DE69507017T2

DE69507017T2 - Cai-resistenzproteine kodierende dna, und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69507017T2
Application number: DE69507017T
Authority: DE
Inventors: Young Sook Bethesda Md 20817 Kim; Elise C. Olney Md 20832 Kohn; Lance A. Potomac Md 20854 Liotta
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1994-03-14
Filing date: 1995-03-14
Publication date: 1999-08-12
Anticipated expiration: 2015-03-15
Also published as: DE69507017D1; ES2128048T3; EP0750637A1; EP0750637B1; US5652223A; WO1995025125A1; CA2185341A1; US5981712A; ATE175212T1; JPH09511236A; GR3029811T3; DK0750637T3; AU684930B2; AU2126395A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung eines CAI- Resistenzgens (CAIR-Gens), das für ein Protein codiert, das zelluläre Resistenz gegen Carboxyamido-triazol (CAI) und funktionell äquivalente Verbindungen verleiht. Diese Erfindung betrifft des weiteren das CAIR-Protein, welches vom CAI-Resistenzgen codiert wird, für das Protein spezifische Antikörper und Nucleinsäuresonden, die spezifisch an das Gen hybridisieren. Zusätzlich stellt die Erfindung Tests zur Bestimmung von CAI-Resistenz in Zellen zur Verfügung und Tests zum Screenen nach Zusammensetzungen, die eine CAI-Resistenz verhindern. Die Erfindung stellt auch Zellinien bereit, die das CAIR-Gen exprimieren und in Kulturen, die ständig CAI und funktionell äquivalenten Verbindungen ausgesetzt sind, wachsen und sich vermehren können.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Calcium-Homöostase ist für die Regulierung des Zellverhaltens von Bedeutung, da es sowohl bei der Regulierung von Signalereignissen als auch bei anderen Zell- und Molekularfunktionen von Wichtigkeit ist. (Cole und Kohn, Cancer and Mefastasis Rev. (1993). Carboxyamido-triazol (CAI) ist ein Inhibitor für die stimulierte Calciumzufuhr durch die spannungszustandsabhängige und nichtspannungszustandsabhängige Calciumzufuhr. Es wurde gezeigt, daß es wichtige stromabwärtige Signalereignisse hemmt, einschließlich der Freisetzung von Arachidonsäure, der Produktion von Inosit-triphosphat als Reaktion auf die Phosphorylierung und Aktivierung der Phospholipase A2 und der Tyrosin- Phosphorylierung als Reaktion auf die Rezeptoraktivierung hemmt (Felder et al. J. Pharm. Exp. Therap., 257: 967-971 (1991); Gusovsky et al. J. Bio. Chem., 268: 7768-7772 (1993)). Diese Signalwege regulieren die Vermehrung und andere Zeilvorgänge wie Adhäsion, Migration und Produktion von Proteasen. (Kohn et al. Cancer Res. (1994) in Druck, Kohn et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vorgetragen; Kohn und Liotta, J. Nat. Cancer Inst., 82: 54-60 (1990)).
Es wurde beobachtet, daß Carboxyamido-triazol (CAI) bösartige Proliferation, Invasion und Metastase von Krebszellen inhibiert, weshalb CAI und verwandte Verbindungen als potentielle Krebstherapeutika vorgeschlagen werden (siehe gleichzeitig anhängige Patentanmeldung USSN 07/985,402). Von Bedeutung bei der Entwicklung und Anwendung von Krebstherapeutika ist die Entwicklung einer Resistenz von Tumorzellen gegenüber der speziellen pharmakologischen Therapie, der sie ausgesetzt werden.
Wo solch eine Resistenz auftritt, ist es wünschenswert, die Resistenz zu bestimmen, um Therapeutika zu ermitteln, die eine solche Resistenz vermeiden oder verhindern. Wenn die Resistenz mit einer veränderten Genexpression verbunden ist, hilft die Isolierung des Gens, das für die mit dem Auftreten der Resistenz assoziierten Proteine codiert, nicht nur den Mechanismus der Arzneimittelresistenz zu erklären, sondern liefert auch nützliche Marker zum Nachweis des Erwerbs der Resistenz sowie nützliche Ziele für einen Eingriff. Vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes CAI-Resistenzgen (CAIR-Gen) bereit, dessen Expression mit CAI-Resistenz verbunden ist. Diese Erfindung stellt auch das Protein, das von diesem Gen codiert wird, bereit. Die Isolierung dieses Gens und Proteins schafft die vorerwähnten und andere Vorteile.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte menschliche Nucleinsäure bereit, die für ein menschliches Carboxyamido-triazol-Resistenzprotein (CAIR-Protein) codiert, wobei die Nucleinsäure imstande ist, in Gegenwart einer menschlichen genomischen DNA-Bank unter stringenten Bedingungen spezifisch an eine zweite Nucleinsäure zu hybridisieren, die aus der Nucleinsäuresequenz von Seq. Id. Nr. 1 besteht. Speziell umfaßt diese Nucleinsäure die Nucleotidsequenz von Seq. Id. Nr. 1. Insbesondere exprimiert die isolierte Nucleinsäure, wenn sie in einer Zellinie vorkommt, das von ihr codierte Protein mit höheren Pegeln, wenn die Zellinie in Gegenwart einer CAI-Konzentration von wenigstens 10 uM kultiviert wird, als wenn die Zellinie unter denselben Kulturbedingungen ohne CAI kultiviert wird.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine isolierte menschliche Nucleinsäuresequenz bereit, die für ein CAIR-Protein codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz wenigstens 85%, insbesondere wenigstens 95% Sequenzidentität mit der Nucleinsäure von Seq. Id. Nr. 1 aufweist. Wenn die isolierte menschliche Nucleinsäuresequenz in einer Zellinie vorkommt, exprimiert sie das von ihr codierte Protein mit höheren Pegeln, wenn die Zellinie in Gegenwart einer CAI- Konzentration von wenigstens 10 uM kultiviert wird, als wenn die Zellinie unter denselben Kulturbedingungen ohne CAI kultiviert wird.
Die Erfindung stellt zusätzlich eine isolierte menschliche Nucleinsäure bereit, die für ein CAIR-Protein codiert, das wenigstens 80%, insbesondere wenigstens 95% Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz von Seq. Id. Nr. 2 aufweist. Wenn diese Isolierte menschliche Nucleinsäure in einer Zellinie vorkommt, exprimiert sie das von ihr codierte Protein mit höheren Pegeln, wenn die Zellinie in Gegenwart einer CAI- Konzentration von wenigstens 10 uM kultiviert wird, als wenn die Zellinie unter denselben Kulturbedingungen ohne CAI kultiviert wird.
In einem anderen Ausführungsbeispiel stellt diese Erfindung ein isoliertes CAIR-Protein bereit, das wenigstens 80% Sequenzidentität, insbesondere wenigstens 95% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Seq. Id. Nr. 2 aufweist. Dieses isolierte CAIR-Protein wird, wenn es in einer Zellinie exprimiert wird, mit höheren Pegeln exprimiert, wenn die Zellinie in Gegenwart einer CAI-Konzentration von wenigstens 10 uM kultiviert wird, als wenn die Zellinie unter denselben Kulturbedingungen ohne CAI kultiviert wird.
Diese Erfindung stellt ein isoliertes CAIR-Protein bereit, wobei das Protein spezifisch an einen Antikörper bindet, der gegen ein Immunogen erzeugt wurde, das aus der durch Seq. Id. Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz besteht. Insbesondere besteht der Carboxy- Terminus des Proteins aus einem Polypeptid von Seq. Id. Nr. 2. Außerdem kann das Protein rekombinant hergestellt werden. Dieses Protein wird mit höheren Pegeln in einer Zellinie exprimiert, wenn die Zellinie in Gegenwart einer CAI-Konzentration von wenigstens 10 uM kultiviert wird, als wenn die Zellinie unter denselben Kulturbedingungen ohne CAI kultiviert wird.
In einem noch anderen Ausführungsbeispiel stellt diese Erfindung eine isolierte Nucleinsäure bereit, die für ein CAIR-Resistenzprotein codiert, wobei das Protein spezifisch an einen Antikörper bindet, der gegen ein Immunogen erzeugt wurde, das aus der durch Seq. Id. Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz besteht. Insbesondere umfaßt diese Nucleinsäure die Nucleotidsequenz von Seq. Id. Nr. 1.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt diese Erfindung Zellen bereit, die zum Wachstum und zur Proliferation imstande sind, wenn sie in Gegenwart von CAI kultiviert werden, das in einer Konzentration von 40 uM bis 45 uM vorliegt. Insbesondere handelt es sich bei diesen Zellen um A2058-20R-Zellen oder OVCAR3-R-Zellen.
Diese Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Bestimmung der CAI-Resistenz einer biologischen Probe bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Inkontaktbringen eines Bindemittels, das imstande ist, spezifisch ein CAI-Resistenzprotein zu binden, mit einer biologischen Probe; b) Inkubation des Bindemittels mit der biologischen Probe, um einen Bindemittel: CAIR-Protein-Komplex zu bilden; und c) Nachweis des Komplexes. Insbesondere ist das Bindemittel ein Antikörper, der spezifisch immunoreaktiv mit dem CAI-Resistenzprotein ist. Speziell umfaßt der Nachweisschritt a) das Inkontaktbringen des Komplexes mit einem markierten Antikörper, der spezifisch das Bindemittel bindet; und b) den Nachweis des markierten Antikörpers.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der CAI-Resistenz einer biologischen Probe bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Inkontaktbringen eines Bindemittels, das imstande ist, spezifisch eine für ein CAI-Resistenzprotein codierende Nucleotidsequenz zu binden, mit einer biologischen Probe; b) Inkubation des Bindemittels mit der biologischen Probe, um einen Bindemittel: Nucleinsäure-Komplex zu bilden; und c) Nachweis des Komplexes. Insbesondere ist das Bindemittel eine Nucleinsäure, die unter stringenten Bedingungen spezifisch an eine zweite Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die für ein CAI-Resistenzprotein codiert. Speziell hybridisiert die Nucleinsäure spezifisch an eine DNA-Sequenz von Sequenz Id. Nummer 1. Noch spezieller umfaßt der Nachweisschritt den Nachweis einer markierten Nucleinsäure.
Diese Erfindung stellt einen Kit zur Bestimmung der CAI-Resistenz bereit, wobei der Kit einen Behälter umfaßt, der ein Bindemittel enthält, das imstande ist, spezifisch ein CAIR- Protein zu binden. Insbesondere ist das Bindemittel des Kit ein Antikörper, der spezifisch an ein CAIR-Protein bindet. Speziell umfaßt der Kit außerdem einen Behälter, der ein Mittel zum Nachweis des Antikörpers enthält.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt die Erfindung einen Kit zur Bestimmung der CAI-Resistenz einer biologischen Probe bereit, wobei der Kit einen Behälter umfaßt, der ein Bindemittel enthält, das imstande ist, spezifisch eine Nucleinsäuresequenz zu binden, die für ein CAI-Resistenzprotein codiert. Insbesondere ist das Bindemittel eine zweite Nucleinsäure, die unter stringenten Bedingungen spezifisch an die Nucleinsäuresequenz hybridisiert.
Die Erfindung stellt ebenfalls einen Kit zur Untersuchung von Verbindungen auf eine CAIR-verhindernde Wirkung bereit, wobei der Kit einen Behälter umfaßt, der eine CAI- resistente Zelle enthält. Insbesondere ist die Zelle A2058-20R oder OVCAR3-R.
Die Verbindung stellt einen Antikörper bereit, der spezifisch an ein CAIR-Protein bindet. Insbesondere wird dieser Antikörper gegen ein Immunogen erzeugt, das aus der durch Seq. Id Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt diese Erfindung eine pharmakologische Zusammensetzung bereit, die CAI-Resistenz verringert, wobei die Zusammensetzung ein Bindemittel umfaßt, das an ein für ein CAIR-Protein codierendes Nucleotid bindet. Insbesondere ist das Bindemittel ein Antisinn-Molekül, das spezifisch an ein Nucleotid hybridisiert, das für ein CAIR-Protein codiert. Speziell ist das Nucleotid, das für ein CAIR- Protein codiert, Seq. Id. Nr. 1.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt Northern-Analysen, die die Induktion des CAIR-Gens anzeigen. Das obere linke Gel zeigt einen Northern-Blot einer ganzen RNA von Eltern-A2058-Zellen, die an eine Sonde hybridisierten, die von einer Subtraktivhybridisierung von CAI-resistenten A2058-20R- Zellen gegen Eltern-A2058-Zellen erhalten wurden. Eine cDNA-Bank wurde von A2058-20R- Zellen erstellt und mit der subtrahierten Sonde gescreent. Wenn die ausgewählten Klone gegen Northern-Blots hybridisiert wurden, identifizierten sie veränderte Genexpression als Folge einer ständigen CAI-Exposition. Die mit 21 DBB (CAIR-1), 15CBB (CAIR-3) und 13BAA (CAIR-2) bezeichneten Gele stellen Klone mit erhöhter Expression als Folge der CAI-Exposition dar. Die transkribierte Information von CAIR-1 beträgt ungefähr 2,8 kb, während die Informationen für CAIR3 und für CAIR-2 jeweils ungefähr 4,5 kb 4,2 kb betragen. In allen Fällen wurden die radioaktiven Signale entfernt und die Blots dann mit radioaktiv markiertem GAPDH als konstitutivem Gen rehybridisiert, um unterschiedliche Beladung zu korrigieren (untere Gele).

BESCHREIBUNG DES BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELS

Definitionen

Die Abkürzungen für die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren folgen dem konventionellen Gebrauch. In der hier verwendeten Polypeptidnotation ist die linke Seite die aminoterminale Seite und die rechte Seite die carboxyterminale Seite gemäß Standardgebrauch und Konvention.
Der Terminus "CAI-Resistenz", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, in Gegenwart von Carboxyamido-triazol (CAI) und funktionell äquivalenten Verbindungen mit einer Konzentration von 10 uM oder größer zu wachsen und sich zu teilen. Funktionell äquivalente Verbindungen sind solche Verbindungen, die sich in zu CAI identischer oder analoger Art bezüglich der Inhibierung der Calciumzufuhr verhalten. Obwohl die spezifischen Aktivitätslevels der funktionell äquivalenten Verbindungen differieren können, erzeugen sie dieselben biologischen Effekte. Das beinhaltet die Inhibierung der Calciumzufuhr und infolgedessen die Verringerung der Zellteilungsrate. Beispiele von funktionell äquivalenten Verbindungen schließen die antimycotischen Imidazole wie Ketoconazol, Miconazol, Fluconazol, Econazol und Itraconazol, die von Merritt et. al., Biochem. J., 271: 515-522 (1990) beschriebene Verbindung und ihre Analoga ein. Diese Analoga, beschrieben im US-Patent Nr. 5,359,078, umfassen Verbindungen der Formel:
wobei Ar²¹ und Ar²² gleich oder unterschiedlich sein können und entweder Phenyl, Naphthyl oder ihre substituierten Analoga sind; X O, S, SO, CO, CHCN, geradkettiges Alkyl, Alkoxy und Alkoxyalkyl ist; Z ist Imidizolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,2,4-Triazolyl, Pyrazinyl, Purinyl, Pyrimidinyl, 1,2,3-Triazolo-{4,5-d-}-pyrimidinyl oder ein substituiertes Analogon davon ist; und p eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist.
Ein "CAI-Resistenzprotein" oder "CAIR-Protein" bezieht sich auf ein Protein, dessen Expression in einer Zelle mit der Fähigkeit einer Zelle korreliert ist, CAI-Resistenz zu entwickeln. Das bedeutet, in Gegenwart von CAI und funktionell äquivalenten Verbindungen zu wachsen und sich zu teilen. Das Resistenzprotein CAIR-1 dieser Erfindung ist durch wenigstens eine prolinreiche Domäne, eine neuartige Domäne homolog zu der Src- Homologie 3-(SH3-)Bindungsdomänen-Konsensussequenz, gekennzeichnet. Die SH3- Bindungsproteindomänen-Konsensussequenz ist XPXXPPPXψXP, wobei die Positionen 2, 7 und 10 obligat P (Prolin) sind, X eine beliebige Aminosäure ist und w eine hydrophobe Aminosäure ist. Dis CAIR-Proteine dieser Erfindung werden induziert, wenn die Zelle CAI ausgesetzt ist, und diese Induktion ist charakteristisch für die CAI-Resistenz und mit ihr korreliert.
Der Terminus "Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotid-Polymer in entweder einzel- oder doppelsträngiger Form und schließt, wenn nicht anders eingeschränkt, bekannte Analoga natürlicher Nucleotide, die in ähnlicher Weise wirken können wie natürlich vorkommende Nucleotide, ein.
Der Ausdruck "codierende Nucleinsäure" oder "codierende Nucleinsäuresequenz" bezieht sich auf eine Nucleinsäure, die die Expression eines spezifischen Proteins oder Peptides lenkt. Die Nucleinsäuresequenzen beinhalten sowohl die DNA-Strang-Sequenz, die in die RNA transkribiert wird, als auch die RNA-Sequenz, die ins Protein translatiert wird. Die Nucleinsäuresequenzen beinhalten sowohl die volle Länge der Nucleinsäuresequenzen als auch kürzere Sequenzen, die von der gesamten Sequenzlänge abgeleitet sind. Es ist klar, daß eine spezielle Nucleinsäuresequenz die degenerierten Codons der nativen Sequenz oder Sequenzen enthält, die eingeführt werden können, um eine Codon-Präferenz in einer spezifischen Wirtszelle zu schaffen. Die Nucleinsäure beinhaltet sowohl den codierenden als auch den nicht codierenden Strang als entweder individuelle Einzelstränge oder als Doppelstrang. Die Termini "hybridisieren" oder "Hybridisierung" beziehen sich auf die Bindung zweier einzelsträngiger Nucleinsäuren durch komplementäre Basenpaarung.
Der Ausdruck "hybridisiert spezifisch an" bezieht sich auf eine Bindung, Doppelstrangbildung oder Hybridisierung eines Moleküls nur an eine bestimmte Nucleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn diese Sequenz bei der Herstellung einer gesamtzellulären DNA oder RNA anwesend ist.
Der Terminus "stringente Bedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Sonde an ihre Ziel-Subsequenz, jedoch an keine anderen Sequenzen hybridisiert. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unterschiedlich bei unterschiedlichen Umständen. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Allgemein werden stringente Bedingungen um ca. 5ºC niedriger gewählt als der thermische Schmelzpunkt (Tm) der spezifischen Sequenz bei definierter Ionenstärke und definiertem pH. Der Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% der Zielsequenz mit einer komplementären Sonde hybridisiert. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration zumindest etwa 0,1 bis 1,0 N Na-Ionenkonzentration bei pH 7,0 bis 7,5 und die Temperatur zumindest etwa 60ºC für lange Sequenzen (z. B. mehr als etwa 50 Nucleotide) und zumindest etwa 42ºC für kurze Sequenzen (z. B. 10 bis 50 Nucleotide) beträgt.
Die Termini "isoliert" oder "im wesentlichen rein" in Zusammenhang mit Nucleinsäuresequenzen, die für CAIR-Proteine oder Fragmente davon codieren, beziehen sich auf isolierte Nucleinsäuren, die für keine Proteine oder Peptide außer CAIR-Proteine oder -Peptide codieren.
Die Termini "isoliert" oder "im wesentlichen gereinigt" oder "isoliert" in Zusammenhang mit einem CAIR-Protein bezeichnen eine chemische Verbindung, die im wesentlichen frei von anderen Zellkomponenten ist. Sie ist vorzugsweise in einem homogenen Zustand, obwohl sie in einer trockenen oder wäßrigen Lösung sein kann. Reinheit und Homogenität werden typischerweise durch Anwendung von Techniken der analytischen Chemie wie Polyacrylamidgelelektrophorese oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bestimmt. Ein Protein, das die in einem Präparat vorhandene vorherrschende Spezies ist, ist im wesentlichen gereinigt. Allgemein umfaßt ein im wesentlichen gereinigtes oder isoliertes Protein mehr als 80% aller makromolekularen Spezies, die in dem Präparat vorhanden sind. Vorzugsweise wird das Protein gereinigt, um mehr als 90% aller vorhandenen makromolekularen Spezies darzustellen. Noch besser wird das Protein zu mehr als 95% gereinigt und am besten wird das Protein zu wesentlicher Homogenität gereinigt, wo andere makromolekulare Spezies mit konventionellen Techniken nicht mehr erfaßt werden.
Der Ausdruck "bindet spezifisch an einen Antikörper" oder "spezifisch immunoreaktiv mit" - bezogen auf ein Protein oder Peptid - bezieht sich auf eine Bindungsreaktion, die bestimmend für die Gegenwart des Proteins in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen oder anderer biologischer Stoffe ist. Das bedeutet, daß unter bestimmten immunologischen Testbedingungen die angegebenen Antikörper an ein bestimmtes Protein binden und nicht signifikant an andere in der Probe vorhandene Proteine binden. Eine spezifische Bindung an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper verlangen, der wegen seiner Spezifität für ein bestimmtes Protein ausgewählt wird. Zum Beispiel können Antikörper, welche gegen das CAI-Proteinfragment mit der durch Seq. Id. Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz hergestellt wurden, selektiert werden, um Antikörper zu erhalten, welche spezifisch mit CAIR-Proteinen und nicht mit anderen Proteinen immunoreaktiv sind. Diese Antikörper erkennen Proteine, die zu dem CAIR-Protein homolog sind. Homologe Proteine umfassen die Familie der CAIR-Proteine, schließen aber andere Signaltransduktionsproteine, die infolge einer CAI-Exposition nicht induziert werden, nicht ein. Eine Vielzahl von immunologischen Testverfahren kann angewendet werden, um Antikörper zu selektieren, die spezifisch mit einem bestimmten Protein immunoreaktiv sind.
Zum Beispiel werden Festphasen-ELISA-Immuntests routinemäßig benützt, um Antikörper, die spezifisch mit einem Protein immunoreaktiv sind, zu selektieren. Siehe Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, für eine Beschreibung von Immuntestverfahren und Bedingungen, die zur Bestimmung einer spezifischen Immunoreaktivität benützt werden können.
Der Terminus "Bindemittel: CAIR-Protein-Komplex", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Komplex aus einem Bindemittel und einem CAIR-Protein, das durch spezifische Bindung des Bindemittels an das CAIR-Protein gebildet wird. Spezifische Bindung des Bindemittels bedeutet, daß das Bindemittel eine spezifische Bindungsstelle hat, die eine Stelle am CAIR-Protein erkennt. Beispielsweise sind Antikörper gegen ein CAIR- Protein, die ein Epitop auf dem CAIR-Protein erkennen, fähig, einen Bindemittel: CAIR- Protein-Komplex durch spezifische Bindung zu bilden. Bezeichnenderweise erlaubt die Bildung eines Bindemittel: CAIR-Proteins die Messung von CAIR-Protein in einer Mischung von anderen Proteinen und Stoffen biologischen Ursprungs. Der Terminus "Antikörper: CAIR- Protein-Komplex" bezieht sich auf einen Bindemittel: CAIR-Protein-Komplex, in dem das Bindemittel ein Antikörper ist.
Der Terminus "Bindemittel: Nucleinsäure-Komplex", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Komplex aus Bindemittel und einer Nucleinsäure, der durch spezifische Bindung des Bindemittels an die Nucleinsäure gebildet wird. Eine spezifische Bindung des Bindemittels bedeutet, daß das Bindemittel eine spezifische Bindungsstelle hat, die eine Stelle am CAIR-Protein erkennt. Beispielsweise können Nucleinsäuresonden, die komplementär zu einer Region der Nucleinsäuresequenz sind, die für ein CAIR-Protein codiert, einen Sonden: CAI-Nucleinsäure-Komplex bilden.
Der Terminus "biologische Probe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine beliebige Probe, die von einem lebenden Organismus oder von einem toten Organismus erhalten wurde. Beispiele für biologische Proben umfassen Körperflüssigkeiten, Gewebsproben und Gewebekulturlinien, die von Patienten genommen wurden.
Der Terminus "rekombinante DNA" oder "rekombinant hergestellte DNA" bezieht sich auf eine DNA, die von ihrer nativen oder endogenen Quelle isoliert und entweder chemisch oder enzymatisch modifiziert wurde, um natürlich auftretende flankierende Nucleotide zu deletieren oder flankierende Nucleotide zu schaffen, die nicht natürlich vorkommen. Flankierende Nucleotide sind jene Nucleotide, die sich entweder stromaufwärts oder stromabwärts von der beschriebenen Sequenz oder Subsequenz von Nucleotiden befinden.
Der Terminus "rekombinantes Protein" oder "rekombinant hergestelltes Protein" bezieht sich auf ein Peptid oder Protein, das unter Verwendung nicht-nativer Zellen hergestellt wurde, welche keine endogene Kopie von DNA haben, die das Protein exprimieren kann. Die Zellen produzieren das Protein, weil sie durch Einführung der geeigneten Nucleinsäuresequenz genetisch verändert wurden. Das rekombinante Protein wird nicht in Gesellschaft mit Proteinen und anderen subzellularen Komponenten angetroffen, die normalerweise mit den Zellen, die das Protein produzieren, assoziiert sind.
Die folgenden Termini werden benützt, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuren oder Polynucleotiden zu beschreiben: "Referenzsequenz", "Vergleichsfenster", "Sequenzidentität" und "Prozentsatz der Sequenzidentität".
Eine "Referenzsequenz" ist eine definierte Sequenz, die als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird; eine Referenzsequenz kann ein Teil einer größeren Sequenz sein, wie z. B. ein Segment einer vollständigen cDNA- oder Gensequenz, die in einer Sequenzliste gegeben ist, so wie die Nucleinsäuresequenz von Seq. Id. Nr. 1, oder sie kann eine komplette cDNA oder Gensequenz umfassen.
Der "Prozentsatz an Sequenzidentität" wird bestimmt durch den Vergleich zweier optimal zueinander ausgerichteter Sequenzen oder Subsequenzen über ein Vergleichsfenster oder eine Spanne, wobei der Teil der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster Insertionen oder Deletionen (z. B. Lücken) umfassen kann im Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Insertionen oder Deletionen umfaßt) für eine optimale gegenseitige Ausrichtung der zwei Sequenzen. Der Prozentsatz wird berechnet, indem die Anzahl an Positionen, bei denen die identische Untereinheit (z. B. Nucleinsäurebase oder Aminosäurerest) in beiden Sequenzen auftritt, bestimmt wird, um die Anzahl der übereinstimmenden Positionen zu erhalten, die Anzahl an übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtanzahl an Positionen im Vergleichsfenster dividiert und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, um den Prozentsatz an Sequenzidentität zu erhalten. Wenn der Prozentsatz an Sequenzidentität mittels der Programme GAP oder BESTFIT (siehe unten) berechnet wird, werden dazu die "default gap weights" (Standard-Lückengewichtung) verwendet.
Wenn der Prozentsatz an Sequenzidentität in Verbindung mit Proteinen oder Peptiden verwendet wird, ist es anerkannt, daß sich Positionen von Resten, die nicht identisch sind, durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden können, wobei Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z. B. Ladung oder Hydrophobizität) substituiert sind und deshalb die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht verändern. Wo sich Sequenzen durch konservative Substitutionen unterscheiden, kann der Prozentsatz an Sequenzidentität nach oben korrigiert werden, um die konservative Natur der Substitution zu korrigieren. Mittel zur Durchführung dieser Korrektur sind dem Fachmann wohlbekannt. Typischerweise beinhaltet dies, daß eine konservative Substitution als eine teilweise statt als eine völlige Nichtübereinstimmung bewertet wird, wodurch der Prozentsatz an Sequenzidentität erhöht wird. So wird zum Beispiel, wenn einer identischen Aminosäure eine Bewertung von 1 und einer nichtkonservativen Substitution eine Bewertung von 0 gegeben wird, einer konservativen Substitution eine Bewertung zwischen 0 und 1 gegeben. Die Bewertung einer konservativen Substitution wird entsprechend dem Algorithmus von Meyers und Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1988), wie er im Programm PC/GENE (Intelligenetics, Moutain View, California, USA) implementiert ist, berechnet. Jede der folgenden sechs Gruppen enthält Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind:
1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
6) Phenyfalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).
Ein "Vergleichsfenster", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Segment von zumindest etwa 20 nebeneinanderliegenden Positionen, üblicherweise etwa 50 bis etwa 200, meist etwa 100 bis etwa 150, in dem eine Sequenz mit einer Referenzsequenz derselben Anzahl an nebeneinanderliegenden Positionen verglichen werden kann, nachdem die zwei Sequenzen optimal zueinander ausgerichtet wurden.
Verfahren zur Ausrichtung von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet ausreichend bekannt. Eine optimale gegenseitige Ausrichtung von Sequenzen zum Vergleich kann mit dem Lokalhomologie-Algorithmus von Smith und Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), der hiermit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert wird, mit dem Homologieausrichtungsalgorithmus von Needleman und Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), der hiermit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert wird, mit dem Verfahren der Suche nach Ähnlichkeit von Pearson und Lipman, Proc. Natt Acad. Sot USA 85: 2444 (1988), das hiermit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert wird, mit computergestützter Darstellung dieser Algorithmen (einschließlich, aber nicht beschränkt auf CLUSTAL im PC/Gene-Programm von Intelligenetics, Moutain View, California, GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA) oder durch Durchsicht durchgeführt werden. Ausführlich beschrieben werden Verfahren für die Ausrichtung von Sequenzen mit Hilfe des CLUSTAL- Programmes insbesondere von Higgins und Sharp in Gene, 73: 237-244 (1988) und in CABIOS 5: 151-153 (1989), die beide hiermit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert werden.

Detaillierte Beschreibung

Vorliegende Erfindung stellt isolierte Proteine bereit, die mit der zellulären Resistenz gegen Carboxyamido-triazol (CAI) und funktionell äquivalente Zusammensetzungen im Zusammenhang stehen, sowie isolierte Nucleinsäuren, die für diese Proteine codieren. Diese isolierten Nucleinsäure- und Proteinzusammensetzungen können für eine Anzahl von Anwendungen verwendet werden. Sowohl das Protein als auch die Nucleinsäure kann zum Beispiel als Marker verwendet werden, der die Entstehung von CAI-Resistenz in Tumorzeilen, die einer CAI-Chemotherapie unterzogen wurden, nachweisen kann. Die Nucleinsäuresequenz kann auch als selektierbarer Marker verwendet werden, indem sie mit einer anderen Nucleinsäuresequenz in einem Vektor verbunden wird und eine Zellinie transformiert wird. Die transformierten Zellen können selektiert werden, indem die Zellen CAI ausgesetzt werden und jene Zellen, die überleben, selektiert werden.
Zusätzlich enthält mindestens ein CAIR Protein, CAIR-1, eine Src-Homologie 3-(SH3- )Bindungsdomäne, die mit SH3-Domänen verschiedener Proteine interagiert und welche zur Veränderung oder Inaktivierung verschiedener intrazellulärer Signalwege oder verschiedener Elemente des Zytoskeletts verwendet werden kann. So können das Protein oder Fragmente, die SH3-Bindungsdomänen tragen als Therapeutika für Krankheiten, die sich durch Probleme in der Calcium-Signaltransduktion auszeichnen, eingesetzt werden. Außerdem können das Protein oder SH3-Bindungsdomänen tragende Fragmente verwendet werden, um auf andere SH3-Domänen tragende Proteine zu testen und diese zu identifizieren und damit neue Elemente im Signaltransduktionsweg zu identifizieren.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Antikörper bereit, die spezifisch zu den CAIR- Proteinen sind. Diese Antikörper können zur Inaktivierung des Proteins verwendet werden und hierdurch die CAIR-Resistenz aufheben. Außerdem können Antikörper, die an die SH3- Bindungsdomänen binden, dazu verwendet werden, mit SH3-tragenden Proteinen zu kompetitieren, und können daher zur Veränderung oder Inhibierung verschiedener Signalwege oder der Funktion verschiedener Elemente des Zytoskelettes herangezogen werden.
Diese Erfindung stellt außerdem Zellinien bereit, die CAI-Resistenz zeigen. Diese Zellinien können als Testmaterial zum Screenen nach Verbindungen verwendet werden, die eine CAI-Resistenz reduzieren oder eliminieren können. Sie können weiters als Modellsysteme verwendet werden, um die Effizienz von Therapeutikamischungen, welche CAI oder analoge Calciumregulationsinhibitoren beinhalten, zu untersuchen.

A. Induktion der CAIR-Genexoression

CAIR-Gene sind in Zellen induziert, welche bei Konfrontation mit CAI und funktionell äquivalenten Zusammensetzungen wachsen und sich teilen.
Zu diesen Zusammensetzungen gehören die antimykotischen Imidizole, wie zum Beispiel Ketoconazol, Miconazol, Fluconazol, Econazol und Itraconazol, jene Zusammensetzung, die von Merritt et al., Biochem. J., 271: 515-522 (1990) beschrieben wurde, und ihre Analoga wie oben beschrieben.
CAIR-Gene können durch die Kultivierung von Zellen in Gegenwart von steigenden Konzentrationen an CAI und seiner funktionellen Äquivalente identifiziert werden. Zellen, die wachsen und sich teilen, werden selektiert, ihre RNA wird isoliert, und es wird eine subtraktive Hybridisierung gegen die unbehandelte elterliche Zellinie durchgeführt. Die subtraktive Hybridisierung liefert eine Sonde, die markiert werden kann und dann dazu verwendet wird, cDNA-Banken auf Klone zu untersuchen, die in Gegenwart von CAI oder seiner funktionellen Äquivalente eine erhöhte Expression des Gens zeigen.

B. CAIR-Proteine

Die CAI-Resistenzproteine (CAIR-Proteine) stehen mit der zellulären CAI-Resistenz in Zusammenhang. Die Expression dieser Proteine ist typischerweise in Zellen induziert, die bei Konfrontation mit CAI oder funktionell äquivalenten Verbindungen überleben.
Seq. Id Nr. 2 zeigt den Carboxy-Terminus eines dieser Proteine (CAIR-1). Dieses Protein enthält eine Anzahl von Src-Homologie 3-(SH3-)Bindungsproteindomänen. SH3- Domänen sind innerhalb einer sehr großen Gruppe von Proteinen konserviert, welche Elemente des Zytoskelettes und intrazelluläre Signalproteine einschließen (Ren et al., Science 259: 1157-1161 (1993)). Diese Domänen scheinen an der Vermittlung von Protein- Protein-Assoziationen beteiligt zu sein und zytoplasmatische Signalvorgänge zu regulieren.
Daher kann das CAIR-1-Protein dieser Erfindung oder Fragmente davon, welche die SH3-Bindungsproteindomänen enthalten, zur Inhibierung oder Veränderung verschiedener intrazellulärer Signalwege verwendet werden. Dies ermöglicht einen Weg der Behandlung verschiedener Krankheiten, die sich durch gestörte intrazelluläre Signalübertragung auszeichnen, wie zum Beispiel Krebs, Hyperproliferationen, eine Korrektur von vaskulären Kollagenosen (z. B. Lupus und rheumatoide Arthritis), Nephropathien, Neuropathien (z. B. ALF, Alzheimer) und Myopathien (z. B. Kardiomyopathien, Skelettalmyopathien).
Mittel zur Identifizierung von SH3-Bindungsdomänen in CAIR-Proteinen sind dem Fachmann wohlbekannt. Wo die Proteinsequenz bekannt ist, können Regionen des Proteins, deren Sequenzen die Konsensusdefinition für SH3-Bindungsdomänen erfüllen (XPXXPPPψXP, wobei Positionen 2, 7 und 10 obligat P (Prolin) sein müssen, X eine beliebige Aminosäure ist und ψ eine hydrophobe Aminosäure ist), einfach durch Durchsicht oder durch die Verwendung von Sequenzanalyseprogrammen wie FASTA oder BESTFIT identifiziert werden.
SH3-Bindungsstellen können auch identifiziert werden, indem auf eine konkrete Bindung zwischen dem CAIR-Protein und Proteinen mit bekannten SH3-Stellen, wie zum Beispiel Ab1, Fyn, Lck und die p85-α-Untereinheit der Phosphatidylinositol-3'-kinase, getestet wird. Geeignete Proteinbindungstests sind dem Fachmann wohlbekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform könnte der Test durchgeführt werden, indem ein GST-CAIR- 1-Fusionsprotein geschaffen wird, das Protein an Glutathionsepharose-Perlen gebunden wird, das immobilisierte Protein den Screening-Proteinen (z. B. Ab1, Fyn, Lck und p85) ausgesetzt wird und dann auf Bindung der Screening-Proteine getestet wird. Die Bindung kann leicht überprüft werden, indem SH3-Protein spezifische markierte monoklonale Antikörper verwendet werden. Diese sind kommerziell erhältlich. Ein Beispiel für diesen Test wird in Beispiel 5 geliefert.
Die CAIR-Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen auch Proteine, die verschiedene Aminosäuresubstitutionen enthalten können, jedoch im wesentlichen dieselbe Konformation und Aktivität wie das unveränderte Protein beibehalten. Daher umfaßt das CAIR-1-Protein, dessen carboxyterminale Sequenz in Seq. Id. Nr. 2 aufgelistet ist, auch Proteine, die konservative Aminosäuresubstitutionen in der aufgelisteten Sequenz zeigen. Diese verwandten Proteine können über ihre Sequenzidentität mit dem CAIR-1-Protein von Seq. Id. Nr. 2 identifiziert werden. Die CAIR-Proteine der vorliegenden Erfindung haben wenigstens 80 Prozent Sequenzidentität, vorzugsweise wenigstens 90 Prozent Sequenzidentität und insbesondere wenigstens 95 Prozent Sequenzidentität mit einem CAIR-Referenzprotein (z. B. Seq. Id. Nr. 2).
Alternativ können verwandte CAIR-Proteine über ihre Kreuzreaktivität mit Antikörpern bestimmt werden, die gegen ein bestimmtes Immunogen erzeugt worden sind, das von dem CAIR-1-Protein der vorliegenden Erfindung codiert wird. In einem Immuntest wird ein CAIR- Protein ermittelt, das spezifisch an einen Antikörper bindet oder spezifisch immunoreaktiv mit diesem ist, wobei der Antikörper gegen ein definiertes Immunogen wie zum Beispiel ein Immunogen, das aus der Aminosäuresequenz von Seq. Id. Nr. 2 besteht, erzeugt wurde. Der Immuntest verwendet ein polyklonales Antiserum, das gegen das Protein von Seq. Id. Nr. 2 produziert wurde. Dieses Antiserum ist so ausgewählt, daß es eine geringe Kreuzreaktivität gegen andere, Nicht-CAIR-Proteine aufweist, und jegliche derartige Kreuzreaktivität wird vor der Verwendung im Immuntest durch vorherige Immunabsorption entfernt.
Um Antisera zur Verwendung in einem Immuntest herzustellen, wird das Protein von Seq. Id. Nr. 2 wie hier beschrieben isoliert (zum Beispiel wird das rekombinante Protein in einer Säugetierzelle produziert). Danach wird ein Säugetier (zum Beispiel ein Mäuse- Inzuchtstamm wie balb/c) unter Verwendung eines Standardadjuvans, wie das Freund'sche Adjuvans, und eines Standardimmunisierungsprotokolls (siehe Harlow and Lane, oben) mit dem Protein von Seq. Id. Nr. 2 immunisiert. Alternativ kann ein synthetisches Peptid, welches von den hier offenbarten Sequenzen abgeleitet wurde und an ein Trägerprotein gekoppelt ist, als Immunogen verwendet werden. Zum Beispiel kann das Peptid von Seq. Id. Nr. 2 verwendet werden. Polyklonale Sera werden gesammelt und in einem Immuntest, zum Beispiel einem Festphasen-Immuntest, bei dem das Immunogen auf einem festen Träger immobilisiert ist, gegen das Immunogen-Protein titriert. Polyklonale Antisera mit einem Titer von 10&sup4; oder mehr werden ausgewählt und auf ihre Kreuzreaktivität gegen Nicht-CAIR- Proteine getestet, indem ein kompetitiver Bindungsimmuntest, wie er bei Harlow und Lane, oben, auf den Seiten 570-573 beschrieben wird, Verwendung findet.
Immuntests im Format der kompetitiven Bindung können zur Bestimmung der Kreuzreaktivität verwendet werden. Zum Beispiel kann das Protein von Seq. Id. Nr. 2 an einen festen Träger gebunden werden. Proteine, die zu dem Test hinzugegeben werden, konkurrieren mit der Bindung der Antisera an das immobilisierte Antigen. Die Fähigkeit der obigen Proteine, mit der Bindung der Antisera an das immobilisierte Protein zu konkurrieren, wird mit dem Protein von Seq. Id. Nr. 2 verglichen. Die Prozente Kreuzreaktivität für die obigen Proteine werden mit Standard-Rechenverfahren berechnet. Jene Antisera, die weniger als 10 Prozent Kreuzreaktivität mit jedem der oben angeführten Proteine aufweisen, werden ausgewählt und vereinigt. Die kreuzreagierenden Antikörper werden dann durch Immunabsorption mit den oben angeführten Proteinen aus den vereinigten Antisera entfernt.
Die immunabsorbierten und vereinigten Antisera werden dann in einem kompetitiven Bindungsimmuntest, wie er oben beschrieben ist, verwendet, um ein zweites Protein mit dem Immunogen-Protein (dem CAIR-Protein von Seq. Id. Nr. 2) zu vergleichen. Um diesen Vergleich durchzuführen, werden die beiden Proteine jeweils über einen großen Konzentrationsbereich getestet, und es wird die Menge jedes Proteins bestimmt, die erforderlich ist, um 50% der Bindung der Antisera an das immobilisierte Protein zu inhibieren. Wenn die erforderliche Menge des zweiten Proteins weniger als das Zehnfache der erforderlichen Menge des Proteins von Seq. Id. Nr. 2 beträgt, dann wird das zweite Protein als spezifisch bindend an einen Antikörper angesehen, der gegen ein Immunogen erzeugt wurde, das aus dem Protein von Seq. Id. Nr. 2 besteht.
Es versteht sich, daß CAIR-Proteine eine Familie von verwandten Proteinen bezeichnet. Für ein spezielles Genprodukt wie das CAIR-1 Protein bezieht sich dieser Terminus nicht nur auf die hierin offenbarte Aminosäuresequenz, sondern auch auf andere Proteine, die allele, nicht-allele oder Speziesvarianten sind. Es versteht sich ebenfalls, daß der Terminus "CAIR-Proteine" nicht-natürliche Mutationen einschließt, die durch absichtliche Mutation mittels konventioneller Rekombinationstechniken wie das Einführen von Einzelmutationen oder durch Herausschneiden kurzer Teile CAIR-Protein-codierender DNA oder durch Substitution neuer Aminosäuren oder Hinzufügen neuer Aminosäuren eingeführt wurden. Solche geringfügigen Veränderungen müssen die immunologische Identität des ursprünglichen Moleküls und/oder seine biologische Aktivität im wesentlichen erhalten. Daher schließen diese Veränderungen Proteine ein, die mit einem bestimmten natürlich vorkommenden CAIR-Protein, zum Beispiel dem in Seq. Id. Nr. 2 gezeigten CAIR-1 Protein, spezifisch immunoreaktiv sind. Die biologischen Eigenschaften der veränderten Proteine können durch Expression des Proteins in einer geeigneten Zellinie und Konfrontation der Zelle in Kultur mit CAI bestimmt werden. Spezielle als geringfügig erachtete Proteinmodifikationen würden konservative Substitutionen einschließen, das heißt, eine Substitution von Aminosäuren ähnlicher chemischer Eigenschaften, z. B. Glutaminsäure für Asparaginsäure oder Glutamin für Asparagin. Durch eine optimale Ausrichtung eines Proteins mit dem Protein von Seq. Id. Nr. 2 sowie durch die Verwendung der hier beschriebenen konventionellen Immuntests zur Bestimmung der immunologischen Identität sowie durch Zellwachstumstests zur Bestimmung der biologischen Aktivität kann man leicht die Proteinzusammensetzungen dieser Erfindung ermitteln.
CAIR-Proteine, die nach ihrem Ursprungsgewebe benannt sind, beziehen sich auf das Genprodukt aus dieser Familie, das überwiegend in diesem Gewebe exprimiert wird. Der Terminus "Skelettmuskel-CAIR-Protein" bezieht sich zum Beispiel auf das CAIR-Protein, das in skelettalem Gewebe exprimiert wird. Als anderes Beispiel bezieht sich der Terminus "Herz-CAIR-Protein" auf das CAIR-Protein, das in Herzgewebe exprimiert wird. Da CAIR- Proteine eine Familie verwandter Proteine darstellen, können die in verschiedenen Geweben exprimierten Proteine das Produkt verschiedener Gene in der Familie sein.

C. CAIR-Protein-codierende Nucleinsäuren

Diese Erfindung bezieht sich auf isolierte Nucleinsäuresequenzen, die für CAIR- Proteine codieren. Die Nucleinsäurezusammensetzungen dieser Erfindung, unabhängig ob RNA, cDNA, genomische DNA oder ein Hybrid der verschiedenen Kombinationen, können aus natürlichen Quellen isoliert oder in vitro synthetisiert werden. Die beanspruchten Nucleinsäuren können in transformierten oder transfizierten intakten Zellen, in einem transformierten oder transfizierten Zell-Lysat oder in teilgereinigter oder im wesentlichen reiner Form vorliegen.
Die Nucleinsäuresequenzen dieser Erfindung sind typischerweise identisch mit oder zeigen wenigstens 85 Prozent Sequenzidentität, vorzugsweise wenigstens 90 bis 95 Prozent Sequenzidentität und insbesondere wenigstens 99 Prozent Sequenzidentität (wie oben beschrieben bestimmt) mit der Nucleinsäuresequenz von Seq. Id. Nr. 1. Nucleinsäuren, die für Säugetier-CAIR-1-Proteine codieren, werden typischerweise unter stringenten Bedingungen an die Nucleinsäuresequenz von Seq. Id. Nr. 1 hybridisieren. Zum Beispiel werden Nucleinsäuren, die für CAIR-Proteine codieren, unter den Hybridisierungs- und Waschbedingungen von 50% Formamid bei 42ºC an die Nucleinsäure von Seq. Id. Nr. 1 hybridisieren. Es können auch andere stringente Hybridisierungsbedingungen gewählt werden. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, daß sie etwa 5ºC unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert liegen. Der Tm ist jene Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Typischerweise werden stringente Bedingungen jene sein, bei denen die Salzkonzentration eine Na-Ionen-Konzentration von mindestens etwa 0,1 bis 1 N bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5 ist und die Temperatur mindestens etwa 60ºC beträgt. Da andere Faktoren die Stringenz der Hybridisierung signifikant beeinflussen können, wobei diese Faktoren unter anderem Basenzusammensetzung und Größe der komplementären Stränge, die Gegenwart organischer Lösungsmittel und das Ausmaß der Basenfehlpaarung einschließen, ist die Kombination von Parametern wichtiger als der absolute Wert jedes einzelnen.
Techniken für die Nucleinsäure-Manipulation von Genen, die für die CAIR-Proteine codieren, wie zum Beispiel das Subklonieren von Polypeptid-codierenden Nucleinsäuresequenzen in Expressionsvektoren, das Markieren von Sonden, DNA- Hybridisierung und dergleichen sind allgemein in Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2. Ausgabe), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, hier zum Zwecke der Bezugnahme zitiert, beschrieben. Dieses Handbuch wird im folgenden als "Sambrook, et al. " bezeichnet.
Im allgemeinen können CAIR-Protein-codierende Nucleinsäuren erhalten werden, indem zuerst eine Zellinie hergestellt wird, in welcher die Expression von CAIR-Proteinen induziert wird. Das wird erreicht, indem die Zellen in Gegenwart von CAI oder einem funktionellen Äquivalent, wie in Abschnitt (A) und Beispiel 1 beschrieben, kultiviert werden. Dann wird durch subtraktive Hybridisierung zwischen in der Kultur erhaltenen CAI- resistenten Zellen und der nicht-resistenten Eltern-Zellinie eine differentielle Sonde erhalten. Verfahren der subtraktiven Hybridisierung sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Hampson et al., Nucleic Acids Res., 20: 2899 (1992) und Beispiel 2.
Die resistente Zellinie wird dann dazu verwendet, eine cDNA-Bank herzustellen, welche anschließend mit der markierten differentiellen Sonde untersucht werden kann. Positive Klone werden dann isoliert, und diese Klone werden mittels der markierten differentiellen Sonde auf induzierte Expression von CAIR-Proteinen gescreent. Klone, die eine induzierte CAIR-Proteinexpression zeigen, können dann mittels Standardtechniken sequenziert werden.
Sequenzauflistung Nummer 1 liefert die Nucleotidsequenz, die auf diese Art für 1269 Basen des 3'Endes des CAIR-1-Gens aus A2058-20R-Zellen erhalten wurde. Diese repräsentiert etwa 40% der gesamten Information, welche ungefähr 2,8 kb beträgt, wie aus dem Northern-Blot (Fig. 1) bestimmt wurde. Diese Sequenzauflistung kann dazu verwendet werden, mittels zahlreicher, dem Fachmann wohlbekannter Verfahren die Gesamtsequenz zu erhalten.
Zum Beispiel können auch verschiedene Verfahren der Zielsequenzamplifikation wie die Polymerasekettenreaktion verwendet werden, um für CAIR-Resistenzprotein codierende DNA zu präparieren. Die Polymerasekettenreaktion-(PCR-)Technologie wird verwendet, um solche Nucleinsäuresequenzen direkt aus mRNA, aus cDNA und aus genomischen DNA- Banken oder cDNA-Banken zu amplifizieren. Die isolierten CAIR-Protein-codierenden Sequenzen können ebenfalls als Matrizen für die PCR-Amplifikation verwendet werden.
Bei den PCR-Techniken werden Oligonucleotid-Primer, die entweder zum 5'- oder zum 3'-Ende der zu amplifizierenden DNA-Region komplementär sind, synthetisiert, oder es können Zufalls-Primer Verwendung finden. Die Polymerasekettenreaktion wird dann mittels dieser beiden Primer durchgeführt. Siehe PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (Innis, M., Gelfand, D., Sninsky, J., und White, T., Hrsg.), Academic Press, San Diego (1990). Primer können so gewählt werden, daß die gesamten Regionen, die ein vollständiges CAIR-Protein codieren, oder, je nach Wunsch, kleinere DNA-Segmente amplifiziert werden.
PCR kann in einer Vielzahl verschiedener Protokolle zur Isolation von CAIR-Proteincodierenden cDNAs verwendet werden. Im allgemeinen werden passende Primer und Sonden für die Amplifikation von CAIR-Protein-codierender DNA hergestellt, indem die CAIR-Protein-codierenden DNA-Sequenzen, wie die in Seq. Id. Nr. 1, analysiert werden. Zum Beispiel können die Oligonucleotide, die zu Regionen von Seq. Id. Nr. 1 komplementär sind, in einem PCR-Protokoll verwendet werden, um Regionen CAIR-Protein-codierender DNAs zu amplifizieren. Wenn diese Regionen einmal PCR-amplifiziert sind, können sie sequenziert werden, und es können aus der erhaltenen Sequenz Oligonucleotid-Sonden hergestellt werden. Diese Sonden können dann für die Isolierung CAIR-Protein-codierender DNAs verwendet werden. Mittels dieses Verfahrens können CAIR-Proteine aus einer Reihe verschiedener Gewebe isoliert werden.
Eine bevorzugte Methode zur DNA-Isolierung ist 5' RACE. Kurz beschrieben, beinhaltet diese Technik die Verwendung von PCR, um eine DNA Sequenz mittels eines Zufalls-5'-Primers und eines definierten 3'-Primers zu amplifizieren. Die amplifizierte Sequenz wird dann in einen Vektor subkloniert, wo sie dann mittels Standardtechniken sequenziert wird. Die 5' RACE-Methode ist dem Fachmann wohlbekannt, und Kits zur Durchführung von 5' RACE sind kommerziell erhältlich (z. B. 5' RACE System, GibcoBRL, Grand Island, New York, USA).
Es gibt viele andere Verfahren zur Isolation von DNA-Sequenzen, die für die CAIR- Resistenzproteine codieren. Zum Beispiel kann eine DNA aus einer genomischen oder einer cDNA-Bank isoliert werden, indem markierte Oligonucleotidsonden verwendet werden, die Sequenzen aufweisen, welche zu den hier offenbarten Sequenzen (Seq. Id. Nr. 1) komplementär sind. Es können zum Beispiel Sonden vollständiger Länge oder Oligonucleotidsonden, die aus Subsequenzen von Seq. Id. Nr. 1 bestehen, verwendet werden. Solche Sonden können in Hybridisierungsversuchen direkt zur Isolierung CAIR- Protein-codierender DNA herangezogen werden. Alternativ können Sonden zur Verwendung in Amplifikationstechniken wie PCR konstruiert werden, und CAIR-Protein-codierende DNA kann isoliert werden, indem Verfahren wie PCR zur Anwendung kommen (siehe unten).
Zur Herstellung einer cDNA-Bank wird aus Gewebe wie Herz- oder Skelettmuskel oder Zellinien, die CAI-Resistenz zeigen, mRNA isoliert. Aus der mRNA wird cDNA hergestellt und in einen rekombinanten Vektor ligiert. Der Vektor wird zwecks Vermehrung, Screening und Klonierung in einen rekombinanten Wirt transfiziert. Verfahren zur Herstellung und zum Screening von cDNA-Banken sind wohlbekannt. Siehe Gubler und Hoffman, Gene 25: 263-269, (1983) und Sambrook et at.
Für eine genomische DNA-Bank wird die DNA aus dem Gewebe oder der Zellinie extrahiert und entweder mechanisch geschert oder enzymatisch verdaut, um Fragmente von etwa 12-20 kb Länge zu erhalten. Durch eine Gradientenzentrifugation werden die Fragmente dann von unerwünschten Größen getrennt und in Bakteriophagen-Lambda- Vektoren oder andere Vektoren eingebaut. Diese Vektoren und Phagen werden wie in Sambrook et al. beschrieben in vitro verpackt. Rekombinanten Phagen werden durch Plaque-Hybridisierung analysiert, wie dies in Benton und Davis, Science, 196: 180-182 (1977) beschrieben ist. Die Koloniehybridisierung wird durchgeführt, wie es allgemein in M. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961-3965 (1975) beschrieben wird.
DNA, welche für ein CAIR-Protein codiert, wird in entweder cDNA- oder genomischen DNA-Banken durch ihre Fähigkeit identifiziert, mit Nucleinsäuresonden zu hybridisieren, zum Beispiel in Southern-Blots, und diese DNA-Regionen werden durch dem Fachmann vertraute Standardverfahren isoliert. Alternativ dazu kann RNA, die für CAIR-Proteine codiert, durch ihre Fähigkeit, in Northern-Blots mit Nucleinsäuresonden zu hybridisieren, identifiziert werden. Siehe Sambrook et al.
Oligonucleotide zur Verwendung als Sonden werden chemisch gemäß dem Festphasen-Phosphoramidit-triester-Verfahren synthetisiert, das zuerst von Beaucage und Carruthers, Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981) beschrieben wurde, indem ein automatisches Synthesegerät verwendet wird, wie es in Needham-VanDevanter, et al., Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168 (1984) beschrieben ist. Die Reinigung von Oligonucleotiden erfolgt entweder durch native Acrylamidgelelektrophorese oder, wie in Pearson und Regnier, J. Chrom., 255: 137-149 (1983) beschrieben, durch Anionenaustausch-HPLC. Die Sequenz der synthetischen Oligonucleotide kann mittels des chemischen Abbauverfahrens von Maxam und Gilbert in: Grossman, L. und Moldave, D., Hrsg. Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65: 499-560 (1980), überprüft werden.
Andere, dem Fachmann bekannte Verfahren können ebenfalls dazu verwendet werden, DNA, die das CAIR Protein codiert, zu isolieren. Für eine Beschreibung weiterer Techniken zur Isolierung von DNA, die für spezifische Proteinmoleküle codiert, siehe Sambrook et al.

D. Expression von CAIR Proteinen

Ist DNA, die für CAIR Proteine codiert, einmal isoliert und kloniert, kann man die CAIR-Proteine in einer Reihe rekombinant gentechnisch veränderter Zellen exprimieren. Es wird davon ausgegangen, daß der Fachmann die zahlreichen Expressionssysteme, die zur Expression von CAIR-Protein-codierender DNA zur Verfügung stehen, kennt.
Kurz zusammengefaßt, wird die Expression natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuren, die für CAIR-Proteine codieren, typischerweise dadurch erreicht, daß die DNA oder cDNA funktionell an einen Promotor (der entweder konstitutiv oder induzierbar ist) angehängt wird, wonach der Einbau in einen Expressionsvektor erfolgt. Diese Vektoren können sich für die Replikation und Integration in entweder Prokaryoten oder Eukaryoten eignen. Typische Expressionsvektoren enthalten Transkriptions- und Translationsterminatoren, Initiationssequenzen und Promotoren, die für die Regulation der Expression von CAIR-Protein-codierenden Polynucleotidsequenzen brauchbar sind. Um einen hohen Expressionspegel eines klonierten Gens, wie zum Beispiel jener Polynucleotidsequenzen, die für CAIR-Proteine codieren, zu erzielen, ist es wünschenswert, Expressionsplasmide zu konstruieren, welche zumindest einen starken Promotor für die Lenkung der Transkription, eine Ribosomenbindungsstelle für die Translationsinitiation und einen Transkriptions/Translationsterminator enthalten. Die Expressionsvektoren können auch generische Expressionskassetten umfassen, die wenigstens eine unabhängige Terminatorsequenz, Sequenzen, welche die Replikation des Plasmids in sowohl Eukaryoten als auch Prokaryoten ermöglichen, d. h. Shuttle-Vektoren, und Selektionsmarker für sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Systeme enthalten. Siehe Sambrook et al. Beispiele für die Expression von CAIR-Proteinen in sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen Systemen sind unten beschrieben.

1. Expression in Prokaryoten

Eine Vielzahl von prokaryotischen Expressionssystemen kann zur Expression von CAIR-Proteinen verwendet werden. Beispiele umfassen E. coli, Bacillus, Streptomyces und dergleichen. CAIR-Proteine können zum Beispiel in E. coli exprimiert werden.
Es ist erforderlich, Expressionsplasmide, welche zumindest einen starken Promotor zur Lenkung der Transkription, eine Ribosomenbindungsstelle für die Translationsinitiation und einen Transkriptions/Translationsterminator enthalten, zu konstruieren. Beispiele für regulatorische Regionen, die für diesen Zweck in E. coli geeignet sind, sind die Promotor- und Operatorregion des Tryptophan-Biosyntheseweges von E. coli, wie von Yanofsky, J. Bacteriot, 158: 1018-1024 (1984) beschrieben, und der linksgerichtete Promotor von Phage Lambda (PX), wie von Herskowitz et al., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445 (1980) beschrieben. Die Miteinbeziehung von Selektionsmarkern in DNA-Vektoren, die in E. coli transformiert wurden, ist ebenfalls zweckmäßig. Beispiele für solche Marker umfassen Gene, die eine Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin oder Chloramphenicol vermitteln. Für Details betreffend Selektionsmarker für die Anwendung in E. coli siehe Sambrook et al.
CAIR-Proteine, die von prokaryotischen Zellen produziert wurden, müssen nicht unbedingt richtig gefaltet sein. Das exprimierte Protein kann bei der Reinigung aus E. coli zunächst denaturiert und anschließend renaturiert werden. Dies kann durch Lösen der bakteriell produzierten Proteine in einem chaotropischen Medium wie Guanidin-HCl und eine Reduktion sämtlicher Cysteinreste mittels eines Reduktionsmittels wie Beta-Mercaptoethanol erreicht werden. Das Protein wird dann entweder durch langsame Dialyse oder durch Gelfiltration renaturiert. Siehe US-Patent Nr. 4,511,503.
Der Nachweis des exprimierten Antigens erfolgt durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet als Radioimmuntest oder Western-Blotting oder Immunpräzipitation bekannt sind. Die Reinigung aus E. coll kann durchgeführt werden, indem man den im US-Patent Nr. 4,511,503 beschriebenen Verfahren folgt.

2. Expression in Eukaryoten

Dem Fachmann ist eine Vielzahl an eukaryotischen Expressionssystemen wie Hefe, Insektenzellinien, Vogel-, Fisch- und Säugetierzellen bekannt. Wie nachfolgend kurz beschrieben wird, können CAIR-Proteine in diesen eukaryotischen Systemen exprimiert werden.
Die Synthese von heterologen Proteinen in Hefe ist wohlbekannt. "Methods in Yeast Genetics", Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) ist eine anerkannte Arbeit, welche die verschiedenen, zur Produktion des Proteins in Hefe zur Verfügung stehenden Verfahren beschreibt.
Geeignete Vektoren haben üblicherweise Expressionskontrollsequenzen wie Promotoren, zu denen die 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme gehören, und einen Replikationsstartpunkt, Terminationssequenzen und dergleichen, wie gewünscht. Geeignete Vektoren sind z. B. in der Literatur beschrieben (Botstein et al., 1979, Gene, 8: 17-24; Broach et al., 1979, Gene 8: 121-133).
Zwei Verfahren werden zur Transformation von Hefezellen verwendet. In einem Fall werden die Hefezellen unter Verwendung von Zymolyase, Lytikase oder Glusulase zuerst in Protoplasten übergeführt, gefolgt von einer Zugabe von DNA und Polyethylenglykol (PEG). Die PEG-behandelten Protoplasten werden anschließend unter selektiven Bedingungen in einem 3%igen Agarmedium regeneriert. Details dieses Verfahrens sind in den Publikationen von J. D. Beggs, 1978, Nature (London), 275: 104-109; und Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 75: 1929-1933 (1978) angegeben. Das zweite Verfahren beinhaltet keine Entfernung der Zellwand. Statt dessen werden die Zellen mit Lithiumchlorid oder Acetat und PEG behandelt und auf selektive Platten gegeben (Ito et at, J. Bact., 153: 163-168, (1983)).
CAIR Proteine können, sind sie einmal exprimiert, aus Hefe durch Lyse der Zellen und Anwendung von Standardproteinisolierungstechniken auf die Lysate isoliert werden. Die Überwachung des Reinigungsprozesses kann durch die Anwendung von Western-Blot- Techniken oder Radioimmuntest- oder anderer Standardimmuntest-Techniken erreicht werden.
Die Sequenzen, welche für CAIR-Proteine codieren, können auch in verschiedene Expressionsvektoren ligiert werden, um für die Transformation von Zellkulturen verwendet zu werden, die z. B. von Säugetieren, Insekten, Vögeln oder Fischen stammen. Beispiele für Zellkulturen, die für die Produktion der Polypeptide brauchbar sind, sind Säugetierzellen. Säugetierzellsysteme liegen oft in der Form von Zell-Monolayern vor, obwohl auch Säugetierzellsuspensionen verwendet werden können. Eine Anzahl geeigneter Wirtszellinien, welche in der Lage sind, intakte Proteine zu exprimieren, wurde auf dem Fachgebiet entwickelt und umfaßt die HEK293-, BHK21- und CHO-Zellinien und verschiedene menschliche Zellen wie z. B. COS-Zellinien, HeLa-Zellen, Myelomazellinien, Jurkat-Zellen usw.. Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen beinhalten wie einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor (z. B. den CMV-Promotor, einen HSV tk-Promotor oder pgk-(Phosphoglyceratkinase- ) Promotor, einen Enhancer (Queen et al., Immunol. Rev., 89: 49 (1986)), und notwendige Prozessierungsinformationsstellen, wie Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen (z. B. eine "large T Ag"-poly(A)-Anhangstelle von SV40) und Transkriptionsterminationssequenzen. Andere tierische Zellen, welche zur Produktion von CAIR Proteinen brauchbar sind, sind z. B. aus dem American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7. Ausgabe 1992) verfügbar.
Passende Vektoren zur Expression von CAIR-Proteinen in Insektenzellen sind normalerweise vom SF9-Baculovirus abgeleitet. Geeignete Insektenzellinien umfassen Moskitolarven-, Seidenraupen-, Phalaenidae-Larven- ("armyworm"), Motten- und Drosophila- Zellinien wie eine Schneider-Zellinie (siehe Schneider J., Embriol. Exp. Morphol. 27: 353- 365, (1987)).
Wie oben erwähnt, enthält der Vektor, z. B. ein Plasmid, welches zur Transformation der Wirtszelle benützt wird, vorzugsweise DNA-Sequenzen, um die Transkription zu initiieren, und Sequenzen, um die Transaktion des Proteins zu kontrollieren. Diese Sequenzen werden als Expressionskontrollsequenzen bezeichnet.
Wie bei Hefe müssen, wenn höhere Tierwirtszellen verwendet werden, Polyadenylierungs- oder Transkriptionsterminationssequenzen von bekannten Säugetiergenen benötigt, um in den Vektor eingebaut werden. Ein Beispiel für eine Terminationssequenz ist die Polyadenylierungssequenz des Wachstumshormongens des Rindes. Sequenzen für das richtige Spleißen des Transkriptes können auch eingeschlossen werden. Ein Beispiel für eine Spleiß-Sequenz ist das VP1-Intron von SV40 (Sprague et al., J. Virol. 45: 773-781 (1983)).
Weiters können Gensequenzen, um die Replikation in der Wirtszelle zu kontrollieren, in den Vektor eingebaut werden, wie diese, welche in den Rinderpapillomvirusartigen Vektoren gefunden wurden. Saveria-Campo, Bovine Papilloma Virus DNA a Eucaryotic Cloning Vector", S 213-238 in DNA Cloning Volume II, a Practical Approach, Hrsg. D. M. Glover, IRL Press, Arlington, Virginia (1985).
Die Wirtszellen sind kompetent oder werden durch verschiedene Mittei für die Transformation kompetent gemacht. Es existieren einige wohlbekannte Verfahren der Einbringung von DNA in tierische Zellen. Diese umfassen: Calciumphosphatpräzipitation, Fusion der Empfängerzellen mit bakteriellen Protoplasten, welche die DNA enthalten, Behandlung der Empfängerzellen mit die DNA enthaltenden Liposomen, DEAE-Dextran, Elektroporation und Mikroinjektion der DNA direkt in die Zellen hinein.
Die transformierten Zellen werden durch auf dem Fachgebiet bekannte Mittel kultiviert. Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R. J., Hutchinson and Ross, Inc., (1977). Die exprimierten Polypeptide werden aus den Zellen, welche als Suspension oder als Monolayer gezüchtet wurden, isoliert. Die letzteren werden durch wohlbekannte mechanische, chemische oder enzymatische Mittel wiedergewonnen.

E. Reinigung der CAIR-Proteine

Die Polypeptide, die durch die Technik der In-vitro-DNA-Rekombination produziert wurden, können durch Standardtechniken gereinigt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Rekombinant produzierte Polypeptide können direkt exprimiert oder als Fusionsprotein exprimiert werden. Das Protein wird dann durch eine Kombination von Zell- Lyse (z. B. Beschallung) und Affinitätschromatographie gereinigt. Bei Fusionsprodukten wird das gewünschte Polypeptid durch nachfolgende Verdauung des Fusionsproteins mit einem geeigneten proteolytischen Enzym freigesetzt.
Die Polypeptide dieser Erfindung können durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Standard-Techniken, welche die selektive Präzipitation mit Substanzen wie Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie, Immunreinigungsverfahren und andere Verfahren einschließen, bis zur wesentlichen Reinheit gereinigt werden. Siehe z. B. R. Scops, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag: New York (1982), hier zum Zwecke der Bezugnahme zitiert. Zum Beispiel können Antikörper gegen CAIR-Proteine gewonnen werden, wie hier beschrieben wird. Zellmembranen werden aus einer Zellinie, welche das rekombinante Protein exprimiert, isoliert, das Protein wird aus den Membranen extrahiert und immunpräzipitiert. Die Proteine können dann weiter wie oben beschrieben durch standardproteinchemische Techniken gereinigt werden.

F. Nachweis von Nucleotiden, welche für CAIR-Proteine codieren

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für den Nachweis von DNA oder RNA, welche für CAIR-Proteine codieren, und für die Messung der Proteine durch Immuntesttechniken bereit. Diese Verfahren sind für zwei allgemeine Zwecke brauchbar. Erstens sind Tests zum Nachweis von Nucleinsäuren, welche für CAIR-Proteine codieren, für die Isolierung dieser Nucleinsäuren aus einer Reihe von Vertebraten-Arten gemäß den in Abschnitt (C) oben beschriebenen Verfahren und unter Verwendung der unten beschriebenen Nucleinsäurehybridisierungstests brauchbar. Zweitens stellen Tests für den Nachweis von Nucleinsäuren, welche für CAIR-Proteine codieren, ein Mittel für den Nachweis von CAI-Resistenz in einer biologischen Probe zur Verfügung.
Dem Fachmann ist eine Reihe von Verfahren für die spezifische DNA- und RNA- Messung unter Verwendung von Nucleinsäurehybridisierungstechniken bekannt. Siehe Sambrook et al.. Zum Beispiel beinhaltet ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von einer für CAIR-Proteine codierenden DNA in einer Probe einen Southern-Transfer.
Kurz beschrieben, wird verdaute genomische DNA in Agarose-Plattengelen in Puffer laufengelassen und auf Membranen transferiert. Die Hybridisierung wird mit den oben diskutierten Nucleinsäuresonden durchgeführt. Wie oben beschrieben wurde, werden die Nucleinsäuresonden auf der Basis von CAIR-Protein-codierenden Nucleinsäuresequenzen konstruiert (siehe Seq. Id. Nr. 1). Die Sonden können entweder die gesamte Länge oder weniger als die gesamte Länge der CAIR-Protein-codierenden Nucleinsäuresequenz umfassen. Kürzere Sonden werden empirisch auf ihre Spezifität getestet. Vorzugsweise sind Nucleinsäuresonden 20 Basen lang oder länger. (Für Verfahren zur Auswahl von Nucleinsäuresondensequenzen zur Verwendung in der Nucleinsäurehybridisierung siehe Sambrook et al.). Die Sichtbarmachung der hybridisierten Teile erlaubt eine qualitative Feststellung der Anwesenheit oder der Abwesenheit von CAIR-Protein-codierender DNA.
In ähnlicher Weise kann ein Northern-Transfer für den Nachweis von CAIR-Proteincodierender mRNA verwendet werden. Kurz beschrieben, wird die mRNA aus einer gegebenen Zellprobe mittels z. B. eines Verfahrens der sauren Guanidin-Phenol-Chloroform- Extraktion isoliert. Die mRNA wird dann elektrophoretisch aufgetrennt, um die mRNA- Spezies zu trennen, und die mRNA wird anschließend von dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. So wie bei den Southern-Blots werden markierte Sonden dazu verwendet, die An- oder Abwesenheit von CAIR-Proteinen zu identifizieren.
Dem Fachmann ist eine Reihe verschiedener Nucleinsäurehybridisierungsformate bekannt. Übliche Formate umfassen zum Beispiel Sandwich-Tests und Kompetitions- oder Verdrängungstests. Hybridisierungstechniken sind allgemein beschrieben in: "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach," Hrsg. Harnes, B. D. und Higgins, S. J., IRL Press, (1985); Gall und Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63: 378-383 (1969); und John et al., Nature 233: 582-587 (1969).
Sandwich-Tests sind zum Beispiel kommerziell brauchbare Hybridisierungstests für den Nachweis oder die Isolierung von Nucleinsäuresequenzen. Solche Tests verwenden eine "Fänger"-Nucleinsäure, welche kovalent an einen festen Träger gebunden ist, und eine markierte "Signal"-Nucleinsäure in Lösung. Die klinische Probe stellt die Ziel-Nucleinsäure bereit. Die "Fänger"-Nucleinsäure und die "Signal"-Nucleinsäuresonde hybridisieren mit der Ziel-Nucleinsäure, um einen "Sandwich"-Hybridisierungskomplex zu bilden. Um wirksam zu sein, kann die Signal-Nucleinsäure nicht mit der Fänger-Nucleinsäure hybridisieren.
Typischerweise werden markierte Signal-Nucleinsäuren zum Nachweis der Hybridisierung verwendet. Komplementäre Nucleinsäuren oder Signal-Nucleinsäuren können durch eines von vielen Verfahren markiert werden, welche typischerweise zum Nachweis der Anwesenheit von hybridisierten Polynucleotiden verwendetet werden. Das gebräuchlichste Nachweisverfahren ist die Verwendung der Autoradiographie mit ³H-, ¹²&sup5;I-, ³&sup5;S-, ¹&sup4;C- oder ³²P-markierten Sonden oder dergleichen. Andere Markierungen umfassen Liganden, welche an markierte Antikörper, Fluorophore, chemiluminiszente Materialien, Enzyme und Antikörper binden, die als spezifische Bindungspaarpartner für einen markierten Liganden dienen können.
Der Nachweis eines Hybridisierungskomplexes kann das Binden eines signalerzeugenden Komplexes an einen Doppelstrang von Ziel- und Sondenpolynucleotiden oder -Nucleinsäuren erfordern. Typischerweise erfolgt so eine Bindung durch Wechselwirkung zwischen einem Liganden und einem Antiliganden, wie z. B. zwischen einer ligandenkonjugierten Sonde und einem antiligandenkonjugierten Signal.
Die Markierung erlaubt außerdem einen indirekten Nachweis des Hybridisierungskomplexes. Zum Beispiel kann die Probe, wenn die Markierung ein Hapten oder ein Antigen ist, durch die Verwendung von Antikörpern nachgewiesen werden. In diesen Systemen wird ein Signal erzeugt, indem fluoreszierende Moleküle oder enzymatische Moleküle an die Antikörper angehängt werden, oder in einigen Fällen, indem eine radioaktive Markierung angehängt wird. (Tijssen P., "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon, R. H., von Knippenberg, P. H., Hrsg., Elsevier (1985), S. 9-20).
Die Empfindlichkeit der Hybridisierungstests kann durch Verwendung eines Nucleinsäureamplifikationssystems verstärkt werden, das die Ziel-Nucleinsäure, die nachzuweisen ist, vermehrt. Beispiele für solche Systeme umfassen das Polymerasekettenreaktion-System (PCR-System) und das Ligasekettenreaktion-System (LCR-System). Andere, kürzlich auf dem Fachgebiet beschriebene Verfahren sind die "Nucleic Acid Sequence Based Amplification" (NASBATM, Changene, Mississauga, Ontario) und das Q-Beta-Replikase-System.
Ein alternatives Mittel für die Feststellung des Expressionspegels eines Gens, welches für ein CAIR-Protein codiert, ist die In-situ-Hybridisierung. In-situ- Hybridisierungstests sind wohlbekannt und sind allgemein beschrieben in Angerer et al., Methods Enzymol., 152: 649-660 (1987). In einem In-situ-Hybridisierungstest werden Zellen oder Gewebearten an einen festen Träger fixiert, typischerweise an einen Objektträger aus Glas. Wenn DNA untersucht werden soll, werden die Zellen mit Hitze oder Alkali denaturiert. Anschließend werden die Zellen bei mittlerer Temperatur mit einer Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht, um das Annealing CAIR-Protein-spezifischer markierter Sonden zu ermöglichen. Die Sonden werden vorzugsweise mittels Radioisotopen oder Fluoreszenzreportern markiert.

G. Nachweis von CAIR Proteinen durch Immuntest

Zusätzlich zum Nachweis der Expression von CAIR-Protein-codierenden Nucleinsäuren durch die Nucleinsäurehybridisierung kann man auch Immuntests zum Proteinnachweis verwenden. Immuntests können zur qualitativen oder quantitativen Analyse von Proteinen verwendet werden. Ein allgemeiner Überblick über die anwendbare Technologie kann gefunden werden in Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pubs., N. Y., (1988), hier zum Zwecke der Bezugnahme zitiert.

1. Antikörperproduktion.

Mehrere Immunogene können zur Produktion von Antikörpern verwendet werden, die spezifisch mit CAIR Proteinen reagieren. Rekombinantes Protein ist das bevorzugte Immunogen für die Produktion monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Natürlich vorkommendes Protein kann auch verwendet werden, entweder in reiner oder in nicht reiner Form. Synthetische Peptide, die unter Verwendung der hier beschriebenen CAIR-1- Sequenzen hergestellt wurden, können ebenfalls als ein Immunogen für die Produktion von Antikörpern gegen das Protein verwendet werden. Rekombinantes Protein kann, wie oben beschrieben, in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen exprimiert werden und, wie allgemein oben beschrieben, gereinigt werden. Das Produkt wird dann in ein Tier, welches zur Produktion von Antikörpern fähig ist, injiziert. Für die anschließende Verwendung in einem Immuntest zur Messung des Proteins können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper erzeugt werden.
Verfahren zur Produktion polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Kurz beschrieben, wird ein Immunogen, vorzugsweise ein gereinigtes Protein, mit einem Adjuvans vermischt, und es werden Tiere immunisiert. Die Immunantwort des Tieres auf die Immunogen-Präparat wird verfolgt, indem testweise Blut abgenommen wird und der Titer der Reaktivität gegen das CAIR-Protein nachgewiesen wird. Sind genügend hohe Antikörpertiter gegen das Immunogen erreicht, wird das Blut des Tieres gesammelt, und es werden Antisera hergestellt. Um die proteinreaktiven Antikörper anzureichern, kann auf Wunsch eine weitere Fraktionierung der Antisera durchgeführt werden. (Siehe Harlow und Lane, oben). Monoklonale Antikörper können mittels verschiedener, dem Fachmann vertrauter Techniken erhalten werden. Kurz beschrieben, werden Milzzellen eines Tieres, das mit einem gewünschten Antigen immunisiert wurde, immortalisiert, üblicherweise durch Fusion mit einer Myelomazelle (siehe Kohler und Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976), hier zum Zwecke der Bezugnahme zitiert). Alternative Verfahren der Immortalisierung umfassen Transformation mit dem Epstein-Barr-Virus, Onkogenen oder Retroviren oder andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Kolonien, die von einzelnen immortalisierten Zellen stammen, werden auf die Produktion von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität und Affinität zum Antigen gescreent, wobei der Ertrag der monoklonalen Antikörper, die durch solche Zellen produziert werden, durch verschiedene Techniken, wie zum Beispiel die Injektion in den peritonealen Raum eines Vertebratenwirtes, verbessert werden kann. Alternativ kann man durch das Screenen einer DNA-Bank aus humanen B-Zellen gemäß dem von Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989) beschriebenen allgemeinen Protokoll DNA-Sequenzen isolieren, welche für einen monoklonalen Antiköper oder ein bindendes Fragment davon codieren.
Verfahren zur Produktion synthetischer Peptide sind dem Fachmann bekannt. Kurz beschrieben, werden die vorausgesagten immunogenen Regionen der hier beschriebenen CAIR-Proteinsequenzen identifiziert. Vorzugsweise werden Peptide von wenigstens 10 Aminosäuren Länge, die diesen Regionen entsprechen, synthetisiert, und die Peptide werden an größere Proteinmoleküle für die folgende Immunisierung konjugiert.
Vorzugsweise werden Peptidsequenzen, die einzigartigen Regionen eines CAIR-Proteins entsprechen, verwendet, um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch immunoreaktiv mit den CAIR-Proteinen sind. Die Produktion von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern wird dann wie oben beschrieben durchgeführt.

2. Immuntests

Ein bestimmtes Protein kann durch eine Anzahl von Immuntestverfahren gemessen werden. Für einen Übersichtsartikel über immunologische und Immuntestverfahren im allgemeinen siehe Basic and Clinical Immunology, 7. Ausgabe, D. Stites und A. Terr Hrsg. (1991). Außerdem können die Immuntests der vorliegenden Erfindung in einer von mehreren Konfigurationen durchgeführt werden, welche ausführlich in den Übersichtsartikeln Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Florida (1980); "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V. Amsterdam (1985); und in Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, oben, beschrieben sind, die jeweils hiermit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert werden.
Immuntests zur Messung von CAIR-Proteinen können mittels einer Reihe von Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. In Kürze beschrieben, können die Immuntests zur Messung des Proteins entweder kompetitive oder nichtkompetitive Bindungstests sein. Bei kompetitiven Bindungstests konkurriert der Analyt in der Probe mit einem markierten Analyten um spezifische Bindungsstellen an einem Fängerstoff, welcher an eine feste Oberfläche gebunden ist. Vorzugsweise ist der Fängerstoff ein Antikörper, der spezifisch mit CAIR-Proteinen reagiert, die wie oben beschrieben hergestellt wurden. Die Konzentration an markiertem Analyt, welcher an den Fängerstoff gebunden ist, ist umgekehrt proportional zur Menge an freiem Analyt in der Probe.
Bei einem kompetitiven Immun-Bindungstest konkurriert das in der Probe vorhandene CAIR-Protein mit markiertem Protein um die Bindung an ein spezifisches Bindemittel, zum Beispiel einen Antikörper, der spezifisch mit dem CAIR-Protein reagiert. Das Bindemittel kann an eine feste Oberfläche gebunden sein, um eine Trennung von gebundenem markierten Protein und ungebundenem markierten Protein zu bewirken. Alternativ kann der kompetitive Bindungstest in flüssiger Phase durchgeführt werden, und jede einer Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken kann dazu verwendet werden, das gebundene markierte Protein von dem ungebundenen markierten Protein zu trennen. Nach der Trennung wird die Menge an gebundenem markierten Protein bestimmt. Die Menge an Protein in der Probe ist umgekehrt proportional zur Menge an markiertem bindenden Protein.
Alternativ kann ein homogener Immuntest durchgeführt werden, in dem ein Trennungsschritt nicht notwendig ist. Bei diesen Immuntests wird die Markierung auf dem Protein durch die Bindung des Proteins an sein spezifisches Bindemittel verändert. Diese Veränderung im markierten Protein resultiert in einer Erniedrigung oder Erhöhung eines durch die Markierung ausgesandten Signals, so daß die Messung der Markierung am Ende des Immuntests einen Nachweis oder eine Quantifizierung des Proteins erlaubt.
CAIR-Proteine können auch durch eine Reihe nichtkompetitiver Immuntestverfahren nachgewiesen und quantifiziert werden. Es wird zum Beispiel ein Festphasen-Sandwich- Immuntest mit zwei Bindungsstellen verwendet. Bei diesem Testtyp ist ein Bindemittel für das Protein, zum Beispiel ein Antikörper, an eine feste Phase gebunden. Ein zweites Protein-Bindemittel, das ebenfalls ein Antikörper sein kann und das Protein an einer anderen Stelle bindet, wird markiert. Nachdem die Bindung an das Protein an beiden Stellen erfolgt ist, wird das ungebundene markierte Bindemittel entfernt und die Menge an markiertem Bindemittel, das an die feste Phase gebunden ist, gemessen. Die Menge an gebundenem markierten Bindemittel ist direkt proportional zur Menge an Protein in der Probe. Alternativ können CAIR-Proteine mittels Immunpräzipitationsverfahren nachgewiesen werden, wie sie von Otto et al., Seite 119-127 in Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Hrsg., Academic Press, New York (1993) beschrieben werden.
Eine Western Blot-Analyse kann ebenfalls zur Bestimmung der Anwesenheit von CAIR-Proteinen in einer Probe durchgeführt werden. Es wird z. B. eine Elektrophorese an einer Gewebeprobe, welche vermutlich das Protein enthält, durchgeführt. Nach der Elektrophorese zur Auftrennung der Proteine und dem Transfer der Proteine auf einen geeigneten festen Träger wie einen Nitrocellulosefilter wird der feste Träger dann mit einem Antikörper inkubiert, welcher mit dem Protein reagiert. Dieser Antikörper kann markiert sein oder kann alternativ durch nachfolgende Inkubation mit einem zweiten markierten Antikörper nachgewiesen werden, welcher den primären Antikörper bindet.
Die oben beschriebenen Immuntestformate verwenden markierte Testkomponenten. Die Markierung kann vielfältige Formen haben. Die Markierung kann gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, direkt oder indirekt an die gewünschte Komponente des Tests gekoppelt werden. Eine große Vielfalt von Markierungen kann verwendet werden. Die Komponente kann durch irgendeines von mehreren Verfahren markiert werden. Traditionell wurde eine radioaktive Markierung verwendet, welche ³H, ¹²&sup5;I, ³&sup5;S, ¹&sup4;C oder ³²P inkorporierte. Nicht-radioaktive Markierungen umfassen Liganden, welche an markierte Antikörper, Fluorophore, chemilumineszente Stoffe, Enzyme und Antikörper binden, welche als spezifische Bindungspaarpartner für einen markierten Liganden dienen können. Die Wahl der Markierung hängt von der geforderten Empfindlichkeit, von der Einfachheit der Konjugation mit der Verbindung, von der erforderlichen Stabilität und dem zur Verfügung stehenden Instrumentarium ab. Für einen Übersichtsartikel über verschiedene Markierungs- oder Signalerzeugungssysteme, die verwendet werden können, siehe US-Patent Nr. 4,391,904, das hiermit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert wird.
Antikörper, die mit einem bestimmten Protein reagieren, können auch durch eine Reihe von Immuntestverfahren gemessen werden. Für einen Übersichtsartikel über immunologische und Immuntestverfahren, welche zur Messung von Antikörpern durch Immuntesttechniken angewendet werden können, siehe Basic and Clinical Immunology, 7. Ausgabe (D. Stites und A. Terr Hrsg.), oben, Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, Hrsg., oben, und Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, oben.
Kurz gesagt, können Immuntests zur Messung von Antisera, welche mit CAIR- Proteinen reagieren, entweder kompetitive oder nichtkompetitive Bindungstests sein. Bei kompetitiven Bindungstests konkurriert der Analyt in der Probe mit einem markierten Analyten um spezifische Bindungsstellen an einem Fängerstoff, der an eine feste Oberfläche gebunden ist. Der Fängerstoff ist vorzugsweise ein gereinigtes, rekombinantes CAIR- Protein, das wie oben beschrieben produziert wurde. Andere Quellen für CAIR-Proteine, isoliertes oder teilweise gereinigtes natürlich vorkommendes Protein eingeschlossen, können auch verwendet werden. Nichtkompetitive Tests sind typischerweise Sandwich-Tests, bei denen der Analyt in der Probe zwischen zwei analytspezifischen Bindemitteln gebunden wird. Eines der Bindemittel wird als Fängerstoff verwendet und ist an eine feste Oberfläche gebunden. Das zweite Bindemittel ist markiert und wird dazu verwendet, den resultierenden Komplex durch visuelle oder instrumentelle Mittel zu messen oder nachzuweisen. Mehrere Kombinationen aus Fängerstoff und markiertem Bindemittel können verwendet werden. Eine Vielzahl verschiedener Immuntestformate, Trennungstechniken und Markierungen kann ebenfalls benutzt werden, ähnlich jenen, die oben für die Messung von CAIR-Proteinen beschrieben wurden.
Diese Erfindung umfaßt ebenfalls Kits zum Nachweis der Anwesenheit von CAIR- Proteinen in Gewebe- oder Blutproben, welche einen Behälter umfassen, der Instruktionsmaterial für die Durchführung des Tests und Antikörper enthält, die selektiv immunoreaktiv mit dem Protein sind. Der Kit kann auch andere Komponenten, wie CAIR- Proteine, Kontrollen, Pufferlösungen und sekundäre Antikörper enthalten.
Diese Erfindung umfaßt weiters Kits zum Nachweis von CAIR-Protein-codierender DNA oder RNA in Gewebe- oder Blutproben, welche Nucleinsäuresonden, wie sie hier beschrieben wurden, und Instruktionsmaterial enthalten. Der Kit kann auch zusätzliche Komponenten wie markierte Verbindungen, wie sie hier beschrieben wurden, zur Identifizierung von doppelsträngigen Nucleinsäuren enthalten.

H. Nachweis der CAIR-Resistenz

Ein allgemeines Problem bei der Behandlung verschiedener Krebsarten ist der Erwerb einer Resistenz der Tumorzellen gegen das spezielle Pharmazeutikum, dem sie ausgesetzt sind. Während der Therapie ist es wünschenswert, auf den Erwerb einer Resistenz gegen ein spezielles Pharmazeutikum zu prüfen, um die Behandlungseffizienz abzuschätzen oder um zu bestimmen, wann spezielle Behandlungsprotokolle geändert oder gestoppt werden müssen.
Wie in Beispiel 1 gezeigt, sind Tumorzellen fähig, eine CAI-Resistenz zu entwickeln. Die Entwicklung dieser Resistenz beinhaltet die Induktion von CAIR-Genen und die daraus folgende Expression von CAIR-Proteinen. Daher stellen sowohl der erhöhte CAIR-mRNA-Pegel als auch der erhöhte CAIR-Protein-Pegel geeignete Marker dar, um den Beginn einer CAI-Resistenz zu erfassen.
Diese Erfindung stellt Tests bereit, um CAI-Resistenz nachzuweisen. Diese Tests erfordern den Nachweis der erhöhten Expression von CAIR-Proteinen in Gewebeproben im Vergleich zu denselben Geweben, bevor sie CAI und seinen funktionellen Äquivalenten ausgesetzt wurden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel erfordern diese Tests, daß eine biologische Probe gewonnen wird (z. B. Tumorbiopsie oder Blutprobe), bevor mit einer Therapie begonnen wird. Während der Behandlung mit CAI oder funktionellen Äquivalenten werden regelmäßig Proben genommen und auf CAIR-Produktion untersucht. Dort, wo die CAIR-Produktion eine Erhöhung relativ zu den Anfangsproben (Prä-CAI-Proben) zeigt, kann auf das Auftreten einer CAI-Resistenz geschlossen werden.
Die CAIR-Produktion kann durch den Nachweis der Expressionspegel von CAIR- mRNA oder CAIR-Proteinen getestet werden. Mittel zum Nachweis von CAIR-mRNA sind in Abschnitt (F) beschrieben, während Mittel zum Nachweis von CAIR-Proteinen in Abschnitt (G) beschrieben sind. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die mRNA mittels Hybridisierungssonden nachgewiesen, während CAIR-Proteine mittels Immuntests nachgewiesen werden.

I. Verwendung von CAI-resistenten Zellen beim Screenen nach Resistenzmodulatoren

Die CAI-resistenten Zellen der vorliegenden Erfindung können wie in einem Biotest dazu verwendet werden, nach Verbindungen zu screenen, die eine CAI-Resistenz reduzieren oder vollkommen eliminieren. Generell wird ein solcher Test die Kultivierung CAI- resistenter Zellen in Gegenwart gleichbleibender oder sich verändernder Konzentrationen der zu screenenden Verbindungen und von CAI oder funktionell äquivalenter Moleküle umfassen. Wo die gescreenten Verbindungen die CAI-Resistenz reduzieren, wird die Wachstumsrate der Zellen abnehmen, oder die Zellen können sterben. Mittel zur Bestimmung der Zellwachstumsrate sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen zum Beispiel die Messung von Veränderungen in der Aufnahme von markierten metabolischen Substraten (z. B. [³H]-Thymidin) oder Zellzählungen.
Diese Erfindung umfaßt weiters Kits zum Screenen von Zusammensetzungen oder Kombinationen von Zusammensetzungen auf therapeutische Wirksamkeit in CAI-resistenten Zellen, welche CAI-resistente Zellen, wie hier beschrieben, und Instruktionsmaterial enthalten. Der Kit kann auch zusätzliche Komponenten wie Kulturmedien, markierte Substrate zur Bestimmung der metabolischen Aktivität der resistenten Zellen, wie sie hier beschrieben werden, für das Screenen von enthalten.

J. Pharmakolopische Zusammensetzungen

Die CAIR-Protein-codierenden Nucleinsäuresequenzen und die CAIR-Proteine selbst können zur Herstellung pharmakologischer Zusammensetzungen mit Antisinn-Molekülen, Antikörpern und Einzelkettenpeptiden verwendet werden. Die Nucleotidsequenz, welche für CAI codiert, kann zur Herstellung von Antisinn-Therapeutika verwendet werden. Diese sind Moleküle, die an mRNA, welche vom CAIR-Gen transkribiert wurde, binden und Heteroduplexmoleküle bilden, die eine weitere Translation verhindern und so die Expression von CAIR-Proteinen inhibieren, was dazu führt, daß die Zelle ihre CAI-Resistenz verliert. Verfahren zur Herstellung von Antisinn-Molekülen sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Cohen et al., US-Patent Nr. 5,264,423 und 5,276,019; Miller et al., US-Patent Nr. 4,469,863 und 4,757,055; und Uhlmann ei at, Chem. Rev., 90: 543-584 (1990).
Alternativ können das CAIR-Protein oder Fragmente davon als Immunogen verwendet werden, um CAIR-Protein spezifische Antikörper zu erzeugen, wie oben beschrieben wurde. Die Antikörper werden an das CAIR-Protein binden und so die normale Wechselwirkung dieses Proteins mit anderen zellulären Bestandteilen verhindern. Wieder wird die Zelle ihre CAI-Resistenz verlieren. Verfahren für die Verwendung von Antikörpern zur Blockierung einer normalen Proteinfunktion sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe zum Beispiel EI-Badry et al., Cell Growth and Diff., 1: 325-331 (1990).
Die CAIR-Proteine können dazu benützt werden, nicht funktionelle Mimetika herzustellen, die mit den normalen CAIR-Proteinen konkurrieren und dadurch die Wirkung der CAIR-Proteine reduzieren oder verändern. Mittel zur Herstellung disfunktioneller Mimetika umfassen die Substitution oder chemische Modifikation von entscheidenden Aminosäureresten. Die Substitution von Aminosäuren kann direkt während der chemischen Synthese von CAIR-Proteinen erfolgen oder, wenn die Proteine rekombinant exprimiert werden, durch die Verwendung von Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese, um die Nucleotidsequenz, die für bestimmte Reste codiert, zu verändern. Mittel zur Herstellung von Peptidmimetika sind dem Fachmann wohlbekannt. Zum Beispiel ist der Wirkstoff BB94 ein Peptidmimetikum, welches das Enzym Kollagenase inhibiert und als Metastaseninhibitor verwendet wird.
Wie oben in Abschnitt (B) beschrieben, enthält das CAIR-1-Resistenzprotein eine Anzahl von SH3-Domänen-Bindungstellen. SH3-Domänen wurden mit einer Reihe von zellulären Signalwegen sowie mit Zytoskelettaktivität in Verbindung gebracht. Das CAIR- Protein oder Fragmente davon, welche die SH3-Bindungsdomänen tragen, können dazu verwendet werden, selektiv SH3-Domänen zu binden und zu blockieren, wodurch spezifische Signaltransduktionswege inhibiert werden. Dies ist bei der Behandlung bestimmter Krankheiten nützlich, welche sich durch abnormale Signalübertragung auszeichnen, wie Krebs, Hyperproliferationen, Korrektur von vaskulären Kollagenosen (z. B. Lupus und rheumatoide Arthritis), Nephropathien, Neuropathien - (z. B. ALF, Alzheimer) und Myopathien (z. B. Kardiomyopathien, Skelettalmyopathien).
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung sind für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung vorgesehen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden vorzugsweise parenteral verabreicht, z. B. intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär. Daher stellt die Erfindung Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung bereit, die eine Lösung der oben beschriebenen Stoffe enthält, welche in einem akzeptablen Träger, vorzugsweise in einem wäßrigen Träger, gelöst oder suspendiert sind. Eine Vielfalt von wäßrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0.4% Kochsalzlösung, 0.3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch konventionelle, wohlbekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden oder können sterilfiltriert werden. Die resultierenden wäßrigen Lösungen können, wie sie sind, verpackt oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Erforderlichenfalls können die Zusammensetzungen pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe enthalten, um physiologischen Bedingungen näherzukommen, wie pH- einstellende und puffernde Substanzen, osmotisch wirksame Substanzen, Netzmittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat etc.
Für feste Zusammensetzungen können klassische nichttoxische feste Träger verwendet werden, die zum Beispiel pharmazeutisch reines Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen einschließen. Für die orale Verabreichung wird eine pharmazeutisch akzeptable nichttoxische Zusammensetzung durch Beimischung irgendeines der normalerweise verwendeten Hilfsstoffe, wie z. B. jene vorstehend aufgelisteten Träger, und von allgemein 10-95% Wirkstoff gebildet, wobei der Wirkstoff vorzugsweise in einer Konzentration von 25%-75% vorliegt.
Für die Verabreichung in Form eines Aerosols werden die Polypeptide, Antikörper, oder Antisinn-Moleküle vorzugsweise in feinverteilter Form gemeinsam mit einem Netzmittel und einem Treibmittel zugeführt. Natürlich darf das Netzmittel nicht toxisch sein und muß vorzugsweise in dem Treibmittel löslich sein. Repräsentative Vertreter solcher Mittel sind die Ester oder partiellen Ester von Fettsäuren, die 6 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, wie zum Beispiel Capron-, Octan-, Laurin-, Palmitin-, Stearin-, Linol-, Linolen-, Olesterin- und Ölsäure mit einem aliphatischen Polyol oder seinem cyclischen Anhydrid. Es können gemischte Ester, wie zum Beispiel gemischte oder natürlich vorkommende Glyceride, verwendet werden. Wenn gewünscht, kann auch ein Träger hinzugefügt werden, wie zum Beispiel Lecithin für die intranasale Verabreichung.
Bei der therapeutischen Anwendung werden dem Patienten Antisinn-Moleküle, Antikörper oder Polypeptide der Erfindung in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Expression von CAIR-Proteinen oder einzelne Signaltransduktionswege zu blockieren. Eine adäquate Menge zur Erreichung dieses Ziels ist als "therapeutisch effektive Dosis" definiert. Effektive Mengen für diese Verwendung werden z. B. von dem speziellen Antisinn-Molekül, Antikörper oder Polypeptid, der Art der Verabreichung, dem Gewicht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und der Einschätzung des verschreibenden Arztes abhängen.

K. Gentherapeutische Anwendungen.

Eine Vielzahl verschiedener menschlicher Krankheiten kann durch therapeutische Ansätze behandelt werden, welche das stabile Einbringen eines Gens in eine menschliche Zelle beinhalten, und zwar derart, daß das Gen transkribiert und das Genprodukt in der Zelle produziert werden kann. Krankheiten, die einer Behandlung durch solch einen Ansatz zugänglich sind, schließen Erbkrankheiten ein, insbesondere solche Krankheiten wie GSD Typ 1A, wo der Defekt an einem einzelnen Gen ist. Für eine Diskussion über die Verwendung von Gentherapie in Richtung der Behandlung von sowohl genetischen als auch erworbenen Krankheiten siehe Miller, A. D. (1992), Nature 357: 455-460, und Mulligan, R. C., (1993), Science 260: 926-932, die beide hiermit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert werden.
Diese Erfindung erwägt die Verwendung von Gentherapie für das Einbringen von CAIR-Genen in gesunde Zellen, so daß diese verschont werden und ermöglichen, kranke, z. B. Tumorzellen höheren CAI-Dosen auszusetzen, während die systemische Toxizität verringert wird. Alternativ kann Gentherapie zum Einschleusen von Genen verwendet werden, die für CAI-Mimetika codieren, welche mit CAI konkurrieren und dadurch den Pegel der CAI-Resistenz von kranken Zellen reduzieren und diese empfänglicher für eine CAI- Therapie machen.
Das Einbringen des Gens oder genetischen Materials in die Zelle ist der erste kritische Schritt bei einer gentherapeutischen Behandlung von Krankheiten. Eine Vielzahl verschiedener Verfahren ist experimentell angewendet worden. Ein Großteil der Forschung hat sich auf die Verwendung retroviraler und adenoviraler Vektoren für das Einbringen der Gene in die Zelle konzentriert. Retrovirale Vektoren haben die Fähigkeit, die transferierten Gensequenzen stabil in die chromosomale DNA der Zielzelle zu integrieren. Retrovirale Vektoren sind besonders attraktiv, weil sie sehr effizient hinsichtlich einer stabilen Transduktion eines hohen Prozentsatzes von Zielzellen sind. Dementsprechend verwenden die meisten zugelassenen klinischen Protokolle für die Gentherapie retrovirale Vektoren. Siehe Miller, A. D., (1992), oben. Retrovirale Vektoren sind wegen der hohen Effizienz, mit der die retroviralen Vektoren Zielzellen transduzieren und in das Genom der Zielzellen integrieren, besonders gut für die Modifizierung von Zellen verwendbar. Zusätzlich haben Retroviren, die den retroviralen Vektor beinhalten, die Fähigkeit, eine große Vielfalt von Gewebezellen zu infizieren.
Retrovirale Vektoren werden durch genetische Manipulation von Retroviren hergestellt. Retroviren werden RNA-Viren genannt, weil das virale Genom aus RNA besteht. Nach der Infektion wird diese genomische RNA revers in eine DNA-Kopie transkribiert, welche mit einem hohen Grad an Stabilität und Effizienz in die chromosomale DNA der transduzierten Zellen integriert wird. Die integrierte DNA-Kopie wird als Provirus bezeichnet und wird von Tochterzellen wie jedes andere Gen geerbt. Das Wildtyp-retrovirale Genom und die provirale DNA besitzen drei Gene: das gag-, das pol- und das env-Gen, welche von zwei Sequenzen mit langer terminaler Redundanz (LTR-Sequenzen) flankiert werden. Das gag-Gen codiert für die internen Struktur-(Nucleocapsid)-Proteine; das pol-Gen codiert für die RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase); und das env Gen codiert für virale Hüllglycoproteine. Die 5'- und 3'-LTRs dienen zur Unterstützung der Transkription und Polyadenylierung der RNAs des Virions. In Nachbarschaft zum 5'-LTR befinden sich Sequenzen, die für die reverse Transkription des Genoms (die tRNA-Primer-Bindungsstelle) und für die effiziente Verpackung der viralen RNA in Partikel (die Psi-Stelle) notwendig sind. Siehe Mulligan, R. C., In: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inouye (Hrsg.), 155-173 (1983); Mann, R. et al., Cell 33: 153-159 (1983); Cone, R. D. und R. C. Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6349-6353 (1984).
Die Gestaltung retroviraler Vektoren ist dem Fachmann wohlbekannt. Siehe Singer, M. und Berg, P, oben. Kurz gesagt, wenn die Sequenzen, die für die Verkapselung (oder Verpackung der retroviralen RNA in infektiöse Virione) notwendig sind, im viralen Genom fehlen, ist das Ergebnis ein cis-agierenden Defekt, welcher die Verkapselung genomischer RNA verhindert. Jedoch ist die resultierende Mutante nach wie vor in der Lage, die Synthese aller Virion-Proteine zu dirigieren. Retrovirale Genome, von denen diese Sequenzen deletiert wurden, sowie Zellinien, welche das mutierte Genom stabil in das Chromosom integriert enthalten, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden zur Konstruktion retroviraler Vektoren verwendet. Die Präparation retroviraler Vektoren und ihre Verwendung sind in vielen Publikationen beschrieben, welche die europäische Patentanmeldung EPA 0 178 220, US-Patent 4,405,712, Gilboa, Biotechnigues 4: 504-512 (1986), Mann et al., Cell 33: 153- 159 (1983), Cone und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6349-6353 (1984), Eglitis, M. A. et al. (1988) Biotechniques 6: 608-614, Miller, A. D. et al. (1989) Biotechniques 7: 981- 990, Miller, A. D. (1992) Nature, oben, Mulligan, R. C. (1993), oben und Gould, B. et al. und die internationale Patentanmeldung Nr. WO 92/07943 mit dem Titel "Retroviral Vectors Useful in Gene Therapy" einschließen. Die Lehren dieser Patente und Publikationen werden hiermit ebenfalls zum Zwecke der Bezugnahme zitiert.
Die retroviralen Vektorpartikel werden durch rekombinantes Inserieren des Gens, das für CAIR-Proteine oder nichtfunktionelle CAIR-Mimetika codiert, in einen Retrovirusvektor und Verpackung des Vektors mit retroviralen Capsidproteinen mittels einer Verpackungszellinie hergestellt. Das resultierende retrovirale Vektorpartikel ist unfähig, sich in der Wirtszelle zu replizieren, und ist fähig, sich in das Wirtszellengenom als provirate Sequenz zu integrieren, die das CAIR-Gen oder das nichtfunktionelle CAIR-Mimetikum enthält. Daraus resultiert, daß der Patient imstande ist, normales CAIR zu produzieren und somit den Effekten der Calciuminfluxinhibitoren zu widerstehen, oder alternativ die Produktion nichtfunktioneller CAIR-Mimetika den Beginn einer CAI-Resistenz verhindert.
Um retrovirale Vektorpartikel herzustellen, werden Verpackungszellinien verwendet. Eine Verpackungszellinie ist eine genetisch konstruierte Säugetiergewebekulturzellinie, welche die für die Verpackung notwendigen viralen Strukturproteine produziert, welche jedoch nicht in der Lage ist, infektiöse Virione zu produzieren. Andererseits fehlen retroviralen Vektoren die Strukturgene, sie besitzen jedoch die Nucleinsäuresequenzen, die für die Verpackung notwendig sind. Um eine Verpackungszellinie herzustellen, wird ein infektiöser Klon eines gewünschten Retrovirus, in welchem die Verpackungsstelle deletiert wurde, konstruiert. Zellen, welche dieses Konstrukt enthalten, werden alle Strukturproteine exprimieren, jedoch kann die eingebrachte DNA nicht verpackt werden. Alternativ können Verpackungszellinien hergestellt werden, indem eine Zellinie mit einem oder mehreren Expressionsplasmiden, welche für die geeigneten Nucleocapsid- und Hüllproteine codieren, transformiert wird. In diesen Zellen können die gag-, pol, und env Gene von demselben oder von verschiedenen Retroviren stammen.
Eine Anzahl von Verpackungszellinien, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, stehen auch zur Verfügung und sind Stand der Technik. Beispiele für diese Zellinien sind Crip, GPE86, PA317 und PG13. Siehe Miller et al., J. Virol. 65: 2220-2224 (1991), hiermit zitiert zum Zwecke der Bezugnahme. Beispiele für andere Verpackungszellinien sind in Cone und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6349-6353 (1984) und in Danos und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 6460-6464 (1988), Eglitis et al. (1988), oben und Miller (1990), oben, beschrieben, ebenfalls sämtlich zitiert zum Zwecke der Bezugnahme.
Es können Verpackungszellinien verwendet werden, welche fähig sind, retrovirale Vektorpartikel mit chimären Hüllproteinen zu produzieren. Alternativ können amphotrope oder xenotrope Hüllproteine wie jene, die von PA317- und GPX-Verpackungszellinien produziert werden, verwendet werden, um die retroviralen Vektoren zu verpacken.
Die nachfolgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Einschränkung angeboten.

BEISPIELE

Beispiel 1

Kultur CAI-resistenter Zellen.

Es wurde beobachtet, daß Carboxyamido-triazol (CAI) bösartige Proliferation, Invasion und Metastase von Krebszellen inhibiert, was die Rolle von CAI und verwandten Verbindungen als potentielle Krebstherapeutika nahelegt. Von Bedeutung bei der Entwicklung und Anwendung von Krebstherapeutika ist die Entwicklung einer Resistenz von Tumorzellen gegenüber der speziellen pharmakologischen Therapie, der sie ausgesetzt werden. Es war daher wünschenswert, Zellen zu entwickeln, die eine Resistenz gegen CAI exprimieren, sowohl als Modellsystem zur Untersuchung der Mechanismen der CAI- Resistenz als auch zur Bereitstellung eines Tests oder Screeningsystems auf Behandlungsmaßnahmen, welche die Resistenz gegen CAI und seinen Analoga reduzieren oder eliminieren.
Parentale menschliche Melanomzellen (A2058) mit geringer Passagezahl (Passage 13) und humane Eierstockkrebszellen (OVCAR3) wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagles medium) kultiviert, welches mit 10% fetalem Kälberserum (FCS) und pen/strep (Penicillin und Streptomycin) supplementiert war. Über einen Zeitraum von 24 bis 30 Monaten wurden die Zellen mit steigenden CAI-Konzentrationen kultiviert, beginnend mit 0.1 uM bis zum Erreichen von 45 uM. Das CAI, welches vom Developmental Therapeutics Program des National Cancer Institute stammte, wurde in DMSO gelöst, und Aliquote wurden bis zur Verwendung bei -70ºC gelagert. Das verdünnte CAI wurde je nach Bedarf direkt zu den Medien hinzugefügt. Während der Kultur und während der gesamten Experimente wurde ein kontinuierlicher Selektionsdruck mit CAI aufrechterhalten.
Es wurde entdeckt, daß A2058-Zellen erhalten wurden, die stabil resistent gegenüber 10 uM (10R), 20 uM (20R), 30 uM (30R) und 40 uM (40R) waren. In der Morphologie der CAI-resistenten A2058-Zellen wurden keine sichtlichen Unterschiede beobachtet. Die Wachstumsrate von CAI-resistenten A2058-Zellen war bis zur 40-uM-Behandlung nicht abgeschwächt, ab welcher sie etwas abnahm.
OVCAR3-Zellen, welche gegenüber 10 uM und 20 uM stabil resistent waren, wurden ebenfalls erhalten. Die OVCAR3-Zellen zeigten leicht verringerte Wachstumsraten während der CAI-Behandlungen.

Beispiel 2

Die Isolierung des CAIR-1 Gens

DNA, welche für ein Protein codiert, das mit CAI-Resistenz in A2058-Zellen korrelierte, wurde durch Subtraktionshybridisierung nach dem von Hampson et al., Nucleic Acids Res., 20: 2899 (1992) beschriebenen Verfahren isoliert.
RNA wurde aus A2058-Zellen isoliert, welche gegen 20 uM resistent waren (A2058- 20R), und als Matrize für die Synthese einer cDNA mittels reverser Transkriptase verwendet. Die resultierende cDNA wurde von der verbleibenden RNA durch alkalische Hydrolyse (0,5 M NaOH, 15 min. 55ºC), gefolgt von einer Sephadex-G50-Spin-Säule, gereinigt. Die cDNA wurde mittels 32P-dCTP-Tracern quantifiziert, und 500 ng wurden für die Hybridisierung in Lösung an 10 ug mRNA verwendet, welche aus der parentalen (Wildtyp-)Zellinie (A2058) gewonnen worden war. Die Hybridisierung wurde für 20 Stunden bei 68ºC in einem Endvolumen von 10 ul mit Endkonzentrationen von 0,5 M NaCl, 25 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, 5 mM EDTA und 1% SDS durchgeführt.
Nach der Hybridisierung wurde das Endprodukt 5fach mit doppeltdestilliertem Wasser von molekularem Reinheitsgrad verdünnt und dann ethanol-präzipitiert (1/10 Volumen 3 M NaOAc, pH 5,0, 2 Vol. 100% Ethanol, Trockeneis für 20 min oder -20ºC über Nacht). Das resultierende Pellet wurde vorsichtig mit 80% Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 50 ul Puffer gelöst (25 mM Tris-HCI, pH 7,0, 1 mM EDTA, 5% DMSO, 2 mM Ascorbinsäure) und 3 min bei 68ºC inkubiert.
Um die mRNA:cDNA-Heteroduplex chemisch querzuvernetzen, wurde 2,5- Diaziridinyl-3,4-benzochinon (DZQ) bis zu einer Endkonzentration von 200 uM zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 20 min bei 45ºC inkubiert. Die Reaktion wurde anschließend wie oben beschrieben ethanol-präzipitiert, gewaschen und als Sonde für entweder Northern-Blots, genomische DNA- oder cDNA-Banken verwendet. Die Sonde wurde unter Verwendung von Standard-Techniken des Random-primings mit ³²P-dCTP markiert, wie von Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1982) beschrieben, was hiermit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert wird. Die Markierungsreaktion wurde für 20 min bei Raumtemperatur unter Verwendung des Enzyms Sequenase II durchgeführt.
Die subtrahierte Sonde wurde zuerst gegen einen Northern-Blot von Gesamt-RNA aus parentalen A2058-Zellen und CAI-resistenten A2058-20R-Zellen hybridisiert. Für eine Anzahl von Transkripten wurde eine erhöhte Expression festgestellt (Fig. 1, oberer linker Teil). Die Rehybridisierung des Blots mit radioaktiv markiertem GAPDH als konstitutivem Gen bestätigte die erhöhte Expression (Fig. 1, unterer linker Teil).
Eine cDNA-Bank wurde von Stratagene (La Jolla, California, USA) aus A2058-20R Zellen konstruiert. Die Genbank wurde mit Standardansätzen untersucht (Id.) und die positiven Sonden wurden plaque-gereinigt. 41 Klone wurden selektiert und 35 wurden durch Restriktionsverdau als nicht überlappend bestimmt. Fünfzehn wurden zufällig ausgewählt, um durch Northern-Analyse auf ihre Expression überprüft zu werden. Die Inserts wurden durch LGT-Agarosegelelektrophorese gereinigt und anschließend unter Standard- Bedingungen des Random-primings radioaktiv markiert (Amersham, Little Chalfont, Bucks, United Kingdom) und mit einem Northern von parentaler (Wildtyp-) Gesamt-RNA und RNA aus A2058-20R-Zellen hybridisiert. Von den gescreenten Klonen zeigten drei (Tabelle 1) eine erhöhte Expression als Antwort auf die Kultivierung mit CAI. Tabelle 1 zeigt für jeden Klon die Größe des Transkripts, wie sie von den Northern-Blots bestimmt wurde (Fig. 1), und die Größe des cDNA-Inserts. Die CAIR-1-cDNA (Klon 21 DBB), welche eine 3,8-fach (Bereich 2-fach bis ca. 4-fach in wiederholten Northerns) gesteigerte Expression im Vergleich zur aus dem konstitutiven GAPDH-Gen bestehenden Kontrolle zeigt, wurde für die Sequenzanalyse ausgewählt. Die CAIR-1-cDNA (Klon-21DBB-Insert) wurde mittels Standard-Dideoxysequenzierung (Sequenasell-Kit) mit ³&sup5;S-dATP-Markierung sequenziert. Die cDNA-Sequenz wird in Seq. Id. Nr. 1 gezeigt. Tabelle 1: Ergebnisse der Subtraktionshybridisierung

Beispiel 3

Charakterisierung von CAIR-1

Die CAIR-1-cDNA-Sequenz wurde mittels GeneWorks und GeneBank analysiert, und es hat sich gezeigt, daß sie einzigartig ist und einen offenen Leserahmen, ein Polyadenylierungssignal und einen Poly(A)-Schwanz enthält, was zeigt, daß es sich um das 3'-Ende eines Säugetiergens handelt. Die Translation der DNA-Sequenz ergab den Carboxy-Terminus eines Proteins, welches laut GeneBank und anderer Datenbankvergleiche einzigartig ist. Die CAIR-1-Sequenz enthält eine einzigartige prolinreiche Sequenz, welche die Konsensusdefinition für Src-Homologie 3-(SH3- )Bindungsproteine erfüllt. Die SH3-Domänen sind in Signalproteinen häufig, und es wurde gezeigt, daß sie auf Zytoskelett-, Membran- und andere Signalproteine abzielen (Koch et al., Science 252: 668-674 (1991)). Die SH3-BP-Domänen-Konsensussequenz ist: XPXXPPPψXP, wobei die Positionen 2, 7 und 10 obligat P (Prolin) sein müssen, das X eine beliebige Aminosäure und das ψ eine hydrophobe Aminosäure ist. Es gibt vier einzigartige Versionen dieser SH3-Bindungsprotein-Konsensussequenzen im Carboxy-Terminus des CAIR-1 Proteins (Tabelle 2). Tabelle 2: Konsensussequenzen von SH3-Bindungsproteindomänen CAIR-1 A bis D wurden innerhalb des von Klon 21 DBB codierten CAIR-Proteins identifiziert.
¹ Ren et al. Science 259: 1157-1161 (1993)
2,3 Kapeller et al. Biol. Chem., 21: 1927-1233 (1994)

Beispiel 4

Expression von CAIR-Proteinen in Geweben.

Handelsübliche Northerns mit Poly(A)-RNA aus menschlichem Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas, Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstöcken, Dünndarm, Dickdarm und peripheren Blutleukozyten wurden von Stratagene (La Jolla, California, USA) bezogen. Die Präparationen wurden mit der CAIR-1-Sonde untersucht.
Die Verteilung von CAIR-1 im menschlichen Gewebe zeigte markante Expression in Herz, Skelettmuskel (beide besitzen bekannterweise eine beträchtliche calcium-vermittelte Regulation) und ebenso in Plazenta, Lunge und Leber. Eine geringere Expression wurde in Gehirn, Niere und Pankreas festgestellt. Die Expression in Prostata, Hoden, Eierstöcken und Dickdarm war minimal.

Beispiel 5

Nachweis von SH3-bindenden Regionen in CAIR-1

Die cDNA von CAIR-1, welche eine SH3-Bindungsdomäne enthält, wird an BamHI- und EcoRl-Orten in pGEX-2T-Vektoren subkloniert. Escherichia-coü-Zellen werden mit dem subklonierten pGEX2T-Vektor transformiert. Die Expression des CAIR-1-Fusionsproteins wird mit Isopropyl-1-thio-B-D-galactopyranosid induziert. Die Zellen werden dann lysiert, und das Lysat, welches die GST-CAIR-1-Fusionsproteine enthält, wird mittels Glutathionagarose- Perlen gereinigt und mit Tris-HCl, das reduziertes Glutathion enthält, eluiert.
Das gereinigte GST-CAIR-1-Fusionsprotein wird an Glutathionsepharose-Perlen immobilisiert. Die Perlen werden anschließend bei 4ºC (unter konstantem Schütteln) mit den Proteinen, welche SH3-Domänen enthalten, wie Ab1, Fyn, Lck und p85, inkubiert. Die Perlen werden gewaschen, und die eluierten Proteine werden mittels SDS-PAGE bei 4ºC und unter konstantem Schütteln überprüft.
Der SH3-CAIR-1-Komplex wird dann mittels Glutathionsepharose-Perlen gereinigt und anschließend elektrophoretisch aufgetrennt. SH3-bindende Komplexe können mit kommerziell erhältlichen SH3-Antikörpern (Antikörper gegen SH3-haltiges Protein) oder mit einem Antikörper gegen CAIR-1 identifiziert werden.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Vereinigte Staaten von Amerika, repräsentiert durch "The Secretary of the Department of Health and Human Services"
(B) STRASSE: 6011 Executive Blvd., Suite 325
(C) STADT: Rockville
(D) STAAT: Maryland
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL (PLZ) 20852
(G) TELEFON: (301) 496-7056
(H) TELEFAX: (301) 402-0220
(I) TELEX:
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: CAI-RESISTENZPROTEINE CODIERENDE DNA UND IHRE ANWENDUNG
(iii) ANZAHL SEQUENZEN: 10
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Floppy-Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(v) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: WO wird zugewiesen
(B) TAG DER ANMELDUNG: 14. März 1995
(C) KLASSIFIKATION:
(vi) FRÜHERE ANMELDEDATEN
(A) ANMELDENUMMER: US 08/212,190
(B) TAG DER ANMELDUNG: 14. März 1994
(vii) INFORMATIONEN ÜBER DEN ANWALT:
(A) NAME: Weber, Kenneth A.
(B) REGISTRIERNUMMER: 31,677
(C) AKTENZEICHEN: 15280-204000PC DHHS Ref. Nr. E-112-94/0
(viii) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (415) 543-9600
(B) TELEFAX: (415) 543-5043
2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 1269 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) ORT: 1..1269
(D) WEITERE INFORMATION: /standard_name = "CAIR-1 cDNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 1
(2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 241 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLART: Protein
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) ORT: 1..241
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "CAIR-1 PROTEIN"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 2
(2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierungsstelle
(B) ORT: 1
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "X ist eine beliebige Aminosäure"
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Region
(B) ORT: 2
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "P ist obligat Prolin"
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierungsstelle
(B) ORT: 3
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "X ist eine beliebige Aminosäure"
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierungsstelle
(B) ORT: 4
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "X ist eine beliebige Aminosäure"
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Region
(B) ORT: 5
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "P ist obligat Prolin"
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Region
(B) ORT: 6
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "P ist obligat Prolin"
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierungsstelle
(B) ORT: 7
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "P ist obligat Prolin"
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierungsstelle
(B) ORT: 8
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "P ist eine hydrophobe Aminosäure"
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierungsstelle
(B) ORT: 9
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "X ist eine Aminosäure"
(ix) EIGENSCHAFT:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Region
(B) ORT: 10
(D) WEITERE INFORMATION: /note= "P ist obligat Prolin"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 3
(2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 4
(2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 5
(2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 6:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 6
(2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 7:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 7
(2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 8:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKULART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 8
(2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 9:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LANGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 9
(2) INFORMATION FÜR SEQ. ID. NR. 10:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 10

Claims

1. Isolierte menschliche Nucleinsäure, die für ein Carboxyamido-triazol- Resistenzprotein (CAIR-Protein) codiert, wobei diese Nucleinsäure imstande ist, in Gegenwart einer menschlichen genomischen DNA-Bank unter stringenten Bedingungen spezifisch an eine zweite Nucleinsäure zu hybridisieren, die aus der Nucleinsäuresequenz von Seq. Id. Nr. 1 besteht.

2. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäuresequenz wenigstens 95% Sequenzidentität mit der Nucleinsäure von Seq. Id. Nr. 1 aufweist.

3. Nucleinsäure nach Anspruch 2, wobei die Nucleinsäure die Nucleotidsequenz von Seq. Id. Nr. 1 umfaßt.

4. Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure, wenn sie in einer Zellinie vorkommt, das von ihr codierte Protein mit höheren Pegeln exprimiert, wenn die Zellinie in Gegenwart einer CAI-Konzentration von wenigstens 10 uM kultiviert wird, als wenn die Zellinie unter denselben Kulturbedingungen ohne CAI kultiviert wird.

5. Isoliertes CAIR-Protein, wobei das Protein wenigstens 80% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Seq. Id. Nr. 2 aufweist.

6. Isoliertes CAIR-Protein nach Anspruch 5, wobei das Protein wenigstens 95% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Seq. Id. Nr. 2 aufweist.

7. Isoliertes CAIR-Protein nach Anspruch 5, wobei das Protein, wenn es in einer Zellinie exprimiert wird, mit höheren Pegeln exprimiert wird, wenn die Zellinie in Gegenwart einer CAI-Konzentration von wenigstens 10 uM kultiviert wird, als wenn die Zellinie unter denselben Kulturbedingungen ohne CAI kultiviert wird.

8. Isoliertes CAIR-Protein nach Anspruch 5, wobei das Protein spezifisch an einen Antikörper bindet, der gegen ein Immunogen erzeugt wurde, das aus der durch Seq. Id Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.

9. Protein nach Anspruch 8, wobei der Carboxy-Terminus des Proteins aus einem Polypeptid von Seq. Id Nr. 2 besteht.

10. CAIR-Protein nach Anspruch 9, wobei das Protein rekombinant hergestellt wurde.

11. Zelle, die zum Wachstum und zur Proliferation imstande ist, wenn sie in Gegenwart von CAI kultiviert wird, das in einer Konzentration von 40 uM bis 45 uM vorliegt.

12. Zelle nach Anspruch 11, wobei die Zelle A2058-20R ist.

13. Zelle nach Anspruch 11, wobei die Zelle OVCAR3-R ist.

14. Verfahren zur Bestimmung der CAI-Resistenz einer biologischen Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) das Inkontaktbringen der Probe mit einem Bindemittel, das imstande ist, spezifisch ein CAIR-Protein oder eine für ein CAIR-Protein codierende Nucleinsäure zu binden;

b) Inkubation des Bindemittels mit der biologischen Probe, um einen Bindemittel: CAIR-Protein- oder Bindemittel: Nucleinsäure-Komplex zu bilden;

c) Nachweis des Komplexes.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Bindemittel ein Antikörper ist, der spezifisch immunoreaktiv mit dem CAIR-Protein ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Nachweisschritt umfaßt:

a) das Inkontaktbringen des Komplexes mit einem markierten Antikörper, der spezifisch das Bindemittel bindet; und

b) Nachweis des markierten Antikörpers.

17. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Bindemittel eine Nucleinsäure ist, die unter stringenten Bedingungen spezifisch an eine zweite Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die für ein CAIR-Protein codiert.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Nucleinsäure spezifisch an eine DNA- Sequenz von Seq. Id. Nr. 1 bindet.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Nachweisschritt den Nachweis einer markierten Nucleinsäure umfaßt.

20. Kit zur Bestimmung der CAI-Resistenz einer biologischen Probe, wobei der Kit einen Behälter umfaßt, der ein Bindemittel enthält, das imstande ist, spezifisch ein CAIR-Protein oder eine für ein CAIR-Protein codierende Nucleinsäure zu binden.

21. Kit nach Anspruch 20, wobei das Bindemittel ein Antikörper ist, der spezifisch an ein CAIR-Protein bindet.

22. Kit nach Anspruch 21, der außerdem einen Behälter umfaßt, der ein Mittel zum Nachweis des Antikörpers enthält.

23. Kit nach Anspruch 20, wobei das Bindemittel eine zweite Nucleinsäure ist, die unter stringenten Bedingungen spezifisch an die Nucleinsäuresequenz bindet.

24. Kit zur Untersuchung von Verbindungen auf eine CAIR-verhindernde Wirkung, wobei der Kit einen Behälter umfaßt, der eine CAI-resistente Zelle enthält.

25. Kit nach Anspruch 24, wobei die CAI-resistente Zelle A2058-20R ist.

26. Kit nach Anspruch 24, wobei die CAI-resistente Zelle OVCAR3-R ist.

27. Antikörper, der spezifisch ein CAIR-Protein bindet.

28. Antikörper nach Anspruch 27, wobei der Antikörper gegen ein Immunogen erzeugt wurde, das aus der durch Seq. Id Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.

29. Pharmakologische Zusammensetzung, die CAI-Resistenz verringert, wobei die Zusammensetzung ein Bindemittel umfaßt, das an ein für ein CAIR-Protein codierendes Nucleotid bindet.

30. Pharmakologische Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei das Bindemittel ein Antisinn-Molekül ist, das spezifisch an ein Nucleotid hybridisiert, das für ein CAIR-Protein codiert.

31. Pharmakologische Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei das Nucleotid, das für ein CAIR-Protein codiert, Seq. Id. Nr. 1 ist.