CN101153050A - 一种分离纯化组蛋白h4的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋生物技术领域，具体的说是一种分离纯化组蛋白H4的方法。其分离纯化步骤为：将样品海蜇破碎，加入磷酸缓冲溶液，2－6℃浸泡0.5－48h；而后离心取上清液；用阴离子交换层析对上清液进行分离，得到组蛋白H4。测其分子量约为11kDa，N－末端氨基酸序列为DN/KIQGITKPA。采用本发明的分离纯化方法，为获得组蛋白提供了新的方法。本发明交换剂流速快，载量高可用于大量粗产品的快速纯化，缩短了分离时间；并且分离纯化的实验步骤少，直接将提取的粗产品过层析柱，减少了组蛋白的损失及活性的丢失。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体的说是一种分离纯化组蛋白H4的方法
背景技术
组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，是一类小分子碱性蛋白质，有五种类型：H1、H2A、H2B、H3、H4，它们富含带正电荷的碱性氨基酸，能够同DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用。组蛋白是一种使细胞生长正常化的物质，能有效的控制细胞的异常增殖，其功能是参与维持染色体结构，阻碍DNA转录RNA。
组蛋白的修饰对基因表达有重要的调节作用。其中，对组蛋白的乙酰化调节研究最多，组蛋白脱乙酰化酶和组蛋白乙酰转移酶参与调解此过程，对某些肿瘤起抑制作用。
有研究指出组蛋白不仅有上述功能，还有其他功能，如激素活性(文献1：Reichhart R，Zeppezauer M & Jrnvall H Preparations ofhomeostatic thymus hormone consist predominantly of histones 2A and2B and suggest additional histone functions.Proc Natl Acad Sci USA1985，82，4871-4875.)，可激活鲑鱼中的白细胞(文献2：Pedersen GM，Gildberg A，Steiro K & Olsen RL Histone-like proteins from Atlanticcod milt：stimulatory effect on Atlantic salmon leucocytes in vivoand in vitro.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 2003，134，407-416.)，抑菌活性。1958年Hirsch首次发现了从小牛胸腺中提取的组蛋白A和B具有抑菌性，可以抑制多种格兰氏阴性菌和阳性菌(文献3：Hirsch，J.G.(1958)Bactericidal action of histones.J.Exp.Med.108.925-944.)。Patat指出在脊椎动物中，从鱼到人类的组蛋白或其碎片具有抗菌性，并用HPLC从小虾Litopenaeus vannamei中分离得到组蛋白H2B/H4的混合物，经实验发现在浓度为3μM时该混合物可以完全抑制细菌M.luteus的生长(文献4：Séverine A.Patat，Ryan B.Carnegie，CeliaKingsbury，Paul S.Gross，Robert Chapman and Kevin L.ScheyAntimicrobial activity of histones from hemocytes of the Pacificwhite shrimp Eur.J.Biochem.2004，271，4825-4833.)。
H4属于核小体组蛋白，该组蛋白相对分子质量较小，约为11kDa，含有102个氨基酸残基，它的作用是将DNA分子盘绕成核小体。H4的赖氨酸20既可发生甲基化也可同时发生乙酰化，对其进行修饰对基因表达起着重要作用，且Patat(文献4)未能证明H4是否有抑菌活性，还需要对H4做更深入的研究，因此组蛋白H4的分离纯化为组蛋白H4的进一步研究打下了基础，提供了必要的前提条件。
Brandt等用Bio-Gel P60层析柱从海胆中分离纯化出H4(文献5：WolfF.Brandt，Walter N.Strickland，Marie Strickland，Lesley Carlisle，Derek Woods，and Claus Vonholt A Histone Programme during the LifeCycle of the Sea Urchin Eur.J.Biochem.1979，94，1-10)；Daniéle等用Biogel P10柱从乌贼睾丸中的染色质分离出H4(文献6：Daniéle，W.T.；Annie，M.P.；Gilbert，B.；Pierre，S.；Gérard B.TheAmino-Acid Sequence of Histone H2A from Cuttlefish Sepia of Jicina IisEur.J Biochem.1982，124，489-498.)；Salvini等用AU-PAGE电泳从Blepharisma japonicum中得到H4(文献7：Mariangela Salvini，Elisabetta Bini，Annalisa Santucci，Renata Batistoni H4histonein the macronucleus of Blepharisma japonicum(Protozoa，Ciliophora，Heterotrichida)FEMS Microbiology Letters 1997，149，93-98)；Patat(文献4)等用C18反相高效液相色谱从太平洋白虾的血球中分离得到H4和H2B的混合物，未能得到纯的H4，这些方法在分离组蛋白之前都是先向提取的染色质中加HCl或H2SO4使所有的组蛋白都沉淀下来，再将该沉淀溶解过滤后，分离纯化，实验步骤多；而且这些方法不能大量分离样品且分离速度较慢。与此同时尚未见到从海蜇中分离纯化H4的报道。
DEAE Sepharose Fast Flow是一种阴离子交换剂，蛋白质溶液进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱，余下的蛋白质均结合在树脂上，但与树脂的亲和力各不相同，可用逐渐增加洗脱液中离子强度的方法将其逐一洗脱出来。Nazmi zer等用DEAE Sepharose FastFlow层析柱从牛奶中纯化黄嘌呤氧化酶(文献8：Nazmi zer，Meltem Müftüoglu，Demet Ataman，Ayse Ercan and I.Hamdi güs The shortpurification procedure，with high yield，consisted of extraction，ammonium sulfate fractionation，and DEAE Sepharose(fast flow)column chromatography Journal of Biochemical and Biophysical Methods，1999，39(3)，153-159)。Liu等用Ni NTA His·Bind Resin和DEAESepharose Fast Flow层析柱从肺炎衣原体中纯化出尿嘧啶-DNA-糖基酶(文献9：Xipeng Liu and Jianhua Liu Cloning，expression，andcharacterization of uracil-DNA glycosylase of Chlamydia pneumoniaein Escherichia coli Protein Expression and Purigication 2004，3.5(1)，46-53)。Wang等依次用DEAE Sepharose Fast Flow，CM-52，and G-100从大肠杆菌分离纯化出重组Cu/Zn超氧歧化酶。(文献10：Zunsheng Wang，Zhuojing He，Qiong Shen，Yuxiang Gu，Suxia Li and Qinsheng YuanPurification and partial characterization of recombinant Cu，Zncontaining superoxide dismutase of Cordyceps militaris in E.coliJ.Chromatogr.B2005，826，114-121.)Zang等用DEAE Sepharose FastFlow层析柱和Ni-charged His·Bind resin层析柱从大肠杆菌中纯化出一个新的重组融合蛋白(文献11：Yuhui Zang，Xu Zhang，Dawen Yuan，YuminZhang，Jie Zhu，Haiqin Lu，Chao Chang and Junchuan Qin)xpression.purification，and characterization of a novel recombinant fusionprotein，rhTPO/SCF，in Escherichia coli Purification Expression andpurification 2006，47(2)，427-433)。Zhang等用DEAE Sepharose FastFlow，Mono Q HR 5/5离子交换色谱和Superose 1210/300凝胶过滤色谱从Gluconobacter oxydans GO112中分离出L-山梨糖脱氢酶(文献12：W.Zhang，B.Yan，J.Wang，J.Yao and Z.Yu Purification andcharacterization of membrane-bound L-sorbose dehydrogenase fromGluconobacter oxydans GO112 Enzyme and Microbial Technology2006，38(5)，643-648.)。但尚未见有用DEAE Sepharose Fast Flow从海蜇触手中分离纯化组蛋白H4的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、分离纯度高的分离纯化组蛋白H4的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术手段包括以下步骤：
(1)提取样品：将50g-150g的海蜇样品破碎，然后加入样品重量0.5-4倍的缓冲液，放入2℃-6℃下，浸泡0.5-48h；而后将其在相对离心力9160-29700g下离心10-30min，取上清液备用；
(2)分离纯化：
①加样前样品预处理：将步骤1)得到样品在2℃-6℃下加入到离子交换剂中，每隔8-12min搅拌一次，共搅拌2-6次，而后在相对离心力573-1467g下，离心5-10min，弃去上清液；
②将已吸附蛋白的离子交换剂注入到层析柱中，用3-5倍床体积的缓冲液淋洗；
③洗脱：采用含有NaCl的缓冲液，以60-90ml/h的洗脱速度进行阶段性洗脱，收集组分。
所述样品为新鲜海蜇触手或置于-80℃--20℃下保存的新鲜海蜇触手；离心温度为2-6℃。
所述缓冲液为浓度5-25mM，pH7.0-8.0的磷酸缓冲液；离子交换剂为：快流速二乙氨基乙基琼脂糖凝胶(Amersham)。
本发明的优点在于：
1.本发明从海蜇触手中分离纯化组蛋白H4的方法，为获得组蛋白提供了新的方法。
2.本发明采用阴离子交换剂DEAE Sepharose Fast Flow从海蜇触手中分离纯化出组蛋白H4，由于该交换剂具有流速快，载量高的特点，并且海蜇中含大量的水，其毒素浓度较低，所以适合采用本发明的离子交换剂从大量海蜇毒素快速纯化组蛋白H4。
3.本发明实验步骤少，直接将提取的粗毒过层析柱，减少了组蛋白的损失及活性的丢失。
4.海蜇是一种资源丰富的海洋生物，采用本发明纯化组蛋白H4的方法为海蜇的开发利用开辟了新的途径。
附图说明
图1为本发明经含0.4M NaCl的磷酸缓冲液洗脱纯化后的组蛋白H4电泳图谱(其中：泳道1为含0.4M NaCl的磷酸缓冲液洗脱的组分；泳道2为蛋白质分子量标准，从下到上依次为14.4，18.4，25.0，35.0，45.0，66.2，116.0kDa)。
图2为测序本发明分离出的组蛋白H4的空白图谱。
图3为测序本发明分离出的组蛋白H4的标准图谱。
图4-1为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱。
图4-2为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱。
图4-3为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱。
图4-4为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱。
图4-5为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱。
图4-6为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱。
图4-7为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱。
图4-8为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱。
图4-9为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱。
图4-10为测序本发明分离出的组蛋白H4的局部扩大图谱
具体实施方式
下面结合实施笔对本发明作进一步详细说明。
实施例1
(1)提取样品：将50g的新鲜海蜇样品破碎，使其达到匀浆状，加入样品重量0.5倍的5mM，pH7.0的磷酸缓冲液中，放入2℃的冷藏柜下，浸泡48h；而后在2℃、相对离心力为9160g转速下离心30min，取上清液备用；
(2)采用高等教育出版社《蛋白质分子基础》所述的考马斯亮兰染色法，以标准牛血清白蛋白为准，测溶液在595nm处的吸光度(A595)，根据朗伯比尔定律，进而算出上清液中海蜇蛋白的浓度(Cmg/ml)。
(3)分离纯化：
①加样前样品预处理：将步骤1)得到样品在2℃下加入到已用5mM，pH7.0的磷酸缓冲液平衡的DEAE Sepharose Fast Flow中，每隔8min搅拌一次，共搅拌6次，而后在2℃、相对离心力为572g，离心10min，弃去上清液；
②将已吸附蛋白的离子交换剂注入到层析柱中，用3倍床体积的缓冲液淋洗；
③洗脱：采用含有0.1-0.6M NaCl的5mM，pH7.0的磷酸缓冲液，以60ml/h的洗脱速度进行阶段性洗脱，收集各组分；所述阶段性洗脱为：首先用含0.1M NaCl的5mM，pH7.0的磷酸缓冲液洗完后再用含0.2M NaCl的5mM，pH7.0的磷酸缓冲液洗，依次至用含0.6M NaCl的5mM，pH7.0的磷酸缓冲液洗脱。
(4)检测：将收集的组分通过SDS-PAGE电泳分析结果得(参见图1)，含0.4M NaCl的磷酸缓冲液洗脱的组分只含有一条带。同时采用Edman降解法测经N-末端氨基酸序列，分析得该蛋白为组蛋白H4(参见图4-1-图4-10)，其中空白是空柱子(参见图2)，标准采用二十种标准氨基酸(参见图3)。
实施例2
与实施例1不同之处在于：
(1)提取样品：将80g的新鲜海蜇样品破碎，加入样品重量1倍的10mM，pH7.2的磷酸缓冲液中，放入4℃的冷藏柜下，浸泡40h；而后在4℃、相对离心力为12190g转速下离心25min，取上清液备用；
(3)分离纯化，采用离子交换层析纯化样品：
①加样前样品预处理：将步骤1)得到样品在4℃下加入到已用10mM，pH7.2的磷酸缓冲液平衡的DEAE Sepharose Fast Flow中，每隔9min搅拌一次，共搅拌6次，而后在4℃、相对离心力为668g，离心5min，弃去上清液；
②将已吸附蛋白的离子交换剂注入到层析柱中，用4倍床体积的缓冲液淋洗；
③洗脱：采用含有0.1-0.6M NaCl的10mM，pH7.2的磷酸缓冲液，以75ml/h的洗脱速度进行阶段性洗脱，收集各组分。
实施例3
与实施例1不同之处在于：
(1)提取样品：将100g的新鲜海蜇样品匀浆，加入样品重量2倍的15mM，pH7.4的磷酸缓冲液中，放入4℃的冷藏柜下，浸泡32h；而后在6℃、相对离心力为17953g转速下离心20min，取上清液备用；
(3)分离纯化，采用离子交换层析纯化样品：
①加样前样品预处理：将步骤1)得到样品在4℃下加入到已用15mM，pH7.4的磷酸缓冲液平衡的DEAE Sepharose Fast Flow中，每隔10min搅拌一次，共搅拌6次，而后在6℃、相对离心力为824g，离心9min，弃去上清液；
②将已吸附蛋白的离子交换剂注入到层析柱中，用4倍床体积的缓冲液淋洗；
③洗脱：采用含有0.1-0.6M NaCl的15mM，pH7.4的磷酸缓冲液，以90ml/h的洗脱速度进行阶段性洗脱，收集各组分。
实施例4
与实施例1不同之处在于：
(1)提取样品：将120g的新鲜海蜇样品匀浆，加入样品重量3.5倍的20mM，pH7.8的磷酸缓冲液中，放入6℃的冷藏柜下，浸泡24h；而后在4℃、相对离心力为23450g转速下离心15min，取上清液备用；
(3)分离纯化，采用离子交换层析纯化样品：
①加样前样品预处理：将步骤1)得到样品在4℃下加入到已用20mM，pH7.8的磷酸缓冲液平衡的DEAE Sepharose Fast Flow中，每隔11min搅拌一次，共搅拌6次，而后在4℃、相对离心力为1290rpm，离心8min，弃去上清液；
②将已吸附蛋白的离子交换剂注入到层析柱中，用5倍床体积的缓冲液淋洗；
③洗脱：采用含有0.1-0.6M NaCl的20mM，pH7.8的磷酸缓冲液，以90ml/h的洗脱速度进行阶段性洗脱，收集各组分。
实施例5
与实施例1不同之处在于：
(1)提取样品：将150g的新鲜海蜇样品匀浆，加入样品重量4倍的25mM，pH8.0的磷酸缓冲液中，放入6℃的冷藏柜下，浸泡16h；而后在4℃、相对离心力为29678g转速下离心10min，取上清液备用；
(3)分离纯化，采用离子交换层析纯化样品：
①加样前样品预处理：将步骤1)得到样品在4℃下加入到已用25mM，pH8.0的磷酸缓冲液平衡的DEAE Sepharose Fast Flow中，每隔12min搅拌一次，共搅拌6次，而后在4℃、相对离心力为1466rpm，离心8min，弃去上清液；
②将已吸附蛋白的离子交换剂注入到层析柱中，用5倍床体积的缓冲液淋洗；
③洗脱：采用含有0.1-0.6M NaCl的25mM，pH8.0的磷酸缓冲液，以90ml/h的洗脱速度进行阶段性洗脱，收集各组分。
上述详细说明针对本发明的实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。
Claims (4)
1.一种分离纯化组蛋白H4的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取样品：将50g-150g的海蜇样品破碎，然后加入样品重量0.5-4倍的缓冲液，放入2℃-6℃下，浸泡0.5-48hh；而后将其在相对离心力为9160-29700g下离心10-30min，取上清液备用；
(2)分离纯化：
①加样前样品预处理：将步骤1)得到的样品在2℃-6℃下加入到离子交换剂中，每隔8-12min搅拌一次，共搅拌2-6次，而后在相对离心力为573-1467g下，离心5-10min，弃去上清液；
②将已吸附蛋白的离子交换剂注入到层析柱中，用3-5倍床体积的缓冲液淋洗；
③洗脱：采用含有NaCl的缓冲液，以60-90ml/h的洗脱速度进行阶段性洗脱，收集组分。
2.按权利要求1所述的分离纯化组蛋白H4的方法，其特征在于：所述样品为新鲜海蜇触手或置于-80℃--20℃下保存的新鲜海蜇触手。
3.按权利要求1所述的分离纯化组蛋白H4的方法，其特征在于：所述离心温度为2-6℃。
4.按权利要求1所述的分离纯化组蛋白H4的方法，其特征在于：所述缓冲液为浓度5-25mM，pH7.0-8.0的磷酸缓冲液；离子交换剂为：快流速二乙氨基乙基琼脂糖凝胶。
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|---|---|---|---|---|
| CN106232614A (zh) * | 2014-05-29 | 2016-12-14 | 新加坡科技研究局 | 蛋白质提取方法 |
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2006
- 2006-09-29 CN CNA2006100479327A patent/CN101153050A/zh active Pending
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