JP3125235B2 - ヒト２６ｓプロテアソーム - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト２６Ｓプロテアソ
ームに関するものであり、さらに詳しくは、ＡＴＰ依存
的にユビキチン結合蛋白質を分解する新規な細胞内多機
能プロテアーゼに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】細胞内で不必要あるいは異常な蛋白質が
分解される機構として、ユビキチン依存的分解経路が知
られている〔Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ，Ｍ．ｅｄ．，Ｕ
ｂｉ−ｑｕｉｔｉｎ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）〕。ユビキチンは分子量約８，５００の蛋
白質で、真核生物の細胞に普遍的に存在し、種々の蛋白
質にイソペプチド結合し、分解のための目印となる。こ
のユビキチンによる蛋白質の修飾および分解にはＡＴＰ
をエネルギー源として必要とすることがわっかている。
しかしながら、このユビキチン化した蛋白質を分解する
酵素の実体については明かになっていないことから、こ
のような、ユビキチン化した蛋白質を分解する機構が解
明できれば、細胞内における不必要あるいは異常な蛋白
質の動態を把握することが可能となり、さらに、各種病
態の診断、および治療法を確立する上で、きわめて有益
であり、その解明が、強く要請されていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者等
は、これまで、構造が解明されていないユビキチン化し
た蛋白質を分解する酵素の詳細を明かにすることを目標
とし、鋭意研究を積み重ねた結果、当該蛋白質を分解す
る酵素として、ヒト２６Ｓプロテアソームを見い出すと
共に、これを精製し、単離することに成功して本発明を
完成するに至った。

【０００４】すなわち、本発明は、ユビキチン化した蛋
白質を分解する新規な細胞内多機能プロテアーゼである
ヒト２６Ｓプロテアソームを提供することを目的とする
ものである。また、本発明は、当該酵素を安定に製造す
る方法およびその酵素学的および物理学的性質も提供す
ることを目的とするものである。さらに、本発明は、ヒ
ト２６Ｓプロテアソームの詳細を明らかにすることによ
り、当該酵素の機能とユビキチン化した蛋白質の分解機
構の解明に役立つのみならず、各種病態の診断、および
治療法として、役立つ新しい技術を提供することを目的
とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るための本発明の構成は、以下の（１）〜（２）からな
る。 （１）ヒト臓器、細胞の細胞質画分より、グリセリン、
２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトー
ル、およびＡＴＰを添加した分離溶媒を用いて、ゲル濾
過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、イオン交換
カラム、およびグリセロール密度勾配遠心を用いた物理
化学的分離方法により精製して製造された、安定な状態
で精製されたヒト２６Ｓプロテアソームであって、下記
の酵素学的および物理学的性質； (1) サクシニル−ロイシル−バリル−チロシン−４−メ
チルクマリル−７−アミドを分解する活性が１０−２０
ｎｍｏｌｅｓ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎである： (2) ユビキチンが結合した蛋白質をＡＴＰ存在下で分解
する活性を有する：(3) ＡＴＰを分解する活性を有する：(4) 超遠心法で測定した沈降係数は２６Ｓである：(5) 分子量は約２０００ｋＤａ（キロダルトン）で、２
１ー３１ｋＤａの２０Ｓプロテアソームと、それ以外に
分子量３５ー１１０ｋＤａの制御因子蛋白質群より構成
される：(6) 電子顕微鏡で観察した分子形状はダンベル状で、そ
の中央部にプロテアソームの構造が認められる：を有するヒト２６Ｓプロテアソーム。

【０００６】（２）前記（１）に記載の、ヒト臓器、細
胞の細胞質画分より安定な状態で精製されたヒト２６Ｓ
プロテアソームを製造する方法であって、ヒト臓器、細
胞の細胞質画分からのヒト２６Ｓプロテアソームを、グ
リセリン、２−メルカプトエタノールあるいはジチオス
レイトール、およびＡＴＰを添加した分離溶媒を用い
て、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、
イオン交換カラム、およびグリセロール密度勾配遠心を
用いた物理化学的分離方法により精製して、安定な状態
で精製されたヒト２６Ｓプロテアソームを調製すること
を特徴とするヒト２６Ｓプロテアソームの製造方法。

【０００７】

【０００８】続いて、本発明についてさらに詳細に説明
する。本発明者等は、これまで、構造が解明されていな
いユビキチン化した蛋白質を分解する酵素の詳細を明か
にすることを目標とし、鋭意研究を重ねてきた。その結
果、本発明により、当該酵素は、既に本発明者等が報告
した２０Ｓプロテアソーム（多機能プロテアーゼ、分子
量約７５０ｋＤａ) 〔Tanaka K., et al., J.Mol. Bio
l., 203, 985ー996 (1988)]と未知機能をもった制御因子
が結合した巨大な複合体であることがわかり、本発明者
等は、２６Ｓプロテアソーム（分子量約２、０００ｋＤ
ａ）と命名した。

【０００９】２０Ｓプロテアソームは、同一分子内に複
数の触媒活性をもつ多成分複合体プロテアーゼであり、
また酸性、塩基性、中性のアミノ酸を分解する多機能性
プロテアーゼでもあるが、ユビキチン化した蛋白質を分
解する活性はなかった。従って、本発明２６Ｓプロテア
ソームは、プロテアーゼとしての２０Ｓプロテアソーム
が、制御因子と結合することにより、ユビキチン化した
蛋白質を識別して、分解するという新しい機能を獲得し
ていることがわかった。さらに、当該酵素の新しい機能
として、ＡＴＰａｓｅ活性をもつことが明かになった。

【００１０】本発明のヒト２６Ｓプロテアソームは、こ
れを用いることにより、当該酵素の機能とユビキチン化
した蛋白質の分解機構の解明に役立つのみならず、各種
病態の診断および治療法として役立つ技術が提供され
る。２６Ｓプロテアソームの主要な機能は、ユビキチン
が結合した蛋白質を分解する活性をもつことであるが、
最近、癌遺伝子や細胞周期関連遺伝子がこのユビキチン
依存性の分解経路で分解されることが報告され注目され
ている。これら蛋白質の例としては、ｃーｍｙｃ癌遺伝
子産物、ｐ５３癌抑制遺伝子産物〔Scheffn-er M., et
al., Cell, 63, 1129ー1136(1990)]、ｃｄｃ２キナーゼ
調節蛋白質であるサイクリン〔Clotzer M., et al., Na
ture, 349, 132ー138 (1991)]などが挙げられる。従っ
て、本発明のヒト２６Ｓプロテアソームを用いることに
より、癌化のメカニズムの解明や癌の治療および診断に
有用である。

【００１１】また、アルツハイマー病患者の脳内にはユ
ビキチン化した蛋白質が異常蓄積しており、少なくと
も、この疾患の原因の一つに細胞内における蛋白質分解
系の異常があることが示唆された。従って、本発明のヒ
ト２６Ｓプロテアソームを用いることにより、アルツハ
イマー病のメカニズムの解明やアルツハイマー病の治療
および診断に有用である。

【００１２】このように、本発明の２６Ｓプロテアソー
ムの使用あるいは測定法の開発は、これらの病態と本酵
素との関わりのヒトにおける治療法および／または診断
法の開発に有用である。かかる測定には、例えば通常の
免疫測定法が使用でき、本発明の２６Ｓプロテアソーム
は該測定に使用する抗体の抗原として用いることができ
る。

【００１３】本発明ヒト２６Ｓプロテアソームの特性を
有する蛋白質を得る製造方法について、詳述すると、以
下の通りである。本発明ヒト２６Ｓプロテアソームはヒ
トの種々の組織、器官、産生細胞から、より具体的に
は、ヒト腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胸腺、などの各種
臓器およびヒト肝癌細胞株、ヒト腎臓細胞株などの樹立
細胞株の細胞質画分より得ることができる。上記の細胞
質分画の調製は、通常の細胞質分画法によることができ
る。例えば、上記記載の細胞をホモジネートし、遠心分
離することにより、細胞膜、核、ミトコンドリア、リソ
ゾームおよびミクロソームの分画を除き、その上清を細
胞質分画として使用できる。

【００１４】かかる細胞質画分からの本発明ヒト２６Ｓ
プロテアソームの分離、精製は、当該酵素の酵素化学
的、物理化学的性質等を利用した各種の処理操作により
実施することができる。例えば、これらの分離、精製方
法としては、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法などの主
として分子量の差を利用する方法、イオンクロマトグラ
フィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティク
ロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、
等電点電気泳動法などの等電点を利用する方法などが挙
げられる。

【００１５】しかしながら、ＡＴＰ依存的にユビキチン
結合蛋白質を分解する２６Ｓプロテアソームの分離、精
製は既に本発明者等が報告した２０Ｓプロテアソームに
比較して、非常に難しい。その理由として、（ｉ）２６
Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームに比較して
非常に不安定である、（ｉｉ）２６Ｓプロテアソームの
活性を検出するためのアッセイ系の確立が容易でないこ
とによる。

【００１６】かかる課題を解決するために、鋭意、検討
を重ねた結果、（ｉ）の課題に対しては２６Ｓ型プロテ
アソームを安定化させる条件として、グリセリン、２ー
メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール、そ
してＡＴＰを分離溶媒中に添加しておくことにより、安
定化させることができた。しかしながら、蛋白質の高次
構造に影響する処理、クロマトグラフィーを繰り返す
と、２６Ｓプロテアソームは、その構成要素に不可逆的
に解離した。

【００１７】従って、本発明者等は、主として、分子サ
イズの違いによる分離を基本戦略として、必要に応じて
最小限のクロマトグラフィーの操作を行なう分離、精製
方法を発明するに至った。より、具体的には、超遠心法
により得た細胞質画分をバイオゲルカラム（バイオラッ
ド社製）、ハイドロキシアパタイトカラム、Ｑーセファ
ロースカラム、グリセロール密度勾配遠心により分離、
精製することにより、本発明２６Ｓプロテアソームを精
製するに至った。

【００１８】次に、（ｉｉ）の課題に対しては、２６Ｓ
プロテアソームの鋭敏なアッセイ法を開発した。一つは
ユビキチン結合蛋白質分解活性の測定に供する基質蛋白
質を安定に確保することにより、酵素活性を定量的に測
定することが可能になった。即ち、本発明者等は、ユビ
キチン依存性蛋白質分解系のよい基質となる¹²⁵I-リゾ
チームとユビキチンを効率よく結合させる方法を開発し
た[ Tamura T., et al., FEBS Lett., 292, 154ー158 (1
991)]。

【００１９】また、本発明者等は、Suc-LLVY-MCA の分
解に対して、２０Ｓプロテアソームは、不活性型である
が、２６Ｓプロテアソームは活性型であることを見いだ
し、Suc-LLVY-MCA の分解活性を調べることにより、２
６Ｓプロテアソームを簡便に検知する方法を開発した。
従って、この簡便なアッセイ法と上記記載のより、定量
性の優れた¹²⁵I-リゾチーム-ユビキチン結合蛋白質の分
解活性を調べることにより、２６Ｓプロテアソーム精製
の指標にした。上記、分離、精製操作により、得られた
本発明ヒト２６Ｓプロテアソームは、前記した酵素学的
および物理化学的性質より特定される。

【００２０】なお、本発明および図面において試薬や分
析法などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ-ＩＵＢに
よる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくも
のであり、その例を次に挙げる。

【００２１】Suc-LLVY-MCA サクシニル−ロイシル
−ロイシル−バリル−チロシン−４−メチルクマリル−
７−アミド（Succinyl-Leucyl-Leucyl-Valyl-Tyrosine-
4-Methyl-Coumaryl-7-Amide) ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム (Sodiumu
Dodecyl Sulphate) ＰＡＧＥ ポリアクリルアミド電気泳動 (Poly
acrylamide gel elect-rophoresis)

【００２２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２３】実施例１ ヒト２６Ｓプロテアソームの精製におけるアッセイ法 （１）ユビキチン化蛋白質の分解活性¹²⁵ Ｉ−リゾチームーユビキチン 結合体は、本発明者等
の方法〔Tamura T.,et al., FEBS Lett., 292, 154ー158
(1991)]に従い、¹²⁵Ｉ−リゾチームとユビキチン結合
体をユビキチン結合酵素系（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３）を用い
て結合した。次いで、¹²⁵Ｉ−リゾチームーユビキチン
結合体 (5、000-10、000 cpm) と２６Ｓプロテアソームを
50mM TrisーHCL (pH7.5)、5mM MgCl₂ 、2mM ATP、1mM ジチ
オスレイトール中（最終体積で100mlになるようにする)
で、３７℃、６０ー１２０分間、インキュベートした。
¹²⁵Ｉ−リゾチームとユビキチン結合体の分解を調べる
ために、575ml の１０％トリフルオロ酢酸と125mlの４
％牛血清アルブミン（キャリア蛋白質）を添加して、酸
可溶性画分をγ-カウンターで測定した。

【００２４】（２）合成基質SucーLLVYーMCA の分解活性 ペプチド合成基質であるSuc-LLVY-MCA（ペプチド研究所
製）と２６Ｓプロテアソームを、0.05% SDS 存在下ある
いは、非存在下において、100mMTris-HCL (pH8.0)中、
３７℃、１０ー３０分間インキュベートした。反応は、
100mlの１０％ＳＤＳと２ｍｌのTrisーHcl (pH9.0) を添
加し停止させ、反応後の溶液の蛍光を測定した。

【００２５】実施例２ ヒト２６Ｓプロテアソームの製造 ヒト２６Ｓプロテアソームの製造は全て、４℃の条件下
で行ない、特に述べないかぎり標準液である 50 mM Tri
sーHCl (pH7.5)、1 m Mジチオスレイトール、5mM MgCl₂ 2
mM ATP、20 %グリセロールを用いて、以下の順序に従い
行なった。

【００２６】（１）超遠心法による精製 新鮮なヒト腎臓約１００ｇを50 mM TrisーHCl (pH7.5)、1
m M ジチオスレイトール、5 mM MgCl₂、2 mM ATP、0.25 M
スクロース中、ワーリングブレンダーを用いてホモジ
ナイズした。得られたホモジネートは、70,100 x g で
１時間超遠心し、得られた上清約４ｇを出発物質とし
た。この上清を70,100 x gで５時間遠心し、得られた２
６Ｓプロテアソームを含む沈殿を約５０ｍｌの標準液に
溶かした。さらに、不溶物を除去するために、10,000 g
で３０分間遠心し、約２４０ｍｇの蛋白質が回収され
た。

【００２７】（２）バイオゲル A-1.5m 分子篩クロマト
グラフィーによる精製 超遠心法で得たサンプルをバイオゲル A-1.5m カラム
（5 x 90 cm）（バイオラッド社製）にアプライし標準
液を用いて60 ml/hrの速度で溶出した。図１に得られた
クロマトグラフィーの溶出パターンを示す。図１におい
て横軸はフラクション番号を、縦軸はSucーLLVYーMCA を
分解する活性（曲線（１））、0.05 % SDS存在下でSucー
LLVYーMCA を分解する活性（曲線（２））、ATPase 活性
（曲線（３））、蛋白質濃度（曲線（４））を示す。ま
た、上段には、各フラクション番号における抗ヒトプロ
テアソームモノクローナル抗体およびポリクローナル抗
体を用いたウェスタン.ブロッティングの結果を示す。

【００２８】バーＡ（フラクション番号８０ー９０）、
バーＢ（フラクション番号１００ー１１５）のフラクシ
ョン画分を比較すると、Ａ画分は0.05 % SDSが存在しな
くてもSucーLLVYーMCA を分解する活性があるが、Ｂ画分
は0.05 % SDSが存在してはじめてSucーLLVYーMCA を分解
する活性が現われた。また、この図中には示していない
がＡ画分には、¹²⁵Ｉ−リゾチームとユビキチン結合体
を分解する活性があるが、Ｂにはなかった。さらにＡ、
Ｂ両画分中には、ウェスタンブロティングの結果から、
プロテアソーームのコンポーネントが含まれることがわ
かった。これらのことより、Ａ画分は２６Ｓプロテアソ
ームであり、Ｂ画分は２０Ｓプロテアソームであること
がわかった。

【００２９】（３）ハイドロキシアパタイトとＱ-セフ
ァロースカラムによる精製 バイオゲル A-1.5m カラムより得られた２６Ｓプロテア
ソームを含むＡ画分を10mM リン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ6.8）、1 mM ジチオスレイトール 、2 mMATP、20 %グ
リセロールで平衡化したハイドロキシアパタイトカラム
（1.5ｘ15ｃｍ）（バイオラッド社製）にアプライし
た。カラムは５ベッド体積の同上緩衝液で洗浄後、吸着
したサンプルは３ベッド体積の0.1M リン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ6.8）、1 mM ジチオスレイトール 、2 mM AT
P、20 %グリセロールで溶出した。

【００３０】溶出サンプルは標準液で平衡化したＱーセ
ファロースカラム（1.5ｘ15ｃｍ）（ファルマシア社
製）にアプライした。アプライした大部分の蛋白質はＱ
-セファロースカラムに吸着した。カラムを５ベッド体
積の標準液で洗浄後、吸着した蛋白質を２００ｍｌの０
−０．８Ｍ ＮａＣｌの直線勾配により溶出し、１．４
ｍｌずつ溶出画分を集めた。図２（Ａ）にＱーセファロ
ースによる溶出パターンを示す。図において、横軸はフ
ラクション番号を、縦軸はSucーLLVYーMCA を分解する活
性（曲線（１））、0.05 % SDS存在下でSucーLLVYーMCA
を分解する活性（曲線（２））、ATPase活性（曲線
（３））、ＮａＣｌのグラディエント濃度（曲線
（４））を示す。また、図２（Ｂ）には、バイオゲル A
-1.5m カラムより得られた２０Ｓプロテアソーム画分の
分離パターンを（Ａ）と同様に示す。図２（Ａ）より、
２６Ｓプロテアソーム画分は０.３８Ｍの塩濃度で溶出
され、0.05 % SDSの存在の有無にかかわらずでSucーLLVY
ーMCA を分解する活性を有するが、図２（Ｂ）より、２
０Ｓプロテアソーム画分は0.05 % SDSが存在しないと、
SucーLLVYーMCA を分解する活性を有さないことがわかっ
た。

【００３１】 （４）グリセロール密度勾配遠心法による精製 Ｑ-セファロースクロマトグラフィーより得られた２６
Ｓ、２０Ｓ画分はそれぞれアミコンＰＭー１０メンブラ
ンを用いた限外濾過により、濃縮し、グリセロール密度
勾配遠心を行なった。その結果を図３に示す。図３にお
いて、（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ２６Ｓ画分、２０Ｓ画
分の分離パターンを示す。また、横軸はフラクション番
号を、縦軸は、SuvcーLLVYーMCA を分解する活性（曲線
（１））、0.05 % SDS存在下でSuvcーLLVYーMCA を分解す
る活性（曲線（２））ATPase活性（曲線（３））、ＡＴ
Ｐ依存的に¹²⁵I-リゾチームーユビキチン結合体を分解
する活性（曲線（４））を示す。

【００３２】図３（Ａ）の２６Ｓ画分において、フラク
ション番号１４ー１６に２６Ｓプロテアソームの特徴で
ある¹²⁵I-リゾチームーユビキチン複合体を分解する活
性および0.05 % SDSの存在の有無にかかわらずでSucーLL
VYーMCA を分解する活性がみられたが、（Ｂ）の２０Ｓ
画分においてはみられず、フラクション番号１８ー２０
に２０Ｓプロテアソームの活性のみがみられた。

【００３３】最終的にフラクション番号１４ー１６の画
分を集めることにより、２６Ｓプロテアソームを精製す
るに至った。その蛋白質量を測定すると、０.６ｍｇで
あり、¹²⁵I-リゾチームーユビキチン結合体を分解する
活性は１０ % /hr/μg prote-in、ATPase活性は１５０
ー２００nmoles/hr/μg protein 、SucーLLVYーMCAを分解
する活性は１０ー２０nmoles/min/μg proteinであっ
た。また、この精製２６Ｓプロテアソームの沈降係数を
超遠心法で測定したところ約２６Ｓであった。またこの
値と拡散係数から、求めた分子量は約2,000ｋＤａであ
った。

【００３４】実施例３ ２６Ｓプロテアソームの電気泳動による構造解析 （１）ＳＤＳーポリアクリルアミド電気泳動による解析 実施例２（４）で精製した２６Ｓプロテアソームの分子
構造を明かにするために、ＳＤＳーポリアクリルアミド
電気泳動（ＳＤＳーＰＡＧＥ）により解析した。グリセ
ロール密度勾配により得られたフラクションを１％ＳＤ
Ｓで変性後、１０ー２０％の濃度勾配ポリアクリルアミ
ドゲルにより分離し、銀染色を行なった。その結果を図
４に示す。グリセロール密度勾配により得られたフラク
ション番号１４ー１６の画分に２６Ｓプロテアソームの
活性が存在するが、この画分には２１ー１１０ＫＤａの
バンドが確認された。従って、２６Ｓプロテアソームは
２１ー３１ＫＤａの２０Ｓプロテアソームと３５ー１１
０ＫＤａの制御因子蛋白質群より構成される巨大な複合
体蛋白質であることがわかった。

【００３５】（２）２次元電気泳動による解析 ２６Ｓプロテアソームの分子構成をさらに明かにするた
めに１次元目に未変性のＰＡＧＥを、２次元目にＳＤＳ
ーＰＡＧＥを行なう２次元電気泳動を行ない、銀染色し
た。その結果を図５に示す。実施例２（４）で精製した
２６Ｓプロテアソームを３ー１０％の未変性のポリアク
リルアミドゲルで分離したところ、1,300ｋＤａ
（１）、1,100ｋＤａ（２）、700ｋＤａ（３）の３本の
バンドが確認された。

【００３６】さらに、２次元目に１０ー２０％のＳＤＳ
ーＰＡＧＥを行なったところ、700ｋＤａ複合体は、２
１ー３１ｋＤａの２０Ｓプロテアソームのコンポーネン
トと５０ｋＤａのコンポーネントより構成されているこ
とがわかった。一方、1,300ｋＤａの複合体は２１ー３
１ｋＤａと３５ー１１０ｋＤａより構成され、1,100ｋ
Ｄａの複合体も1,300ｋＤａの分離パターンに類似して
いた。これらのことより、1,100ｋＤａと700ｋＤａの複
合体は1,300ｋＤａの複合体が一部分解したものであ
り、２６Ｓプロテアソームは、電気泳動上は、1,300 ｋ
Ｄａの複合体であることがわかった。

【００３７】実施例４ ２６Ｓプロテアソームのユビキチン結合蛋白質の分解活
性 実施例２（４）で精製した２６Ｓプロテアソームのユビ
キチン結合蛋白質に対する分解活性を調べた。ユビキチ
ン結合蛋白質として、¹²⁵I−リゾチームーユビキチン結
合体を用い、２ｍＭＡＴＰ存在下、精製２６Ｓプロテア
ソームを２時間反応させた後、ＳＤＳーＰＡＧＥを行な
い、オートラジオグラフィーを行なった。オートラジオ
グラムの結果を図６に示す。

【００３８】図６において、左端は分子量マーカーを、
レーン（１）は２６Ｓプロテアソーム非存在下の場合、
レーン（２）、（３）、（４）、（５）はそれぞれ、
２、４、８、１０μｇの２６Ｓプロテアソームを添加し
た場合の結果を示す。２６Ｓプロテアソーム非存在下の
場合、¹²⁵I−リゾチームーユビキチン複合体のバンド
が、６７ｋＤａ以上にみられたが（レーン（１））、２
６Ｓプロテアソームを添加した場合は、これらのバンド
が消失し、¹²⁵I−リゾチームの１４ｋＤａのバンドのみ
となった。これらの結果より、精製２６Ｓプロテアソー
ムはＡＴＰ存在下でユビキチン結合蛋白質を分解する活
性があることがわかった。

【００３９】実施例５ ２６ＳプロテアソームのＡＴＰａｓｅ活性 実施例２（４）で精製した２６ＳプロテアソームのＡＴ
Ｐａｓｅ活性について、ＡＴＰａｓｅの阻害在を用いて
調べた。その結果を図７に示す。図７において、横軸
は、ＡＴＰａｓｅ阻害剤であるヴァナデイト（Ａ）とヘ
ミン（Ｂ）の添加濃度を、縦軸は、ＡＴＰ存在下の¹²⁵I
−リゾチームーユビキチン複合体の分解活性（曲線
（１））およびＡＴＰ分解活性（曲線（２））を示す。

【００４０】２６ＳプロテアソームにはＡＴＰ分解活性
があることを 実施例２（４）で記載したが、この活性
はＡＴＰａｓｅ阻害剤であるヴァナデイトとヘミンの添
加により、濃度依存的に阻害される。また、この際、
¹²⁵I−リゾチームーユビキチン結合体の分解活性も同様
に阻害された。これらの結果より、２６Ｓプロテアソー
ムのＡＴＰ依存性のユビキチン化蛋白質の分解には、Ａ
ＴＰの分解が必要であることがわかった。

【００４１】実施例６ ヒト２６Ｓプロテアソームの形状 ヒト２６Ｓプロテアソームを５０μｇ/ml に調製し、１
ー３％ウラニル酢酸（ｐＨ４.５）で支持膜上に逆染色
し、電子顕微鏡（日立社製、Ｈ７０００）で観察した。
図８に、電子顕微鏡写真より得られた写真を基に２６Ｓ
プロテアソームの分子構造モデルを示す。この図８で示
されるように２６Ｓプロテアソームの分子形状はダンベ
ル状で、その中央部には２０Ｓプロテアソームの構造が
認められた。

【００４２】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明は、ユビキ
チン化した蛋白質を分解する新規細胞内多機能プロテア
ーゼであるヒト２６Ｓプロテアソームを精製し、単離す
ることにより、当該酵素の詳細を明らかにしたものであ
り、これにより、当該酵素の機能とユビキチン化した蛋
白質の分解機構の解明に役立つのみならず、各種病態の
診断、および治療法として役立つ新しい技術を提供し得
る等の効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明ヒト２６Ｓプロテアソームのバイオゲル
カラムによる精製における溶出パターンを示す。

【図２】本発明ヒト２６ＳプロテアソームのＱーセファ
ロースカラムによる精製における溶出パターンを示す。

【図３】本発明ヒト２６Ｓプロテアソームのグリセロー
ル密度勾配遠心法による精製における分画パターンを示
す。

【図４】本発明ヒト２６ＳプロテアソームのＳＤＳ-Ｐ
ＡＧＥによる分析結果を示す。

【図５】本発明ヒト２６Ｓプロテアソームの２次元電気
泳動による分析結果を示す。

【図６】本発明ヒト２６Ｓプロテアソームによるユビキ
チンが結合したリゾチーム蛋白質の分解をＳＤＳーＰＡ
ＧＥで分析した結果を示す。

【図７】本発明ヒト２６Ｓプロテアソームのユビキチン
結合蛋白質の分解に及ぼすATP-ase阻害剤およびヘミン
の添加効果を示す。

【図８】本発明ヒト２６Ｓプロテアソームの形状を電子
顕微鏡写真を基に作製した分子構造モデルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト臓器、細胞の細胞質画分より、グリ
   セリン、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレ
   イトール、およびＡＴＰを添加した分離溶媒を用いて、
   ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、イオ
   ン交換カラム、およびグリセロール密度勾配遠心を用い
   た物理化学的分離方法により精製して製造された、安定
   な状態で精製されたヒト２６Ｓプロテアソームであっ
   て、下記の酵素学的および物理学的性質； (1) サクシニル−ロイシル−バリル−チロシン−４−メ
   チルクマリル−７−アミドを分解する活性が１０−２０
   ｎｍｏｌｅｓ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎである： (2) ユビキチンが結合した蛋白質をＡＴＰ存在下で分解
   する活性を有する：(3) ＡＴＰを分解する活性を有する：(4) 超遠心法で測定した沈降係数は２６Ｓである：(5) 分子量は約２０００ｋＤａ（キロダルトン）で、２
   １ー３１ｋＤａの２０Ｓプロテアソームと、それ以外に
   分子量３５ー１１０ｋＤａの制御因子蛋白質群より構成
   される：(6) 電子顕微鏡で観察した分子形状はダンベル状で、そ
   の中央部にプロテアソームの構造が認められる：を有するヒト２６Ｓプロテアソーム。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の、ヒト臓器、細胞の細
   胞質画分より安定な状態で精製されたヒト２６Ｓプロテ
   アソームを製造する方法であって、ヒト臓器、細胞の細
   胞質画分からのヒト２６Ｓプロテアソームを、グリセリ
   ン、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイト
   ール、およびＡＴＰを添加した分離溶媒を用いて、ゲル
   濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、イオン交
   換カラム、およびグリセロール密度勾配遠心を用いた物
   理化学的分離方法により精製して、安定な状態で精製さ
   れたヒト２６Ｓプロテアソームを調製することを特徴と
   するヒト２６Ｓプロテアソームの製造方法。