CN106232614A - 蛋白质提取方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于从生物样品中提取DNA压缩蛋白质的方法。

Description

蛋白质提取方法

背景技术

本文所公开的实施方案涉及用于从蛋白质制剂中提取DNA压缩蛋白质(DNA-compaction protein)的方法。

已经描述了用于提取和表征DNA压缩蛋白质的方法。一种这样的方法涉及将样品暴露于高浓度的氯化钠，如2.5M。另一种方法涉及暴露于低pH，如pH 1.0或更低，持续最长达16小时。氯化钠和低pH的组合尚未被使用，推测起来是因为它们被理解的作用机理是彼此对立的。已经描述了对于两种技术中的任一种使用表面活性剂连同通过尺寸排阻色谱进行的随后处理。

发明内容

在一些方面，本文所公开的实施方案提供了用于从制剂中提取DNA压缩蛋白质的方法，所述方法包括在约0.1到约1.0的pH下使制剂与有机阳离子、中性盐和非离子型表面活性剂接触，温育所述混合物约30分钟到约150分钟的一段时间；去除固体以提供提取物，将所述提取物施加到颗粒填充柱，所述颗粒填充柱包含(1)适于实施空隙排阻模式的阴离子交换色谱的正电性颗粒，或(2)具有约5,000道尔顿的排阻极限的基本上不带电荷的尺寸排阻色谱颗粒，其中所述颗粒填充柱具有颗粒间体积，其中所施加的提取物的体积不大于所述颗粒间体积，在施加步骤之后，随后用缓冲液沿所述柱向下置换样品，并收集对应于所述柱的排阻体积的峰中的所提取的DNA压缩蛋白质。

附图说明

图1显示了色谱图，显示了通过以空隙排阻模式操作的正电性颗粒柱对初始提取物进行的分级分离。以灰色突出显示的峰包含提取的组蛋白蛋白质。

具体实施方式

在一些实施方案中，提供了用于从含有期望蛋白质的生物制剂中提取DNA压缩蛋白质的方法，其包括初始提取步骤，所述初始提取步骤包括使所述制剂与阳离子型有机化合物、浓度为约1到约3M的中性盐和非离子型表面活性剂的组合在约0.1到约1.0范围的pH下接触约30分钟到约2小时，以提供提取物样品；然后是最终提取步骤，其包括将所述提取物样品施加到填充有适于进行空隙排阻模式的分级分离的正电性颗粒的柱、或者填充有具有约5,000道尔顿的排阻极限的基本上不带电荷的多孔颗粒的柱；其中所施加的样品在它进入所述柱时的体积小于或等于所述柱的颗粒间体积；在施加步骤之后，随后用缓冲液沿所述柱向下置换样品，并收集对应于所述柱的排阻体积的峰中的所提取的DNA压缩蛋白质。

在一些实施方案中，提供了用于从制剂中提取DNA压缩蛋白质的方法，所述方法包括在约0.1到约1.0的pH下使制剂与有机阳离子、中性盐和非离子型表面活性剂接触，温育所述混合物约30分钟到约150分钟的一段时间；去除固体以提供提取物，将所述提取物施加到颗粒填充柱，所述颗粒填充柱包含(1)适于以空隙排阻模式实施阴离子交换色谱的正电性颗粒，或(2)具有约5,000道尔顿的排阻极限的基本上不带电荷的尺寸排阻色谱颗粒，其中所述颗粒填充柱具有颗粒间体积，其中所施加的提取物的体积不大于所述颗粒间体积，在施加步骤之后，用缓冲液沿所述柱向下置换样品，并收集对应于所述柱的排阻体积的峰中的所提取的DNA压缩蛋白质。

在一些实施方案中，有机阳离子选自由胍依沙吖啶、亚甲蓝、道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、氯己定、阿来西定(alexidine)、苯扎氯铵、三(2-氨乙基)胺、十六烷基三甲基铵、聚乙烯亚胺和其组合组成的组。

在一些实施方案中，依沙吖啶或亚甲蓝的浓度在选自由非零量到0.05％(重量/体积)、0.01％到0.1％、0.02到0.05％和0.03％到0.10％组成的组的范围。

在一些实施方案中，胍的浓度在选自由0.5到1.5M、0.8到1.2M和0.9到1.1M组成的组的范围。

在一些实施方案中，中性盐以约1M到约3M的浓度范围存在。

在一些实施方案中，中性盐是氯化钠或氯化钾。

在一些实施方案中，非离子型表面活性剂选自由Tween 20、Tween 40、Tween 60和Nonidet NP40组成的组。

在一些实施方案中，非离子型表面活性剂以约0.05％到约0.25％w/v的浓度范围存在。

在一些实施方案中，DNA压缩蛋白质包括一种或多种组蛋白蛋白质。

在一些实施方案中，所述制剂选自由细胞培养物上清液、体液、组织均质物、来自分离分级过程的级分组成的组。

在一些实施方案中，期望的非组蛋白蛋白质是天然存在的蛋白质或重组蛋白质。

在一些实施方案中，期望的非组蛋白蛋白质选自由抗体、IgG、IgM、非抗体蛋白质组成的组。

在一些实施方案中，可以从初始提取步骤中省略阳离子型有机化合物。

在一些实施方案中，可以省略色谱最终提取步骤。

在一些实施方案中，提供了配置成进行本文所公开的方法的试剂盒。

DNA压缩蛋白质的提取是具有挑战性的，因为强的自缔合和与DNA的相互作用。虽然用于提取的试剂在市面有售，但已经发现，声称支持有效提取的方法显著低估了存在的实际量。除此之外，显然不能从更复杂的结构如核小体中完全释放DNA压缩蛋白质如组蛋白。已知的提取条件还在长提取过程中降解组蛋白，并且加剧低估。已经发现，被现有的提取方法分别采用的通过高盐进行的电荷抑制和低pH下的电荷排斥的主要机理是相互对立的，并且当一起使用时可能产生甚至更大的组蛋白含量的低估，除非在特定范围内。现有的组蛋白提取方法的另一个问题是，如果提取环境变回生理环境，则组蛋白变得不能平行检测，因为它们在未提取的样品中。这暗示已知的组蛋白检测方法取决于含有组蛋白的结构如核小体的暂时失稳，以暴露组蛋白抗原位点，这进而表明现有的提取方法仅在样品位于提取环境中时才能实现那些抗原位点的暴露。

已经出乎意料地发现，被使用并被认为揭示含有通过细胞培养产生的期望重组蛋白质的制剂中所有污染性宿主蛋白质的量的宿主蛋白质测定不能准确地检测DNA压缩蛋白质，包括组蛋白。实验数据记录被认为揭示总宿主蛋白质的宿主蛋白质测定将组蛋白含量低估超过20,000倍(P.Gagnon等，J.Chromatogr.A 1340(2014)68-78)。这代表了生物药物的纯化中的一个重大问题，因为这意味着用于组蛋白去除的纯化方法由于该能力而不能被评价或选择，并且用于人类疗法的最终产品可能含有不安全的污染物载荷。

准确的组蛋白定量的问题延伸到测定校准标准。由于难以实现从天然来源有效提取组蛋白，因此一些供应商已经开发出了过表达一种组蛋白以使得组蛋白不与核小体中的DNA结合的细胞培养方法。这代表了自身与天然含有组蛋白的样品的组成的偏离，这种偏离代表了分析误差的潜在来源，并且由于此类“校准”溶液仅含有单一组蛋白物质(通常为H3)的事实而被加剧。它代表了达到以下程度的另一错误来源：在细胞质表达或从细胞分泌的该组蛋白不经历与天然组蛋白相同的翻译后修饰。

本文公开了一种更有效的组蛋白提取方法，所述方法包括使含有组蛋白的制剂与包含阳离子型有机化合物、浓度为约1到约3M的中性盐、浓度为约0.01％到约0.25％的非离子型表面活性剂的要素和条件的组合在约0.1到约1.0的pH下接触30分钟到2小时；然后将所述样品施加到填充有适于进行空隙排阻模式的阴离子交换色谱的正电性颗粒的柱，或者施加到填充有具有约5,000道尔顿的排阻极限的基本上不带电荷的多孔颗粒的柱；其中所施加的样品在它进入所述柱时的体积小于或等于所述柱的颗粒间体积；并收集对应于所述柱的排阻体积的峰中的所提取的组蛋白蛋白质。这产生了比依赖于以下的提取方法更高的组蛋白回收率：pH 1、或2.5M NaCl、或者与0.1％非离子型表面活性剂NP40组合、或所有上述物质、或任何浓度的胍自身。出乎意料地，通过所公开的方法提取的组蛋白在缓冲制剂回复到生理条件时不与DNA和其它染色质成分重组装。这与已知的提取方法如单独的低pH形成根本对比，其中低pH提取的样品恢复到生理条件导致组蛋白组分变得与在未提取的样品中一样难以检测。术语“生理条件”在本上下文中被理解为指约6.5到约7.5的pH和约12到约16毫西门子/cm(mS/cm)的电导率。不受理论的束缚，据信所公开的方法避免这种限制的能力可能源于在色谱分离的最后步骤期间含有组蛋白的级分与仍未识别的重组装促进成分的分离。当使用空隙排阻模式的阴离子交换色谱作为最终提取步骤时，似乎残余DNA可能是去除的主要重组装促进组分，并且它通过结合到正电性颗粒的表面而被去除。无论什么机理，本文的方法防止提取后重组装的能力均允许提取的样品处于不干扰后续免疫测定的生理条件下，而低pH提取通常要求检测抗体也在低pH下应用，这可能通过损害检测抗体或抑制其抗原结合动力学来减少信号。最终色谱分离的另一益处在于，它使得提取的样品可以得到基本上相同的结果，尽管初始样品的盐浓度或pH有适度变化，这与已知的提取方法如低pH不同，其中盐浓度的变化有助于通过后续测定获得的值的实质性假变化。最终色谱分离的另一益处在于，它使得所有提取的样品都可以存在于相同的条件下，而不管它们的初始样品的pH和电导率，其中相关系列样品之间的条件一致性被理解为有助于更好的总准确度和该系列样品之间的组蛋白值的可比性。该益处延伸到用于最终色谱分离的标准化缓冲液的使用，其使得可以在不同时间分析的样品之间能够具有更好的一致性和可再现性，并且还使得所公开的方法能够以试剂盒形式实施。特别是当色谱介质是正电性时实现的另一益处在于，所述提取方法选择性地去除可能干扰后续免疫测定的大比例的酸性污染物。如所暗示的，这使得提取的组蛋白处于相对纯化的状态，表明所公开的方法可以用于制备用于定量测定的样品，或用于纯化具有准确代表天然组蛋白分布的组成的校准标准物，或用于纯化用于其它目的的样品。源于样品暴露于低pH和升高的盐浓度的相对短的持续时间的所公开的方法的另一益处在于，它与已知的提取方法如低pH相比减少了总测定时间。源于样品暴露于低pH和升高的盐浓度的相对短的持续时间的所公开的方法的另一的益处在于，它降低了对提取的组蛋白的损害，这是在低pH下提取的慢性问题，因为它也降低了提取的组蛋白的可检测性，这导致组蛋白含量的低估和结果的不受控可变性的增加。

在一个示例性实施方案中，可以通过添加足以实现将pH降低至约0.1到约1.0的酸(如体积比例为约15％v/v的200mM盐酸)，将待提取的样品的pH降低至约0.1到约1.0。将氯化钠添加到2M的最终浓度。将阳离子型有机化合物胍添加到0.25M的最终浓度。将非离子型表面活性剂Nonidet NP40添加到0.1％的最终浓度，并且将混合物在室温下温育1小时。通过任何适当的方法如过滤或离心来去除固体。用基于尺寸排阻的缓冲液交换色谱介质如Sephadex G25填充柱，然后将其平衡到50mM Hepes，100mM NaCl，pH 7.0。将澄清的样品施加到柱，使得施加的样品在它进入柱时的体积不超过填充床的颗粒间体积。将另外的缓冲液施加到柱以使样品输送通过该柱。收集含有提取的组蛋白并在平衡缓冲液中洗脱的第一峰。

在另一示例性实施方案中，可以通过添加足以实现该条件的酸(如体积比例为约15％v/v的200mM硫酸)，将待提取的样品的pH降低至约1。将氯化钠添加到3M的最终浓度。将阳离子型有机化合物胍添加到0.2M的最终浓度。将非离子型表面活性剂Tween-20添加到0.1％的最终浓度，并且将混合物在室温下温育1小时。通过任何适当的方法如过滤或离心来去除固体。用阴离子交换色谱介质如UNOsphere Q填充柱，然后将其平衡到50mM Tris，pH8.0。将澄清的样品施加到柱，使得施加的样品在它进入柱时的体积不超过填充床的颗粒间体积。将另外的缓冲液施加到柱以使样品输送通过该柱。收集含有提取的组蛋白并在平衡缓冲液中洗脱的第一峰。例如，参见下面的图1和实施例7。实验数据表明，与使用填充有名义上不带电荷的多孔颗粒的柱的方法相比，这种方法产生更高的组蛋白回收率和高得多的组蛋白纯度水平，两者都是相对于不存在酸性蛋白质和明显不存在含有DNA的核小体残余物的情况而言。

在另一示例性实施方案中，通过添加足以实现该条件的酸(如体积比例为约15％v/v的200mM硫酸)，将待提取的样品的pH降低至约0.1到约1.0。将氯化钠添加到1M的最终浓度。将阳离子型有机化合物依沙吖啶添加到最终浓度0.025％(w/v)。将非离子型表面活性剂NP40添加到0.1％的最终浓度，并且将混合物在室温下温育1小时。通过任何适当的方法如过滤或离心来去除固体。用阴离子交换色谱介质如Nuvia Q填充柱，然后将其平衡到50mMHepes，pH 7.0。将澄清的样品施加到柱，使得施加的样品在它进入柱时的体积不超过填充床的颗粒间体积。将另外的缓冲液施加到柱以使样品输送通过该柱。收集含有提取的组蛋白并在平衡缓冲液中洗脱的第一峰。将澄清的样品施加到柱，使得施加的样品在它进入柱时的体积不超过填充床的颗粒间体积。将另外的缓冲液施加到柱以使样品输送通过该柱。收集含有提取的组蛋白并在平衡缓冲液中洗脱的第一峰。

在另一示例性实施方案中，通过添加足以实现该条件的酸(如体积比例为约0.8％v/v的200mM硫酸)，将待提取的样品的pH降低至约0.1到1.0。将氯化钠添加到1.5M的最终浓度。将阳离子型有机化合物亚甲蓝添加到最终浓度0.025％(w/v)。将非离子型表面活性剂NP40添加到0.1％的最终浓度，并且将混合物在室温下温育1小时。通过任何适当的方法如过滤或离心来去除固体。用阴离子交换色谱介质如UNOsphere Q填充柱，然后将其平衡到50mM Hepes，100mM NaCl，pH 7.0。将澄清的样品施加到柱，使得施加的样品在它进入柱时的体积不超过填充床的颗粒间体积。将另外的缓冲液施加到柱以使样品输送通过该柱。收集含有提取的组蛋白并在平衡缓冲液中洗脱的第一峰。

在一些实施方案中，阳离子型有机化合物可以是氯己定、苯扎氯铵、阿来西定、三(2-氨乙基)胺或聚乙烯亚胺或十六烷基三甲基溴化铵或前述的组合，潜在地包括依沙吖啶、亚甲蓝、道诺霉素、多柔比星和/或胍。不归于任何特定理论，实验数据表明这些化合物上的正电荷可以增强它们与核小体的DNA组分的相互作用，从而竞争性地减弱DNA压缩蛋白质与DNA的相互作用。在胍的情况下，其提取增强效果可以通过其作为离液剂的作用进一步被介导。在依沙吖啶、道诺霉素、多柔比星和/或亚甲蓝的情况下，它们的提取增强作用可以通过它们嵌入DNA结构中的能力进一步被介导，引起DNA的部分解旋，从而削弱DNA和DNA压缩蛋白质如组蛋白的相互作用。

在一些实施方案中，初始样品组成在pH、电导率、盐种类、细胞培养基组分或期望重组蛋白质的特征方面可以不受限制。在一些实施方案中，一系列样品内的初始样品组成可以随一个或多个参数系统地变化，例如来自先前吸附色谱纯化步骤的级分，其可以随以下因素而彼此不同：盐含量或pH或另一参数的增加或降低，以及每种潜在地含有不同的蛋白质亚组。在一些实施方案中，一系列样品中的初始样品组成可以相对于从一个样品到下一个样品存在的蛋白质亚组而变化，但是条件可以是几乎不变的，例如当样品源于尺寸排阻色谱步骤时。

在一些实施方案中，用于色谱步骤的缓冲液也可以是其中存在最终提取的样品的缓冲液。在一些此类实施方案中，最终缓冲液可以仅含有缓冲组分并且缺少另外的盐或其它组分，如防腐剂或冷冻保护等。在一些此类实施方案中，最终缓冲条件可以合理地模拟生理条件。在一些此类实施方案中，相同的缓冲剂可以用于处理相关组中的所有样本。在一些此类实施方案中，相同的缓冲剂可以用于处理不相关组中的所有样本。

在一些实施方案中，初始提取pH可以是约0.1到1.0。在一些此类实施方案中，通过向样品中添加200mM盐酸或硫酸或另一酸或酸的组合来实现提取pH。在一些此类实施方案中，通过以15％v/v的比例向样品中添加约200mM酸来实现提取pH。在一些实施方案中，添加的酸的体积比例可以是5％到50％、或10％到25％、或12.5％到17.5％。在一些实施方案中，酸的浓度可以是100mM或200mM或300mM，或更低、中间或更高的浓度。在一些此类实施方案中，酸的体积和浓度将被调节为实现目标pH的酸的最低量。在一些实施方案中，目标pH可以在0.1到1.0、或0.2到0.9、或0.3到0.8、或0.4到0.7、或0.5到0.6的范围、或不同的范围或中间值。在一些实施方案中，另一种酸或酸的组合可以以类似的总浓度被采用，或者如果需要，则可以以更高的浓度被采用以克服样品的缓冲效应，或者如果显示实现目标pH，则可以以更低的浓度被采用，或者以不同的比例被采用。

在一些实施方案中，提取期间中性盐的浓度可以是1M、或2M、或3M，或者在1M到3M、或1.5M到2.5M、或1.75M到2.25M、或1.8M到2.2M、或1.9M到2.1M的范围、或不同的范围或中间值。在一些此类实施方案中，中性盐将是NaCl或KCl、或其组合、或另一中性盐。在一些实施方案中，盐可以作为液体浓缩物被添加。在一些实施方案中，中性盐可以作为固体被添加。

在一些实施方案中，阳离子型有机化合物可以是作为游离碱或盐(如硫酸胍或盐酸胍或乙酸胍)添加的胍离子。在一些此类实施方案中，最终提取混合物中的胍离子的浓度将是小于2M的非零量。在一些此类实施方案中，所述浓度可以是0.05M、或0.1M、或0.15M、或0.2M、或0.25M、或0.5M、或1.0M或1.5M。在一些此类实施方案中，胍浓度可以在1.5M到0.05M、或1M到0.1M、或0.5M到0.15M、或0.4M到0.2M的范围、或不同的范围或中间浓度。在一些实施方案中，阳离子型离液剂可以作为液体浓缩物被添加。在一些实施方案中，阳离子型离液剂可以作为固体被添加。在一些实施方案中，胍离子可以不存在。

在一些实施方案中，阳离子型有机化合物可以是浓度为0.025％(w/v)、或0.01％、或0.1％、或浓度为0.01％到0.1％或中间值的依沙吖啶或亚甲蓝。

在一些实施方案中，非离子型表面活性剂可以是Nonidet NP40或Tween-20、或Tween-40或Tween-60。在一些此类实施方案中，表面活性剂浓度可以是0.01％、或0.025％、或0.05％、或0.075％、或0.1％、或0.25％、或0.5％，或在1％到0.01％、0.5％到0.05％、或0.25％到0.025％、或0.2％到0.02％、或0.15％到0.05％、或0.125％到0.075％、或1.1％到0.9％范围、或不同的范围或中间值。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂可以是除NP40或Tween以外的物质，如Triton或Brij或其它物质。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂可以被两性离子型表面活性剂如CHAPS、CHAPSO或八葡糖苷(octaglucoside)代替。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂可以被阴离子型表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵代替。

在一些实施方案中，初始提取的时间可以是15分钟、或30分钟、或60分钟、或120分钟、或150分钟、或180分钟、或更长。实验数据表明组蛋白的降解以大于1小时的间隔发生，但以两小时仍然相当小，尽管以更长的间隔更严重。30分钟的间隔倾向于产生比60分钟更低的表观值，这表明1小时为合理的最少提取时间，但是存在在一些情况下可能优选中间持续时间的可能性。在一些此类实施方案中，可以谨慎地评价30分钟到150分钟、或45分钟到90分钟、或50分钟到70分钟的范围、或其它间隔或中间值。数据表明样品组成可能影响最有效的持续时间，并且已含有死细胞达最长时间的样品最可能需要最长的酸暴露间隔，因为它们将代表如下情况：其中期望蛋白质产物将具有与细胞外染色质相互作用、从而潜在地导致形成抵抗解离的聚集体的最大机会。

在一些实施方案中，用于最终提取步骤的色谱介质可以包含如用于实施阴离子交换色谱技术的正电性多孔颗粒。在一些此类实施方案中，阴离子交换介质可以根据它们已知的支持空隙排阻模式的阴离子交换色谱技术的能力来进行具体选择，如R.Nian等(J.Chromatography A 1282(2013)127-132)所述。在一些此类实施方案中，阴离子交换介质可以是UNOsphere Q(Bio-Rad Laboratories)。在一些此类实施方案中，阴离子交换介质可以是Nuvia Q(Bio-Rad Laboratories)。在一些此类实施方案中，阴离子交换介质可以是Capto Q(GE Healthcare)或适于实施该技术的另一种阴离子交换剂。在一些实施方案中，样品在其进入柱时的体积将小于柱的颗粒间体积。在一些此类实施方案中，样品的体积可以比柱的颗粒间体积小1％。在一些此类实施方案中，样品的体积可以比颗粒间体积小5％，或小10％，或小20％，或小50％，或小90％，或小99％，或降低到小于非零量的任何样品体积，但样品体积通常不应超过颗粒间体积。

在其中将空隙排阻模式的阴离子交换介质用于最终提取步骤的一些实施方案中，选择用于进行该步骤的平衡缓冲液可以通过在最低电导率下体现碱性pH而有益，在该最低电导率下，期望的非组蛋白蛋白质(如果存在)保持可溶并且不被阴离子交换介质保留。在其中使用空隙排阻模式的阴离子交换介质来纯化用作校准标准物或用于其它目的的组蛋白，并且不存在期望的非组蛋白蛋白质的一些实施方案中，在最低电导率下采用碱性pH可能是有益的，在该最低电导率下，组蛋白保持稳定并且不被阴离子交换介质保留。因此，pH可以是8.0、或9.0或9.5、或10.0、或更高。在一些此类实施方案中，盐将不存在。在一些此类实施方案中，可以选择缓冲物质以赋予缓冲液最低电导率。例如，两性离子缓冲液通常赋予缓冲液自身可忽略的电导率，并且存在的任何电导率均可归因于用于调节其pH的抗衡离子。对于本领域技术人员将显而易见的是，pH越高且电导率越低，将与组蛋白蛋白质的提取同时发生的从样品中去除的酸性物质的多样性越大。将同样显而易见的是，这些条件将最可能去除含有DNA的核小体残余物，因为它们将有利于DNA结合到交换剂的正电性表面，同时使组蛋白组分的电荷排斥最小化。换句话说，此类条件将产生最高的组蛋白纯度，特别是就DNA的去除而言。当目的是获得用作校准标准物的高度纯化的组蛋白或获得纯化的组蛋白使得它们可以被表征时，这可以被预期是有利的。本领域技术人员将知道如何按比例扩大提取技术以获得任何期望量的纯化组蛋白。

在一些实施方案中，用于最终提取步骤的色谱介质可以包含如用于实施缓冲液交换色谱技术的尺寸排阻色谱颗粒。在一些此类实施方案中，缓冲液交换介质可以体现对应于质量为约5,000D的假定球状蛋白质的排阻极限。在一些此类实施方案中，缓冲液交换介质可以是Sephadex G25。在一些此类实施方案中，通过由制造商进行的粒度分级(particlesizing)来改变介质的粒度分布，其中例如对于Sephadex G25，最小的粒度分布将与称为超细的G25等级相关，并且略大的粒度分布将与称为细的G25等级相关，并且略高的粒度分布将与称为中的G25等级相关，并且略高的粒度分布将与称为粗的G25等级相关。在一些实施方案中，具有约5,000D的排阻极限的多孔颗粒可以由其它聚合物如Trisacryl GF05构造，Trisacryl GF05被理解为由丙烯酰胺聚合物制成，相比之下，葡聚糖聚合物用于Sephadex。在一些实施方案中，可以使用具有更低排阻极限的尺寸排阻介质如Sephadex G10实现更高的组蛋白回收率。一般来说，由此类介质提供的分级分离的能力和质量将是最高的，具有对应于最小和最窄粒度分布的等级。在一些实施方案中，样品在其进入柱时的体积将小于柱的颗粒间体积。在一些此类实施方案中，样品的体积可以比柱的颗粒间体积小1％。在一些此类实施方案中，样品的体积可以比颗粒间体积小5％，或小10％，或小20％，或小50％，或小90％，或小99％，或降低到任何更小的非零量。

在将尺寸排阻介质用于最终提取步骤的一些实施方案中，选择用于进行该步骤的平衡缓冲液可以体现宽范围的条件而不降低总组蛋白提取效率。pH可以在4到10范围，电导率可以在小于1mS/cm到50mS/cm或更大范围，缓冲液可以含有表面活性剂或其它添加剂。

在其中用正电性色谱介质或用尺寸排阻色谱介质进行最终提取步骤，并且进行所公开的方法的目的被用于制备用于组蛋白定量分析的样品的一些实施方案中，被选择用于平衡柱步骤的缓冲液将被配制以适应后续免疫测定的需要。本领域技术人员将理解，采用不同传感器的免疫测定需要不同的化学环境以实现最佳性能，并且所公开的方法适应这些需要的能力由此增加了它们的灵活性和应用范围。在例如其中所公开的方法用于提取作为校准标准物的组蛋白的一些实施方案中，被选择用于最终提取步骤的缓冲液可以被选择为组蛋白稳定缓冲液，和/或可以尤其在冷藏或冷冻条件下储存期间被配制。

定义

对术语进行了定义，使得可以更容易地理解本文的实施方案。另外的定义陈述于整个具体实施方案中。

“DNA压缩蛋白质”是指以如下方式与基因组DNA相互作用的蛋白质物质，该方式允许长DNA区段借助于由于其与一种或多种DNA压缩蛋白质物质相互作用而被折叠、螺旋或超螺旋从而位于小区域内。

“组蛋白”是指在真核生物体中发现的一组DNA压缩蛋白质物质。组蛋白通常有5种，由组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4组成。

“核小体”是指通过DNA压缩蛋白质与DNA的相互作用产生的二级结构，其中所述二级结构介导DNA的压缩。核小体通常由包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2个的核心组蛋白八聚体组成，其中DNA围绕该核心缠绕约1.5倍。核小体内组蛋白与DNA的缔合是如此强烈，以致于它们使DNA和组蛋白组分两者稳定而免受裂解、解离或构象变化，使得需要化学上严格的提取程序来使组蛋白可被免疫测定检测。

“核小体阵列”是指通过自身与组蛋白H1缔合的接头DNA的一部分以线性排列连接的2个或更多个核小体。

“染色质”是指基因组DNA以及缔合的DNA压缩蛋白质和其它成分。染色质在细胞死亡后立即开始降解，导致形成不同大小的核小体阵列、单个核小体、组蛋白和DNA。

“颗粒间体积”是指来自填充在三维空间如色谱柱中的颗粒的空间。颗粒间体积通常指柱的空隙体积、或柱空隙、或简单地指空隙。术语颗粒间体积被认为是最准确的，因为空隙体积有时用于指颗粒的深内部体积，由于扩散质量输送的无效性或者由于孔仅仅是浅的而从未实现蛋白质进入其中。在典型的系统中，重力沉降颗粒柱中的空隙体积构成总床体积的约40％。

“排阻极限”是指可以进入基于多孔颗粒的色谱介质的孔中的最大蛋白质的尺寸。这被理解为基于假定的球状(球形)蛋白质的任意准则。例如，排阻极限为5,000D的色谱介质将允许小于5,000D的蛋白质扩散到其孔中，而大于5,000D的蛋白质将不能扩散到此类孔中。天然存在的蛋白质被理解为不是完全球形的，因此该示例被理解为是不现实地严格的，然而，由介质制造商公布的排阻极限可用于鉴别分子的粗略尺寸等级的候选介质。

“空隙排阻”在它用于名义上不带电荷的多孔颗粒，如用于尺寸排阻色谱时，是指其中大于排阻极限的蛋白质和/或其它溶质被它们的尺寸限制于柱的颗粒间体积的现象。“空隙排阻”在它用于正电性颗粒时，是指其中蛋白质和/或其它溶质的亚组被它们的电荷性质限制于柱的颗粒间体积的现象。Nian等(见上文)提供了电正性颗粒柱中的空隙排阻的详细讨论。在通过尺寸和通过电荷两者进行的空隙排阻的情况下，柱载荷类似地被限制于不大于柱的颗粒间体积的样品体积；并且在两种情况下，从柱洗脱的第一峰均被理解为含有原始样品的在它们通过柱期间被排阻到颗粒间体积(空隙体积)中的组分。该峰通常被称为空隙峰、空隙排阻峰或排阻峰。

“阳离子”是指带正电荷的离子。

“阴离子”是指带负电荷的离子。

“非离子”是指缺乏电荷的离子。

“两性离子”是指同时带有处于平衡的正电荷和负电荷的化合物，其中正电荷抵消正电荷的作用，反之亦然，使得所述化合物上的净电荷为零。

“离液剂”是指倾向于使蛋白质或其它生物分子变性的化合物，其中术语变性被理解为意指将结构松弛到蛋白质失去其天然功能并且在极端情况下可能完全失去可识别的结构特征的程度。通常已知的离液剂包括胍离子(阳离子)、脲(非离子)和硫氰酸盐(阴离子)。

在某些实施方案中，所公开的方法可以在不偏离上述一般实例的情况下被应用，以获得给定样品的组蛋白含量的良好定量估计。一般来说，最初应当利用正电性多孔颗粒柱进行涉及色谱步骤的第二提取阶段，因为实验数据显示它们支持最高的组蛋白回收率和纯度。考虑到原始未提取样品相对于最初存在于样品中的含组蛋白实体的组成而变化的潜力，可以谨慎地检查某些变量以确保条件与样品适当匹配。例如，在通过活细胞的均质化获得的样品中，组蛋白将几乎排他性地与核小体缔合。此类样品可以被优选用于制备校准标准物。在源于含有死细胞的生物流体的样品中，实验显示核小体和它们的降解副产物已变得与细胞产生的其它蛋白质缔合(P.Gagnon等，见上文)，这可以使组蛋白更抵抗提取；或由于先前缔合DNA的酶裂解总组蛋白群体的亚组可以没有阻塞，这潜在地使它们更易于降解。在一些实施方案中，期望的重组蛋白质的特征可能具有介导与组蛋白或核小体结构的强相互作用的性质，这还可能影响它们的可提取性。要检查的最简单的工艺变量将是提取时间。到目前为止的实验数据表明，提取效率增加最高达约60分钟，然后如果持续更长的间隔，则似乎提取效率下降。下降被理解为不反映提取效率，而是组蛋白由于过度暴露于提取条件所致的降解。不管什么原因，可以进行评价不同提取时间的简单实验以确定来自给定来源的样品的最佳值。其它变量也可以以类似的概念方式被优化，其中中性盐、有机阳离子或表面活性剂的浓度或pH或组合系统地变化。在一些实施方案中，还可以测试不同种类的中性盐、酸、离液剂(阳离子型、非离子型、两性离子型、阴离子型)、DNA嵌入剂和表面活性剂。被称为实验设计(DoE)的技术在本领域中是众所周知的，用于最小化获得统计学上有效的数据体以确定给定变量集的最佳条件所需的测试数量。

在一些实施方案中，开始使用以空隙排阻模式利用填充有正电性颗粒的柱的最终提取步骤将是有利的，因为这通常产生最高的回收率和最高纯度的组蛋白。在一些实施方案中，评价通过使用用于最终步骤的尺寸排阻色谱与用于最终步骤的阴离子交换色谱获得的结果可能是值得的。在一些实施方案中，评价不同等级或类型的尺寸排阻介质、或不同的阴离子交换色谱介质以确定哪种介导最高程度的总提取效率可能是值得的。

在一些实施方案中，当使用先前未表征的抗组蛋白ELISA用于分析时，测试基于胍的提取与基于依沙吖啶或亚甲蓝的提取可能是有用的，因为实验数据表明，不同ELISA产品所使用的不同抗体可以能够更差或更好地检测从通过一种或另一种提取方法制备的样品中检测的组蛋白。然而，在一些实施方案中，用有机阳离子如依沙吖啶、亚甲蓝、道诺霉素、多柔比星或另一DNA嵌入剂进行提取通常将支持提取的组蛋白的最高回收率，尤其当随后施加到适于进行空隙排阻模式的阴离子交换色谱的正电性颗粒柱时。

适于进行最终提取步骤的一些色谱介质是已知的，但并不是所有的都已经被调查，并且可以开发证明适于实施所公开的方法的新介质。已知合适的尺寸排阻色谱介质包括Sephadex G25，优选超细或细的等级，但中等级和粗等级也可以支持令人满意的结果，如产品如Trisacryl GF05可能如此。已知合适的阴离子交换色谱介质包括UNOsphere Q、Nuvia Q和Capto Q，其中UNOsphere Q已产生特别优异的结果。在一些实施方案中，将需要确定可以被施加到填充有给定色谱介质的给定柱的样品的体积。这可以在简单实验中针对两种介质类别来确定，其中将溶于50mM磷酸钠、1M NaCl(pH～7.0)中的1mg/mL溶菌酶制剂施加至平衡到50mM磷酸钠(pH7.0)的填充柱。在第一次通过时，进行图表标记以指示施加样品的点，并施加柱体积的10％的样品体积。用平衡缓冲液追踪样品引入，以沿柱向下置换样品组分。监测280nm处的紫外光的吸光度和电导率。在洗脱曲线上，标记280信号开始上升的点，然后标记电导率信号开始上升的点。来自这两个点的体积随该柱的颗粒间(空隙)体积而变化，并且提供可以被施加到该柱的样品的最大体积的估计，以便将整个空隙峰中的组蛋白尽可能完全地提取。在后续实验中，加载柱体积的20％。在后续实验中，加载柱体积的30％。在每种情况下，检查以确保在电导率信号开始增加之前，UV吸光度返回到基线。目的是确定满足该条件的最大样品体积。在填充有具有均一直径的完全球形颗粒的柱中，颗粒间体积接近柱体积的40％，但是它可以取决于多种因素而具有更较小的比例(Nian等，见上文)。例如，实际经验证实，柱在填充期间的压缩差异地降低颗粒间体积。另外，来自将样品引入系统中并且该样品实际进入柱的点的不受控的流体分散可以导致进入柱的样品体积大于通过注射端口引入的体积。出于这些原因，可以谨慎地进行其中如上所述引入各种体积的样品的简单实验，以确定可以在样品端口引入并且仍然提供期望的组蛋白提取峰以在盐和其它组分洗脱之前完全洗脱的样品的最大体积。

在一些实施方案中，评价除阳离子型有机化合物之外的离液化合物可能引人关注，但是迄今为止的实验数据表明替代物较差。尿素是众所周知的离液剂，其不能得到与胍离子相当的结果。该结果是出乎意料的，因为胍离子和尿素两者都已知通过直接结合生物分子来介导它们的离液效应，并且两者应当在损害组蛋白方面具有类似的作用。不归于任何特定理论，可能是正电性胍离子在某种程度上受到来自正电性组蛋白的静电排斥，从而比它们在胍不被排斥时可以耐受更高的胍浓度。同时，胍离子可以通过带正电荷的胍离子与DNA上每个磷酸二酯桥上的带负电荷的氧原子静电结合而优先使DNA变性，并且变性可能帮助从DNA上解离组蛋白，从而促成更高的提取效率。还可以考虑阴离子型离液剂如硫氰酸盐或高氯酸盐，尽管初步数据表明它们也劣于胍

在一些实施方案中，除胍以外的阳离子型有机化合物可以改善组蛋白提取效率，如依沙吖啶和亚甲蓝。实验数据表明，其它阳离子型有机化合物比缺少阳离子型有机化合物的系统支持更完全的提取，尽管它们通常不如依沙吖啶或亚甲蓝有效。在一些此类实施方案中，依沙吖啶或亚甲蓝的替代物可以由氯己定、阿来西定、十六烷基三甲基铵、道诺霉素、多柔比星、三(2-氨乙基)胺和/或聚乙烯亚胺组成。

实施例

实施例1不同洗涤剂和浓度的影响。进行一系列实验以评价不同去洗涤剂对2.5MNaCl,0.2M HCl中的组蛋白提取的作用。所有洗涤剂浓度均为0.05％。提取效率基于从Active Motif(Tokyo)获得的ELISA。用Tween-20、Tween-40、Tween-60和Nonidet NP-40获得最高的提取效率。完整数据示于表1中：

表1.

实施例2在不同洗涤剂中表面活性剂浓度的作用。利用从Active Motif公司和Cell Signaling(Danvers，MA，USA)获得的ELISA在不同浓度下比较来自实施例2的最高性能的洗涤剂。在2M NaCl，0.2M HCl中进行提取。将提取物用Sephadex G25柱(GEHealthcare)经缓冲液交换到50mM Hepes，150mM NaCl，pH 7中。Tween-20提供特别好的结果。完整数据示于表2中：

表2

实施例3.提取时间对组蛋白H3定量的作用。在4℃，在0.2M HCl，0.1％NP-40，2.5MNaCl中提取含有单克隆抗体的细胞培养基的样品。以规则的时间间隔取出等分试样，并在Sephadex G25上经缓冲液交换到50mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.0中。用Cell Signaling制造的ELISA确定组蛋白H3值。在16小时(960min)时间过程中信号减少约15％。结果示于表3中：

表3

实施例4在2M NaCl，0.2M HCl，0.1％NP40中的不同有机阳离子的作用。在初始提取之后，将样品经缓冲液交换到50mM Hepes pH 7.0中。还评价了所选择的非阳离子型有机化合物。用来自Active Motifs和Cell Signaling的ELISA确定组蛋白H3值。对于ActivMotif ELISA，依沙吖啶得到特别好的结果。对于Cell Signaling ELISA，胍得到特别好的结果。所有阳离子型有机化合物均优于非阳离子型有机化合物。结果示于表4中：

表4

实施例5比较依沙吖啶、亚甲蓝和胍，1.5M NaCl，0.1％NP-40，0.2M HCl。用Sephadex G25经缓冲液交换到50mM Hepes，pH 7.0中。通过ELISA测量组蛋白H3，以一式三份进行实验，并对结果取平均值。结果示于表5中：

表5

实施例6比较不同提取方法。比较多种提取方法，并用来自Active Motifs和CellSignaling的ELISA评价提取的样品。提取1：无提取，实验对照。提取2：0.2M HCl。提取3：0.2M HCl，随后滴定为pH 7.0。提取4：0.2M HCl，通过尺寸排阻经缓冲液交换到50mMHepes，pH 7.0中。提取5：2.5M NaCl，0.1％NP40。提取6：2.5M NaCl，0.1％NP40，通过尺寸排阻经缓冲液交换到50mM Hepes，pH 7中。提取7：0.2M HCl，1.5M NaCl，0.1％NP40。提取8：0.2M HCl，1.5M NaCl，0.1％NP40，通过尺寸排阻经缓冲液交换到50mM Hepes，pH 7中。提取9：0.2M HCl，2M NaCl，0.1％NP40，1.25M盐酸胍。提取10：0.2M HCl，2M NaCl，0.1％NP40，1.25M盐酸胍，然后通过尺寸排阻经缓冲液交换到50mM Hepes，pH7中。提取11：0.2M HCl，1.5M NaCl，0.1％NP40，0.2％依沙吖啶。提取12：0.2M HCl，1.5M NaCl，0.1％NP40，0.2％依沙吖啶，然后通过尺寸排阻色谱经缓冲液交换到50mM Hepes，pH 7中。结果示于表6中：

表6

实施例7.利用空隙排阻阴离子交换的第二提取步骤与利用尺寸排阻的第二提取步骤的比较。用0.2 M HCl，2 M NaCl，0.1％NP40，0.05％依沙吖啶提取含有IgG单克隆抗体的细胞培养物收获物1小时。通过缓冲液交换色谱的最终提取步骤将一半样品在SephadexG25上处理到50 mM Tris，pH 8中。通过空隙排阻色谱将另一半在UNOsphere Q上处理到50mM tris，pH 8中。用来自Active Motifs和Cell Signaling的组蛋白H3 ELISA测定样品。下表中给出了两个柱上的空隙排阻峰的平均H3值。空隙排阻阴离子交换色谱对于两种测定均得到最高响应。结果示于表7中：

表7

最终提取 Active Motif Cell Signaling

空隙排阻 3343 1000

尺寸排阻 337 310

图1图解说明了采用空隙排阻阴离子交换色谱的步骤，并且以灰色突出显示了所收集的空隙排阻峰。

实施例8在最终提取之后沉淀物的形成。当在低于0.5M的NaCl浓度下进行初始提取时，在通过尺寸排阻色谱经缓冲液交换到50mM Hepes pH 7.0中之后观察到沉淀物。如果在不存在胍的情况下进行初始提取，则即使在1M NaCl中也观察到类似结果。如果在1MNaCl存在下在大于0.75M的胍中进行初始提取，则观察到类似结果。当在依沙吖啶或亚甲蓝存在下进行初始提取时，在0.0M到0.5M NaCL中观察到类似结果。在所有情况下，沉淀物的去除均直接对应于H3信号的丧失，表明组蛋白蛋白质存在于沉淀物中。

从上述实施例将显而易见的是，即使在不存在阳离子型有机化合物的情况下，所公开的方法也比已知方法实现了更高程度的组蛋白提取效率。考虑到所公开的方法支持给定样品中组蛋白蛋白质的最准确定量的意图，优选包括阳离子型有机化合物，尽管认识到一些用户可以判断可以在没有阳离子型有机化合物的情况下获得可接受的结果。然而，即使在此类情况下，本领域技术人员也将认识到包括色谱步骤将仍有必要。应当同样认识到，将作为所公开的方法的一部分描述的色谱步骤添加到已知的提取方法中将使那些其它方法被赋予所公开的方法的一些优点。

在一些实施方案中，所公开的方法可以用于从样品中提取组蛋白，用于产生对那些样品中的组蛋白的定量估计的目的。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法可以进一步包括对样品或制剂等中组蛋白的量进行定量的步骤。此类样品或制剂可以包括体液、细胞或组织裂解物、细胞培养物上清液和从任何此类来源(如来自纯化过程)处理的样品。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括将定量的组蛋白的量与组蛋白的参考量或内标物进行比较的步骤。产生定量估计的目的可以是确定意在用于人类注射的期望的纯化的治疗性蛋白质中的组蛋白的量，以确保期望的蛋白质满足适当的安全性和规章标准。在一些实施方案中，在对组蛋白的量进行定量之后，所述方法可以包括确定组蛋白的量是否满足安全性和/或规章标准的步骤。在另一个此类实施方案中，产生定量估计的目的可以是确定从意在去除组蛋白和/或其它污染物的分级分离(纯化)步骤收集的一系列级分的每一个中的组蛋白的量。

在一些应用中，产生定量估计的目的可以是确定在一系列分级分离步骤中的每一个之后剩余的组蛋白的量。在此类实施方案中，产生定量估计的目的可以是指导开发意在特定地通过候选工艺从制剂中去除组蛋白的分级分离方法。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法可以进一步包括对一种或多种级分或类似划分组的组蛋白来源组中组蛋白的量进行定量的步骤。在对一系列级分中的组蛋白进行定量之后，所述方法可以进一步包括收集包含组蛋白的所有级分。在收集所有级分之后，可以对组蛋白进一步进行以下中的一个或多个步骤：分离组蛋白、经缓冲液交换收集的级分、过滤、微滤或纳米过滤、通过色谱方法进一步纯化或其组合。

在一些实施方案中，所公开的方法可以用于提取组蛋白，用于产生校准标准物以支持对包含未知组蛋白含量的样品中组蛋白的定量分析的目的。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法可以进一步包括用提取的组蛋白形成校准标准物的步骤。在一些实施方案中，从中提取组蛋白的样品可以是活细胞制剂。因此，方法可以包括本文所公开的方法的第一提取步骤可以用活细胞制剂。在其它实施方案中，从中提取组蛋白的样品可以是细胞培养基，如用于产生重组蛋白质的细胞培养基，并且可以含有大比例的死细胞。在其它此类情况下，从中检测组蛋白的样品可以是体液，如血清、或血浆、或眼泪、或母乳、或胸膜液、或唾液或另一体液。在其它实施方案中，所公开的方法可以用于提取组蛋白，用于纯化它们的目的。在一些此类实施方案中，特别是当利用以空隙排阻模式使用的正电性颗粒柱进行最终提取步骤时，组蛋白的实质性纯化将与提取同时发生。在一些此类实施方案中，通过所公开的方法产生的部分纯化的组蛋白提取物可以通过其它方法进一步被纯化。在一些实施方案中，此类其它方法可包括色谱方法，如以下的一种或多种：疏水相互作用色谱、阳离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、混合模式色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱。

本文所引用的所有参考文献均以引用方式且出于所有目的整体并入，其并入程度就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地且个别地指明出于所有目的以引用方式整体并入一样。当以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容相冲突时，本说明书意在替代和/或优先于任何此类相冲突的内容。

用于本说明书和权利要求中的所有表示成分的量、色谱条件等的数字均应当理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非另有相反指明，否则本说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数为近似值，其可根据本发明实施方案试图获得的期望性能而改变。

如对本领域技术人员将显而易见的，可以进行本文所公开的实施方案的许多更改和变化，而不脱离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅以举例方式提供，而不意在以任何方式进行限制。本说明书和实施例意在被认为仅仅是示例性的，本文的实施方案的真正范围和精神由所附权利要求书指明。

Claims (13)

1.一种用于从制剂中提取DNA压缩蛋白质的方法，所述方法包括：

使所述制剂与有机阳离子、中性盐和非离子型表面活性剂在约0.1到约1.0的pH下接触；

温育所述混合物约30分钟到约150分钟的一段时间；

去除固体以提供提取物；

将所述提取物施加到颗粒填充柱，所述颗粒填充柱包含(1)适于以空隙排阻模式实施阴离子交换色谱的正电性颗粒，或(2)具有约5,000道尔顿的排阻极限的基本上不带电荷的尺寸排阻色谱颗粒，其中所述颗粒填充柱具有颗粒间体积；

其中所施加的提取物的体积不大于所述颗粒间体积；

在所述施加步骤之后，使缓冲液通过所述柱以沿所述柱向下置换该样品，并且收集对应于所述柱的排阻体积的峰中的所提取的DNA压缩蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机阳离子选自由胍依沙吖啶、亚甲蓝、道诺霉素、多柔比星、氯己定、阿来西定、苯扎氯铵、三(2-氨乙基)胺、十六烷基三甲基铵、聚乙烯亚胺和其组合组成的组。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中依沙吖啶或亚甲蓝的浓度在选自由非零量到0.05％(重量/体积)、0.01％到0.1％、0.02到0.05％以及0.03％到0.10％组成的组的范围。

4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中胍的浓度在选自由0.5到1.5M、0.8到1.2M以及0.9到1.1M组成的组的范围。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述中性盐以约1M到约3M的浓度范围存在。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述中性盐是氯化钠或氯化钾。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂选自由Tween 20、Tween40、Tween 60和Nonidet NP40组成的组。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂以约0.05％到约0.25％w/v的浓度范围存在。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA压缩蛋白质包括一种或多种组蛋白蛋白质。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂选自由细胞培养物上清液、体液、组织均质物、来自分离分级过程的级分组成的组。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中期望的非组蛋白蛋白质是天然存在的蛋白质或重组蛋白质。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中期望的非组蛋白蛋白质选自由抗体、IgG、IgM、非抗体蛋白质组成的组。

13.一种配置成体现权利要求1-12的试剂盒。