가장 밀집한 것으로 간주된다. 통상의 시스템에 있어서, 중력 정착 입자들의 칼럼 내의 보이드 부피는 전체 층 부피의 약 40%를 구성한다.

"배제 한계(exclusion limit)"는 다공성 입자 기반의 크로마토그래피 매체의 공극들로 들어갈 수 있는 가장 큰 단백질의 크기를 언급한다. 이는 가상적인 구상(구형) 단백질에 기초하는 임의의 가이드라인으로 이해된다. 예를 들면, 5,000D의 배제 한계를 갖는 크로마토그래피 매체는 5,000D보다 작은 단백질들이 그 공극들 내로 확산되는 것을 허용할 수 있지만, 5,000D보다 큰 단백질들은 이러한 공극들 내로 확산될 수 없다. 자연적으로 생성되는 단백질들은 완전하게 구형인 것으로 이해되지는 않으며, 따라서 이러한 예는 비현실적으로 엄격한 것으로 이해되지만, 매체 제조업자들에 의해 공표된 배제 한계들은 분자들의 대략적인 크기 분류들을 위한 가용 매체들을 확인하는 데 유용할 수 있다.

"보이드 배제(void exclusion)"는 크기 배제 크로마토그래피에 대해 사용되는 바와 같이 명목상으로 하전되지 않은 다공성 입자들에 적용되는 경우에 상기 배제 한계보다 큰 단백질들 및/또는 다른 용질들이 칼럼의 입자간 부피에 대한 이들의 크기에 의해 제한되는 현상을 언급한다. "보이드 배제"는 전기양성의 입자들에 적용되는 경우에 단백질들의 하위 세트들 및/또는 다른 용질들이 이들의 전하 성질들에 의해 칼럼의 입자간 부피에 대해 제한되는 현상을 언급한다. 전기양성의 입자들의 칼럼들 내의 보이드 배제의 상세한 논의는 Nian 등(앞서의 문헌)에 의해 제공된다. 크기 및 전하에 의한 보이드 배제 모두의 경우에 있어서, 칼럼 부하는 유사하게 칼럼의 입자간 부피보다 크지 않은 샘플 부피로 제한되며, 양 경우들에서, 상기 칼럼으로부터 용리되는 첫 번째 피크는 상기 칼럼을 통한 이들의 통과 동안에 상기 입자간 부피(상기 보이드 부피) 내로 배제되었던 상기 최초 샘플의 성분들을 포함하는 것으로 이해된다. 이러한 피크는 통상적으로 보이드 피크, 보이드 배제 피크, 또는 배제 피크로 언급된다.

"양이온성(cationic)"은 양성으로 하전된 이온을 언급한다.

"음이온성(anionic)"은 음성으로 하전된 이온을 언급한다.

"비이온성(nonionic)"은 전하가 결핍된 이온을 언급한다.

"쌍성이온성(zwitterionic)"은 상기 양성의 전하가 상기 양성의 효과를 취소시키지 않고 그 반대로도 되어 화합물 상의 순 전하가 영인 균형을 이룬 양성 및 음성의 전하들을 지니는 화합물을 언급한다.

"카오트로프(chaotrope)"는 단백질들 또는 다른 생물분자들 변성시키는 경향이 있는 화합물을 언급하며, 여기서 변성이라는 용어는 단백질이 그 생리 작용을 소실하고, 극단적으로 될 경우에 인지 가능한 구조적 특징들을 완전히 소실할 수 있는 정도까지 그 구조를 이완시키는 것으로 이해된다. 통상적으로 알려진 카오트로프들은 구아니디늄 이온들(양이온성), 요소(urea)(비이온성) 및 티오시아네이트(thiocyanate)들(음이온성)을 포함한다.

특정한 실시예들에 있어서, 개시되는 방법은 주어진 샘플의 히스톤 함량의 우수한 정량적 추산들을 얻기 위해 앞서 기술한 일반적인 예들로부터 변화 없이 적용될 수 있다. 일반적인 사실상, 상기 크로마토그래피 단계를 수반하는 추출의 두 번째 상(phase)은 실험 데이터가 이들이 가장 높은 히스톤 회수 및 순도를 유지하는 점을 나타내기 때문에 초기에 전기양성의 다공성 입자들의 칼럼으로 수행되어야 한다. 샘플 내에 최초로 존재하는 히스톤을 함유하는 실체(entity)들의 조성에 대하여 변화되는 최초의 추출되지 않은 샘플들에 대한 잠재성이 정해지면, 상기 조건들이 샘플과 적절하게 부합되는 점을 확보하기 위한 특정 변수들을 점검하는 것은 신중할 수 있다. 예를 들면, 살아있는 세포들의 균질화로부터 유래되는 샘플들에서, 상기 히스톤들은 뉴클레오솜들과 거의 배제적으로 연관될 것이다. 이러한 샘플들은 보정 기준들의 제조에 대해 선호될 수 있다. 죽은 세포들을 함유하는 생물학적 유체들로부터 유래되는 샘플들에서, 뉴클레오솜들 및 이들의 퇴화 부산물들은 세포들에 의해 생성되는 다른 단백질들과 연관되는 것이 실험적으로 나타났으며(P. Gagnon 등의 앞서의 문헌), 이는 상기 히스톤들이 추출에 대해 보다 저항하게 할 수 있거나, 전체 히스톤 집단의 하위 세트가 이전에 연관된 DNA의 효소 세포 용해로 인해 방해자들이 없게 되어, 잠재적으로 이들이 퇴화에 대해 보다 취약하게 만든다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 재조합 단백질의 특성들은 이들의 추출률에도 영향을 미칠 수 있는 히스톤들 또는 뉴클레오솜 구조체들과의 강한 상호작용들을 매개하는 성질이 될 수 있다. 점검을 위한 가장 간단한 프로세스 변수는 추출 시간이 될 것이다. 현재까지의 실험 데이터는 추출 효율이 약 60분까지 증가되고, 이후에 보다 긴 간격들 동안 계속되는 경우에는 저하되는 점을 나타낸다. 상기 감소는 추출 효율을 반영하는 것이 아니라 오히려 추출 조건들에 대한 과도한 노출로 인한 히스톤들의 퇴화로 이해된다. 어떠한 이유로든, 다른 추출 시간들을 평가하는 간단한 실험이 정해진 소스로부터의 샘플들을 위한 최적을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 다른 변수들 또한 유사한 개념적인 방식으로 최적화될 수 있으며, 여기서 중성염, 유기 양이온, 또는 계면활성제의 농도, 혹은 pH, 또는 그 결합들은 체계적으로 변화된다. 일부 실시예들에 있어서, 중성염들, 산들, 카오트로프들(양이온성, 비이온성, 쌍성이온성, 음이온성), DNA 삽입제(intercalating agent)들 그리고 계면활성제들의 다른 종들을 테스트하는 것 또한 가능하다. 실험 계획법(DoE)으로 알려진 기술은 변수들의 정해진 세트들에 대한 최적의 조건들을 확인하는 데이터의 통계적으로 유효한 요체를 얻기 위해 요구되는 테스트들의 숫자를 최소화하기 위한 것으로 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다.

일부 실시예들에 있어서, 보이드 배제 모드로 전기양성의 입자들로 충진된 칼럼을 사용하는 최종 추출 단계를 이용하여 시작하는 것이 통상적으로 히스톤들의 가장 높은 회수 및 가장 높은 순도를 생성하기 때문에 유리할 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 최종 단계에 대한 음이온 교환 크로마토그래피에 비하여 상기 최종 단계에 대한 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 구현되는 결과들을 평가하는 것이 가치가 있을 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 가장 높은 정도의 전체적인 추출 효율을 매개하는 것을 결정하기 위해 다른 등급들이나 유형들의 크기 배제 매체들 또는 다른 음이온 교환 크로마토그래피 매체들을 평가하는 것이 가치가 있을 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 분석을 위해 미리 특성화되지 않은 항-히스톤 ELISA를 이용할 때, 실험 데이터가 다른 ELISA 생성물들에 의해 사용되는 다른 항체들이 어느 하나의 추출 방법에 의해 제조되는 샘플들로부터 검출되는 히스톤들을 보다 덜 또는 보다 우수하게 검출할 수 있는 점을 나타내기 때문에 에타크리딘 또는 메틸렌 블루 기반의 추출에 비하여 구아니딘 기반의 추출을 시험하는 것이 유용할 수 있다. 그러나, 일부 실시예들에서, 에타크리딘, 메틸렌 블루, 다우노마이신, 독소루비신, 또는 다른 DNA 삽입제(intercalator)와 같은 유기 양이온으로의 추출은 특히 보이드 배제 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위해 적합한 전기양성의 입자들의 칼럼에 대한 적용이 수반될 때에 일반적으로 추출된 히스톤들의 가장 높은 회수를 유지할 것이다.

상기 최종 추출 단계를 수행하기 위해 적합한 일부 크로마토그래피 매체들이 알려져 있지만, 모두가 조사되지는 않았으며, 개시되는 방법들을 수행하기 위해 적합한 것으로 입증되는 새로운 매체들이 개발될 수 있다. 적합한 것으로 알려진 크기 배제 크로마토그래피 매체들은 바람직하게는 초미세 또는 미세 등급의 세파덱스 G25를 포함하지만, 중간 및 거친 등급들도 트리스아실 GF05와 같은 제품들이 경우에 만족스러운 결과를 유지할 수 있다. 적합한 것으로 알려진 음이온 교환 크로마토그래피 매체들은 우노스피어 Q, 누비아 Q 및 캅토 Q를 포함하며, 우노스피어 Q가 특히 우수한 결과들을 생성한다. 일부 실시예들에 있어서, 정해진 크로마토그래피 매체로 충진된 주어진 칼럼에 적용될 수 있는 샘플의 부피를 결정하는 것이 필요할 것이다. 이는 pH 7.0까지의 50mM의 인산나트륨, 1M의 NaCl 내의 라소자임(lysozyme)의 제제가 1㎎/mL로 pH 7.0의 50mM의 인산나트륨으로 평형화된 충진된 칼럼에 적용되는 간단한 실험에서 양 매체 등급들에 대해 결정될 수 있다. 첫 번째 통과 상에서, 샘플이 적용되는 지점을 나타내는 차트 마크를 표기하고, 상기 칼럼 부피의 10%의 샘플 부피를 적용한다. 평형화 완충제로 상기 샘플 성분들을 상기 칼럼의 이래로 변위시키는 샘플 도입이 후속된다. 280㎚에서 자외선 광의 흡수 및 전도도를 모니터한다. 용리 프로파일 상에서, 280 신호가 상승되기 시작하는 지점을 표기하고, 이후에 전도도 신호가 상승되기 시작하는 지점을 표기한다. 이들 두 지점들로부터의 부피가 상기 칼럼의 입자간(보이드) 부피의 함수이며, 가능한 한 완전히 추출되는 전체 보이드 피크 내의 히스톤들을 위하여 상기 칼럼에 적용될 수 있는 샘플의 최대 부피의 추정을 제공한다. 후속하는 실험에서, 상기 칼럼 부피의 30%가 적재된다. 각 경우에서, 상기 전도도 신호가 증가하기 시작하기 전에 상기 UV 흡수가 베이스라인으로 돌아가는 지를 확인한다. 목적은 이러한 조건들을 수행하는 최대 샘플 부피를 확인하는 것이다. 균일한 직경의 완전히 구형인 입자들로 충진된 칼럼에 있어서, 상기 입자간 부피는 칼럼 부피의 40%에 가깝지만, 다양한 인자들에 의존하여 덜 비례할 수 있다(Nian 등의 앞서의 문헌). 예를 들면, 실제 실험은 충진하는 동안에 상기 칼럼의 압축이 입자간 부피를 다르게 감소시키는 점을 입증한다. 또한, 상기 샘플이 상기 시스템 내로 도입되고, 실제로 상기 칼럼으로 들어가는 경우에 상기 지점으로부터의 제어되지 않은 유체 분산은 주입 포트를 통해 도입되었던 부피보다 큰 상기 칼럼으로 들어가는 샘플의 부피를 야기할 수 있다. 이러한 이유로 인해, 상기 샘플 포트에서 도입될 수 있고, 염들이나 다른 성분들이 용리되기 전에 완전하게 용리되는 상기 원하는 히스톤-추출된 피크를 여전히 제공하는 샘플의 가장 큰 부피를 결정하기 위해 다양한 부피들의 샘플들이 전술한 바와 같이 도입되는 간단한 실험을 수행하는 것은 신중할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 비록 현재까지의 실험 데이터가 선택적인 것들이 우수하지 않은 점을 나타내지만 양이온성 유기 화합물들 이외에 카오트로픽 화합물들을 평가하는 것이 관심의 대상이 될 수 있다. 요소는 구아니디늄 이온들에 비교할만한 결과들을 가져오지 못하는 잘 알려진 카오트로픽제(chaotropic agent)이다. 이러한 결과는 구아니디늄 이온들 및 요소 모두가 생물분자들에 대한 직접적인 결합에 의해 이들의 카오트로픽 효과들을 매개하는 것으로 알려져 있고, 이들이 히스톤들을 손상시키는 것에 대해 유사한 효과들을 가져야 하기 때문에 예기치 않았던 것이다. 어떤 특정 이온에 제한되지 않고, 상기 전기양성의 구아니디늄 이온들은 전기양성의 히스톤들로부터 어느 정도 정전기적으로 반발되고, 이에 따라 구아니딘이 반발되지 않았을 경우에 이들이 견딜 수 있는 경우보다 높은 구아니딘의 농도를 견딜 수 있다. 동시에, 구아니디늄 이온들은 DNA 상의 각 포스포디에스테르 브리지(phosphodiester bridge)에서 음성으로 하전된 산소 원자들에 대한 양성으로 하전된 구아니디늄 이온들의 전정기적인 결합에 의해 DNA를 우선적으로 변성시킬 수 있고, 이러한 변성은 DNA로부터 히스톤들을 분리시키는 데 도움이 될 수 있으므로, 보다 높은 추출 효율에 기여한다. 비록 예비 데이터가 이들도 구아니디늄보다 우수하지 못한 점을 나타내지만, 티오시아네이트(thiocyanate)들 또는 퍼클로레이트(perchlorate)들과 같은 음이온성 카오트로프들 또한 고려될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 에타크리딘 및 메틸렌 블루와 같은 구아니딘 이외의 양이온성 유기 화합물들이 히스톤 추출 효율을 증진시킬 수 있다. 실험 데이터는 다른 양이온성 유기 화합물들이 비록 이들이 일반적으로 에타크리딘 또는 메틸렌 블루와 같이 효과적이지는 않지만 양이온 유기 화합물들이 결핍된 시스템들보다 완전한 추출을 유지하는 점을 나타낸다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 에타크리딘 또는 메틸렌 블루에 대한 선택적인 것들은 클로르헥시딘, 알렉시딘, 세틸트리메틸암모늄, 다우노마이신, 독소루비신, 트리스(2-아미노에틸)아민 및/또는 폴리에틸렌이민으로 구성될 수 있다.

실험예

실험예 1. 다른 세제(detergent)들 및 농도들의 영향. 일련의 실험들이 2.5M의 NaCl, 0.2M의 HCl 내에서 히스톤 추출에 대한 다른 세제들의 영향들을 평가하기 위해 수행되었다. 모든 세제 농도들은 0.05%였다. 추출 효율은 액티브 모티프(Active Motif)(도쿄)로부터 입수한 ELISA을 기초로 하였다. 가장 높은 추출 효율들은 트윈(Tween)-20, 트윈-40, 트윈-60 및 노니뎃(Nonidet) NP-40으로 얻어졌다. 완료 데이터를 표 1에 나타낸다.

[표 1]

계면활성제 히스톤 H3, ng/mL

에틸렌디아민 테트라키스 테트롤 0

(ethylenediamine tetrakis tetrol)

콜아미노프로필디메틸암모늄 프로판 술포네이트 37

(cholaminopropyldimethylammonium propane sulfonate)

트윈-65 50

데실트리메틸암모늄 브로마이드 98

(decyltrimethylammonium bromide)

계면활성제 없음 101

헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 283

(hexadecyltrimethylammonium bromide)

미리스틸트리메틸아민 브로마이드 351

(myristyltrimethylamine bromide)

트리메틸옥타데실암모늄 브로마이드 386

(trimethyloctadecylammonium bromide)

플루로닉(Pluronic) F126 567

글리콜산 에톡실레이트(glycholic acid ethoxylate) 678

도데실트리메틸암모늄 브로마이드 703

(dodecyltrimethylammonium bromide)

트윈-60 865

트윈-40 888

트윈-20 890

노니뎃 NP40 939

실험예 2. 다른 세제들에 대한 계면활성제 농도의 효과. 실험예 2로부터의 가장 높게 수행되는 세제들이 액티브 모티프사 및 셀 시그널링(Cell Signaling)(댄버스, 메사추세츠주, 미국)으로부터의 ELISA들로 다른 농도들에서 비교되었다. 추출은 2M의 NaCl, 0.2M의 HCl에서 수행되었다. 추출물은 세파덱스 G25의 칼럼(GE 헬스케어)으로 pH 7의 50mM의 헤페스, 150mM의 NaCl로 완충제 교환되었다. 트윈-20이 특히 우수한 결과들을 제공하였다. 완료 결과들을 표 2에 나타낸다.

[표 2]

계면활성제 H3/액티브 모티프 H3/셀 시그널링

없음 92 0

노니뎃 NP40

0.01% 650 206

0.05% 4203 509

0.10% 4704 404

0.15% 4755 316

0.20% 4937 181

트윈-20

0.01% 1736 0

0.05% 6478 748

0.10% 6333 844

0.15% 6984 957

0.20% 6376 769

트윈-40

0.01% 1783 0

0.05% 4678 270

0.10% 5438 443

0.15% 4760 28

0.20% 5160 249

트윈-60

0.01% 2648 0

0.05% 4039 235

0.10% 4620 234

0.15% 4457 87

0.20% 4383 74

실험예 3. 히스톤 H3의 정량화에 대한 추출 시간의 효과. 단일클론성(monoclonal) 항체를 함유하는 세포 배양 배지들의 샘플이 4℃의 0.2M의 HCl, 0.1%의 NP-40, 2.5M의 NaCl 내에서 추출되었다. 부분 표본(aliquot)들은 규칙적인 시간 간격들로 제거되었고, 세파덱스 G25 상에서 pH 7.0의 50mM의 헤페스, 150mM의 NaCl로 완충제 교환되었다. 히스톤 H3 값들은 셀 시그널링에서 제조된 ELISA로 결정되었다. 신호는 16시간(960분)의 시간 과정에 걸쳐 약 15% 감소되었다. 결과들을 표 3에 나타낸다.

[표 3]

시간 간격(분) 히스톤 H3

0 3

30 2778

60 2774

120 2665

240 2484

360 2590

480 2449

960 2366

실험예 4. 2M의 NaCl, 0.2M의 HCl, 0.1%의 NP40 내의 다른 유기 양이온들의 효과들. 샘플들은 초기 추출 후에 pH 7.0의 50mM의 헤페스로 완충제 교환되었다. 선택된 비-양이온성 유기 화합물들 또한 평가되었다. 히스톤 H3 값들은 액티브 모티프 및 셀 시그널링으로부터의 ELISA들로 결정되었다. 에타크리딘은 액티브 모티프 ELISA로 특히 우수한 결과들을 가져왔다. 구아니딘은 셀 시그널링 ELISA로 특히 우수한 결과들을 가져왔다. 모든 양이온성 유기 화합물들은 비-양이온성 유기 화합물들보아 우수하였다. 결과들은 표 4에 나타난다.

[표 4]

유기 양이온 H3/액티브 모티프 H3/셀 시그널링

클로르헥시딘

0.001% 2056 517

0.01% 1840 515

에타크리딘

0.025% 2961 480

0.05% 3663 371

세틸트리메틸암모늄 브로마이드

0.025% 1367 0

0.050% 1540 0

폴리에틸렌이민-1200

0.025% 2839 583

0.05% 2968 642

구아니딘

0.5M 311 717

1.0M 504 1319

1.5M 1323 1578

2.0M 2438 841

2.5M 3487 0

비-양이온성 유기물들

요소

1.5M 1415 947

2.0M 842 997

2.5M 655 916

티오시안산 나트륨

0.25M 0 0

0.50M 0 0

1.0M 0 0

1.5M 0 0

실험예 5. 1.5M의 NaCl, 0.1%의 NP-40, 0.2M의 HCl 내의 에타크리딘, 메틸렌 블루 및 구아니딘의 비교. 세파덱스 G25로써 pH 7.0의 50mM의 헤페스로 완충제 교환되었다. 히스톤 H3은 ELISA에 의해 측정되었고, 실험들은 삼중으로 수행되었으며, 결과들을 평균화되었다. 결과들을 표 5에 나타낸다.

[표 5]

유기 양이온 H3/액티브 모티프 H3/셀 시그널링

에타크리딘

0.025% 3236 2714

0.050% 2936 2736

0.100% 2768 3009

0.150% 2688 3278

0.200% 3122 3479

메틸렌 블루

0.025% 2064 3638

0.050% 2331 3479

0.100% 4065 3196

0.150% 3468 3259

0.200% 3248 3166

구아니딘

0.5M 1031 4149

1.0M 559 3980

1.5M 524 1529

2.0M 550 384

` 2.5M 444 171

실험예 6. 다른 추출 방법들의 비교. 다양한 추출 방법들이 비교되었고, 추출된 샘플들은 액티브 모티프 및 셀 시그널링으로부터의 ELISA들로 평가되었다. 추출 1: 추출 없음, 대조 실험. 추출 2: 0.2M의 HCl. 추출 3: 0.2M의 HCl, 후속하여 pH 7.0로 적정됨. 추출 4: 0.2M의 HCl, 크기 배제에 의해 pH 7.0의 50mM의 헤페스로 완충제 교환됨. 추출 5: 2.5M의 NaCl, 0.1%의 NP40. 추출 6: 2.5M의 NaCl, 0.1%의 NP40, 크기 배제에 의해 pH 7의 50mM의 헤페스로 완충제 교환됨. 추출 7: 0.2M의 HCl, 1.5M의 NaCl, 0.1%의 NP40. 추출 8: 0.2M의 HCl, 1.5M의 NaCl, 0.1%의 NP40, 크기 배제에 의해 pH 7의 50mM의 헤페스로 완충제 교환됨. 추출 9: 0.2M의 HCl, 2M의 NaCl, 0.1%의 NP40, 1.25M의 구아니딘 HCl. 추출 10: 0.2M의 HCl, 2M의 NaCl, 0.1%의 NP40, 1.25M의 구아니딘 HCl, 이후에 크기 배제에 의해 pH 7의 50mM의 헤페스로 완충제 교환됨. 추출 11: 0.2M의 HCl, 1.5M의 NaCl, 0.1%의 NP40, 0.2%의 에타크리딘. 추출 12: 0.2M의 HCl, 1.5M의 NaCl, 0.1%의 NP40, 0.2%의 에타크리딘, 이후에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 pH 7의 50mM의 헤페스로 완충제 교환됨. 결과들을 표 6에 나타낸다.

[표 6]

추출 방법 셀 시그널링 액티브 모티프

1 26 0

2 2245 655

3 585 175

4 14 0

5 2241 1206

6 837 185

7 139 761

8 3636 4580

9 89 375

10 5884 2755

11 126 728

12 4337 5948

실험예 7. 크기 배제에 대한 보이드 배제 음이온 교환으로의 제2 추출 단계. IgG 단일클론성 항체를 함유하는 세포 배양 수확물(harvest)이 0.2M의 HCl, 2M의 NaCl, 0.1%의 NP40, 0.05%의 에타크리딘으로 1시간 동안 추출되었다. 샘플의 절반은 세파덱스 G25 상에서 pH 8의 50mM의 트리스로의 완충 교환 크로마토그래피의 최종 추출 단계에 의해 처리되었다. 나머지 절반은 우노스피어 Q 상의 pH 8의 50mM의 트리스로의 보이드 배제 크로마토그래피에 의해 처리되었다. 상기 샘플들은 액티브 모티프 및 셀 시그널링으로부터의 히스톤 H3 ELISA들로 분석되었다. 양 칼럼들 모두 상의 보이드 배제 피크에 대한 평균 H3 값들은 다음 표에 주어진다. 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피가 양 분석들에서 가장 높은 반응을 가져왔다. 결과들을 표 7에 나타낸다.

[표 7]

최종 추출 액티브 모티프 셀 시그널링

보이드 배제 3343 1000

크기 배제 337 310

도 1은 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피를 채용하는 단계를 예시하며, 그레이(gray)로 수집된 보이드 배제 피크를 강조한다.

실험예 8. 최종 추출 다음의 침전물들의 형성. 초기 추출이 0.5M보다 낮은 NaCl의 농도들에서 수행될 때, 침전이 크기 배제 크로마토그래피에 의한 pH 7.0의 50mM의 헤페스로의 완충제 교환 다음에 관찰된다. 유사한 결과가 초기 추출이 구아니딘의 부존재, 심지어 1M의 NaCl에서 수행될 경우에 관찰된다. 유사한 결과가 상기 초기 추출이 1M의 NaCl의 존재에서 0.75M 보다 큰 구아니딘에서 수행될 경우에 관찰된다. 초기 추출이 에타크리딘 또는 메틸렌 블루의 존재에서 수행될 때에 유사한 결과가 0.0M 내지 0.5M의 NaCl에서 관찰된다. 모든 경우들에서, 침전물의 제거는 H3 신호의 손실에 직접 대응되며, 상기 침전물이 히스톤 단백질들에 의해 점유되는 점을 나타낸다.

앞서의 실험예들로부터 개시되는 방법들이 상기 양이온성 유기 화합물의 부존재에서도 알려진 방법들 보다 높은 정도의 히스톤 추출 효율을 구현하는 점이 분명해질 것이다. 주어진 샘플 내의 가장 정확한 히스톤 단백질들의 정량화를 유지하는 개시되는 방법들의 주의도가 정해지면, 상기 양이온성 유기 화합물의 포함은 비록 일부 사용자들이 포함이 없이 용인되는 결과들이 얻어질 수 있는 것으로 판단할 수 있지만 바람직한 것이 된다. 그러나, 이러한 경우들에서도, 해당 기술 분야의 숙련자는 상기 크로마토그래피 단계의 포함이 필수적으로 남을 것인 점을 인지할 것이다. 알려진 추출 방법들에 대한 개시되는 방법의 일부로서 기재되는 상기 크로마토그래피 단계들의 추가가 이들 다른 방법들에게 개시되는 방법들의 이점들의 일부를 부여할 것인 점이 동등하게 인지되어야 한다.

일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 이들 샘플들 내의 히스톤들의 정량 추정을 개발하는 목적을 위해 샘플들로부터 히스톤들을 추출하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법들은 샘플이나 침전 또는 이와 유사한 것들 내의 히스톤들의 양을 정량화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 샘플들 또는 제제들은 체액들, 세포 또는 조직 용해물들, 세포 배양 상청액들, 그리고 정제 프로세스들로부터와 같이 임의의 이러한 소스들로부터 처리된 샘플들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법들은 히스톤들의 정량화된 양을 히스톤들의 기준 수량 또는 내부 기준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 정량 추정을 개발하는 목적은 상기 원하는 단백질이 적절한 안전성 및 규제 기준들을 만족시키는 지를 확인하기 위해 인간 주입을 위해 의도되는 원하는 정제된 치료 단백질 내의 히스톤들의 정량을 결정하는 것이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 히스톤들의 양을 정량화한 후, 상기 방법들은 히스톤들의 양이 안정성 및/또는 규정 기준을 만족시키는 지를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 이러한 실시예에 있어서, 정량 추정을 개발하는 목적은 히스톤들 및/또는 다른 오염물들을 제거하도록 의도되는 분별(정제) 단계로부터 수집된 각각의 일련의 부분들 내의 히스톤들의 정량을 결정하는 것이 될 수 있다.

일부 적용들에서, 정량 추정을 개발하는 목적은 각각의 일련의 정제 단계들 후에 남아 있는 히스톤들의 정량을 결정하는 것이 될 수 있다. 이러한 실시예들에 있어서, 정량 추정을 개발하는 목적은 가용 프로세스에 의한 제제로부터 특히 히스톤들을 제거하도록 의도되는 분별 방법들의 개발을 안내하는 것이 될 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에서, 여기에 개시되는 방법들은 하나 또는 그 이상의 부분들이나 유사하게 나누어진 히스톤 소스들의 그룹들 내의 히스톤들의 양을 정량화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일련의 부분들 내의 히스톤들을 정량화시킨 후, 상기 방법들은 히스톤을 포함하는 모든 부분들을 수집하는 단계를 더 포함할 수 있다. 모든 부분들을 수집한 후, 상기 히스톤들에 상기 히스톤들을 분리시키는 단계, 상기 수집된 부분들을 완충제 교환하는 단계, 여과시키는 단계, 마이크로- 또는 나노-여과시키는 단계, 크로마토그래피 방법을 통해 더 정제하는 단계 또는 이들의 결합들의 하나 또는 그 이상의 단계들이 더 수행될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 알려지지 않은 히스톤 함량들을 갖는 샘플들 내의 히스톤들의 정량적 분석을 유지하기 위한 보정 기준을 생성하는 목적을 위해 히스톤들을 추출하도록 이용될 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에서, 여기에 개시되는 방법들은 상기 추출된 히스톤으로 보정 기준을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 히스톤들이 추출되는 샘플은 살아있는 세포 제제가 될 수 있다. 따라서, 방법들은 살아있는 세포 제제로 여기에 개시되는 방법들의 첫 번째 추출 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 히스톤들이 추출되는 샘플은 재조합 단백질들의 생산에 사용되는 것과 같은 세포 배양 배지가 될 수 있고, 상당한 배합이나 죽은 세포들을 함유할 수 있다. 이러한 다른 경우들에서, 상기 히스톤들이 추출되는 샘플은 혈청, 또는 혈장, 또는 눈물, 또는 젖, 또는 흉수, 또는 침 혹은 다른 체액과 같은 체액이 될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 이들을 정제하는 목적을 위해 히스톤들을 추출하도록 이용될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 특히 상기 최종 추출 단계가 보이드 배제 모드로 사용되는 전기양성의 입자들의 칼럼으로 수행되는 경우, 히스톤들의 실질적인 정제가 추출과 동시에 일어날 것이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들에 의해 생성되는 부분적으로 정제된 히스톤 추출물은 다른 방법들에 의해 더 정제될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 이러한 다른 방법들은 다음의 하나 또는 그 이상과 같은 크로마토그래피 방법들을 포함할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography), 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography), 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), 크기 배제 크로마토그래피.

여기서 언급되는 모든 참고 문헌들은 각각의 개별적인 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 모든 목적들을 위해 그 전체 개시 사항들이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내어지는 것과 같은 정도까지 그 전체 개시 사항들이 모든 목적들을 위해 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항에 모순되지 않는 정도까지 본 명세서는 임의의 이러한 모순적인 문제를 대체하거나 및/또는 우선하도록 의도된다.

본 명세서와 특허청구범위에서 사용되는 구성 성분들, 크로마토그래피 조건들 등을 나타내는 모든 숫자들은 모든 예들에서 "약(about)"이라는 용어에 의해 변경되는 것으로 이해된다. 이에 따라, 다르게 기재되지 않는 한, 본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 설정되는 수치적 변수들은 본 발명의 개시되는 방법들에 의해 수득되는 것으로 간주되는 원하는 성능에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.

여기에 개시되는 실시예들의 많은 변형들과 변화들이 해당 기술 분야의 숙련자에게는 분명한 바와 같이 그 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 개시되는 특정 실시예들은 단지 예로써 제시되는 것이며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의미하지 않는다. 본 명세서와 실험예들은 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 여기에 개시되는 실시예들의 진실한 사상과 범주 내에서 단지 예시적인 것들로 간주되도록 의도된다.

Claims (13)

1. 제제(preparation)로부터 DNA-응축 단백질(compaction protein)을 추출하기 위한 방법에 있어서,
   상기 제제를 약 0.1 내지 약 1.0의 pH에서 유기 양이온, 중성염 및 비이온성 계면활성제와 접촉시키는 단계를 포함하고;
   약 30분부터 약 150분까지의 기간 동안 혼합물을 배양하는 단계를 포함하며;
   추출물을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계를 포함하고;
   상기 추출물을 (1) 보이드 배제(void exclusion) 모드로 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 수행하기 위해 적합한 전기양성의 입자들, 또는 (2) 약 5,000달톤(Dalton)의 배제 한계(exclusion limit)를 갖는 실질적으로 하전되지 않은 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 입자들을 포함하는 입자 충진 칼럼에 적용하는 단계를 포함하며, 상기 입자 충진 칼럼은 입자간 부피(interparticle volume)를 가지고;
   상기 적용되는 추출물의 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않으며,
   상기 적용하는 단계 후, 완충제를 상기 샘플을 상기 칼럼 아래로 변위시키도록 상기 칼럼을 통과시키는 단계 및 상기 칼럼의 배제된 부피에 대응되는 피크(peak) 내의 추출된 DNA-응축 단백질들을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 유기 양이온은 구아니디늄(guanidinium), 에타크리딘(ethacridine), 메틸렌 블루(methylene blue), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 알렉시딘(alexidine), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine), 세틸트리메틸암모늄(cetyltrimethylammonium), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 에타크리딘 또는 메틸렌 블루의 농도는 영(zero)이 아닌 양부터 0.05%(부피 대 중량)까지, 0.01% 내지 0.1%, 0.02% 내지 0.05% 및 0.03% 내지 0.10%로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 구아니디늄의 농도는 0.5M 내지 1.5M, 0.8M 내지 1.2M 및 0.9M 내지 1.1M으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 중성염은 약 1M부터 약 3M까지의 농도 범위 내로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 중성염은 염화나트륨 또는 염화칼륨인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 비이온성 계면활성제는 트윈(Tween) 20, 트윈 40, 트윈 60 및 노니뎃(Nonidet) NP40으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제 약 0.05%w/v부터 약 0.25%w/v까지의 농도 범위 내로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA-응축 단백질은 하나 또는 그 이상의 히스톤(histone) 단백질들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 제제는 세포 배양 상청액(cell culture supernatant), 체액, 조직 균질액(homogenate) 및 분별 프로세스로부터의 부분(fraction)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 원하는 비-히스톤 단백질은 자연 단백질 또는 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 원하는 비-히스톤 단백질은 항체, IgG, IgM 및 비-항체 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 구현하도록 구성되는 키트.

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