CN1053195C - 从鸡血中提取鸡核酸及核蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以鸡血中提取鸡核酸及核蛋白的方法，它主要是以加有抗凝剂的新鲜鸡血为原料进行直接匀浆破碎处理或沉降后的匀浆破碎处理以及低渗盐溶血处理提取细胞核，再用浓盐法、去垢剂法及稀碱法从细胞核中提取核酸。从鸡血中提取核蛋白可取由上述方法得到的细胞核用氯化钠处理，再向得到的核蛋白溶液中加无水乙醇或冷水。本发明原料充足、成本低、还解决了鸡血的污染；本发明易工业化，而且还可针对不同的使用目的采用不同的方法。
Description
本发明涉及一种核酸的制备方法。
核酸是人体和生物体的主要遗传物质，它对生物的生长、发育、遗传、代谢等生命活动起着重要的作用，使用核酸具有调节代谢、增加营养、抗衰老和增加机体的抵抗力的作用。因此人们发明了多种提取核酸的方法。如在1996年3月6日发明专利公报上公开的一种<从天然植物细胞中提取核酸的生产工艺> (申请号94115437.8)它是以大豆粕为原料采用生物化学提取技术制备核酸的。该植物性核酸与动物性核酸有一定差异，不易被人体吸收。也有人研究出易被人体接受的核酸，如在1994年10月19日发明专利公报上公开的一种<人体胎盘核酸的制备方法及其应用>(申请号93111041.6)它是以新鲜胎盘为原料，在-10～-70℃迅速冷冻，并在低温下破碎胎盘组织，采用透析方法提取核酸，随着计划生育工作的开展，原料来源比较困难，而且制备条件比较苛刻，不易工业化生产。
本发明的目的在于提供一种以废弃的鸡血为原料，采用比较简单的生化提取技术制备核酸及核蛋白的方法。
本发明的目的可通过以下措施来实现：一种从鸡血中提取鸡核酸的方法，其特征在于：
(1)原料及处理：取新鲜鸡血并向其内加入0.5克/每100毫升鸡血的柠檬酸钠抗凝剂，
(2)从抗凝鸡血中提取细胞核，
①对沉降后的抗凝鸡血进行血细胞匀浆破碎处理，或②对沉降后的抗凝鸡血进行低渗盐溶血方法处理，或③对抗凝鸡血直接进行匀浆处理，
(3)从细胞核中提取核酸，
①浓盐法：用5～10％的氯化钠於4℃对细胞核处理20小时，且两者的体积比为细胞核∶氯化钠溶液＝1∶30，用蛋白质变性剂处理核蛋白溶液，再用无水乙醇处理核酸溶液，或②去垢剂法：用20％十二烷基磺酸钠於PH＝9.0处理细胞核终浓度2％，用蛋白质变性剂处理核蛋白溶液，再用无水乙醇处理核酸溶液，或③稀碱法：用1N氢氧化钠或氢氧化钾溶液於PH＝12.6对细胞核处理30分钟，用蛋白质变性剂处理核蛋白溶液，再无水乙醇处理核酸溶液。
一种从鸡血中提取鸡核蛋白的方法，其特征在于：
(1)原料及处理：取新鲜鸡血并向其内加入0.5克/每100毫升鸡血的柠檬酸钠抗凝剂，
(2)从抗凝鸡血中提取细胞核，
①对沉降后的抗凝鸡血进行血细胞匀浆破碎处理，或②对沉降后的抗凝鸡血进行低渗盐溶血方法处理，或③对抗凝鸡血直接进行匀浆处理，
(3)从细胞核得到核蛋白，用5～10％氯化钠溶液於4℃对细胞核处理20小时且两者的体积比为细胞核∶氯化钠溶液＝1∶30，得到的核蛋白溶液或用乙醇处理或用冷水处理。
本发明提取核酸的方法主要包括如下过程：(1)原料及其处理：本发明的原料为家禽血，最好是鸡血。为防止新鲜鸡血凝结不便操作，因此必须向新鲜鸡血中加入抗凝剂。该抗凝剂可以是草酸钠、最好是柠檬酸钠，用量为每100毫升鸡血添加0.5克柠檬酸钠。(2)从鸡血中提取细胞核：可以有三种做法①对沉降后的抗凝鸡血进行血细胞匀浆破碎处理，a取抗凝的鸡血，通过离心法或自然沉降法去除上层血浆，收集下层的血细胞。b将血细胞进行匀浆破碎处理，使其释放出细胞核，离心收集细胞核洗涤备用。②对沉降后的抗凝鸡血用溶血方法处理：a取抗凝鸡血通过离心法和自然沉降法去除上层血浆，收集下层的血细胞，b将血细胞用溶血方法处理，使其释放出细胞核该溶血方法包括低渗盐溶液处理法和氮气空化作用处理法，最好是采用低渗盐溶液处理法，即用0.2％的氯化钠溶液对血细胞处理30分钟，两者的体积比为血细胞∶0.2％氯化钠＝1∶8，离心收集细胞核洗涤备用。③对抗凝鸡血直接进行匀浆处理：a取抗凝鸡血直接进行匀浆处理，使细胞破碎，释放出细胞核，b离心去掉含血浆和血红蛋白的上清液，收集细胞核洗涤备用。(3)从细胞核中提取核酸：可以有三种方法
①浓盐法
a用5～10％的氯化钠，最好是10％氯化钠浓盐液处理细胞核，两者的体积比为细胞核液∶氯化钠溶液＝1∶30，於4℃处理20小时，得到粘稠的核蛋白溶液。
b用蛋白质变性剂处理核蛋白溶液，其蛋白质变性剂有多种，如苯酚、氯仿、二乙基焦碳酸、硫氰酸胍、氯化胍等，它们可单独使用，也可交替或联合使用。最好是用苯酚或氯仿对核蛋白溶液进行多次处理，除去核蛋白溶液的蛋白质，即可得到核酸溶液。
c将核酸溶液用无水乙醇处理得到核酸沉淀，干燥后即为核酸干品。
②去垢剂法
a用阴离子去垢剂如十二烷基磺酸钠、磺酸十二烷基锂、磺酸十二烷肌氨酸钠、脱氧胆酸钠、4-氨基水扬酸钠、萘-1.5二磺酸钠、三异丙基磺酸钠、最好是用20％十二烷基磺酸钠，对细胞核进行处理，在PH＝9.0处理约30分钟终浓度为2％，得到粘稠的核蛋白溶液。
b与浓盐法步骤b相同。
c与浓盐法步骤c相同。
③稀碱法
a采用稀碱液处理细胞核，
用1N的强碱溶液(氢氧化钠或氢氧化钾)在PH＝12.6小时处理30分钟，得到粘稠的核蛋白溶液。
b与浓盐法步骤b相同。
c与浓盐法步骤c相同。
本发明提取核蛋白的方法：
(1)采用与上述相同的原料及处理，得到抗凝鸡血。
(2)采用与上述相同的提取核酸的方法，从鸡血得到细胞核。
(3)从细胞核得到核蛋白：采用浓盐液5～10％氯化钠，最好是10％氯化钠处理细胞核，两者的体积比为细胞核液∶氯化钠溶液＝1∶30，於4℃处理20小时，得到粘稠的核蛋白溶液。该核蛋白溶液可以用乙醇处理：向核蛋白溶液中加无水乙醇，使核蛋白沉淀，将核蛋白沉淀干燥即为核蛋白干品，或者将核蛋白溶液用冷水处理：向核蛋白溶液中加冷水，使溶液中氯化钠终浓度为0.9％，得到核蛋白沉淀，将核蛋白沉淀干燥即为核蛋白干品。
本发明相比现有技术具有如下优点：
本发明的方法原料来源充足，是切实可行的工业化生产核酸的方法，采用本发明的方法制得的核酸成本低、收率高，同时又解决了家禽血的污染，为它们的综合利用开辟了新的途径。本发明的方法适用性强，可针对不同的核酸使用目的和要求采用不同的核酸提取方法。
例1
取240ml新鲜鸡血加入柠檬酸钠1.2克，可得到240ml的抗凝鸡血。
例2
取142ml抗凝鸡血，离心(1500rpm)20分钟，倾去上清液，得47ml血细胞。然后向其内加入100ml生理盐水，得到血细胞液。将上述血细胞液用匀浆机(10000转/分)匀浆5分钟，经镜检血细胞破碎，无完整细胞膜，离心(2000rpm)10分钟，倾去上清液。沉淀用生理盐水洗涤、离心两次，得到的沉淀为细胞核。
例3
取3ml置于4℃冰箱中过夜的抗凝鸡血，倾去上清液得1ml血细胞。然后向其内加入8ml 0.2％氯化钠溶液，混匀，室温放置30分钟。经镜检血细胞破碎，无完整细胞膜，离心(2000rpm)10分钟，倾去上清液，沉淀用生理盐水洗涤、离心两次，得到的沉淀为细胞核。
例4
取350ml抗凝鸡血，用匀浆机(10000转/分)匀浆6分钟，经镜检血细胞破碎，无完整细胞膜，离心(2000rpm)10分钟，倾去含血浆和血红蛋白的上清液，沉淀用生理盐水洗涤、离心两次，得到的沉淀为细胞核。
例5
取3.3ml细胞核加10％氯化钠溶液100ml搅拌均匀，於4℃冰箱过夜得到粘稠的核蛋白溶液。向上述核蛋白溶液中加200ml水，用1NNaOH调PH＝8，再加150ml饱和苯酚〔0.5MTris-HCL、0.1MEDTA、0.1MNaCl缓冲液，PH＝8，苯酚∶缓冲液＝70∶30(体积比)〕混合均匀，离心(2000rpm)20～30分钟，取上清液再加入50ml饱和苯酚处理两次，得到270ml上清液，(核酸溶液)。向上述的核酸溶液加入2倍体积的无水乙醇，得到核酸沉淀，将沉淀烘干可得到核酸干品0.216克，收率0.72克/100ml血。
例6
取1ml细胞核加8ml生理盐水，用1N氢氧化钠调PH＝9.0，加1ml 20％的十二烷基磺酸钠，混匀后于4℃冰箱过夜得SDS处理液，然后加60ml生理盐水稀释，用等体积水饱和苯酚液(PH＝8.0)混匀，离心(2000rpm)20～30分钟，取上清液再加入25ml的水饱和苯酚液处理一次，得到70ml上清液(核酸溶液)。向上述的核酸溶液加2倍体积的无水乙醇得到核酸沉淀，将沉淀烘干可得到核酸干品0.11克、收率1.18克/100ml血。
例7
重复例6的操作，其中取SDS处理液10ml，加入5ml氯仿，剧烈振荡20分钟，离心(3000rpm)30分钟，取上清液加2.5ml氯仿剧烈振荡，再离心30分钟，取上清液即为核酸溶液。最后可得到核酸干品0.08克、收率0.86克/100ml血。
例8
取1ml细胞核加4ml生理盐水稀释，用1N氢氧化钠调溶液的PH值，使PH＝12.6，处理30分钟后用等体积水饱和苯酚液(PH＝8.0)混匀，离心(2000rpm)20～30分钟，得到6ml上清液(核酸溶液)，向上述核酸溶液加2倍体积的无水乙醇得到核酸沉淀，将沉淀烘干可得到核酸干品1.0克，收率1.07克/100ml血。
例9
取1.67ml细胞核加10％氯化钠溶液50ml，搅拌均匀，於4℃冰箱过夜，得到粘稠的核蛋白溶液。向上述核蛋白溶液中加2倍体积的无水乙醇使核蛋白完全沉淀，将核蛋白沉淀干燥得0.23克核蛋白干品，收率1.5/100ml血。
例10
取1.67ml细胞核加5％氯化钠溶液50ml搅拌均匀，於4℃冰箱过夜，得到粘稠的核蛋白溶液。向上述核蛋白溶液中加冷水，使溶液中氯化钠终浓度为0.9％，得到的核蛋白沉淀经干燥得到0.14克核蛋白干品，收率0.9克/100ml血。
Claims (2)
1、一种从鸡血中提取鸡核酸的方法，其特征在于：
(1)原料及处理：取新鲜鸡血并向其内加入0.5克/每100毫升鸡血的柠檬酸钠抗凝剂，
(2)从抗凝鸡血中提取细胞核，
①对沉降后的抗凝鸡血进行血细胞匀浆破碎处理，或②对沉降后的抗凝鸡血进行低渗盐溶血方法处理，或③对抗凝鸡血直接进行匀浆处理，
(3)从细胞核中提取核酸，
①浓盐法：用5～10％的氯化钠於4℃对细胞核处理20小时，且两者的体积比为 细胞核∶氯化钠溶液＝1∶30，用蛋白质变性剂处理核蛋白溶液，再用无水乙醇处理核酸溶液，或②去垢剂法：用20％十二烷基磺酸钠於PH＝9.0处理细胞核终浓度2％，用蛋白质变性剂处理核蛋白溶液，再用无水乙醇处理核酸溶液，或③稀碱法：用1N氢氧化钠或氢氧化钾溶液於PH＝12.6对细胞核处理30分钟，用蛋白质变性剂处理核蛋白溶液，再用无水乙醇处理核酸溶液。
2、一种从鸡血中提取鸡核蛋白的方法，其特征在于；
(1)原料及处理：取新鲜鸡血并向其内加入0.5克/每100毫升鸡血的柠檬酸钠抗凝剂，
(2)从抗凝鸡血中提取细胞核，
①对沉降后的抗凝鸡血进行血细胞匀浆破碎处理，或②对沉降后的抗凝鸡血进行低渗盐溶血方法处理，或③对抗凝鸡血直接进行匀浆处理，
(3)从细胞核得到核蛋白，用5～10％氯化钠溶液於4℃对细胞核处理20小时且两者的体积比为 细胞核∶氯化钠溶液＝1∶30，得到的核蛋白溶液或用乙醇处理或用冷水处理。
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