JPH0622759A - ラット２６ｓプロテアソームおよびその製造方法 - Google Patents
ラット２６ｓプロテアソームおよびその製造方法Info
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- JPH0622759A JPH0622759A JP4199028A JP19902892A JPH0622759A JP H0622759 A JPH0622759 A JP H0622759A JP 4199028 A JP4199028 A JP 4199028A JP 19902892 A JP19902892 A JP 19902892A JP H0622759 A JPH0622759 A JP H0622759A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ラット２６Ｓプロテアソームおよびその製造
方法を提供する。 【構成】 ユビキチン結合蛋白質を分解する細胞内多機
能プロテアーゼであるラットＳ２６プロテアソーム。当
該ラット２６Ｓプロテアソームは、ラット肝臓細胞など
の細胞質画分から、ＡＴＰを添加した特定の分離溶媒を
用いた物理化学的分離方法により、精製、単離すること
によって製造される。 【効果】 ユビキチン化した蛋白質を解する作用を有
し、各種癌をはじめとする各種病態のメカニズムの解
明、診断および治療などに有用である。
方法を提供する。 【構成】 ユビキチン結合蛋白質を分解する細胞内多機
能プロテアーゼであるラットＳ２６プロテアソーム。当
該ラット２６Ｓプロテアソームは、ラット肝臓細胞など
の細胞質画分から、ＡＴＰを添加した特定の分離溶媒を
用いた物理化学的分離方法により、精製、単離すること
によって製造される。 【効果】 ユビキチン化した蛋白質を解する作用を有
し、各種癌をはじめとする各種病態のメカニズムの解
明、診断および治療などに有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ラット２６Ｓプロテア
ソームに関するものであり、さらに詳しくは、ＡＴＰ依
存的にユビキチン結合蛋白質を分解する新規な細胞内多
機能プロテアーゼおよびその製造方法に関するものであ
る。
ソームに関するものであり、さらに詳しくは、ＡＴＰ依
存的にユビキチン結合蛋白質を分解する新規な細胞内多
機能プロテアーゼおよびその製造方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】細胞内で不必要あるいは異常な蛋白質が
分解される機構として、ユビキチン依存的分解経路が知
られている〔Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ Ｍ． ｅｄ．，
「Ｕ−ｂｉｑｕｉｔｉｎ」Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ （１９８８）〕。ユビキチンは、分子量約８、５
００の蛋白質で、真核生物の細胞に普遍的に存在し、種
々の蛋白質にイソペプチド結合し、分解のための目印と
なる。このユビキチンによる蛋白質の修飾および分解に
は、ＡＴＰをエネルギー源として必要とすることがわっ
かている。
分解される機構として、ユビキチン依存的分解経路が知
られている〔Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ Ｍ． ｅｄ．，
「Ｕ−ｂｉｑｕｉｔｉｎ」Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ （１９８８）〕。ユビキチンは、分子量約８、５
００の蛋白質で、真核生物の細胞に普遍的に存在し、種
々の蛋白質にイソペプチド結合し、分解のための目印と
なる。このユビキチンによる蛋白質の修飾および分解に
は、ＡＴＰをエネルギー源として必要とすることがわっ
かている。
【０００３】このようなユビキチン化した蛋白質を分解
する機構が解明できれば、細胞内における不必要な蛋白
質、あるいは異常な蛋白質の動態を把握することが可能
となり、さらに各種癌をはじめとする各種病態の診断、
および治療法を確立する上で、きわめて有益である。し
かしながら、このユビキチン化した蛋白質を分解する酵
素の実体については明らかになっていないことから、当
該、ユビキチン化した蛋白質を分解する機構の詳細を解
明することが強く要請されていた。
する機構が解明できれば、細胞内における不必要な蛋白
質、あるいは異常な蛋白質の動態を把握することが可能
となり、さらに各種癌をはじめとする各種病態の診断、
および治療法を確立する上で、きわめて有益である。し
かしながら、このユビキチン化した蛋白質を分解する酵
素の実体については明らかになっていないことから、当
該、ユビキチン化した蛋白質を分解する機構の詳細を解
明することが強く要請されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者等
は、このような状況を踏まえ、これまで、構造が解明さ
れていないユビキチン化した蛋白質を分解する酵素の詳
細を明らかにすると共に、各種癌をはじめとする各種病
態の診断、および治療法を確立することことを目標とし
て鋭意研究を積み重ねた結果、当該酵素として、ユビキ
チン化した蛋白質を分解する細胞内多機能プロテアーゼ
である新規なラット２６Ｓプロテアソームを精製し、単
離すると共に、その詳細について解明することに成功し
て、本発明を完成するに至った。
は、このような状況を踏まえ、これまで、構造が解明さ
れていないユビキチン化した蛋白質を分解する酵素の詳
細を明らかにすると共に、各種癌をはじめとする各種病
態の診断、および治療法を確立することことを目標とし
て鋭意研究を積み重ねた結果、当該酵素として、ユビキ
チン化した蛋白質を分解する細胞内多機能プロテアーゼ
である新規なラット２６Ｓプロテアソームを精製し、単
離すると共に、その詳細について解明することに成功し
て、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、ユビキチン化した蛋
白質を分解する細胞内多機能プロテアーゼである新規な
ラット２６Ｓプロテアソームを提供することを目的とす
るものである。
白質を分解する細胞内多機能プロテアーゼである新規な
ラット２６Ｓプロテアソームを提供することを目的とす
るものである。
【０００６】また、本発明は、当該酵素を安定、かつ高
収率で製造する方法を提供することを目的とするもので
ある。
収率で製造する方法を提供することを目的とするもので
ある。
【０００７】また、本発明は、ラット２６Ｓプロテアソ
ームの酵素学的および物理学的性質などの詳細を明らか
にすることにより、当該酵素の機能の解明に役立つのみ
ならず、各種癌をはじめとする各種病態の診断、および
治療法として有用な新しい技術を提供することを目的と
するものである。
ームの酵素学的および物理学的性質などの詳細を明らか
にすることにより、当該酵素の機能の解明に役立つのみ
ならず、各種癌をはじめとする各種病態の診断、および
治療法として有用な新しい技術を提供することを目的と
するものである。
【０００８】さらに、本発明は、ラット２６プロテアソ
ームを抗原として調製される抗体を利用することによ
り、各種癌をはじめとする各種病態の免疫測定法による
診断技術を提供することを目的とするものである。
ームを抗原として調製される抗体を利用することによ
り、各種癌をはじめとする各種病態の免疫測定法による
診断技術を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るための本発明の構成は、以下の１〜３よりなるもので
ある。 １ 下記の酵素学的および物理学的性質を有するラット
２６Ｓプロテアソーム。 （１）ユビキチンが結合した蛋白質を、ＡＴＰ存在下で
分解する活性を有する （２）ＡＴＰを分解する活性を有する （３）超遠心法で測定した沈降係数は、２６Ｓである （４）分子量は、約２，０００ｋＤａ（キロダルトン）
であり、２１ー３１ｋＤａの２０Ｓプロテアソームと、
それ以外の分子量３５ー１１０ｋＤａの制御因子蛋白質
群より構成される （５）電子顕微鏡で観察した分子形状は、ダンベル状
で、その中央部に２０Ｓプロテアソームの構造が認めら
れる （６）中性アミノ酸である合成基質Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−
ＭＣＡ（サクシニル−ロイシル−ロイシル−バリル−チ
ロシン−４−メチル−クマリル−７−アミド）を分解す
る酵素活性を有し、その至適ｐＨは、７．５ー９．０で
ある （７）酸性アミノ酸であるＣｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡ（カル
ボベンゾキシルーロイシルーロイシルーグルタミン酸ー
２ーナフチルアミド）を分解する酵素活性を有し、その
至適ｐＨは、７．０ー８．５であり、至適温度は、３５
℃ー４５℃、至適ＳＤＳ添加濃度は、０．０５％である （８）塩基性アミノ酸であるＢｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡ
（ｔ−ブチルオキシカルボニルーロイシルーアルギニル
ーアルギニンー４ーメチル−クマリルー７ーアミド）を
分解する酵素活性を有し、その至適ｐＨは、７．５ー
９．０であり、至適温度は、３０℃ー４５℃である
るための本発明の構成は、以下の１〜３よりなるもので
ある。 １ 下記の酵素学的および物理学的性質を有するラット
２６Ｓプロテアソーム。 （１）ユビキチンが結合した蛋白質を、ＡＴＰ存在下で
分解する活性を有する （２）ＡＴＰを分解する活性を有する （３）超遠心法で測定した沈降係数は、２６Ｓである （４）分子量は、約２，０００ｋＤａ（キロダルトン）
であり、２１ー３１ｋＤａの２０Ｓプロテアソームと、
それ以外の分子量３５ー１１０ｋＤａの制御因子蛋白質
群より構成される （５）電子顕微鏡で観察した分子形状は、ダンベル状
で、その中央部に２０Ｓプロテアソームの構造が認めら
れる （６）中性アミノ酸である合成基質Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−
ＭＣＡ（サクシニル−ロイシル−ロイシル−バリル−チ
ロシン−４−メチル−クマリル−７−アミド）を分解す
る酵素活性を有し、その至適ｐＨは、７．５ー９．０で
ある （７）酸性アミノ酸であるＣｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡ（カル
ボベンゾキシルーロイシルーロイシルーグルタミン酸ー
２ーナフチルアミド）を分解する酵素活性を有し、その
至適ｐＨは、７．０ー８．５であり、至適温度は、３５
℃ー４５℃、至適ＳＤＳ添加濃度は、０．０５％である （８）塩基性アミノ酸であるＢｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡ
（ｔ−ブチルオキシカルボニルーロイシルーアルギニル
ーアルギニンー４ーメチル−クマリルー７ーアミド）を
分解する酵素活性を有し、その至適ｐＨは、７．５ー
９．０であり、至適温度は、３０℃ー４５℃である
【００１０】２ ラット臓器、細胞の細胞質画分より、
物理化学的分離方法により、安定、かつ高収率で精製さ
れたラット２６Ｓプロテアソームを製造する方法におい
て、当該物理化学的分離方法が、超遠心、ゲル濾過カラ
ム、ハイドロキシアパタイトカラム、グリセロール密度
勾配遠心から選択される１種以上を用いたものであるこ
とを特徴とする前記１に記載されたラット２６Ｓプロテ
アソームの製造方法。
物理化学的分離方法により、安定、かつ高収率で精製さ
れたラット２６Ｓプロテアソームを製造する方法におい
て、当該物理化学的分離方法が、超遠心、ゲル濾過カラ
ム、ハイドロキシアパタイトカラム、グリセロール密度
勾配遠心から選択される１種以上を用いたものであるこ
とを特徴とする前記１に記載されたラット２６Ｓプロテ
アソームの製造方法。
【００１１】３ ラットの臓器、細胞の細胞質画分よ
り、物理化学的分離方法により、安定、かつ高収率で精
製されたラット２６Ｓプロテアソームを製造する方法に
おいて、グリセリン、２ーメルカプトエタノールあるい
はジチオスレイトール、およびＡＴＰを添加した分離溶
媒を用いた物理化学的分離方法により、精製することを
特徴とする前記２に記載されたラット２６Ｓプロテアソ
ームの製造方法。
り、物理化学的分離方法により、安定、かつ高収率で精
製されたラット２６Ｓプロテアソームを製造する方法に
おいて、グリセリン、２ーメルカプトエタノールあるい
はジチオスレイトール、およびＡＴＰを添加した分離溶
媒を用いた物理化学的分離方法により、精製することを
特徴とする前記２に記載されたラット２６Ｓプロテアソ
ームの製造方法。
【００１２】続いて、本発明についてさらに、詳細に説
明する。本発明者等は、これまで、構造が解明されてい
ないユビキチン化した蛋白質を分解する酵素の詳細を明
らかにすることを目標とし、鋭意研究を重ねてきた。そ
の結果、本発明により、当該酵素は、既に本発明者等が
報告した２０Ｓプロテアソーム（多機能プロテアーゼ、
分子量約７５０ｋＤａ) 〔（ＴａｎａｋａＫ．，ｅｔ
ａｌ．，「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２０３，９８５ー
９９６（１９８８）〕と、未知機能をもった制御因子が
結合した巨大な複合体であることがわかり、本発明者等
は、２６Ｓプロテアソーム（分子量約２、０００ｋＤ
ａ）と命名した。
明する。本発明者等は、これまで、構造が解明されてい
ないユビキチン化した蛋白質を分解する酵素の詳細を明
らかにすることを目標とし、鋭意研究を重ねてきた。そ
の結果、本発明により、当該酵素は、既に本発明者等が
報告した２０Ｓプロテアソーム（多機能プロテアーゼ、
分子量約７５０ｋＤａ) 〔（ＴａｎａｋａＫ．，ｅｔ
ａｌ．，「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２０３，９８５ー
９９６（１９８８）〕と、未知機能をもった制御因子が
結合した巨大な複合体であることがわかり、本発明者等
は、２６Ｓプロテアソーム（分子量約２、０００ｋＤ
ａ）と命名した。
【００１３】２０Ｓプロテアソームは、同一分子内に複
数の触媒活性をもつ多成分複合体プロテアーゼであり、
また酸性、塩基性、中性のアミノ酸を分解する多機能性
プロテアーゼでもあるが、ユビキチン化した蛋白質を分
解する活性はなかった。
数の触媒活性をもつ多成分複合体プロテアーゼであり、
また酸性、塩基性、中性のアミノ酸を分解する多機能性
プロテアーゼでもあるが、ユビキチン化した蛋白質を分
解する活性はなかった。
【００１４】従って、本発明の２６Ｓプロテアソーム
は、プロテアーゼとしての２０Ｓプロテアソームが、制
御因子と結合することにより、ユビキチン化した蛋白質
を識別して、分解するという新しい機能を獲得している
ものであることがわかった。また、当該酵素の新しい機
能として、ＡＴＰａｓｅ活性をもつことが明らかになっ
た。さらに、当該酵素は、２０Ｓプロテアソームと同様
に、酸性、塩基性、中性のアミノ酸を分解する活性をも
っていたが、アミノ酸分解における至適ＳＤＳ濃度、至
適ｐＨ、至適温度は、２０Ｓプロテアソームと異なるこ
とが明らかになった。
は、プロテアーゼとしての２０Ｓプロテアソームが、制
御因子と結合することにより、ユビキチン化した蛋白質
を識別して、分解するという新しい機能を獲得している
ものであることがわかった。また、当該酵素の新しい機
能として、ＡＴＰａｓｅ活性をもつことが明らかになっ
た。さらに、当該酵素は、２０Ｓプロテアソームと同様
に、酸性、塩基性、中性のアミノ酸を分解する活性をも
っていたが、アミノ酸分解における至適ＳＤＳ濃度、至
適ｐＨ、至適温度は、２０Ｓプロテアソームと異なるこ
とが明らかになった。
【００１５】このような新しい知見を基礎として、本発
明のラット２６Ｓプロテアソームは、これを用いること
により、当該酵素の機能の解明に役立つのみならず、各
種癌をはじめとする各種病態の診断、および治療法とし
て役立つ技術を確立する上で有用なものである。
明のラット２６Ｓプロテアソームは、これを用いること
により、当該酵素の機能の解明に役立つのみならず、各
種癌をはじめとする各種病態の診断、および治療法とし
て役立つ技術を確立する上で有用なものである。
【００１６】このように、２６Ｓプロテアソームの主要
な機能は、ユビキチンが結合した蛋白質を分解する活性
をもつことであるが、最近、癌遺伝子産物や、細胞周期
関連遺伝子産物が、このユビキチン依存性の分解経路で
分解されることが報告され注目されている。
な機能は、ユビキチンが結合した蛋白質を分解する活性
をもつことであるが、最近、癌遺伝子産物や、細胞周期
関連遺伝子産物が、このユビキチン依存性の分解経路で
分解されることが報告され注目されている。
【００１７】これら遺伝子産物の蛋白質の例としては、
ｃーｍｙｃ癌遺伝子産物、ｐ５３癌抑制遺伝子産物
〔（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｃｅ
ｌｌ」６３，１１２９ー１１３６（１９９０）〕、ｃｄ
ｃ２キナーゼ調節蛋白質であるサイクリン（Ｃｌｏｔｚ
ｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｎａｔｕｒｅ」３４９，
１３２ー１３８（１９９１）〕などが挙げられる。
ｃーｍｙｃ癌遺伝子産物、ｐ５３癌抑制遺伝子産物
〔（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｃｅ
ｌｌ」６３，１１２９ー１１３６（１９９０）〕、ｃｄ
ｃ２キナーゼ調節蛋白質であるサイクリン（Ｃｌｏｔｚ
ｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｎａｔｕｒｅ」３４９，
１３２ー１３８（１９９１）〕などが挙げられる。
【００１８】従って、本発明のラット２６Ｓプロテアソ
ームは、癌化のメカニズムの解明や、癌の治療、および
診断に有用である。
ームは、癌化のメカニズムの解明や、癌の治療、および
診断に有用である。
【００１９】また、アルツハイマー病患者の脳内には、
ユビキチン化した蛋白質が異常蓄積しており、少なくと
も、この疾患の原因の一つに細胞内における蛋白質分解
系の異常があることが示唆された。従って、本発明のラ
ット２６Ｓプロテアソームは、アルツハイマー病のメカ
ニズムの解明や、アルツハイマー病の治療、および診断
に有用である。
ユビキチン化した蛋白質が異常蓄積しており、少なくと
も、この疾患の原因の一つに細胞内における蛋白質分解
系の異常があることが示唆された。従って、本発明のラ
ット２６Ｓプロテアソームは、アルツハイマー病のメカ
ニズムの解明や、アルツハイマー病の治療、および診断
に有用である。
【００２０】このように、本発明の２６Ｓプロテアソー
ムを用いた各種病態の診断法、および治療法の開発は、
これらの病態と本酵素との係わりを、ヒトにおける各種
病態の治療法および／または診断法の開発に直結する意
味で有用である。かかる測定には、例えば通常の免疫測
定法が使用でき、本発明の２６Ｓプロテアソームは、当
該測定に使用する抗体の抗原として好適に使用される。
ムを用いた各種病態の診断法、および治療法の開発は、
これらの病態と本酵素との係わりを、ヒトにおける各種
病態の治療法および／または診断法の開発に直結する意
味で有用である。かかる測定には、例えば通常の免疫測
定法が使用でき、本発明の２６Ｓプロテアソームは、当
該測定に使用する抗体の抗原として好適に使用される。
【００２１】すなわち、本発明のラット２６Ｓプロテア
ソームを抗原として常法によりモノクローナル抗体を作
製し、当該モノクローナル抗体を有効成分として各種病
態を測定し、診断するための免疫測定用診断剤を製造す
ることができる。当該診断剤としては、肝癌、腎癌、白
血病などの悪性腫瘍の診断剤などが好適なものとして例
示される。
ソームを抗原として常法によりモノクローナル抗体を作
製し、当該モノクローナル抗体を有効成分として各種病
態を測定し、診断するための免疫測定用診断剤を製造す
ることができる。当該診断剤としては、肝癌、腎癌、白
血病などの悪性腫瘍の診断剤などが好適なものとして例
示される。
【００２２】次に、本発明ラット２６Ｓプロテアソーム
の特性を有する蛋白質を得る製造方法について、詳述す
ると、以下の通りである。本発明ラット２６Ｓプロテア
ソームは、ラットの種々の組織、器官、産生細胞から、
より具体的には、ラット腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胸
腺、などの各種臓器、およびラット肝癌細胞株、ラット
腎臓細胞株などの樹立細胞株の細胞質画分より得ること
ができる。
の特性を有する蛋白質を得る製造方法について、詳述す
ると、以下の通りである。本発明ラット２６Ｓプロテア
ソームは、ラットの種々の組織、器官、産生細胞から、
より具体的には、ラット腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胸
腺、などの各種臓器、およびラット肝癌細胞株、ラット
腎臓細胞株などの樹立細胞株の細胞質画分より得ること
ができる。
【００２３】上記の細胞質分画の調製は、通常の細胞質
分画法によることができる。例えば、上記記載の細胞を
ホモジネートし、遠心分離することにより、細胞膜、
核、ミトコンドリア、リソゾームおよびミクロソームの
分画を除き、その上清を細胞質分画として使用できる。
分画法によることができる。例えば、上記記載の細胞を
ホモジネートし、遠心分離することにより、細胞膜、
核、ミトコンドリア、リソゾームおよびミクロソームの
分画を除き、その上清を細胞質分画として使用できる。
【００２４】かかる細胞質画分からの本発明ラット２６
Ｓプロテアソームの分離、精製は、当該酵素の酵素化学
的、物理化学的性質等を利用した各種の処理操作により
実施することができる。例えば、これらの分離、精製方
法としては、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法などの主
として分子量の差を利用する方法、イオンクロマトグラ
フィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティ−
クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点を利用する方法など
が挙げられる。
Ｓプロテアソームの分離、精製は、当該酵素の酵素化学
的、物理化学的性質等を利用した各種の処理操作により
実施することができる。例えば、これらの分離、精製方
法としては、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法などの主
として分子量の差を利用する方法、イオンクロマトグラ
フィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティ−
クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点を利用する方法など
が挙げられる。
【００２５】しかしながら、ＡＴＰ依存的にユビキチン
結合蛋白質を分解する２６Ｓプロテアソームの分離、精
製は、既に本発明者等が報告した２０Ｓプロテアソーム
に比較して、非常に難しい。その理由として、（ｉ）２
６Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームに比較し
て非常に不安定である、（ｉｉ）２６Ｓプロテアソーム
の活性を検出するためのアッセイ系の確立が容易でない
ことがあげられる。
結合蛋白質を分解する２６Ｓプロテアソームの分離、精
製は、既に本発明者等が報告した２０Ｓプロテアソーム
に比較して、非常に難しい。その理由として、（ｉ）２
６Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームに比較し
て非常に不安定である、（ｉｉ）２６Ｓプロテアソーム
の活性を検出するためのアッセイ系の確立が容易でない
ことがあげられる。
【００２６】かかる課題を解決するために、鋭意検討を
重ねた結果、（ｉ）の課題に対しては２６Ｓ型プロテア
ソームを安定化させる条件として、グリセリン、２ーメ
ルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール、そし
てＡＴＰ、を分離溶媒中に添加しておくことにより、安
定化させることができることがわかった。
重ねた結果、（ｉ）の課題に対しては２６Ｓ型プロテア
ソームを安定化させる条件として、グリセリン、２ーメ
ルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール、そし
てＡＴＰ、を分離溶媒中に添加しておくことにより、安
定化させることができることがわかった。
【００２７】しかしながら、蛋白質の高次構造に影響す
る処理、クロマトグラフィーを繰り返すと、２６Ｓプロ
テアソームは、その構成要素に不可逆的に解離した。そ
こで、このような知見を基礎として、本発明者等は、主
として、分子サイズの違いによる分離を基本戦略とし
て、必要に応じて最小限のクロマトグラフィーを操作を
行なう分離、精製方法を開発するに至った。
る処理、クロマトグラフィーを繰り返すと、２６Ｓプロ
テアソームは、その構成要素に不可逆的に解離した。そ
こで、このような知見を基礎として、本発明者等は、主
として、分子サイズの違いによる分離を基本戦略とし
て、必要に応じて最小限のクロマトグラフィーを操作を
行なう分離、精製方法を開発するに至った。
【００２８】即ち、ラット２６Ｓプロテアソームの製造
方法として、（１）超遠心法により得た細胞質画分を、
（２）バイオゲルカラム1.5ｍカラム、（３）バイオゲ
ル5ｍカラム、（４）ハイドロキシアパタイトカラム、
（５）グリセロール密度勾配遠心により分離、精製する
方法を開発するに至った。
方法として、（１）超遠心法により得た細胞質画分を、
（２）バイオゲルカラム1.5ｍカラム、（３）バイオゲ
ル5ｍカラム、（４）ハイドロキシアパタイトカラム、
（５）グリセロール密度勾配遠心により分離、精製する
方法を開発するに至った。
【００２９】本発明のラット２６Ｓプロテアソームの精
製方法の特徴は、２６Ｓプロテアソームを、できるだけ
カラムに吸着させないで精製することにより、蛋白質の
解離を防ぐことにある。即ち、（２）、（３）のバイオ
ゲルカラムでは、２６Ｓプロテアソームはそれぞれ、分
子篩により溶出された。また、（４）のハイドロキシア
パタイトカラムでは、溶出液中のＡＴＰの濃度を２ｍＭ
から５ｍＭにすることにより、２０Ｓプロテアソームは
カラムに吸着するが、２６Ｓプロテアソームはカラムに
吸着せずに溶出された。さらに、２６Ｓプロテアソーム
が吸着するＱーセファロースカラム等の電荷の差による
精製を省いた。
製方法の特徴は、２６Ｓプロテアソームを、できるだけ
カラムに吸着させないで精製することにより、蛋白質の
解離を防ぐことにある。即ち、（２）、（３）のバイオ
ゲルカラムでは、２６Ｓプロテアソームはそれぞれ、分
子篩により溶出された。また、（４）のハイドロキシア
パタイトカラムでは、溶出液中のＡＴＰの濃度を２ｍＭ
から５ｍＭにすることにより、２０Ｓプロテアソームは
カラムに吸着するが、２６Ｓプロテアソームはカラムに
吸着せずに溶出された。さらに、２６Ｓプロテアソーム
が吸着するＱーセファロースカラム等の電荷の差による
精製を省いた。
【００３０】これらの改良により、２６Ｓプロテアソー
ムがカラムに吸着することによる解離を防ぎ、簡便に収
率よく２６Ｓプロテアソームを精製する方法を開発する
に至った。
ムがカラムに吸着することによる解離を防ぎ、簡便に収
率よく２６Ｓプロテアソームを精製する方法を開発する
に至った。
【００３１】次に、（ｉｉ）の課題に対しては、２６Ｓ
プロテアソームの鋭敏なアッセイ法を開発した。一つは
ユビキチン結合蛋白質分解活性の測定に供する基質蛋白
質を安定に確保することにより、酵素活性を定量的に測
定することが可能になった。即ち、本発明者等は、ユビ
キチン依存性蛋白質分解系のよい基質となる125 Ｉ−リ
ゾチームとユビキチンを効率よく結合させる方法を開発
した〔（Ｔａｍｕ−ｒａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，「ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ．」２９２，１５４ー１５８（１９９
１）〕。
プロテアソームの鋭敏なアッセイ法を開発した。一つは
ユビキチン結合蛋白質分解活性の測定に供する基質蛋白
質を安定に確保することにより、酵素活性を定量的に測
定することが可能になった。即ち、本発明者等は、ユビ
キチン依存性蛋白質分解系のよい基質となる125 Ｉ−リ
ゾチームとユビキチンを効率よく結合させる方法を開発
した〔（Ｔａｍｕ−ｒａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，「ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ．」２９２，１５４ー１５８（１９９
１）〕。
【００３２】また、本発明者等は、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−
ＭＣＡの分解に対して、２０Ｓプロテアソームは、不活
性型であるが、２６Ｓプロテアソームは活性型であるこ
とを見いだし、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡの分解活性を
調べることにより、２６Ｓプロテアソームを簡便に検知
する方法を開発した。従って、この簡便なアッセイ法
と、上記記載の、より定量性の優れた125 Ｉ−リゾチー
ム−ユビキチン結合蛋白質の分解活性を調べることによ
り、２６Ｓプロテアソーム精製の指標にした。
ＭＣＡの分解に対して、２０Ｓプロテアソームは、不活
性型であるが、２６Ｓプロテアソームは活性型であるこ
とを見いだし、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡの分解活性を
調べることにより、２６Ｓプロテアソームを簡便に検知
する方法を開発した。従って、この簡便なアッセイ法
と、上記記載の、より定量性の優れた125 Ｉ−リゾチー
ム−ユビキチン結合蛋白質の分解活性を調べることによ
り、２６Ｓプロテアソーム精製の指標にした。
【００３３】上記、分離、精製操作により、得られた本
発明ラット２６Ｓプロテアソームは、前記した酵素学的
および物理化学的性質により特定される新規なものであ
る。
発明ラット２６Ｓプロテアソームは、前記した酵素学的
および物理化学的性質により特定される新規なものであ
る。
【００３４】なお、本明細書および図面において、試薬
や分析法などを略号で表示する場合は、ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものを用いており、その例を次に挙げる。
や分析法などを略号で表示する場合は、ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものを用いており、その例を次に挙げる。
【００３５】Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ；サクシニル−
ロイシル−ロイシル−バリル−チロシン−４ーメチルク
マリル−７−アミド（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌｅｕｃｙｌ
−Ｌ−ｅｕｃｙｌ−Ｖａｌｙｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−４
−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｒｍ−ａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄ
ｅ）
ロイシル−ロイシル−バリル−チロシン−４ーメチルク
マリル−７−アミド（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌｅｕｃｙｌ
−Ｌ−ｅｕｃｙｌ−Ｖａｌｙｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−４
−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｒｍ−ａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄ
ｅ）
【００３６】Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡ；カルボベンゾキシ
ル−ロイシル−ロイシル−グルタミン酸−β−ナフチル
アミド（Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−
Ｌｅ−ｕｃｙｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ−β−Ｎ
ａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ）
ル−ロイシル−ロイシル−グルタミン酸−β−ナフチル
アミド（Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−
Ｌｅ−ｕｃｙｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ−β−Ｎ
ａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ）
【００３７】Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡ；ｔ−ブチルオキ
シカルボニルーロイシルーアルギニルーアルギニンー４
ーメチル−クマリル−７−アミド（ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘ
ｙｃ−ａｒｂｏｎｙｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ａｒｇｉｎｙｌ
−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−Ｍ−ｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｒｍ
ａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ）
シカルボニルーロイシルーアルギニルーアルギニンー４
ーメチル−クマリル−７−アミド（ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘ
ｙｃ−ａｒｂｏｎｙｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ａｒｇｉｎｙｌ
−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−Ｍ−ｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｒｍ
ａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ）
【００３８】ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕ−ｌｐｈａｔｅ）
ｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕ−ｌｐｈａｔｅ）
【００３９】ＰＡＧＥ ポリアクリルアミド電気泳
動（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ eｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
動（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ eｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
【００４０】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ ラット２６Ｓプロテアソームの精製におけるアッセイ法 （１）ユビキチン化蛋白質の分解活性125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体は、本発明者等
の方法（ＴａｍｕｒａＴ．，ｅｔ ａｌ．，「ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．」２９２，１５４ー１５８（１９９１）〕
に従い、125 Ｉ−リゾチームとユビキチンをユビキチン
結合酵素系（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３）を用いて結合した。次
いで、125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体（５，０
００−１０，０００ｃｐｍ）と、２６Ｓプロテアソーム
（あるいは精製過程でのカラムフラクション）を、５０
ｍＭ ＴｒｉｓーＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭジチオスレイトール中
（最終体積で１００μｌになるようにする）で、３７℃
６０−１２０分間、インキュベートした。反応後の125
Ｉ−リゾチームとユビキチン結合体の分解を調べるため
に、５７５μｌの１０％トリフルオロ酢酸と１２５μｌ
の４％牛血清アルブミン（キャリア蛋白質）を添加し
て、酸可溶性画分をγ−カウンターで測定した。
本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ ラット２６Ｓプロテアソームの精製におけるアッセイ法 （１）ユビキチン化蛋白質の分解活性125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体は、本発明者等
の方法（ＴａｍｕｒａＴ．，ｅｔ ａｌ．，「ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．」２９２，１５４ー１５８（１９９１）〕
に従い、125 Ｉ−リゾチームとユビキチンをユビキチン
結合酵素系（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３）を用いて結合した。次
いで、125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体（５，０
００−１０，０００ｃｐｍ）と、２６Ｓプロテアソーム
（あるいは精製過程でのカラムフラクション）を、５０
ｍＭ ＴｒｉｓーＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭジチオスレイトール中
（最終体積で１００μｌになるようにする）で、３７℃
６０−１２０分間、インキュベートした。反応後の125
Ｉ−リゾチームとユビキチン結合体の分解を調べるため
に、５７５μｌの１０％トリフルオロ酢酸と１２５μｌ
の４％牛血清アルブミン（キャリア蛋白質）を添加し
て、酸可溶性画分をγ−カウンターで測定した。
【００４１】（２）合成ペプチドの分解活性 ペプチド合成基質としては、中性アミノ酸であるＳｕｃ
ーＬＬＶＹーＭＣＡ、塩基性アミノ酸であるＢｏｃ−Ｌ
ＲＲ−ＭＣＡ（ペプチド研究所社製）、および酸性アミ
ノ酸であるＣｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡ（シグマ社製）のいず
れかを用い、２６Ｓプロテアソーム（あるいは精製過程
でのカラムフラクション）と、０．０５％ＳＤＳ存在下
あるいは、非存在下において、１００ｍＭ Ｔｒｉｓー
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、３７℃で、１０ー３０分間イ
ンキュベートした。反応は、１００μｌの１０％ ＳＤ
Ｓと２ｍｌの０．１Ｍ ＴｒｉｓーＨｃｌ（ｐＨ９．
０）を添加し停止させ、反応後の溶液の蛍光を測定し、
分解活性を測定した。
ーＬＬＶＹーＭＣＡ、塩基性アミノ酸であるＢｏｃ−Ｌ
ＲＲ−ＭＣＡ（ペプチド研究所社製）、および酸性アミ
ノ酸であるＣｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡ（シグマ社製）のいず
れかを用い、２６Ｓプロテアソーム（あるいは精製過程
でのカラムフラクション）と、０．０５％ＳＤＳ存在下
あるいは、非存在下において、１００ｍＭ Ｔｒｉｓー
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、３７℃で、１０ー３０分間イ
ンキュベートした。反応は、１００μｌの１０％ ＳＤ
Ｓと２ｍｌの０．１Ｍ ＴｒｉｓーＨｃｌ（ｐＨ９．
０）を添加し停止させ、反応後の溶液の蛍光を測定し、
分解活性を測定した。
【００４２】（３）ＡＴＰａｓｅ活性の測定 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５−１５
μｌの精製過程でのカラムフラクションあるいは２６Ｓ
プロテアソーム（１−２μｇ）、１ｍＭ ジチオスレイ
トール、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，および０．５μＣｉ
〔２，８−3 Ｈ〕ＡＴＰを混合し（総体積２５μｌ），
３７℃で６０分間反応させた。反応は、０．１Ｍ ＡＴ
Ｐ，ＡＤＰ，およびＡＭＰと３μｌの１０％ＳＤＳを添
加することにより停止させた。
μｌの精製過程でのカラムフラクションあるいは２６Ｓ
プロテアソーム（１−２μｇ）、１ｍＭ ジチオスレイ
トール、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，および０．５μＣｉ
〔２，８−3 Ｈ〕ＡＴＰを混合し（総体積２５μｌ），
３７℃で６０分間反応させた。反応は、０．１Ｍ ＡＴ
Ｐ，ＡＤＰ，およびＡＭＰと３μｌの１０％ＳＤＳを添
加することにより停止させた。
【００４３】反応液２μｌを、０．５Ｍ ＬｉＣｌを含
む１Ｍギ酸中において、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）
セルロース ＦーＴＬＣプラスチックシート（メルク
社）上で展開し、生じたＡＤＰを分離した。〔3 Ｈ〕Ａ
ＴＰから〔3 Ｈ〕ＡＤＰへの変換は、Ａｒｍｏｎ等の方
法〔Ａｒｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｊ．Ｂｉｏｌ．，Ｃ
ｈｅｍ．」２６５，２０７２３−２０７２５（１９９
０）〕により、測定した。
む１Ｍギ酸中において、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）
セルロース ＦーＴＬＣプラスチックシート（メルク
社）上で展開し、生じたＡＤＰを分離した。〔3 Ｈ〕Ａ
ＴＰから〔3 Ｈ〕ＡＤＰへの変換は、Ａｒｍｏｎ等の方
法〔Ａｒｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｊ．Ｂｉｏｌ．，Ｃ
ｈｅｍ．」２６５，２０７２３−２０７２５（１９９
０）〕により、測定した。
【００４４】実施例２ ラット２６Ｓプロテアソームの製造 ラット２６Ｓプロテアソームの製造は全て、４℃の条件
下で行ない、特に述べないかぎり標準液である２５ｍＭ
ＴｒｉｓーＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレ
イトール、２ｍＭ ＡＴＰ、２０％グリセロールを用い
て、以下の順序に従い行なった。
下で行ない、特に述べないかぎり標準液である２５ｍＭ
ＴｒｉｓーＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレ
イトール、２ｍＭ ＡＴＰ、２０％グリセロールを用い
て、以下の順序に従い行なった。
【００４５】（１）超遠心法による精製 ウィスターラット（雄）の肝臓を摘出し、総重量５００
ｇ分の肝臓を、その約３倍体積量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ーＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレイトール、
２ｍＭ ＡＴＰ、０．２５Ｍ スクロース中で、Ｐｏｔ
ｔｅｒーＥｌ−ｖｅｈｊｅｍのホモジナイザーを用いて
ホモジナイズした。得られたホモジネートは、３０，０
００ｒｐｍ（日立ＲＰ４２ロータ、平均 ７０，１００
ｘｇ）で１時間超遠心し、得られた上清約３ー４ｇを出
発物質とした。
ｇ分の肝臓を、その約３倍体積量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ーＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレイトール、
２ｍＭ ＡＴＰ、０．２５Ｍ スクロース中で、Ｐｏｔ
ｔｅｒーＥｌ−ｖｅｈｊｅｍのホモジナイザーを用いて
ホモジナイズした。得られたホモジネートは、３０，０
００ｒｐｍ（日立ＲＰ４２ロータ、平均 ７０，１００
ｘｇ）で１時間超遠心し、得られた上清約３ー４ｇを出
発物質とした。
【００４６】この上清を７０，１００ｘｇで５時間遠心
し、得られた２６Ｓプロテアソームを含む沈殿を約５０
ｍｌの標準液に溶かした。さらに、不溶物を除去するた
めに、２０，０００ｘｇで３０分間遠心した。この超遠
心法による精製により、約１．５ｇの蛋白質が回収さ
れ、ＡＴＰ依存的に125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結
合体を分解する活性は、４．３ｎｇ／ｈ／ｍｇであっ
た。なお、この活性は、クルードな状態でも、−７０℃
で、数カ月間安定であった。
し、得られた２６Ｓプロテアソームを含む沈殿を約５０
ｍｌの標準液に溶かした。さらに、不溶物を除去するた
めに、２０，０００ｘｇで３０分間遠心した。この超遠
心法による精製により、約１．５ｇの蛋白質が回収さ
れ、ＡＴＰ依存的に125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結
合体を分解する活性は、４．３ｎｇ／ｈ／ｍｇであっ
た。なお、この活性は、クルードな状態でも、−７０℃
で、数カ月間安定であった。
【００４７】（２）バイオゲルＡ−１．５ｍとＡー５ｍ
分子篩クロマトグラフィーによる精製 超遠心法で得たサンプル約５００ー６００ｍｇを、バイ
オゲルＡ−１．５ｍカラム（５ｘ１００ｃｍ、バイオラ
ッド社製）にアプライし、標準液を用いて６０ｍｌ／ｈ
ｒの速度で溶出した。各フラクションは１０ｍｌずつ集
め、その酵素活性を測定した。図１Ａに得られたクロマ
トグラフィーの溶出パターンを示す。図１Ａにおいて、
横軸はフラクション番号を、縦軸はＳｕｃーＬＬＶＹー
ＭＣＡを分解する活性（曲線（１））、０．０５％ＳＤ
Ｓ存在下でＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する活性
（曲線（２））、ＡＴＰａｓｅ 活性（曲線（３））、
蛋白質濃度（曲線（４））を示す。
分子篩クロマトグラフィーによる精製 超遠心法で得たサンプル約５００ー６００ｍｇを、バイ
オゲルＡ−１．５ｍカラム（５ｘ１００ｃｍ、バイオラ
ッド社製）にアプライし、標準液を用いて６０ｍｌ／ｈ
ｒの速度で溶出した。各フラクションは１０ｍｌずつ集
め、その酵素活性を測定した。図１Ａに得られたクロマ
トグラフィーの溶出パターンを示す。図１Ａにおいて、
横軸はフラクション番号を、縦軸はＳｕｃーＬＬＶＹー
ＭＣＡを分解する活性（曲線（１））、０．０５％ＳＤ
Ｓ存在下でＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する活性
（曲線（２））、ＡＴＰａｓｅ 活性（曲線（３））、
蛋白質濃度（曲線（４））を示す。
【００４８】図１Ａで、バーａ（フラクション番号７５
付近）、バーｂ（フラクション番号１００付近）のフラ
クション画分を比較すると、ａ画分は、０．０５％ＳＤ
Ｓが存在しなくてもＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解す
る活性があるが、ｂ画分は、０．０５％ＳＤＳが存在し
てはじめてＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する活性が
現われた。
付近）、バーｂ（フラクション番号１００付近）のフラ
クション画分を比較すると、ａ画分は、０．０５％ＳＤ
Ｓが存在しなくてもＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解す
る活性があるが、ｂ画分は、０．０５％ＳＤＳが存在し
てはじめてＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する活性が
現われた。
【００４９】また、この図中には示していないが、ａ画
分には、125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体を分解
する活性があるが、ｂ画分にはなく、さらにａ、ｂ両画
分中には、ウェスタンブロティングの結果から、プロテ
アソームのコンポーネントが含まれることがわかった。
これらのことより、ａ画分は、２６Ｓプロテアソームで
あり、ｂ画分は、２０Ｓプロテアソームであることがわ
かった。
分には、125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体を分解
する活性があるが、ｂ画分にはなく、さらにａ、ｂ両画
分中には、ウェスタンブロティングの結果から、プロテ
アソームのコンポーネントが含まれることがわかった。
これらのことより、ａ画分は、２６Ｓプロテアソームで
あり、ｂ画分は、２０Ｓプロテアソームであることがわ
かった。
【００５０】そこで、バーａで示した２６Ｓ画分（蛋白
質量で９０ー１２０ｍｇ）をプールして、次の精製に移
った。２６Ｓプロテアソームは、バイオゲルＡー１．５
ｍカラムでは、ボイドボリュームに近接して溶出するた
め、他の蛋白質が混入していた。そこで、夾雑蛋白質を
除去するために、バイオゲルＡー１．５ｍカラムによる
精製でプールした２６Ｓ画分（約３００ｍｇ）をアミコ
ンＰＭー１０メンブランにより、約５０ｍｌに濃縮し、
バイオゲルＡー５ｍカラム（５ｘ１００ｃｍ、バイオラ
ッド社製）にバイオゲルＡー１．５ｍカラムの際と同条
件でアプライした。
質量で９０ー１２０ｍｇ）をプールして、次の精製に移
った。２６Ｓプロテアソームは、バイオゲルＡー１．５
ｍカラムでは、ボイドボリュームに近接して溶出するた
め、他の蛋白質が混入していた。そこで、夾雑蛋白質を
除去するために、バイオゲルＡー１．５ｍカラムによる
精製でプールした２６Ｓ画分（約３００ｍｇ）をアミコ
ンＰＭー１０メンブランにより、約５０ｍｌに濃縮し、
バイオゲルＡー５ｍカラム（５ｘ１００ｃｍ、バイオラ
ッド社製）にバイオゲルＡー１．５ｍカラムの際と同条
件でアプライした。
【００５１】図１Ｂに、得られたクロマトグラムのパタ
ーンを示す。図１Ｂにおいて、横軸はフラクション番号
を、縦軸はＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する活性
（曲線（１））、０．０５％ＳＤＳ存在下でＳｕｃーＬ
ＬＶＹーＭＣＡを分解する活性（曲線（２））、蛋白質
濃度（曲線（３））を示す。図１Ｂにおいて、夾雑する
蛋白質は、ボイドボリュームに溶出され（曲線
（３））、ＳＤＳ非存在下でも、ＳｕｃーＬＬＶＹーＭ
ＣＡを分解する２６Ｓプロテアソームの活性（曲線
（１））が、フラクション番号７８付近のａ画分にみら
れた。
ーンを示す。図１Ｂにおいて、横軸はフラクション番号
を、縦軸はＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する活性
（曲線（１））、０．０５％ＳＤＳ存在下でＳｕｃーＬ
ＬＶＹーＭＣＡを分解する活性（曲線（２））、蛋白質
濃度（曲線（３））を示す。図１Ｂにおいて、夾雑する
蛋白質は、ボイドボリュームに溶出され（曲線
（３））、ＳＤＳ非存在下でも、ＳｕｃーＬＬＶＹーＭ
ＣＡを分解する２６Ｓプロテアソームの活性（曲線
（１））が、フラクション番号７８付近のａ画分にみら
れた。
【００５２】図１Ｃに、図１Ｂと同様のフラクションに
おけるＡＴＰａｓｅ活性と125 Ｉ−リゾチームーユビキ
チン結合体を分解する活性を示す。図１Ｃにおいて横軸
はフラクション番号を、縦軸は125 Ｉ−リゾチームーユ
ビキチン結合体を分解する活性（曲線（１））およびＡ
ＴＰａｓｅ活性（曲線（２））を示す。図１Ｃから、バ
ーａで示される画分には、125 Ｉ−リゾチームーユビキ
チン結合体を分解する高い活性がみられた。また、この
画分には、ＡＴＰａｓｅ活性もみられた。そこで、この
画分（約１００ｍｇ）をプールして次の精製に移った。
おけるＡＴＰａｓｅ活性と125 Ｉ−リゾチームーユビキ
チン結合体を分解する活性を示す。図１Ｃにおいて横軸
はフラクション番号を、縦軸は125 Ｉ−リゾチームーユ
ビキチン結合体を分解する活性（曲線（１））およびＡ
ＴＰａｓｅ活性（曲線（２））を示す。図１Ｃから、バ
ーａで示される画分には、125 Ｉ−リゾチームーユビキ
チン結合体を分解する高い活性がみられた。また、この
画分には、ＡＴＰａｓｅ活性もみられた。そこで、この
画分（約１００ｍｇ）をプールして次の精製に移った。
【００５３】（３）ハイドロキシアパタイトカラムによ
る精製 バイオゲルＡー５ｍカラムで得られた２６Ｓプロテアソ
ーム画分に、ＡＴＰを最終濃度５ｍＭになるように添加
した。このサンプル約１００ｍｇを、１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．８）、１ｍＭジチオスレイトール、５ｍ
Ｍ ＡＴＰ、２０％グリセロールで平衡化したハイドロ
キシアパタイトカラム（ベッドボリューム；５５ｍｌ）
にアプライした。
る精製 バイオゲルＡー５ｍカラムで得られた２６Ｓプロテアソ
ーム画分に、ＡＴＰを最終濃度５ｍＭになるように添加
した。このサンプル約１００ｍｇを、１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．８）、１ｍＭジチオスレイトール、５ｍ
Ｍ ＡＴＰ、２０％グリセロールで平衡化したハイドロ
キシアパタイトカラム（ベッドボリューム；５５ｍｌ）
にアプライした。
【００５４】２６Ｓプロテアソームは、５ｍＭＡＴＰ存
在下では、カラムに吸着せずに溶出されたが、２０Ｓプ
ロテアソームを含む約７０％の蛋白質はカラムに吸着し
た。カラムは１ベッド体積の上記緩衝液で洗浄し、非吸
着画分として集めた。こうして、約３０ｍｇの２６Ｓプ
ロテアソーム蛋白質が得られた。
在下では、カラムに吸着せずに溶出されたが、２０Ｓプ
ロテアソームを含む約７０％の蛋白質はカラムに吸着し
た。カラムは１ベッド体積の上記緩衝液で洗浄し、非吸
着画分として集めた。こうして、約３０ｍｇの２６Ｓプ
ロテアソーム蛋白質が得られた。
【００５５】（４）グリセロール密度勾配遠心法による
精製 ハイドロキシアパタイトカラムによる精製で得られた２
６Ｓプロテアソーム画分をアミコンＰＭ−１０メンブラ
ンを用いた限外濾過により２．０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、
グリセロール密度勾配遠心法による精製を行なった。
精製 ハイドロキシアパタイトカラムによる精製で得られた２
６Ｓプロテアソーム画分をアミコンＰＭ−１０メンブラ
ンを用いた限外濾過により２．０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、
グリセロール密度勾配遠心法による精製を行なった。
【００５６】図２に、その結果を示す。図２において横
軸はフラクション番号を、Ａの縦軸はＳｕｃーＬＬＶＹ
ーＭＣＡを分解する活性（曲線（１））、０．０５％Ｓ
ＤＳ存在下でＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する活性
（曲線（２））、蛋白質濃度（曲線（３））を示し、Ｂ
の縦軸は、125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体を分
解する活性（曲線（４））およびＡＴＰａｓｅ活性（曲
線（５））を示す。０．０５％のＳＤＳ存在下あるい
は、非存在下でもＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する
活性が、バーａで示したフラクション番号１２ー１６付
近にみられた。さらに、この画分には、125 Ｉ−リゾチ
ームーユビキチン結合体を分解する活性およびＡＴＰａ
ｓｅ活性がみられた。
軸はフラクション番号を、Ａの縦軸はＳｕｃーＬＬＶＹ
ーＭＣＡを分解する活性（曲線（１））、０．０５％Ｓ
ＤＳ存在下でＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する活性
（曲線（２））、蛋白質濃度（曲線（３））を示し、Ｂ
の縦軸は、125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体を分
解する活性（曲線（４））およびＡＴＰａｓｅ活性（曲
線（５））を示す。０．０５％のＳＤＳ存在下あるい
は、非存在下でもＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣＡを分解する
活性が、バーａで示したフラクション番号１２ー１６付
近にみられた。さらに、この画分には、125 Ｉ−リゾチ
ームーユビキチン結合体を分解する活性およびＡＴＰａ
ｓｅ活性がみられた。
【００５７】最終的に、このフラクション番号１２ー１
６の画分を集めることにより、２６Ｓプロテアソームを
精製するに至った。その蛋白質量を測定すると、約５５
０μｇであり、その酵素活性を示すと以下の様になっ
た。125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体の分解活
性；４１８ ｐｇ／ｈｒ／μｇ、ＡＴＰａｓｅ活性；
２．１ｎｍｏｌ／ｈｒ／μｇ、ＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣ
Ａの分解活性；３０．５ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ 。ま
た、この精製２６Ｓプロテアソームの沈降係数を超遠心
法で測定したところ約２６Ｓであった。また、この値と
拡散係数から、求めた分子量は約２、０００ｋＤａであ
った。
６の画分を集めることにより、２６Ｓプロテアソームを
精製するに至った。その蛋白質量を測定すると、約５５
０μｇであり、その酵素活性を示すと以下の様になっ
た。125 Ｉ−リゾチームーユビキチン結合体の分解活
性；４１８ ｐｇ／ｈｒ／μｇ、ＡＴＰａｓｅ活性；
２．１ｎｍｏｌ／ｈｒ／μｇ、ＳｕｃーＬＬＶＹーＭＣ
Ａの分解活性；３０．５ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ 。ま
た、この精製２６Ｓプロテアソームの沈降係数を超遠心
法で測定したところ約２６Ｓであった。また、この値と
拡散係数から、求めた分子量は約２、０００ｋＤａであ
った。
【００５８】実施例３ ラット２６Ｓプロテアソームの電気泳動による構造解析 （１）ＳＤＳーポリアクリルアミド電気泳動にによる解
析 実施例２（４）で精製したラット２６Ｓプロテアソーム
の分子構造を明らかにするために、ＳＤＳーポリアクリ
ルアミド電気泳動（ＳＤＳーＰＡＧＥ）により解析し
た。ラット２６Ｓプロテアソームを１％ＳＤＳで変性
後、Ｌａｅｍｍｌｉ等の方法〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．
Ｋ．，「Ｎａｔｕｒｅ」２２７，６８０−６８５（１９
７０）〕による１０ー２０％濃度勾配ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、銀染色を行なった。その
結果を、図３に示す。また、同様にして、精製したヒト
腎臓２６Ｓプロテアソームおよびラットおよびヒトのそ
れぞれの２０Ｓプロテアソームの電気泳動の結果もあわ
せて示す。
析 実施例２（４）で精製したラット２６Ｓプロテアソーム
の分子構造を明らかにするために、ＳＤＳーポリアクリ
ルアミド電気泳動（ＳＤＳーＰＡＧＥ）により解析し
た。ラット２６Ｓプロテアソームを１％ＳＤＳで変性
後、Ｌａｅｍｍｌｉ等の方法〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．
Ｋ．，「Ｎａｔｕｒｅ」２２７，６８０−６８５（１９
７０）〕による１０ー２０％濃度勾配ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、銀染色を行なった。その
結果を、図３に示す。また、同様にして、精製したヒト
腎臓２６Ｓプロテアソームおよびラットおよびヒトのそ
れぞれの２０Ｓプロテアソームの電気泳動の結果もあわ
せて示す。
【００５９】図３Ａに示す様に、ラットおよびヒトの２
０Ｓプロテアソームの分子量は、既に本発明者等が報告
した様に、２１ー３１ｋＤａであった。一方、２６Ｓプ
ロテアソームについては、図３Ｂに示す様に、ラットお
よびヒトで、ともに２１ー１１０ＫＤａのバンドが確認
された。ラットとヒトでは電気泳動上のパターンは図
中、矢印で示した箇所が異なっていたが、他はほとんど
一致していた。従って、ラット２６Ｓプロテアソーム
は、ヒトと同様に、２１ー３１ＫＤａの２０Ｓプロテア
ソームと３５ー１１０ＫＤａの制御因子蛋白質群より構
成される巨大な複合体蛋白質であることがわかった。
０Ｓプロテアソームの分子量は、既に本発明者等が報告
した様に、２１ー３１ｋＤａであった。一方、２６Ｓプ
ロテアソームについては、図３Ｂに示す様に、ラットお
よびヒトで、ともに２１ー１１０ＫＤａのバンドが確認
された。ラットとヒトでは電気泳動上のパターンは図
中、矢印で示した箇所が異なっていたが、他はほとんど
一致していた。従って、ラット２６Ｓプロテアソーム
は、ヒトと同様に、２１ー３１ＫＤａの２０Ｓプロテア
ソームと３５ー１１０ＫＤａの制御因子蛋白質群より構
成される巨大な複合体蛋白質であることがわかった。
【００６０】次に、ラット２６Ｓプロテアソーム中にジ
スフィルド結合が存在するかどうかを調べるために、２
ーメルカプトエタノール存在下で電気泳動を行なったと
ころ（図６Ｂ、＋ＭＥ）、非存在下の場合（−ＭＥ）と
比較して変わらなかった。このことより、ラット２６Ｓ
プロテアソーム複合体中には、ジスフィルド結合が存在
しないことがわかった。
スフィルド結合が存在するかどうかを調べるために、２
ーメルカプトエタノール存在下で電気泳動を行なったと
ころ（図６Ｂ、＋ＭＥ）、非存在下の場合（−ＭＥ）と
比較して変わらなかった。このことより、ラット２６Ｓ
プロテアソーム複合体中には、ジスフィルド結合が存在
しないことがわかった。
【００６１】（２）２次元電気泳動による解析 ２６Ｓプロテアソームの分子構成をさらに明らかにする
ために、１次元目に等電点電気泳動、２次元目にＳＤＳ
ーＰＡＧＥ（１２．５％のゲル濃度）を行なう２次元電
気泳動を、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ の方法〔Ｏ’Ｆａｒｒ
ｅｌｌ Ｐ．Ｈ．，「Ｊ．Ｂ．Ｃｈｅｍ．」２５０，４
００７−４０２１（１９７５）〕で行ない、銀染色し
た。その結果を図４に示す。
ために、１次元目に等電点電気泳動、２次元目にＳＤＳ
ーＰＡＧＥ（１２．５％のゲル濃度）を行なう２次元電
気泳動を、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ の方法〔Ｏ’Ｆａｒｒ
ｅｌｌ Ｐ．Ｈ．，「Ｊ．Ｂ．Ｃｈｅｍ．」２５０，４
００７−４０２１（１９７５）〕で行ない、銀染色し
た。その結果を図４に示す。
【００６２】図４において、横軸は、等電点マーカー
で、縦軸は分子量マーカーを示す。図４では、等電点３
ー１０、分子量２１ー３１ｋＤａに１５ー２０個のバン
ド（囲みＢ）と等電点４．０ー６．５、分子量３５ー１
１０ｋＤａに１５ー２５個のバンド（囲みＡ）が見られ
た。Ｂの１５ー２０個の成分は、本発明者等が、すでに
報告した２０Ｓプロテアソームの構成成分であり、一
方、Ａの１５ー２０個の成分は、２０Ｓプロテアソーム
に結合する制御因子蛋白質群であった。
で、縦軸は分子量マーカーを示す。図４では、等電点３
ー１０、分子量２１ー３１ｋＤａに１５ー２０個のバン
ド（囲みＢ）と等電点４．０ー６．５、分子量３５ー１
１０ｋＤａに１５ー２５個のバンド（囲みＡ）が見られ
た。Ｂの１５ー２０個の成分は、本発明者等が、すでに
報告した２０Ｓプロテアソームの構成成分であり、一
方、Ａの１５ー２０個の成分は、２０Ｓプロテアソーム
に結合する制御因子蛋白質群であった。
【００６３】（３）未変性状態でのポリアクリルアミド
電気泳動 ２６Ｓプロテアソームの分子構造をさらに明らかにする
ために、未変性状態でポリアクリルアミド電気泳動（PA
GE）を行なった。その結果を図５に示す。ポリアクリル
アミドゲルの濃度は、３％（Ａ）、４％（Ｂ）、５％
（Ｃ）で比較し、サンプルとしては、精製した２０Ｓプ
ロテアソーム（２０Ｓ）を１０μｇ、肝臓のホモジネー
トを超遠心して得たクルードなエクストラクト（ＣＥ）
を２００μｇ、および精製した２６Ｓプロテアソーム
（２６Ｓ）を３．５μｇを用い、それぞれのゲルで比較
した。
電気泳動 ２６Ｓプロテアソームの分子構造をさらに明らかにする
ために、未変性状態でポリアクリルアミド電気泳動（PA
GE）を行なった。その結果を図５に示す。ポリアクリル
アミドゲルの濃度は、３％（Ａ）、４％（Ｂ）、５％
（Ｃ）で比較し、サンプルとしては、精製した２０Ｓプ
ロテアソーム（２０Ｓ）を１０μｇ、肝臓のホモジネー
トを超遠心して得たクルードなエクストラクト（ＣＥ）
を２００μｇ、および精製した２６Ｓプロテアソーム
（２６Ｓ）を３．５μｇを用い、それぞれのゲルで比較
した。
【００６４】３％および４％のゲルでは、２６Ｓプロテ
アソームは、同様の挙動を示し、２つのアイソフォーム
２６Ｓαと２６Ｓβの存在が確認されたが、５％ゲルで
は、確認できなかった。一方、２０Ｓプロテアソーム
は、すべてのゲル濃度で確認でき、ポリアクリルアミド
濃度に電気泳動上の移動度が依存していた。さらに、ク
ルードなエクストラクトにおいてみられる２６Ｓα、２
６Ｓβ、および２０Ｓプロテアソームのバンドは、それ
ぞれ精製して得られたバンドの位置に一致していた。こ
のことは、実施例２の（４）で精製して得られた２６Ｓ
プロテアソームには、２つのアイソフォームが存在する
ことを示している。
アソームは、同様の挙動を示し、２つのアイソフォーム
２６Ｓαと２６Ｓβの存在が確認されたが、５％ゲルで
は、確認できなかった。一方、２０Ｓプロテアソーム
は、すべてのゲル濃度で確認でき、ポリアクリルアミド
濃度に電気泳動上の移動度が依存していた。さらに、ク
ルードなエクストラクトにおいてみられる２６Ｓα、２
６Ｓβ、および２０Ｓプロテアソームのバンドは、それ
ぞれ精製して得られたバンドの位置に一致していた。こ
のことは、実施例２の（４）で精製して得られた２６Ｓ
プロテアソームには、２つのアイソフォームが存在する
ことを示している。
【００６５】さらに、この二つのアイソフォームを電気
泳動で調べたところ、２６Ｓα、２６Ｓβプロテアソー
ムは、ともに同じ分子量の２０Ｓプロテアソームと３５
ー１５０ｋＤａの制御因子から構成されていることがわ
かった。このことより、この２つのアイソフォームが生
じたのは、分子量サイズによるものではなく、荷電状態
の違う２種類の２６Ｓプロテアソームが存在しているた
めであることがわかった。
泳動で調べたところ、２６Ｓα、２６Ｓβプロテアソー
ムは、ともに同じ分子量の２０Ｓプロテアソームと３５
ー１５０ｋＤａの制御因子から構成されていることがわ
かった。このことより、この２つのアイソフォームが生
じたのは、分子量サイズによるものではなく、荷電状態
の違う２種類の２６Ｓプロテアソームが存在しているた
めであることがわかった。
【００６６】実施例４ ラット２６ＳプロテアソームのＡＴＰａｓｅ活性とユビ
キチン結合蛋白質の分解活性 実施例２の（４）で精製したラット２６Ｓプロテアソー
ムのＡＴＰａｓｅ活性および125 Ｉ−リゾチームーユビ
キチン 結合体分解活性のｐＨ依存性とＡＴＰ依存性を
調べた。ｐＨ依存性の結果を図６Ａに、ＡＴＰ濃度依存
性の結果を図６Ｂに示す。図６Ａより、２６Ｓプロテア
ソームのＡＴＰａｓｅ活性とユビキチン結合蛋白質分解
活性は、ｐＨ８ー９にピークがあったことより、該酵素
の至適ｐＨは８ー９であることがわかった。
キチン結合蛋白質の分解活性 実施例２の（４）で精製したラット２６Ｓプロテアソー
ムのＡＴＰａｓｅ活性および125 Ｉ−リゾチームーユビ
キチン 結合体分解活性のｐＨ依存性とＡＴＰ依存性を
調べた。ｐＨ依存性の結果を図６Ａに、ＡＴＰ濃度依存
性の結果を図６Ｂに示す。図６Ａより、２６Ｓプロテア
ソームのＡＴＰａｓｅ活性とユビキチン結合蛋白質分解
活性は、ｐＨ８ー９にピークがあったことより、該酵素
の至適ｐＨは８ー９であることがわかった。
【００６７】また、図６Ｂより、２６Ｓプロテアソーム
のＡＴＰ分解のＫｍ値は、約０.２５ｍＭであることが
わかった。これらの結果より、精製２６Ｓプロテアソー
ムはＡＴＰ存在下でユビキチン結合蛋白質を分解する活
性があり、その至適ｐＨは、８ー９、Ｋｍ値は、０．２
５ｍＭであることがわかった。
のＡＴＰ分解のＫｍ値は、約０.２５ｍＭであることが
わかった。これらの結果より、精製２６Ｓプロテアソー
ムはＡＴＰ存在下でユビキチン結合蛋白質を分解する活
性があり、その至適ｐＨは、８ー９、Ｋｍ値は、０．２
５ｍＭであることがわかった。
【００６８】実施例５ ラット２６ＳプロテアソームのＡＴＰａｓｅ活性 実施例２の（４）で精製したラット２６Ｓプロテアソー
ムのＡＴＰａｓｅ活性について、ＡＴＰａｓｅの阻害剤
等を用いて調べた。その結果を表１に示す。表１には、
ユビキチン結合蛋白質、およびＡＴＰ分解活性に及ぼす
各種阻害剤の添加効果について、すなわち、添加した化
合物の最終濃度におけるＡＴＰａ−ｓｅ活性、および
125 Ｉ−リゾチームーユビキチン 結合体分解活性の無
添加コントロールに対する相対活性（％）を示す。
ムのＡＴＰａｓｅ活性について、ＡＴＰａｓｅの阻害剤
等を用いて調べた。その結果を表１に示す。表１には、
ユビキチン結合蛋白質、およびＡＴＰ分解活性に及ぼす
各種阻害剤の添加効果について、すなわち、添加した化
合物の最終濃度におけるＡＴＰａ−ｓｅ活性、および
125 Ｉ−リゾチームーユビキチン 結合体分解活性の無
添加コントロールに対する相対活性（％）を示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】ＡＴＰａｓｅ阻害剤であるヴァナディトと
クゥエルセチンは、２６ＳプロテアソームのＡＴＰａｓ
ｅ活性を阻害するとともに、125 Ｉ−リゾチームーユビ
キチン結合体分解活性も大きく阻害（コントロールの３
５％以下）した。また、Ｎーエチルマレイミドとヘミン
もこれらの活性をＡＴＰａｓｅ阻害剤と同様に阻害し
た。しかしながら、プロテアーゼインヒビターとして知
られているロイペプチン、キモスタチン、ＥＰー４７５
はこれらの活性を阻害しなかった。
クゥエルセチンは、２６ＳプロテアソームのＡＴＰａｓ
ｅ活性を阻害するとともに、125 Ｉ−リゾチームーユビ
キチン結合体分解活性も大きく阻害（コントロールの３
５％以下）した。また、Ｎーエチルマレイミドとヘミン
もこれらの活性をＡＴＰａｓｅ阻害剤と同様に阻害し
た。しかしながら、プロテアーゼインヒビターとして知
られているロイペプチン、キモスタチン、ＥＰー４７５
はこれらの活性を阻害しなかった。
【００７１】これらの結果より、２６Ｓプロテアソーム
のＡＴＰ分解活性とユビキチン化蛋白質の分解とは、密
接に関連していることがわかった。また、２６Ｓプロテ
アソームの活性は、既存のプロテアーゼインヒビターで
は、阻害されなっかたことより、既存のプロテアーゼと
は、異なる触媒活性部位を持つと推察される。
のＡＴＰ分解活性とユビキチン化蛋白質の分解とは、密
接に関連していることがわかった。また、２６Ｓプロテ
アソームの活性は、既存のプロテアーゼインヒビターで
は、阻害されなっかたことより、既存のプロテアーゼと
は、異なる触媒活性部位を持つと推察される。
【００７２】実施例６ ラット２６Ｓプロテアソームの蛋白質分解活性に及ぼす
影響因子 ラット２０Ｓプロテアソームは、不活性型で細胞内に局
在し、ＳＤＳやポリＬーリシンで活性化され、酸性、塩
基性、および中性のアミノ酸を分解することが知られて
いる〔Ｔａｎａｋａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，「Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．」２６１，１５１９７−１５２０３（１
９８６）〕。しかしながら、２６Ｓプロテアソームの詳
細については明らかになっていないため、その蛋白質分
解活性に及ぼすＳＤＳ濃度、ｐＨ、温度の影響を２０Ｓ
プロテアソームと比較した。
影響因子 ラット２０Ｓプロテアソームは、不活性型で細胞内に局
在し、ＳＤＳやポリＬーリシンで活性化され、酸性、塩
基性、および中性のアミノ酸を分解することが知られて
いる〔Ｔａｎａｋａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，「Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．」２６１，１５１９７−１５２０３（１
９８６）〕。しかしながら、２６Ｓプロテアソームの詳
細については明らかになっていないため、その蛋白質分
解活性に及ぼすＳＤＳ濃度、ｐＨ、温度の影響を２０Ｓ
プロテアソームと比較した。
【００７３】なお、蛋白質分解活性の測定においては、
基質として、合成基質を用い、中性アミノ酸としては、
キモトリプシン様基質Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ（ペプ
チド研究所社製）、酸性アミノ酸としては、Ｃｂｚ−Ｌ
ＬＥ−ＮＡ（シグマ社製）、塩基性アミノ酸としては、
トリプシン様基質Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡ（ペプチド研
究所社製）を用いた。
基質として、合成基質を用い、中性アミノ酸としては、
キモトリプシン様基質Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ（ペプ
チド研究所社製）、酸性アミノ酸としては、Ｃｂｚ−Ｌ
ＬＥ−ＮＡ（シグマ社製）、塩基性アミノ酸としては、
トリプシン様基質Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡ（ペプチド研
究所社製）を用いた。
【００７４】（ｉ）ＳＤＳ濃度 図７に、ラット２０Ｓプロテアソームと２６Ｓプロテア
ソームの蛋白質分解活性に及ぼすＳＤＳ添加濃度の効果
を示す。２０Ｓプロテアソーム（図７上段）は、Ｓｕｃ
−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ、Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡの分解に対
しては不活性型であったが、ＳＤＳ添加により活性化さ
れ、最大活性はＳＤＳ濃度が０．０５％で見られ、０．
０７％以上では、酵素の変性により失活した。一方、Ｂ
ｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの分解は、ＳＤＳ濃度依存的に阻
害された。
ソームの蛋白質分解活性に及ぼすＳＤＳ添加濃度の効果
を示す。２０Ｓプロテアソーム（図７上段）は、Ｓｕｃ
−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ、Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡの分解に対
しては不活性型であったが、ＳＤＳ添加により活性化さ
れ、最大活性はＳＤＳ濃度が０．０５％で見られ、０．
０７％以上では、酵素の変性により失活した。一方、Ｂ
ｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの分解は、ＳＤＳ濃度依存的に阻
害された。
【００７５】次に、２６Ｓプロテアソーム（図７下段）
について調べたところ、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡの分
解に対してＳＤＳを添加をしなくても活性があることが
わかった。さらにこの活性は、ＳＤＳ濃度０．０１％で
は阻害されたが、それ以上の濃度では、再び活性化さ
れ、２０Ｓプロテアソームと同様の挙動を示した。
について調べたところ、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡの分
解に対してＳＤＳを添加をしなくても活性があることが
わかった。さらにこの活性は、ＳＤＳ濃度０．０１％で
は阻害されたが、それ以上の濃度では、再び活性化さ
れ、２０Ｓプロテアソームと同様の挙動を示した。
【００７６】これは、２６Ｓプロテアソーム中の２０Ｓ
プロテアソームが０．０１％で解離し、さらにＳＤＳを
添加することにより、２０Ｓプロテアソームが活性化さ
れるためと考えられる。Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡの分解に
対しては２０Ｓプロテアソームと同様の挙動を示すが、
Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの分解に対しては、ＳＤＳによ
る濃度依存的阻害効果は、大きかった。これらの結果よ
り、２０Ｓプロテアソームは制御因子と結合することに
より、２６Ｓプロテアソームを生成し、２０Ｓプロテア
ソームと異なる蛋白質分解活性を示すことがわかった。
プロテアソームが０．０１％で解離し、さらにＳＤＳを
添加することにより、２０Ｓプロテアソームが活性化さ
れるためと考えられる。Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡの分解に
対しては２０Ｓプロテアソームと同様の挙動を示すが、
Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの分解に対しては、ＳＤＳによ
る濃度依存的阻害効果は、大きかった。これらの結果よ
り、２０Ｓプロテアソームは制御因子と結合することに
より、２６Ｓプロテアソームを生成し、２０Ｓプロテア
ソームと異なる蛋白質分解活性を示すことがわかった。
【００７７】（２）ｐＨによる影響 図８に、ラット２０Ｓプロテアソーム（図８上段）と２
６Ｓプロテアソーム（図８下段）の蛋白質分解活性に及
ぼすｐＨの影響を示す。黒丸は、０．０５％ＳＤＳ添加
した際の、また、白丸は無添加の際の蛋白質分解の相対
活性を示す。２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームは共
に、中性から弱アルカリ性領域に最大活性があった。
６Ｓプロテアソーム（図８下段）の蛋白質分解活性に及
ぼすｐＨの影響を示す。黒丸は、０．０５％ＳＤＳ添加
した際の、また、白丸は無添加の際の蛋白質分解の相対
活性を示す。２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームは共
に、中性から弱アルカリ性領域に最大活性があった。
【００７８】Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ分解活性につい
ては、両プロテアソーム共に、ｐＨ８に最大活性があっ
たが、分解活性のパターンは両プロテアソームでは異な
っていた。２６ＳプロテアソームのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−
ＭＣＡ分解活性において、ＳＤＳはｐＨ８．０以下で
は、いくぶん阻害的に作用するが、ｐＨ８．０以上では
影響しなかった。
ては、両プロテアソーム共に、ｐＨ８に最大活性があっ
たが、分解活性のパターンは両プロテアソームでは異な
っていた。２６ＳプロテアソームのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−
ＭＣＡ分解活性において、ＳＤＳはｐＨ８．０以下で
は、いくぶん阻害的に作用するが、ｐＨ８．０以上では
影響しなかった。
【００７９】一方、２０Ｓプロテアソームに関しては、
広範囲のｐＨにわたって、ＳＤＳは、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ
−ＭＣＡ分解活性を上昇させた。Ｃｂｚ−ＬＬＥ−Ｎ
Ａ、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの分解に対するｐＨの影響
は、両プロテアソーム共にほぼ同様の挙動を示し、この
際、ＳＤＳはＣｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡの分解に対して活性
化に、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの分解に対しては阻害的
に作用した。
広範囲のｐＨにわたって、ＳＤＳは、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ
−ＭＣＡ分解活性を上昇させた。Ｃｂｚ−ＬＬＥ−Ｎ
Ａ、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの分解に対するｐＨの影響
は、両プロテアソーム共にほぼ同様の挙動を示し、この
際、ＳＤＳはＣｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡの分解に対して活性
化に、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの分解に対しては阻害的
に作用した。
【００８０】（３）温度による影響 図９に、ラット２０Ｓプロテアソーム（図９上段）と２
６Ｓプロテアソーム（図９下段）の蛋白質分解活性に及
ぼす温度の影響を示す。黒丸は０．０５％ＳＤＳを添加
した際の、また白丸は無添加の際の蛋白質分解の相対活
性を示す。
６Ｓプロテアソーム（図９下段）の蛋白質分解活性に及
ぼす温度の影響を示す。黒丸は０．０５％ＳＤＳを添加
した際の、また白丸は無添加の際の蛋白質分解の相対活
性を示す。
【００８１】図９上段に示される様に、２０Ｓプロテア
ソームの蛋白質分解の相対活性は、全て４０℃で最大活
性があった。一方、図９下段に示される様に、２６Ｓプ
ロテアソームのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ分解活性は４
０℃では不安定であったが、０．０５％ＳＤＳを添加し
た際には、５０℃に最大活性があった。これに対して、
Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡおよびＢｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの
分解に及ぼす温度の影響に関しては、２０Ｓおよび２６
Ｓプロテアソームは、ほぼ同様の挙動を示した。これら
のことより、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡを分解するキモ
トリプシン様活性に関しては、２６Ｓプロテアソームの
ほうが、２０Ｓプロテアソームより、安定であることが
わかった。
ソームの蛋白質分解の相対活性は、全て４０℃で最大活
性があった。一方、図９下段に示される様に、２６Ｓプ
ロテアソームのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ分解活性は４
０℃では不安定であったが、０．０５％ＳＤＳを添加し
た際には、５０℃に最大活性があった。これに対して、
Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡおよびＢｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの
分解に及ぼす温度の影響に関しては、２０Ｓおよび２６
Ｓプロテアソームは、ほぼ同様の挙動を示した。これら
のことより、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡを分解するキモ
トリプシン様活性に関しては、２６Ｓプロテアソームの
ほうが、２０Ｓプロテアソームより、安定であることが
わかった。
【００８２】実施例７ ラット２６Ｓプロテアソームの形状 ヒト２６Ｓプロテアソームを５０ｍｇ／ｍｌに調製し、
１ー３％ウラニル酢酸（ｐＨ４．５）で支持膜上に逆染
色し、電子顕微鏡（日立社製、Ｈ７０００）で観察し
た。
１ー３％ウラニル酢酸（ｐＨ４．５）で支持膜上に逆染
色し、電子顕微鏡（日立社製、Ｈ７０００）で観察し
た。
【００８３】図１０に、電子顕微鏡写真を基に描いた２
６Ｓプロテアソームの分子構造モデルを示す。図１０で
示されるように２６Ｓプロテアソームの分子形状はダン
ベル状で、その中央部には２０Ｓプロテアソームの構造
が認められた。
６Ｓプロテアソームの分子構造モデルを示す。図１０で
示されるように２６Ｓプロテアソームの分子形状はダン
ベル状で、その中央部には２０Ｓプロテアソームの構造
が認められた。
【００８４】
【発明の効果】本発明者等の研究によれば、プロテアソ
ームの遺伝子は、肝癌細胞、腎癌細胞、白血病細胞など
の悪性腫瘍細胞において正常細胞に比較して異常に高く
発現し、さらに、これらの腫瘍細胞の核にプロテアソー
ムが、異常蓄積することが観察されており、本発明の２
６Ｓプロテアソームを抗原とする抗体を用いることによ
り、これらの各種腫瘍をはじめとする各種病態を、通常
の免疫測定法により測定し、前記各種病態を診断するこ
とが可能である。
ームの遺伝子は、肝癌細胞、腎癌細胞、白血病細胞など
の悪性腫瘍細胞において正常細胞に比較して異常に高く
発現し、さらに、これらの腫瘍細胞の核にプロテアソー
ムが、異常蓄積することが観察されており、本発明の２
６Ｓプロテアソームを抗原とする抗体を用いることによ
り、これらの各種腫瘍をはじめとする各種病態を、通常
の免疫測定法により測定し、前記各種病態を診断するこ
とが可能である。
【００８５】また、多機能プロテアーゼが、前記悪性腫
瘍をはじめ、アルツハイマー病等の各種病態と深く関与
している重要な因子であるとされていることから、本発
明のラット２６プロテアソームは、そのような各種病態
の発現メカニズムの解明と、その有効な治療法を確立す
る上できわめて有用なものである。
瘍をはじめ、アルツハイマー病等の各種病態と深く関与
している重要な因子であるとされていることから、本発
明のラット２６プロテアソームは、そのような各種病態
の発現メカニズムの解明と、その有効な治療法を確立す
る上できわめて有用なものである。
【図１】本発明ラット２６Ｓプロテアソームのバイオゲ
ルカラムによる精製における溶出パターンを示す。
ルカラムによる精製における溶出パターンを示す。
【図２】本発明ラット２６Ｓプロテアソームのグリセロ
ール密度勾配遠心法による精製における溶出パターンを
示す。
ール密度勾配遠心法による精製における溶出パターンを
示す。
【図３】本発明ラット２６ＳプロテアソームのＳＤＳ-
ＰＡＧＥによる分析結果を示す。
ＰＡＧＥによる分析結果を示す。
【図４】本発明ラット２６Ｓプロテアソームの２次元電
気泳動による分析結果を示す。
気泳動による分析結果を示す。
【図５】本発明ラット２６Ｓプロテアソームの未変性状
態での電気泳動による分析結果を示す。
態での電気泳動による分析結果を示す。
【図６】本発明ラット２６Ｓプロテアソームによるユビ
キチン結合蛋白質およびＡＴＰ分解活性に及ぼすｐＨお
よびＡＴＰ濃度依存性を示す。
キチン結合蛋白質およびＡＴＰ分解活性に及ぼすｐＨお
よびＡＴＰ濃度依存性を示す。
【図７】本発明ラット２６Ｓプロテアソームの蛋白質分
解活性のＳＤＳ濃度依存性を示す。
解活性のＳＤＳ濃度依存性を示す。
【図８】本発明ラット２６Ｓプロテアソームの蛋白質分
解活性のｐＨ依存性を示す。
解活性のｐＨ依存性を示す。
【図９】本発明ラット２６Ｓプロテアソームの蛋白質分
解活性の温度依存性を示す。
解活性の温度依存性を示す。
【図１０】本発明ラット２６Ｓプロテアソームの形状を
電子顕微鏡写真を基に作製した分子構造モデルを示す。
電子顕微鏡写真を基に作製した分子構造モデルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 9015−2Ｊ
Claims (3)
- 【請求項１】下記の酵素学的および物理学的性質を有す
るラット２６Ｓプロテアソーム。 （１）ユビキチンが結合した蛋白質を、ＡＴＰ存在下で
分解する活性を有する （２）ＡＴＰを分解する活性を有する （３）超遠心法で測定した沈降係数は、２６Ｓである （４）分子量は、約２，０００ｋＤａ（キロダルトン）
であり、２１ー３１ｋＤａの２０Ｓプロテアソームと、
それ以外の分子量３５ー１１０ｋＤａの制御因子蛋白質
群より構成される （５）電子顕微鏡で観察した分子形状は、ダンベル状
で、その中央部に２０Ｓプロテアソームの構造が認めら
れる （６）中性アミノ酸である合成基質Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−
ＭＣＡ（サクシニル−ロイシル−ロイシル−バリル−チ
ロシン−４−メチル−クマリル−７−アミド）を分解す
る酵素活性を有し、その至適ｐＨは、７．５ー９．０で
ある （７）酸性アミノ酸であるＣｂｚ−ＬＬＥ−ＮＡ（カル
ボベンゾキシルーロイシルーロイシルーグルタミン酸ー
２ーナフチルアミド）を分解する酵素活性を有し、その
至適ｐＨは、７．０ー８．５であり、至適温度は、３５
℃ー４５℃、至適ＳＤＳ添加濃度は、０．０５％である （８）塩基性アミノ酸であるＢｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡ
（ｔ−ブチルオキシカルボニルーロイシルーアルギニル
ーアルギニンー４ーメチル−クマリルー７ーアミド）を
分解する酵素活性を有し、その至適ｐＨは、７．５ー
９．０であり、至適温度は、３０℃ー４５℃である - 【請求項２】 ラット臓器、細胞の細胞質画分より、物
理化学的分離方法により、安定、かつ高収率で精製され
たラット２６Ｓプロテアソームを製造する方法におい
て、当該物理化学的分離方法が、超遠心、ゲル濾過カラ
ム、ハイドロキシアパタイトカラム、グリセロール密度
勾配遠心から選択される１種以上を用いたものであるこ
とを特徴とする前記請求項１に記載されたラット２６Ｓ
プロテアソームの製造方法。 - 【請求項３】 ラットの臓器、細胞の細胞質画分より、
物理化学的分離方法により、安定、かつ高収率で精製さ
れたラット２６Ｓプロテアソームを製造する方法におい
て、グリセリン、２ーメルカプトエタノールあるいはジ
チオスレイトール、およびＡＴＰを添加した分離溶媒を
用いた物理化学的分離方法により、精製することを特徴
とする前記請求項２に記載されたラット２６Ｓプロテア
ソームの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4199028A JPH0622759A (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | ラット２６ｓプロテアソームおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4199028A JPH0622759A (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | ラット２６ｓプロテアソームおよびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622759A true JPH0622759A (ja) | 1994-02-01 |
Family
ID=16400918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4199028A Pending JPH0622759A (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | ラット２６ｓプロテアソームおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0622759A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7601512B2 (en) | 2002-07-19 | 2009-10-13 | Bayer Cropscience Ag | Methods for identifying inhibitors of the 20S and 26S proteasome |
| JP2019527815A (ja) * | 2016-06-06 | 2019-10-03 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | 生体高分子複合体の精製のための方法 |
-
1992
- 1992-07-03 JP JP4199028A patent/JPH0622759A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7601512B2 (en) | 2002-07-19 | 2009-10-13 | Bayer Cropscience Ag | Methods for identifying inhibitors of the 20S and 26S proteasome |
| JP2019527815A (ja) * | 2016-06-06 | 2019-10-03 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | 生体高分子複合体の精製のための方法 |
| US11401301B2 (en) | 2016-06-06 | 2022-08-02 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. | Method for the purification of biological macromolecular complexes |
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