【発明の詳細な説明】
CAI耐性タンパク質をコードするDNAおよびその使用
発明の分野
本発明は、カルボキシアミド−トリアゾール(CAI)および機能的に同等の化合
物に対する細胞の耐性を付与するタンパク質をコードするCAI耐性（CAIR）遺伝
子の単離に関する。本発明は、さらに、CAI耐性遺伝子によりコードされるCAIR
タンパク質、前記タンパク質に対して特異的な抗体、および前記遺伝子に特異的
にハイブリダイズする核酸プローブに関する。さらに、本発明は、細胞における
CAI耐性を決定するアッセイ、およびCAI耐性を除去する組成物についてスクリー
ニングするアッセイを提供する。本発明は、また、CAIR遺伝子を発現し、そして
CAIおよび機能的に同等の化合物に対して長期暴露した培養物中で成長しかつ増
殖することができる細胞系を提供する。
発明の背景
カルシウムのホメオスタシスは、シグナリング事象ならびに他の細胞および分
子の機能の調節において際立っているので、細胞の挙動の調節において重要であ
る（ColeおよびKohn、Cancer and Metastasis Rev.（1993）。カルボキシアミド
−トリアゾール(CAI)は、電圧ゲートおよび非電圧ゲートカルシウム流入による
刺激されたカルシウムの流入のインヒビターである。それはアラキドン酸の解放
、ホスホリパーゼＡ２のリン酸化および活性化に応答したイノシトールトリホス
フェートの生産、およびレセプターの活性化に応答したチロシンのリン酸化を包
含する重要な下流のシグナリング事象を
阻害することが示された（Feldr、et al.、J．Pharm．Exp．Therap．257：967-9
71(1991)；Gusovsky、et al.、J．Blo．Chem．268：7768-7772(1993)）。これら
のシグナリング経路は、増殖および他の細胞の事象、例えば、プロテアーゼの付
着、移動、および生産を調節する（Kohn、et al.、Cancer Res.(1994)印刷中、K
ohn、et al.、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、cmmunicated；KohnおよびLiotta、
J．Nat．Cancer Inst.、82：54-60(1990)）。
カルボキシアミド−トリアゾール(CAI)は、癌細胞の悪性増殖、侵入、および
転移を阻止することが観察され、CAIおよび関係する化合物の潜在的癌治療薬と
して役割を示唆する（同時継続出願USSN07／985,402参照）。腫瘍細胞が暴露さ
れる特定の薬理学的養生法に対する腫瘍細胞の耐性の発生は、癌治療薬の開発お
よび利用において重要である。
このような耐性が出現する場合、このような耐性の出現を除去または阻止する
治療を案出するために、この耐性を確認することが望ましい。耐性が遺伝子の発
現の変更に関連するとき、耐性の出現に関連するタンパク質をコードする遺伝子
の単離は薬物耐性のメカニズムの解明を促進するばかりでなく、かつまた耐性の
獲得を検出する有用なマーカーならびに関与に有用な標的を提供する。本発明は
、その発現がCAI耐性に関係づけられる単離されたCAI耐性（CAIR）遺伝子を提供
する。本発明は、また、この遺伝子によりコードされるタンパク質を提供する。
この遺伝子およびタンパク質の単離は、前述および他の利点を提供する。
発明の要約
本発明は、ヒトカルボキシアミド−トリアゾール耐性（CAIR）タンパク質をコ
ードする単離されたヒト核酸を提供し、ここで前記核
酸はヒトゲノムライブラリーの存在においてストリンジェント条件下に配列番号
：１の核酸配列から成る第２核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることが
できる。詳しくは、この核酸は配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなる。
さらに詳しくは、単離された核酸は、細胞系の中に見出されるとき、それがコー
ドするタンパク質を発現し、前記発現は、CAIを含まない同一培養条件下に細胞
系を培養するときより、少なくとも10μＭの濃度のCAIの存在下に細胞系を培養
するとき、より高いレベルである。
本発明は、また、CAIRタンパク質をコードする単離されたヒト核酸配列を提供
し、ここで核酸配列は配列番号：１の核酸と少なくとも85％、特に少なくとも95
％の配列の同一性を有する。単離されたヒト核酸配列は、細胞系の中に見出され
るとき、それがコードするタンパク質を発現し、前記発現は、CAIを含まない同
一培養条件下に細胞系を培養するときより、少なくとも10μＭの濃度のCAIの存
在下に細胞系を培養するとき、より高いレベルにおいてである。
本発明はさらに、配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも80％、特に少なく
とも95％のアミノ酸の同一性を有するCAIRタンパク質をコードする単離されたヒ
ト核酸を提供する。この単離されたヒト核酸は、細胞系の中に見出されるとき、
それがコードするタンパク質を発現し、前記発現は、CAIを含まない同一培養条
件下に細胞系を培養するときより、少なくとも10μＭの濃度のCAIの存在下に細
胞系を培養するとき、より高いレベルにおいてである。
他の態様において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも80％
、特に95％の配列の同一性を有する単離されたCAIRタンパク質を提供する。この
単離されたCAIRタンパク質は、細胞系において発現されるとき、CAIを含まない
同一培養条件下に細胞系を培養するときより、少なくとも10μＭの濃度のCAIの
存在下に細胞
系を培養するとき、より高いレベルで発現される。
本発明は、配列番号：２で描写されるアミノ酸配列から成る免疫原に対して発
生した抗体に特異的に結合する単離されたCAIRタンパク質を提供する。さらに詳
しくは、タンパク質のカルボキシル末端は配列番号：２のポリペプチドから成る
。さらに、タンパク質は組換え的に生産することができる。このタンパク質は、
CAIを含まない同一培養条件下に培養された細胞系におけるより、少なくとも10
μＭのCAIの存在下に培養された細胞系において、より高いレベルで発現される
。
なお他の態様において、本発明は、配列番号：２で描写されるアミノ酸配列か
ら成る免疫原に対して発生した抗体に特異的に結合するCAIR耐性タンパク質をコ
ードする単離された核酸を提供する。さらに詳しくは、この核酸は配列番号：１
のヌクレオチド配列を含んでなる。
さらに他の実施態様において、本発明は、１μＭ〜45μＭの濃度の範囲のCAI
、特に20μＭ〜45μＭの濃度の範囲のCAI、なお特に40μＭ〜45μＭの濃度の範
囲のCAIの存在下に培養したとき成長しかつ増殖することができる細胞を提供す
る。なお特に、これらの細胞はＡ2058−20Ｒ細胞またはOVCAR３−Ｒ細胞である
。
本発明は、さらに、生物学的試料のCAIに対する耐性を決定する方法を提供し
、この方法は、ａ）CAI耐性タンパク質に特異的に結合できる結合因子を生物学
的試料と接触させ、ｂ）結合因子を生物学的試料とインキュベートして結合因子
：CAIRタンパク質複合体を形成し、そしてｃ）複合体を検出する工程、を含んで
なる。さらに詳しくは、結合因子はCAI耐性タンパク質と特異的に免疫反応性で
ある抗体である。なおさらに詳しくは、検出工程はａ）複合体を結合因子と特異
的に結合する標識化抗体と接触させ、そしてｂ）標識
化抗体を検出する、ことを含んでなる。
他の態様において、本発明は、生物学的試料のCAIの耐性を決定する方法を提
供し、ここでこの方法は、ａ）CAI耐性タンパク質をコードするヌクレオチド配
列に特異的に結合できる結合因子を生物学的試料と接触させ、ｂ）結合因子を生
物学的試料とインキュベートして結合因子：核酸複合体を形成し、そしてｃ）複
合体を検出する工程、を含んでなる。さらに詳しくは、結合因子はストリンジェ
ント条件下にCAI耐性タンパク質をコードする第２核酸配列に特異的にハイブリ
ダイゼーションする核酸である。なおさらに詳しくは、核酸は配列番号：１のDN
A配列に特異的にハイブリダイゼーションする。なおいっそう詳しくは、検出工
程は標識化核酸を検出することからなる。
本発明はCAIに対する耐性を決定するキットを提供し、ここでキットはCAIRタ
ンパク質に特異的に結合することができる結合因子を含有する容器を含んでなる
。さらに詳しくは、キット結合因子はCAIRタンパク質に特異的に結合する抗体で
ある。なおいっそう詳しくは、キットは抗体を検出する手段を含有する容器をさ
らに含む。
他の態様において、本発明は生物学的試料のCAIに対する耐性を決定するキッ
トを提供し、ここでキットはCAI耐性タンパク質をコードする核酸配列に特異的
に結合することができる結合因子を含有する容器を含んでなる。さらに詳しくは
、結合因子はストリンジェント条件下に前記核酸配列に特異的にハイブリダイゼ
ーションする第２核酸である。
本発明は、また、CAI耐性除去活性について化合物をアッセイするキットを提
供し、ここでキットはCAI耐性細胞を含有する容器を含んでなる。さらに詳しく
は、CAI耐性細胞はＡ2058−20ＲまたはOVCAR３−Ｒである。
本発明は、CAIRタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。さらに詳しく
は、これらの抗体は配列番号：２で描写されるアミノ酸配列から成る免疫原に対
して発生される。
他の態様において、本発明は、CAIRタンパク質をコードするヌクレオチドに結
合する結合因子を含んでなるCAI耐性を減少する医薬組成物を提供する。さらに
詳しくは、結合因子はCAIRタンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイ
ブリダイゼーションするアンチセンス分子である。なおさらに詳しくは、CAIRタ
ンパク質をコードするヌクレオチドは配列番号：１である。
図面の簡単な説明
第１図は、CAIR遺伝子のアップレギュレーション(up-regulation)を示すノザ
ン分析を示す。上左のゲルは、親Ａ2058細胞に対するＡ2058−20Ｒ CAI耐性細胞
のサブトラクティブ(subtractive)ハイブリダイゼーションから得られたプロー
ブにハイブリダイゼーションした親Ａ2058細胞からの合計のRNAのノザンブロッ
トを示す。cDNAライブラリーをＡ2058−20Ｒ細胞からつくり、サブトラクトした
（subtracted）プローブでスクリーニングした。選択したクローンは、ノザンブ
ロットに対してハイブリダイゼーションしたとき、CAIに対する長期暴露に応答
して遺伝子の発現の変更を同定した。21DBB(CAIR−１)、15CBB(CAIR−３)および
13BAA(CAIR−２)と標識するゲルは、CAI暴露に応答した発現の増加を示すクロー
ンを表す。CAIR−１の転写されたメッセージは約2.8kbであるが、CAIR３およびC
AIR−２についてのメッセージは、それぞれ、約4.5kbおよび4.2kbである。すべ
ての場合において、ブロットをストリップし、次いでハウスキーピング遺伝子と
して放射性標識化GAPDHと再ハイブリダイゼーションして異なる負荷について補
正した（より低いゲ
ル）。
好ましい態様の説明
定義
20の天然に存在するアミノ酸についての略号は普通の使用に従う。本明細書お
いて使用するポリペプチドの表示法において、標準の使用および約束に従い、左
側の方向はアミノ末端の方向であり、そして右側の方向はカルボキシ末端の方向
である。
用語「CAI耐性」は、本明細書おいて使用するとき、10μＭまたはそれより高
い濃度においてカルボキシアミド−トリアゾール(CAI)および機能的に同等の組
成物の存在下に成長しかつ増殖する細胞の能力を言及する。機能的に同等の組成
物は、カルシウムの流入の阻害においてCAIと同一であるか、またはそれに類似
する方法で作用する組成物である。機能的に同等の組成物の比活性レベルは異な
ることがあるが、それらは同一の生物学的作用を生成する。これらはカルシウム
の流入の阻害を誘導し、結局細胞の増殖速度の減少を誘導する。機能的に同等の
組成物の例は、抗真菌性イミダゾール、例えば、ケトコナゾール、ミコナゾール
、フルコナゾール、エコナゾールおよびイトラコナゾール、Merritt、et al.、B
iochem．J.、271：515-522(1990)に記載されている化合物およびその類似体であ
る。これらの類似体は、米国特許第5,359,078号に記載されており、下記式の化
合物を包含する：
式中、Ar21およびAr22は同一であるか、または異なっていてもよく、フェニル、
ナフチル、またはそれらの置換類似体であり、ＸはＯ、Ｓ、SO、CO、CHCN、直鎖
状アルキル、アルコキシおよびアルコキ
シアルキルであり、Ｚはイミダゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，３
−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、ピラジニル、プリニル、ピリミジ
ニル、１，２，３−トリアゾロー｛４，５−ｄ｝−ピリミジニル、またはそれら
の置換類似体であり、そしてｐは０〜４の整数である。
「CAI耐性タンパク質」または「CAIRタンパク質」は、その発現がCAI耐性を表
示する、すなわち、CAIおよび機能的に同等の組成物の存在下に成長しかつ増殖
する、細胞の能力と相関するタンパク質を意味する。本発明のCAIR−１耐性タン
パク質は、少なくとも１つのプロリンに富んだドメイン、Src相同性３（SH３）
結合ドメインのコンセンサス配列に対して相同性の新規なドメインにより特徴づ
けられる。SH３結合タンパク質ドメインのコンセンサス配列はXPXXPPPψXPであ
り、ここで位置２、７および10は必須Ｐ（プロリン）であり、Ｘは任意のアミノ
酸であり、そしてψは疎水性アミノ酸である。本発明のCAIRタンパク質は、細胞
がCAIに暴露されるとき、アップレギュレート(up-regulate)され、そしてこのア
ップレギュレーションはCAI耐性の特徴を示しかつCAI耐性と相関する。
用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまた
はリボヌクレオチドのポリマーを意味し、そして特記しない限り、天然に存在す
るヌクレオチドに類似する方法で機能することができる天然のヌクレオチドの既
知の類似体を包含するであろう。
用語「コードする核酸」または「コードする核酸配列」は、特定のタンパク質
またはペプチドの発現を指令する核酸を意味する。核酸配列は、RNAに転写され
るDNA鎖配列およびタンパク質に翻訳されるRNA配列の双方を包含する。核酸配列
は全長の核酸配列ならびに全長の配列から誘導される短い配列の双方を包含する
。特定の核
酸配列は、特定の宿主細胞においてコドンの採択を提供するために導入すること
ができる天然の１または２以上の配列の縮重コドンを包含することが理解される
であろう。核酸は個々の一本鎖または二本鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖の
双方を包含する。
用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイジング」は、相補的塩基対
を介する２つの一本鎖核酸の結合を意味する。
用語「に特異的にハイブリダイズする」は、特定のヌクレオチド配列が全体の
細胞のDNAまたはRNAの調製において存在するとき、ストリンジェント条件下にそ
のヌクレオチド配列のみに対するある分子の結合、二本鎖化、またはハイブリダ
イゼーションを意味する。
用語「ストリンジェント条件」は、あるプローブがその標的サブ配列にハイブ
リダイズするが、他の配列にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジ
ェント条件は配列依存的であり、そして異なる環境において異なるであろう。よ
り長い配列はより高い温度において特異的にハイブリダイズする。一般に、スト
リンジェント条件は、定められたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱
的融点（Tm）より約５℃低いように選択される。Tmは標的配列の50％が相補的プ
ローブにハイブリダイズする温度（定められたイオン強度およびpHにおける）で
ある。典型的には、ストリンジェント条件は塩濃度がpH7.0〜7.5において少なく
とも約0.1〜1.0ＮのNaイオン濃度であり、そして温度が長い配列（例えば、約50
ヌクレオチドより大きい）について少なくとも約60℃でありそして短い配列（例
えば、10〜50ヌクレオチド）について約42℃であるような条件である。
用語「単離された」または「実質的に純粋な」は、CAIRタンパク質またはその
断片をコードする核酸配列について言及するとき、CA
IRタンパク質またはペプチド以外のタンパク質またはペプチドをコードしない単
離された核酸を言及する。
用語「単離された」または「実質的に精製された」または「単離された」は、
CAIRタンパク質について言及するとき、他の細胞成分本質的に含有しない化学組
成物を言及する。それは好ましくは均質な状態であるが、乾燥しているか、また
は水溶液であることができる。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術
、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィ
ーを使用して決定される。調製物の中に存在する優勢な種であるタンパク質は実
質的に精製される。一般に、実質的に精製されたまたは単離されたタンパク質は
、調製物の中に存在するすべての高分子量の種の80％より大を構成するであろう
。好ましくは、タンパク質は存在するすべての高分子量の種の90％より大を表す
ように精製される。より好ましくはタンパク質は95％より大きく精製され、そし
て最も好ましくはタンパク質は本質的に均質性に精製され、ここで他の高分子量
の種は慣用技術により検出されない。
用語「抗体に特異的に結合する」または「と特異的に免疫反応性」は、タンパ
ク質またはペプチドについて言及するとき、タンパク質および他の生物学的物質
の異種集団の存在下のタンパク質の存在を決定する結合反応を言及する。こうし
て、表示されたイムノアッセイ条件下に、特定の抗体は特定のタンパク質に結合
し、そして試料の中に存在する他のタンパク質に有意な量において結合しない。
このような条件下の抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異
性について選択された抗体を必要とする。例えば、CAIRタンパク質と特異的に免
疫反応性であるが、他のタンパク質と免疫反応性ではない抗体を得るために、配
列番号：２に描写されるアミノ酸配列をもつCAIタンパク質断片に対して発生さ
せた抗体を選
択することができる。これらの抗体はCAIRタンパク質に対して相同性のタンパク
質を認識する。相同タンパク質はCAIRタンパク質のファミリーを包含するが、CA
Iに対する暴露に応答してアップレギュレートされない他のシグナルトランスダ
クションタンパク質を包含しない。種々のイムノアッセイのフォーマットを使用
して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択することができ
る。例えば、あるタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために、固
相ELISAイムノアッセイが日常的に使用される。特定の免疫反応性を決定するた
めに使用できるイムノアッセイのフォーマットおよび条件の説明は、下記の文献
を参照のこと：HarlowおよびLane（1988）Antibodies，A Laboratory Manual、C
old Spring Harbor Publications、New York。
用語「結合因子：CAIRタンパク質複合体」は、本明細書おいて使用するとき、
CAIRタンパク質への結合因子の特異的結合により形成された結合因子とCAIRタン
パク質との複合体を意味する。結合因子の特異的結合は、結合因子がCAIRタンパ
ク質上のある部位を認識する特異的結合部位を有することを意味する。例えば、
CAIRタンパク質に対して発生しかつCAIRタンパク質上のエピトープを認識する抗
体は、特異的結合により結合因子：CAIRタンパク質複合体を形成することができ
る。典型的には、結合因子：CAIRタンパク質の形成は他のタンパク質および生物
学的物質の混合物中のCAIRタンパク質の測定を可能とする。用語「抗体：CAIRタ
ンパク質複合体」は、結合因子が抗体である結合因子：CAIRタンパク質複合体を
意味する。
用語「結合因子：核酸複合体」は、本明細書おいて使用するとき、核酸への結
合因子の特異的結合により形成された結合因子と核酸との複合体を意味する。結
合因子の特異的結合は、結合因子がCAIRタンパク質上のある部位を認識する特異
的結合部位を有することを
意味する。例えば、CAIRタンパク質をコードする核酸配列のある領域に対して相
補的である核酸プローブはプローブ：CAI核酸複合体を形成することができる。
用語「生物学的試料」は、本明細書おいて使用するとき、生きている生物また
は死亡した生物から得られた任意の試料を意味する。生物学的試料の例は、患者
から採った体液、組織の検体、および組織の培養物である。
用語「組換えDNA」または「組換え的に生産されたDNA」は、その天然または内
因的源から単離され、そして天然に存在するフランキングヌクレオチドを欠失す
るか、または天然に存在しないフランキングヌクレオチドを提供するように化学
的または酵素的に修飾されたDNAを意味する。フランキングヌクレオチドは、ヌ
クレオチドの記載した配列またはサブ配列から上流または下流に存在するヌクレ
オチドである。
用語「組換えタンパク質」または「組換え的に生産されたタンパク質」は、タ
ンパク質を発現できるDNAの内因性コピーをもたない非天然の細胞を使用して生
産されたペプチドまたはタンパク質を意味する。細胞は適当な核酸配列の導入に
より遺伝的に変更されているので、タンパク質を生産する。組換えタンパク質は
タンパク質とアソシエートして見出されず、そして他の細胞下成分はタンパク質
を生産する細胞と通常アソシエートしている。
２種またはそれ以上の核酸の間の配列の関係を記載するために下記の用語を使
用する：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列の同一性」および「配列の
同一性の百分率」。
「参照配列」は、配列の比較のための基準として使用する規定された配列であ
る；参照配列はより大きい配列のサブセット、例えば、配列のリストに記載され
ている全長のcDNAまたは遺伝子配列のセ
グメント、例えば、配列番号：１の核酸配列であることができるか、または完全
なcDNAまたは遺伝子配列を含んでなることができる。
「配列の同一性の百分率」は、比較ウィンドウまたはスパンにわたって２つの
最適に整列された配列またはサブ配列を比較することによって決定され、ここで
比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列に
ついて参照配列（付加または欠失を含まない）に比較して、付加または欠失（す
なわち、ギャップ）を含むことができる。百分率は、同一サプユニット（例えば
、核酸塩基またはアミノ酸残基）が双方の配列の中に存在する位置の数を決定し
て合致した位置の数を生成し、合致した位置の数を比較のウィンドウの中の位置
の合計数で割り、そして結果に100を掛けて配列の同一性の百分率を得ることに
よって計算される。配列の同一性の百分率は、プログラムGAPまたはBESTFIT（下
記を参照）を使用して計算したとき、デフォールト・ギャップ・ウェイト(defau
lt gap weights)を使用して計算される。
配列の同一性の百分率はタンパク質またはペプチドに対する言及において使用
するとき、同一でない残基位置は同類ミノ酸置換により異なることがあることが
認識され、同類ミノ酸置換においてアミノ酸残基は同様な化学的性質（例えば、
電荷または疎水性）をもつ他のアミノ酸残基で置換され、したがって分子の機能
的性質を変化しない。同類置換において配列が異なる場合、配列の同一性の百分
率は置換の保存的特質について補正するために上方に調節することができる。こ
の調節を行う手段は当業者によく知られている。典型的には、これは完全なミス
マッチよりむしろ部分的ミスマッチとして同類置換にスコアをつけ、これにより
配列の同一性の百分率を増加することを含む。したがって、例えば、同一のアミ
ノ酸に１のスコアを与えかつ非同類置換にゼロのスコアを与える場合、同類置換
はゼロと１との間のスコアが与えられる。同類置換のスコアは、プログラムPC／
GENE（Intelligenetics、米国カリフォルニア州マウテンビュー）において実行
されているように、MeyersおよびMiller、Computer Applic．Biol．Sci．、４：
11-17(1988)のアルゴリズムに従い計算される。下記の６つのグループの各々は
、互いにについて同類置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
「比較ウィンドウ」は、本明細書おいて使用するとき、少なくとも約20、通常
約50〜約200、より通常約100〜約150の隣接位置のセグメントを意味し、ここに
おいてある配列を同一数の隣接位置の参照配列に対して、２つの配列を最適に整
列させた後、比較することができる。
比較のための配列の整列方法はこの分野においてよく知られている。比較のた
めの配列の整列は、SmithおよびWaterman、Adv．Appl．Math．2：482(1981)（こ
れは引用することによって本明細書の一部とされる）の局所的相同アルゴリズム
、NeedlemanおよびWunsch、J．Mol．Biol．48：443(1970)（これは引用すること
によって本明細書の一部とされる］の相同整列アルゴリズム、PearsonおよびLip
man、Proc．Natl．Acad．Scl．USA 85：2444(1988)（これは引用することによっ
て本明細書の一部とされる）の類似性の方法の
サーチ、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（下記のものを包
含するが、これらに限定されない：CLUSTAL in the PC／Gene program by Intel
ligenetics、カリフォルニア州マウテンビュー、GAP、BESTFIT、FASTA、およびT
FASTA in the Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Grou
p（GCG）、575 Science Dr．、米国ウイスコンシン州マジソン）、または検査に
より実施することができる。特に、CLUSTALプログラムを使用する整列方法は、
下記の文献によく記載されている：HigginsおよびSharp、Gene、73:237-244(198
8)およびCABIOS 5：151-153(1989)（それらの双方は引用することによって本明
細書の一部とされる）。
詳細な説明
本発明は、カルボキシアミド−トリアゾール(CAI)および機能的に同等の組成
物に対する細胞の耐性と相関する単離されたタンパク質、およびこれらのタンパ
ク質をコードする単離された核酸を提供する。これらの単離された核酸およびタ
ンパク質組成物は多数の用途において使用することができる。例えば、タンパク
質および核酸の双方は、CAI化学療法を行う腫瘍細胞によるCAIに対する耐性の獲
得を示すマーカーとして使用することができる。核酸配列は、また、ベクターに
おいて他の核酸配列にそれを結合し、そして細胞系を形質転換することによって
選択可能なマーカーとして使用することができる。形質転換された細胞は、それ
らをCAIに暴露し、生存する細胞を選択することによって、選択することができ
る。
さらに、少なくとも１つのCAIRタンパク質であるCAIR−１は、種々のタンパク
質上のSH３ドメインと相互作用するSer相同性３（SH３）結合ドメインを含有し
、そして種々の細胞内シグナリング経路
または細胞骨格要素を調節または不活性化するために使用することができる。こ
うして、SH３結合ドメインを有するタンパク質または断片は、カルシウムのシグ
ナリングの問題により特徴づけられる疾患の状態のための治療薬として使用する
ことができる。さらに、SH３結合ドメインを有するタンパク質または断片は、SH
３ドメインを有する他のタンパク質についてアッセイしかつそれらを同定し、こ
れによりシグナリング経路における新しい要素を同定するために使用することが
できる。
本発明は、また、CAIRタンパク質に対して特異的な抗体を提供する。これらの
抗体を使用してタンパク質を不活性化し、これによりCAI耐性を除去することが
できる。さらに、SH３結合ドメインに結合する抗体を使用してSH３を有するタン
パク質と競合させるために使用することができ、こうして種々のシグナリング経
路または種々の細胞骨格要素の作用を調節または阻害するために使用することが
できる。
本発明は、さらに、CAI耐性を表示する細胞系を提供する。これらの細胞系は
、CAI耐性を減少または排除することができる化合物についてスクリーニングす
るアッセイとして使用することができる。それらは、また、CAIまたは類似のカ
ルシウム調節インヒビターを含む混合薬物養生法の有効性を評価するためのモデ
ル系として使用することができる。Ａ．
CAIR遺伝子の発現の誘導
CAIおよび機能的に同等の組成物と対抗させるとき成長しかつ増殖する細胞に
おいて、CAIR遺伝子はアップレギュレートされる。これらの化合物は、抗真菌性
イミダゾール、例えば、ケトコナゾール、ミコナゾール、フルコナゾール、エコ
ナゾールおよびイトラコナゾール、Merritt、et al.、Biochem．J．、271：515-
522(1990)
に記載されている化合物およびその類似体を包含する。
CAIR遺伝子は、細胞を増加する濃度のCAIおよぴその機能的同等物の存在下に
培養することによって、同定することができる。成長しかつ増殖する細胞を選択
し、それらのRNAを単離し、そしてサブトラックション(subtraction)ハイブリダ
イゼーションを非対抗親細胞系に対して実施する。サブトラクティブハイブリダ
イゼーションはプローブを生じ、このプローブを標識化することができ、次いで
CAIまたはその機能的同等物の存在下に遺伝子の増加した発現を示すクローンに
ついてcDNAライブラリーをプロービングするために使用する。Ｂ．
CAIRタンパク質
CAI耐性（CAIR）タンパク質を細胞のCAI耐性に関係づける。これらのタンパク
質のこれらの発現は、典型的には、CAIまたは機能的に同等の化合物を使用する
対抗に対して生き残る細胞においてアップレギュレートされる。
１つのこのようなタンパク質（CAIR−１）のカルボキシル末端は配列番号：２
に示されている。このタンパク質は多数の相同性３ドメイン（SH３）結合タンパ
ク質のドメインを含有する。SH３ドメインは非常に大きいグループのタンパク質
、例えば、細胞骨格要素および細胞内シグナリングタンパク質の間に保存される
（Ren、et al.、Science 259：1157-1161(1993)）。これらのドメインはタンパ
ク質−タンパク質の会合の仲介に関係し、そして細胞質のシグナリング（同上）
を調節するように思われる。
したがって、SH３結合ドメインを含んでなる本発明のCAIR−１タンパク質また
はそれらの断片は、種々の細胞内シグナリング経路の阻害または調節において使
用することができる。これは異常な細胞内シグナリングにより特徴づけられる種
々の疾患、例えば、癌、過
増殖状態、膠原血管分布（例えば、狼瘡および慢性関節リウマチ）の補正、ネフ
ロパシー、神経疾患（際えば、ALF、アルツハイマー病）、およびミオパシー（
例えば、心筋症、骨格筋症）の治療のモードを提供する。
CAIRタンパク質中のSH３結合ドメインを同定する手段は当業者によく知られて
いる。タンパク質配列が既知である場合、SH３結合ドメインについてのコンセン
サス定義を満足する配列を有するタンパク質の領域(XPXXPPPψXP、ここで位置２
、７および10は必須Ｐ（プロリン）であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、そして
ψは疎水性アミノ酸である）は、配列分析のプログラム、例えば、FASTAまたはB
ESTFITを使用する検査により容易に同定することができる。
SH３結合ドメインは、また、CAIRタンパク質および既知のSH３挿入を有するタ
ンパク質、例えば、Ab１、Fyn、Lckおよびホスファチジルイノシトール３’キナ
ーゼのｐ85αサブユニットの間の実際の結合についてアッセイすることによって
同定することができる。タンパク質結合アッセイは当業者によく知られている。
好ましい実施態様において、アッセイはGST−CAIR−１融合タンパク質をつくり
、このタンパク質をグルタチオン−セファローズビーズ上に固定化し、固定化さ
れたタンパク質をスクリーニングタンパク質（例えば、Ab１、Fyn、Lckおよびｐ
85）に暴露し、次いでスクリーニングタンパク質の結合についてアッセイするこ
とによって実施することができる。結合はSH３タンパク質に対して特異的な標識
化モノクローナル抗体を使用して容易にアッセイすることができる。これらは商
業的に入手可能である。このアッセイの例は実施例５に記載されている。
本発明のCAIRタンパク質は、また、種々のアミノ酸置換を含有するが、未修飾
タンパク質と本質的に同一のコンフォメーションおよ
び活性を保持するタンパク質を包含する。したがって、CAIR−１タンパク質（そ
のカルボキシル末端の配列は配列番号：２に記載されている）は、また、記載し
た配列における同類ミノ酸置換を反映するタンパク質を包含する。これらの関係
するタンパク質は、配列番号：２のCAIR−１タンパク質とのそれらの配列の同一
性により決定することができる。本発明のCAIRタンパク質は、参照CAIRタンパク
質（を除外して配列番号：２）に比較して少なくとも80％の配列の同一性、好ま
しくは少なくとも90％の配列の同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列の
同一性を有する。
また、関係するCAIRタンパク質は、本発明のCAIR−１タンパク質によりコード
される限定した免疫原に対して発生した抗体とのそれらの交差反応性により決定
することができる。限定した免疫原、例えば、配列識別No.２のアミノ酸配列か
ら成る免疫原に対して発生した抗体に特異的に結合するか、または特異的に免疫
反応性であるCAIRタンパク質は、イムノアッセイにおいて決定される。このイム
ノアッセイは、配列識別No.２に対して発生させたポリクローナル抗血清を使用
する。この抗血清は他の非CAIRタンパク質に対して低い交差反応性を有するよう
に選択され、そして任意のこのような交差反応性はイムノアッセイにおいて使用
する前に免疫吸収により除去される。
イムノアッセイにおいて使用するための抗血清を生産するために、配列番号：
２のタンパク質を本明細書おいて記載するように単離される（例えば、組換えタ
ンパク質は哺乳動物細胞系において生産される）。次いで、哺乳動物（例えば、
マウスの同系交配系、例えば、balb／ｃ）を、標準的アジュバント、例えば、フ
ロインドアジュバント、および標準的免疫化プロトコールを使用して配列番号：
２のタンパク質で免疫化する（参照、HarlowおよびLane、前掲）。
また、本明細書において開示する配列から誘導された合成ペプチドを免疫原とし
て使用することができる。例えば、配列番号：２のペプチドを使用できる。ポリ
クローナル血清を集め、そしてイムノアッセイ、例えば、固体支持体上に固定化
された免疫原を使用する固相イムノアッセイにおいて免疫原タンパク質に対して
力価決定する。104またはそれより大きい力価を有するポリクローナル抗血清を
選択し、そして競合結合イムノアッセイ、例えば、HarlowおよびLane、前掲、pp
．570-573に記載されているイムノアッセイを使用して、非CAIRタンパク質に対
するそれらの交差反応性について試験する。
競合結合方式におけるイムノアッセイを交差反応性の決定のために使用するこ
とができる。例えば、配列番号：２のタンパク質を固体支持体に固定化すること
ができる。アッセイに添加されたタンパク質は固定化された抗原への抗血清の結
合と競合することができる。固定化された抗原への抗血清の結合と競合する上記
タンパク質の能力を配列番号：２のタンパク質を比較する。上記タンパク質につ
いての交差反応性の百分率を、標準的計算を使用して、計算する。上に列挙した
タンパク質の各々と10％より低い交差反応性を有する抗血清を選択し、プールす
る。次いで、交差反応する抗体を、上に列挙したタンパク質との免疫吸収により
、プールした抗血清から除去する。
次いで、免疫吸収しそしてプールした抗血清を前述の競合結合イムノアッセイ
において使用して、免疫原タンパク質（配列番号：２のCAIRタンパク質）に対し
て第２タンパク質を比較する。この比較を行うために、２つのタンパク質の各々
を広い範囲の濃度においてアッセイし、そして免疫化タンパク質への抗血清の結
合の50％を阻害するために要求される各タンパク質の量を決定する。要求される
第２タンパク質の量が要求される配列番号：２のタンパク質の量の10倍より低い
場合、第２タンパク質は配列番号：２のタンパク質から成る免疫原に対して発生
した抗体に特異的に結合すると言う。
CAIRタンパク質は関係するタンパク質のファミリーを意味することが理解され
るであろう。特定の遺伝子産物、例えば、CAIR−１タンパク質について、この用
語は本明細書において開示するアミノ酸配列ばかりでなく、かつまた対立遺伝子
、非対立遺伝子または種の変異型である他のタンパク質を意味する。また、用語
「CAIRタンパク質」は慣用技術を使用する計画的な変異、例えば、単一点突然変
異によるか、またはCAIRタンパク質をコードするDNAの短い区画を切除すること
によるか、または新しいアミノ酸の置換または新しいアミノ酸の付加により、導
入された非天然の突然変異を包含することが理解されるであろう。このような小
型変更はもとの分子の免疫同一性および／またはその生物学的活性を実質的に維
持しなくてはならない。したがって、これらの変更は表示した天然に存在するCA
IRタンパク質、例えば、配列識別No.２に示すCAIR−１タンパク質と特異的に免
疫反応性であるタンパク質を包含する。変更されたタンパク質の生物学的性質は
、適当な細胞系においてタンパク質を発現させ、そして培養において細胞をCAI
と対抗させることによって決定することができる。小さいと考慮される特定のタ
ンパク質の修飾は、同類置換、すなわち、同様な化学的性質のアミノ酸の置換、
例えば、アスパラギン酸についてグルタミン酸またはアスパラギンについてグル
タミン、を包含するであろう。あるタンパク質を配列番号：２のタンパク質と最
適に整列させかつ免疫同一性の細胞成長アッセイを決定するために本明細書にお
いて記載する慣用のイムノアッセイを使用して生物学的活性を決定することによ
って、本発明のタンパク質組成を容易に決定することができる。
それらの組織の由来により表示するCAIRタンパク質は、その組織において主と
して発現されるこのファミリーからの遺伝子産物を指示する。例えば、用語「骨
格筋CAIRタンパク質」は骨格組織において発現されるCAIRタンパク質を指示する
。他の例として、用語「心朦CAIRタンパク質」は心臓組織において発現されるCA
IRタンパク質を指示する。CAIRタンパク質は関係するタンパク質のファミリーを
表すので、異なる組織において発現されるタンパク質はそのファミリーにおける
異なる遺伝子の産物であることができる。Ｃ．
CAIRタンパク質をコードする核酸
本発明は、CAIRタンパク質をコードする単離された核酸配列に関する。本発明
の核酸組成物は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、または種々の組成のハイブリッドであ
るかどうかにかかわらず、天然源から単離することができるか、またはin vitro
で合成することができる。特許請求する核酸は、形質転換されたまたはトランス
フェクションされた全細胞で、形質転換されたまたはトランスフェクションされ
た細胞ライゼイトで、または部分的に精製されたまたは実質的に純粋な形態で存
在することができる。
本発明の核酸配列は、典型的には、配列番号：１の核酸配列と同一であるか、
またはそれに対して少なくとも85％の配列の同一性、好ましくは少なくとも90〜
95％の配列の同一性、より好ましくは少なくとも99％の配列の同一性（前述した
ように決定して）を示す。哺乳動物CAIR−１タンパク質をコードする核酸は、典
型的には、ストリンジェント条件下に配列番号：１の核酸配列にハイブリダイゼ
ーションする。例えば、CAIRタンパク質をコードする核酸は、42℃において50％
のホルムアミドのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下に、配列識別No．１
の核酸にハイブリダイゼーションするであろう。他のストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件を選択
することもできる。一般に、ストリンジェント条件は、定めたイオン強度および
pHにおいて、特定の配列の熱的融点（Tm）より約５℃低いように選択される。Tm
は標的配列の50％が好ましくは合致したプローブにハイブリダイゼーションする
温度（定められたイオン強度およびpHにおける）である。典型的には、ストリン
ジェント条件は塩濃度がpH7.0〜7.5において少なくとも約0.1〜1.0ＮのNaイオン
濃度でありかつ温度が少なくとも約60℃である条件であろう。他の因子、中でも
、塩基濃度および相補的鎖の大きさ、有機溶媒の存在および塩基のミスマッチの
程度はハイブリダイゼーションのストリンジェンシイに有意に影響を与えること
があるので、パラメーターの組成物はいずれか１つの絶対測度よりも重要である
。
CAIRタンパク質をコードする遺伝子の核酸の操作技術、例えば、ポリペプチド
をコードする核酸配列の発現ベクターの中へのサブクローニング、プローブの標
識化、DNAハイブリダイゼーションなどは、一般に、下記の文献に記載されてい
る：Sambrook et al．、Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第２版)、Vol
.１−３、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、19
89、これは引用することによって本明細書の一部とされる。このマニュアルを以
後「Sambrook et al．」と呼ぶ。
一般に、CAIRタンパク質をコードする核酸は、まずCAIRタンパク質の発現をア
ップレギュレートする細胞系を産生することによって得ることができる。これは
、節（Ａ）および実施例１に記載するように、CAIまたは機能的同等物の存在下
に細胞を培養することによって達成される。
次いで、培養において得られたCAI耐性細胞と非耐性親細胞系との間のサブト
ラクティブハイブリダイゼーションにより、サブトラクションプローブを得る。
サブトラクティブハイブリダイゼーショ
ンの方法は当業者によく知られている。参照、例えば、Hampson、et al.、Nucle
ic Acids Res．20．2899（1992）、および実施例２。
次いで、耐性細胞系を使用してcDNAライブラリーを生産し、次いでこのライブ
ラリーを標識化サブトラクションプローブでプロービングすることができる。次
いで陽性のクローンを単離し、それらのクローンを標識化サブトラクションプロ
ーブでCAIRタンパク質のアップレギュレートされた発現についてスクリーニング
する。次いで、アップレギュレートされたCAIRタンパク質の発現を示すクローン
を標準的技術により配列決定することができる。
配列番号：１は、Ａ2058−20Ｒ細胞から得られたCAIR−１遺伝子の３’末端の
1269塩基についてこの方法において得られたヌクレオチド配列を提供する。これ
はノザンブロットから決定してほぼ2.8kbである全長のメッセージの約40％を表
す（第１図）。この分野においてよく知られている多数の方法に従い、この配列
のリストを使用して全長の配列を得ることができる。
例えば、標的配列を増幅する種々の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使
用して、CAIR耐性タンパク質をコードするDNAを調製することもできる。ポリメ
ラーゼ連鎖反応(PCR)技術を使用して、mRNAから、cDNAから、そしてゲノムDNAの
ライブラリーまたはcDNAライブラリーから、このような核酸配列を直接増幅する
。また、CAIRタンパク質をコードする単離された配列をPCR増幅のための鋳型と
して使用することができる。
PCR技術において、増幅すべきDNA領域の５’または３’境界に対して相補的な
オリゴヌクレオチドのプライマーを合成するか、またはランダムプライマーを使
用することができる。次いで、２つのプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反
応を実施する。参照、PC
R Protocols：A Guide to Methods and Applications（Innis、M、Gelfand、D.
、Sninsky、J.およびWhite、T.編）、Academic Press、San Diego(1990)。プラ
イマーは全長のCAIRタンパク質をコードする全体の領域を増幅するか、またはよ
り小さいDNA配列を増幅するように必要に応じて選択することができる。
PCRはCAIRタンパク質をコードするcDNAを単離するために種々のプロトコール
において使用することができる。一般に、CAIRタンパク質をコードするDNA配列
、例えば、配列番号：１において見出されるものの合成から、CAIRタンパク質を
コードするDNAを増幅するために適当なプライマーおよびプローブを発生させる
。例えば、配列番号：１の領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドをPCRプロ
トコールにおいて使用して、CAIRタンパク質をコードするDNAの領域を増幅する
ことができる。いったんこのような領域がPCR増幅されると、それらを配列決定
し、そして得られた配列からオリゴヌクレオチドプローブを調製することができ
る。これらのプローブを使用して、CAIRタンパク質をコードするDNAを単離する
ことができる。この手法に従い、種々の異なる組織からCAIRタンパク質を単離す
ることができる。
DNA単離の好ましいアプローチは５’RACEである。簡単に述べると、この技術
はPCRを使用してランダム５’プライマーおよび限定した３’プライマーでDNA配
列を増幅することを含む。次いで、増幅された配列をベクターの中にサブクロー
ニングし、ここでそれを次いで標準的技術に従い配列決定する。５’RACE法は当
業者によく知られており、そして５’RACEを実施するためのキットは商業的に入
手可能である（例えば、５’RACE System、GibcoBRL、米国ニューヨーク州グラ
ンドアイランド）。
CAIR耐性タンパク質をコードするDNA配列を単離する多数の方法
が存在する。例えば、本明細書において記載する配列（配列番号：１）に対して
相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲノムま
たはcDNAライブラリーからDNAを単離することができる。例えば、全長のプロー
ブを使用するか、または配列識別No．１のサブ配列から成るオリゴヌクレオチド
プローブを使用することができる。このようなプローブはハイブリダイゼーショ
ンアッセイにおいて直接を使用して、CAIRタンパク質をコードするDNAを単離す
ることができる。また、プローブはPCRのような増幅技術において使用するため
に設計することができ、そしてCAIRタンパク質をコードするDNAはPCRのような方
法を使用することによって単離することができる（下記を参照）。
cDNAライブラリーを調製するために、mRNAを組織、例えば、心臓、骨格筋、ま
たはCAI耐性を示す細胞系から単離する。cDNAをmRNAから調製し、組換えベクタ
ーの中に結合する。このベクターを増殖、スクリーニングおよびクローニングの
ために組換え宿主の中にトランスフェクションする。cDNAライブラリーを作りそ
してスクリーニングする方法はよく知られている。参照、GublerおよびHoffman
、Gene 25：263-269(1983)およびSambrook、et al.。
ゲノムライブラリーについて、DNAを組織または細胞系から抽出し、そして機
械的に剪断するか、または酵素的に消化して約12〜20kbの断片を得る。次いで、
断片を勾配遠心により望ましくない大きさの断片から分離し、そしてバクテリオ
ファージラムダのベクターまたは他のベクター中で構築する。これらのベクター
およびファージを、Sambrook、et al.に記載されているように、in vitroでパッ
ケージする。BentonおよびDavis、Science、196：180-182(1977)に記載されてい
るように、組換えファージをプラークハイブリダイゼーションにより分析する。
一般にM．Grunstein et al．、Proc
．Natl．Acad．Sci．USA、72：3961-3965(1975)に記載されているように、コロ
ニーハイブリダイゼーションを実施する。
CAIRタンパク質をコードするDNAを、cDNAまたはゲノムライブラリーにおいて
、例えば、サザンブロット上で、核酸プローブとハイブリダイゼーションするそ
の能力により同定し、そしてこれらのDNA領域を当業者に知られている標準的方
法によって単離する。また、CAIRタンパク質をコードするRNAをノザンブロット
において核酸プローブとハイブリダイゼーションするその能力により同定するこ
とができる。Sambrook、et al.を参照のこと。
最初にBeaucageおよびCarruthers、Tetra．Lett.、22：1859-1862(1981)に記
載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従い、Needham-VanDevanter
、et al.、Nucleic Acids Res.、12:6159-6168(1984)に記載されているように、
自動化合成装置を使用して、プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチド
を化学的に合成する。オリゴヌクレオチドの精製は、PearsonおよびRegnier、J
．Chrom．、255：137-149(1983)に記載されているように、固有のアガロースゲ
ル電気泳動またはアニオン交換HPLCによる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、
MaxamおよびGilbert、in Grossman、L.およびMoldave、D.編、Academic Press、
New York、Methods in Enzymology、65：499-560(1980)の化学的分解法を使用し
て評価することができる。
また、当業者に知られている他の方法を使用して、CAIRタンパク質をコードす
るDNAを単離することができる。特定のタンパク質分子をコードするDNAの単離の
他の技術の説明については、Sambrook、et al.を参照のこと。Ｄ．
CAIRタンパク質の発現
いったんCAIRタンパク質をコードするDNAが単離され、クローニ
ングされると、種々の組換え操作した細胞においてCAIRタンパク質を発現させる
ことができる。当業者はCAIRタンパク質をコードするDNAの発現のために利用可
能な多数の発現系に精通していることが期待される。
簡単に要約すると、CAIRタンパク質をコードする天然または合成の核酸の発現
は、典型的には、DNAまたはcDNAをプロモーター（これは構成的または誘導可能
である）に作用可能に連鎖し、次いで発現ベクターの中に組込むことによって達
成されるであろう。ベクターは原核生物または真核生物における複製および組込
みのために適当である。典型的な発現ベクターは、CAIRタンパク質をコードする
ポリヌクレオチド配列の発現の調節に有用な転写および翻訳のターミネーター、
開始配列、およびプロモーターを含有する。クローニングされた遺伝子、例えば
、CAIRタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、の高いレベルの発現を得
るために、少なくとも、転写を指令するための強いプロモーター、転写開始のた
めのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含有する発現プラ
スミドを構築することが望ましい。発現ベクターは、また、少なくとも１つの独
立のターミネーター配列、真核生物および原核生物の双方におけるプラスミドの
複製を可能とする配列、すなわち、シャトルベクター、および真核生物および原
核生物の双方の系のための選択マーカーを含有する遺伝子の発現カセットを含ん
でなることができる。参照、Sambrook、et al.。真核生物および原核生物の双方
の系におけるCAIRタンパク質の発現の実施例は後述されている。
１． 原核生物における発現
種々の原核生物の発現系を使用してCAIRタンパク質を発現させることができる
。例は大腸菌（E.coli）、バシラス（Bacillus）、ストレプトマイセス（Ｓtrep
tomyces）などである。例えば、CAIRタン
パク質を大腸菌（E.coli）において発現させることができる。
少なくとも、転写を指令するための強いプロモーター、転写開始のためのリボ
ソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含有する発現プラスミドを
構築することが必須である。大腸菌（E.coli）においてこの目的に適当な調節領
域の例は、Yanofsky、J．Bacterriol.、158：1018-1024(1984)に記載されている
大腸菌（E.coli）のトリプトファン生合成経路のプロモーター、およびHersKowi
tz、et al.、Ann．Rev．Genet.、14：399-445(1980)に記載されているファージ
ラムダ（Ｐλ）の左の方のプロモーターである。大腸菌（E.coli）中で形質転換
されたDNAベクターの中に選択マーカーを含めることも有用である。このような
マーカーの例は、アンピシリン、テトラサイクリン、またはクロランフェニコー
ルに対する耐性を特定する遺伝子である。大腸菌（E.coli）において使用のため
の選択マーカーに関する詳細については、Sambrook、et al.を参照のこと。
原核細胞により生産されるCAIRタンパク質は必ずしも適切に折りたたみするこ
とがないことがある。大腸菌（E.coli）からの精製の間に、発現されたタンパク
質をまず変性し、次いで復元させることができる。これは下記のようにして達成
することができる。細菌的に生産されたタンパク質をカオトロープ剤（chaotrop
ic agent）、例えば、グアニジンHClの中に可溶化し、そして還元剤、例えば、
ベータ−メルカプトエタノールですべてのシステインを還元する。次いで、タン
パク質を遅い透析によるか、またはゲル濾過により復元する。参照、米国特許第
4,511,503号。
発現された抗原の検出は、この分野において知られている方法、例えば、ラジ
オイムノアッセイ、またはウェスタンブロッティング技術または免疫沈降により
達成される。大腸菌（E.coli）からの精
製は、米国特許第4,511,503号に記載されている手法に従い達成することができ
る。
２． 真核生物における発現
種々の真核生物の発現系、例えば、酵母、昆虫細胞系、鳥類、魚類、および哺
乳動物の細胞は当業者に知られている。下記に簡単に説明されているように、CA
IRタンパク質をこれらの真核生物系において発現させることができる。
酵母における異種タンパク質の合成はよく知られている。Methods in Yeast G
enetics、Sherman、et al.、、Cold Spring Harbor Laboratory、(1982)は、酵
母中でタンパク質を生産するために利用可能な種々の方法を記載するよく認識さ
れた研究である。
適当なベクターは、通常、発現制御配列、例えば、プロモーター、例えば、３
−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素、および複製起点、停止配列
などを必要に応じて有する。例えば、適当なベクターは文献に記載されている(B
otstein、et al.、1979、Gene、8：17-24；Broach、et al.、1979、Gene、8：12
1-133)。
酵母細胞を形質転換するとき、２つの手法を使用する。１つの場合において、
酵母細胞をまずザイモリアーゼ、リティカーゼまたはグルスラーゼを使用してプ
ロトプラストに変換し、次いでDNAおよびポリエチレングリコール(PEG)を添加す
る。次いで、PEG処理したプロトプラストを選択的条件下に３％寒天培地中で再
生する。この手法の詳細は下記の論文に記載されている：J．D．Beggs、1978、N
ature（London）、275：104-109；およびHinnen、et al.、Proc．Natl．Acad．S
cl．USA、75:1929-1933(1978)。第２手法は細胞壁の除去を含まない。その代わ
り、細胞を塩化リチウムまたはアセテートおよびPEGで処理し、そして選択的プ
レート上に置く（Ito、et al.、J．Bact.、153：163-168(1983)）。
CAIRタンパク質は、いったん発現されると、細胞を溶解し、そしてライゼイト
に標準的タンパク質単離技術を適用することによって、酵母から単離することが
できる。ウェスタンブロット技術または他の標準的イムノアッセイ技術のラジオ
イムノアッセイを使用することによって、精製プロセスをモニターすることがで
きる。
また、CAIRタンパク質をコードする配列は、例えば、哺乳動物、昆虫、鳥類ま
たは魚類由来の細胞培養物を形質転換するとき使用するための種々の発現ベクタ
ーに結合することができる。ポリペプチドの生産に有用な細胞培養物の例は哺乳
動物細胞である。哺乳動物細胞系はしばしば細胞の単層の形態であるが、哺乳動
物細胞の懸濁液を使用することもできる。完全なタンパク質を発現することがで
きる多数の適当な宿主細胞系がこの分野において開発されてきており、そしてHE
K293、BHK21、およびCHO細胞系、および種々のヒト細胞、例えば、COS細胞系、H
eLa細胞、骨髄腫細胞系、Jurkat細胞系などを包含する。これらの細胞のための
発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター（例えば、CM
Vプロモーター、HSVtkプロモーターまたはpgk(ホスホグリセレートキナーゼ)プ
ロモーター）、エンハンサー(Queen、et al.、Immunol．Rev．89：49(1986))、
および必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、RNAスプラ
イス部位、ポリアデニル化部位（例えば、SV40の大きいTAgポリＡ付加部位）、
および転写停止配列を含むことができる。CAIRタンパク質の生産に有用な他の動
物細胞は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American
Type Culture Collection）の細胞系およびハイブリドーマのカタログ（第７版
、1992）から入手可能である。
昆虫細胞におけるCAIRタンパク質の発現に適当なベクターは通常SF９バキュロ
ウイルスから誘導される。適当な昆虫細胞系は、力幼
虫、カイコ、アワヨトウの幼虫、ガおよびショウジョウバエ（Drosophila）、例
えば、Schneider細胞系を包含する（参照、Schneider、J．Embyrol．Exp．Morph
ol．27：353-365(1987)）。
上に示したように、宿主細胞を形質転換するために使用されるベクター、例え
ば、プラスミドは転写を開始するDNA配列およびタンパク質の翻訳を制御する配
列を含有することが好ましい。これらの配列は発現制御配列と呼ばれる。
酵母を使用するときのように、高等動物の宿主細胞が使用される。既知の哺乳
動物遺伝子からのポリアデニル化または転写ターミネーターの配列をベクターの
中に組込むことが必要である。ターミネーター配列の例はウシ成長ホルモン遺伝
子からのポリアデニル化配列である。転写の正確なスプライシングのための配列
を含めることもできる。スプライシング配列の例はSV40からのVP１イントロンで
ある（Sprague、et al.、J．Virol．45:773-781(1983)）。
さらに、宿主細胞における複製を制御する遺伝子配列をベクター、例えば、ウ
シ乳頭腫ウイルス型ベクターの中に見出されるベクターの中に組込むことができ
る。Saveria-Campo、Bovine Papilloma virus DNA a Eukaryotic Clonig Vector
¨、pp．213-238 in DNA Cloning Vol．II a Practical Approach、D.M．Glove
r編、IRL Press、Arlington、Virginia（1985）。
宿主細胞は形質転換に対して応答能があるか、または種々の手段により応答能
があるようにされる。動物細胞の中にDNAを導入するいくつかのよく知られてい
る方法が存在する。これらは下記のものを包含する：リン酸カルシウム沈澱法、
受容細胞とDNAを含有する細菌のプロトプラストとの融合、DNAを含有するリポソ
ームによる受容細胞の処理、DEAEデキストラン、エレクトロポレーションおよび
直接細胞の中へのマイクロインジェクション。
発現されたポリペプチドを細胞から懸濁液または単層として単離する。Bioche
mical Methods in Cell Culture and Virology、Kuchler、R.J.、Hutchinson an
d Ross，Inc.(1977)。発現されたペプチドを懸濁液または単層として成長した細
胞から単離する。後者はよく知られた機械的、化学的または酵素的手段により回
収する。Ｅ．
CAIRタンパク質の精製
組換えDNA技術により生産されたポリペプチドは、当業者によく知られている
標準的技術により精製することができる。組換え的に生産されたポリペプチドは
直接発現させるか、または融合タンパク質として発現させることができる。次い
で、タンパク質は細胞溶解（例えば、超音波処理）とクロマトグラフィーとの組
み合わせにより精製する。融合産物のために、融合タンパク質を引き続いて適当
なタンパク質分解酵素で消化すると、所望のポリペプチドが解放される。
本発明のポリペプチドは、この分野においてよく知られている標準的技術、例
えば、硫酸アンモニウムのような物質を使用する選択的沈降、免疫精製法などに
より、実質的純度に精製することができる。例えば、R．Scopes、Protein Purif
ication：Principles and Practice、Springer-Verlag：New York（1982）参照
、（引用することによって本明細書の一部とされる）。例えば、本明細書に記載
するように、抗体をCAIRタンパク質に対して発生させることができる。組換えタ
ンパク質を発現する細胞系から細胞膜を単離し、タンパク質を膜から抽出し、そ
して免疫沈降させる。次いで、タンパク質を前述したように標準的タンパク質化
学により精製する。Ｆ．
CAIRタンパク質をコードするヌクレオチドの検出
本発明は、CAIRタンパク質をコードするDNAまたはRNAを検出する方法、および
イムノアッセイ技術によりタンパク質を測定する方
法を提供する。これらの方法は２つの一般的目的に有用である。第１に、CAIRタ
ンパク質をコードするヌクレオチドを検出するアッセイは、上記（Ｃ）に記載す
る方法に従い、そして後述する核酸ハイブリダイゼーションのアッセイの使用に
より、種々の脊椎動物種からこれらの核酸を単離するために有用である。第２に
、CAIRタンパク質をコードする核酸を検出するアッセイは、細菌試料中のCAI耐
性を検出する手段を提供する。
核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して特定のDNAおよびRNAを測定する種
々の方法は当業者に知られている。参照、Sambrook、et al.。例えば、試料中の
CAIRタンパク質をコードするDNAの存在または非存在を評価する１つの方法はサ
ザン転移を包含する。
簡単に述べると、消化されたゲノムDNAを緩衝液中でアガローススラブゲル上
で展開し、そして膜に転移させる。前述の核酸プローブを使用してハイブリダイ
ゼーションを実施する。前述したように、CAIRタンパク質をコードする核酸配列
（配列番号：１）に基づいて核酸プローブを設計する。プローブはCAIRタンパク
質をコードする核酸配列の全長であるか、または全長より短いことができる。よ
り短いプローブを特異性について実験的に試験する。好ましくは、核酸プローブ
は20塩基またはそれより長い長さである。（核酸ハイブリダイゼーションにおい
て使用のための核酸プローブを選択する方法については、Sambrook、et al.を参
照のこと。）ハイブリダイゼーションした部分の可視化は、CAIRタンパク質をコ
ードするDNAの存在または非存在の定量的決定を可能とする。
同様に、CAIRタンパク質をコードするmRNAを検出するためにノザン転移を使用
することができる。簡単に述べると、例えば、酸グアニジニウム−フェノール−
クロロホルム抽出法を使用して、所定の細胞試料からmRNAを単離する。次いで、
mRNAを電気泳動させてmRNA
種を分離し、そしてmRNAをゲルからニトロセルロース膜に移す。サザンブロット
を使用するときのように、標識化プローブを使用してCAIRタンパク質の存在また
は非存在を同定する。
種々の核酸ハイブリダイゼーションのフォーマットは当業者に知られている。
例えば、普通のフォーマットはサンドイッチアッセイおよび競合または置換アッ
セイを包含する。ハイブリダイゼーション技術は一般に下記の文献に記載されて
いる：¨Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，¨Hames、B．D
．およびHiggins、S．J．、IRL Press、(1985)；GallおよびPardue、Proc．Natl
．Acad．Sci．U.S.A．、63:378-383(1969)；およびJohn et al．、Nature、223
：582-587(1969)。
例えば、サンドイッチアッセイは核酸配列の検出または単離するために商業的
に有用なハイブリダイゼーションアッセイである。このようなアッセイは、固体
支持体に共有結合で固定化された「捕捉」核酸配列および溶液中の標識化「シグ
ナル」核酸を利用する。臨床試料は標的核酸を提供するであろう。「捕捉」核酸
および「シグナル」核酸のプローブは、標的核酸とハイブリダイゼーションして
「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション複合体を形成する。有効であるために
は、シグナル核酸は捕捉核酸とハイブリダイゼーションすることができない。
典型的には、標識化核酸配列を使用してハイブリダイゼーションを検出する。
相補的核酸またはシグナル核酸は、典型的にはハイブリダイゼーションしたポリ
ヌクレオチドの存在するために使用されるいくつかの方法の任意の１つにより、
標識化することができる。最も普通の検出法は、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは32
Ｐ標識化プローブなどを使用するオートラジオグラフィーの使用である。他の
標識は、標識化抗体に結合するリガンド、発蛍光団、化学発光剤
、酵素、および標識化リガンドのための特異的結合対のメンバーとして働くこと
ができる抗体を包含する。
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、シグナル発生複合体を標的およびプ
ローブのポリヌクレオチドまたは核酸の二本鎖に結合することを必要とすること
がある。典型的には、このような結合はシグナルと複合化したリガンドおよび抗
リガンドの間のようなリガンドおよび抗リガンドの相互作用を通して起こる。
標識は、また、ハイブリダイゼーション複合体の間接的検出を可能とする。例
えば、標識がハプテンまたは抗原である場合、シグナルは蛍光分子または酵素分
子を抗体に取り付けるか、または、ある場合において、放射性標識を取り付ける
ことによって発生させる（Tijssen、P.、¨Practice and Theory of Enzyme Imm
unoassays，¨Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology
、Burdon、R．H．、van Knippenberg、P．H．編、Elsevier（1985）、pp．9-20
。）。
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増殖する核
酸増幅系の使用により増強することができる。このような系の例は、ポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)系およびリガーゼ連鎖反応(LCR)系である。この分野において最
近記載された他の方法は、核酸配列に基づく増幅(NASBATM、Cangene、Mississau
ga、Ontario)およびＱベータレプリカーゼ系である。
CAIRタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを決定する別法はインサイチ
ュ・ハイブリダイゼーションである。インサイチュ・ハイブリダイゼーションア
ッセイはよく知られており、そして一般にAngerer、et al.、Methods Enzymol.
、152：649-660(1987)に記載されている。インサイチュ・ハイブリダイゼーショ
ンにおいて、細胞または組織の検体を固体支持体、典型的にはガラスに固定す
る。DNAをプロービングするために、細胞を熱またはアルカリで変性する。次い
で、細胞をハイブリダイゼーション溶液と適度な温度において接触させて、CAIR
タンパク質に対して特異的な標識化プローブのアニーリングを可能とする。プロ
ーブは好ましくは放射性同位元素または蛍光性リポーターで標識化する。Ｇ．
イムノアッセイによるCAIRタンパク質の検出
核酸ハイブリダイゼーションによりCAIRタンパク質をコードする核酸の発現を
検出することに加えて、イムノアッセイを使用してタンパク質を検出することも
できる。イムノアッセイを使用してタンパク質を定性的または定量的に分析する
ことができる。適用可能な技術の一般的概観は下記の文献に見出すことができる
：HarlowおよびLane、Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor
Pubs.、N.Y．(1988)(引用することによって本明細書の一部とされる)。
１． 抗体の生産
多数の免疫原を使用して、CAIRタンパク質と特異的に反応性の抗体を生産する
ことができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体の生産のために好ましい免疫原である。また、天然に存在するタンパク質を
純粋であるか、または純粋でない形態で使用することができる。本明細書におい
て記載するCAIR−１配列を使用して作った合成ペプチドを、タンパク質に対する
抗体の生産のための免疫原として使用することができる。組換えタンパク質は前
述したように真核細胞または原核細胞の中で発現させ、そして一般的に前述した
ように精製することができる。次いで、抗体を生産することができる動物の中に
産物を注入する。タンパク質を測定するイムノアッセイにおいて引き続いて使用
するために、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を発生させることが
できる。
ポリクローナル抗体を生産する方法は当業者に知られている。簡単に述べると
、免疫原、好ましくは精製したタンパク質をアジュバントと混合し、そして動物
を免疫化する。試験のために採血し、CAIRタンパク質に対する反応性の力価を決
定することによって、免疫原調製物に対する動物の免疫応答をモニターする。免
疫原に対して適当に高い力価の抗体が得られるとき、血液を動物から集め、抗血
清を調製する。所望ならば、抗血清をさらに分画してタンパク質に対して反応性
の抗体を濃縮することができる（HarlowおよびLane、前掲参照）。
モノクローナル抗体は当業者に知られている種々の技術により得ることができ
る。簡単に述べると、所望の抗体で免疫化した動物からの脾細胞を、普通に骨髄
腫細胞との融合により、永久分裂能化する（参照、KohlerおよびMilstein、Eur
．J．Imuunol．6：511-519(1976)（引用することによって本明細書の一部とされ
る）。免疫化の別の方法は、エプスタイン−バー−ウイルス、オンコジーン、ま
たはレトロウイルスを使用する形質転換、またはこの分野においてよく知られて
いる他の方法を包含する。単一の免疫化細胞から発生するコロニーを抗原に対す
る所望の特異性およびアフィニティーの抗体の生産についてスクリーニングし、
そしてこのような細胞により生産されるモノクローナル抗体の収量を種々の方法
、例えば、脊椎動物の宿主の腹腔の中への注入により増強することができる。ま
た、モノクローナル抗体またはその結合断片をコードするDNA配列は、Huse、et
al.、Science 246：1275-1281(1989)に概説されている一般的プロトコールに従
い、ヒトＢ細胞からDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離す
ることができる。
合成ペプチドの生産方法は当業者に知られている。簡単に述べる
と、本明細書において記載するCAIRタンパク質の配列の予測される免疫原領域を
同定する。これらの領域に対応する好ましくは少なくとも10アミノ酸の長さのペ
プチドを合成し、そしてペプチドを引き続く免疫化のためにより大きいタンパク
質に接合する。好ましくは、CAIRタンパク質のユニーク領域に対応するペプチド
配列を使用して、CAIRタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を発生させる。次
いで、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の生産を前述したように実
施する。
２． イムノアッセイ
種々のイムノアッセイ法により、特定のタンパク質を測定することができる。
一般に免疫学的およびイムノアッセイ手法については、Basic and Clinical Imm
unology第７版、D．StitesおよびA．Terr編（1991）を参照のこと。そのうえ、
本発明のイムノアッセイはいくつかの立体配置のいずれにおいても実施すること
ができ、これらは下記の文献において広範に概観されている：Enzyme Immunoass
ay、E．T．Maggio編、CRC Press、Boca Raton、Florida(1980)；¨Practice and
Theory of Enzyme Immunoassays，¨P．Tijseen、Laboratory Techniques in B
iochemistry and Molecular Biology、Elsevier Science Publishers B．V．Ams
terdam(1985)；および、HarlowおよびLane、Antibodies，A Laboratory Manual
、前掲、それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。
CAIRタンパク質の測定のためのイムノアッセイは、当業者に知られている種々
の方法により実施することができる。簡単に述べると、タンパク質を測定するイ
ムノアッセイは競合または非競合結合アッセイであることができる。競合結合ア
ッセイにおいて、固体表面に結合した捕捉因子上の特定の結合部位について試料
の分析物は標識化分析物と競合する。好ましくは、捕捉因子は前述したように生
産されたCAIRタンパク質と特異的に反応性の抗体である。捕捉因子に結合した標
識化分析物の濃度は、試料の中に存在する遊離の分析物の量に逆比例する。
競合結合イムノアッセイにおいて、試料の中に存在するCAIRタンパク質は、特
定の結合因子、例えば、CAIRタンパク質と特異的に反応性の抗体に対する結合に
ついて、標識化タンパク質と競合する。結合因子は固体表面に結合して、結合し
た標識化タンパク質を結合しない標識化タンパク質から分離することができる。
また、競合結合アッセイを液相中で実施し、そしてこの分野において知られてい
る種々の技術の任意のものを使用して、結合した標識化タンパク質を結合しない
標識化タンパク質から分離することができる。分離後、結合した標識化タンパク
質の量を決定する。試料の中に存在するタンパク質の量は標識化タンパク質の結
合量に逆比例する。
あるいは、均質イムノアッセイを実施することができ、ここで分離工程は不必
要である。これらのイムノアッセイにおいて、タンパク質上の標識はその特異的
結合因子へのタンパク質の結合により変更される。標識化タンパク質におけるこ
の変更は標識が放射するシグナルの減少または増加を生ずるので、イムノアッセ
イの終わりにおける標識の測定はタンパク質の検出または定量を可能とする。
CAIRタンパク質は、また、種々の非競合イムノアッセイ法により検出および定
量することができる。例えば、２つの部位の固相サンドイッチイムノアッセイを
使用する。この型のアッセイにおいて、タンパク質のための結合因子、例えば、
抗体を固相に取り付ける。第２タンパク質結合因子は、また、抗体であることが
でき、そしてタンパク質に異なる部位において結合し、これを標識化する。タン
パク質上の双方の部位における結合後、未結合の標識化結合因子を除去し、そし
て固相に結合した標識化結合因子の量を測定する。標
識化結合因子の量は、試料中のタンパク質の量に直接比例する。また、CAfRタン
パク質は下記の文献に記載されているような免疫沈降法により検出することがで
きる：Otto et al．、pp．119-127、Methods in Cell Biology、Vol．37：Antib
odies in Cell Biology、Asai編、Academic Press、New York（1993）。
また、ウェスタンブロット分析を実施して試料中のCAIRタンパク質の存在を決
定することができる。電気泳動は、例えば、タンパク質を含有することが推測さ
れる組織の試料について実施する。電気泳動によりタンパク質を分離し、そして
適当な固体支持体、例えば、ニトロセルロースのフィルターにタンパク質を移し
た後、固体支持体をタンパク質と反応性の抗体とインキュベートする。この抗体
を標識化するか、または一次抗体と結合する第２標識化抗体との引き続くインキ
ュベーションにより検出することができる。
前述のイムノアッセイのフォーマットは標識アッセイ化合物を使用する。標識
は種々の形態であることができる。標識はこの分野においてよく知られている方
法に従うアッセイの所望の成分に直接または間接に結合することができる。広範
な種類の標識を使用することができる。成分はいくつかの方法の任意の１つによ
り標識化することができる。伝統的には、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐ
組込んだ放射性標識を使用した。非放射性標識は、標識化抗体に結合するリガン
ド、発蛍光団、化学発光剤、酵素、および標識化リガンドのための特異的結合対
のメンバーとして働くことができる抗体を包含する。標識の選択は、要求される
感度、成分との複合化の容易さ、安定性の要件、および利用可能な計装に依存す
る。使用できる種々の標識化またはシグナル生成システムの概観については、米
国特許第4,391,904号（これは引用することによって本明細書の一部とされる）
。
特定のタンパク質と反応性の抗体は、また、種々のイムノアッセイ法により測
定することができる。イムノアッセイ技術による抗体の測定に適用可能な免疫学
的およびイムノアッセイ手法の概観については、下記の文献を参照のこと：Basi
c and Clinical Immunology第７版（D．StitesおよびA．Terr編）前掲、Enzyme
Immunoassay、E．T．Maggi編、前掲、およびHarlowおよびLane、Antibodies，A
Laboratory Manual、前掲。
簡単に述べると、CAIRタンパク質と反応性の抗血清を測定するイムノアッセイ
は競合または非競合結合アッセイであることができる。競合結合アッセイにおい
て、固体表面に結合した捕捉因子上の特定の結合部位について試料の分析物は標
識化分析物と競合する。好ましくは、捕捉因子は前述したように生産された精製
された組換えCAIRタンパク質である。単離されたまたは部分的に精製された天然
に存在するタンパク質を包含するCAIRタンパク質の他の源を使用することもでき
る。非競合アッセイは典型的にはサンドイッチアッセイであり、ここで試料の分
析物は２つの分析物特異的結合試薬の間に結合する。結合因子の１つを捕捉因子
として使用し、そして固体表面に結合する。第２結合因子を標識化し、そして視
的または計装手段により生ずる複合体を測定または検出する。多数の捕捉因子お
よび標識化結合因子の組み合わせを使用することができる。CAIRタンパク質の測
定について前述したものに類似する種々の異なるイムノアッセイのフォーマット
、分離技術および標識を使用こともできる。
本発明は、また、タンパク質と選択的に反応性の抗体を含有する容器と、試験
を実施するための取扱説明書とを含んでなる、組織または血液試料中のCAIRタン
パク質の存在を検出するキットを包含する。このキットは、また、他の成分、例
えば、CAIRタンパク質、対
照、緩衝溶液、および二次抗体を含有することができる。
本発明は、本明細書に記載する核酸プローブと、取扱説明書とを含んでなる、
組織または血液試料中のCAIRタンパク質をコードするDNAまたはRNAを検出するキ
ットを包含する。このキットは、また、本明細書に記載するように、二本鎖核酸
を同定するための、追加の成分、例えば、標識化化合物を含有することができる
。Ｈ．
CAIR耐性の検出
種々の癌の治療における共通の問題は、腫瘍細胞が暴露される特定の製剤に対
する腫瘍細胞の耐性の獲得である。治療の効能を測定するか、または特定の治療
のプロトコールを中止または変更するときを決定するために、治療の間に特定の
製剤に対する耐性の獲得についてアッセイすることが望ましい。
実施例１に示すように、腫瘍細胞はCAIに対して耐性を発生させることができ
る。この耐性の発生はCAIR遺伝子のアップレギュレーションおよびその結果のCA
IRタンパク質の発現を含む。したがって、CAIRmRNAおよびCAIRタンパク質の双方
のレベルの増力旧よ、CAI耐性の開始を検出するための好都合なマーカーを提供
する。
本発明はCAI耐性を検出するアッセイを提供する。これらのアッセイは、CAIお
よびその機能的同等物への暴露前に、同一組織に関する試料の組織中のCAIRタン
パク質の発現の増加の検出を必要とする。本発明の好ましい態様において、これ
らのアッセイは治療的養生法前に生物学的試料（例えば、腫瘍のバイオプシーま
たは血液試料）を得ることを必要とする。CAIまたは機能的同等物を使用する治
療の間に、引き続く試料を採り、CAIR産生についてアッセイする。CAIR産生が初
期の（プレCAI)試料に関して増加を示す場合、CAI耐性の開始を推定することが
できる。
CAIRmRNAまたはCAIRタンパク質の発現レベルを検出することによ
って、CAIR産生をアッセイすることができる。CAIRmRNAを検出する手段は節（Ｆ
）に記載されているが、CAIRタンパク質を検出する手段は節（Ｇ）に記載されて
いる。好ましい態様において、mRNAをハイブリダイゼーションプローブにより検
出するが、CAIRタンパク質はイムノアッセイにより検出する。Ｉ．
耐性モジュレーターについてのスクリーニングにおけるCAI耐性の使用
本発明のCAI耐性細胞をバイオアッセイにおけるように利用して、CAI耐性を減
少または除去する化合物についてスクリーニングすることができる。一般に、こ
のようなアッセイは、固定したまたは変化する濃度のスクリーニングすべき化合
物およびCAIまたは機能的同等分子の存在下にCAI耐性細胞を培養することを含む
であろう。スクリーニングした化合物はCAI耐性を減少する場合、細胞の成長速
度は減少するか、または細胞は死亡するであろう。細胞の成長速度を決定する手
段は当業者によく知られておりそして、例えば、標識化代謝物質（例えば、[3Ｈ
]−チミジン）の吸収の変化の測定または細胞の計数を包含する。
本発明は、さらに、本明細書に記載するCAI耐性細胞と、取扱説明書とを含ん
でなる、CAI耐性細胞における治療効能について組成物または組成物の組み合わ
せをスクリーニングするキットを包含する。このキットは、また、追加の成分、
例えば、培地、スクリーニングについて本明細書に記載したような耐性細胞の代
謝活性を評価する標識化物質を含有する。Ｊ．
医薬組成物
CAIRタンパク質をコードする核酸配列およびCAIRタンパク質それら自体は、ア
ンチセンス、抗体、および一本鎖ペプチドの医薬組成物の調製に利用することが
できる。CAIをコードするヌクレオチド
配列はアンチセンス治療薬の生産に使用できる。これらはCAIR遺伝子から転写さ
れたmRNAに結合し、これによりCAIRタンパク質の発現を阻害して細胞がそのCAI
耐性を解放するようにさせる分子である。アンチセンス分子を生産する方法は当
業者によく知られている。参照、例えば、Cohen、et al.、米国特許第5,264,423
号および米国特許第5,276,019号；Miller、et al.、米国特許第4,469,863号、お
よび米国特許第4,757,055号；およびUhlmann、et al.、Chem．Rev.、90：543-58
4(1990)。
また、CAIRタンパク質またはその断片を免疫原として使用して、前述したCAIR
タンパク質に対して特異的な抗体を発生させることができる。抗体はCAIRタンパ
ク質に結合し、これによりそのタンパク質と他の細胞成分との通常の相互作用を
防止する。再び、細胞をCAI耐性を解放するであろう。また、抗体を使用して通
常のタンパク質機能をブロックする方法は当業者によく知られている。参照、例
えば、El-Badry、et al.、Cell Growth and Diff．、1：325-331(1990)。
通常のCAIRタンパク質と競合し、これによりCAIRタンパク質の作用を減少また
は調節する非機能的模擬物を作るために、CAIRタンパクを使用することができる
。機能障害の模倣物を生産する手段は、重要なアミノ酸残基の置換または化学的
修飾を包含する。CAIRタンパク質の化学的合成の間に、または特定の残基をコー
ドするヌクレオチド配列を変更するために部位特異的突然変異誘発を使用するこ
とによってタンパク質が組換え的に発現される場合に、アミノ酸の置換は直接達
成することができる。ペプチドの模倣物の生産手段は当業者によく知られている
。例えば、薬物BB94は酵素コラゲナーゼを阻害し、そして転移インヒビターとし
て使用される。
節（Ｂ）において上に記載したように、CAIR−１耐性タンパク質
は多数のSH３ドメイン結合部位を含有する。SH３ドメインは、多数の細胞のシグ
ナリング経路ならびに細胞骨格活性に関係づけられた。SH３結合ドメインを有す
るCAIRタンパク質またはそれらの断片を使用してSH３ドメインを選択的に結合し
かつブロックし、これにより特定のシグナルトランスダクション経路を阻害する
ことができる。これは異常なシグナリング、例えば、癌、過増殖状態、膠原血管
分布（例えば、狼瘡および慢性関節リウマチ）の補正、ネフロパシー、神経疾患
（例えば、ALF、アルツハイマー病）、およびミオパシー（例えば、心筋症、骨
格筋症）により特徴づけられるある種の疾患の治療において有用である。
本発明の医薬組成物は、非経口的、局所の、経口的または局所的投与に意図さ
れる。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、ま
たは筋肉内に投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは
水性担体の中に溶解または懸濁した前述の因子の溶液を含んでなる非経口的投与
のための組成物を提供する。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、0.4％の
生理食塩水、0.3％のグリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。こ
れらの組成物は慣用のよく知られている滅菌技術により滅菌するか、または滅菌
濾過することができる。生ずる水溶液はそのまま使用するために包装するか、ま
たは、凍結乾燥し、凍結乾燥した調製物を無菌の溶液と組み合わせた後、投与す
る。組成物は生理学的状態に近似させるために要求される薬学上許容される補助
物質、例えば、pH調節物質および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤など、例えば、酢
酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウ
ム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどを含有す
ることができる。
固体組成物のために、慣用の無毒の担体を使用することができ、
これらの例は下記の通りである：例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース
、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロー
ス、スクロース、炭酸マグネシウムなど。経口的投与のために、薬学上許容され
る無毒の組成物は、任意の通常使用される賦形剤、例えば、前述の担体、および
一般に10〜95％、より好ましくは25〜75％の濃度の活性成分を混入することによ
ってドメインされる。
エーロゾルの投与のために、ポリペプチド、抗体、またはアンチセンス分子を
好ましくは微細な形態で界面活性剤および噴射剤と一緒に供給する。界面活性剤
は、もちろん、無毒であり、好ましくは噴射剤の中に可溶性でなくてはならない
。このような因子の代表例は、６〜22個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、
カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール
酸、リノレン酸、オステリン酸およびオレイン酸と、脂肪族多価アルコールまた
はその環状無水物とのエステルまたは部分的エステルである。混合エステル、例
えば、混合または天然のグリセリドを使用することができる。担体を、必要に応
じて、例えば、鼻内供給のためのレシチンように、含めることもできる。
治療的適用において、本発明のアンチセンス分子、抗体、またはポリペプチド
をCAIRタンパク質の発現をブロックするか、または特定のシグナルのトランスダ
クション経路をブロックするために十分な量で患者に投与される。これを達成す
るために適切な量は「治療的に有効な投与量」と定義される。この使用に有効な
量は、例えば、特定のアンチセンス分子、抗体、またはポリペプチド、投与方法
、患者の体重および一般的健康状態、および処方する医師の判断に依存するであ
ろう。Ｋ．
遺伝子治療の適用
種々のヒトの疾患を治療のアプローチにより治療することができ、これらのア
プローチは遺伝子が転写されかつ遺伝子産物を細胞の中で生産されることができ
るように、ヒト細胞の中に遺伝子を安定に導入することを包含する。このアプロ
ーチにより治療可能な疾患は、遺伝病、特に欠陥が単一の遺伝子によるGSD1a型
のような疾患を包含する。遺伝病ならびに後天性疾患の治療に対する遺伝子治療
の適用についての説明については、下記の文献を参照のこと：Miller、A．D.(19
92)Nature 357：455-460、およびMul1igan、R．C（1993）Science 260：926-932
(これらの双方は引用することによって本明細書の一部とされる)。
本発明は、CAIR遺伝子を健康な細胞の中に導入し、こうしてそれらが節約され
るようにし、そして非健康な細胞、例えば、腫瘍細胞をより高い投与量のCAIに
暴露すると同時に全身的毒性を減少することができる遺伝子治療を包含する。ま
た、CAIと競合し、これにより病気の細胞のCAI耐性レベルの減少してCAI治療に
細胞を感受性とさせるCAI模倣物をコードする遺伝子を導入するために、遺伝子
治療を使用することができる。
細胞の中への遺伝子または遺伝子物質の供給は、疾患の遺伝子治療における最
初の重大なステップである。種々の方法が実験的に使用されてきている。大部分
の研究は、細胞の中に遺伝子を送り出すためのレトロウイルスおよびアデノウイ
ルスのベクターの使用に集中されている。レトロウイルスのベクターは、転移さ
れた遺伝子配列を標的細胞の染色体DNAの中に安定に組込む能力を有する。レト
ロウイルスのベクターは、高い百分率の標的細胞を安定にトランスダクションす
ることにおいて非常に効率よいので、特に魅力的である。したがって、承認され
た遺伝子治療の臨床的プロトコールの大部分はレトロウイルスのベクターを有す
る。参照、Miller、A．D.(
1992)前掲。レトロウイルスのベクターは、レトロウイルスのベクターが標的細
胞をトランスダクションしかつ標的細胞のゲノムの中に組込まれる効率が高いの
で、細胞を修飾するために特に有用である。さらに、レトロウイルスのベクター
を有するレトロウイルスは広範な種類の組織からの細胞を感染することができる
。
レトロウイルスのベクターはレトロウイルスの遺伝子操作により生産される。
ウイルスのゲノムはRNAであるので、レトロウイルスはRNAウイルスと呼ばれる。
感染すると、このゲノムRNAはDNAコピーに逆転写され、このDNAコピーは高度の
安定性および効率でトランスフェクションされた細胞の染色体DNAの中に組込ま
れる。組込まれたDNAコピーはプロウイルスと呼ばれ、そして任意の他の遺伝子
のように娘細胞により遺伝される。野生型レトロウイルスのゲノムおよびプロウ
イルスのDNAは３つの遺伝子を有する：gag、polおよびenv遺伝子、これらは２つ
の長い末端の反復(LTR)配列によりフランキングされる。gag遺伝子は内部の構造
（ヌクレオキャプシド）タンパク質をコードする；pol遺伝子はRNA指令DNAポリ
メラーゼ（逆転写酵素）をコードする；そしてenv遺伝子はエンベロープ糖タン
パク質をコードする。５’および３’LTRはヴィリオンRNAの転写およびポリアデ
ニル化を促進する働きをする。ゲノムの逆転写のために必要な配列（tRNAプライ
マー結合部位）および粒子の中へのウイルスRNAの効率よい包膜のために必要な
配列(Psi部位)が５’LTRに隣接して存在する。参照、Mulligan、R．C．、In：Ex
perimental Manipulation of Gene Expression、M．Inouye(編)、155-173(1983)
；Mann、R.、et al.、Cell、33：153-159(1983)；Cone、R．D．およびR．C．Mul
ligan、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、81：6349-6353(1984)。
レトロウイルスのベクターの設計は当業者によく知られている。
参照、Singer、M.およびBerg、P.前掲。簡単に述べると、包膜（または感染性ウ
イルスの中へのレトロウイルスRNAのパッケージ）のために必要な配列がウイル
スゲノムから欠如される場合、ゲノムRNAの包膜を妨害するcis作用性欠陥が生ず
る。しかしながら、生ずる変異体はすべてのヴィリオンタンパク質の合成をなお
指令することができる。これらの配列が欠失されたレトロウイルスのゲノム、な
らびに染色体の中に安定に組込まれた突然変異のゲノムを含有する細胞系はこの
分野においてよく知られており、そしてレトロウイルスのベクターの構築のため
に使用される。レトロウイルスのベクターの調製およびそれらの使用は、下記の
ものを包含する多数の刊行物に記載されている：欧州特許出願EPA第0 178 220号
、米国特許第4,405,712号、Gilboa、Biotechniques 4：504-512(1986)、Mann、e
t al.、Cell 33：153-159(1983)、ConeおよびMulligan、Proc．Natl．Acad．Sci
．USA 81：6349-6353(1984)、Eglltis、M．A．、et al.(1988)Biotechniques 6
：608-614、Miler、A．D．et al.(1989)Biotechniques 7：981-990、Miller、A
．D.(1992)Nature、前掲、Mulligan、R．C.(1993)、前掲、およびGould、B．et
al．、および国際特許出願No．WO92／07943号、発明の名称「遺伝子治療におけ
るレトロウイルスのベクター」。これらの特許および刊行物の教示は、引用する
ことによって本明細書の一部とされる。
レトロウイルスのベクターの粒子は、CAIRタンパク質または非機能的CAIRタン
パク質の模倣物をコードする遺伝子をレトロウイルスのベクターの中に組換え的
に挿入し、そしてこのベクターをパッケージング細胞系の使用によりレトロウイ
ルスのキャプシドタンパク質でパッケージすることによって調製される。生ずる
レトロウイルスのベクターの粒子は、宿主細胞の中で複製することができず、そ
してCAIR遺伝子またはCAIRタンパク質非機能的模倣物を含有するプロウイルス配
列として宿主細胞のゲノムの中に組込まれることができる。その結果、患者は正
常のCAIRを生産し、そしてカルシウム流入インヒビターの作用を発生することが
できるか、または非機能的CAIR模倣物の生産はCAI耐性の開始を防止する。
パッケージング細胞系を使用してレトロウイルスのベクターの粒子を調製する
。パッケージングに要求される必要なウイルス構造タンパク質を生産するが、感
染性ヴィリオンを生産することができない、遺伝的に構築された哺乳動物の組織
培養細胞系がパッケージング細胞系である。他方において、レトロウイルスのベ
クターは構造遺伝子を欠如するが、パッケージングに必要な核酸配列を有する。
パッケージング細胞系を調製するために、パッケージング部位が欠失されている
所望のレトロウイルスの感染性クローンを構築する。この構築物を含有する細胞
はすべての構造タンパク質を発現するであろうが、導入されたDNAはパッケージ
されることができないであろう。また、パッケージング細胞系は適当なから成る
およびエンベロープタンパク質をコードする１または２以上の発現プラスミドで
細胞系を形質転換することによって生産することができる。これらの細胞におい
て、gag、pol、およびenv遺伝子は同一であるか、または異なるレトロウイルス
から誘導することができる。
本発明に適当な多数のパッケージング細胞系はこの分野において入手可能であ
る。これらの細胞系の例は、Crip、GPE86、PA317およびPG13である。Miller et
al．、J．Virol．65：2220-2224(1991)参照のこと（これは引用することによっ
て本明細書の一部とされる）。他のパッケージング細胞系の例は、下記の文献に
記載されている：ConeおよびMulligan、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、81：6349
-6353(1984)およびDanosおよびMulligan、Proc．Natl．Acad．
Sci．USA、85：6460-6464(1988)、Eglitis、et al.(1988)前掲、およびMiller、
(1990)前掲、（また、すべては引用することによって本明細書の一部とされる）
。
キメラエンベロープタンパク質を有するレトロウイルスのベクターの粒子を生
産することができるパッケージング細胞系を使用することができる。また、両栄
養性または異種栄養性のエンベロープタンパク質、例えば、PA317およびGPZパッ
ケージング細胞系により生産されるタンパク質を使用してレトロＸイルスのベク
ターをパッケージすることができる。
下記の実施例により本発明を例示するが、本発明を限定しない。実施例 実施例１ CAI耐性細胞の培養
カルボキシアミド−トリアゾール(CAI)は、癌細胞の悪性増殖、侵入、および
転移を阻止することが観察され、潜在的癌治療薬としてのCAI、および関係する
化合物の役割を示唆する。腫瘍細胞が暴露される特定の薬理学的養生法に対する
腫瘍細胞の耐性の発生は、癌治療薬の開発および利用において問題を有する。し
たがって、CAI耐性のメカニズムを検査するためのモデル系としてかつCAIおよび
その類似体に対する耐性を減少または排除する治療養生法のためのアッセイまた
はスクリーニング系を提供するために、CAIに対する耐性を発現する細胞を開発
することは望ましかった。
低い継代（継代13）の親ヒト黒色腫細胞（Ａ2058）、およびヒト卵巣癌細胞(O
VCAR３)を、10％ウシ胎児血清(FCS)およびpen／strep(ペニシリン／ストレプト
マイシン)を補充したダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）中で培養した。24〜3
0月の期間にわたって、
細胞を0.1μＭから出発して45μＭに到達する増加する濃度のCAIとインキュベー
トした。ナショナル・キャンサー・インスチチュートの開発治療プログラム（De
velopmental Therapeutics Program of the National Cancer Institute）から
入手したCAIをDMSO中に溶解し、そして使用するまでアリコートを−70℃におい
て貯蔵した。CAIで連続的選択圧を培養を通じて維持し、そしてすべての実験を
通じて維持した。
10μＭ（10Ｒ）、20μＭ（20Ｒ）、30μＭ（30Ｒ）、および40μＭ（40Ｒ）に
対して慢性的に耐性であるＡ2058細胞が得られることが見出された。Ａ2058のCA
I耐性細胞の形態の明らかな差は観察されなかった。Ａ2058のCAI耐性細胞の成長
速度は40μＭの処理まで減衰せず、40μＭにおいて成長速度は多少減少した。
10μＭおよび20μＭのCAIに対して慢性的に耐性であるOVCAR３がまた確立され
た。OVCAR３細胞はCAI処理におけるよりわすかに低い成長速度を有した。実施例２ CAIR−１遺伝子の単離
Ａ2058細胞においてCAI耐性と相関するタンパク質をコードするDNAを、Hampso
n、et al.、Nucleic Acids Res.、20：2899（1992）に記載されている方法に従
い、サブトラックションハイブリダイゼーションにより単離した。
RNAを20μＭの耐性Ａ2058細胞（Ａ2058−20Ｒ）から単離し、逆転写酵素を使
用するcDNAの合成に鋳型として使用した。生ずるcDNAを、残留RNAからアルカリ
性加水分解(0.5ＭのNaOH、15分、55℃)、次いでSephadexG50スピンカラムにより
精製した。32Ｐ−dCTPトレーサーを使用してcDNAを定量し、そして500ngを親（
野生型）細胞系（Ａ2058）から得られた10μｇのmRNAに溶液中でハイブリダイ
ゼーションするために使用した。ハイブリダイゼーションは10μｌの最終体積に
おいて0.5MのNaCl、25mMのHEPES緩衝液、pH7.5、５mMのEDTA、および１％のSDS
の最終濃度で68℃において20時間実施した。
ハイブリダイゼーション後、最終産物を分子等級の二重蒸留H2Oで５倍に希釈
し、次いでエタノール沈澱させた（１／10体積の３ＭのNaOAc、pH5.0、２体積の
100％のエタノール、ドライアイス、−20℃において20分または一夜）。生ずる
ペレットを80％のエタノールでおだやかに洗浄し、真空乾燥し、50μｌの緩衝液
（25mMのTris-HCl、pH7.0、１mMのEDTA、５％のDMSO、２mMのアスコルビン酸）
中に溶解し、そして68℃において３分間インキュベートした。
mRNA：cDNAヘテロ二本鎖を化学的に架橋するために、２，５−ジアジリジニル
−３，４−ベンゾキノン(DZQ)を200μＭの最終濃度に添加し、そして反応混合物
を45℃において20分間インキュベートした。次いで反応を前述したようにエタノ
ール沈澱させ、洗浄し、ノザンブロット、ゲノムDNA、またはcDNAライブラリー
をプロービングするために使用した。プローブを下記の文献に記載されているよ
うに標準的ランダムプライマー技術を使用して32Ｐ−dCTPで標識化した：Maniat
is、et al.、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor L
aboratory Press、NY(1982)(これは引用することによって本明細書の一部とされ
る)。標識化反応は、セクエナーゼ(Sequenase)II酵素を使用して室温において20
分間実施した。
サブストラクテッド（subtracted）プローブを、まず、親Ａ2058細胞およびCA
I耐性Ａ2058−20Ｒ細胞からの全体のRNAのノザンブロットに対してハイブリダイ
ゼーションさせた。多数の転写体の発現の増加が見られた（第１図、上左パネル
）。ハウスキーピング遺
伝子として放射性標識化GAPDHとのブロットの再ハイブリダイゼーションは、発
現の増加を確証した（第１図、下左パネル）。
cDNAライブラリーをＡ2058−20Ｒ細胞からストラタジーン(Stratagene)(米国
カリフォルニア州ラジョラ)により構築した。このライブラリーを標準的アプロ
ーチ（同上）を使用してプロービングし、そして陽性プローブをプラーク精製し
た。41クローンを選択し、そして35は制限消化により非オーバーラッピングであ
ると決定された。ノザン分析による発現の決定のために、15をランダムに選択し
た。インサートを低融点アガロースゲル電気泳動により精製し、次いで標準的ラ
ンダムプライマー条件で放射性標識化し（Amersham、Little Chalfont、Bucks、
United Kingdom）そして親（野生型）の全体のRNAおよびＡ2058−20Ｒ細胞から
のRNAのノザンとハイブリダイゼーションさせた。スクリーニングしたクローン
の中で、３つ（表１）はCAIとの培養に応答した発現の増加を示した。表１は、
各クローンについて、ノザンブロットから決定した転写体の大きさ（第１図）お
よびcDNAインサートの大きさを示す。GAPDHハウスキーピング遺伝子に比較して3
.8倍（複製ノザンについて２倍〜４倍の領域）増加した発現を示すCAIR−１cDNA
(クローン21DBB)を配列分析のために選択した。35Ｓ−dATP標識をもつ標準的ジ
デオキシ配列決定（セクエナーゼIIキット）を使用して、CAIR−１cDNA（クロー
ン21DBBインサート）を配列決定した。cDNA配列を配列識別Ｎo.１に示す。
実施例３ CAIR−１の特性決定
CAIR−１cDNA配列をジーンワーク(GeneWork)および遺伝子バンクにより分析し
、そしてユニークでありかつオープンリーディングフレーム、ポリアデニル化シ
グナルおよびそれが哺乳動物遺伝子の３’末端であることを示すポリＡテイルを
含有することが見出された。DNA配列の翻訳は、遺伝子バンクおよび他のデータ
ベース比較によりユニークであるタンパク質のｃカルボキシル末端を生じた。CA
IR−１配列は、Src相同３（SH３）結合タンパク質のためのコンセンサス定義を
満足するユニークプロリンに富んだ配列を含有する。SH３ドメインはシグナリン
グ調製における共通であり、そして細胞骨格、膜および他のシグナリングタンパ
ク質を標的とすることが示された（Koch、et al.、Science 252：668-674(1991)
。SH３ BPドメインのコンセンサス配列は下記の通りである：XPXXPPPψXPであり
、ここで位置２、７および10は必須Ｐ（プロリン）であり、Ｘは任意のアミノ酸
であり、そしてψは疎水性アミノ酸である。CAIR−１タンパク質のカルボキシル
末端においてSH３結合タンパク質のコンセンサス配列の４つのユニークバージョ
ンが存在する（表２）。
実施例４ 組織におけるCAIRタンパク質の発
ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎、および膵臓、脾臓、胸腺、前
立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血白血球からのポリ−ARNAから成る
商用ノザンをストラタジーン（米国カリフォルニア州ラジョラ）から入手した。
調製物をCAIR−１プローブでプロービングした。
CAIR−１のヒト組織の分布は、心臓、骨格筋（双方は重要なカルシウム伝達調
節を有することが示された）およびまた胎盤、肺、および肝臓における顕著な発
現を証明した。脳、腎、および胎盤において、より少ない発現か認められた。胎
盤、精巣、卵巣、および結腸における発現は最小であった。実施例５ CAIR−１におけるSH３結合領域の検出
SH３結合領域を含有するCAIR−１のcDNAを、pGEX-2TのBamHＩおよびEcoRＩ部
位の中にサブクローニングする。大腸菌（Escherichia coli）細胞をサブクロー
ニングしたpGEX2Tベクターで形質転換する。CAIR−１融合タンパク質の発現をイ
ソプロピル−１−チオ−Ｂ
−Ｄ−ガラクトピラノシドで誘導する。次いで細胞を溶解し、そしてGST−CAIR
−１融合タンパク質を含有するライゼイトをグルタチオンアガロースビーズで精
製し、そして還元されたグルタチオンを含有するTris-HClで溶離した。
精製されたGST−CAIR−１融合タンパク質をグルタチオン−セファローズビー
ズ上に固定化する。次いで、ビーズを４℃においてSH３ドメイン、例えば、Ab1
、Fyn、Lckおよびｐ85を含有するタンパク質とインキュベートする（一定に揺動
しながら）。ビーズを洗浄し、そして溶離されたタンパク質をSDS-PAGEにより４
℃において一定に揺動しなからチェックする。
次いで、SH３−CAIR−１複合体をグルタチオン−セファローズビーズを使用し
て精製し、次いで電気泳動により分離する。SH３結合複合体は商業的に入手可能
なSH３抗体（SH３を含有するタンパク質に対する抗体）またはCAIR−１に対する
抗体により同定することができる。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/18
Ｃ０７Ｋ 16/18 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｃ１２Ｑ 1/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｇ０１Ｎ 33/53 9637−4Ｂ 21/08
// Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
21/08 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，
ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ
，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，
ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ
Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ
，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，
ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 キム，ヤング スーク
アメリカ合衆国，メリーランド 20817,
ベセスダ，ブラッドリー ブールバード
7000