JPH03504438A

JPH03504438A - アンドロジェンレセプターを含むｄｎａ結合蛋白質

Info

Publication number: JPH03504438A
Application number: JP1504989A
Authority: JP
Inventors: リャウ，シューツン; チャン，チャウンシャン
Original assignee: アーチ　デベロプメント　コーポレイション
Priority date: 1988-03-30
Filing date: 1989-03-24
Publication date: 1991-10-03
Also published as: WO1989009223A1; CA1341305C; EP0407462A1; EP0407462A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称アンドロジエンレセプターを含むＤＮＡ結合蛋白質関連出願の相互参照この発明は、１９８８年１０月５日に申請されて、係属している米国特許出願第２５３．８０７号の部分継続出願である。それもまた、１９８８年３月３０日に申請されて係属している米国特許出願第１７６．１０７号の部分継続出願である。

発明の背景この発明は、一般に、ＤＮＡ結合性の制御蛋白質に関係しており、特に、アンドロジエンレセプター蛋白質とＴＲ２と呼ばれる新しいＤＮＡ結合性蛋白質をコードしているＤＮＡ配列に、また、これらのＤＮＡ配列の組み換えられた発現のポリペプチド産物に、また、これらのＤＮＡ配列から導かれたアミノ酸配列を持つペプチドに、また、このような蛋白質やペプチドに特異的な抗体に、そして、このような蛋白質およびそれに関連した核酸の検出と定量の手続きに関係している。

ステロイドホルモンには、５つの主要なりラス、プロジェスティン、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、アンドロジエン、およびニストロジエンがある。レセプター蛋白質は、それぞれ特異的なステロイドホルモンに組織特異的な方法で分配され、ターゲット細胞内では、ステロイドホルモンは対応する細胞内レセプターと特異的な複合体を形成出来る。［Ｊ６ｎｓｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）５９巻、６３２ページ（１９６８）；Ｇｏｒｓｋｉら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、３８巻、４２５−４５０ページ（１９７６）；および、Ｌｉａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　ＨｏｒｍｏｎｅｓＨ，Ｌ、Ｊ、Ｍａｋｉｎ編（Ｂ　１　ａｃｋｗｅ　ｌ　１Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ、０ｘｆｏｒｄ、１９８４）の６３３ページ］、遺伝子発現のホルモンによる制御は、ステロイドレセプター複合体とあるゲノムフラグメントとの相互作用および特異的遺伝子の転写の調節を含むものと思われる０例えば、Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、、２５巻％５２９ページ（１９８５）；および、山本、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１９巻２０９ページ（１９８５）を見よ、ホルモンの第一義的な作用は特異的タイプの細胞における遺伝子のサブセットの転写の促進を含む。

例えば、様々なステロイドレセプターをコードしているｃＤＮＡのクローニングの成功は、ステロイドとＤＮＡの結合部に含まれる異なるステロイドレセプター領域の構造と機能の分析を可能とした０例えば、ＨＨｏｌ−１９ｎｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、３１８巻６３５ページ、（１９８５）；Ｍｉｅｓ　−ｆｅｌｄら、Ｃｅ１１．４６巻、３８９ページ（１９８６）ＨＤａｎｉｅｌｓｅｎら、ＥＭＢＯＪ、５巻、２５１３ページ（１９８６）；Ｇｒｅｅｎｅら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１巻、１１５０ページ（１９８６）；　Ｋｒｕｓｔら、ＥＭＢＯＪ、５巻、８９１ページ（１９８６）ＨＬｏｏｓｆｅｌｔら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’　　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　、８３巻、９０４５ページ（１９８６）；Ｃｏｎｎｅｅｌｙら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３３巻、７６７ページ（１９８７）Ｌａｗら、Ｐｒｏｃ、Ｎｅｔ’　　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）　、８４巻、２８７７ページ（１９８７）；Ｍｉｓｒａｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　、１４３巻、７４０ページ、（１９８７）ＨＡｒｒｉｚａら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３７巻、２６８ページ（１９８７）ｓＳａｐら、Ｎａ−ｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　、３２４巻、６３５ページ（１９８６）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　、３１８＠、６４１ページ（１９８６）Ｂｅｎｂｒｏｏｋら、Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ、２３８巻、７８８ページ（１９８７）、およびＥｖａｎｓら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、８８９ページ（１９８８）を見よ。

テストステロンなどのようなアンドロジエンは、雄の第２次性徴の発達の原因となり、主として精巣で合成される。アンドロジエンレセプター（ＡＲ）のｃＤＮＡのクローニングは困難であった。なぜならば、最近まで、ＡＲに対する単一特異的な抗体はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いるものが入手できなかったからである。Ｇｏｖｉｎｄａｎら、Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ。

１、Ｉｎｖｅｓｔ、　、１０巻（補遺２）（１９８７）の要約は、ヒト精巣λｇｔ−１１ｃＤＮＡライブラリーからの、ヒトアンドロジエンレセプターをコードしているｃＤＮＡの単離を報告した。そこでは、ヒト糖質コルチコイド、エストラジオール及びプロジエステロンレセブターに対応する合成オリゴヌクレオチドがプローブとして用いられた。伝えられるところによれば、発現された蛋白質はトリチウムラベルされたＤＨＴ　（ジヒドロテストステロン）と高い親和性と特異性を持って結合した。

しかしながら、アンドロジエンレセプターの全長に対して何らのヌクレオチド配列もアミノ酸配列も与えられなかっただけで無く、アンドロジエンレセプターと推定される多ローンの全長の単離に関しても何らの記述も与えられなかった。

最近、Ｃｈａｎｇら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、３２４ページ（１９８８年４月１５日）は、本件の発明者はその共著者であるが、アンドロジエンレセプターをコードしているｃ　ＤＮＡをヒト精巣及びラット腹部前立腺ｃＤＮＡライブラリーから得たと述べた。これらのヒト及びラットのアンドロジエンレセプターのｃＤＮＡは、９４ｋＤａ及び７６ｋＤａのレセプターをコードするのに十分な長さであると報告された。この分子量は、ＤＮＡ　　Ｉｎ５ｐｅｃｔｏｒ　　ＩＩ　　オープン　リーディングフレーム　分析用（Ｔｅｘｔｃｏ　　Ｗ　　ｅ　　ｓ　　ｔＬｅｂａｎｏｎ、Ｎｅｗ　　Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）として知られるソフトウェアプログラムの助けを借りて引き出された。新しいＤＮＡ　　Ｉｎ５ｐｅｃｔｏｒ　　Ｕｅ　　プログラムを使うと、ｈＡＲ（９１８アミノ酸）は推定分子量９８，６０８を持ち、ｒＡＲ（９０２アミノ酸）は分子量９８，１３３を持つ。それゆえ、“９４ｋＤａ”と報告されたＡＲは今や“９８ｋＤａ″ＡＲと呼ばれ、２番目のＡ　Ｔ　Ｇ　／　Ｍ　ｅ　ｔから始まり、“７６ｋＤａ”と報告されたｈＡＲとｒＡＲポリペプチドは今や“７９　ｋ　Ｄ　ａ”　と呼ばれる。

Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’　　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８５巻、７２１１ページ（１９８８年１０月５日）も見よ。これも本件発明者の共著である。

対照的に、Ｌｕｂａｈｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、３２７ページ（１９８８）は、ヒト副畢丸及び培養ヒト包皮繊維芽細胞を用いて、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）中で発現されて蛋白質を産生するヒトｃＤＮＡを得た。この蛋白質はサイドシル中にあり、アンドロジエンに結合できる。しかしながら、このｃＤＮＡは、推定分子量４１，０００のレセプターをコードするのに足りるだけである。従って、この得られたｃＤＮＡは、ＡＲの一部分をコードしているだけである。

この発明にとって興味のあることには、Ｙｏｕｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１２３巻、６０１ページ（１９８８）では、抗−ＡＲモノクローナル抗体が報告された。抗−ＡＲ自己抗体は、ＬｉａＯら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８２巻、８３４５ページ（１９８４）（本件の共同発明者の一人である）に述べられているように、前立腺癌患者の血清中で同定された。

そして、それは、その力価、親和性及び特異性の面から特徴付けられた。次に、それらの抗体力価に冨む患者の血液からリンパ球が単離され、Ｅｐｓｔｅｉｎ− Ｂａｒｒ　　Ｖｉｒｕｓ　（ＥＢＶ）でトランスホームされ、そして、抗−ＡＲモノクローナル抗体産主用にクローン化された。これらのモノクローナル抗体はラット前立腺のアンドロジエンレセプターと相互作用することが見出された。抗体産生の増大の試みは抗体分泌の減衰をもたらした。トランスホームされたＢ− 細胞にとって、ハイブリドーマ細胞よりも不安定であることは珍しいことではない。Ｋｏｚｂｏｒら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４巻、２３ページ（１９８４）　　このような　細胞系統に伴う不安定さのゆえに、モノクローナル抗体の代りの源が良いと思われ従って、この分野では、アンドロジエンレセプター蛋白質と他のＤＮＡ結合性蛋白質の一次構造のコンホメーションに関する情報が必要である。それは、恐らく、ヒト及び他のは乳動物の同じ領域をコードしているＤＮＡ配列の知識によって与えられるであろう。このようなりＮＡ配列が入手出来れば、ＤＮＡ−ＤＮＡ。

ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション手順が蛋白質と結合した核酸の検出、定量、そして／または単離に役立つのと同様に、組換え技法を応用して、原核及び真核の宿主細胞における大規模な蛋白質の産生を可能にするであろう。アンドロジエンレセプター及び関係したＤＮＡ結合性蛋白質を所有していること、及び／または、その同じもののアミノ酸配列の知識は、それがまた、モノクローナル及びポリクローナル抗体（蛋白質フラグメントまたは模倣して合成されたペプチドに対する抗体も含む）の開発を可能にするであろう。それは、蛋白質を発現している細胞に対する標識及び治療薬のような物質の組織特異的な送達に役立つのと同様に、液体及び組織標本中の蛋白質の検出と定量だめの免疫学的方法に利用できる。

免豆立ｌ上この発明は、アンドロジエンレセプター蛋白質及び構造的に関係のあるＴＲ２と呼ばれる蛋白質をコードしている新しく精製され単離されたＤＮＡ配列を提供する。

この蛋白質もＤＮＡ結合能を（従ってＤＮＡ複製または転写調節能を）持っている。現在提出されている形態では、新しいＤＮＡ配列は、ヒト及びラットのアンドロジエンレセプターとヒトＴＲ蛋白質をコードしているｃＤＮＡ配列を含む。

ゲノムＤＮＡ、及び部分的にまたは全体的にヌクレオチドから化学合成されたＤＮＡなどの他のＤＮＡ形態もまた、欠失や変異を有するＤＮＡと同様に、この発明の意図に含まれる。

この発明で提供されたＤＮＡ配列の同種または異種の、プロモーター、オペレーター、レギュレーターなどのような発現調節ＤＮＡ配列との結合は、イン　ビ　ボ（ｉｎ　　ｖｉｖｏ）及びイン　ビ　ト　ロ　　（ｉｎｖｉｔｒｏ）で転写されてメツセンジャーＲＮＡを生成することを可能にする。それが、また、翻訳されてアンドロジエンレセプターとＴＲ２蛋白質及び関連したポリ−およびオリゴ −ペプチドを産生ずることを許す。この発明の好ましいＤＮＡ発現系では、ＡＲ及びＴＲ２をコードしているＤＮＡは、ウィルス（Ｔ７）の制御（プロモーター）ＤＮＡ配列と機能的に結合されている。それは無細胞系内で、イン　ビトロ　の転写と翻訳を行なって、例えば、７９ｋＤ及び９８ｋＤのヒトアンドロジエンレセプター（ｈＡＲ）蛋白質、７９ｋＤ及び９８ｋＤのラットアンドロジエンレセプター（ｒＡＲ）蛋白質及び、２０ｋＤと５２ｋＤの分子種を含むＴＲ２蛋白質のような小さい形態の蛋白質の産生を許す。

適切なウィルス環状ＤＮＡプラスミツドベクターを潜在的に含む原核及び真核宿主細胞へのＤＮＡ配列の取り込みも、この発明の意図に含まれ、これまで天然の源から得られなかった有用な蛋白質を多量に産生ずることが期待される。この発明によって提供される系は、トランスホームされたＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５α細胞を含む、それは、アメリカ特許庁の微生物寄託の要求に従って、１９８９年１月２５日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ％１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　　２０８５２　　に寄託された。

Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，受理Ｎｏ、６７８７９はＥＣ−ｈＡＲ３６００と呼ばれ、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ。

６７８７８はＥＣ−ｒＡＲ２８３０、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

Ｎｏ、６７８７７はＥＣ−ＴＲ２−５，そして、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、６７８７６はＥＣ−ＴＲ２−７と呼ばれる。は乳動物宿主細胞の使用は翻訳後修飾（例えば、先端切除、糖鎖付加、及びチロシン、セリンまたはスレオニンの燐酸化）の供給が期待される。それは、この発明の組換え発現産物の最上の生物学的活性を与えるのに必要であろう。

この発明の新しい蛋白質産物は、ＡＲ及びＴＲ２蛋白質の一次構造コンホメーション（すなわち、アミノ酸配列）を持つポリペプチド、このペプチドの断片及びアミノ酸配列を複製して作られた合成ペプチドを含む。この発明の蛋白質、蛋白質断片、及び合成ペプチドは、治療、診断、及び予後の使用を含む多（の使用が考えられる。−そして、ＡＲ及びＴＲ２蛋白質と特異的に免疫反応するモノクローナル及びポリクローナル抗体の調製のための基礎を提供するであろう、好ましい蛋白質断片及び合成ペプチドは、ＤＮＡ結合能には関与していないＡＲ及びＴＲ２蛋白質の重複する領域を含んでいるものである。そして、もっとも好ましいものは、ＡＲ及びＴＲ２蛋白質の抗原決定基を少なくとも一つ持つものである。

ＡＲ及びＴＲ２蛋白質、及びそれらの断片及びペプチドに高い免疫特異性をもって結合する能力によって特徴付けられるポリクローナルおよびモノクローナル抗体もまたこの発明によって提供される。それらは他の蛋白質、特にＤＮＡ結合性蛋白質とは共通でない固有の抗原決定基を認識する。

この発明によって、ＡＮＩ−６、ＡＮＩ−７、ＡＮＩ−１５と呼ばれるモノクローナル抗体が実例的に提供される。それらは、Ｈ−ＡＮＩ−６、Ｈ−ＡＮ　１− ７、Ｈ−ＡＮ　ｌ　−１５と呼ばれるバイプリドーマ細胞系統によって産生される。それらは、アメリカ特許庁の微生物寄託の要求に従って％１９８９年１月２５日に、それぞれ受理Ｎｏ、　　ＨＢ　１０，０００　；　）ＩＢ９゜９９９；及びＨＢＩｏ、００１として、Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ　　　Ｔｙｐｅ　　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　　Ｃｏ　　ｌ　　１　　ｅｃ　　−ｔｉｏｎ、１２３０１　　　Ｐ　　　ａ　　　ｒ　　　ｋ　　　ｌ　　　ａ　　　ｗ　　　ｎＤｒｉｖｅ、　　Ｒｏｃｋｖｉ　　１　１ｅ　％　Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に寄託された。これらの抗体は、（ａ）ラット腹部前立腺由来のアンドロジエンレセプターおよびｈＡＲ−ｃＤＮＡ及びｒＡＲ−ｃＤＮＡの構造から予言される配列を持つ合成ペプチドへの結合能によって、（ｂ）自然に生じたアンドロジエンレセプター及び組換えられたアンドロジエンレセプターに対する、自然の及び変性したコンホメーションに於ける、特異的免疫学的反応性及び可逆的免疫結合能によって、そして、（ｃ）ｈＡＲの現存する３３１残基から５７７残基及びｒＡＲ中の対応するアミノ酸配列の重複している配列のすべてまたは実質的に免疫学的に重要な部分を含む蛋白質様物質に対する特異的免疫学的反応性及び可逆的免疫結合能によって特徴付けられる。

この発明のモノクローナル抗体は、ヒトまたはラットの前立腺、及びＡＲに富む器官及び培養細胞のような他の源からのＡＲの親和性による精製に用いることができる。

正常、異常、または変異した形態のＡＲ及びＴＲ２、及びそれらに結合している核酸（例えば、ＤＮＡ及びｍＲＮＡ）を検出及び／または定量するための新しい手順もこの発明によって提供される。この発明の抗体は、実例的に、液体及び組織試料中のＡＲ及びＴＲ２蛋白質及びこの発明のＤＮＡ配列（特にＤＮＡ結合性蛋白質をコードしている配列を含むもの）の定量的検出のための既知の免疫学的手順に用いられるであろう、それは適切に標識され、これらの蛋白質をコードしているｍＲＮＡの定量的検出に用いられるであろう。

従って、この発明では、（ａ）図３に示されている新しいＡＲ及びＴＲ２をコードしているＤＮＡ配列が提供されており、同様に（ｂ）ＡＲ及びＴＲ２をコードしているＤＮＡで、ハイブリダイズしているものが提供されている。そのハイブリダイゼーションの条件は、ここで述べられ、この発明のＣＤＮＡの最初の単離で用いられた条件よりきついかまたは等しいものである。

そして、（Ｃ）同じ対立遺伝子の変異、または、少なくとも部分的には変異したコドンな使って作られたＡＲ及びＴＲ２類似ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列が提供されている。これらに対応して、そのようなりＮＡ配列を取り込んだウィルスまたは環状プラスミツドＤＮＡベクターと、そのようなりＮＡ配列及びベクターによってトランスホームされ、またはトランスフェクトされた原核及び真核宿主細胞が提供される。それは、そのような宿主を培養して成育させ、組換えによってＡＲ及びＴＲ２蛋白質を産生じ、それらの蛋白質を宿主またはその培養培地から単離するための新しい方法と同様である。

この発明の好ましいポリペプチド産物は、約７９ｋＤ（２番目のＡＴＧ／Ｎｅｔから始まる）及び９８ｋＤの（１番目のＡ　Ｔ　Ｇ　／　Ｍ　ｅ　ｔから始まる）ｈＡＲポリペプチドを含む。それらは、それぞれ、図３に示されるように、推定７３４及び９１８のアミノ酸残基を持っている。図３に示されるように、７３３及び９０２残基の推定配列を持つ７９ｋＤ及び９８ｋＤのｒＡＲポリペプチド分子種、及び、図４に示されるように、１８４及び４８３残基の同じ推定アミノ酸配列を持つ２０ｋＤ及び５２ｋＤ分子種のヒトＴＲ２ポリペプチドもまた好ましい。好ましい７９ｋＤ及び９８ｋＤのｈＡＲ及びｒＡＲポリペプチドはイン　ビトロで産生され、高い特異性をもってアンドロジエンに特異的に結合する能力とヒト自己免疫抗−アンドロジェンレセブター抗体による免疫沈降性によって特徴付けられる。

この発明の他の面及び利点は、以下の詳述を考慮すれば明白である。それはこの発明の実施の多くの実例と次のような参考図を含む。

図１は、ヒトアンドロジエンレセプターｃＤＮＡベクターの構築で用いられた計画を示す。

図２は、ラットアンドロジエンレセプターｃＤＮＡベクターの構築で用いられた計画を示す。

図３は、ヒトアンドロジエンレセプター（ｈＡＲ）ＤＮＡクローンの３７１５塩基対のヌクレオチド配列とｈＡＲ蛋−白質の７３４及び９１８アミノ酸残基の推定配列を与える。更に、ラットアンドロジエンレセプター（ｒＡＲ）ＤＮＡクローンの３２１８塩基対のヌクレオチド配列及び２つのｒＡＲ分子種の７３３及び９０２アミノ酸の推定配列を与える。

図４は、ヒトＴＲ２ＤＮＡクローンの２０２９塩基対のヌクレオチド配列と”ＴＲ２−５”分子種の４８３のアミノ酸及び”ＴＲ２−７”分子種の１８４のアミノ酸の推定配列を与える。そして、図５は、ヒトアンドロジエンレセプター、糖質コルチコイドレセプター、鉱質コルチコイドレセプター、プロジエステロンレセブター、ニストロジエンレセプター、ＴＲ２、ラットＡＲ、ニワトリビタミンＤレセプター（ｃ−ＶＤＲ）、及びトリ赤芽球症ウィルスのＶ−ｅｒｖＡ　　オンコジーン産物のシスティンに冨むＤＮＡ結合領域の整列を与える。

図６．７、及び８は、それぞれ、ＡＲ遺伝子の３つの異なる部分（Ｎ−末端、ＤＮＡ結合領域、アンドロジエン結合領域）を、ｐＡＴＨ発現ベクターを用いて、ｔｒｐＥ遺伝子のＮ−末端側半分にフレームを一致させて融合させたものを示している。

１且皇１１以下の例は、この発明の実施を示している。例１は、ヒト及びラットアンドロジエンレセプターのｃＤＮＡの単離、調製、及び部分的構造分析に関係する。例２は、ＡＲ−タイプのｃＤＮＡ配列のヒトＸ−染色体上の存在の確認に関係する。

例３は、ＡＲ−タイプｃＤＮＡを含むヒト及びラットｃＤＮＡの他のクローンからの調製とｐＧＥＭ−３２プラスミツドへの結合に関係する。例４は、ＡＲ−タイプのｃＤＮＡのプラスミツドＤＮＡの転写及び翻訳に関係する。例５は、例４の発現産物のステロイド結合活性と関係する。例６は、例４の発現産物のヒト自己抗体への結合活性に関係する。例７は、ＴＲ２−ｃＤＮＡの特徴付けに関係する。例８は、ＴＲ２−ｃＤＮＡの、イン　ビトロでの、転写及び翻訳に関係する。例９は、ＴＲ２−ｃＤＮＡ発現産物の結合活性に関係する。例１０は、ラット腹部前立腺におけるＴＲ２ｍＲＮＡレベルのアンドロジエンによる制御に関係する。例１１は、この発明の組換え発現系に関係する。例１２は、融合蛋白質の産生とこの発明に応じたポリクローナル及びモノクローナル抗体の産主における利用に関係する。例１３は、この発明のＤＮＡプローブの使用に関係する。例１４は、この発明のＤＮＡ配列による遺伝子導入動物の開発に関係する。

これらの例は、単に説明することが目的であり、この発明の範囲をいずれにしても制限する意図は無い。

例１ヒト及びラットアンドロジエンレセプターのｃＤＮＡの調製と部分的構造分析ヒトアンドロジエンレセプター（ｈＡＲ）とラットアンドロジエンレセプター（ｒＡＲ）のｃＤＮＡの単離は、んＧＴＩＩ　　ｃＤＮＡライブラリーを用いて達成された。ヒト精巣及び前立腺λＧＴ１１　ライブラリーは、Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　　Ｃｏ、、Ｐａ１ｏ　　Ａｌｔｏ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　　から得られた。

そしてラット腹部前立腺んＧＴＩＩライブラリーは、Ｅ、ｃｏｌｉＹ１０９０を用いて、Ｃｈａｎｇら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｂｅｍ、　、２６２巻、１１９０１ページ（１９８７）に述べられた様にして作成された。一般に、クローンは、様々なステロイドレセプターに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて弁別された。ｃＤＮＡライブラリーは、最初は、糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）ｓニストロジエンレセプター（ＥＲ）、プロジエステロンレセブター（ＰＲ）、鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）、そしてトリ赤芽球症ウィルスのＶ　　ｅｒｖＡオンコジーン産物のＤＮＡ結合領域のヌクレオチド配列に相同にデザインされた４　１−ｂｐのオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングされた。このプローブは、以下の配列を有した：ＴＧＴ−ＧＧＡＡＧＣＴＧＴ／ＣＡＡＡＧＴＣ／ＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＧＧ／ＡＧＣＡＡ／ＧＴＧＧＡＡＧＧプラークはニトロセルロースフィルターに写され、５゛−末端を３２ｐで標識された４ｌ−ｂｐオリゴヌクレオチドプローブを用いて選別された。ハイブリダイゼーション条件は、２５％　ホルムアミド、５ｘＤｅｎ−ｈａｒｄｔ溶液（０，１％　フィコール　４００．０．１％　ポリビニルピロリドン、０．１％　ウシ血清アルブミン）、０．１％　ＳＤＳ、５ｘ　　Ｓ　　　Ｓ　　　Ｃ（ＬＸ　　ＳＳＣは、１５０ｍＭＮａＣ１，１５ｍＭ　　クエン酸ナトリウムを含む）、１００μｇ　／　ｍ　ｌ　　変性したサケ精子ＤＮＡ、及びｌμｇ／ｍｌ　　ポリＡ、３０℃であった。フィルターは、０．１％　ＳＤＳ、０．０５％　ビロリン酸ナトリウム、および０．４Ｘ　　ＳＳＣを含む溶液で、３７℃で洗われた。

最初のスクリーニングには、４１ｂｐプローブを用いて、もっと緩いハイブリダイゼーション条件（２×　　“５ＳＣ１３７℃）が使われた。残ったクローンは、結局、３７℃で、ＳＳＣ濃度を０．４Ｘ　　ＳＳＣに下げることにより、または温度を上げることにより、またはホルムアミドの濃度を上げることにより、よりきつい条件で、プローブを加えられた。いくらかの手順において、５ｘＳＳＣ１８％　デキストラン硫駿、及び２０％　ホルムアミド、４２℃が用いられた。

その結果は、０．６ＸＳＳＣで得られたものと同じであった。

約３　　Ｘ　　１０’のヒト精巣由来の組換え体と６　×１０１のラット腹部前立腺由来の組換え体から、それぞれ、３０２個及び２１個の陽性のクローンが得られた。

ＡＲは、他のステロイドレセプターのＤＮＡ結合領域と高い相同性を持つシスティンに冨むＤＮＡ結合領域を持つであろうという仮定に基いて、最初のスクリーニングで陽性のクローンは、５°−末端をｓ２Ｐで標識された２４−ｂｐのオリゴヌクレオチドをプローブとして、除去の過程を通して、ＡＲのｃＤＮＡの存在の可能性が探られた。ＧＲ−ｃＤＮＡクローンは、２つのＧＲ−特異的な２４− ｂｐオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングされ、除去された。そのプローブは、ｈＧＲ−ｃＤＮＡのＤ　’Ｎ　Ａ結合領域の５゛−末端または３°−末端に隣接するヌクレオチドセグメントと同一のヌクレオチド配列を持つ、すなわち、ＴＧＴＡＡＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣ及びＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡＣＴＣＴＣＡ、２４４個及び１４個のクローンは、それぞれ、ｈＧＲ−及びｒＧＲ−ｃＤＮＡクローンとして除去された。

ＰＲの５°−末端（ＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＡＡＡ／ＧＣＣＡＧＴ／−ＣＣＡＧＡＧＣ）の４つの２４−ｂｐのプローブ及びＥＲの３°−末端（ＧＣＡ／−ＣＧＡＣＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＴＴＧ）の２つの２４−ｂｐのプローブを用いた同様の手順によって、ヒト精巣ライブラリー中には、ＥＲ−及びＰＲ−ｃＤＮＡクローンは検出されなかった。ラット前立腺ライブラリー中には、ＥＲ−ｃＤＮＡクローンは検出されなかったが、ｈＰＲ−特異的な２４−ｂｐのプローブに陽性のクローンが一つ得られた。

他のステロイドレセプターをコードしていると思われるクローンの除去の後で、残っているクローン中の挿入ＤＮＡは制限地図作成により分析され、ジデオキシ配列分析のためにＭ１３ベクター中でサブクローニングされた。Ｃｈａｎｇら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６２巻、２８２６ページ（１９８７）を見よ。ヌクレオチド配列分析は、４つのクローンにｈＭＲ−ｃＤＮＡクローンであると同定することを許した。　この段階的な除去の過程を通して、５４個のヒト精巣クローンと６個のラット前立腺クローンが選択され、２つのグループに分類された。３０個のヒト精巣クローンは重複した配列を持ち２．１ｋｂのｃＤＮＡを形成する。そして、２４個のヒト精巣及び６個のラット前立腺クローンは重複した配列を持ち、約２．７ｋｂのｃＤＮＡを形成する。この２つのｃＤＮＡのグループは、それぞれ、”ＴＲ２−タイプ及び”ＡＲ−タイプｃＤＮＡと呼ばれた。

例２ヒトＸ−染色体上には、ＴＲ２−タイプのｃＤＮＡよりもＡＲ−タイプのｃＤＮＡ配列が存在するということの確認。

ポリＡ付加信号と推定される配列（ＡＡＴＡＡＡ）と”ＴＲ−２タイプｃＤＮＡ中の５°−末端との距離は２．０ｋｂｔ、か無く、これは他のステロイドレセプターのｃＤＮＡのそれよりもかなり短い、従って、”ＴＲ−２タイプｃＤＮＡよりも”ＡＲ−タイプ”ｃＤＮＡがアンドロジエンレセプターをコードしていると思われた。更に情報を得るために、Ｋｕｎｋｅ　ｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ　ｓ　ｅ　ａ　ｒ　ｃ　ｈ。

１１巻、７９６１ページ（１９８３）に従って用意されたヒトＸ−染色体ライブラリーは、例１のＴＲ２−タイプｃＤＮＡ及びＡＲ−タイプｃＤＮＡをプローブとして分析された。ＴＲ２−タイプのｃＤＮＡフラグメントでは、陽性のクローンは検出されなかった。一方、ヒト精巣由来のＡＲ−タイプの１．９ｋｂのｃＤＮＡフラグメント（クローンＡＲ１３２）では、３つの陽性クローンが得られた。それゆえに、ＡＲ−タイプのｃＤＮＡ配列がＸ−染色体上にあることが確認された。Ｘ−染色体は、ＡＲ−遺伝子を含む染色体として暗示された［Ｌｙｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、２２７巻、１２１７ページ（１９７０）；Ｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）７２巻、１４６９ページ（１９７５）；及びＡｍｈｅｉｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、（ＵＳＡ）、７３巻、８９１ページ（１９７６）］ので、この情報は、恐ら＜−ＴＲ２〜タイプでは無くて、”ＡＲ−タイプ”ｃＤＮＡが、アンドロジエンレセプターをコードするＤＮＡ配列を含むということを示唆した。

２つのヒトクローンは、重複して２．７ｋｂのｃＤＮＡを形成する挿入ＤＮＡを含むが、それらは、ＡＲ１３２及びＡＲ５と呼ばれた。２つのラットクローンは、重複して２．８ｋｂのｃＤＮＡを形成する挿入ＤＮＡを含むが、それらは、ｒＡＲｌびｒＡＲ４と呼ばれた。制限酵素消化の後で、これらのＡＲ−タイプのクローンからのＤＮＡセグメントは、リガーゼ処理され、選択され、そして、下記の例３に述べられているようにして、ｐＢＲ３２２及びｐＧＥＭ−３２ベクターを用いて増幅された。

例３Ａ、２つの異なるクローン由来のＡＲ−タイプのｃＤＮＡを含むヒトｃＤＮＡの調製及びクローニングベクターＪ）ＧＥＭ−３Ｚプラスミツドへのりガーゼによる導入図１は、ｈＡＲ−ｃＤＮＡクローンの全長を構築するときに用いられた計画に関係する。クローンＡＲ１３２のｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩで消化されて１．９ｋｂのフラグメントを得た。それはＫｐｎ　Ｉで消化されてｌｋｂのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントを与えた。

このｌｋｂのフラグメントは、クローンＡＲ５をＫｐｎＩとＰｖｕＩで消化して得られた３ｋｂのフラグメントとリガーゼにより結合された。　生じた４ｋｂのフラグメントは、ｐＢＲ３２２ベクターのＥｃｏＲＩおよびＰｖｕ　Ｉ消化部位に挿入され、Ｅ、ｃｏｌｉＤＨ５αに感染された。このトランスホームされたクローンはテトラサイクリン耐性により選択された。挿入ＤＮＡを持つプラスミツドは、Ｃ１ａＩとＮｄｅ　Ｉで消化され、２．６ｋｂフラグメントを得た。このフラグメントは、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡ　　ポリメラーゼ　ＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントによってプラント末端化され、前辺てＳｍａ　Ｉ消化によってプラント末端化されたクローニングベクターｐＧＥＭ−３ＺプラスミツドＤＮＡ　（Ｐｒｏｍｅｇａ　　Ｂｉｏｔｅｃ、ＭａｄｉｓｏｎＷｌ、）にリガーゼで結合された。Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５α細胞はこうして作られたプラスミツド（プラスミツドＰｈＡＲ３６００と呼ばれる）でトランスホームされ、このプラスミツドを含むコロニーはアンピシリン耐性により選択され、増幅された。プラスミツドＰｈＡＲ３６００でトランスホームされたＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５αは、ＥＣ− ｈＡＲ３６００と呼ばれ、１９８９年１月２５日に、受理Ｎｏ、６７８７９で、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

１２３０１　　　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　　Ｄ　　　ｒ　　　ｉ　　　ｖ　　　ｅ　　　、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　　２０８５２に寄託された。

このプラスミツドＤＮＡは、単離され、その構造が、制限酵素地図とシーケンシングによって分析された。

ｐＧＥＭＢＺ中の２．６ｋｂのｈＡＲのＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ消化によって得られた２、ＯｋｂのｈＡＲフラグメントは、ｈＨＲの他の１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ −ＮｒｕＩフラグメントとリガーゼで結合され、全長３７１５ｂｐのｈＡＲを得た。オーブンリーディングフレームは、約２．８ｋｂであり、これは９００以上のアミノ酸からなる蛋白質をコードするのに十分である。この蛋白質の中央付近には、７２個のアミノ酸を持つシスティンに富む領域がある。それは、他のステロイドレセプターのＤＮＡ結合領域と思われる領域に高度に類似している。

以下に詳述され、図２に示されるように、少し変えた過程で、ラットＡＲクローンの”全長”を作成すると、ＲＮＡを転写産物として与える構造を生じる。そのＲＮＡは翻訳可能で、７９ｋＤと９８ｋＤの蛋白質を生じる。

Ｂ、ラットの２．７ｋｂのｃＤＮＡの調製及びリガーゼによるクローニングベクターｐＧＥＭ−３Ｚプラク、ミツドへの結合クローンｒＡＲの２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ　　ｃＤＮＡ挿入物は、ＸｍｎＩで消化され、２．３ｋｂのフラグメントを得た。この２．３ｋｂのＸｍｎ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、他のｃＤＮＡクローンの挿入物（ｒＡＲ４のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ挿入部位）のＰｓｔＩでの消化によって得られた４００ｂｐのフラグメントにリガーゼで結合された。この結合された２、７ｋｂのフラグメントは、ＳｍａＩ及びＰｓｔＩ消化されたｐＧＥＭ−３２ベクターに挿入され、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５ａに感染された。Ｅ。

ｃｏｌｉ　　ＤＨ５α細胞は、このプラスミツドでトランスホームされ、このプラスミツドを含むコロニーは、アンピシリン耐性で選択され、増幅された。これらの細胞は、ＥＣ−ｒＡＲ２８３０と呼ばれ、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄ　　ｒ　　ｉ　　ｖ　　ｅ　　、Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　ｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　　２０８５２に、１９８９年１月　２５日に、受理Ｎｏ、６７８７８として、寄託された。図２に記されているように、この構築物は、転写産物に、同じフレーム内の、メチオニンに対応する２つのコドンの２番目の方（ＡＴＧ、と呼ばれる）から翻訳を開始することを許す。

Ｃ，ラットの２．８３ｋｂのｃＤＮＡの調製及びクローニングベクターｐＧＥＭ −３Ｚプラスミツドへの結合ｒＡＲ１の２．４ｋｂのＥｃｏＥＩ−ＥｃｏＲＩｃＤＮＡ挿入物は、ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、１，６８ｂｐのフラグメントを得た。この１．６８ｋｂのＥｃｏ−ＲＩ−Ｈｉｎｄｍフラグメントは、他のｃＤＮＡクローン挿入物（ｒＡＲ６）のＨｉｎｄｎｌとＰｓｔＩでの消化によって得られた１、１５ｋｂのＤＮＡフラグメントと結合された。結合された２゜８３ｋｂのフラグメントは、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化されたｐＧＥＭ　　３Ｚベクターに挿゛入され、Ｅ。

ｃｏｌｉ　　ＤＨ５ａに感染された。Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　（ＤＨ５α）細胞は、このプラスミツトでトラスホームされ、このプラスミツドを含むコロニーは、アンピシリン耐性で選択され、増幅された６図２に記されているように。

この構築物は、転写産物に、同一フレーム内のメチオニンに対応する２つのコドンの最初の方（Ａ　Ｔ　Ｇ　＋　と呼ばれる）から翻訳を開始することを許す。

図３は、ラット及びヒトＡＲクローンのより長い”全長”のＤＮＡ配列のヌクレオチド配列と推定されるアミノ酸配列を与える。

１番目及び２番目のメチオニンに対応するコドンは、ｒＡＲではアミノ酸の１位と１７０位であり、ｈＡＲでは、１位と１８５位である。

例４ヒトＡＲ−タイプ　ｃＤＮＡプラスミツドのウサギ網赤血球溶解系中での転写と翻訳２．６ｋｂ　　ｈＡＲＤＮＡセグメントを含むｐＧＥＭ−３２ベクター（２０ｕｇ）は、例３で述べられたように、制限酵素ＢａｍＨＩで線形化され、フェノール／クロロホルム抽出され、エタノール沈殿された。線形化されたプラスミツドは、４０ｍＭ）　　リ　ス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５、ｅｍＭ　　ＭｇＣ１ｇ　、２ｍＭスペルミジン、ｌｏｍＭ　　ＮａＣ１，１０ｍＭＤＴＴ１５００ｕＭＡＴＰ％ＧＴＰ、およびＵＴＰ。

１６０ユニツトのりポヌクレアーゼインヒビター、５μｇ　プラスミツド、３０ユニツトのＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ　　Ｂｉｏｔｅｃ％Ｍａｄｉ　−５ｏｎ、ＷＩ）及びジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を含み、水を加えて最終体積１００ｕ　ｌとした反応混合物中で、転写された。Ｔ７　　ＲＮＡポリメラーゼがこのプラスミツドＤＮＡの転写に用いられた。なぜならば、Ｔ７プロモーターは、ＳＰ６プロモーターよりも、結合されたＡＲ−ＣＤＮＡの５°−末端の前方−見出されたからである。

この反応は、４０℃で、２時間行なわれた。ＲＱＩＤＮａｓｅｌ　（５ニーｙト）が加えられ、４０℃で、１５分間反応が続けられた。この反応混合物は、フェノール／クロロホルム（１：　１）抽出され、ついで、クロロホルムで抽出された。ＲＮＡ産物は、Ｏ，１体積の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５体積のエタノールを加えて沈殿され、０．５Ｍ　　ＮａＣ１に再懸濁され、そして２．５体積のエタノールで再沈殿された。転写されたＲＮＡは、単離され、それから、ウサギ網赤血球溶解系中で翻訳された。

ＲＮＡの翻訳は、マイクロコツカス　ヌクレアーゼ処理されたウサギ網赤血球溶解系（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ％Ｍａｄｉｓｏｎ％Ｗｌ）のプレーミックス　キット（１００ｕｌ）中で、８ｇｇのｍ　ＲＮ　Ａ　ｓ４０μＣｉの［”ｓｌメチオニン（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ　　Ｃｏ、、ＡｒｌｉｎＡｒｌｌｎ　　）Ｉｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）及びメチオニンを除く各１００μＭのアミノ酸混合物の存在下において、成し遂げられた。放射性メチオニンの取り込みを測定するために、３μｌの反応混合物が１．５％　Ｈ２Ｏ３，１ｍＭ　　メチオニン、及び０．０４％　ウシ血清アルブミンを含む１ｍｌのＩＭ　　ＮａＯＨに加えられた。この混合物は、ｔＲＮＡと結合した［”ｓｌメチオニンを加水分解するために、３７℃で、１５分間インキエベートされた。放射性蛋白質産物は、１ｍｌの２５％　トリクロロ酢酸を加えて沈殿され、沈殿に結合している放射能が測定された。　　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（８％　アクリルアミド　ゲル）分析が、Ｓａｌｔｚｍａｎら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６２Ｉｔ！、４３２ページ（１９８７）に記載されたようにして行なわれ、翻訳された産物の８５％以上が７９ｋＤの蛋白質であることが見出された。

例５７９ｋＤのｈＡＲ蛋白質の合成アンドロジエンへの結合活性クローン化ＤＮＡによってコードされた蛋白質のステロイド結合活性を調べるために、例４の網赤血球溶解系は、新しく合成された蛋白質を含んでいるが、１７ α［１Ｈ］−メチル−１７β−エストラ−４，９゜１１−トリエン−３−オン（［”　ＨＩ　Ｒ１８８１）、ＡＲと高い親和性を持って結合する有効な合成アンドロジエンとインキュベートされた。［Ｌｉａｏら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４８巻、６１５４ページ（１９７３）］特異的に、このクローン化ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡは、例４で述べられたようにして、ウサギ網赤血球溶解系中で翻訳され、この溶解物のアリコートは、５βＭ　　［’　Ｈｌ　Ｒ１８８１（８７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と、２５βＭ、５０ βＭ、または２５０βＭの非放射性ステロイドの非存在化で、または存在化で、インキュベートされた。最終的インキュベーション体積は１００ＬＬｌであった。放射性アンドロジエンの結合は、Ｌｉａｏら、Ｊ、５ｔｅｒｏｉｄ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２０巻、１１ページ（１９８４）で述べられたように、ヒドロキシルアパタイト−フィルター法で測定された。

その結果は、非放射性ステロイドを添加しない、コントロールの管の中に結合した放射能（５０００ｄ　ｐｍ）に対するパーセンテージとして表わされ、表１に列挙されている。

表１クローン化ｃＤＮＡにコードされたｈＡＲのアンドロジエン特異的な結合加えられた　　　［”　ＨＩ　Ｒ１８８１の結合（コントロ非放射性　　　　− ルに対するパーセンテージ）ステロイド　　　　　２５βＭ　　５０βＭ　　２５０βＭＲ１８８１１３１０１５α−ジヒドロ　　　２５　　　１７　　　　　６テストステロン５β−ジヒドロ　　　８９　　　８９　　　　８１テストステロン１７β−エストラ　　９１　　　９１　　　　８６ジオールプロジエステロン　１００　　　９１　　　　９２デキサメタシン　　１００　　　９３　　　　９３ヒドロコーチシン　　９６　　　９０　　　　９０テストステロン　　　３８　　２８　　試験してない表１に示されるように、活性な天然アンドロジエン、１７β〜ヒドロキシ−５α−アントロスタン−３−オン（５ α−ジヒドロ−テストステロン）は、［３Ｈ］Ｒ１８８１の結合に対して、よく競争するが、不活性な５β−アイソマーは、よ（競争しなかった。これは、それがＡＲと強く結合していないことを示唆している。結合活性はステロイド特異的であった。デキサメタシン、ヒドロコーチシン、プロジェステロン、及び１７β −エストラジオールは、７９ｋＤの蛋白質への結合において、放射性アンドロジエンと良く競争しなかった。

類似のステロイドの結合特異性も、クローン化ｃＤＮＡによってコードされたｒＡＲについて観察された。Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８５巻、７２１１−７２１５ページ（１９８８）ヒドロキシルアパタイト　フィルター　アッセイ法を用いて、約−分子の３ＳＳ −ラベルされた７９ｋＤのこの溶解物から得られた蛋白質が約−分子のトリチウム化されたアンドロジエンとリガンドの飽和濃度において結合するということが、観察された。スキャッチャード　プロット分析によると、見掛けの解離定数は０．３１βＭであった。これは以前に、５ｃｈｉ　ｌ　ｌ　ｉｎｇら、Ｔｈｅ　　Ｐ　ｒ　ｏ　ｓ　ｔ　ａ　ｔ　ｅ、５巻、５８１ページ（１９８４）によって、ラットの腹部前立腺のＡＲについて報告された結合定数（０，６５βＭ）と似ている。

例６７９ｋＤの蛋白質のヒト自己抗体への結合活性い（らかの前立腺癌の老人は、その血清試料中に、高い力価のＡＲに対する自己−免疫抗体を持つ、ということは、以前に報告された。［Ｌｉａｏら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８２巻、８３４５ページ（１９８５）］　　それゆえに、ヒト自自己体が網赤血球溶解系で作られた７９ｋＤの蛋白質を認識する能力が、調べられた。例４の溶解系中で作られたレセプター蛋白質は、［”　ＨＩ　Ｒ１８８１と、放射性アンドロジエン−アンドロジエンレセプター（Ａ−ＡＲ）複合体を形成するためにインキュベートされ、それから、自己抗体を含む血清と混合された。

翻訳されたＡＲを含む網赤血球溶解物は、例４に述べられたように、［”ＨＩＲ１８８１とインキュベートされ、それから、再び、ＡＲに対する抗体（抗−ＡＲ血清）を含む５ｕｌのヒト男性の血清の存在下で、または、非存在下で、４℃で、４時間、インキュベートされた。抗−ヒト免疫グロブリン（抗−ＩｇＧ）を含むウサギ血清が、それから、第二抗体として加えられた。４℃で、１８時間のインキュベーションの後で、混合物は遠心分離され、沈殿に結合した放射能が定量された。抗−ＡＲ抗体を含まない、ヒト女性の血清も、比較に用いられた。

下の表２に示された結果は、高力価のヒト血清及びウサギの抗−ヒト免疫グロブリンＩｇＧの両者の存在下における放射性Ａ−ＡＲ複合体の定量的免疫沈降を示している。５ＤＳ−ＰＡＧＥによると、免疫沈降した蛋白質が７９ｋＤの蛋白質であることも観察された。

表２クローン化ｃＤＮＡの転写によるＲＮＡの翻訳によって作られたｈＡＲの抗−ヒト免疫グロブリン依存性の沈降［”　Ｈ］　Ｒ１８８１抗血清　　　　免疫沈降されたとインキュベート　　の添加　　　　放射能（ｄｐｍ）された試料ｃＤＮＡに　　　　　無し　　　　　　　　　　３２コードされた　十抗−ＡＲ血清＋抗−ＩｇＧ　　８２１２ＡＲ’　　　　　子女性の血清＋抗−ＩｇＧ　　　　４３０＋抗＝ＩｇＧ　　　　　　　　　　　８加熱された　　十抗−ＡＲ血清＋抗−ＩｇＧ　　　　４２ＡＲ” ＢＭＷ溶解物０＋抗−ＡＲ血清＋抗−ＩｇＧ　　　２０４ａ　　８５００ｄｐｍの作られた放射性ＡＲ複合体が用いられた。

ｂ　　ＡＲを含む網血球溶解系はレセプターを不活性化するために５０℃で２０分間加熱され、抗血清の添加前に結合した放射性アンドロジエンを放出した。

Ｃブロム　モザイク　ウィルス（ＢｒｏｍｅＭｏｓａｉｃ　　Ｖｉｒｕｓ）ＲＮＡが、網赤血球溶解物翻訳系中で、クローン化ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡの代わりに用いられた。

例７ＴＲ２−ｃＤＮＡの特徴付は得られた４０個以上のＴＲ２−タイプのヒトｃＤＮＡクローン、それは例１で述べられた３０個を含むが、の内のＴＲ２−５と呼ばれるクローンは、図４に示されるように２０２９塩基対の長さを持つことが見出された。最初のＡＴＧとターミネータ−ＴＡＡの間のオーブン　リーディング　フレームは、５２ｋＤと計算される分子量を持つ４８３個のアミノ酸をコードできる。推定上のＤＮＡ結合領域はアンダーラインを引かれた。推定上のイニシェーク−ＡＴＧは、活性開始コドンに対するＫｏｚａｋのコンセンサス配列（ｃｏｎ−ｃｅｎｓｕｓ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ）とよく整合した。

［Ｋｏｚａｋ％Ｎａｔｕｒｅ、３０８巻、２４１ページ（１９８４）を見よ］　このＡＴＧコドンの二つ上流のトリブレットは、同一フレーム内のターミネータ −（ＴＡＡ）であるが、更に、ＡＴＧのイニシェークー機能を支援している０例１の３０個のＴＲ２−タイプのクローンからの１１個は、ＴＲ２−７と呼ばれるクローンによって表わされるが、ヌクレオチド配列６６９と６７０の間に最初の４２９ｂｐの挿入を含む、（図４にアスタリスクで示されている）　この挿入は、終止コドンＴＡＧをもたらす（脚注の挿入配列にアンダーラインが引かれている）。それは、オーブン　リーディングフレームを、２０ｋＤと計算される分子量の１８４アミノ酸に減じる。これらの１１個のＴＲ２クローン中の挿入（または、他の１９個のＴＲ２クローン中の欠失）は、ヒト精巣中の二つのｍＲＮＡの存在、または、ｃＤＮＡ構築中のアーティファクトの存在を表わす。

３°−非翻訳領域には、ＴＲ２−５クローンのヌクレオチド配列２０００と２００７の間に真核生物のポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡが存在する。

推定上のリガンド結合領域のオーブン　リーディングフレームについてのＴＲ− ２の他の変異が、得られた。

これらのあるものは、新しいホルモンのレセプター、または細胞性エフェクターをコードするかもしれない。

ＴＲ２−ｃＤＮＡ配列の知識が、他の細胞性レセプター、遺伝子、及び、正常及び病気の器官の両方における細胞の成長と機能を制御するリガンド（内因性のものまたは治療薬）の単離と構造分析に利用されるということが期待される。

図５は、ヒトアンドロジエンレセプター、糖質コルチコイドレセプター、鉱質コルチコイドレセプター、プロジェステロンレセブター、ニストロジエンレセプター、ヒトＴＲ２蛋白質、ラットＡＲ、ニワトリビタミンＤレセプター（ｃ−ＶＤＲ）、及びトリ赤芽球症ウィルスのＶ−ｅｒｖＡオンコジーン産物のシスティンに富むＤＮＡ結合領域のアミノ酸配列の整列を描く、左端の数字は個々のレセプターにおけるアミノ酸残基の位置を表わす、共通の残基は実線で囲まれている０点線で囲まれた残基は実線で囲まれたもののうちで共通でないものを表わす。ｖ −ｅｒｖＡは星印を付けた位置に二つ多いアミノ酸を持つ。

この領域には、いくらかのアミノ酸が異なるコドンな使用するにも関わらず、ヒト及びラットのＡＲのｃＤＮＡは同一のアミノ酸配列を持つ、この領域においても、ヒトＡＲまたはラットＡＲと他のレセプターとの相同性は次のとうりである：糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）　、７６．４％；鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）　、７６．４％；ブロジエステロンレセブター（ＰＲ）、７９．２％；ニストロジエンレセプター（ＥＲ）、５５．６％、ＴＲ２，４５，８％；トリビタミンＤレセプター（ｃ−ＶＤＲ）　、４０．３％；そして、トリ赤芽球症ウィルスのｖ−ｅｒｖＡオンコジーン産物、４０．３％　ステロイドが結合する推定上の領域では、それはステロイドレセプターの−ＣＯＯＨ末端付近に約２００個のアミノ酸を持つが、ヒトＡＲまたはラットＡＲとｈＧＲ，ｈＭＲｌまたはｈＰＲとの間の相同性は約４５−５５％である。ところが、ヒトＡＲ及びラットＡＲとｈＥＲとの間の相同性は２０％より低い。

従って、ヒト及びラットＡＲは、ｖ−ｅｒｖＡまたは、ニストロジエン、ビタミンＤ及び甲状腺ホルモンのレセプターよりも、ＧＲ，ＭＲ５及びＰＲと密接に関係するらしい。

ＴＲ２のＤＮＡ結合領域（アミノ酸１１１〜１８３）は、次の様にステロイドレセプター　スーパー　ファミリーと高い相同性を持つ：レチノイン酸しセプターｆＧｉｇｕｅｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３３０巻、６２４ページ（１９８７）３．６５％；甲状腺ホルモンレセプター（Ｔｓ　Ｒ）［Ｓａｐら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻、６３５ページ（１９８７）１．５９％；鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）、［Ａｒｒｉｚａら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３５巻、２６８ページ（１９８７）］、５４％；ビタミンＤ３レセプター（ＶＤｓ　Ｒ）［ＭｃＤｏｎｎｅ　ｌら、５ｃｉｅｎｃｅ。

２３５巻、１２１４ページ（１９８７）］、５３％；ｈＥＲＲ１及びｈＥＥＲ２、（Ｇｉｇｕｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１巻、９１ページ（１９８８）コ、５１％、：ニストロジエンレセプター（ＥＲ）、［Ｈｏ　１１　ｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３１８巻、６３５ページ（１９８５）、５１％；糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）［Ｈｏｌ　ｌｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３１８巻、６３５ページ（１９８５）］、５０％；アンドロジエンレセプター（ＡＲ）、５０％；ブロジエステロンレセブター（ＰＲ）、４９％；　　［Ｌｏｏｓｆｅｌｔら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’　　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ｔＪｓＡ）、８３巻、９０４５ページ（１９８６）］　　図５に記されているように、推定上のＤＮＡ結合領域の２０個のアミノ酸（９個のＣｙＳ、３個のＡｒｇ、２個のＧｌｙ、２個のＰｈｅ、１個のＬｙｓ、１個のＭｅｔ、１個のＡｓｐ、１個のＨｉｓ）の位置はすべての単離された甲状腺ステロイドレセプター遺伝子間において同一である。この高度に保存された領域はＤＮＡ結合フィンガーの形成に関与するであろうということが提案された。Ｗｅｉｎ−ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１８巻、６７０ページ（１９８５）を見よ。他方のステロイドレセプターと同様に、ＴＲ２は甲状腺ホルモンレセプターのＤＮＡ結合領域にのみ見出される二つの余分なアミノ酸（Ｌｙｓ−Ａｓｎ）は持たない。Ｓａｐら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻、６３５ページ（１９８７）を見よ。

例８ＴＲ２ｃＤＮＡの　イン　ビトロの転写と翻訳クローンＴＲ２−５及びＴＲ２− ７由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡ挿入物は、単離され、本質的に例３に述べられたようにして　イン　ビトロでの転写のために、ＥｃｏＲＩ消化されたｐＧＥＭ−３２ベクターに結合された。これらのプラスミツドでトランスホームされたＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５ａ細胞は、ＥＣＴＲ２−５及びＥＣＴＲ２−７と呼ばれ、Ａｍｅｒ−ｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃ　−ｔｉｏｎ、１２３０１　　Ｐ　　ａ　　ｒ　　ｋ　　１　　ａ　　ｗ　　ｎＤｒｉｖｅ％　Ｒｏｃｋｖｉ　１１ｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に、１９８９年１月２５日に、加盟Ｎｏ。

６７８７７及び６７８７６として寄託された。

転写されたＲＮＡは、それから、ウサギ網赤血球溶解系で翻訳された。５ＤＳ− ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、ＴＲ２−７の主な翻訳産物は、内部に４２９ｂｐの挿入を持つが、２０ｋＤの蛋白質であることが見出された。ＴＲ２−５の主な翻訳産物は５２ｋＤの蛋白質であった。

これらの翻訳産物を更に特徴付けるために、翻訳溶解物はＤＮＡセルロースカラムに通された。結合産物は、それから、溶出され、濃縮され、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥに掛けられた。その結果は、翻訳された蛋白質はまさにＤＮＡ結合蛋白質であることを示した。

例９ＴＲ２−５ｃＤＮＡ発現産物の結合活性ＴＲ２−５クローンの翻訳産物のステロイド結合活性を調べるために、その産物は、アンドロジエン、プロジェステロン、糖質コルチコイド、及びニストロジエンを含むすべての主要なりラスのステロイドとインキュベートされた。しかし、上記のステロイドとの意味のある結合は観察されなかった。このことは必ずしもこの蛋白質のステロイド結合能を否定するものではない。恐らく、ＴＲ２−５発現産物のステロイド結合活性は何らかの翻訳後修飾と関連しており、ウサギ網赤血球溶解系中にはそれが欠如していたのであろう。ＴＲ２−５の翻訳された蛋白質は、ステロイド非依存性であるか、または、ヒト精巣またはラット腹部前立腺に存在する未確認のリガンドと結合するかのどちらかであろう。

ＴＲ２ｍＲＮＡの大きさは、ＴＲ２−５ｃＤＮＡ挿入物をプローブとして、ノーザンブロッティング分析によって決定された。一本の２．５ｋｂの一バンドが検出された。それは５２ｋＤの蛋白質をコードするのに十分な配列情報を含んでいるに違いない、ＴＲ２ｍ　ＲＮ　Ａの組織別の分布もドツト−ハイブリダイゼーション゛によって分析された。このハイブリダイゼーションは、デンシトメーターでオートラジオグラフをスキャンすることによって可視化され１個々の点は切り出されて、放射能が液体シンチレーションカウンターによって計測された。［Ｃｈａｎｇら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、２６２巻、２８２６ページ（１９８７）を見よ。］その結果は、ＴＲ２ｍＲＮＡは他の組織に比べて、ラットの腹部前立腺に多いことが示された：前立腺　１００％；精嚢　９２％；精巣　４２％：顎下線１８％；肝臓　１３％：腎臓　く　１　％　：　そ　し　て子宮　〈１％。

例１０ラット腹部前立腺のＡＲ及びＴＲ２のｍＲＮＡレベルのアンドロジエンによる制御の分析ラットの腹部前立腺はアンドロジエン感受性器官であり最大量のＡＲ及びＴＲ２ｍＲＮＡを含んでいるので、アンドロジエンの枯渇と補充のｍＲＮＡレベルに対する影響がＲＮＡドツトハイブリダイゼーションとノーザンブロッティング分析によって調べられた。全ＲＮＡが正常ラット、去勢されたラット、及び前辺て去勢してから５α−ジヒドロテストステロン（１７β−ヒドロキシ−５α−アントロスタンド−３−オン）処理されたラットの腹部前立腺から抽出された。ＤＮＡの単位量あたりのＡＲｍＲＮＡレベルは、去勢後２日以内に、正常ラットのレベルの２００〜３００％に増加した。去勢されたラットへの５α−ジヒドロテストステロンの投与（５ｍｇ／ラット７日）は、ＡＲｍＲＮＡのレベルを正常ラットのそれにまで減じた。ＴＲ２ｍＲＮＡレベルは、ＤＮＡの単位量当たり、去勢後２日以内に、正常ラットの１７０％に増加した。５α−ジヒドロテストステロン（５ｍｇ／ラット７日）の去勢されたラットへの注射は、ＴＲ２ｍＲＮＡを正常ラットのレベルにまで減じた。興味深いことには、前立腺の全ＲＮＡレベルは、同じ期間に、正常レベルの４０％に減少した。前立腺のＴＲ２ｍＲＮＡレベルに対するアンドロジエンの影響は、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）の注射の実験によって更に確かめられた。フルタミド、抗−アンドロジエン物質であり去勢されたラットの腹部前立腺重量に対する５α−ジヒドロテストステロンの影響を相殺する［Ｎｅｒｉら、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｕｒｏｌ、　、１０巻、１２３ページ（１９７２）］、が正常ラットに２〜６日にわたって注射された。それから、ＴＲ２ｍＲＮＡレベルが、上述のように、ドツトハイブリダイゼーションによって測定された。その結果は、フルタミドの注射は、去勢と同様に、ＴＲ２ｍＲＮＡレベルを増加させることを示した。ＡＲまたはＴＲ２蛋白質のレベルの変化は、ｍＲＮＡの安定性と利用における変化、または遺伝子転写の制御における変化に起因するのであろう、アンドロジエンによって特定の遺伝子が同じ器官において異なる程度に活性化または不活性化されることは、アンドロジエンが標的細胞における遺伝子発現のパターンの構築に関与することを示唆する。もし、アンドロジエンの仲介する遺伝子抑制の機構が前立腺の発育に関係するならば、その機構と遺伝子構造の研究、抑制されたＡＲとＴＲ２ｍＲＮＡの研究は、正常及び異常な前立腺及び他のホルモン感受性器官におけるアンドロジエン作用のよりよい理解をも与えるであろう。

ＡＲ及びアンドロジエン感受性遺伝子の構造における欠陥、及び／またはこれらの遺伝子の産物の産生と機能の制御の欠如もまた、前立腺癌のような、アンドロジエン感受性または非感受性の腫瘍の異常な発育の原因となり得る。従って、この方向の研究は、患者のための新しい診断法及び治療法を考案するのに有用である。

例１１クローン化ＡＲ−遺伝子及びアンドロジエン感受性遺伝子の真核及び原核細胞における発現クローン化された遺伝子が、は乳動物、酵母、及び細菌細胞へ導入されたときに、機能する能力は、遺伝子の機能と制御機構の理解にとって非常に有益であると判明した。組換え技法は、天然の源からは容易に得られない遺伝子発現産物（蛋白質）を、大量に、供給できる。細菌の系は、最適の生物学的活性のための本質的な翻訳後修飾を必要としない蛋白質の大規模な生産に非常に有用であるが、真核細胞系は、その発現された蛋白質を機能する形態にまで正確に修飾する能力があるので、特に有利である。

良く知られた技法を用いて、ＡＲ−ｃＤＮＡ及びＴＲ２−ｃＤＮＡは、容易に遺伝子産物の大規模な生産に利用できるであろう。この目的のために、もつとも有効な転写単位が、様々な宿主細胞中で機能できる制御信号を持つ非ウィルス性ベクターと同様にウィルス性ベクターを用いて、構築された。ＳＶ４０、ｐＳＶ２、アデノウィルス、及びウシパピローマウィルスＤＮＡが、多くの真核遺伝子な真核細胞に導入し、それらを制御された遺伝的環境で発現させるために用いられ、成功した。

これらの及び類似の系は、ＡＲ−及びＴＲ２−遺伝子の発現にとって適当であると期待される。遺伝子の移動を助けるために、二つのもつとも広く用いられている方法である”燐酸カルシウム沈殿法”と”ＤＥＡＥ−デキストラン技法”が使用できる。遺伝子は、細胞に短期的に導入モき、その場合は３日間まで発現が続くが、あるいは、もっと永久的に導入して安定にトランスホームされた細胞系統を作り得る０発現された蛋白質はアンドロジエン結合法によって、または抗体アッセイ法によって検出され得る。

クローン化ＡＲ−遺伝子の発現は、下記のように、真核細胞系で達成された。ＮＩＨ３Ｔ３　細胞は、ＮＩＨ３ｗｉｓｓマウス胚から確立された接触阻害性を持つ細胞であるが、ｐＢＰＶＭＴＨベクターへ挿入されたｈＡＲｃＤＮＡで、Ｇｏｒｍａｎ、”　ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ”、２巻、１４３−１９０ページ、Ｇｌｏｖｅｒ編；　　（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｗａｓｈｉｎｇ−ｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，１９８５）に述べられたようにしてコトランスフエクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓ−ｆｅａｔ）された。トランスフェクトされた細胞は、クローン化され、多穴（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｗｅｌ　ｌ）細胞培養プレート中で生育された。約１００種の個別の細胞系統が単離された。これらのうちの６種は、［”Ｈ］Ｒ１８８１−結合活性が、ｐＳＶベクター単独で、すなわちｈＡＲｃＤＮＡ配列を用いないで、トランスフェクトされた細胞のそれの少なくとも４倍であることが示された。

原核細胞系でＡＲｃＤＮＡを発現させるために、ｈＡＲ及びｒＡＲｃＤＮＡは、ｐＵＲ，えＧＴＩＩ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＫＫ２３３−２、ｐＬＥＸ。

ｐＡＴＨｌ、ｐＡＴＨ２、ｐＡＴＨ１０、及びｐＡＴＨｌｌを含む多くの発現ベクターに挿入された。

ＡＲｃＤＮＡを挿入されたベクターは、Ｅ、ｃｏｌｉ系統（ＪＭ１０９、ＤＨ５ａ、　Ｙ１０８９、ＪＭ１０５、及びＲＲＩ）に感染させるのに用いられた。ポリアクリルアミド　ゲル　電気泳動によれば、感染された細菌は、ＡＲｃＤＮＡ挿入物によってコードされたＡＲフラグメントを合成できる。　これらのＡＲポリペプチドのあるものは培養中に劣化される。アミノ末端、ＤＮＡ−結合、及びアンドロジエン結合領域は、例１２に述べられるように、これらの領域を表わす融合蛋白質を構築するのに用いられた。

例１２ＡＲに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体の産生アンドロジエン感受性器官からの意味のある量のＡＲの単離は、非常に困難であった。従って、ｈＡＲまたはｒＡＲのｃＤＮＡの高レベルな発現は、例１１に示されたように、ＡＲの大規模な生産の理想的な方法と期待される。更に、ＡＲ分子の蛋白質の推定されるアミノ酸配列と同一の配列を持つオリゴペプチドは、安価に大量に化学合成できる。真核及び原核細胞中の発現ベクターによって産生されたＡＲと化学合成されたＡＲオリゴペプチドは、共に、モノクローナル抗体の産生のための抗原として、以下に詳述されるように、用いられた。

一般的に、いくらかの化学合成されたオリゴペプチドは、ＡＲに特異的な配列を表わす（すなわち、ＰＹＧＤＭＲＬＥＴＡＲＤＨＶＬＰ　　、ＣＰＹＧＤＭＲＬＥＴＡＲＤＨＶＬＰ　、及びＳ　Ｉ　ＲＲＮＬＶＹＳＣＲＧＳＫＤＣＩＩＮＫ）が、それらはＢＳＡ及びＫＬＨキャリアー蛋白質に結合され、マウスを免疫するのに用いられた。これらのマウスの膵臓細胞は、ミエローマ細胞と融合され、ハイブリッドの抗体産生細胞が作られた。４つの雑種培養の上清のＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノアッセイ）による分析は、ラット腹部前立腺のＡＲと相互作用する免疫グロブリンの存在を示す、ということが明らかとなった。これらのモノクローナル抗体を産生ずる細胞は、前辺てブリスタンで処理されたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔に、注射できることが予想される。それから、腹水が採取され、硫酸アンモニウムで沈殿され得る。

アンドロジエンレセプター融合蛋白質のＥ、ｃｏｌｉにおける発現ＡＲ遺伝子の３つの異なる部分（Ｎ−末端領域、ＤＮＡ結合領域、及びアンドロジエン結合領域を含む）は、ｔｒｐＥ遺伝子（ｔｒｐＥプロモーター−ｔｒｐＥコード領域の最初の９６９ｂｐ−ｐＵｃｌ　２の多重クローニング領域）のＮ− 末端側の半分に、同じフレームで、ｐＡＴＨ発現ベクターを用いて、それぞれ図６．７、及び８に示されるように融合された。Ｄｉｅｃｋ−ｍ　ａ　ｎ　ｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６０巻、１５１３ページ（１９８５）　　これらの構築は、Ｎ−末端領域の一部を含む約２５ｋＤａのＡＲ、ＤＮＡ結合領域の主要な部分を含む２９ｋＤａのＡＲ，及びアンドロジエン結合領域の一部を含む１２ｋＤａのＡＲの、３３ｋＤａのｔｒｐＥ蛋白質への融合を生じた。ｔｒｐＥ蛋白質は不溶性なので、部分的に、精製され、誘導された融合蛋白質は、単に、Ｅ、ｃｏｌｉの溶解と不溶性の融合蛋白質の沈殿によって得られた。５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動の後で、誘導された融合蛋白質、すなわちコントロールｐＡＴＨベクター（ＡＲ遺伝子を挿入されてない）中には存在しない蛋白質、はゲルからスライスされ、それから免疫処理に用いられた。

この特に例示された３つ以外の融合蛋白質もまた、これらの方法を用いて構築され得る。

抗−ＡＲ抗体の産生と精製ウサギ、ラット、及びマウスは、５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル　スライスが含んでいる変性された融合蛋白質、または泳動溶出された５ＤＳ−フリーの融合蛋白質で、他の蛋白質精製法によって得られた融合蛋白質と同様にして、免疫された。抗血清中の融合蛋白質に対する抗体の存在はＥＬＩＳＡによってアッセイされた。

高い力価の陽性の血清は、更に、二抗体沈降法で、ラット腹部前立腺サイドシルの［”Ｈ］ＡＲを抗原として、アッセイされた。その結果は、１μｍの粗血漬はｌＯ〜２０ｆｍｏｌｅの［”ＨｌＡＲを沈降させるということを示した。それから、抗−ＡＲ粗血清は、免疫血清の特異的な懸濁液によって、親和性によって精製された。その免疫血清は、ＰＡＴＨベクターによって発現されたｔｒｐＥ蛋白質（ＡＲ配列を含むものも、含まないものも）を含んでいる。結合した抗体は、ｔｒｐＥ蛋白質が不溶性なので、懸濁液から除去できる。ｔｒｐＥ蛋白質にのみに特異的な抗体は除去された。ＡＲに特異的な抗体は単離され、再びＥＬ　Ｉ　ＳＡ及び二抗体沈降法によって確認された。

抗−アンドロジエンレセプター　モノクローナル抗体の産生免疫されたラットは、その血清がＥＬＩＳＡによって、抗−ＡＲ抗体陽性と検定されたときは、すぐに、融合のために犠牲にされることが判定された。膵臓は取り出され、すり潰されて、細胞はＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ　　Ｍ　　ｏ　　ｄ　　ｉ　　ｆ　　ｉ　　ｅ　　ｄＥｎｇｌｅ’ｓ　　Ｍｅｄｉｕｍ）中に放された。

ＤＭＥＭ＋フィコール　ハイバーク（ＦｉｃｏｌｌＨｙｐａｑｕｅ）を含むＤＭＥＭを用いての一連の遠心分離を通して、この膵臓細胞は単離された。Ｓ　Ｐ　２１０ミエローマ細胞は、生育され、分割され、そして２０％ＦＣＳ、１％　ＭＯＰ　Ｓ、及びＩＸＬ−Ｇｉｎを含む５０ｍ１のＤＭＥＭ中に、融合の２日前に、希釈された。Ｓ　Ｐ　２１０細胞（５Ｘ　　１０”）と５Ｘ　　１０’の膵臓細胞が融合に使われた。−晩インキユベートした後で、融合した細胞が集められ、ＩＸＨ−Ｔ、１×　メトトレキセート、２０％　ＦＣＳ、及びＩＸ　　ＰＢＳを含むＤＭＥＭ中に懸濁され、そして９６−穴のプレートに分配された。プレートは、６日後に、ＤＭＥＭと２０％ＦＣＳを補われた。バイプリドーマは、Ｅｎｇｒａｌｌら、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、ｅｔＢｉｏｐｈｙｓ、ＡＣＴＡ、２５１巻、４２７−４３９ページ（１９７１）のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、同定され、アッセイされた。このアッセイにおいて、プレートは、ＡＲ融合蛋白質またはｔｒｐＥ蛋白質でコートされた。それは、抗原として働き、ＥＬ　Ｉ　ＳＡリーダー上で読まれた。

ＡＲ融合蛋白質で陽性反応を引き起こされたバイプリドーマのみが、１０　　細胞／ｍｌの濃度まで”限界希釈”され（１１ｍ１ｔ　　ｄｉ　１ｕｔｅｄ）　、それから、９６−穴プレートの半分にわたって分配された。残っている細胞は、元の穴から、２４−穴プレートに移された。これらのプレートはそれぞれ、胸腺細胞の支持細胞層を有した。この胸腺細胞層は、注射されていないラットから単離された胸腺細胞から作られ、遠心分離によって精製され、１２００〜１４００　　ＲＡＤＳの放射線照射を受け、そして２０％　ＦＣＳを含むＤＭＥＭでＩＸ　　１０’　　細胞／ｍｌに希釈された。

これらの胸腺細胞を有する９６−穴プレートからの陽性のものは、再びＥＬ　Ｉ　ＳＡによって試験された。このＡＲ融合蛋白質での再試験で陽性のもののみが、モノクローナル抗体の精製用に育成された。３つの穴がＡＲに対するモノクローナル抗体を産生じた。ＥＬＩＳＡ及び二抗体アッセイは、ともに陽性であった。このモノクローナル抗体は、ＡＮＩ−６、ＡＮＩ−７、及びＡＮＩ−１５と呼ばれ、この３つの細胞系統は、ＨＡＮＩ−６、ＨＡＮＩ−７、及びＨＡＮＩ−１５と呼ばれ；それぞれ、加盟Ｎｏ、１０％０００；９．９９９；及び１０．００１；として１９８９年１月２５日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ　　ｌ　　−ｔｕｒｅ　　Ｃｏｌ　１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　　ＤｒｉｖｅＲｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　　２０８５２に寄託された。

抗−ＡＲ抗体の特異性ショ糖密度勾配遠心が、この３つのモノクローナル抗−ＡＲ抗体の特性とそれらの非変性［”　Ｈｌ　ＡＲとの反応性を特徴付けるために用いられた。

サイドシルは、去勢されたラットの腹部前立腺から、下記のようにして調製された。ラッ、トは、麻酔下で、陰嚢法によって、去勢された。それらは、１８時間後に、頚椎脱臼によって殺され、腹部前立腺が取り出されて、ハサミでミンスされ、バッファーＡ　（５０ｍＭ　　燐酸ナトリウム、ｐＨ７，５，１、ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　　２　ｍ　ＭＤＴＴ、１０ｍＭ　　モリブデン酸ナトリウム、１０％（Ｖ／Ｖ）　　グリセロール、及び１０ｍＭ　　フッ化ナトリウム）中で洗われ、組織の体積の２倍のバッファーＡ＋０．１ｍＭ　　バシトラシン、１ｍＭ　　ＰＭＳＦ、及びアプロチニン（ＩＴＩＵ）中でホモゲナイズされた。

ホモジェネートは、５、ｏｏｏｘ　　ｇ　　で１０分間遠心分離され、１０ｎＭ ”Ｈ−アンドロジエンに調製され、２２５、ｏｏｏｘ　　ｇ　　で４５分間遠心され、そしてデキストラン−コートされた木炭で処理された。′Ｈ−Ａ−ＡＲ複合体を含む１００ｕ１のサイドシル溶液は、１００μｍの精製された抗−アンドロジエンレセプターモノクローナル抗体、ＡＮＩ−６（組織培養培地の２０倍の濃度）と６時間インキュベートされた。ショ糖密度勾配遠心は、２５７．０ＯＯＸ　　ｇ　　で、１６時間、４℃で、２０ｍＭ　　）　　リス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　　ＤＴＴ、ｌ　０％（ｖ　／　ｖ　）　　グリセロール、及び０．４Ｍ　　ＫＣＩを含むリニアーな５−２０％（Ｗ／Ｖ）のショ糖勾配で行なわれた。勾配は、フラクションに分けられ、底から番号が付けられ、そしてフラクションごとに０．２ｍｌが集められた。得られた結果は、これらの３つのモノクローナル抗体、ＡＮＩ−６、ＡＮＩ−７、及びＡ　Ｎ　１ −１．５は認識され、放射性ラベルされたアンドロジエンレセプター（［”　ＨＥ　ＡＲ）と効果的に結合されるということが示された。

この［”　ＨＥ　ＡＲ及び他のステロイドレセプター複合体は、０．４Ｍ　　ＫＣＩを含むショ糖勾配中で、約４−５８の沈降係数を有した。抗−ＡＲ抗体は、４−５８の沈降係数を、ラット肝臓の［３ＨＥ糖質コルチコイドレセプタ一複合体、ＭＣＦ−７細胞のニストロジエンレセプター複合体、及びＴ４７Ｄ細胞のプロジェステロンレセブター複合体に対しては変化させなかったが、ラット腹部前立腺の［”　ＨＥ　Ａ−ＡＲ複合体の沈降係数を４８から９−１２Ｓまたはより重たい単位へとシフトさせた。５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動分析によって、ヒト及びラットＡＲｃＤＮＡのすべての主要なイン　ビトロでの転写／翻訳産物は抗−ＡＲ抗体によって免疫沈降され得るということもまた見出された。

例１３ヒト及び動物の器官及び癌細胞中の異常の研究におけるＡＲｃＤＮＡとＴＲ２ｃＤＮＡのプローブとしての使用転移性の前立腺癌患者は、最初は、アンドロジエン撤去治療（去勢または抗アンドロジエン処理）にしばしば順調に応答する。しかしながら、殆どの患者は、結局、アンドロジエン−状態（ａｎｄｒｏｇｅｎ− ｓｔａｔｅ）が再発し、それには、有意に生存率を増加する化学療法は使用できない。アンドロジエン−非依存性または一非感受性の癌細胞の源に係わらず、病気の細胞におけるアンドロジエン非感受性または異常性が、（ａ）ＡＲまたはＴＲ２遺伝子における、または、（ｂ）それらの転写または翻訳の制御における、または、（ｃ）他の細胞性因子における定性的または定量的変化によるものかどうかを理解することは重要である。

ＡＲｃＤＮＡ％ＴＲ２ｃＤＮＡ、またはそれらの部分的セグメントは、これらの研究において、特異的なプローブとして使用できる。

ＡＲまたはＴＲ２遺伝子の分析のために、標的器官、腫瘍、及び培養細胞から単離された高分子量のゲノムＤＮＡは、ＡＲ遺伝子の同定と特徴付けに使用できる。

種々の制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを分割するのに使用できる。フラグメントは、サザーン分析（アガロース電気泳動からニトロセルロースへの移動及びＡＲｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション）によって分析できる。同定のあとで、選択されたフラグメントは、クローン化され、そして配列分析され得る。ＡＲまたはＴＲ２ｃＤＮＡの適当なオリゴヌクレオチドフラグメントをブライマーとして、正常または異常な器官または細胞から単離されたゲノムＤＮＡを特異的なりＮＡポリメラーゼによって増幅することも可能である。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されたゲノムＤＮＡは、それから、配列の異常を同定するために分析され得る。５ａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０巻、１３５０ページ（１９８５）；Ｍｕｌｌｉｓ、アメリカ特許Ｎ００４．６８３．２０２　；　１９８７年７月２８日及びＭｕｌｌｉＳ、アメリカ特許Ｎ０９４．６８３．１９５．１９８７年７月２８日も見よ。ＡＲまたは関係する蛋白質のｍＲＮＡを分析するために、ドツト　ハイブリダイゼーション及びノーザン　ハイブリダイゼーション分析が、ｍＲＮＡ及びＡＲまたはレセプタ一様分子の定量的及び定性的な特徴付けに用いられた。これらの研究から、アンドロジエン非感受性及び感受性の腫瘍細胞におけるＡＲ遺伝子及びそれらの発現の種々の形態の数に関する重要な情報が得られる。

アンドロジエン感受性及び非感受性の腫瘍、及び精巣雌性化症候群のラット及びヒト由来の細胞系統から得られたＤＮＡ及びＲＮＡは、上記の方法で分析された。予備実験は、アンドロジエン応答における異常性はＡＲの遺伝子における配列の欠失／変異によるのであろうということを示した。

例１４遺伝子導入動物の開発遺伝子導入技術が外来ＤＮＡの発現のために使用された。それゆえに、アンドロジエンレセプターに欠陥のある動物にアンドロジエン感受性を授けることは可能であろう。例えば、精巣雌性化マウスまたはラットのような、アンドロジエン非感受性動物は、不完全なＡＲ遺伝子または不完全なＡＲそのものを持つことが知られている。もし正常ＡＲ遺伝子を含むＤＮＡが受精されたマウス胚に注射されたら、遺伝子導入マウスは、その遺伝子を保持し、発現し、そしてアンドロジエン応答に必要な機能的なＡＲを産生ずるであろう。マイクロ−インジェクションのためには、非感受性動物内で発現され得るＤＮＡを含むＡＲ遺伝子を用いる必要がある。

ヒトＸ−染色体ライブラリー及びラットゲノムＤＮＡライブラリー由来の多くのゲノムのレセプターのクローンが得られ、そしてその構造が分析された。

ＡＲ配列を含むクローンは、エンドヌクレアーゼ　マツピング、サザーン　ハイブリダイゼーション、及びＳｌヌクレアーゼ　マツピングによって特徴付けられるであろう。こうして同定された５°及び３°非翻訳領域は、ＡＲコード領域の組織特異的な発現に必要なりＮＡの最小の大きさを決めるのを助けるであろう、この５゛及び３°領域の部分的配列分析は、プロモーター及びポリアデニル化領域を表わす最小の領域の場所を定めた。非翻訳領域の上流の約２〜５ｋｂ及びポリ（Ａ）部位の下流の０．５〜ｌｋｂの配列は、ｃＤＮＡクローン（最小遺伝子）と融合され、マウスの胚に注入されるであろう、遺伝子導入マウスは、ミニ− 遺伝子（ｍｉｎｉ−ｇｅｎｅ）に特異的なプローブを用いて、テイルＤＮＡ　（ｔａｉ　ｌ　　ＤＮＡ）の分析によって同定されるであろう。

通常、この遺伝子導入マウス系統の幾らかだけがその導入遺伝子を発現できる。

導入遺伝子は、抑制配列の存在のために、または外来遺伝子の転写的に不活性な染色体上の場所へのインテグレーションのために、または導入遺伝子と内在性エンハンサ−との並列のために不活性なのであろう。更に、アンドロジエン非感受性は、様々な他の要因によるものであり、ＡＲ遺伝子またはその発現における異常性によるものではないであろう。

前述の実例は、アンドロジエンレセプター及びＴＲ−２を含むＤＮＡ結合性蛋白質をコードしているヒト及びラットｃＤＮＡの単離に関係し、更に特に、無細胞系における、対応するｃＤＮＡの転写及び対応するｍＲＮＡの翻訳を記述する。

この発明は、特異的な方法と構成によって述べられたが、この発明を考察して、この分野の熟練者には、変形や修飾が思い付かれるであろうということは理解される。

それゆえに、追加されたクレームにおいて、この発明の範囲内にある同等の変形の類をすべて、要求されたものとして、覆うことが意図されている。

Ｆ工ＧＵＲＥ　　１Ｆ工ＧＵＲＥ　　２ ■〒・！ピ・肌：・６　Ｈｊ・ ■１・引１・；葺］・■吐 ■：・■１・３′ｉ′・３′！′・３藁；・■１・１１・１丁・儒１・互ト・友に（・−Ｉ　Ｈｉ・８ぢ１１　艮８：、１ご：；　眠パ１〜Ｌｌｌ　　　Ｌｉｔ−１１ｍ（口〉　ψトＩＨ）・ロト脣※うｊ賊１・５ｆｌ　Ａ　：Ａ　′ｉ巨：Ｍａ、ｃｎｆｌｉ・Ｊエミ：ヨ〒・■〒・１蝕・ＦＵ！・３Ｗｉ・ぎ包１・■１・′、隨：・Ｉわ、ｉ番：・−２目：・３′ｉ′・コＶ・綽：・！と〒・■詞５Ｅ：・繭：・ミ目わお：・北””　　”ｉｌｇｊｉｌへυ１　３乙：’：！：ＺＦ：・隷：・■：・■１・ ■諏ｉ舷！界１・Ｊ阜：・！リド１１・隷置：訪・融合蛋白質りＡＴＨ１ベクターとラソ）ＡＲ配列のＤＮＡ結合領域を使用）融合蛋白質（ｐＡＴＨ１１ベクターとラツ）ＡＲ配列のアンドロジエン結合領域を使用）国際調査報告ＰＣＴ／ＬＩＥ二う／〇二：２９ ”ｌＮ１１”−”””””””＠ＰＣ”、／ＵＳ９〕１０に３Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】１．精製され単離された、アンドロジェンレセプターポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列。２．請求項第１項に記載のＤＮＡ配列で、ヒトアンドロジェンレセプターポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列。３．請求項第１項に記載のＤＮＡ配列で、ラットアンドロジェンレセプターポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列。４．精製され単離された、ＴＲ２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列。５．請求項第１項または第４項に記載の、ＣＤＮＡ配列であるＤＮＡ配列。６．請求項第１項または第４項に記載の、ゲノムＤＮＡ配列であるＤＮＡ配列。７．請求項第１項または第４項に記載の、部分的に合成されたＤＮＡ配列であるＤＮＡ配列。８．請求項第１項に記載のＤＮＡ配列で、図３に記載されているＤＮＡ配列。９．請求項第４項に記載のＤＮＡ配列で、図４に記載されているＤＮＡ配列。１０．原核または真核の宿主細胞で、請求項第１項または第４項に記載のＤＮＡ配列でトランスホームまたはトランスフェクトされた宿主細胞。１１．請求項第１０項に記載のトランスホームされた原核宿主細胞で、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α細胞と呼はれるものをトランスホームしたもので、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，寄託Ｎｏ．との対応が、ＥＣ−ｈＡＲ３６００はＡ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，Ｎｏ．６７８７９、ＥＣ−ｒＡＲ２８３０はＡ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，Ｎｏ．６７８７８、ＥＣ　ＴＲ２−５はＡ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，Ｎｏ．６７８７７、そしてＥＣＴＲ２−７はＡ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，Ｎｏ．６７８７６と成っている原核宿主細胞。１２．請求項第１項または第４項に記載のＤＮＡ配列を含むウィルス性または環状ＤＮＡブラスミッド。１３．請求項第１２項に記載のウィルス性または環状ＤＮＡブラスミッドで、更に、前述のアンドロジェンレセプターまたはＴＲ２をコードしているＤＮＡに、機能的に結合された発現制御ＤＮＡ配列を含むウィルス性または環状ＤＮＡブラスミッド。１４．アンドロジェンレセプターポリペプチドの生産法で、請求項第１項に記載のＤＮＡ配列でトランスホームまたはトランスフェクトされた宿主細胞の、培地における生育、及び前述の宿主細胞または培地からの、前述のＤＮＡ配列の発現のポリペプチド産物の単離を含むアンドロジェンレセプターポリペプチドの生産法。１５．アンドロジェンレセプターポリペプチドの生産法で、請求項第１項に記載のＤＮＡ配列の無細胞転写及び翻訳系中での処理、及び前述の系からの前述のＤＮＡ配列の発現のポリペプチド産物の単離を含むアンドロジェンレセプターポリペプチドの生産法。１６．ＴＲ２ポリペプチドの生産法で、請求項第４項に記載のＤＮＡ配列でトランスホームまたはトランスフェクトされた宿主細胞の、培地における生育、及び前述の宿主細胞または培養からの、前述のＤＮＡ配列の発現のポリペプチド産物の単離を含むＴＲ２ポリペプチドの生産法。１７．ＴＲ２ポリペプチドの生産法で、請求項第４項に記載のＤＮＡ配列の無細胞転写及び翻訳系中での処理、及び前述の系からの前述のＤＮＡ配列の発現のポリペプチド産物の単離を含むＴＲ２ポリペプチドの生産法。１８．請求項第１項に記載のＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボにおける発現のポリペプチド産物１９．図３に記載されたアミノ酸配列。２０．請求項第１８項に記載のポリペプチド産物で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる９８ｋｂ及び７９ｋｂの分子量及びアンドロジェンヘの結合能によって特徴付けられるポリペプチド産物。２１．請求項第４項に記載のＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボにおける発現のポリペプチド産物２２．ＴＲ２ポリペプチド。２３．ＤＮＡ結合能に関与しない蛋白質の領域内のＡＲまたはＴＲ２蛋白質に存在するアミノ酸の配列、またはＡＲまたはＴＲ２の抗原決定基を少なくとも一つ持つアミノ酸配列に重複する合成ペプチド。２４．アンドロジェンレセプターポリペプチドまたはＴＲ２ポリペプチドのＤＮＡ結合能のある領域内の抗原決定基以外の抗原決定基を少なくとも一つ認識する特異的な免疫反応性のある抗体。２５．請求項第２４項に記載のモノクローナル抗体。２６．請求項第２４項に記載のモノクローナル抗体及びハイブリドーマ細胞系統Ｎｏ．ＨＢ１０、０００；ＨＢ９、９９９；及びＨＢ１０、００１によって産生されるモノクローナル抗体。２７．請求項第２４項に記載のポリクローナル抗体。２８．アンドロジェンレセプターと請求項第２４項に記載の抗体との免疫反応に基づく、アンドロジェンレセプターの定量的検出法。２９．ＴＲ２レセプターと請求項第２４項に記載の抗体との免疫反応に基づく、ＴＲ２レセプターの定量的検出法。３０．前述の核酸と請求項第１項に記載のＤＮＡとのハイブリダイゼーションに基づく、アンドロジェンレセプターをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの定量的検出法。３１．前述の核酸と請求項第４項に記載のＤＮＡとのハイブリダイゼーションに基づく、ＴＲ２セブターをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの定量的検出法。３２．試料中に存在するＡＲまたはＴＲ２特異的な遺伝子配列の定量的及び定性的検出法、であって、ａ）前述の試料を、前述の特異的配列の各ストランドに対する単一のオリゴヌクレオチドプライマーによって、オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズした各配列の各ストランドに、各プライマーの伸長産物が各核酸ストランドに相補的になるように合成されるようなハイブリダイズ条件下で、前述のプライマーが各特異的配列の各ストランドにハイブリダイズするのに十分に相補的であるように選び、一つのプライマーから合成された伸長産物が、相補的な相手から離れたときに、他のプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレートとして役立ち得るように選んで、処理し、ｂ）検出されるべき配列が存在するとき、プライマー伸長産物をそのテンプレートから離すために、試料を、変性条件下で処理し、ｃ）試料をオリゴヌクレオチドプライマーによって処理し、それによって、プライマー伸長産物がステップｂ）で作られた各単一ストランドをテンプレートとして合成され、その結果、特異的核酸配列が存在するならば、増幅されるようにし、ｄ）ステップｃ）の産物へ標識されたオリゴヌクレオチドプローブを添加し、それにより、各配列が、前述の配列またはその変異にハイブリダイズできることが検出されるようにし、そしてｅ）前述のハイブリダイゼーションが起きたかどうかを判定するというステップを含む定量的及び定性的検出の方法。