JPS62111683A - ヒトＣｈＥ型タン白質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １豆立且１ 本発明は神経伝達物質−加水分解酵素、アセチルコリン
エステラーゼ、ＥＣ３，１，１，７、ＡＣｈＥと略記、
の分野であり、この酵素はコリン作動性シナプスおよび
神経筋接合部における重要な要素である。コリンエステ
ラーゼ（ＣｈＥ）は各種細胞に見られ、多分子形で存在
する。本発明によれば、ヒトＣｈＥの主な型をコードす
る各種ｃＤＮＡおよびｍＲＮ八が供される。各種のＣｈ
Ｅの人聞生産のために遺伝子工学が使われる。

ＣＩ−ＩＥを生産しつるバクテリアの如き発現系が供さ
れる。こうして入手できるＣｈＥは解毒剤として有機リ
ンＯＰ中毒の治療およびこのような有毒物質にやられた
患者の治療に有用なものである。

活性ＣｈＥを生ずるｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞の如き翻
訳系にて翻訳可能な、非常に純粋な形のコリンエステラ
ーゼｍＲＮＡの製造法をも供される。

コリンエステラーゼの有機リン酸結合部位に存在する共
通へキサペプチド配列により作った合成オリゴヌクレオ
チドプローブが供される。このようなプローブは各種源
の遺伝子工学的につくったライブラリィの配列を含むｃ
ＤＮＡ断片を選択するのに使われる。

更に、適当な発現ベクターに挿入されたこのようなｃＤ
ＮＡ断片を含むバクテリアコロニーも供される。クロー
ン化ＤＮＡによりコードされたペプチドを生産するため
に適当に誘導する場合、これらの細胞は抗−ＡＣｈＥ抗
体と免疫反応性のタン白質を合成する。したがって、Ｃ
ｈＥ生合成に直接関係する哺乳動物ＤＮＡ配列の同定を
行なった。　　４ 更に、本発明は真のＣｈＥ−型触媒活性を有するタンパ
ク質に関する。このようなタン白質はサクシンコリンお
よび／又は有機リン解ｆＲ”ｌＪ剤の有効な成分である
。ヒトＡＣｈと反応する抗体が供される。

コリン作動性シナプスでは、酵素アセチルコリンエステ
ラーゼ（アセチルコリンヒドラーゼ、ΔＣｈＥ、ＥＣ３
，１，１，７）は神経伝達物質アセチルコリン（ＡＣｈ
）を非常に迅速に破壊して、このアセチルコリンに対す
る電気生理学的応答を終らせる（Ａ、５ｉｌｖｅｆ、　
Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆＣｈｏｌ　１ｎｅｓｔｅ
ｒａｓｅ、北オランダ出版、アムステルダム、１９７４
参照）。１乳初物のコリンニステラーぜ（ＣｈＥｓ）は
いくつかのレベルで広いポリフオミズムを示す。それら
は基質特異性により、アセチルコリンエステラーゼ（ア
セチルコリンヒドラーゼ、ＥＣ３，１，１，７，ＡＣｈ
Ｅ）と偽コリンエステラーゼ（アセチルコリンヒドラー
ゼ、ＥＣ３，１，１，８，ＣｈＥ）に区別することがで
きる。これらは各種阻害剤に対する感受性が異なる。両
方共約６００アミノ酸残基のサブユニットから成り、グ
リシル化（１０〜２０％）されている。

Ｃｈ［’Ｓは複分子形でみられ、シュクロース勾配に対
する各種沈降係数を示し、非イオン洗剤と異なった流動
力学的反応を示しかつ各種サブユニツ１〜から成る（Ｈ
ａｓｓｏｕｌｉｅ　Ｊ、とＳ、Ｂｏｎ　１八ｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｎｃｕｒｏｓｃｉ、、　５．５７〜１０６．
１９８２参照）。哺乳動物の神経組織においてＣｈＥｓ
の細胞質と膜関連プールが分泌されるが、すべての形の
ＣｈＥｓは類似の触媒性を有し、共通のアセチルコリン
結合部位を有することを示唆している（１．　ＩＦ５．
　Ｃｈａｂｌｅ、　１ｎ：Ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓ
ｅ−Ｆｕｎｄａｓ＋ｅｎｔａｌａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃｄ
　Ａｓｐｅｃｔｓ、　Ｈ，Ｂｒｚｉｎ、　Ｅ、Ａ、８ａ
ｎｎａｒｄと０．５ｋｅｔ、　３４５〜３５９．１９８
４６照）。しかし、各種ＡＣｈＥ形の亜細胞分離につい
て、その異なる両親媒性についておよびマルチナブユニ
ットタン自分子への各種アセンブリイ様式により、いろ
いろなＣｈＥＳは違ったポリペプチド領域をも含みうる
。このことは、類似性（Ｆａｍｂｒｏｕｇｈら、Ｐｒ０
Ｃ，Ｎａ目、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９．１０７
８〜１０８２．１９８２）および各種ＡＣｈＥと各種生
物間の違い（Ｄｏｃｔｏｒら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ且、５７６７〜５７７１．
１９８３）を示ず抗体のレポートにより支持される。

普通に使われる殺虫剤の多くは有機リン（ＯＰ）化合物
ｐあり、昆虫のＡＣｈＥをブロックする作用がある。こ
のような昆虫が殺虫剤に対する非感受性が進む多くの場
合には、有機リン酸と反応しないＡＣｉＥの発現形が増
大するために、この環条がおきる。このような現象を成
功裡に行うために、このようなＡＣｈＥ形の出現が制御
されるメカニズムを知る必要がある。

゛哺乳動物ＡＣｈＥの完全な阻害（即ち、ＯＰ−毒の投
与により）、活性部位セリンとの安定な化学量論的（１
：１）共有結合により、致命的である。ＯＰ中毒の治療
には、可逆的ＣｈＥ阻害剤の使用、および活用部位セリ
ンのヒドロキシル基からホスホリル部分を切り離す活性
部位方向のヌクレオフィル（例えば、四級オキシム）と
阻害酵素との反応を含む。平行的な拮抗反応（エージン
グ）は阻害したＣｈＥを、共有結合したＯＰ基を脱アル
４ニル化することにより普通に使われる再活性化剤で再
生できない形に転換し、そしてサリン、ＤＦＰおよびソ
マンのようなある有機リン酸による中毒の治療を非常に
難しくする（Ｎａ口００ａ１八ｃａｄｃｍｙ　　ｏｆ　
　５ｃｉｅｎｃｅｓ　　Ｒｅｐｏｒｔ、　　　１　９　
８　２　　）　　。

コリンエステラーゼ遺伝子におけケ度ヱノ変巽偽コリン
Ｔステラ−ぜ（ψＣｈＥ）は血清に特に多い。「ヌル］
のψＣｈＥ活性をもつ患者（即ち、その＋（＋ｌ清試料
はアセチルコリンを加水分解することがひきない）は自
然の条件下では少しも健康上の問題はなく、外科処理中
サクシニルコリン（短期作用の筋肉馳緩剤として普通に
使われる薬剤）を与えると、長期間無呼吸を受ける。し
かし、外科手術前に変則型の酵素を検出しかつ特長づ（
）る迅速、簡単なルーチンの方法はない。

ヒトＡＣｈＥのアミノ酸配列は知られていない。

同じ６アミノ酸は丁ｏｒｐｅｄｏ　Ａ　Ｃｈ　Ｅテ１〜
ラマーおよびヒト偽ＣｈＥテトラマー両方の有機リン結
合部位に含まれることが最近分った（　ＨｃＰｈｅｅ−
Ｑｕｉｇｌｅｙ、　Ｋ、　Ｊ、　８ｉｏ１．　Ｃｈｅｉ
、２６０．１２１８５〜１２１８９．１９８５　：　Ｓ
ｃｈｕｍａｃｈａｒ等、Ｎａｔｕｒｅ３１９．４０７〜
４０９．１９８６）。

ＣｈＥｓの有機リン酸結合部位のこのヘキサペプチドに
おけるアミノ酸配列は、〔３日〕−ジイソプロピル７０
ロホスフエートでラベルした精製酵素の部分的タン自分
解湾化により、最近いくつかの研究所で測定され、かつ
有機リン酸に結合しりｆ：　＋）　ン残基ト共に、Ｇ　
Ｉ　Ｖ−Ｇ　ｌ　ｕ−８ｅ　ｒ　−ＡｌａＧｌｙ−Δ１
ａであることが分った。

「ヌル」型のＵＣｈＥはこのペプチドにて修飾されるこ
とが示唆された。

コリンエステラーゼのレベルと性質における通常の変化 ヒト脳ＡＣｈＥの分子形のレベル（５ｐｏｋｅｓ、　Ｅ
。

Ｇ、Ｓ、、　Ｂｒａｉｎ　１０３．１７９〜１８３．１
９８０）と分子形の組成（Ａｔａｃｋ　、　Ｊ、Ｒ，等
、Ｎｅｔ＋＋”０３Ｃｉ、ＬＯｔｔ、４０．１９９〜２
０４．１９８３）はアルツハイマー型の老人性痴呆（Ｓ
ＤＡＴ、６５才以上の約５％）又はダウン症候群（染色
体２１の三染色体性）の如きいくつかの神経病又は遺伝
病において報告された。コリン作動性脳区域におけるＡ
ＣｈＥのレベルは約５０％まで落ち、そしてテトラマー
形の酵素は５ＤＡＴにて完全に消失する。

ダウン症候群をもつ固体は４０才萌では５ＤＡＴ徴候を
常に進める。更にヒトエンブリオにおける開放神経管欠
損がＡＣｈＥテトラマーの羊水への分泌により臨床的に
特長づけられる。これらの現象の通常の試験はシュクロ
ース勾配分画、続いて基質加水分解の酵素試験又はゲル
電気泳動およびＡＣｈＥ活性染色を含む。特異的ＡＣｈ
Ｅ形のレベルを測定する単純な選択法が特に望ましい。

ＡＣｈＥ生合成を調節するＡＣｅ座を欠くホモ接合Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉ　Ｉａ変異体は幼虫分化の非常に初期段階
で死ぬ（Ｈａｌｌ、　Ｊ、０．、Ｑｕａｆ、　Ｒｅｖ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ」、３〜４７９．１９８２）。

その２つのコリンエステラーゼ遺伝子の１つの発現に欠
ける線虫変異体は生存し得ない。ヒトにおけるＡＣｈＥ
遺伝子のホモ接合変異は初期流産又は胎児の酷い神経節
奇形どなる公算が強い。これまで、特巽固体がそのよう
な変異をイｉケるかどうかを測定する方法はない。

発明の要約 本発明は遺伝工学的ＡＣｈＥ様酵素活性ベプヂドおよび
その製造法に関する。更に詳述すると、本発明はポリク
ローナルおよびモノクローナルアセチルコリンエステラ
ーゼ特異抗体と反応するペプチドに関する。また、ヒト
アセデルコリンエステラーゼと特異的に反応するそのよ
うなペプチドに対し刺激される抗体に関し、かつ病気Ｗ
Ｊ連のＣｈＥｓ変化の患者による検出のためにその抗体
の臨床的使用に関する。

更に本発明は上記した遺伝工学的タン白質をコードする
ｃＤＮＡに関し、かつそのｃＤＮＡを含むバクテリアｌ
１ｌＩＩａと真核細胞の如き発現系ならびに合成形の哺
乳動物ＣｈＥをコードするｍＲＮＡに関する。このｃＤ
ＮＡは上記したヌクレオチド配列を含む。更に本発明は
ヒトコリンエステラーゼをコードするヌクレオチド配列
を含むヒトコリンエステラーゼ遺伝子の断片および適当
なファージ（シャロン４Ａファージ）等の発現ベクター
にてクローンした断片に関する。

本発明によれば、活性コリンエステラーゼを産生しうる
培養可能な細胞が供され、この細胞は遺伝工学的コリン
エステラーゼフード配列を含む。

このような細胞は背椎細胞、バクテリア細胞および酵母
細胞でよい。本発明の方法は上記した型の適当なホスト
細胞を、望ましい活性酵素をコードするＤＮＡ配列を含
む組み換えベクターによりトランスフェクションし、そ
の細胞を培養し、酵素を回収しそして精製することから
成る。

更に本発明は活性成分として上記ＣｈＥ型酵素を含有す
る、有機リン化合物毒の予防ならびに治療に使用する医
薬組成物に関する。

本発明によれば、ヒトを含む哺乳動物において、遺伝的
に変化したコリンエステラーゼ産生遺伝子測定用試験が
供される。この試験の詳細は次の工程から成る方法に記
述される。

ａ、患者の細胞からＤＮＡを抽出する、ｂ、　このＤＮ
Ａを酵素的制限を行なう、Ｃ６このＤＮＡの断片を電気
泳仙的に分離して、その断片を適当な担体にプロットす
る、ｄ、　所定の配列のラベルしたＤＮＡプローブを供
する、 ｅ、　　ｃの断片をｄのプローブとハイブリドする、ｆ
、　ハイブリドパターンにより変化した遺伝子の有無を
調べる。

国際寄託機関への寄託 ファージＦＢＣｈＥ　　１２ａ　　ｇｔ　　１０Ｊ３よ
びプラスミドＦＢＣｈＥｐＥＸ　　１２ａはフランスの
パスツール研の機関に寄託した。番号は夫々ｌ−５３４
とｌ−５５２゜ 本発明の他の特徴は次の記述から明かになる。

本発明の生成物の適用には、以下のものがある。

１、イエ用性二本発明は非常に高いＫｄ値で有機リン毒
に結合する十分闇の酵素を生産する手段を供する。この
タン白質（又はその一部）はＯＰ毒に対する非常に有効
な薬として使用できる。

２、ＵＣｈＥ欠失の臨床的検出は、鐘状血球β−Ｓグロ
ブリンをコードする遺伝子の異常性の検出に類似して、
ゲノムＤＮＡに対するオリゴヌクレオヂドハイブリドを
使って、外科手術後の長期無呼吸現象を抑制する（　Ｃ
ｏｎｎｅｒ。

８　Ｊ、ら　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ旦　０．２７８〜２８２．１９８３）。ゲノ
ムＤＮＡの少量試料および単一ハイブリド工程における
これらの正常な配列と欠失配列とを区別するのに使う試
験法が供される。

３、ＡＣｈＥの活性部位トポグラフィとアミノ酸配列の
解明は、ＣｈＥＳの毒性又は病気関連変化を検出する迅
速、簡単な臨床方法の発展の新しいアプローチを開く。

このことは例えば、各種神経病において変る主なものの
様であるテトラマー形に特異的なペプチドドメインに対
して顕在化されるモノ特異的抗体を使って、ラジオイム
ノアッセイにより行なうことができる。

４、ＣｈＥ遺伝子の変異が致命的か酷いダメージの原因
であることが許可されるならば、ＤＮＡレベルでそのよ
うな変異を検出する方法を供することができ、非常に初
期の妊娠段階で欠失遺伝子を同定できる。これは漿膜絨
毛又は羊ｇ！１ｌＩｌｒ芽細胞由来のＤＮＡおよびＣｈ
Ｅｌ伝子由米子由来特長づけられたプローブを使って、
ハイブリド試験により行なうことができる。

望ましい　　の　゛ ヒトＣｈＥｓをコードするｍＲＮＡ種を同定するために
、触媒的に活性なＣｈＥｓを産生し得る非常に感度のよ
い、有効な翻訳系としてミクロ注入したＸｅｎｏｐｕｓ
卵母細胞の使用を本発明者は開発した（Ｓｏｒｅｑ、　
Ｉｆ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ７９．８３０〜８３５．１９８２）。

各ＩＣｈＥ−発現源由来のｍＲＮＡをこれらの卵母細胞
に注入すると、ＣｈＥ活性を生成する（　Ｈ，５ｏｒｅ
ｑ、等、ＥＨＢｏ　Ｊｏｕｒｎａｌ　　３．１３７１〜
１３７５．１９８４）。このバイオアッセイは相当する
組織において、ＣｈＥｍＲＮＡのレベルを直接モニター
するのに使われた。本発明昔が最近開発したＣｈＥ活性
の測定法（Ｒ，Ｐａｒｖａｒ　ｉ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅＩｌ、　　１３３．４５０〜４５６．１９８３）
と組み合わせて、これらの活性を特に高感度で測定でき
かつ卵母細胞生産酵素の生化学的性質を規定することが
できる（　Ｈ，５ｏｒｅｑ、　０ＲＣＣｒｉｔｉｃａｌ
　Ｒｅｖｉｅｗ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｖｏｌ、１
８．１９９〜２３８．１９８５）。

卵母細胞におけるＣｈＥｍＲＮＡレベルの測定は時間と
濃度依存であることが実証されかつ脳ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａから産生した酵素は「真の」哺乳初物へ〇ｈＥとして
生化学的に規定された。全ポリ（Ａ）”ＲＮＡに対する
Ｃ　ｈ　Ｅ　ｍ　ＲＮ　Ａの濃度を計算した場合、全ｍ
ＲＮＡの約１×１０−５の値を示した（ｓｏｒｅｑ、等
、同上、１９８４）。第一グリオーム、Ｗｉ膜腫および
胚脳由来のＤＭＳＯ−変性ｍＲＮＡのシェフロース勾配
分画は３２Ｓ、２Ｏ８および９Ｓで沈降する３つの大き
さのＣｈＥ−１導ｍＲＮＡを示した。これらの各種Ｃｈ
Ｅ−誘導ｍＲＮＡのほは試験される３つの組織源間で変
った。各種基質特異性を有する、卵母細胞で産生される
ＣｈＥｓを区別するために、選択的阻害剤の存在下でそ
の活性を測定した。

ＡＣｈＥとψＣｈＥ多重結合コリンエステラーゼ活性が
ｍＲＮＡ−注入卵母ｌｌｌｌ１１でみられた。更に、「
真の」および「偽Ｊ　ＣｈＥ活性を誘導するヒト脳ｍＲ
，ＮＡは各種サイズ分布をもち、各種ｍＲＮＡはいろい
ろな型のＣｈＥｓに翻訳されることを示唆している。ヒ
トの神経系におけるＣｈＥｓの異質性は翻訳後のレベル
に限定されず、ｍＲＮＡのレベルに拡張することをこれ
らの知見は意味する。更に、ＣｈＥｍＲＮＡの組成はい
ろいろな脳細胞形で異なるようであり、各種移動するＣ
ｈＥ分子形の生産はｍＲＮＡのレベルで少なくとも部分
的にコントロールされるようである。

脳の各種細胞形においてＣｈＥｍＲＮＡ配列のすべての
完全な表示を確立するために、全脳からｃＤＮＡライブ
ラリィを作ることが必要であった。

したがって、特別の脳領域がＡＣｈＥに非常に富むとい
う事実を利用しなかった。だから本発明の選択したｍＲ
ＮＡ調製物はヒト胎児脳由来の全体的未分画ポリ（Ａ＞
”ｍＲＮＡであった。実際、ＣｈＥタン白質をコードす
る特別のＤＮＡ配列に焦点を合わせる為に、高特異性と
選択性のプローブを研究することが決まった。このよう
な性質は、コリンエステラーゼに対しユニークであるア
ミノ酸配列により調製した、合成短鎖オリゴヌクレオチ
ドにより供された。

合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは相補的ＤＮＡ配
列に特異的にハイブリドすることが分った（Ｗａｌｌａ
ｃｅ、　Ｒ，Ｂ、等、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、　
　９．８７９〜８９４．１９８１）。適当なハイブリド
条件下で、塩基対オリゴヌクレオチドＸＤＮＡ二本鎖分
子のみが形成する。不適当な組み合わせの塩基対を含む
二本鎖分子は不適当である。この技術はヒトベータ２マ
クログロブリン、ネズミ移植抗原、ヒトアポリボタン白
質等をコードするｃＤＮＡのうまい単離に適用できた。

ＣｈＥｓの有機リン酸−結合部位（ＯＰＳＹＮ）由来の
共通へキサペプチド配列はＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇ　ｌ　ｕ
−８ｅ　ｒ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇ　ｌ　ｙテある。遺伝子コ
ードの雨衣性のために、このペプチドは次のように３８
４個のオリゴヌクレオチドの１つによりコードされる。

ＯＰ　Ｓ　Ｙ　Ｎ　　オリゴヌクレオチドＰｈｅ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　ｃｌｙＡＡＧ
　　ＣＣＮ　　ＣＴＣＡＧＮ　　ＣＧＮ　　ＣＣＴＴＣ
Ａ （ｗｈｅｒｅ　Ｎ　＝　Ａ、Ｃ，Ｇ　ｏｒ　Ｔ）。

これらのオリゴデオキシヌクレオチドの３つの混合物は
、各々１７のヌクレオチドの１２８個の各種鎖を含む、
０ＰＳＹＮと命名し、ホスホアミダイト化学を使って固
形相合成により￥Ｊ造した（　Ｂｅａｕｃａｇｃ　　等
、Ｔｅｔｒａ、　Ｌｅｔｔ、　　２２．１８５９〜１８
６２．１９８１　；　Ｈｃｂｒｉｄｅ等、Ｔｅｔｒａ。

Ｌｅｔｔ、　　２４．２４５〜２４８．１９８３；Ａｔ
ｋｉｎｓｏｎ’ｌ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　
５ｙｎｔｈｅｓｒｓ−ａｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒ
ｏａｃｈ、　Ｇａｔｅ　Ｈ，Ｊ、　、Ｉ　ＲＬブレス、
３５〜８１．１９８４）。使用した合成法はＡｄａｌｌ
ｌＳ等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　１０５．６
６１〜６６３．１９８３により示されたものであった。

２つ又は４つのヌクレオチド混合物を導入せねばならな
い合成サイクルにおいて、固形相体を２つ又は４つの等
部に分けた。各部分を必要なホスホアミダイト試薬の１
つのみと反応させた。このサイクルに続いて、各種部分
を再び一緒にした。この操作は混合物中、各成分の大体
の等量の存在を確実にした。このオリゴデオキシヌクレ
オチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動（２０％アク
リルアミド、７Ｍ尿素）、続いてセファデックスＧ−５
０クロマトグラフイで精製した。

０ＰＳＹＮプローブはグアノシンとシトシン残基に特に
富んでいる。したがって、本発明者は高非特異性結合を
抑ｖ１するために、４０℃でこれらのプローブとハイブ
リドを行なった。ファージＤＮＡはプラークからニトロ
セルロースフィルターに移した（　ＨａｎｉａｔｉＳ等
、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　１ａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ
ｏ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

Ｐｒｅｓｓ、１９８２　）　、　フィルターを６ＸＳＳ
Ｃ（ＩＸＳＳＣ＝０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムと０
．１５Ｍ　　ＮａＣ１）、５ｘデンハ−ｔ−（１ＸＤｅ
ｎｈａｒｄｔ溶液は０，０２％Ｆｉｎｃｏｌｌ　／　０
　、０２％ポリビニルピロリドン１０．０２％牛血清ア
ルブミン）および０．１η／ＩＩｔｌサケ精子にて４０
℃／２時間ブレハイブリドのために培養した。この工程
の後、６ＸＳＳＣ１５×デンハート、０．０５Ｉ！ｇ／
ｄサケ精子ＤＮＡおよび３Ｘ１０６（ＩＤＩＩ／ｍの［
３２ＰＪ−ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブにて
４０℃／１６時間ハイブリドした。ついでフィルターを
３ＸＳＳＣ中４０℃／４０分洗い、放出した放射活性が
３００ｄｐ［Ｉｌ／Ｉｄ未満になるまで洗浄溶液を４〜
８度変えた。露出１０１問は増強スクリーン（ＣＡＷＯ
）（最初のスクリーンで２〜３日、別のスクリーンで１
日〉で１〜３日であった。第３のスクリーン工程に続い
て、３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライド（ＣＨ３
）４ＮＣＩを使用して、塩基組成−独立法における短か
い、ＧＣ−リッチなハイブリドに対し識別した（　Ｗｏ
ｏｄ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
＾　８２．１５８５〜１５８８．１９８５）、５０ｍＭ
トリスＨＣＩ、ｐＨ８，０，２ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび
ドデシル硫酸ナトリウム１■／ｄを含有する３Ｍ（ＣＨ
３）４ＮＣＩ溶液でフィルターを３７℃下リンスした。

リンスしたフィルターを同じ（ＣＨ３）４　ＮＣＩ溶液
で５３℃±１℃で２０分振盪浴にて２度洗った。

本研究の正確性を増すために、新たにオリゴデオキシヌ
クレオチドプローブを調製した。このプローブ（ＯＰＳ
ＹＮＯと略記）は３ｂのオリゴデオキシヌクレオチド、
各々２９−ヌクレオチド鎖長、の混合物と考えた。これ
らは０ＰＳＹＮプローブと４つの付加アミノ酸、Ａｌａ
−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｖａｔと同じへキサペプチドから成
るデカペプチドをコードした。ヒト血清ψＣｈＥにこの
ペプチドを続けるために報告された （　０．　Ｌｏｃｋｅｒｉｄｏｅ、　　ｒ　Ｃｈｏｌ　
１ｎｅｓｔｅｒａｓｅｓ−Ｆｕｎｄａｎ＋ｅｎｔａｌ　
ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｓｐｅｃｔｓ　Ｊ　Ｂｒｚ
ｉｎ等著、５〜１２．１９８４）。このプローブの複雑
さを制限しかつ正しいオリゴデオキシヌクレオチドが十
分な特異的活性に存在させるために、すべての４つのヌ
クレオチドが見つかるすべての位置にデオキシイノシン
を挿入した。「不活性」ヌクレオチドであるデオキシイ
ノシンはＡ、Ｃ又は王とハイブリドするがあるいは少な
くともハイブリドの安定化を妨害しないことが予期され
る （　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＪＳＡ　８２．１９３１〜１９３
５．１９８５）。しかし、デオキシイノシンを含有する
このような不完全ハイブリドの安定性は同じ長さの完全
ハイブリドのものより低いことが予期される（　Ｔａｋ
ａｈａＳｈｉ　、同上１９８５）。このことが意味する
のは、我々の洗浄条件下安定に保つため牲、０ＰＳＹＮ
ＯＸｃＤＮＡハイブリドが１７以上の塩基対マツチを含
むべきということである。換言すれば、正しいＣＤＮＡ
を示さない１６〜１７塩基対マツチをもつ０ＰＳＹＮ−
陽性は０ＰＳＹＮＯにより除外されつる。

一緒に、４つのスクリーニング実験を行なった。

これらは８（ＣＨ３）４ＮＣＲ−安定０ＰＳＹＮ陽性の
単離をし、それから単一のクローンだけが０ＰＳＹＮＯ
とハイブリドした。更に、０ＰＳＹＮｉと■および０Ｐ
ＳＹＮＯの両方をもつこのクローンにより示されるハイ
ブリドシグナルは、３Ｍ（ＣＨ３）４ＮＣＩ洗浄に対し
安定のま）である唯一のものであった。単離されたｃＤ
ＮＡインサーｉへ（ＦＢＣｈＥｌ　２と略記）はヒ］・
コリンエステラーゼのサブユニットサイズの約半分をコ
ードするに十分な読み枠をもつ７６５ヌクレオチド、か
ら成った（　Ｌｏｃｔｒｉｄｇｅ　、同上、１９８４）
。

プローブ０ＰＳＹＮと０ＰＳＹＮＯに相補的なＦＢＣｈ
Ｅｌ２のヌクレオチド配列は、これらのオリゴヌクレオ
チドプローブをデザインするのに使われるペプチド配列
に正確に一致した。

ＦＢＣｈＥ１２配列から予測されるアミノ酸がヒトψＣ
ｈＥについて発表された入手可能なペプチド配列と整列
さぼると、成熟酵素のコード領域の約半分が規定され、
Ｎ−末端ペプチドに相当りる残基１（ヌクレオチド１８
７）で出発し、そしてアミノ酸配列から測定されるよう
にψＣｈＥの活性部位トリプシンによるペプチドに含ま
れる残塁２０２で終る。この配列は活性部位セリンを含
み、ジイソプロピル７０ロホスフエートによりラベルス
ルコトができる（　Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ　、同上、１９
８４）。ＦＢＣｈＥ１２配列により意味されるＮ−末端
ペプチドはＵＣｈＥペプチドに類似し、但し、我々ノ配
列では、Ｔｏｒｐｅｄｏ　Ａ　Ｃｈ　Ｅ　（ＨｃＰｈｅ
ｅ−Ｑｕｉｇｌｃｙ等、同上、１９８５）のＮ−末端ペ
プチドのように、残基１２はＩｊ／Ｓであるのに対し、
アミノ酸配列によりみられるヒトＵＣｈＥの相当する残
基はＧｌｙである。更に、ＦＢＣｈＥｌ２によりコード
されるＣｈＥのＮ−末端は赤血球ＡＣｈＥについて報告
されたペプチドと異なる（　ＨａａＳとＲｏｓｅｎｂｅ
ｒｒｙ、静ａ１．　８ｉｏｃｈｅｓ、　　１４８．１５
４〜１６２．１９８５）。要するに、これはＦＢＣｈＥ
ｌ　２がＵＣｈＥをコードすることを示唆している。

ＦＢＣｈＥｌ２におけるψ（：、　ｈ　Ｅアミノ−末端
残基（ヌクレオチド１１５〜１８７）の上流領域は膜関
連の、かつエクスポートされたタン白アリカーサ−のリ
ーダーペプチドに特長的な２０アミノ酸をコードする。

この領域の疎水性配列は大きな非極性アミノ酸に富んで
いる。それはトリペプチド）ｌｉｓ−３ｅｒ−１−ｙｓ
の前にあり、Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｈｉｓで終り、両方共極
性アミノ酸から成る。更に上流のｃＤＮＡ配列は停止コ
ドンのない十分量いた読み枠から成り、２つのメチオニ
ン残塁を含む。

このＤＮＡとＦＢＣｈＥ１２クローンの推論的アミノ酸
配列はＴｏｒｐｅｄｏ電気器官由来のＡＣｈＥをコード
するｃＤＮＡクローンについて発表された平行配列に匹
敵していた（　５ｃｈｕＩＩｌａｃｈｅｒ等、同上、１
９８６）。この分析は丁ｏｒｐｅｄｏとヒト酵素の相当
部分の間に４７％のホモロジイを示し、それらが共通の
祖先源を有することを強く示唆している。

更に高いレベルの保存がＤＮＡレベルよりアミノ酸レベ
ルで見つかった。ＦＢＣｈＥｌ２によりコードされたタ
ン白質の直接的特性について、ＣＤＮＡインサートはβ
−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子と連結してｏＥ
Ｘバクテリア発現ベクターにサブクローンした。ＤＥＸ
Ｒ現を誘導して、２つのポリペプチド、９０と４０キロ
ダルトンを産生し、それを抗β−ガラクトシダーゼ抗体
と反応させ、無傷のβ−ガラクトシダーゼ（１１７キロ
ダルトン）の合成は殆んど完全に終った。

９０にｄのものではなく、４０Ｋｄのポリペプチドをタ
ン白プロットにおいてヒト赤血球とＴｏｒｐｅｄｏ　Ｔ
ｉ気器官ＡＣｈＥに対する抗体と特異的に反応し、両方
のポリペプチドはβ−ガラクトシダーゼ−ＦＢＣｈＥｌ
２の部分加水分解融合タン白質から誘導され、４０Ｋｄ
のポリペプチドはＦＢＣｈＥｌ２によりコードされる情
報を含むことを示唆している。全ヒト血清タン白質に対
する抗血清によるタン０フ０フ８分析では、多分この多
特異的抗血清における低けの抗−コリンエステラーゼ抗
体により、有意な特異的反応を示さなかった。

このヒトＣｈＥｃＤＮＡにより１）ＥＸベクターにてコ
ードされたバクテリア産生のタン白質は分取勾配ゲル電
気泳動、電気溶離および凍結乾燥により精製し、完全フ
ロインドアジュバントと共にウサギに注入した。ウサギ
の血清は、２週間間隔でこのタン白質３００μびを３回
連続して注入して調製した。イムノプロット分析では、
この血清に赤血球由来の高度に精製した７０にｄＡ　Ｃ
ｈ　Ｅ　２０日ｇの低ｆｆ１ｒ１　：　１０．０００稀
釈により反応する抗体を含むことを示した。これをまた
ＡＣｈＥに富む胎児脳と肝臓抽出物にて約９ＱＫｄのタ
ン白質と、およびψＣｈＥに富む胎児筋肉と肝臓にて約
６０Ｋｄのタン白質と反応した。（ヒトコリンエステラ
ーゼに対する抗体はヒトコリンエステラーゼＣＤＮＡと
バクテリア−発現産物により導き出された。５ＯｒｅＱ
等、＾ｂｅｔ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ。

Ｓｏｃ、、１９８６）。

この抗血清はアルツハイマー病患習のようなＣｈＥｓの
レベルと性質の変化を測定する臨床試験に使うことがで
きる。

ＦＢＣｈＥｌ　２によりコードされたタン白質の生体内
生合成を研究するために、インサートＣＤＮＡを［３２
Ｐ　−］ラベルし、ヒトＲＮＡとＤＮＡでハイブリドし
た。１０ｔ１ｇのポリ（Ａ）”ＲＮＡ／レーンを負荷さ
せたＲＮＡプロットにおいて、［３２Ｐ］−ラベルした
ＦＢＣｈＥｌ２を胎児脳と肝臓に存在するが、コリンエ
ステラーゼ欠失ヒト［ｐｉｄｅｍｏｉｄ癌腫には存在し
ないＲＮＡの単一２．４にｂバンドと反応した（　５Ｏ
ｒｅＱ等、同上、１９８４）。ハイブリドを実現するに
要する露出時間は比較的長く（１０日）、このｍＲＮΔ
が胎児脳と肝臓の如ぎ陽性組織源にでもや）低濃度で存
在することを示唆している。この仮説は胎児脳ライブラ
リィを［３２Ｐ］−ラベルＦＢＣｈＥ１２で再スクリー
ンして確証した。１×１０６ファージの内６つはＦＢＣ
ｈＥｌ２とハイブリドした３つの異なるインサートを含
有した。

これらの内２つはＦＢＣｈＥｌ２に含まれる部分的断片
でありかつ３つ目は最初のＣＤＮＡクローンをもつ部分
的配列ホモロジイのみを示した。この分析はｃＤＮ△ラ
イブラリィにおけるコリンエステラーゼｃＤＮＡクロー
ンの欠乏を強調している。

胎児脳と肝臓中の特定のコリンエステラーゼをコードす
るｍＲＮＡレベルはＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞にｍＲＮＡ
マイクロ注入して平行して分析し、ＡＣｈＥｍＲＮＡど
ψＣｈＥｍＲＮＡを翻訳し、その触媒活性の酵素生成物
を得た。イソー〇ＭＰへ−無反応ＡＣｈＥのかなりの産
生が胎児脳か肝！ｉＡＲＮ　Ａを（＋−Ｉ　Ｅ　Ｄ　Ｒ
Ｎ　Ａではない）を注入した卵母細胞に見られた。反対
に、肝臓ｒｒｌＮＡだけが［３Ｗ２８４Ｃ５１−無反応
ψＣｈＥの有意量を産生ずることができた。したがって
、ＲＮＡプロットハイブリドに示されたパターンはＡＣ
ｈＥｍＲＮＡのレベルと、又はコリンエステラーゼｍ　
ＲＮ　Ａの両種と（但し偽−ＣｈＥｍＲＮＡ甲独ではな
い）と匹敵する。

Ｆ　Ｂ　Ｃｈ　Ｅ　１２のゲノムＤＮＡ源はＤＮＡプロ
ットハイブリドにより試験した。［３２ＰＩ、−ラベル
ＦＢＣｈＥ１２は長さ４．７と２．５にｂの、ＥＣ０Ｒ
ｆで誘導した２つのヒトＤＮＡ断片とハイブリドした。

最初のＦＢＣｈＥｌ　２ｃＤＮＡクローンにおける内部
ＥＣＯＲ１部位の存在を考慮し、かつ２０μびのゲノム
ＤＮＡで観察されるシグナル強度を１．ＯｎＧのλ（ｌ
ｔｌｏ−ＦＢＣｈＥｌ２で検出されるものに比較して、
ＦＢＣ１ＩＥ１２とハイブリドするＤＮＡ配列は多くの
コピーではヒトゲノムに存在しないことをこの分析は指
摘している。マウスＤＮＡの平行分析は有意であるが、
強いハイブリドを示さず、他の浦乳肋物種における相同
のコリンエステラーゼＤＮＡ配列の存在を示唆している
。したがって、翻訳配列をもつクローン（ＦＢＣｈＥｌ
　２ａと略記）も供される。

他の組織源から誘導したｃＤＮＡライブラリィにおける
類似の配列を研究するために、更にＦＢＣｈＥ１２クロ
ーンをプローブとして使った。このようないくつかのク
ローンは、λＱｔｌＯファージでクローンした、胎児肝
１１ＣＤＮＡライブラリィからおよび第一グリオブラス
トーマｃＤＮＡライブラリィから単離した。胎児ヒトコ
リンエステラーゼの全長配列はこれらのクローンから推
量し、次のＦＣｈＥ図に示した。

ａＣＰ　　　Ｏ：Ｉ　　　Ｑ　−ｍ　　　（ｆ　Ｌｌｌ
　　　１−ｍ　　　（Ｘ　：ｌ　　　ＣＬｏし　　ドａ
＋）−１）　ａ）＋　（Ｊ−１−Φ　　Ｕ二Ｃａ　　Ｌ
ＩＪ　　　■ン　　ζ」　　■ζ　　ト」クト＋Ｌ　　
　ｅｘｌ：　　　ｌ−１１１？！島　　ぐ）　　トΦ　
　←フＬ１１−　　ζ−）−Ｊ：　　　［！ｌ−）−１
＋ｚ　　　＋山（Ｃ）−ＬＪ口　　＋（Ｌ　　　Ｌ）Ｌ
ｌ　　　ｌ−Ｊ　　　ｌ−１１Ｌ　　　ＬｊＪ口ｃ　　
　ａｏ＋　　　＋ｏ　　　ａｅ＋　　　ａコ　　ａａ＋
　　　＜＞ａｌｎ　　口Ｌ　　　ＬＩＬ　　　←−ζ−
←−〇−ζａ　　　ａａ　　　ｕ↓　　（−り０　　ζ
−ロロＨ←口　　（′）＋）−ω　　ζ−ロフ　　ＣＬ
　　ヒュ←−ぐＩＮ　　　■−−一（＞　　　←ａｌ（
Ｊω　　（山ａ−ａａａｔ、ｐａ−ζ−ＬＩＪ　　　＋
ω　　口くｇ、＞　　ｑ５　　Ａｉ　　曇５　　Ｑ；　
　Ｈ；　Ｇ　”、；０コ　　（）＋　　口α　　０フ　
　トＶ　　ぐ−■Ｌ　　　（ｆｌｌｌヒａｔ　　　Ｉｊ
、−ＣりＬ　　　（ｔ−←ｊ　　　（！＞　　　ｕＪ：
　　　（１＞ト」　　■Ｌ）　　　１−１−　　　ｆＬ
）　　　１−（Ｌ　　　ζ−く←　　ζ」Ｌ）：ｌ　　
　Ｃ！ＩＣＬ　　　ａ：＋　　　ａフ　　ｔ−ｅ　　　
ｃフ　　　トー　　０ａｔ１−１ＩＩＣ！ｌ　＋＋　　
ぐ−Ｃ−Ｃｖ　　　＋ｌ　　　Ｌｌ４：　　　（ＤＬ←
」　　←←　　口０　０口　　ζζ　　←−ζμ　　ζ
（ｌ−＞　　ｓａｔ　　　Ｏ）ＯＬＪフ　　Ｃ１（Ｐ　
　口α　←Ｃζ＼ロー　　ｊ−ｊ：　　　（Ｊｕ　　　
１−０１　　　Ｃ！ｌｌＬ　　　ＬＩＬ　　　（ｔｌｌ
ｌ　　　Ｌｌ−＋Ｌ）Ｌｌｌ　　　ｌ−Ｌ　　　ＬＩＩ
ＩＬ　　　ｕ−ｕａ　　　＋＋　　　ａａ　　　Ｌ）ロ
ロコ　　（！＋１１１　　１−コ　　ＬＩＬ　　　ａｌ
ＩＩＬＩＬ　　　ｌ−ＣＩ−：ＩＩ−ｅｔ　　　ａ＞　
　　１−Ｑｌ　　　ａ＞　　　ａ＞　　　ｃｐａ　　　
ａｔｎ　　　１−Ｑｌト」　　ζＪ　　　ＬＩＪ　　　
１−１−　　　（！Ｊ　　　ａ町　　（ζ　　ω」ＣＣ
Ｉ−Ｌ　　　ＬＩＬ、　　　ＬＪ＞　　　１−０　　　
（ｔｏ　　　ｌ−Ｌ　　　ｌ−１１１クー（＞　　　ζ
＞　　ロー　　ωＬ　　口し　　ωω　　←。

Ｕ口　　←ト　　←ｌ−ロロ　　Ｏ良　　■エ　　トω
　　（−１−ＣＬ　　　（ｆＬ　　　Ｌｌｌｌｌ　　　
１−ｆｆｌ　　　ド（＋Ｃζ■　　のＬａｕ＋　　　Ｑ
の　　）−二　　（−りψ　　ぐ１）　トー　　Ｕ−口
ζ　　＋ｆｌ’ｌ　　　１−ＩＬ　　　ＬＪ工　　（（
Ｃζく　　ζ−−■ＦＣｈＥ配列はヒトψＣｈＥについ
て発表された正確なＮ−末端、活性部位およびＣ−末端
ベプチトヲ含ム（Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ　、同上、１９８
４）、ノザーンａ５よびサザーンゲルハイブリドにおい
て、ＦＢＣｈＥ１２と同じ結果を得る。部分１−１ｏｅ
−３消化により調製したシャロン４ＡにおけるゲノムＤ
ＮＡライブラリィをスクリーンするのにプローブとして
使う場合、５陽性ファージとハイブリドした。

クローンＦＢＣｈＥ１２とＦＣｈＥは、付加的コリンエ
ステラーゼｃＤＮＡクローンを単離しかつ他のヒトコリ
ンエステラーゼの全アミノ酸配列を測定する目的で、我
々のｃＤＮＡライブラリィのスクリーンに役立つ。加え
て、コリンエステラーゼ並びにそのｍＲＮＡの写しやタ
ン白生成物をコードするヒト遺伝子の構成、構造および
調節の研究に使われる。

適切な発現ベクターに挿入されると、上記のｃＤＮＡは
触媒活性をもつ忠実なヒトＣｈＥの産生に指向しうる。

生成したＣｈＥはＯＰ−ａｍとサクシニルコリンと反応
する。このようなＣｈＥは上記化合物に対するｗＩ毒剤
として非常に有効である。

このような構築物を含有する真核Ｓ胞は触媒活性のある
ＣｈＥ−型生成物の大量生産に適している。

例 ■、脳組織を記述したように調製した（　Ｒａｚｏｎ。

Ｍ、、５ｏｒｅｑ、　Ｈ，、Ｒｏｔｈ、Ｅ、、８ａｒｔ
ａｌ、＾、および５１１ｇ＋ａｎ、　　１．　　Ｅｘｐ
、　　Ｎｅｒｕｏｌ、　　８４．　６８　１−６９５．
１９８４）。

■、真核組織源のボリアデニール化ＲＮＡの調製は記述
したように行なった（　Ｐｒｏｔｙ、　Ｃ，。

Ｚｅｕｉｎ−８ｏｎｋｉｎ、　０．、　　Ｇｎａｔｔ、
　Ａ、、にｏｃｈ、　Ｒ，。

Ｚｉｓｌｉｎｇ、　　Ｒ，、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　０．
および５ｏｒｅｑ。

ｎ、、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、　　１９
８６　）。

■、ゲル電気泳動およびシュクロース勾配遠沈によるＤ
ＮＡとＲＮＡのサイズ分画は記述されるように行なった
（Ｓ＊ｒｅｑ、　Ｈ，等、同上、１９８４　：　５ｏｒ
ｅｑ、　Ｈ，等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２．　１８２７〜１８３１．１９８
５：Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｆ、　Ｈ，等、ＥＭＢＯＪｏｕ
ｒｎａｌ　３．１４９９〜１５０５、１　９８４）　　
。

■、タン白ゲル電気泳動は勾配ポリアクリルアミドゲル
電気波＠ＩＪ（５〜１５％）により行なった（Ｇｉｖｅ
ｏｎ、　Ｄ、、　ｉｎ；　Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙＡｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｎｅｗｒｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ、　５ｏｒｅｑ。

Ｉｌ、、　　５ｅｒｉｅｓ　　ｏｆ　　Ｈｅｔｈｏｄｓ
　　ｉｎ　　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｇ＋１ｓｔｒｙ。

ＩＢＲｏ　１１ａｎｄｂｏｏｋ　５ｅｒｉｅｓ、　　第
７巻、ジョン・ワイリイー・アンドサンズ、ニューヨー
ク、２３１〜２４３．１９８４）。

Ｖ、ｍＲＮＡをｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞への注入は５Ｏ
ｒｅｑ、　１１．等、同上、１９８２　；　５ｏｒｅｑ
、ｔｌ、同上、１９８４、同上１９８５に記載のように
行なった。

■、コリンエステラーゼ放射分析試験は５ｏｒｅｑ、Ｈ
。

等、同上、１９８４　：　Ｒａｚｏｎ、Ｎ、等、同上、
１９８４　；　２ａｋｕｔ、Ｉｔ、等、Ｊ、Ｎｅ１Ｊｒ
ＯＣｈｅ１．　ＵＳ、　　３８２〜３８９．１９８５に
記載のように行なった。

■、ヒトゲノムＤＮＡライブラリィはシャロン４Ａラム
ダファージにおける抹梢血液ＤＮＡの部分ＩＩ　ａ　ｅ
　−３切断片をクローニングしてつくった（Ｈａｎｉａ
ｔｉｓ等、同上、１９Ｂ２）そしてＥ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２は株ＬＥ３９２　（Ｆ−１ｈｓｄ
　　Ｒ５１４（ｒｉ；ｍ′ｋ）ｓｕｐＦ５８１ａｃ　　
Ｙ、Ｑａｌ　　Ｋ２、Ｑａｌ　　Ｔ２２、ｍｅｔ　　８
１、ｔｒｐ　　Ｒ５５）由来のものであり、標準法によ
り増幅させた（Ｈａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａ
ｎｕａｌ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｔｌａｒ
ｂｏｒ　　ｔａｂ、。

１９８２）。

■、制限酵素による消化は各々の場合、供給者、Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　８ｉｏ１ａｂｓにより推奨された条
件下で行なった。酵素反応は適当な温度で少なくとも２
時間行なった。

■、アガロースゲルによるＤＮＡ断片の電気的溶離、Ｄ
ＮＡのニック翻訳およびファージＤＮＡの調製（大規模
）は記述通り行なった（　５ｏｒｅｑ等、同上、１９８
５）。

Ｘ、サンガージデオキシ技術によるＤＮＡ配列化はＦ、
Ｓａｎｇｅｆ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１４．１２０５〜
１２１０．１９８１の通り行ない、６％０．２ｍ厚アク
リルアミドゲルを使用した（　ｓａｎｇｅｒ等、ＦＥＢ
Ｓ　　Ｌｅｔｔ、８７１１０７〜１１０．１９７８　：
　Ｇｕｒｏｆｆ等、Ａｎａ　Ｉｙｔ、　Ｂ　１ｏｃｈ。

１１５．４５０〜４５７．１９８１）。サンガージデオ
キシ技術に規定されたＤＮＡ配列はＷＩＣＣで入手でき
るＲＵＮＳＥＱプログラム（Ｓｅｇｅ等、Ｎｕｃ、　Ａ
ｃ１ｄ　Ｒｃｓ、　　９．４３７〜４４４．１９８１）
により分析した。

ＸＬ　０ＰＳＹＮオリゴヌクレオチドの合成は記述通り
行なった（　ｐｒｏｄｙ等、同上、１９８６）。

ＸＩＦ、０ＰＳＹＮオリゴヌクレオチドの順、序、合成
およびスクリーニングの戦略。

次の９−マー　オリゴヌクレオチドの混合物は０ＰＳＹ
ＮＷ製物のすべての５′末端に含まれていた。

Ｐｈｅ　　　Ｇ　ｌｙ　　　Ｇｌｕ （Ｍ＝Ａ又はＧ、Ｎ＝Ａ、Ｃ，Ｇ又はＴ）ＡＡＭ　　　
ＣＣＡ　　　ＣＴＣ この混合物を６部分に分け、各々はセリンのコドン（Ａ
ＧＮ又はＴＣＭ）の一つに続いた。これらを再度４つの
混合物に分け、各々に Ａｌａ　　Ｇｌｙ ＣＧＮ　　ＣＣ Ｎ＝Ａ、Ｃ，Ｇ又はＴ を加えた。

ＸＩ［［、合成オリゴヌクレオチドを［３”Ｐ］ＡＴＰ
で末端ラベルするのはＨａｎｉａｔｉｓのハンドブック
（１９８２）とｐｒｏｄｙ等、１９８６に従った。

Ｘ　ＩＶ　、適当な発現系における触媒活性ＣｈＥの製
造に必要かつ十分な全長ＦＣｈＥ　　ＤＮＡの最小長さ
は発現可能な部分的ＣｈＥＣＤＮＡクローンの特定部位
突然変異誘発により規定される。上記したように、ヒト
由来活性（ＡＣｈＥおよび／又は偽−ＣｈＥ活性）を有
するタン白質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現
ベクターはそのようなタン白質の生産に使用できる。こ
の生産はバクテリア、真核細胞又は酵母細胞により行な
うことができる。

本発明はそのようなｉｍを培養して得られる生物活性タ
ン白質を包含する。ヒト由来の触媒活性ＣｈＥが上記Ｆ
ＣｈＥｃＤＮＡ配列により生産されうる適切な系が供さ
れる。これらはバクテリア、酵母又は１乳動物［ｌ胞の
如きホスト系ならび構築物を含み、適当な発現ベクター
および上記ＣｈＥＣＤＮＡ配列の全体又は一部から成る
。

Ｘｖ、真正のヒト由来触媒活性ＣｈＥの大８生産方法は
ＸｒＶのような発現系を使って供され、ＣｈＥをコード
するｃＤＮＡを実施可能なように発現性ＤＮＡと末端−
末端で結合させた構築物でトランスフェクションさせる
。ヒトＡＣｈＥ又はヒト偽−ＣｈＥ活性を有するタン白
質は、有機リン（ＯＰ）化合物による中毒の治療薬とし
て、ＯＰ中毒やサクシニルコリンによるブロッキングに
対する解毒剤として、およびＯＰ化合物又はサクシニル
コリン化合物の効果を中和する有用性を有する組成物の
活性成分として使用できる。このような活性タン白質の
有効通はηの範囲である。この組成物はこのＯＰ化合物
の作用を中和するのに使う別の活性成分を含有してもよ
い。

ＸＶｌ、ＯＰ剤の保護に十分な真のヒト由来活性ＣｈＥ
の最小サイズが供され、分子工学技術により短縮され又
は修飾されたヒトＣｈＥＣＤＮＡからの触媒的に活性な
酵素の合成により規定され、発現ベクター構築物に再挿
入され、かつ適当なホスト系にて発現されて、ＯＰ剤と
有効に反応する生物活性タン白質を生成する。

ＸＶｌ、ＯＰ−結合に活性的に含まれるタン白ドメイン
は表１、■、■に示ず。人工は全長ＦＣｈＥｃＤＮＡ配
列によりコードされるりン白配列を示し、シグナルペプ
チドと上流ペプチドに先行するヒトＣｈＥの完全第一配
列を含む。表■はメチオニンより開始しかつシグナル　
ペプチドのみを含むＣｈＥタン白配列配列し、表■はシ
グナル　ペプチドと先行ペプチドのない、成熟ＣｈＥタ
ン白配列配列す。

（〉 ロ コ ζ ０１ｆｉ　ＩＩＩ　ＩＩＩ　Ｌ　＞Ｌ　Ｌ　ａｌ　（＋
＋Ｌ　　　　　）−−−１！　　　　−１！　　　　　
中　　　−−ＩＩ　　　　　１ロＬ　　ＯＬ　　Ｏコ　
ＯＬ　　０１　０ａＩ　Ｏ：ｌ　　ＯＬ　　０ｌ−ｏｌ
ｌｌ　　■Ｊ：Ｑ−〜Ｊ：　　ｅＫ　　−Ｏｒ　　Ｃ１
ｍ　　００＋　　Ｎｆへの　Ｎｌ−−口　う−つ（Ｌｌ
’＋１　円−寸の　ぐＬ＼フフＣ：ｌ＞Ｃ：＞１ −　　　　ω　　　　ｌｌＩ　　　　　ψ　　　　−−
一一一ロ　　　−　　　　」　　　ζ　　　　ロ　　　
ロ　　　　ロ　　　　ロ　　　　−　　　　　寵１ａｌ
ＬＬ：＋ＣｅＬＬＱＩｆｉ Ｊ：ａＩｍ−＋１ｎｆｆｌＪ：Ｌ）”　瓢ｌψｃ１１口
ζζ←龜− フＩＩＩＬひツー■喝コ＼ １１１−＋４：Ｌ　　　　　四　　　　１０＞　　　　
−伽−工　　　　ｌ＋　　　ζ　　　　Ｊ）Ｊ（ｆＪＰ
ｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｓａｒ　　Ｇｌｕ　　Ｐ
ｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｉ
Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＡＳｎ　Ｔ
ｙｒ　Ａｒｇ　Ｃ１１ｕ　Ａｌａ　Ｌ１５ｗ　　Ｔｙｒ
　　Ａｌａ　　Ｌｓ＝ｕ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｖａｌ　　Ｔｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｌ・Ｐｈｅ　Ｔ
ｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｓｅ
ｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌ＋Ｈｉｓ　ＧＬｙ　Ｔｙｒ　Ｌ
Ｙ！ｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｖ
ａＬ　　Ｔ！Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｅｌｓ　　Ｌｙｓ　
　Ｐｈｅ　　Ｌ、ｙｓ　　Ｔｙｒ　　１１＊　　Ｈｔｓ
　　Ｓｅｒ　　Ｌ）Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓ＠１ｉｅ　Ｅ５ｅｒ　Ａｓｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　ＶａＬ　Ａｓｎ　Ｌｙ
ｅｓ　Ａ９Ｓａｒ　　ＩＩ彎ＬしＬＩ　Ａｌ！Ｐ　　Ｉ
ＩＥ！　　ＩＩｓ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　５ｅｒＬ
６Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　
Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　ＴｒＧｉｎ　Ｐｈｅ
　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｌｙｓ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　’５＠Ｉｓ　ＬＩ？ｕ　Ｐｈｅ　Ｇｉ
ｎ　　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＡＳｐ　　Ｔｒｐ　ＶａＬ　　
Ａｓｐ＝ｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｇ　ｌｌ５４日０ ｙｅｓ　　Ｐｈｅ　５ｅｒ−Ｇｌｕ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌ
ｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　　Ａｈａ　Ｐｈ＋？＝ｕ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｔｒｐ　　Ｐｒｏ　　ＧＺｕ　　Ｔｒｐ　　Ｍｅ
七　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔｒｔ−Ｌｅｕ　　Ｔｒ
ｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　ＩＩｓ　Ｔ
ｈｒ　［３１ｎ１ｓ　Ａｒｑ　Ｔｒｐ　Ａｆａ　Ａｇｎ
　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｙｑ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙｒｒ　Ｔｒ
ｐ　　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　　Ｌｓｕ　Ｌｙｓ　ＡＺａ　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｒ＋　Ｌｙ＊５日Ｏ ｎ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｃｙｓ　　Ｓｇｒ　　Ｔｈｒ　　Ｍｅ七ｕ　Ｇｌ
ｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　＾ｒｇ　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　Ａｓ
ｐ　　Ｇｌｕ　Ａｌａｐ　Ａｓｎ　Ａｇｎ　Ｔｙｒ　Ｍ
ｅｔ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　　Ｔｒ−ｐ　　Ｌｙｓ　Ａｓｎ
ｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　Ｌａｕ４”’−’　　
　　　　Ｌ　　　　　　Ｌ　　　　　　Ｉｌｌ　　　　
　　）　　　　　　Ｉｌｌ　　　　　　コ　　　　　ａ
コ　　　　　ＬＬ−＋Ｌ：ＩＬ　　　　　　ψ　　　　
　　シ、　　　　　＞　　　　　Ｌ４゜ Ｌ２ｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　　ｌｉｅ　　ｌｌｌ１！ｌｉ
ｅ　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌ＋４＝ Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＡＳｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐ
ｈｌ？　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ　Ｐｔ４； Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　　Ｍ＋？ｔ
　ＨｆｇＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌ＞４ζ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　　ｒｌｅ　　１ｉｅＴｈｒ　Ｇｉｎ　
Ａｓｎ　Ｐｒｏ　　ＩＩｓ　Ｌ）Ａｓｎ　　Ｐｈａ　　
Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　＾ｑｎ　　
Ｐｒｏ　　＾ｓｎ　　Ｇｌコ； Ｌ１２ｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｓｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｇ　
ｌ１ｇ５ｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅ５＝ Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　
Ｍｅｔ　　５ｅａｒ　　ＩＩｓ　　Ｌ９ＬＪ　　Ａ９＾
ｒｃ３　ＬｙＳＴｙ’ｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　ＴｒＭｅｎ　Ｍｅｔ　ＡＳｐ　
　Ｔｒｐ　　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　　Ｐｈｅ　Ａｓ
ｎ　　Ａｓ５ｕ Ｓｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４４０＋ｕ　　Ｐｒｏ　
　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　ＬＹＳ　
ＬＹＳ　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕｒｅ　　Ｇｌｕ　
　Ｈ４Ｓ　Ａｒｇ　　’３ｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　
　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｔｒ−ｐ　　Ｐｒ。

’０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　４日０〆ｓ　　Ｌｅｕ
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ｅｕ 手続補正書（自船 昭和６１年１１月１１日

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＣｈＥ活性を有する遺伝子工学的によるタン
   白質。
2. （２）ヒトＡＣｈＥ又はヒト偽−ＣｈＥ活性を有する、
   特許請求の範囲第１項記載のタン白質。
3. （３）少なくとも一つのヒトコリンエステラーゼに特異
   的なポリクローナル抗体とモノクロナール抗体と反応す
   る、特許請求の範囲第１項記載のタン白質。
4. （４）ＣｈＥ活性を有するヒト天然タン白質に相当する
   、特許請求の範囲第１項記載のタン白質。
5. （５）ＡＣｈＥ又は偽−ＣｈＥ活性を有する、特許請求
   の範囲第４項記載のタン白質。
6. （６）ヒトＣｈＥ活性を有するタン白質をコードする配
   列から成る、ＤＮＡ配列。
7. （７）ヒトＡＣｈＥ又は偽−ＣｈＥ活性をもつタン白質
   をコードする、特許請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列
   。
8. （８）ヒト血清偽コリンエステラーゼのＮ−末端、活性
   部位およびＣ−末端ペプチド特性を有する完全タン白質
   をコードする全コード領域を含む、特許請求の範囲第６
   項記載のＤＮＡ配列。
9. （９）配列： 【ＤＮＡ配列があります】 のｃＤＮＡ又はヒトＡＣｈＥあるいは偽−ＣｈＥ活性を
   有するペプチドをコードする配列の一部である、特許請
   求の範囲第６項記載のＤＮＡ。
10. （１０）ヒトＡＣｈＥに対する抗体と反応するＣｈＥ様
    ペプチドをコードするのに使うバクテリアｐＥＸ＿３プ
    ラスミドに結合した配列： 【ＤＮＡ配列があります】 である、特許請求の範囲第９項記載のＤＮＡ。
11. （１１）発現性ＤＮＡ配列に結合しかつ翻訳開始と停止
    シグナルが側面にあるヒトＣｈＥ活性を有するタン白質
    をコードする、特許請求の範囲第６項又は第７項に記載
    のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現ベクター。
12. （１２）ウィルス、バクテリア又は真核細胞起源のドメ
    インから成る、特許請求の範囲第１１項記載のベクター
    。
13. （１３）発現性ＤＮＡ配列はバクテリアｐＥＸ＿３プラ
    スミドである、特許請求の範囲第１１項記載のベクター
    。
14. （１４）特許請求の範囲第６項記載のｃＤＮＡをβ−ガ
    ラクトシダーゼ遺伝子の３′−末端に実施可能のように
    結合している、特許請求の範囲第１１項記載のベクター
    。
15. （１５）ヒトコリンエステラーゼタン白質をコードする
    ヌクレオチド配列を含有する、シヤロン４Ａファージに
    クローンさせたヒトコリンエステラーゼ遺伝子の断片。
16. （１６）特許請求の範囲第６項から第１０項のいずれか
    １項に記載のＤＮＡとハイブリドする、特許請求の範囲
    第１５項記載の断片。
17. （１７）生細胞の外側に連結し、培養可能な細胞を感染
    しかつそこに維持させる能力を有し、その産物は特許請
    求の範囲第６項から第１６項のいずれか１項に記載のＤ
    ＮＡ配列を含む、組み換え体ＤＮＡ分子。
18. （１８）ヒトＣｈＥ活性を有するタン白質を産生する、
    特許請求の範囲第１７項記載の組み換え体ＤＮＡ分子で
    感染させた培養可能な背椎、バクテリア又は酵母細胞。
19. （１９）特許請求の範囲第１８項記載の細胞を培養しそ
    してその精製タン白質を回収して得た、ヒトＣｈＥ活性
    を有するタン白質。
20. （２０）ヒトＣｈＥ活性を有するタン白質の製造法。
21. （２１）ヒトＡＣｈＥおよび偽−ＣｈＥと特異的に反応
    する抗体の製造法において、実験動物に特許請求の範囲
    第３項記載の精製タン白質を注入し、ついで生成抗体を
    回収することを特徴とする、上記方法。
22. （２２）組織抽出液又は体液と特許請求の範囲第２１項
    記載の抗体とを反応させ、そしてその結果を評価する、
    病気又は先天性シンドロームにより変るコリンエステラ
    ーゼタン白質の患者中の有無を検出する試験。
23. （２３）患者に異常なコリンエステラーゼ産生遺伝子の
    有無を測定する試験であつて、 ａ、患者の細胞からＤＮＡを抽出する、 ｂ、ＤＮＡの酵素的制限を行なう、 ｃ、ＤＮＡの断片を電気泳動的に分離しそしてその断片
    を適当な担体にプロットし、 ｄ、所定の配列のラベル化ＤＮＡプローブを供し、 ｅ、ｃ、の断片をｄ、のプローブでハイブリドし、ｆ、
    そのハイブリドパターンにより異常遺伝子の有無を測定
    する、 上記試験。
24. （２４）活性成分として、特許請求の範囲第１項から第
    ５項のいずれか１項に記載の偽−ＣｈＥ又はＡＣｈＥ活
    性を有するタン白質を含有する、予防薬として又はＯＰ
    解毒薬として又はＯＰ拮抗薬として又はサクシニルコリ
    ン効果として使用する組成物。