JPH08116972A

JPH08116972A - ヒト２６ｓプロテアソーム構成成分蛋白質

Info

Publication number: JPH08116972A
Application number: JP6264810A
Authority: JP
Inventors: Keiichi Yano; 敬一矢野; Motoo Yamazaki; 基生山▲崎▼; Keiji Tanaka; 啓二田中
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1994-10-28
Publication date: 1996-05-14
Also published as: CA2154543A1; US5846810A

Abstract

(57)【要約】【構成】ヒト２６Ｓプロテアソームを構成する蛋白質
のうち、Ｐ１１２蛋白質及びＰ３１蛋白質、該蛋白質を
コードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだベクター及び
該ベクターを含有する細胞。【効果】本発明の蛋白質は、ヒト２６Ｓプロテアソー
ムの機能の解明に有用であるのみならず、各種病態の診
断および治療法としても有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト細胞内プロテアー
ゼであるヒト２６Ｓプロテアソームを構成する蛋白質に
関する。本発明の蛋白質は、ヒト２６Ｓプロテアソーム
の機能の解明に有用であるのみならず、各種病態の診断
および治療法にも有用である。

【０００２】

【従来の技術】多機能プロテアーゼであるプロテアソー
ムは酵母からヒトに至る真核生物に広く存在し、細胞内
でエネルギー依存的にユビキチン結合蛋白質を分解する
酵素である。構造的には分子量２１〜３１キロダルトン
の種々の構成成分からなる２０Ｓプロテアソームと３０
〜１１２キロダルトンの種々の構成成分からなる沈降係
数２２ＳのＰＡ７００制御蛋白質群で構成され、全体と
して沈降係数２６Ｓ、分子量約２００万ダルトンの巨大
分子を形成している[Rechsteiner, M., et al.,J.Biol.
Chem., 268, 6065-6068 (1993) 、Yoshimura, T., et a
l., J.Struct.Biol.,111, 200-211 (1993) 、Tanaka,
K., et al., New Biologist, 4, 173-187(1992）] 。
その構造的及び機能的な解析からはその全容は明らかに
なっていないが、主として酵母とマウスを用いた研究か
ら次第に明らかになりつつある。プロテアソームの機能
解析研究においては以下の機能が報告されている。

【０００３】細胞内におけるエネルギー依存性の蛋白質
分解機構はユビキチン結合による蛋白質の選別にはじま
るが、ユビキチン化蛋白質を分解するＡＴＰ依存的な活
性は２０Ｓプロテアソームにはなく、２６Ｓプロテアソ
ームにあることが明らかになり[Chu-Ping et al., J.Bi
ol.Chem., 269, 3539-3547 (1994）] 、本発明のヒト２
６Ｓプロテアソームはエネルギー依存性の蛋白質分解機
構の解明に有用である。細胞周期の調節に関与する因子
は、一般に半減期が短く、厳格な量的制御をうけている
場合が多い。実際、癌遺伝子産物であるＭｏｓ、Ｍｙ
ｃ、Ｆｏｓなどはエネルギー、ユビキチン依存的に２６
Ｓプロテアソームにより分解されることが明らかにされ
（Ishida, N., et al., FEBS Lett., 324, 345-348 (19
93) 、Hershko,A., and Ciechanover, A., Annu.Rev.Bi
ochem., 61, 761-807 (1992)] 、細胞周期制御における
プロテアソームの重要性が認識されつつある。

【０００４】また免疫系における重要性も指摘されてお
り、クラスＩ主要組織適合複合体抗原提示においてプロ
テアソームが積極的に関与していることも示唆され[Mic
halek MT., et al., Nature,363, 552-554 (1993）] 、
さらにアルツハイマー患者の脳内においてユビキチン化
蛋白質が異常に蓄積しているという現象[Kitaguchi,N.,
et al., Nature, 331, 530-532 (1988）] からは、ア
ルツハイマー病にプロテアソームが関与していることも
示唆されるなど、プロテアソームは多彩な機能を有する
という点で各種病態の診断や治療に有用である。

【０００５】２６Ｓプロテアソームの主たる機能はユビ
キチン化蛋白質を分解する活性である。中でもｃ- Ｍｙ
ｃをはじめとする癌遺伝子産物やサイクリンのような細
胞周期関連遺伝子産物の分解が、ユビキチン依存の経路
で分解されることが判明している。また肝癌細胞、腎癌
細胞、白血病細胞などにおいてプロテアソーム遺伝子は
正常細胞に比較して異常発現しており〔Kanayama, H.,
et al., Cancer Res.,51, 6677-6685 (1991)〕、腫瘍細
胞核にプロテアソームが異常蓄積していることが観察さ
れている。従って、本発明のヒトプロテアソームの構成
成分はこれらの癌化のメカニズムの解明や癌の診断ある
いは治療に有用となることが期待される。

【０００６】また、プロテアソームの発現がインターフ
ェロンγ等によって誘導され、細胞内での抗原提示に深
く関与していることが知られている[Aki, M., et al.,
J.Biochem., 115, 257-269 (1994）] 。従って、ヒトプ
ロテアソームの構成成分は免疫系の抗原提示のメカニズ
ムの解明や免疫抑制剤の開発にも期待できる。さらに、
プロテアソームはアルツハイマー患者の脳内に異常蓄積
しているユビキチンとも深く関わっているとも考えら
れ、本発明のヒトプロテアソームの構成成分は、アルツ
ハイマー病の原因解明やその治療に有用である。

【０００７】このように多機能が期待できるプロテアソ
ームは該酵素の利用以外にも、各構成成分を抗原として
抗体を作製し、免疫測定法により各種病態の診断に用い
ることも可能である。本発明のヒト２６Ｓプロテアソー
ムの特性を有する蛋白質については特開平５−２９２９
６４に開示されており、また、ラットプロテアソーム構
成蛋白質については特開平５−２６８９５７及び特開平
５−３１７０５９に開示されているが、本発明のヒト２
６Ｓプロテアソームの構成成分は知られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
２６Ｓプロテアソームを構成する蛋白質のうち、Ｐ１１
２蛋白質及びＰ３１蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを組み込んだベクター及び該ベクターを含
有する細胞を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１で
示されるアミノ酸配列を含むヒト２６Ｓプロテアソーム
構成成分Ｐ１１２蛋白質及び配列番号３で示されるアミ
ノ酸配列を含むヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ３
１蛋白質、これらの蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを組み込んだベクター及び該ベクターを含有する細胞
に関する。本発明のヒトプロテアソームの構成成分Ｐ１
１２蛋白質およびＰ３１蛋白質は、それぞれ配列番号
１、３のそれぞれに示されるアミノ酸配列のＮ末端にメ
チオニンを有していないポリペプチド、およびアミノ酸
配列のＮ末端にそれぞれヒトプロテアソームの構成成分
Ｐ１１２蛋白質またはＰ３１蛋白質のシグナルペプチド
配列の一部または全部が結合したポリペプチドも包含す
る。

【００１０】また、自然変異により、もしくは人工の変
異によりポリペプチドの主たる活性に大きく影響を与え
ることなく、ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を
変化させることが可能であり、本発明はそのような相同
変異体に相当するポリペプチドも包含する。本発明の蛋
白質は、ヒトを含む各種動物の臓器および細胞株から単
離するか、ペプチド合成法に基づく調製法によっても得
ることができるが、組換えＤＮＡ技術で得る方法が好ま
しく用いられる。以下、組換えＤＮＡ技術による本発明
の蛋白質の製造方法を示す。

【００１１】本発明のヒト２６Ｓプロテアソームの構成
成分Ｐ１１２蛋白質およびＰ３１蛋白質をコードするＤ
ＮＡを以下のようにして製造する。まず、牛プロテアソ
ームのＰ１１２蛋白質およびＰ３１蛋白質に相当する部
分アミノ酸配列〔DeMartino, GN., et al., J.Biol.Che
m., 269, 20878-20884（1994）〕に基づいてＲＴ−ＰＣ
Ｒ法〔コンバインド・リバース・トランスクリプション
・ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法; Combined
reverse transcription - polymerase chain reactio
n; Science 241, 708-712 (1988) 〕によりｃＤＮＡ断
片を合成し、それをプローブとしてプラークハイブリダ
イゼーションによりヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分
を生産するヒト腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胸腺などの
各種臓器およびＨｅｐＧ２細胞株（ＡＴＣＣＨＢ８０
６５）などのヒト肝癌細胞株、ヒト腎臓細胞株などの細
胞株の細胞質画分のｃＤＮＡライブラリーよりＰ１１２
蛋白質およびＰ３１蛋白質をコードするＤＮＡを含むフ
ァージを単離する。

【００１２】上記ｃＤＮＡライブラリーの調製法を以下
に例示する。ヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分を生産
する細胞であるヒトＨｅｐＧ２細胞からグアニジン／セ
シウムクロライド法やグアニジンチオシアネート法等に
より、全ＲＮＡを調製する。次に、オリゴｄＴセルロー
スなどを用いてカラム法またはバッチ法により、全ＲＮ
Ａから本発明の蛋白質をコードするｍＲＮＡを精製した
後、得られたｍＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素を用いて
オカヤマバーグ法[Mol.Cell.Biol. 2, 161-170 (1982)]
やグブラーホフマン法[Gene 25, 623-269 (1983)] 等に
よりｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡをプラスミ
ドやファージに組み込み、ｃＤＮＡライブラリーを調製
する。

【００１３】ｃＤＮＡを組み込むプラスミドまたはファ
ージベクターは、本発明のｃＤＮＡを宿主内で複製保持
されるものであれば、いずれのものでもよいが、例え
ば、pBR322やpC119 等のプラスミド、λｇｔ１０等のフ
ァージベクター等があげられる。プラスミドにｃＤＮＡ
を組み込む方法としては、サンブルークらの方法[EMBO
J. 4, 91-103 (1985)]が、ファージベクターに組み込む
方法としてはHyunh, T.V. らの方法[A Practical appro
ach (D.M.Glover 編) vol.1, p49, IRL Press, Oxford]
などがあげられる。

【００１４】上記のように得られたプラスミドは、エレ
クトロポレーション法やカルシウムクロライド法によ
り、大腸菌やバチルスなどの適当な宿主に導入して、こ
れを形質転換できる。ファージベクターは、インビトロ
パッケージング法等を用いて増殖させた宿主に導入する
ことができる。得られたｃＤＮＡからヒトプロテアソー
ムの構成成分のｃＤＮＡを選択する方法としてはラベル
化したプローブを用いたプラークハイブリダイゼーショ
ン法やコロニーハイブリダイゼーション法があげられ
る。

【００１５】上記ハイブリダイゼーションにおけるプロ
ーブとして用いるＤＮＡは本発明の２６Ｓプロテアソー
ム構成成分Ｐ１１２蛋白質またはＰ３１蛋白質とハイブ
リダイズするものであればよく、それらの構成成分のア
ミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドや他
の構成成分をコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学
合成ＤＮＡ、およびこれらの部分ＤＮＡなどを用いても
よい。またヒト以外のマウスや酵母で決定された構成成
分の塩基配列をもとに、適当な配列を選択することも可
能である。本発明のヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分
Ｐ３１蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドま
たはファージとしては、例えば、Ｐ３１等があげられ
る。また、本発明のヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分
Ｐ１１２蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド
またはファージとしては、例えば、Ｐ１１２等があげら
れる。Ｐ３１を含む大腸菌であるEscherichia coli P31
およびＰ１１２を含む大腸菌であるEscherichia coli P
112 は、それぞれ平成６年１０月１８日付で工業技術院
生命工学技術研究所にFERM BP-4837、FERM BP-4838とし
て寄託されている。ＤＮＡ塩基配列の決定はマキサムギ
ルバート法やジデオキシ法などにより行うことができ
る。

【００１６】本発明のヒト２６Ｓプロテアソーム構成成
分Ｐ１１２蛋白質およびＰ３１蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡを含むＤＮＡは、上記の方法以外にヒト、マウス、
酵母などのゲノムＤＮＡライブラリーからクローニング
することも可能である。プロモーター、ターミネータ
ー、分泌シグナル等は宿主で機能するものであればいか
なるものでもよく、公知の組換え技術に従って得ること
ができる。また本発明のＤＮＡの発現は、以上のように
直接発現させなくてもよく、β−ガラクトシダーゼなど
のような他の蛋白質との融合蛋白質として発現後、適当
なプロテアーゼで切断して得る方法も可能である。

【００１７】宿主細胞に関しては、本発明のベクターを
組み込むことができ、本発明の蛋白質を生産できるもの
であれば動物細胞や昆虫細胞や酵母などの真核生物およ
び大腸菌やバチルスなどの原核生物のいずれでも用いる
ことができる。本発明の組換え体ベクターを含有する細
胞の培養に関しても常法により可能である。培養物から
の単離精製は公知の分離操作を組み合わせて行うことが
できる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による
処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈澱法、透
析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、等電点
電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【００１８】本発明において、アミノ酸、ペプチドはＩ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ−生化学命名委員会で採用された略記
法により表示され、例えば下記の略号が使用される。な
お、アミノ酸等に関して光学異性体が存在し得る場合、
とくに明示しなければＬ体を示すものとする。Ａｌａ：（Ａ）アラニンＡｒｇ：（Ｒ）アルギニンＡｓｎ：（Ｎ）アスパラギンＡｓｐ：（Ｄ）アスパラギン酸Ｃｙｓ：（Ｃ）システインＧｌｎ：（Ｑ）グルタミンＧｌｕ：（Ｅ）グルタミン酸Ｇｌｙ：（Ｇ）グリシンＨｉｓ：（Ｈ）ヒスチジンＩｌｅ：（Ｉ）イソロイシンＬｅｕ：（Ｌ）ロイシンＬｙｓ：（Ｋ）リジンＭｅｔ：（Ｍ）メチオニンＰｈｅ：（Ｆ）フェニルアラニンＰｒｏ：（Ｐ）プロリンＳｅｒ：（Ｓ）セリンＴｈｒ：（Ｔ）スレオニンＴｒｐ：（Ｗ）トリプトファンＴｙｒ：（Ｙ）チロシンＶａｌ：（Ｖ）バリンまた、ポリデオキシリボヌクレオチド及びオリゴヌクレ
オチドは下記の略号で表されるデオキシリボヌクレオチ
ドの配列により表記する。Ａ：アデニンＣ：シトシンＧ：グアニンＴ：チミンとくにことわらない限り、デオキシリボヌクレオチド配
列の左端は５’端である。

【００１９】以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明
する。

【００２０】

【実施例】

実施例１（１）ヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ１１２蛋
白質およびＰ３１蛋白質の精製新鮮なヒト腎臓約１００ｇを用い、特開平５−２９２９
６４に記載されているヒトプロテアソームの精製法に従
い、バイオゲルＡ−１. ５ｍ（５×９０ｃｍ、バイオラ
ッド製）、ハイドロキシアパタイト（１. ５×１５ｃ
ｍ、バイオラッド製）、Ｑ−セファロース（１. ５×１
５ｃｍ、ファルマシア製）によるカラムクロマトグラフ
ィーおよびグリセロール密度勾配遠心法によりヒトプロ
テアソームの精製を行った。得られたヒトプロテアソー
ムを、日立Ｌ６２００型高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）システムより、逆相ＨＰＬＣを行った。カ
ラムは、Shodex RS Pak D4-613 (０．６×１５ｃｍ、昭
和電工製）を用い、以下の２液によるグラジエント溶出
を行った。

【００２１】第１液：０．０６％トリフルオロ酢酸第２液：０．０５％トリフルオロ酢酸、７０％アセトニ
トリルグラジエント：（第１液：第２液）＝（５０：５０）か
ら（３０：７０）への６０分間での直線濃度勾配Ｐ１１２蛋白質溶出濃度：（第１液：第２液）＝（３
８：６２）Ｐ３１蛋白質溶出濃度：（第１液：第２液）＝（４３：
５７）上記溶出画分については、一部をジチオスレイトール還
元下、８．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を
行い、図１に示すように、Ｐ１１２蛋白質およびＰ３１
蛋白質をそれぞれ単離精製した。

【００２２】（２）ｃＤＮＡライブラリーの調製ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣＨＢ８０６５）
を１０％牛胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル
培養液（ＤＭＥＭ）中で培養した。この細胞液をリン酸
緩衝液で洗浄後回収し、Chirgwin等の方法(Biochemistr
y,18, 5294-5299, 1979)に従い、グアニジンチオシアネ
ート法を用い、全ＲＮＡを調製した。この全ＲＮＡをオ
リゴ（ｄＴ）−ラテックス（Oligo -dT30 、宝酒造製）
に３７℃で１０分間、オリゴ（ｄＴ）結合緩衝液（0.5M
NaCl, 10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 0.1% SDS）中
で付加結合させた。遠心分離後上清を除き、洗浄緩衝液
（0.1M NaCl, 10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 0.1% S
DS）に懸濁後再び遠心分離し上清を除くことでｔＲＮＡ
およびｒＲＮＡを除去し、オリゴ（ｄＴ）−ラテックス
に結合したpoly(A) ⁺RNA を蒸留水で６５℃、５分間で
溶出した。溶出液に１／２０倍量の５ＭＮａＣｌ、２.
５倍量エタノールを加えてエタノール沈澱させた後、７
０％エタノールで洗浄し、poly(A) ⁺RNA を得た。この
poly(A) ⁺RNA を用いてポリメラーゼ・チェイン・リア
クション法（ＰＣＲ法）によりプローブを調製するため
の鋳型となる一本鎖ｃＤＮＡをFirst-strand cDNA Synt
hesisKit （ファルマシア製）により合成した。得られ
たpoly(A) ⁺RNA を鋳型とし、GublerとHoffman 等の方
法(Gene,25, 263-268, 1983)に従ってTime Saver cDNAS
ynthesis Kit （ファルマシア製）を用いて制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ切断末端を持つ２本鎖ｃＤＮＡを合成した。即
ち、poly(A) ⁺RNA を鋳型としてオリゴ（ｄＴ） _12-18
プライマーとCloned Murine Reverse Transcriptase に
より１本鎖ｃＤＮＡを合成し、更に大腸菌RNase H と大
腸菌DNA polymeraseにより２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
合成した２本鎖ｃＤＮＡはクレノー断片(Klenow Fragme
nt; DNA polymerase I Large Fragment 、日本ジーン
製）により平滑にした後、T4 DNA Ligase によりＥｃｏ
ＲＩ切断末端を持つＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを
付加し、さらにＥｃｏＲＩ切断末端をT4 Polynucleotid
e Kinaseによりリン酸化した後、ファージクローニング
ベクターであるλＺＡＰIIのマルチクローニングサイト
のＥｃｏＲＩ部位（PREDIGESTED LAMBDA ZAPII/EcoRI/C
IAP CLONING KIT 、STRATAGENE社製）を用いてλＺＡＰ
IIのパッケージングを行った後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅを宿主としてｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００２３】（３）プローブの調製（１）で得られたＰ１１２蛋白質について０. １Ｍトリ
ス緩衝液（ｐＨ７. ８）、２Ｍ尿素中、１μｇのトリプ
シンにより３７℃で８時間酵素消化を行った。得られた
部分ペプチド断片を逆相ＨＰＬＣで分離し、そのＮ末端
のアミノ酸配列を決定した結果、ＸＮＬＹＱＤＤＡＶＴ
ＧＥおよびＸＸＡＩＬＡＱＧＩＬＤＡＧ（各配列中、Ｘ
は未決定アミノ酸を意味する）というアミノ酸配列を有
することが判明した。このアミノ酸配列に基づき、セン
ス鎖〔5'-AAT(T/C)T(T/G)TATCAGGATGATGCTGT(T/G)AC(T/
G)GGTGA-3'〕およびアンチセンス鎖〔5'-CCAGCATC(A/C)
AAAATACCCTGAGC(A/C)A(A/G)AAT(A/C)GC-3'〕のプライマ
ーを合成し、（２）で得られたＨｅｐＧ２細胞first-st
rand cDNA を鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、７
２０ヌクレオチドのＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物
を平滑化するためにクレノー断片（Klenow Fragment ；
日本ジーン製）処理を行い、さらにT4 polynucleotide
Kinase（日本ジーン製）により両端をリン酸化し、これ
をＥｃｏＲＶ切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ
（＋）ベクターにT4 DNA Ligase を用いて挿入した。ア
ミノ酸配列を決定した結果、このＰＣＲ産物がウシプロ
テアソームＰ１１２蛋白質のアミノ酸配列と高い相同性
を示したので、この断片をRandomPrimer Labeling Kit
（宝酒造製）を用いてα-³²Ｐ- ｄＣＴＰで標識し、ク
ローン単離用プローブとした。

【００２４】（４）クローンの単離（２）で得られたｃＤＮＡライブラリーをＮＺＹプレー
ト（直径１５０ｍｍ；ファルコン社製）上に１プレート
あたり約５万プラークが形成されるように、計１０プレ
ートまき、このプレート上にナイロンフィルターである
Hyboind N+（アマシャム製）をのせ、１. ５ＭＮａＣ
ｌ、０. ５ＮＮａＯＨ水溶液を用いて固定後、４２℃で
６時間、（３）で得られたプローブを用いてプレハイブ
リダイゼーション(Prehybridization)を行い、さらに４
２℃で１２時間、ハイブリダイゼーション(Hybridizati
on) を行った。

【００２５】１回目のスクリーニングで１１個のクロー
ンを得、これらのクローンについてＮＺＹプレート（直
径９０ｍｍ；岩城硝子製）上に１プレートにつき１００
から２００プラークになるようにまき、２回目のスクリ
ーニングを行い、５個のクローンを得た。得られたクロ
ーンをXL1-Blue、Helper Phage R408 （STRATAGENE社
製）と共に感染させ、λＺＡＰIIからｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＳＫ(-) への切り出し、ＸＬ１- Ｂｌｕｅへの形
質転換を行い、得られたクローンのうち約３キロベース
の挿入を持つものが２個得られた。

【００２６】（５）ｃＤＮＡ塩基配列の決定（４）で得られた約３キロベースの挿入を持つ２個のク
ローンのうちの１つについてサブクローンするためにｃ
ＤＮＡインサートの５’側、３’側両方向からそれぞれ
様々な長さのデリーションクローン(Deletion clone)を
作成した。５’側からのDeletion cloneはｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＳＫ(-) のマルチクローニングサイトの制限
酵素ＳａｃＩとＳｐｅＩで切断後、エキソヌクレアーゼ
III （日本ジーン製）によりＳｐｅＩ部位より１〜１０
分間消化し、Mung Bean nuclease（日本ジーン製）によ
り１本鎖ｃＤＮＡを消化し、さらにクレノー断片により
完全に平滑末端にし、T4DNA リガーゼにより環状化さ
せ、大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換した。３’側からの
Deletion cloneはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ(-) の制
限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄIII で切断後、５’側Deleti
on cloneと同様にして得た。

【００２７】塩基配列の解析は、A.L.F.DNA Sequencer
、Auto Read Sequencing Kit（ファルマシア製）を用
い、サンガー等のジデオキシターミネーション法(Proc.
Natl.Acad.Sci. U.S.A.,74, 5463-5467, 1977)に基づい
て行った。以上のようにして得られたヒトプロテアソー
ムの構成成分Ｐ１１２蛋白質のｃＤＮＡの塩基配列を配
列番号２に示した。ｃＤＮＡの全長は３１７５ヌクレオ
チドで、そのうちコード領域は２８５９ヌクレオチドで
あり、アミノ酸９５３残基に相当した。配列番号１にＰ
１１２蛋白質のアミノ酸配列を示した。図２にヒトプロ
テアソームの構成成分Ｐ１１２のｃＤＮＡの制限酵素地
図を示した。

【００２８】（６）Ｐ１１２蛋白質発現ベクターの構
築ヒトプロテアソーム構成成分Ｐ１１２蛋白質の発現ベク
ターを以下のようにして構築した。Ｐ１１２蛋白質のｃ
ＤＮＡのＮ末端メチオニンを含むセンス鎖のプライマー
（5'-GAAGCTTATGATCACCTCGGCCGCTGG-3' ）とｃＤＮＡ塩
基配列の４８３ｂｐにあるＡａｔIIサイトを含むアンチ
センス鎖のプライマー（5'-AAAGACGTCCAGTCTTCGTG-3'）
を用いてＰＣＲを行い、得られたＰ１１２蛋白質のｃＤ
ＮＡのＮ末端側をコードしているＰＣＲ産物を、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(Polynucleotide Kinase) により
リン酸化し、クレノー断片により完全に平滑化した。さ
らに制限酵素ＡａｔIIで消化し、Ｐ１１２蛋白質のｃＤ
ＮＡオリジナルクローンを制限酵素ＡａｔIIとＳｍａＩ
（マルチクローニングサイト）で消化し、ウシ腸アルカ
リホスファターゼ(Calf Intestine Alkaline Phosphata
se) で脱リン酸化したベクターにT4 DNA Ligase により
挿入した。得られたＰ１１２蛋白質のｃＤＮＡ発現ベク
ターの構造を図３に示した。この発現ベクターを大腸菌
ＨＢ１０１株へ導入し、イソプロピル−１−チオ−β−
Ｄ−ガラクトシドで誘導をかけることにより、菌体中に
Ｐ１１２蛋白質が得られることを、（１）と同様の逆相
ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に
より確認した。

【００２９】実施例２ヒトプロテアソームの構成成分Ｐ３１蛋白質の遺伝子の
クローニングは実施例１と同様に行った。但し、プライ
マーはＰ３１蛋白質の部分アミノ酸配列の分析から得ら
れたＸＩＬＥＩＧＡＱＷＳＩ（配列中、Ｘは未決定アミ
ノ酸を意味する）のセンス鎖〔5'-ATTTTTGAGATTGGTGC(G
/T)CAGTGG(A/T)(G/T)TAT-3' 〕およびＸＡＥＦＨＴＥＬ
ＥＲＬのアンチセンス鎖〔5'-AGTCTTTCTAGTTC(G/T)GTGT
GGAATTC(G/T)GC-3' 〕を合成して使用した。また、実施
例１と同様にしてＨｅｐＧ２の１本鎖ｃＤＮＡを鋳型と
してＰＣＲを行ったところ、約２００ヌクレオチドのＰ
ＣＲ産物を得、以下実施例１の（３）と同様にしてRand
om Primer Labeling Kit（宝酒造製）を用いてα-³²Ｐ
- ｄＣＴＰで標識し、クローン単離用プローブを得た。

【００３０】クローンの単離についても実施例１の
（４）と同様に行った結果、１回目のスクリーニングで
１４個のクローンを得、これらのクローンについてＮＺ
Ｙプレート（直径９０ｍｍ）上に１プレートにつき１０
０から２００プラークになるようにまき、２回目のスク
リーニングを行い、５個のクローンを得た。得られたク
ローンをXL1-Blue、Helper Phage R408 （STRATAGENE社
製）と共に感染させ、λＺＡＰIIからｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＳＫ(-) への切り出し、ＸＬ１- Ｂｌｕｅへの形
質転換を行い塩基配列を決定した。その結果、ヒトプロ
テアソーム構成成分Ｐ３１蛋白質のｃＤＮＡは９２８ヌ
クレオチドであり、そのうちコード領域は７７１ヌクレ
オチドであり、アミノ酸２５７アミノ酸に相当した。配
列番号４にＰ３１蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配
列を、配列番号３にＰ３１蛋白質のアミノ酸配列をそれ
ぞれ示した。また、図４にヒトプロテアソームの構成成
分Ｐ３１蛋白質のｃＤＮＡの制限酵素地図を示した。

【００３１】ヒトプロテアソーム構成成分Ｐ３１蛋白質
の発現ベクターは実施例１の（６）と同様にして構築し
た。この発現ベクターを大腸菌ＨＢ１０１株へ導入し、
イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドで誘導
をかけることにより、菌体中にＰ３１蛋白質が得られる
ことを、実施例１で示した逆相ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動により確認した。

【００３２】

【発明の効果】本発明により、ヒト２６Ｓプロテアソー
ム構成成分蛋白質が提供される。本発明のヒト２６Ｓプ
ロテアソーム構成成分蛋白質は、ヒト２６Ｓプロテアソ
ームの機能解明に有用であるだけでなく、悪性腫瘍をは
じめとする各種病態の診断および治療法として有用であ
る。

【００３３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：953 配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド Met Ile Thr Ser Ala Ala Gly Ile Ile Ser Leu Leu Asp Glu Asp Glu 5 10 15 Pro Gln Leu Lys Glu Phe Ala Leu His Lys Leu Asn Ala Val Val Asn 20 25 30 Asp Phe Trp Ala Glu Ile Ser Glu Ser Val Asp Lys Ile Glu Val Leu 35 40 45 Tyr Glu Asp Glu Gly Phe Arg Ser Arg Gln Phe Ala Ala Leu Val Ala 50 55 60 Ser Lys Val Phe Tyr His Leu Gly Ala Phe Glu Glu Ser Leu Asn Tyr 65 70 75 80 Ala Leu Gly Ala Arg Asp Leu Phe Asn Val Asn Asp Asn Ser Glu Tyr 85 90 95 Val Glu Thr Ile Ile Ala Lys Cys Ile Asp His Tyr Thr Lys Gln Cys 100 105 110 Val Glu Asn Ala Asp Leu Pro Glu Gly Glu Lys Lys Pro Ile Asp Gln 115 120 125 Arg Leu Glu Gly Ile Val Asn Lys Met Phe Gln Arg Cys Leu Asp Asp 130 135 140 His Lys Tyr Lys Gln Ala Ile Gly Ile Ala Leu Glu Thr Arg Arg Leu 145 150 155 160 Asp Val Phe Glu Lys Thr Ile Leu Glu Ser Asn Asp Val Pro Gly Met 165 170 175 Leu Ala Tyr Ser Leu Lys Leu Cys Met Ser Leu Met Gln Asn Lys Gln 180 185 190 Phe Arg Asn Lys Val Leu Arg Val Leu Val Lys Ile Tyr Met Asn Leu 195 200 205 Glu Lys Pro Asp Phe Ile Asn Val Cys Gln Cys Leu Ile Phe Leu Asp 210 215 220 Asp Pro Gln Ala Val Ser Asp Ile Leu Glu Lys Leu Val Lys Glu Asp 225 230 235 240 Asn Leu Leu Met Ala Tyr Gln Ile Cys Phe Asp Leu Tyr Glu Ser Ala 245 250 255 Ser Gln Gln Phe Leu Ser Ser Val Ile Gln Asn Leu Arg Thr Val Gly 260 265 270 Thr Pro Ile Ala Ser Val Pro Gly Ser Thr Asn Thr Gly Thr Val Pro 275 280 285 Gly Ser Glu Lys Asp Ser Asp Ser Met Glu Thr Glu Glu Lys Thr Ser 290 295 300 Ser Ala Phe Val Gly Lys Thr Pro Glu Ala Ser Pro Glu Pro Lys Asp 305 310 315 320 Gln Thr Leu Lys Met Ile Lys Ile Leu Ser Gly Glu Met Ala Ile Glu 325 330 335 Leu His Leu Gln Phe Leu Ile Arg Asn Asn Asn Thr Asp Leu Met Ile 340 345 350 Leu Lys Asn Thr Lys Asp Ala Val Arg Asn Ser Val Cys His Thr Ala 355 360 365 Thr Val Ile Ala Asn Ser Phe Met His Cys Gly Thr Thr Ser Asp Gln 370 375 380 Phe Leu Arg Asp Asn Leu Glu Trp Leu Ala Arg Ala Thr Asn Trp Ala 385 390 395 400 Lys Phe Thr Ala Thr Ala Ser Leu Gly Val Ile His Lys Gly His Glu 405 410 415 Lys Glu Ala Leu Gln Leu Met Ala Thr Tyr Leu Pro Lys Asp Thr Ser 420 425 430 Pro Gly Ser Ala Tyr Gln Glu Gly Gly Gly Leu Tyr Ala Leu Gly Leu 435 440 445 Ile His Ala Asn His Gly Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Leu Leu Asn Gln 450 455 460 Leu Lys Asn Ala Ser Asn Asp Ile Val Arg His Gly Gly Ser Leu Gly 465 470 475 480 Leu Gly Leu Ala Ala Met Gly Thr Ala Arg Gln Asp Val Tyr Asp Leu 485 490 495 Leu Lys Thr Asn Leu Tyr Gln Asp Asp Ala Val Thr Gly Glu Ala Ala 500 505 510 Gly Leu Ala Leu Gly Leu Val Met Leu Gly Ser Lys Asn Ala Gln Ala 515 520 525 Ile Glu Asp Met Val Gly Tyr Ala Gln Glu Thr Gln His Glu Lys Ile 530 535 540 Leu Arg Gly Leu Ala Val Gly Ile Ala Leu Val Met Tyr Gly Arg Met 545 550 555 560 Glu Glu Ala Asp Ala Leu Ile Glu Ser Leu Cys Arg Asp Lys Asp Pro 565 570 575 Ile Leu Arg Arg Ser Gly Met Tyr Thr Val Ala Met Ala Tyr Cys Gly 580 585 590 Ser Gly Asn Asn Lys Ala Ile Arg Arg Leu Leu His Val Ala Val Ser 595 600 605 Asp Val Asn Asp Asp Val Arg Ser Ala Ala Val Glu Ser Leu Gly Phe 610 615 620 Ile Leu Phe Arg Thr Pro Glu Gln Cys Pro Ser Val Val Ser Leu Leu 625 630 635 640 Ser Glu Ser Tyr Asn Pro His Val Arg Tyr Gly Ala Ala Met Ala Leu 645 650 655 Gly Ile Cys Cys Ala Gly Thr Gly Asn Lys Glu Ala Ile Asn Leu Leu 660 665 670 Glu Pro Met Thr Asn Asp Pro Val Asn Tyr Val Arg Gln Gly Ala Leu 675 680 685 Ile Ala Ser Ala Leu Ile Met Ile Gln Gln Thr Glu Ile Thr Cys Pro 690 695 700 Lys Val Asn Gln Phe Arg Gln Leu Tyr Ser Lys Val Ile Asn Asp Lys 705 710 715 720 His Asp Asp Val Met Ala Lys Phe Gly Ala Ile Leu Ala Gln Gly Ile 725 730 735 Leu Asp Ala Gly Gly His Asn Val Thr Ile Ser Leu Gln Ser Arg Thr 740 745 750 Gly His Thr His Met Pro Ser Val Val Gly Val Leu Val Phe Thr Gln 755 760 765 Phe Trp Phe Trp Phe Pro Leu Ser His Phe Leu Ser Leu Ala Tyr Thr 770 775 780 Pro Thr Cys Val Ile Gly Leu Asn Lys Asp Leu Lys Met Pro Lys Val 785 790 795 800 Gln Tyr Lys Ser Asn Cys Lys Pro Ser Thr Phe Ala Tyr Pro Ala Pro 805 810 815 Leu Glu Val Pro Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Val Ser Thr Ala Val 820 825 830 Leu Ser Ile Thr Ala Lys Ala Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys 835 840 845 Lys Glu Glu Glu Lys Met Glu Val Asp Glu Ala Glu Lys Lys Glu Glu 850 855 860 Lys Glu Lys Lys Lys Glu Pro Glu Pro Asn Phe Gln Leu Leu Asp Asn Pro Ala Arg Val Met Pro Ala Gln Leu Lys Val Leu Thr Met Pro Glu 885 890 895 Thr Cys Arg Tyr Gln Pro Phe Lys Pro Leu Ser Ile Gly Gly Ile Ile 900 905 910 Ile Leu Lys Asp Thr Ser Glu Asp Ile Glu Glu Leu Val Glu Pro Val 915 920 925 Ala Ala His Gly Pro Lys Ile Glu Glu Glu Glu Gln Glu Pro Glu Pro 930 935 940 Pro Glu Pro Phe Glu Tyr Ile Asp Asp 945 950 953

【００３４】配列番号：２配列の長さ：2859 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ATGATCACCT CGGCCGCTGG AATTATTTCT CTTCTGGATG AAGATGAACC ACAGCTTAAG 60 GAATTTGCAC TACACAAATT GAATGCAGTT GTTAATGACT TCTGGGCAGA AATTTCCGAG 120 TCCGTAGACA AAATAGAGGT TTTATACGAA GATGAAGGTT TCCGGAGTCG GCAGTTTGCA 180 GCCTTAGTGG CATCTAAAGT ATTTTATCAC CTGGGGGCTT TTGAGGAGTC TCTGAATTAT 240 GCTCTTGGAG CAAGGGACCT CTTCAATGTC AATGATAACT CTGAATATGT GGAAACTATT 300 ATAGCAAAAT GCATTGATCA CTACACCAAA CAATGTGTGG AAAATGCAGA TTTGCCTGAA 360 GGAGAAAAAA AACCAATTGA CCAGAGATTG GAAGGCATCG TAAATAAAAT GTTCCAGCGA 420 TGTCTAGATG ATCACAAGTA TAAACAGGCT ATTGGCATTG CTCTGGAGAC ACGAAGACTG 480 GACGTCTTTG AAAAGACCAT ACTGGAGTCG AATGATGTCC CAGGAATGTT AGCTTATAGC 540 CTTAAGCTCT GCATGTCTTT AATGCAGAAT AAACAGTTTC GGAATAAAGT ACTAAGAGTT 600 CTAGTTAAAA TCTACATGAA CTTGGAGAAA CCTGATTTCA TCAATGTTTG TCAGTGCTTA 660 ATTTTCTTAG ATGATCCTCA GGCTGTGAGT GATATCTTAG AGAAACTGGT AAAGGAAGAC 720 AACCTCCTGA TGGCATATCA GATTTGTTTT GATTTGTATG AAAGTGCTAG CCAGCAGTTT 780 TTGTCATCTG TAATCCAGAA TCTTCGAACT GTTGGCACCC CTATTGCTTC TGTGCCTGGA 840 TCCACTAATA CGGGTACTGT TCCGGGATCA GAGAAAGACA GTGACTCGAT GGAAACAGAA 900 GAAAAGACAA GCAGTGCATT TGTAGGAAAG ACACCAGAAG CCAGTCCAGA GCCTAAGGAC 960 CAGACTTTGA AAATGATTAA AATTTTAAGT GGTGAAATGG CTATTGAGTT ACATCTGCAG 1020 TTCTTAATAC GAAACAATAA TACAGACCTC ATGATTCTAA AAAACACAAA GGATGCAGTA 1080 CGGAATTCTG TATGTCATAC TGCAACCGTT ATAGCAAACT CTTTTATGCA CTGTGGGACA 1140 ACCAGTGACC AGTTTCTTAG AGATAATTTG GAATGGTTAG CCAGAGCCAC TAACTGGGCA 1200 AAATTTACTG CTACAGCCAG TTTGGGTGTA ATTCATAAGG GTCATGAAAA AGAAGCATTA 1260 CAGTTAATGG CAACATACCT TCCCAAGGAT ACTTCTCCAG GATCAGCCTA TCAGGAAGGT 1320 GGAGGTCTCT ATGCACTAGG TCTTATTCAT GCCAATCATG GTGGTGATAT AATTGACTAT 1380 CTGCTTAATC AGCTTAAGAA CGCCAGCAAT GATATCGTTA GACACGGTGG CAGTCTGGGC 1440 CTTGGTTTGG CAGCCATGGG AACTGCACGT CAAGATGTTT ATGATTTGCT AAAAACAAAC 1500 CTTTATCAGG ATGATGCAGT AACAGGGGAA GCAGCTGGCC TGGCCCTAGG TTTGGTTATG 1560 TTGGGCTCTA AAAATGCTCA GGCTATTGAG GACATGGTTG GTTATGCACA AGAAACTCAA 1620 CATGAGAAGA TTCTGCGTGG TCTTGCAGTT GGCATAGCTT TAGTAATGTA TGGGAGGATG 1680 GAAGAGGCTG ATGCTCTCAT TGAATCTCTC TGTCGTGACA AGGACCCAAT TCTTCGAAGG 1740 TCTGGAATGT ATACTGTAGC CATGGCTTAT TGTGGCTCTG GTAACAACAA AGCAATTCGA 1800 CGCCTGCTAC ATGTGGCTGT AAGTGATGTG AATGATGATG TCAGGAGTGC AGCAGTAGAA 1860 TCACTTGGGT TCATTCTATT CAGAACCCCT GAACAGTGCC CAAGTGTTGT CTCTTTGTTG 1920 TCAGAGAGTT ACAACCCTCA TGTGCGCTAC GGAGCTGCAA TGGCCTTGGG GATATGCTGT 1980 GCTGGTACAG GAAACAAGGA AGCCATTAAT TTGCTAGAAC CAATGACAAA CGACCCCGTG 2040 AACTACGTGA GGCAAGGGGC ACTCATAGCT TCAGCTCTCA TCATGATCCA GCAGACTGAA 2100 ATCACTTGTC CAAAGGTGAA TCAGTTCAGA CAGCTGTATT CCAAAGTCAT CAATGATAAG 2160 CATGATGATG TCATGGCCAA GTTTGGCGCT ATTCTGGCCC AGGGCATACT GGATGCAGGT 2220 GGTCATAATG TCACAATCTC CTTGCAGTCC AGGACTGGGC ATACTCATAT GCCTTCTGTG 2280 GTTGGCGTCC TTGTATTTAC CCAGTTTTGG TTCTGGTTTC CTCTTTCACA CTTCCTGTCA 2340 TTGGCTTATA CCCCTACCTG TGTCATTGGC CTTAACAAGG ACTTAAAGAT GCCGAAAGTT 2400 CAGTATAAAT CGAACTGTAA ACCATCCACA TTTGCATATC CTGCCCCTCT GGAAGTACCA 2460 AAAGAAAAAG AAAAGGAAAA GGTTTCTACT GCTGTATTAT CTATAACTGC CAAGGCTAAA 2520 AAGAAGGAAA AAGAAAAGGA AAAAAAGGAG GAGGAGAAAA TGGAAGTGGA TGAGGCAGAG 2580 AAAAAGGAGG AAAAAGAGAA GAAAAAAGAA CCTGAGCCAA ACTTCCAGTT ATTGGATAAC 2640 CCAGCCCGAG TTATGCCTGC CCAGCTTAAG GTCCTAACCA TGCCGGAGAC CTGTAGATAC 2700 CAGCCTTTCA AACCACTCTC TATTGGAGGC ATCATCATTC TGAAGGATAC CAGTGAAGAC 2760 ATTGAGGAGC TGGTGGAACC TGTGGCAGCA CATGGCCCAA AAATCGAGGA GGAGGAACAA 2820 GAGCCAGAAC CCCCAGAACC ATTTGAGTAT ATTGATGAT 2859

【００３５】配列番号：３配列の長さ：257 配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド Met Tyr Glu Gln Leu Lys Gly Glu Trp Asn Arg Lys Ser Pro Asn Leu 5 10 15 Ser Lys Cys Gly Glu Glu Leu Gly Arg Leu Lys Leu Val Leu Leu Glu 20 25 30 Leu Asn Phe Leu Pro Thr Thr Gly Thr Lys Leu Thr Lys Gln Gln Leu 35 40 45 Ile Leu Ala Arg Asp Ile Leu Glu Ile Gly Ala Gln Trp Ser Ile Leu 50 55 60 Arg Lys Asp Ile Pro Ser Phe Glu Arg Tyr Met Ala Gln Leu Lys Cys 65 70 75 80 Tyr Tyr Phe Asp Tyr Lys Glu Gln Leu Pro Glu Ser Ala Tyr Met His 85 90 95 Gln Leu Leu Gly Leu Asn Leu Leu Phe Leu Leu Ser Gln Asn Arg Val 100 105 110 Ala Glu Phe His Thr Glu Leu Glu Arg Leu Pro Ala Lys Asp Ile Gln 115 120 125 Thr Asn Val Tyr Ile Lys His Pro Val Ser Leu Glu Gln Tyr Leu Met 130 135 140 Glu Gly Ser Tyr Asn Lys Val Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ile Pro Ala 145 150 155 160 Glu Ser Tyr Thr Phe Phe Ile Asp Ile Leu Leu Asp Thr Ile Arg Asp 165 170 175 Glu Ile Ala Gly Cys Ile Glu Lys Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Phe Thr 180 185 190 Glu Ala Thr Arg Ile Leu Phe Phe Asn Thr Pro Lys Lys Met Thr Asp 195 200 205 Tyr Ala Lys Lys Arg Gly Trp Val Leu Gly Pro Asn Asn Tyr Tyr Ser 210 215 220 Phe Ala Ser Gln Gln Gln Lys Pro Glu Asp Thr Thr Ile Pro Ser Thr 225 230 235 240 Glu Leu Ala Lys Gln Val Ile Glu Tyr Ala Arg Gln Leu Glu Met Ile 245 250 255 Val 257

【００３６】配列番号：４配列の長さ：771 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ATGTACGAGC AACTCAAGGG CGAGTGGAAC CGTAAAAGCC CCAATCTTAG CAAGTGCGGG 60 GAAGAGCTGG GTCGACTCAA GCTAGTTCTT CTGGAGCTCA ACTTCTTGCC AACCACAGGG 120 ACCAAGCTGA CCAAACAGCA GCTAATTCTG GCCCGTGACA TACTGGAGAT CGGGGCCCAA 180 TGGAGCATCC TACGCAAGGA CATCCCCTCC TTCGAGCGCT ACATGGCCCA GCTCAAATGC 240 TACTACTTTG ATTACAAGGA GCAGCTCCCC GAGTCAGCCT ATATGCACCA GCTCTTGGGC 300 CTCAACCTCC TCTTCCTGCT GTCCCAGAAC CGGGTGGCTG AGTTCCACAC GGAGTTGGAG 360 CGGCTGCCTG CCAAGGACAT ACAGACCAAT GTCTACATCA AGCACCCAGT GTCCCTGGAG 420 CAATACCTGA TGGAGGGCAG CTACAACAAA GTGTTCCTGG CCAAGGGTAA CATCCCCGCC 480 GAGAGCTACA CCTTCTTCAT TGACATCCTG CTCGACACTA TCAGGGATGA GATCGCTGGG 540 TGCATCGAGA AGGCCTACGA GAAAATCCTT TTCACTGAGG CCACCCGGAT CCTCTTCTTC 600 AACACACCCA AAAAGATGAC AGACTACGCC AAGAAGCGAG GGTGGGTCCT GGGCCCCAAC 660 AACTACTACA GTTTTGCCAG CCAGCAGCAG AAGCCGGAAG ACACCACCAT TCCCTCCACA 720 GAACTGGCCA AACAGGTCAT CGAGTATGCC CGGCAGCTGG AGATGATCGT C 771

【図面の簡単な説明】

【図１】は、ヒト２６ＳプロテアソームのＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動の結果を示す。レーン１はヒト
２６Ｓプロテアソーム、レーン２は構成成分Ｐ１１２蛋
白質、レーン３は構成成分Ｐ３１蛋白質をそれぞれ示
す。

【図２】は、ヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ１１
２蛋白質のｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。実線はベク
ターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ(-) を示し、黒
いカラムはＰ１１２のｃＤＮＡの翻訳領域を示し、白い
カラムは５’および３’の非翻訳領域を示す。なお、カ
ラム下の数値は開始コドンＡＴＧの１番目および終止コ
ドンの１ｂｐ前のヌクレオチドの位置を示す。

【図３】は、ヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ１１
２蛋白質およびＰ３１蛋白質のｃＤＮＡ発現ベクターの
構造を示す。

【図４】は、ヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ３１
蛋白質のｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。実線はベクタ
ーであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ(-) を示し、黒い
カラムはＰ３１蛋白質のｃＤＮＡの翻訳領域を示し、白
いカラムは５’および３’の非翻訳領域を示す。なお、
カラム下の数値は開始コドンＡＴＧの１番目および終止
コドンの１ｂｐ前のヌクレオチドの位置を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/46 ＡＡＭＡＢＡＡＤＳＡＤＵＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＢＡＡＤＳＡＤＵ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で示されるアミノ酸配列を含
むヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ１１２蛋白質。
【請求項２】請求項１記載のヒト２６Ｓプロテアソー
ム構成成分Ｐ１１２蛋白質をコードするｃＤＮＡまたは
該ｃＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ。
【請求項３】配列番号２で示される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡ。
【請求項４】請求項２記載のヒト２６Ｓプロテアソー
ム構成成分Ｐ１１２蛋白質をコードするｃＤＮＡまたは
該ｃＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが組み込まれた組換
え体ベクター。
【請求項５】配列番号２で示される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡまたは該ｃＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが組み
込まれた組換え体ベクター。
【請求項６】配列番号２で示される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡまたは該ｃＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが組み
込まれた組換え体ベクターＰ１１２。
【請求項７】請求項４、５または６記載の組換え体ベ
クターを含有する細胞。
【請求項８】配列番号３で示されるアミノ酸配列を含
むヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ３１蛋白質。
【請求項９】請求項１記載のヒト２６Ｓプロテアソー
ム構成成分Ｐ３１蛋白質をコードするｃＤＮＡまたは該
ｃＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ。
【請求項１０】配列番号４で示される塩基配列を含む
ｃＤＮＡ。
【請求項１１】請求項９記載のヒト２６Ｓプロテアソ
ーム構成成分Ｐ３１蛋白質をコードするｃＤＮＡまたは
該ｃＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが組み込まれた組換
え体ベクター。
【請求項１２】配列番号４で示される塩基配列を含む
ｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが組
み込まれた組換え体ベクター。
【請求項１３】配列番号４で示される塩基配列を含む
ｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが組
み込まれた組換え体ベクターＰ３１。
【請求項１４】請求項１１、１２または１３記載の組
換え体ベクターを含有する細胞。