DE69534246T2

DE69534246T2 - Mn-gen und -protein

Info

Publication number: DE69534246T2
Application number: DE69534246T
Authority: DE
Inventors: Jan Zavada; Silvia Pastorekova; Jaromir Pastorek
Original assignee: Institute of Virology (Slovak Academy of Science)
Current assignee: Institute of Virology (Slovak Academy of Science)
Priority date: 1994-06-15
Filing date: 1995-06-15
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2015-06-16
Also published as: DE69536047D1; EP0763110B1; EP1595947A1; DE69534246D1; JP2002515848A; EP0763110B9; EP1595947B1; ES2339461T3; HK1084148A1; EP0763110A2; JP3977416B2; ATE458043T1; ATE296883T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der medizinischen Genetik und das Gebiet der Biotechnologie und der Immunchemie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Identifizierung eines neuen Genes – des MN-Genes – eines zellulären Genes, das für das MN-Protein codiert. Die Erfinder haben herausgefunden, dass MN-Proteine mit der Tumorigenität assoziiert sind. Beweise weisen darauf hin, dass das MN-Protein einen potentiellen neuen Typ eines Onkoproteins repräsentiert. Die Identifizierung eines MN-Antigens ebenso wie Antikörper, die hierfür spezifisch sind, in Patientenproben stellt die Basis für diagnostische/prognostische Assays für Krebs bereit. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung den MN-Promotor.
Hintergrund der Erfindung
Ein neues quasi-virales Mittel mit ziemlich unüblichen Eigenschaften wurde durch seine Fähigkeit nachgewiesen, Mutanten des Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) mit einem Hitze-labilen Oberflächen G-Protein in HeLa-Zellen (eine Zelllinie, die aus einem humanen zervikalen Adenokarzinom abgeleitet ist) zu komplementieren, die mit humanen Brustkrebszellen co-kultiviert wurden (Zavada et al., Nature New Biol., 240: 124 (1972); Zavada et al., J. Gen. Virol., 24: 327 (1974); Zavada J., Arch. Virol., 50: 1 (1976); Zavada, J., J. Gen. Virol., 63: 15–24 (1982); Zavada und Zavadova, Arch. Virol., 118: 189 (1991)). Das quasi-virale Mittel wurde als MaTu bezeichnet, weil es vermutlich von einem humanen Brusttumor (mammary tumor) abgeleitet ist.
Es existiert ein signifikantes medizinisches Interesse an der Untersuchung und Charakterisierung von MaTu, weil es als gänzlich neuer Typ eines molekularen Parasiten lebender Zellen erscheint und möglicherweise aus einem humanen Tumor stammt. Zavada et al., internationale Veröffentlichungs-Nr. WO 93/18152 (veröffentlicht am 1. September 1993), beschreibt die Aufklärung der biologischen und molekularen Natur von MaTu, die die Entdeckung des MN-Genes und -Proteines zur Folge hatte. MaTu wurde von den Erfindern als Zweikomponentensystem entdeckt, das einen exogenen transmissiblen Bestandteil, nämlich MX, und eine endogene zelluläre Komponente, nämlich MN, aufweist. Der MN-Bestandteil stellte sich als zelluläres Gen heraus, das eine nur sehr geringe Homologie mit bekannten DNA-Sequenzen zeigt. Das MN-Gen lag in der chromosomalen DNA aller getesteten Vertebraten vor und seine Expression war mit der Tumorigenität in starkem Maße korreliert.
Das exogene MaTu-MX-transmissible Mittel wurde als Lymphozyten-Choriomeningitis-Virus (LCMV) identifiziert, der HeLa-Zellen persistent infiziert. Die Erfinder haben entdeckt, dass die MN-Expression in HeLa-Zellen positiv durch die Zelldichte reguliert wird und dass ihre Expressionsstärke bzw. ihr Expressionsniveau durch eine persistierende Infektion mit LCMV erhöht wird.
Hierin bereitgestellte Forschungsergebnisse zeigen, dass Zellen, die mit MN-cDNA transfiziert wurden, Veränderungen durchmachen, die auf eine maligne Transformation hinweisen. Weitere Forschungserkenntnisse zeigen, dass die Störung der Zellzyklus-Kontrolle eine der Mechanismen ist, durch den MN zum komplexen Prozess der Tumorentwicklung beitragen kann.
Hierin beschrieben ist das Klonieren und Sequenzieren des MN-Genes und der rekombinanten Produktion von MN-Proteinen. Die Volle-Länge-MN-cDNA-Sequenz (SEQ. ID. NO.: 1), die Aminosäuresequenz, die davon abgeleitet ist (SEQ. ID. NO.: 2), eine genomische Sequenz für MN in voller Länge (SEQ. ID. NO.: 5) einschließlich der vorgeschlagenen Promotorsequenz (SEQ. ID. NO.: 27) sind bereitgestellt. 11 Exons (SEQ. ID. NO.: 28–38) und 10 Introns (SEQ. ID. NO.: 39–48) sind durch das MN-Gen umfasst. Ebenfalls ist hierin eine 1,4 Kilobasenregion (SEQ. ID. NO.: 49) im Mittelteil der genomischen MN-Sequenz beschrieben, die den Charakter einer typischen CpG-reichen Insel aufweist und die multiple vermeintliche Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP2 und Sp1 enthält.
Ebenfalls beschrieben sind Antikörper, die gegen Proteine/Polypeptide hergestellt wurden. MN-Proteine/Polypeptide können in serologischen Untersuchungen verwendet werden, um MN-spezifische Antikörper nachzuweisen. Weiterhin können MN-Proteine/Polypeptide und/oder Antikörper, die mit MN-Antigen reaktiv sind, in Immunassays verwendet werden, um MN-Antigen nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. Solche Assays können diagnostisch und/oder prognostisch für neoplastische/prä-neoplastische Erkrankungen sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte Nukleinsäure bereit, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest 16 Nukleotide umfasst und eine Nukleotidsequenz aufweist, die aus Folgendem ausgewählt ist:

(a) der MN-Promotor-Nukleotidsequenz wie in der begleitenden 6 dargestellt und die Nukleotidsequenzen, die zu dieser MN-Promotor-Nukleotidsequenz komplementär sind; und
(b) Nukleotidsequenzen, die zumindest zu 80% mit der Nukleotidsequenz von (a) und zu den Komplementen der Nukleotidsequenzen homolog sind; wobei die isolierte Nukleinsäuresequenz eine Promotoraktivität aufweist und/oder als Primer für die Polymerasekettenreaktion zum Identifizieren des MN-Promotors dient.

Indem der Umfang der vorliegenden Erfindung angegeben wurde, wird diese nunmehr weiter beschrieben und ausführlicher dargestellt werden.
Diese Offenbarung ist auf das MN-Gen, Fragmente hiervon und die verwandte cDNA gerichtet, die beispielsweise wie folgt nützlich sind: 1) Um MN-Proteine/Polypeptide für die biochemische Technik bzw. Biotechnologie zu erzeugen; 2) um Nukleinsäuresonden herzustellen, um auf das Vorhandensein des MN-Gens in Zellen eines Subjektes zu testen; 3) um geeignete Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) herzustellen, beispielsweise zur Verwendung in PCR-basierten Assays oder um Nukleinsäuresonden zu erzeugen; 4) um MN-Proteine und -Polypeptide ebenso wie Homologe oder nahe Homologe hierzu zu identifizieren; 5) um verschiedene mRNAs zu identifizieren, die von MN-Genen in verschiedenen Gewebezellen transkribiert wurden, vorzugsweise von Menschen; und 6) um Mutationen in MN-Genen zu identifizieren. Sie betrifft weiterhin aufgereinigte und isolierte DNA-Moleküle, die das MN-Gen oder Fragmente hiervon umfassen oder die verwandte cDNA oder Fragmente hiervon.
Somit betrifft die Offenbarung gemäß eines Aspektes isolierte Nukleinsäuresequenzen, die MN-Proteine oder -Polypeptide codieren, wobei die Nukleotidsequenzen für diese Nukleinsäuren aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Folgendem besteht:

(a) SEQ. ID. NO.: 1;
(b) Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen an SEQ. ID. NO.: 1 oder an ihr Komplement hybridisieren;
(c) Nukleotidsequenzen, die sich von SEQ. ID. NO.: 1 oder von den Nukleotidsequenzen von (b) in ihrer Codon-Sequenz wegen der Degenerierung des genetischen Codes unterscheiden. Weiterhin sind solche Nukleinsäuresequenzen aus Nukleotidsequenzen ausgewählt, die auf Grundlage der Degenerierung des genetischen Codes an SEQ. ID. NO.: 1 oder an ihr Komplement unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren würden.

Weiterhin können solche isolierten Nukleinsäuren, die MN-Proteine oder -Polypeptide codieren, ebenfalls die MN-Nukleinsäuren der in 3(A–F) dargestellten genomischen Sequenz einschließen, d. h. SEQ. ID. NO.: 5 ebenso wie Sequenzen, die an diese oder ihr Komplement unter stringenten Bedingungen hybridisieren oder an SEQ. ID. NO.: 5 oder ihr Komplement unter solchen Bedingungen hybridisieren würden, jedoch auf Grundlage der Degenerierung des genetischen Codes. Degenerierte Varianten von SEQ. ID. NO.: 1 und 5 liegen innerhalb des Umfangs der Offenbarung.
Weiterhin betrifft diese Offenbarung Nukleinsäuresonden, die Fragmente der isolierten Nukleinsäuren sind, die MN-Proteine oder Polypeptide wie oben beschrieben codieren. Vorzugsweise umfassen diese Nukleinsäuresonden zumindest 29 Nukleotide, besonders bevorzugt zumindest 50 Nukleotide, noch mehr bevorzugt zumindest 100 Nukleotide und noch mehr bevorzugt zumindest 150 Nukleotide.
Noch weiter betrifft diese Offenbarung isolierte Nukleinsäuren, die zumindest 27 Nukleotide enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Folgendem besteht:

(a) SEQ. ID. NO.: 1, 5 und 27–49, die zu SEQ. ID. NO.: 1, 5 und 27–49 komplementär sind;
(b) Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Standardhybridisierungsbedingungen an eine oder mehrere der folgenden Nukleotidsequenzen hybridisieren: SEQ. ID. NO.: 1, 5 und 27–49 und die respektiven Komplemente der SEQ. ID. NO.: 1, 5 und 27–49; und
(c) Nukleotidsequenzen, die sich von den Nukleotidsequenzen von (a) und (b) in ihrer Codonsequenz wegen der Degenerierung des genetischen Codes unterscheiden. Die Offenbarung betrifft ebenfalls Nukleinsäuren, die jedoch aufgrund der Degenerierung des genetischen Codes an die Nukleinsäuren von (a) und (b) unter stringenten Standardhybridisierungsbedingungen hybridisieren würden. Weiterhin betrifft diese Offenbarung Nukleinsäuren von (b) und (c), die teilweise oder insgesamt an die nicht-codierenden Bereiche von SEQ. ID. NO.: 5 oder seinem Komplement wie beispielsweise Sequenzen hybridisieren, die als Nukleinsäuresonden funktionieren, um MN-Nukleinsäuresequenzen zu identifizieren. Eine konventionelle Technologie kann zur Bestimmung verwendet werden, ob die Nukleinsäuren von (b) und (c) oder der Fragmente von SEQ. ID. NO.: 5 nützlich sind, um MN-Nukleinsäuresequenzen zu identifizieren, wie es beispielsweise in Benton und Davis, Science, 1996: 180 (1977) und Fuscoe et al., Genomics, 5: 100 (1989), beschrieben ist. Im Allgemeinen sind solche Nukleinsäuren vorzugsweise zumindest 29 Nukleotide, am meisten bevorzugt zumindest 50 Nukleotide und noch mehr bevorzugt zumindest 100 Nukleotide lang. Eine beispielhafte und bevorzugte Nukleinsäuresonde ist SEQ. ID. NO.: 55 (eine 470 bp-Sonde, die in RNase-Protektionsassays von Nutzen ist).

Testkits können die Nukleinsäuresonden umfassen, die diagnostisch/prognostisch für eine neoplastische und/oder prä-neoplastische Erkrankung von Nutzen sind. Bevorzugte Testkits umfassen Mittel zum Nachweisen oder Messen der Hybridisierung der Sonden an das MN-Gen oder das mRNA-Produkt des MN-Gens, wie beispielsweise ein Visualisierungsmittel.
Fragmente der isolierten Nukleinsäuren können ebenfalls als PCR-Primer verwendet werden, um Segmente von MN-Genen zu amplifizieren, und können beim Identifizieren von Mutationen in MN-Genen von Nutzen sein. Typischerweise sind die PCR-Primer Oligonukleotide, vorzugsweise zumindest 16 Oligonukleotide, sie können jedoch beträchtlich länger sein. Beispielhafte Primer können von 17 bis ungefähr 50 Nukleotiden sein, vorzugsweise von ungefähr 19 Nukleotiden bis ungefähr 45 Nukleotiden.
Weiterhin betrifft sie die Verwendung solcher PCR-Primer in Verfahren zum Nachweisen von Mutationen in einem isolierten MN-Gen und/oder Fragmenten hiervon. Beispielsweise können solche Verfahren das Amplifizieren eines oder mehrerer Fragmente eines MN-Gens durch PCR und die Bestimmung umfassen, ob jedes der einen oder mehreren Fragmente Mutationen enthält, durch beispielsweise Vergleichen der Größe der amplifizierten Fragmente mit solchen von in ähnlicher Weise amplifizierten entsprechenden Fragmenten von MN-Genen, von denen bekannt ist, dass sie normal sind, durch Verwendung eines PCR- Einstrangkonformations-Polymorphismus-Assay oder eines denaturierenden Gradientengel-Elektrophorese-Assays.
Diese Offenbarung betrifft ebenfalls Nukleinsäuren, die MN-Proteine oder -Polypeptide codieren, die spezifisch durch monoklonale Antikörper gebunden sind, die als M75 bezeichnet werden und die durch die Hybridoma VU-M75 erzeugt werden, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209 (USA) unter der ATCC-Nr. HB 11128 hinterlegt sind und/oder durch monoklonale Antikörper, die als MN12 bezeichnet werden, erzeugt durch die Hybridoma MN 12.2.2, hinterlegt bei der ATCC unter der ATCC-Nr. HB 11647.
Diese Offenbarung betrifft weiterhin isolierte Nukleinsäuren, die zumindest 16 Nukleotide enthalten, vorzugsweise zumindest 29 Nukleotide, besonders bevorzugt zumindest 50 Nukleotide, wobei die Nukleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht:

(a) die MN-Nukleinsäuren, enthalten in den Plasmiden A4a, XE1 und XE3, die bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Manassas, Virginia in den Vereinigten Staaten von Amerika unter den jeweiligen ATCC-Nr. 97199, 97200 und 97198 hinterlegt wurden;
(b) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen an die MN-Nukleinsäuren von (a) hybridisieren; und
(c) Nukleinsäuren, die sich von den Nukleinsäuren von (a) und (b) in ihrer Kondonsequenz aufgrund der Degenerierung des genetischen Codes unterscheiden. Solche isolierten Nukleinsäuren können beispielsweise Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) sein.

Die Erfindung betrifft weiterhin isolierte Nukleinsäuren, die für ein MN-Protein, MN-Fusionsprotein oder MN-Polypeptid codieren, das operativ bzw. funktionell an eine Expressionskontrollsequenz innerhalb eines Vektors gebunden ist; einzellige Wirte, prokaryontisch oder eukaryontisch, die damit transformiert oder transfiziert wurden; und Verfahren zum rekombinanten Erzeugen von MN-Proteinen, MN-Fusionsproteinen und MN-Polypeptiden, die das Transformieren oder Transfizieren einzelliger Wirte mit dieser Nukleinsäure umfassen, die operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden sind, das Kultivieren der transformierten oder transfizierten einzelligen Wirte, so dass die MN-Proteine, -Fusionsproteine oder -Polypeptide exprimiert werden, und ein Extrahieren und Isolieren des MN-Proteinfusionsprotems oder -Polypeptids.
Rekombinante Nukleinsäuren, die MN-Fusionsproteine codieren, werden beansprucht, insofern, als sie im Wesentlichen aus einem MN-Protein oder MN-Polypeptid und einem Nicht-MN-Protein oder -Polypeptid bestehen, wobei die Nukleotidsequenz für den Anteil der Nukleinsäure, die das MN-Protein oder -Polypeptid codiert, aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht:

(a) SEQ. ID. NO.: 1;
(b) Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen an SEQ. ID. NO.: 1 oder an ihr Komplement hybridisieren; und
(c) Degenerierte Varianten von SEQ. ID. NO.: 1 und der Nukleotidsequenzen von (b);

Das Nicht-MN-Protein oder -Polypeptid kann vorzugsweise für Menschen nicht immunogen sein und typischerweise nicht reaktiv für Antikörper in humanen Körperflüssigkeiten sein. Beispielsweise für eine solche DNA-Sequenz ist die Alpha-Peptid-codierende Region der Beta-Galactosidase und eine Sequenz, die für Glutathion-S-Transferase oder ein Fragment hiervon codiert. Jedoch kann in einigen Fällen ein Nicht-MN-Protein oder -Polypeptid, das serologisch aktiv, immunogen und/oder antigenetisch wirksam ist, als Fusionspartner an ein MN-Antigen bevorzugt werden. Weiterhin werden hierin solche rekombinanten Fusionsproteine/Polypeptide offenbart, die im Wesentlichen rein und nicht-natürlich vorkommend sind. Beispielhafte Fusionsproteine sind GEX-3X-MN, MN-Fc und MN-PA, die unten beschrieben sind.
In HeLa und in tumorigenen HeLa × Fibroblasten-Hybridzellen (H/F-T) ist das MN-Protein als ein „Zwillings"-Protein p54/58N manifestiert; es ist glycosyliert und bildet Disulfid-verbrückte Oligomere. Wie durch Elektrophorese auf reduzierenden Gelen bestimmt wird, weisen MN-Proteine auf nicht-reduzierenden Gelen Molekulargewichte im Bereich von ungefähr 40 kD bis ungefähr 70 kD auf, vorzugsweise von ungefähr 45 kD bis ungefähr 65 kD, besonders bevorzugt von ungefähr 48 kD bis ungefähr 58 kD, auf. MN-Proteine in Form von Oligomeren weisen Molekulargewichte im Bereich von ungefähr 145 kD bis ungefähr 160 kD auf, vorzugsweise von ungefähr 150 bis ungefähr 155 kD, noch mehr bevorzugt von ungefähr 152 bis ungefähr 154 kD. Eine vorhergesagte Aminosäuresequenz für ein bevorzugtes MN-Protein ist in 1(A–C) (SEQ. ID. NO.: 2) dargestellt. Weitere spezielle MN-Proteine oder -Polypeptide werden durch das vermeintliche MN-Signalpeptid exemplifiziert, dargestellt als die ersten 37 Aminosäuren in 1(A–C) (SEQ. ID. NO.: 6), bevorzugte MN-Antigen-Epitope (SEQ. ID. NO.: 10–16) und die Domänen des MN-Proteins, repräsentiert in den 1(A–C) als Aminosäuren 38–135 (SEQ. ID. NO.: 50), 136–391 (SEQ. ID. NO.: 51), 415–434 (SEQ. ID. NO.: 52) und 435–459 (SEQ. ID. NO.: 53).
Die Entdeckung des MN-Gens und -Proteins und somit von im Wesentlichen komplementären MN-Genen und -Proteinen, die hierdurch codiert sind, führte zur Erkenntnis, dass die Expression von MN-Proteinen mit der Tumorigenität assoziiert war. Diese Erkenntnis hatte die Erzeugung von Verfahren zur Folge, die für Krebs und präkanzeröse Zustände diagnostisch/prognostisch sind. Verfahren und Zusammensetzungen zum Identifizieren des Ausbruchs oder des Vorhandenseins einer neoplastischen Erkrankung werden durch Nachweisen und/oder Quantifizieren des MN-Antigens in Patientenproben, einschließlich von Gewebsschnitten und -abstrichen, Zell- und Gewebsextrakten von Wirbeltieren, vorzugsweise Säugetieren und besonders bevorzugt Menschen, bereitgestellt. Solches MN-Antigen kann ebenfalls in Körperflüssigkeiten zu finden sein.
MN-Proteine und -Gene sind in der Forschung betreffend die molekularen Mechanismen in der Onkogenese, in Krebsdiagnostika/-prognostika von Nutzen und können in der Krebsimmuntherapie von Nutzen sein. Die vorliegende Erfindung ist zum Nachweisen einer breiten Vielzahl neoplastischer und/oder prä-neoplastischer Erkrankungen von Nutzen. Beispielhafte neoplastische Erkrankungen schließen Karzinome ein, wie beispielsweise Brustdrüsen-, Blasen-, Ovarial-, Uterus-, Cervix-, Endometrium-, Plattenepithelzell- und adenosquamöse Karzinome; Kopf- und Nackenkrebs; mesodermale Tumore, beispielsweise Neuroblastome und Retinoblastome, Sarkome, beispielsweise Osteosarkome und Ewing's Sarkom; und Melanome. Von speziellem Interesse sind Kopf- und Nackenkrebs, gynäkologische Krebsarten einschließlich Ovarial-, Cervix-, Vaginal-, Endometrium- und Vulva-Krebs; gastrointestinaler Krebs wie beispielsweise Magen-, Darm- und Speiseröhrenkrebs; Krebs des Urinartrakts, beispielsweise Blasen- und Nierenkrebs; Hautkrebs; Leberkrebs; Prostatakarzinom; Lungenkrebs; und Brustkrebs. Von noch weiter speziellem Interesse sind gynäkologische Krebsarten; Brustkrebs; Urinartraktkrebs, insbesondere Blasenkrebs; Lungenkrebs und Leberkrebs. Noch weiter von speziellem Interesse sind gynäkologische Krebsarten und Brustkrebs. Gynäkologi sche Krebsarten von speziellem Interesse sind Karzinome der Uterincervix bzw. des Gebärmutterhalses, des Endometriums und der Ovarien; insbesondere schließen solche gynäkologische Krebsarten wie cervikale Plattenepithelzellkarzinome, adenosquamöse Karzinome, Adenokarzinome ebenso wie gynäkologische präkanzeröse Zustände, wie beispielsweise metaplastische cervikale Gewebe und Kondylomen ein.
Die Offenbarung betrifft weiterhin die biochemische Technik des MN-Gens, von Fragmenten hiervon und verwandter cDNA. Beispielsweise kann das Gen oder ein Fragment hiervon oder verwandte cDNA in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt werden, wobei es operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden wird; Wirtszellen, vorzugsweise einzellige, können mit einem solchen Expressionsvektor transformiert oder transfiziert werden; und ein MN-Protein/Polypeptid, vorzugsweise ein MN-Protein, wird darin exprimiert. Ein solches rekombinantes Protein oder Polypeptid kann glycosyliert oder nicht glycosyliert sein, vorzugsweise glycosyliert, und kann bis zur im Wesentlichen Reinheit aufgereinigt werden. Sie betrifft weiterhin MN-Proteine/Polypeptide, die synthetisch oder in anderer Weise biologisch hergestellt werden.
Diese MN-Proteine/Polypeptide können in Assays verwendet werden, um das MN-Antigen in Patientenproben und in serologischen Tests nachzuweisen, um auf MN-spezifische Antikörper zu testen. MN-Proteine/Polypeptide dieser Erfindung sind serologisch aktiv, immunogen und/oder antigen. Sie können weiterhin als Immunogene verwendet werden, um MN-spezifische Antikörper, polyklonal und/oder monoklonal, ebenso wie eine Immun-T-Zell-Reaktion zu erzeugen.
Die Offenbarung betrifft weiterhin MN-spezifische Antikörper, die diagnostisch/prognostisch verwendet werden können, und die therapeutisch verwendet können.
Bevorzugt sind MN-spezifische Antikörper, die mit den jeweils durch die Aminosäuresequenzen des MN-Proteins repräsentierten Epitope reaktiv sind, die in den 1(A–C) wie folgt dargestellt sind: von AA (= Aminosäure) 62 bis AA 67 (SEQ. ID. NO.: 10); von AA 55 bis AA 60 (SEQ. ID. NO.: 11); von AA 127 bis AA 147 (SEQ. ID. NO.: 12); von AA 36 bis AA 51 (SEQ. ID. NO.: 13); von AA 68 bis AA 91 (SEQ. ID. NO.: 14); von AA 279 bis AA 291 (SEQ. ID. NO.: 15); und von AA 435 bis AA 450 (SEQ. ID. NO.: 16). Besonders bevorzugt sind Antikörper, die mit den in den SEQ. ID. NO.: 10, 11 und 12 repräsentierten Epitope reaktiv sind. Noch mehr bevorzugt sind Antikörper, die mit den von SEQ. ID. NO.: 10 und 11 repräsentierten Epitopen reaktiv sind, wie beispielsweise die Mabs (= monoklonale Antikörper) M75 und MN12. Am meisten bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die mit dem von SEQ. ID. NO.: 10 repräsentierten Epitop reaktiv sind.
Ebenfalls bevorzugt sind Antikörper, die gegen rekombinant produzierte MN-Proteine hergestellt wurden, beispielsweise GEX-3X-MN, MN 20-19, MN-Fc und MN-PA. Ebenfalls bevorzugt sind MN-spezifische Antikörper, die gegen glycosylierte MN-Proteine hergestellt sind, wie beispielsweise MN 20-19, exprimiert in Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen.
Eine Hybridoma, die einen repräsentativen MN-spezifischen Antikörper, nämlich den monoklonalen Antikörper M75 (Mab M75) produziert, wurde bei der ATCC unter Nummer HB 11128 wie oben angezeigt hinterlegt. Der M75-Antikörper wurde dazu verwendet, das MN-Protein zu entdecken und zu identifizieren, und kann dazu verwendet werden, MN-Antigen in Western Blots, in Radioimmunassays und in immunhistochemischen Assays, beispielsweise in Gewebsproben, die frisch, eingefroren oder Formalin-, Alkohol-, Aceton- oder in anderer Weise fixiert sind, und/oder in Paraffin eingebettet oder entparaffinisiert sind, zu identifizieren. Ein weiterer repräsentativer MN-spezifischer Antikörper, nämlich Mab MN12, wird durch die Hybridome MN 12.2.2 sezerniert, die bei der ATCC unter der Bezeichnung HB 11647 hinterlegt wurde.
MN-spezifische Antikörper können beispielsweise in der Labordiagnostik unter Verwendung einer Immunfluoreszenzmikroskopie oder immunhistochemischer Färbungen verwendet werden; als Bestandteil in Immunassays zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des M-Antigens, beispielsweise in klinischen Proben; als Sonden für das Immunblotting zum Nachweisen des MN-Antigens, in der Immunelektronenmikroskopie mit Kolloidalgold-Beads zur Lokalisierung von MN-Proteinen und/oder Polypeptiden in Zellen; und in der Gentechnik zum Klonieren des MN-Gens oder von Fragmenten hiervon oder von verwandter cDNA. Solche MN-spezifischen Antikörper können als Bestandteile von diagnostischen/prognostischen Kits verwendet werden, beispielsweise zur in vitro-Verwendung auf histologischen Schnitten; beispielsweise können Antikörper ebenfalls zur in vivo-Diagnostik/Prognostik verwendet werden, beispielsweise können solche Antikörper in geeigneter Weise wie mit einem geeigneten radioaktiven Isotop markiert werden und in vivo dazu verwendet werden, Metastasen durch Szintigraphie zu lokalisieren. Weiterhin können solche Antikörper in vivo therapeutisch dazu verwendet werden, Krebspatienten mit oder ohne toxischen und/oder zytostatischen Mitteln, die daran befestigt sind, zu behandeln. Weiterhin können solche Antikörper in vivo verwendet werden, um das Vorhandensein neoplastischer und/oder prä-neoplastischer Erkrankungen nachzuweisen. Noch weiter können solche Antikörper dazu verwendet werden, MN-Proteine und -Polypeptide affinitätszureinigen.
Diese Offenbarung betrifft ebenfalls Verfahren zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung und/oder einer prä-neoplastischen Erkrankung, die die Hemmung der Expression von MN-Genen durch Verabreichung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen umfasst, die im Wesentlichen zur aus MN-Genen transkribierten mRNA komplementär sind. Diese Antisense-Nukleinsäuresequenzen sind solche, die an derartige mRNA unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Bevorzugt sind Antisense-Nukleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen zu den Sequenzen am 5'-Ende der MN-cDNA-Sequenz im wesentlichen komplementär sind, wie in 1(A–C) dargestellt ist. Bevorzugt sind diese Antisense-Nukleinsäuresequenzen Oligonukleotide.
Diese Offenbarung betrifft ebenfalls Vakzinen, die eine immunogene Menge eines oder mehrere im Wesentlichen reiner MN-Proteine und/oder Polypeptide umfassen, die in einem physiologisch akzeptablen, nicht-toxischen Träger dispergiert sind, wobei die Menge dazu wirksam ist, einen Vertebraten bzw. ein Wirbeltier, vorzugsweise ein Säugetier, besonders bevorzugt einen Menschen, gegen eine neoplastische Erkrankung zu immunisieren, die mit der Expression von MN-Proteinen verbunden ist. Derartige Proteine können rekombinant, synthetisch oder in anderer Weise biologisch erzeugt sein. Eine spezielle Anwendung einer solchen Vakzine würde darin bestehen, einem Rezidiv und/oder einer Metastase vorzubeugen. Es könnte beispielsweise einem Patienten verabreicht werden, der einen MN-tragenden chirurgisch entfernten Tumor aufwies, um einem Wiederauftreten des Tumors vorzubeugen.
Die Immunassays können in Testkits ausgestaltet sein, die MN-Proteine/Polypeptide und/oder MN-spezifische Antikörper umfassen. Solche Testkits können in Festphasenformaten vorliegen, sind jedoch hierauf nicht beschränkt und können ebenfalls in Flüssigphasenformaten vorliegen und können auf immunhistochemischen Assays, ELISAs, Teilchenassays, radiometrischen oder fluorometrischen Assays entweder unamplifiziert oder amplifiziert unter Verwendung beispielsweise der Avidin/Biotin-Technologie vorliegen.
Abkürzungen
Die folgenden Abkürzungen werden hierin verwendet werden:

AA: – Aminosäure
ATCC: – American Type Culture Collection
Bp: – Basenpaare
BLV: – boviner Leukämievirus
BSA: – Rinderserumalbumin
BRL: – Bethesda Research Laboratories
CA: – Carboanhydrase
CAT: – Chloramphenicolacetyltransferase
Ci: – Curie
cm: – Zentimeter
CMV: – Zytomegalievirus
cpm: – Zähler pro Minute (counts per minute)
C-Terminus: – Carboxyl-Terminus
°C: – Grad Celsius
DEAE: – Diethylaminoethyl
DMEM: – Dulbecco's modified Eagle medium
EDTA: – Ethylendiamintetraessigsäure
EIA: – Enzymimmunassay
ELISA: – Enzym-gebundener Immunsorbenz-Assay
F: – Fibroblasten
FCS: – fötales Kalbsserum
FITC: – Fluoresceinisothiocyanat
GEX-3X-MN: – Fusionsprotein MN Glutathion S-Transferase
H: – HeLa-Zellen
HEF: – humane Embryofibroblasten
HeLa K: – Standardtyp von HeLa-Zellen
HeLa S: – Stanbridge's mutiertes HeLa D98/AH.2
H/F-T: – Hybrid-HeLa-Fibroblastenzellen, die tumorigen sind; Abgeleitet von HeLa D98/AH.2
H/F-N: – Hybrid-HeLa-Fibroblastenzellen, die nicht tumorigen sind; abgeleitet von HeLa D98/AH.2
HRP: – Meerrettichperoxidase
Inr: – Starter
IPTG: – Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid
kb: – Kilobase
kbp: – Kilobasenpaare
kD: – Kilodalton
LCMV: – Lymphocyten-Choriomeningitis-Virus
LTR: – Lange terminale Wiederholung (long terminal repeat)
M: – molar
mA: – Milliamper
MAb: – Monoklonaler Antikörper
ME: – Mercaptoethanol
MEM: – minimales essentielles Medium
min.: – Minuten
mg: – Milligramm
ml: – Milliliter
mM: – millimolar
MMC: – Mitomycin C
MLV: – murines Leukämievirus
N: – normale Konzentration
NEG: – negativ
ng: – Nanogramm
Nt: – Nukleotid
N-Terminus: – Amino-Terminus
ODN: – Oligodesoxynukleotid
ORF: – offenes Leseraster
PA: – Protein A
PBS: – Phosphat-gepufferte Salzlösung
PCR: – Polymerasekettenreaktion
PEST: – Kombination von Ein-Buchstabenabkürzungen für Prolin, Glutaminsäure, Serin, Threonin
pI: – isoelektrischer Punkt
PMA: – Phorbol 12-myristat 13-acetat
POS: – positiv
Py: – Pyrimidin
RIA: – Radioimmunassay
RIP: – Radioimmunpräzipitation
RIPA: – Radioimmunpräzipitationsassay
RNP: – RNase-Schutzassay
SDRE: – Serumdosisreaktions-Element
SDS: – Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE: – Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese
SIND: – Kurze dazwischenliegende Wiederholungssequenz (short interspersed repead sequence
SP-RIA: – Festphasenradioimmunassay
SSDS: – synthetische Spleißdonorstelle
SSPE: – NaCl (0,18 M), Natriumphosphat (0,01 M), EDTA (0,001 M)
TBE: – Trisborat/EDTA-Elektrophoresepuffer
TCA: – Trichloressigsäure
TC-Medien: – Gewebskulturmedien
TMB: – Tetramethylbenzidin
Tris: – Tris(hydroxymethyl)aminomethan
μCi: – Mikrocurie
μg: – Mikrogramm
μl: – Mikroliter
μM: – Mikromolar
VSV: – vesikulärer Stomatitisvirus
X-MLV: – xenotropes murines Leukämievirus

Zelllinien

HeLa K

Standardtyp von HeLa-Zellen; aneuploid, Epithel-artige Zelllinie, isoliert aus einem humanen zervikalen Adenokarzinom (Gey et al., Cancer Res., 12: 264 (1952); Jones et al., Obstet. Gynecol., 38: 945–949 (1971)), bezogen von Professor B. Korych (Institute of Medical Microbiology and Immunology, Charles University; Prag, Czech Republic)

HeLaD98/AH.2 (auch (HeLa S)

Mutierter HeLa-Klon, der Hypoxanthinguanin-Phosphoribosyltransferase-defizient ist (HGPRT^–), freundlicherweise von Eric J. Stanbridge (Department of Microbiology, College of Medicine, University of California, Irvine, Ca (USA)) bereitgestellt und beschrieben in Standbridge et al., Science, 215: 252–259 (15. Januar 1982); Stamm der Hybridzellen H/F-N und H/F-T, ebenfalls von E. J. Stanbridge bezogen.

NIH-3T3

murine Fibroblastenzelllinie, beschrieben in Aaronson, Science, 237: 178 (1987).

XC

Zellen, gewonnen aus einem Ratten-Rhabdomyosarkom, induziert mit Rous-sarcoma-Virus induziertem Rattensarkom (Svoboda, J., Natl. Cancer Center Institute Monograph No. 17, IN: „International Conference on Avian Tumor Viruses" (J. W. Beard, Hsg.), Seiten 277–298 (1964)), freundlich bereitgestellt von Jan Svoboda (Institute of Molecular Genetics, Czechoslovak Academy of Sciences; Prag, Czech Republic); und

CGL1

H/F-N-Hybridzellen (HeLa D98/AH.2-Derivat)

CGL2

H/F-N-Hybridzellen (HeLa D98/AH.2-Derivat)

CGL3

H/F-T-Hybridzellen (HeLa D98/AH.2-Derivat)

CGL4

H/F-T-Hybridzellen (HeLa D98/AH.2-Derivat)

Nukleotid- und Aminosäuresequenzsymbole

Die folgenden Symbole werden dazu verwendet, die hierin dargestellten Nukleotide zu repräsentieren:

Basen-Symbol	Bedeutung
A	Adenin
C	Cytosin
G	Guanin
T	Thymin
U	Uracil
I	Inosin
M	A oder C
R	A oder G
W	A oder T/U
S	C oder G
Y	C oder T/U
K	G oder T/U
V	A oder C oder G
H	A oder C oder T/U
D	A oder G oder T/U
B	C oder G oder T/U
N/X	A oder C oder G oder T/U

Es existieren 20 Hauptaminosäuren, von denen jede durch eine unterschiedliche Anordnung dreier benachbarter Nukleotide gekennzeichnet ist (Triplett-Code oder Codon), und die zusammen in einer spezifischen Ordnung verbunden sind, um ein charakteristisches Protein zu bilden. Eine Drei-Buchstaben- oder Ein-Buchstaben-Konvention ist hierin verwendet worden, um diese Aminosäuren zu identifizieren, wie beispielsweise in 1(A–C), wie folgt:
Kurze Beschreibung der Figuren
1(A–C) stellt die Nukleotidsequenz für einen Volle-Länge-MN-cDNA (SEQ. ID. NO.: 1) Klon bereit, der wie hierin beschrieben isoliert wurde. 1(A–C) stellt ebenfalls die vorhergesagte Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NO.: 2) dar, die von der cDNA codiert wird.
2 vergleicht die Ergebnisse des Immnunisierens von Baby-Ratten gegenüber XC-Tumorzellen mit Rattenserum, das gegen das Fusionsprotenin MN Glutathion S-transferase (GEX-3X-MN) (die IM-Gruppe) hergestellt wurde, mit dem Ergebnis des Immunisierens von Baby-Ratten mit Kontrollratten-Seren (die C-Gruppe). Jeder Punkt auf der graphischen Darstellung repräsentiert das Tumorgewicht eines Tumors von einer Ratte. Beispiel 2 führt solche Experimente im Einzelnen auf.
3(A–F) stellt eine vollständige 10.898 bp genomische Sequenz von MN (SEQ. ID. NO.: 5) bereit. Die Basenzählung ist wie folgt: 2.654 A; 2.739 C; 2.645 G; und 2.859 T. Die 11 Exons sind in Großbuchstaben dargestellt.
4 ist eine Restriktionskarte der Volle-Länge-MN-cDNA. Das offene Leseraster ist als offene Box dargestellt. Die dicken Linien unter der Restriktionskarte veranschaulichen die Größen und Positionen von zwei überlappenden cDNA-Klonen. Die horizontalen Pfeile zeigen die Positionen der Primer R1 (SEQ. ID. NO.: 7) und R2 (SEQ. ID. NO: 8) an, die für das 5'-Ende RACE verwendet werden. Relevante Restriktionsorte sind BamHI (B), EcoRV (V), EcoRI (E), PstI (Ps), PvuII (Pv).
5 ist eine Karte des humanen MN-Gens. Die nummerierten schraffierten Boxen repräsentieren Exons. Die als LTR bezeichnete Box bezeichnet eine Region der Homologie mit HERV-K LTR. Die leeren Boxen sind Alu-verwandte Sequenzen.
6 ist eine Nukleotidsequenz für den vorgeschlagenen Promotor für das humane MN-Gen (SEQ. ID. NO.: 27). Die Nukleotide sind von der Transkriptionsstartstelle gemäß RNase-Schutzassay nummeriert. Potentielle regulatorische Elemente weisen eine darüberliegende Linie auf. Transkriptionsstartstellen sind durch Sternchen (RNase-Schutz) und Punkte (RACE) angezeigt. Die Sequenz des ersten Exons beginnt unter den Sternchen.
7 stellt eine schematische Darstellung des Alignments der genomischen MN-Klone gemäß ihrer Position bezüglich der Transkriptionsstartstelle bereit. Alle genomischen Fragmente außer Bd3 wurden aus einer genomischen Lambda-FIX-III-genomischen Bibliothek isoliert, abgeleitet von HeLa-Zellen. Klon Bd3 wurde von einer humanen fötalen Gehirnbibliothek gewonnen.
8 zeigt die Konstruktion und das Klonieren einer Reihe von 5'-Deletionsmutanten einer vermeintlichen putativen MN-Promotorregion, gebunden an das bakterielle CAT-Gen.
Ausführliche Beschreibung
Es ist hierin dargestellt, dass das MN-Gen in 11 Exons und 10 Introns organisiert ist. Hierin beschrieben ist das Klonieren und Sequenzieren der MN-cDNA und genomischer Sequenzen und die gentechnische Veränderung des MN-Proteins – wie beispielsweise der GEX-3X-MN, MN-PA-, MN-Fc- und MN-20-19-Proteine. Die rekombinanten MN-Proteine können bequemerweise durch Affinitätschromatographie aufgereinigt werden.
MN wird in HeLa-Zellen durch ein Zwillingsprotein, p54/58N, manifestiert. Immunblots unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der mit p5/58N reaktiv ist (MAb M75), zeigen zwei Banden bei 54 kD und 58 kD. Diese beiden Banden können einem Typ von Proteinen entsprechen, der sich durch sein Glycosylierungsmuster oder wie er prozessiert bzw. verarbeitet wird, unterscheidet. Hierin zeigt der Begriff „Zwillingsprotein" p54/58N an.
Die Expression von MN-Proteinen scheint für neoplastische Erkrankungen diagnostisch/prognostisch zu sein. Es stellte sich heraus, dass das MN-Zwillingsprotein, nämlich p54/58N in HeLa-Zellen und in tumorigenen Stanbridge's (H/F-T)-Hybridzellen exprimiert wird (Standbridge et al., Somatic Cell Genet. 7: 699–712 (1981); und Standbridge et al., Science, 215: 252–259 (1982)), jedoch nicht in Fibroblasten und in nicht-tumorigenen (H/F-N)-Hybridzellen (Standbridge et al., id.). In frühen Studien, berichtet in Zavada et al. WO 93/18152, siehe oben, stellte sich heraus, dass MN-Proteine in Immunblots zu finden waren, die aus humanen Ovarial-, Endometrium- und Uteruscervix-Karzinomen hergestellt wurden und in einigen benignen Neoplasien (wie beispielsweise Brustdrüsenpapillom), jedoch nicht in normalen Ovarial-, Endometrium-, Uterus- oder Placenta-Geweben. Beispiel 1 führt hierin weiterhin Forschungsarbeiten an der MN-Genexpression aus, wobei sich herausstellte, dass das MN-Antigen, wie durch immunhistochemische Färbung nachgewiesen, in Tumorzellen von mehreren Krebsarten vorliegen, einschließlich Cervix-, Blasen-, Kopf- und Nacken- und Nierenzellkarzinomen, um nur einige zu nennen. Weiterhin zeigen die immunhistochemischen Färbeexperimente von Beispiel 1, dass unter den normalen getesteten Geweben nur normale Magengewebe routinemäßig und extensiv das Vorhandensein von MN-Antigen zeigten. Es wird hierin weiterhin gezeigt, das das MN-Antigen manchmal in morphologisch normal erscheinenden Regionen von Gewebsproben vorliegt, die eine Dysplasie und/oder Malignität zeigen.
MN-Gen – Klonieren und Sequenzieren
1(A–C) stellt die Nukleotidsequenz für einen Volle-Länge-MN-cDNA-Klon bereit, isoliert wie unten beschrieben (SEQ. ID. NO.: 1). 3(A–F) stellt eine vollständige genomische MN-Sequenz bereit (SEQ. ID. NO.: 5). 6 zeigt die Nukleotidsequenz für einen vorgeschlagenen MN-Promotor (SEQ. ID. NO.: 27).
Es sollte klar sein, dass wegen der Degenerierung des genetischen Codes mehr als ein Codon für eine Aminosäure codieren wird (beispielsweise codieren die Codone TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG jeweils für die Aminosäure Leucin (Leu)), und dass Variationen der Nukleotidsequenzen beispielsweise in SEQ. ID. NOS.: 1 und 5, wobei ein Codon durch ein anderes ersetzt wird, ein im Wesentlichen äquivalentes Protein oder Polypeptid erzeugen würde. Alle solchen Variationen der Nukleotidsequenz der MN-cDNA und komplementärer Nukleinsäuresequenzen sind im Umfang dieser Offenbarung mit eingeschlossen.
Es sollte weiter klar sein, dass die hierin beschriebenen und in den 1(A–C), 3(A–F) und 6 dargestellten Nukleotidsequenzen nur die präzisen Strukturen der cDNA, der genomischen und Promotornukleotidsequenzen darstellen, die hierin isoliert und beschrieben wurden. Es ist zu erwarten, dass geringfügig modifizierte Nukleotidsequenzen durch in der Technik bekannte Techniken modifiziert und gefunden werden können, die für im Wesentlichen ähnliche oder homologe MN-Proteine oder -Polypeptide codieren, beispielsweise solche, die ähnliche Epitope aufweisen, und solche Nukleotidsequenzen und Proteine/Polypeptide werden als Äquivalente für die Zwecke dieser Offenbarung angesehen. DNA oder RNA mit äquivalenten Codonen wird als im Umfang der Offenbarung liegend betrachtet, genauso wie synthetische Nukleinsäuresequenzen, die Proteine/Polypeptide codieren, die mit den MN-Proteinen/Polypeptiden homolog oder im Wesentlichen homolog sind, ebenso wie solche Nukleinsäuresequenzen, die an solche beispielhaften Sequenzen unter stringenten Bedingungen (SEQ. ID. NOS.: 1, 5 und 27) hybridisieren würden oder die aufgrund der Degenerierung des genetischen Codes an diese cDNA-Nukleotidsequenzen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren würden. Modifikationen und Variationen von Nukleinsäuresequenzen, wie hierin angezeigt, haben angenommenermaßen Sequenzen zur Folge, die im Wesentlichen dieselben wie die beispielhaften MN-Sequenzen und Fragmente hiervon sind.
Teil-cDNA-Klone
In Zavada et al., ebd., wurde die Isolierung eines teilweisen MN-cDNA-Klons einer Länge von 1.397 Bp beschrieben. Eine Lambda-gt11-cDNA-Bibliothek von LMCV-infizierten HeLa-Zellen wurde hergestellt und einem Immunscreening mit dem Mab M75 in Kombination mit Ziegen-anti-Maus-Antikörpern unterworfen, konjugiert mit alkalischer Phosphatase. Ein positiver Klon wurde aufgenommen und in die NotI-Stelle von pBluescript-KS (Stratagen; La Jolla, CA (USA)) subkloniert, wodurch pBluescript-MN erzeugt wurde.
Zwei entgegengesetzt ausgerichtete ineinander verschachtelte Deletionen wurden unter Verwendung des Erase-a-Base^TM-Kits (Promega; Madison, WI (USA)) durchgeführt, und durch das Didesoxy-Verfahren mit einem T7-Sequenzierungskit sequenziert (Pharmacia; Piscataway, NJ (USA)). Die Sequenzierung zeigte einen Teil-cDNA-Klon, wobei das Insert eine Länge von 1.397 bp aufwies. Die Sequenz umfasste ein großes 1.290 bp offenes Leseraster und eine 107 bp 3'-untranslatierte Region, die ein Polyadenylierungssignal (AATAAA) enthielt. Jedoch passte die Sequenz, die das erste ATG-Codon im offenen Leseraster (ORF) umgab, nicht zur Definition einer Translationsstartstelle. Zusätzlich, wie sich aus einem Vergleich der Größe des MN-Klons mit derjenigen der entsprechenden mRNA in einem Northern Blot ergab, zeigte sich, dass die cDNA ungefähr 100 bp vom 5'-Ende seiner Sequenz entfernt fehlte.
Volle-Länge-cDNA-Klon
Versuche, einen Volle-Länge-Klon aus der ursprünglichen cDNA-Bibliothek zu isolieren, schlugen fehl. Deswegen führten die Erfinder eine rasche Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) unter Verwendung von MN-spezifischen Primern R1 und R2 durch (SEQ. ID. NO.: 7 und 8), abgeleitet von der 5'-Region des ursprünglichen cDNA-Klons. Das RACE-Produkt wurde in pBluescript eingefügt und die gesamte Population rekombinanter Plasmide wurde mit einem MN-spezifischen Primer ODN1 (SEQ. ID. NO.: 3) sequenziert. Auf diese Weise wurde eine zuverlässige Sequenz am echten 5'-Ende der MN-cDNA, wie in 1(A–C) gezeigt (SEQ. ID. NO.: 1) gewonnen.
Insbesondere wurde ein RACE unter Verwendung des 5'-RACE-Systems (GIBCO BRL; Gaithersburg, MD (USA)) wie folgt durchgeführt. 1 μg mRNA (dieselbe wie oben) wurde als Matrize für die Erststrang-cDNA-Synthese verwendet, die durch das MN-spezifische Antisense-Oligonukleotid geprimt wurde, nämlich R1 (5'-TGGGGTTCTTGAGGATCTCCAGGAG -3') (SEQ. ID. NO.: 7). Das Erststrangprodukt wurde zweimal in Gegenwart von Ammonium-acetat ausgefällt und ein homopolymerer C-Schwanz wurde an sein 3'-Ende durch TdT angebunden. Ein mit einem Schwanz versehene cDNA wurde dann durch PCR unter Verwendung eines ineinandergeschachtelten Primers, R2 (5'-CTCTAACTTCAGGGAGCCCTCTTCTT-3') (SEQ. ID. NO.: 8) und eines Ankerprimers, der an den Homopolymer-Schwanz annealt (5'- CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3') (SEQ. ID. NO.: 9) amplifiziert. Das amplifizierte Produkt wurde mit BamHI- und SalI-Restriktionsenzymen digeriert und in das pBluescript II KS-Plasmid kloniert. Nach der Transformation wurde Plasmid-DNA aus der gesamten Population transformierter Zellen aufgereinigt und als Matrize zum Sequenzieren mit dem MN-spezifischen Primer ODN1 (SEQ. ID. NO.: 3, ein 29-mer 5'-CGCCCAGTGGGTCATCTTCCCCAGAAGAG-3' als Matrize verwendet.
Auf Grundlage der Ergebnisse der RACE-Analyse ergab sich, dass die Volle-Länge-MN-cDNA-Sequenz einen einzigen ORF enthielt, ausgehend von Position 12, mit einem ATG-Codon, das sich in einem guten Kontext (GCGCATGG) mit der Regel befindet, die für den Translationsstart vorgeschlagen wurde (Kozak, J. Cell. Biol., 108: 229–241 (1989)). (Siehe unten unter der Rubrik Kartierung der MN-Gentranskriptionsstartstelle für eine Feinkartierung des 5'-Endes des MN-Gens). Die AT-reiche 3' untranslatierte Region enthält ein Polyadenylierungssignal (AATAAA), das dem Ende der cDNA um 10 Bp vorausgeht. Überraschenderweise zeigte die Sequenz aus dem ursprünglichen Klon ebenso wie aus vier zusätzlichen Klonen, die aus derselben cDNA-Bibliothek gewonnen wurden, keinen Poly(A)-Schwanz. Darüberhinaus fand sich knapp stromabwärts des Poly(A)-Signals ein ATTTA-Motiv, von dem angenommen wird, dass es zur mRNA-Instabilität beiträgt (Shaw und Kamen, Cell, 46: 659–667 (1986)). Diese Tatsache ließ die Möglichkeit entstehen, dass der Poly(A)-Schwanz aufgrund des spezifischen Abbaus der MN-mRNA fehlt.
Genomische Klone
Um die MN-Regulierung zu studieren, wurden genomische MN-Klone isoliert. Ein genomischer MN-Klon (Bd3) wurde aus einer humanen Cosmid-Bibliothek isoliert, hergestellt aus fötalem Gehirn unter Verwendung sowohl von MN-cDNA als Sonde als auch der MN-spezifischen Primer, die vom 5'-Ende der cDNA ODN1 ein abgeleitet wurden (SEQ. ID. NO.: 3, siehe oben) und ODN2 (SEQ. ID. NO.: 4; 19-mer (5'-GGAATCCTCCTGCATCCGG-3')). Die Sequenzanalyse zeigte, dass der genomische Klon eine Region stromaufwärts von einer MN-Transkriptionsstartstelle abdeckte und mit der BamHI-Restriktionsstelle endete, die innerhalb der MN-cDNA angeordnet ist. Weitere genomische MN-Klone können in ähnlicher Weise isoliert werden.
Um die vollständige genomische Region von MN zu identifizieren, wurde die humane genomische Bibliothek in Lambda-FIX-II-Vektor (Stratagene) aus chromosomaler HeLa-DNA hergestellt und durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung von MN-cDNA wie unten beschrieben gescreent. Mehrere unabhängige rekombinante MN-Phagen wurden identifiziert, isoliert und durch Restriktionskartierung und Hybridisierungsanalysen charakterisiert. Vier überlappende Rekombinanten, die die gesamte genomische Region von MN abdecken, wurden ausgewählt, digeriert und in pBluescript subkloniert. Die Subklone wurden darauf ineinandergeschachtelten (nested) Deletionen in zwei Richtungen und einem Sequenzierung unterworfen. Die DNA-Sequenzen wurden umgeschrieben und durch Computer unter Verwendung des DNASIS-Softwarepaketes analysiert.
Die Details der Isolierung genomischer Klone, die die vollständige genomische Region für MN abdecken, sind unten dargestellt. 7 stellt ein Schema des Alignments von genomischen MN-Klonen gemäß der Transkriptionsstartstelle dar. Die Plasmide, die den A4a-Klon und die XE1- und XE3-Subklone enthalten, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209 (USA) am 6. Juni 1995 jeweils unter den ATCC-Hinterlegungsnummern 97199, 97200 und 97198 hinterlegt.
Isolierung genomischer DNA-Klone
Die humane genomische Sau3AI HeLa-Bibliothek wurde in Lambda-FIX-II-Vektor präpariert (Stratagene; La Jolla, CA (USA)) gemäß der Vorschrift des Herstellers. Die humane fötale Gehirncosmid-Bibliothek in SuperCos-Cosmid stammte von Stratagene. Rekombinante Phagen oder Bakterien wurden auf 1 × 10⁵ Plaque-bildenden Einheiten auf 22 × 22 cm Nunc-Platten oder 5 × 10⁴ Zellen auf 150 mm Petrischalen ausplattiert und die Plaques oder Kolonien wurden auf Hybond-N-Membranen (Amersham) übertragen. Eine Hybridisierung wurde mit der Volle-Länge-MN-cDNA durchgeführt, die mit (P³²) PdCTP durch das Multiprime-DNA-Markierungsverfahren (Amersham) markiert waren, bei 65°C in 6 × SSC, 0,5% SDS, 10 × Denhardt's und 0,2 mg/1 ml Lachsspermien-DNA. Die Filter wurden zweimal in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 20 Minuten gewaschen. Die getrockneten Filter wurden gegenüber Röntgenfilmen exponiert und positive Klone wurden aufgenommen. Die Phagen und Bakterien wurden durch 3–4 sequentielle Umläufe des Screenings isoliert.
Subklonieren und DNA-Sequenzierung
Genomische DNA-Fragmente wurden in einen pBluescript KS subkloniert und Matrizen zum Sequenzieren wurden durch serielle ineinander verschachtelte Deletionen erzeugt, unter Verwendung des Erase-a-Base-Systems. Die Sequenzierung wurde durch das Didesoxynukleotid-Kettenterminationsverfahren unter Verwendung des T7-Sequenzierungskits (Pharmacia) durchgeführt. Nukleotidsequenzalignments und -analysen wurden unter Verwendung des DNASIS-Softwarepaketes (Hitachi Software Engineering) durchgeführt.
Exon-Intron-Struktur eine vollständigen genomischen MN-Region
Die vollständige Sequenz der überlappenden Klone enthält 10.898 bp (SEQ. ID. NO.: 5). 5 zeigt die Organisation des humanen MN-Gens, und zeigt den Ort aller 11 Exons ebenso wie die 2 stromaufwärts und 6 Intron-Alu-Wiederholungselemente. Alle Exons sind klein und bewegen sich von 27 bis 191 Bp mit der Ausnahme des ersten Exons, das 445 bp ist. Die Intron-Größen bewegen sich von 89 bis 1.400 Bp.
Tabelle 1, nachstehend, listet die Spleißdonor- und Akzeptorsequenzen auf, die mit Konsensor-Spleiß-Sequenzen übereinstimmen, einschließlich des AG-GT-Motivs (Mount, „A catalogue of splice junction sequences", Nucleic Acids Res. 10: 459–472 (1982)). Tabelle 1 Exon-Intron-Struktur des humanen MN-Gens

** Positionen sind auf die Nukleotidnummerierung in der gesamten genomischen Sequenz bezogen, einschließlich der 5'-flankierenden Region (3(A–F))
* Die Nummer entspricht der Transkriptionsstartstelle, bestimmt unten durch RNase-Schutzassay

Eine Recherche nach Sequenzen, die mit dem MN-Gen verwandt sind, in der EMBL-Datenbank, zeigten keine spezielle Homologie außer für 6 vollständige und 2 teilweise Alu-Typ-Wiederholungen mit einer Homologie zu Alu-Sequenzen, die sich von 69,8% bis 91% bewegen (Jurka und Milosavljevic, „Reconstruction and analysis of human Alu genes", J. Mol. Evol. 32: 105–121 (1991)). Unter der Charakterisierung der 5'-flankierenden Region ist ebenfalls eine 222 bp Sequenz nahe dem 5'-Ende der genomischen Region dargestellt, die einer Region des HERV-K LTR homolog ist.
Kartierung der MN-Gen Transkriptionsstartstelle
Im früheren Versuch, den Ort des Transkriptionsstartes des MN-Gens durch RACE (oben) zu lokalisieren, wurde ein Haupt-PCR-Fragment gewonnen, dessen Sequenz sich an der Startstelle 12 bp stromaufwärts vom ersten Codon des ORF befand. Dieses Ergebnis wurde wahrscheinlich aufgrund einer bevorzugten Amplifikation der kürzesten Form der mRNA erzielt. Deswegen verwendeten die Erfinder einen RNase-Schutzassay (RNP) zur Feinkartierung des 5'-Endes des MN-Gens. Die Sonde war eine gleichförmig markierte 470 Nukleotid Copy-RNA (nt –205 bis +265 (SEQ. ID. NO.: 55), die an eine Gesamt-RNA von MN-exprimierenden HeLa- und CGL3-Zellen hybridisiert war und auf einem sequenzierenden Gel analysiert wurde. Diese Analyse zeigte, dass die MN-Gentranskription an multiplen Stellen beginnt, wobei das 5'-Ende des längsten MN-Transkriptes 30 nt länger als das kürzlich von RACE charakterisierte war.
RNase-Schutzassay
³²P-markierte RNA-Sonden wurde mit einem RNA-Transkriptionskit (Stratagene) hergestellt. In vitro-Transkriptionsreaktionen wurden unter Verwendung von 1 μg des linearisierten Plasmids als Matrize, 50 μCi von [P³²P]rUTP (800 Ci/mmol), 10 U entweder von T3- oder T7-RNA-Polymerase und anderen Bestandteilen des Transkriptionskits unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zur Kartierung des 5'-Endes von MN mRNA wurde das 470 Bp NcoI-BamHI-Fragment (NcoI eingefüllt durch ein Klenow-Enzym) des Bd3-Klons (nt –205 bis +265 bezüglich des Transkriptionsstartes) an EcoRV-BamHI-Stellen von pBluescript SK+ subkloniert, mit HindIII linearisiert und mit einer 73-RNA-Polymerase markiert. Für die 3'-Ende-mRNA-Analyse wurde eine Sonde, die unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase auf einer KS-dXE3-16-Matrize hergestellt wurde (einer der ineinander verschachtelten Deletionsklone der genomischen MN-Region des XE3-Subklons) digeriert mit Sau3AI (das Exon 11 an Position 10.629) schneidet) verwendet. Ungefähr 3 × 10⁵ cpm einer RNA-Sonde wurden pro RNase-Schutzassay-Reaktion verwendet.
RNase-Schutzassays (RNP) wurden unter Verwendung des Lysat RNase-Protektionskits (USB/Amersham) gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Zellen unter Verwendung einer Lyse-Lösung in einer Konzentration von ungefähr 10⁷ Zellen/ml lysiert und 45 μl des Zellhomogenats wurden in RNA/RNA-Hybridisierungsreaktionen mit ³²P-markierten RNA-Sonden verwendet, die wie oben hergestellt wurden. Im Anschluss an Über-Nacht-Hybridisierungen bei 42°C wurden die Homogenate für 30 Minuten bei 37°C mit einem RNase-Cocktailgemisch behandelt. Geschütze RNA-Duplices wurden auf Polyacrylamid/Urea-denaturierenden Sequenzierungsgels laufengelassen. Fixierte und getrocknete Gele wurden gegenüber Röntgenfilm für 24–72 Stunden exponiert.
Kartierung der MN-Gentranskriptions-Terminationsstelle
Ein RNase-Schutzassay, wie oben beschrieben, wurde ebenfalls dazu verwendet, das 3'-Ende der MN cDNA zu verifizieren. Dies war bezüglich unserer früheren Erkenntnis von Bedeutung, dass die cDNA ein Poly(A)-Signal enthält, ihr jedoch ein Poly(A)-Schwanz fehlt, der während der vorgeschlagenen Degradation bzw. Abbau von MN mRNA aufgrund des Vorhandenseins eines Instabilitätsmotivs in seiner 3'-untranslatierten Region verlorengegangen sein könnte. Eine RNP-Analyse von MN mRNA mit dem Fragment des genomischen Klons XE3, der die Region von Interesse abdeckte, bekräftigte unsere Daten von der MN-cDNA-Sequenzierung, weil das 3'-Ende des geschützten Fragmentes der letzten Base der MN cDNA entsprach (Position 10.752 der genomischen Sequenz). Diese Stelle erfüllt ebenfalls das Erfordernis nach dem Vorhandensein eines zweiten Signals einer genomischen Sequenz, das zur Transkriptionstermination und Polyadenylierung erforderlich ist (McLauchlan et al., Nucleic Acids Rs., 13: 1347 (1985)). Motiv TGTGTTAGT (nt 10.759–10.767) entspricht sowohl der Konsensussequenz als auch der Position dieses Signals innerhalb von 22 bp stromabwärts vom PolyA-Signal (nt 10.737–10.742) gut.
Charakterisierung der 5'-flankierenden Region
Der genomische Bd3-Klon, isoliert aus einer humanen fötalen Gehirncosmid-Bibliothek, deckte eine Region von 3,5 kb stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle des MN-Gens ab. Er enthält keine signifikante codierende Region. Zwei Alu-Wiederholungen sind an den Positionen –2.587 bis –2.296 angeordnet (SEQ. ID. NO.: 56) und –1.138 bis –877 (SEQ. ID. NO.: 57) (bezüglich des durch RNP bestimmten Transkriptionsstartes). Die dem 5'-Ende proximale Sequenz ist mit der U3-Region der langen terminalen Wiederholungen (long terminal repeats) der humanen endogenen Retroviren HERV-K stark homolog (91,4% Identität) (Ono, M., „Molecular cloning and long terminal repeat sequences of human endogenous retrovirus genes related to types A and B retrovirus genes", J. Virol. 58: 937–944 (1986)). Das LTR-artige Fragment ist 222 bp lange mit einem A-reichen Schwanz an seinem 3'-Ende. Es repräsentiert am meisten wahrscheinlich den Teil eines SINE (short interspersed repeated sequence)-artigen nonviralen Retroposons, das von HERV-K stammt (Ono et al., „A novel human nonviral retroposon derived from an endogenous retrovirus", Nucleic Acids Res., 15: 8725–8373 (1987)). Es existieren keine Sequenzen, die regulatorischen Elementen in diesem Fragment entsprechen, weil der 3'-Teil des U3 und die gesamten R- und U5-Regionen des LTR vom genomischen Bd3-Klon abwesend sind und das Glucocorticoid-responsive Element ebenso wie die Enhancerkernsequenz jenseits ihrer 5'-Grenze vorliegen.
Jedoch wurden zwei Keratinozyten-abhängige Enhancer in der Sequenz stromabwärs vom LTR-artigen Fragment an den Positionen –3.010 und –2.814 identifiziert. Solche Elemente sind in die Transkriptionsregulierung der E6-E7-Onkogene der humanen Papillomaviren involviert und es wird angenommen, dass diese zu ihrer Gewebsspezifität beitragen (Cripe et al., „Transcriptional regulation of the human papillomavirus-16 E6-E7 promoter by a keratinocyte-dependent enhancer, and by viral E2 transactivator and repressor gene products: implications for cervical carcinogesis", EMBO J., 6: 3745–3753 (1987)).
Die Nukleotidsequenzanalyse der DNA 5' zum Transkriptionsstart (von nt –507) zeigte keine erkennbare TATA-Box innerhalb der erwarteten Distanz vom Beginn des ersten Exons (6). Jedoch legt das Vorhandensein potentieller Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren nahe, dass diese Region einen Promotor für das MN-Gen enthalten kann. Es existieren mehrere Konsensus-Sequenzen für Transkriptionsfaktoren AP1 und AP2 ebenso wie für andere regulatorische Elemente, einschließlich einer p53-Bindungsstelle (Locker und Buzard, „A dictionary of transcription control sequences", J. DNA Sequencing and Mapping, 1: 3–11 (1990); Imagawa et al., „Transcription factor AP-2 mediates induction by two different signal-transduction pathways: protein kinase C and cAMP", Cell, 51: 251–260 (1987); El Deiry et al., „Human genomic DNA sequences define a consensus binding site for p53", Nat. Genet., 1: 44–49 (1992)). Obwohl die vermeintliche Promotorregion 59,3% C + G enthält, weist diese keine zusätzlichen Attribute von CpG-reichen Inseln auf, die für TATA-lose Promotoren der Housekeeping-Gene typisch sind (Bird, „CpG-rich islands and the function of DNA methylation", Nature, 321: 209–213 (1986)). Eine weitere Klasse von Genen, denen eine TATA-Box fehlt, verwenden das Initiator(Inr)element als Promotor. Viele dieser Gene sind nicht konstitutiv aktiv, sie werden jedoch viel mehr während der Differenzierung oder Entwicklung reguliert. Das Inr weist eine Konsensussequenz von PyPyPyCAPyPyPyPyPy (SEQ. ID. NO.: 23) auf und umfasst die Transkriptionsstartstelle (Smale und Baltimore, „The 'initiator' as a transkription control element", Cell, 57: 103–113 (1989)). Es existieren zwei solcher Konsensussequenzen im vermeintlichen MN-Promotor; sie überlappen jedoch nicht mit dem Transkriptionsstart (6).
In den initialen Experimenten waren die Erfinder nicht dazu in der Lage, eine Promotoraktivität in humanen Karzinomzellen HeLa und CGL3 zu zeigen, die MN exprimieren, unter Verwendung des 3,5 kb Bd3-Fragmentes und Reihen von seinen Deletionsmutanten (von nt –933 bis –30) (SEQ. ID. NO.: 58), fusioniert an das Chloramphenicolacetyltransferase(CAT)-Gen in einem transienten System. Dies mag darauf hinweisen, dass entweder die Promotoraktivität der Region 5' zum MN-Transkriptionsstart unterhalb der Empfindlichkeit des CAT-Assays liegt oder zusätzliche regulatorische Elemente, die in unseren Konstrukten nicht vorliegen, erforderlich sind, um die Expression des MN-Gens anzutreiben.
Bezüglich dieser Tatsache wurde eine interessante Region im Mittelteil des MN-Gens gefunden. Die Region ist ungefähr 1,4 kb lang (nt 4.600–6.000 der genomischen Sequenz; SEQ. ID. NO.: 49) und überspannt ausgehend vom 3'-Teil des ersten Introns den Bereich bis zum Ende des 5. Exons. Die Region weist den Charakter einer typischen CpG-reichen Insel auf, mit 62,8% C + G-Gehalt und 82 CpG: 131 GpC Dinukleotiden. Darüber hinaus sind vielfache vermeintliche Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP2 und Sp1 (Locker und Buzard, siehe oben; Briggs et al., „Purification and biochemical characterization of the promoter-specific transcription factor Sp-1", Science, 234: 47–52 (1986)) im Zentrum dieses Areals konzentriert. Insbesondere das 3. Intron mit einer Länge von 131 bp enthält 3 Sp1 und drei AP2 Konsensussequenzen. Diese Daten zeigen die mögliche Einbeziehung dieser Region in die Regulation der MN-Genexpression an. Jedoch muss die Funktionalität dieser Region ebenso wie anderer regulatorischer Elemente, die im vorgeschlagenen 5'-MN-Promotor zu finden sind, nach wie vor bestimmt werden.
MN-Promotoranalyse
Um die für die MN-Genexpression notwendigen Sequenzen zu definieren, wurde eine Serie von 5'-Deletionsmutanten der vermeintlichen Promotorregion an das bakterielle Chloramphenicolacetyltransferase(CAT)-Gen fusioniert. (Siehe 8). Die pMN-CAT-Deletionskonstrukte wurden unter Verwendung eines DEAE-Dextranverfahrens für die transiente Expression in HeLa und CGL3-Zellen transfiziert. Solche Zellen wurden verwendet, weil sie natürlicherweise das MN-Protein exprimieren und somit alle erforderlichen Transkriptionsfaktoren enthalten sollten.
Nach 48 Stunden wurden Rohzelllysate hergestellt und die Aktivität des exprimierten CAT wurde gemäß Acetylierung von (¹⁴C)Chloramphenicol durch Dünnschichtchromatographie ausgewertet. Jedoch wurde keine MN-Promotor CAT-Aktivität entweder in den HeLa- oder den CGL3-Zellen in einem transienten System nachgewiesen. Andererseits ergaben Reporter-CAT-Plasmide mit viralen Promotoren (beispielsweise pBLV-LTR + Tax-Transaktivator, pRSV CAT und pSV2 CAT), die als positive Kontrolle dienten, starke Signale bezüglich des Chromatogramms. (pSV2 CAT trägt den SV40-Ursprung und exprimiert CAT aus dem SV40 early Promotor (P_E). pRSV CAT exprimiert CAT aus dem Rous-sarkoma-Virus(RSV)LTR-Promotor (P_Ltr)).
Keine nachweisbare CAT-Aktivität wurde in zusätzlichen Experimenten unter Verwendung zunehmender Mengen transfizierter Plasmide (von 2 bis 20 g DNA pro Schale) und verlängerten Zeitspannen der Zellinkubation nach Transkription beobachtet. Eine erhöhte Zelldichte verbesserte die Ergebnisse ebenfalls nicht (im Gegensatz zu den Erwartungen auf Grundlage der Dichte-abhängigen Expression von nativem MN-Protein in HeLa-Zellen). Weil die Erfinder Konsensussequenzen für die Transkriptionsfaktoren AP2 und AP1 im vermeintlichen MN-Promotor fanden, untersuchten sie die Wirkung ihrer Induktoren Dexamethason (1 m) und Phorbolesterphorbol 12-myristat 13-acetat (PMA 50 ng/ml) auf die CAT-Aktivität. Jedoch war der MN-Promotor gegenüber solchen Verbindungen nicht responsiv.
Das Folgende stellt Erklärungen für diese Ergebnisse bereit:

– Der putative MN-Promotor, der der Transkriptionsstartstelle unmittelbar vorausgeht, ist sehr schwach und seine Aktivität liegt unterhalb der Empfindlichkeit eines Standard-CAT-Assays;
– zusätzliche Sequenzen (beispielsweise Enhancer) sind zur MN-Transkription notwendig.

Um weiteres Licht auf die Regulierung der MN-Expression auf die Ebene der Transkription zu werfen, wurden Konstrukte, analog den MN-CAT-Konstrukten hergestellt, vorbereitet, wobei die MN-Promotorregion stromaufwärts vom Neomycinphosphotransferase-Gen gelegen ist, das zur Säugetierexpression gentechnisch verändert wurde. Solche Konstrukte werden dann in Zellen transfiziert, die einer Selektion mit G418 unterworfen werden. Die Aktivität des Promotors wird dann auf Grundlage der Anzahl von G418-resistenten Kolonien ausgewertet, die sich ergeben. Dieses Verfahren weist die Kapazität auf, die Aktivität eines Promotors nachzuweisen, der 50 bis 100 mal schwächer im Vergleich zu den Promotoren ist, die durch einen CAT-Assay nachweisbar sind.
Abgeleitete Aminosäuresequenz
Der ORF, der in 1(A–C) dargestellten MN cDNA weist die Codierungskapazität für ein 459 Aminosäureprotein mit einem berechneten Molekulargewicht von 49,7 k auf. Das MN-Protein weist einen geschätzten pI von ungefähr 4 auf. Wie durch Aminosäuresequenzanalyse bestimmt, kann die abgeleitete Primärstruktur des MN-Proteins in vier unterschiedliche Regionen aufgeteilt werden. Die initiale hydrophobe Region der hydrophoben Region von 37 Aminosäuren (AA) entspricht einem Signalpeptid. Das reife Protein weist einen N-terminalen Teil von 377 AA auf, ein hydrophobes Transmembran-Segment von 20 AA und eine C-terminale Region von 25 AA. Alternativ kann das MN-Protein als fünf Domänen aufweisend angesehen werden, die wie folgt sind: (1) ein Signalpeptid (Aminosäuren (AA) 1–37; SEQ. ID. NO.: 6); (2) eine Region mit einer Homologie zur Collagen-Alpha1-Kette (AA 38–135; SEQ. ID. NO.: 50); (3) eine Carboanhydrasedomäne (AA 136–391; SEQ. ID. NO.: 51); (4) eine Transmembranregion (AA 415–434; SEQ. ID. NO.: 52); und (5) einen intrazellulären C- Terminus (AA 435–459; SEQ. ID. NO.: 53). (Die AA-Nummern sind auf 1(A–C) bezogen).
Eine ausführlichere Einsicht in die Primärstruktur des MN-Proteins offenbarte das Vorhandensein mehrerer Konsensussequenzen. Eine potentielle N-Glycosylierungsstelle wurde an Position 346 von 1(A–C) gefunden. Dieses Merkmal zusammen mit einer vorhergesagten Membran-überspannenden Region sind mit den Ergebnissen konsistent, in denen MN sich als N-glycosyliertes Protein erwies, das in der Plasmamembran lokalisiert ist. Die MN-Proteinsequenz, die von der cDNA abgeleitet war, zeigte sich ebenfalls als sieben S/TPXX-Sequenzelemente aufweisend (SEQ. ID. NO.: 25 und 26) (eines von diesen ist das Signalpeptid), definiert von Suzuki, J. Mol. Biol. 207: 61–84 (1989) als Motive, die häufig in Gen-regulatorischen Proteinen zu finden sind. Jedoch sind nur zwei von diesen aus den nahegelegen Konsensus-Aminosäuren zusammengesetzt.
Experimente haben gezeigt, dass das MN-Protein dazu in der Lage ist, Zinkkationen zu binden, wie es durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Zn-geladener chelierender bzw. Komplex-bildender Sepharose gezeigt wurde. Aus HeLa-Zellen durch Mab M75 immunpräzipitiertes MN-Protein zeigte eine schwache katalytische Aktivität von CA. Die CA-artige Domäne von MN weist eine strukturelle Prädisposition auf, so dass sie als Bindungsstelle für kleine lösliche Domänen dient. Somit könnte das MN-Protein eine gewisse Art der Signaltransduktion vermitteln.
Es wurde gezeigt, dass MN-Protein aus LCMV-infizierten HeLa-Zellen durch Verwendung von DNA-Cellulose-Affinitätschromatographie an immobilisierte doppelsträngige Lachssamen-DNA bindet. Die Bindungsaktivität erforderte sowohl das Vorhandensein von Zinkkationen als auch die Abwesenheit eines Reduktionsmittels im Bindungspuffer.
Sequenzähnlichkeiten
Eine Computeranalyse der MN-cDNA-Sequenz wurde unter Verwendung von DNASIS und PROSID (Pharmacia Software packages) durchgeführt. GenBank, EMBL, Proteinidentifikationsquelle und SWISS-PROT-Datenbanken wurden auf alle möglichen Sequenzähnlichkeiten hin durchsucht. Zusätzlich wurde eine Recherche nach Proteinen durchgeführt, die Sequenz ähnlichkeiten mit MN teilten, in der MIPS-Datenbank mit dem FastA-Programm (Pearson und Lipman, PNAS (USA), 85: 2444 (1988)).
Es zeigte sich, dass das MN-Gen klarerweise eine neue Sequenz ist, die aus dem humanen Genom abgeleitet ist. Recherchen nach Aminosäuresequenzähnlichkeiten in Proteindatenbanken zeigte als nächste Homologie ein Sequenzidentitätsniveau (38,9% bei 256 AA oder 44 bei einer 170-AA-Überlappung) zwischen dem zentralen Anteil des MN-Proteins (AAs 136–391 (SEQ. ID. NO.: 51)) oder 221–390 (SEQ. ID. NO.: 54) von 1(A–C) und Carboanhydrasen (CA). Jedoch bewegt sich die gesamte Sequenzhomologie zwischen der cDNA-MN-Sequenz und cDNA-Sequenzen, die unterschiedliche CA-Isoenzyme codieren in einem Homologiebereich von 48–50%, die vom Fachmann auf dem Gebiet als gering angesehen wird. Deswegen ist die MN-cDNA-Sequenz nicht mit irgendeiner CA-cDNA-Sequenz verwandt.
Nur sehr eng verwandte nt-Sequenzen mit eine Homologie von zumindest 80–90% würden aneinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Ein Sequenzvergleich der MN-cDNA-Sequenz, der in 1(A–C) dargestellt ist, und einer entsprechenden cDNA der humanen Carboanhydrase II (CA II) zeigten, dass keine identischen Strecken zwischen den beiden Sequenzen existieren, die lang genug sein könnten, dass ein Segment der CA-II-cDNA-Sequenz mit 50 oder mehr Nukleotiden für eine Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die MN cDNA oder umgekehrt zur Verfügung haben würde.
Obwohl MN-abgeleitete Aminosäuresequenzen eine gewisse Homologie zu bekannten Carboanhydrasen zeigen, unterscheiden sie sich von diesen in mehreren Aspekten. Sieben Carboanhydrasen sind bekannt (Dodgson et al. (Hsg.), The Carbonic Anhydrases, (Plenum Press; New York/London (1991)). Alle der bekannten Carboanhydrasen sind Proteine von ungefähr 30 kd, kleiner als die p54/58N-verwandten Produkte des MN-Gens. Weiterhin formen die Carboanhydrasen keine Oligomere, wie es die MN-verwandten Proteine tun.
Der N-terminale Teil des MN-Proteins (AA 38–135; SEQ. ID. NO.: 50) zeigt eine 27–30%ige Identität mit einer humanen Collagen-Alpha1-Kette, die ein wichtiger Bestandteil der extrazellulären Matrix ist.
MN-Proteine und/oder Polypeptide
Der Satz „MN-Proteine und/oder Polypeptide" (MN-Proteine/Polypeptide) ist hierin so definiert, dass er Proteine und/oder Polypeptide bedeutet, die von einem MN-Gen oder Fragmenten hiervon codiert sind. Ein beispielhaftes und bevorzugtes MN-Protein weist die abgeleitete Aminosäuresequenz auf, die in 1(A–C) dargestellt ist. Bevorzugte MN-Proteine/Polypeptide sind solche Proteine und/oder Polypeptide, die eine beträchtliche Homologie mit dem in 1(A–C) dargestellten MN-Protein aufweisen. Beispielsweise sind solche im Wesentlichen homologen MN-Proteine/Polypeptide solche, die mit den MN-spezifischen Antikörpern reaktiv sind, vorzugsweise die Mabs M75, MN12, MN9 und MN7 oder deren Äquivalente.
Ein „Polypeptid" ist eine Kette von Aminosäuren, die kovalent durch Peptidbindungen gebunden sind, und es wird hierin angenommen, dass diese aus 50 oder weniger Aminosäuren bestehen. Ein „Protein" ist hierin so definiert, dass es ein Polypeptid ist, das aus mehr als 50 Aminosäuren besteht.
MN-Proteine zeigen mehrere interessante Merkmale: eine Zellmembranlokalisierung, eine Zelldichte-abhängige Expression in HeLa-Zellen, eine Korrelation mit dem tumorigenen Phänotyp von HeLa × Fibroblasten somatischen Zell-Hybride und eine Expression in mehreren humanen Karzinomen neben anderen Geweben. Wie es hierin beispielsweise in Beispiel 1 demonstriert wird, ist das MN-Protein direkt in Tumorgewebsschnitten zu finden, jedoch nicht im Allgemeinen in den dazugehörigen normalen Geweben (Ausnahmen sind unten in Beispiel 1 angegeben, wie in normalem Magengewebe). MN wird ebenfalls manchmal in morphologisch normal erscheinenden Arealen von Gewebsproben exprimiert, die eine Dysplasie und/oder Malignität zeigen. Zusammengenommen legen diese Merkmale eine mögliche Einbeziehung von MN in die Regulierung der Zellproliferation, -differenzierung und/oder -transformation nahe.
Es ist denkbar, dass ein Protein oder Polypeptid, das von einer neoplastischen Zelle in vivo erzeugt wurde, in seiner Sequenz von demjenigen von einer Tumorzelle erzeugten in einer Zellkultur oder durch eine transformierte Zelle verändert sein könnte. Somit fallen MN-Proteine und/oder -polypeptide, die variierende Aminosäuresequenzen aufweisen, einschließlich, jedoch ohne Einschränkung, Aminosäuresubstitutionen, -verlängerungen, -deletionen, -trunkierungen bzw. -verkürzungen und Kombinationen hiervon, in den Umfang dieser Offenbarung. Es sei ebenfalls erwähnt, dass ein Proteinübrigbleibsel innerhalb von Körperflüssigkeiten Gegenstand von Abbauprozessen ist, wie beispielsweise proteolytischen Prozessen; somit können MN-Proteine, die signifikant trunkiert sind, und MN-Polypeptide in Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Seren zu finden sein. Der Satz „MN-Antigen" wird hierin verwendet, um MN-Proteine und/oder Polypeptide zu umfassen.
Es sei weiterhin erwähnt, dass die Aminosäuresequenz von MN-Proteinen und -polypeptiden durch Gentechnik modifiziert werden kann. Ein oder mehrere Aminosäuren können deletiert oder substituiert werden. Solche Aminosäureveränderungen können irgendeine messbare Veränderung der biologischen Aktivität des Proteins oder Polypeptids verursachen und Proteine oder Polypeptide zur Folge haben, die innerhalb dieser Offenbarung liegen, ebenso wie MN-Muteine.
Die MN-Proteine und -polypeptide können auf einer Vielzahl von Wegen hergestellt werden, beispielsweise rekombinant, synthetisch oder in anderer Weise biologisch, d. h. durch Spalten längerer Proteine und Polypeptide in enzymatischer und/oder chemischer Weise. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von MN-Proteinen ist ein rekombinantes Verfahren. Besonders bevorzugte Verfahren des rekombinanten Erzeugens von MN-Proteinen sind unten für die GEX-3X-MN, MN20-19-, MN-Fc- und MN-PA-Proteine beschrieben.
Rekombinante Produktion von MN-Proteinen und Polypeptiden
Ein repräsentatives Verfahren zur Herstellung der MN-Proteine, das in 1(A–C) dargestellt ist oder von Fragmenten hiervon, würde darin bestehen, dass Volle-Länge- oder ein geeignetes Fragment der MN cDNA in einen geeigneten Expressionsvektor, wie er unten beispielhaft aufgeführt ist, eingefügt wird. In Zavada et al., WO 93/18152, siehe oben, ist die Erzeugung eines Fusionsproteins GEX-3X-MN unter Verwendung des Teil-cDNA-Klons (oben beschrieben) im Vektor pGEX-3X (Pharmacia) beschrieben. Nicht-glycosyliertes GEX-3X-MN (Das MN-Fusionsprotein MN-Glutathion-S-Transferase) aus XL1-Blue-Zellen. Hierin beschrieben ist die rekombinante Produktion sowohl eines glycosylierten MN-Proteins, exprimiert aus Insektenzellen, als auch von nicht-glycosyliertem MN-Protein, exprimiert aus E. coli unter Verwendung des Expressionsplasmides pEt-22b (Novagen Inc., Madison, WI (USA)).
Baculovirus-Expressionssysteme. Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden zur Infektion in mehrere Typen von Insektenzellen entwickelt. Beispielsweise wurden rekombinante Baculoviren u. a. für Folgendes entwickelt: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Heliothis zea, Spodoptera frugiperda und Trichoplusi ni (PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 89/046699; Wright, Nature, 321: 718 (1986); Fraser et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 25: 225 (1989)). Verfahren zur Einbringung exogener DNA-Insektenwirte sind in der Technik wohl bekannt. DNA-Transfektions- und Virusinfektionsverfahren variieren üblicherweise mit der Insektenart, die transformiert werden soll. Siehe beispielsweise Autographa (Carstens et al., Virology, 101:311 (1980)); Spodoptera (Karg, „Baculovirus Vectors for Expresson of Foreign Genes", in: Advances in Virus Research, 35 (1988)); und Heliothis (virescens) (PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 88/02030).
Eine breite Vielzahl von anderen Wirts-Klonierungsvektor-kombinationen können in nützlicher Weise beim Klonieren der wie hierin beschriebenen isolierten MN-DNA verwendet werden. Beispielsweise kann ein nützlicher Klonierungsträger chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen einschließen, wie beispielsweise verschiedene bekannte bakterielle Plasmide, wie beispielsweise pBR322, andere E.-coli-Plasmide und deren Derivate und Plasmide mit breiterem Wirtsbereich wie beispielsweise RP4, Phagen-DNA, wie beispielsweise die zahlreichen Derivate des Phagen Lambda, beispielsweise NB989 und Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet wurden, wie beispielsweise Plasmide, die modifiziert wurden, um Phagen-DNA-Expressionskontrollsequenzen zu verwenden.
Nützliche Wirte können eukaryontische oder prokaryontische Wirte einschließen, beispielsweise bakterielle Wirte wie E. coli und andere Bakterienstämme, Hefen und andere Pilze, Tier- und Pflanzenzellen, wie beispielsweise Tier- oder Pflanzenzellen in Kultur, Insektenzellen oder andere Wirte einschließen. Natürlich sind nicht alle Wirte gleichermaßen effizient. Die jeweilige Wahl der Wirt-/Kloniervehikel-Kombination kann durch den Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung nach eingehender Erwägung der hierin dargelegten Prinzipien erfolgen, ohne dass vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abgewichen wird.
Die jeweils für die Einfügung des ausgewählten DNA-Fragments in das Kloniervehikel zur Bildung eines rekombinanten DNA-Moleküls gewählte Stelle wird durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt. Dazu gehören die Größe und Struktur des zu exprimierenden Proteins oder Polypeptids, die Anfälligkeit des gewünschten Proteins oder Polypeptids für endoenzymatischen Abbau durch die Wirtszellenkomponenten und Verunreinigungen durch seine Proteine, Expressionseigenschaften, wie z. B. die Position des Start- und Stopp-Codons, und weitere Faktoren, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung klar sein werden.
Das rekombinante Nukleinsäuremolekül, das das MN-Gen, dessen Fragment oder cDNA enthält, kann eingesetzt werden, um einen Wirt zu transformieren, um dadurch zu ermöglichen, dass dieser Wirt (Transformant) das Strukturgen oder dessen Fragment exprimiert und das Protein oder Polypeptid produziert, wofür die Hybrid-DNA codiert. Das rekombinante Nukleinsäuremolekül kann ebenfalls eingesetzt werden, um einen Wirt zu transformieren, und um dadurch zu ermöglichen, dass der Wirt bei Replikation zusätzliche rekombinante Nukleinsäuremoleküle als Quelle für die MN-Nukleinsäure und Fragmente hiervon produziert. Die Auswahl bzw. Selektion eines geeigneten Wirtes für eine dieser Verwendungen wird durch eine Vielzahl von nach dem Stand der Technik bekannten Faktoren gesteuert. Dazu gehören beispielsweise die Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, die Toxizität der Nebenprodukte, die Einfachheit der Gewinnung des gewünschten Proteins oder Polypeptids, die Expressionseigenschaften, biologische Sicherheit und die Kosten.
Wenn die Wirtszelle ein Prokaryont, beispielsweise E. coli ist, werden kompetente Zellen, die zur DNA-Aufnahme befähigt sind, aus Zellen hergestellt, die nach der Exponentialwachstumsphase geerntet werden und in der Folge auf bekannte Weise nach dem CaCl₂-Verfahren behandelt werden. Die Transformation kann auch durchgeführt werden, nachdem ein Protoplast der Wirtszelle gebildet wurde.
Wenn der eingesetzte Wirt ein Eukaryont ist, können Transfektionsverfahren, wie beispielsweise die Verwendung eines Kalziumphosphat-Präzipitats, Elektroporation, herkömmliche mechanische Verfahren wie z. B. Mikroinjektion, Insertion eines in rote Blutkörperchen oder in Liposomen als Wirt eingekapselten Plasmides, Behandlung von Zellen mit Mitteln, wie Lysophosphatidylcholin, oder die Verwendung von Virusvektoren oder dergleichen verwendet werden.
Das Ausmaß bzw. das Niveau der Produktion eines Proteins oder Polypeptids wird durch drei Hauptfaktoren bestimmt: (1) die Anzahl der Kopien des Gens oder der dafür codierenden DNA-Sequenz innerhalb der Zelle; (2) die Effizienz, mit der diese Gene und Sequenzkopien transkribiert und translatiert werden; und (3) die Stabilität der mRNA. Die Effizienz der Transkription und Translation (die gemeinsam die Expression ausmachen) hängt wiederum von Nukleotidsequenzen ab, die normalerweise vor der gewünschten codierenden Sequenz angeordnet sind. Diese Nukleotidsequenzen und Expressionskontrollsequenzen definieren u. a. die Position, an der eine RNA-Polymerase interagiert, um die Transkription in Gang zu. setzen (die Promotorsequenz), und an die sich Ribosomen binden und mit der RNA (dem Transkriptionsprodukt) wechselwirken, um die Translation zu starten. Nicht alle derartigen Expressionskontrollsequenzen funktionieren mit der gleichen Effizienz. Es ist daher vorteilhaft, die spezifischen codierenden Sequenzen für das gewünschte Protein von ihren benachbarten Nukleotidsequenzen abzutrennen und sie stattdessen mit bekannten Expressionskontrollsequenzen zu fusionieren, um eine größere Expressionsstärke zu begünstigen. Nachdem dies erreicht wurde, kann das neugeschaffene DNA-Fragment in ein Multicopyplasmid bzw. ein Plasmid mit vielfacher Kopienzahl oder ein Bakteriophagenderivat eingefügt werden, um die Anzahl an Gen- oder Sequenzkopien innerhalb der Zelle zu erhöhen und dadurch die Ausbeute an exprimiertem Protein weiter zu verbessern.
Es können mehrere Expressionskontrollsequenzen eingesetzt werden. Dazu gehören die Operator-, Promotor- und Ribosomenbindungs- und -wechselwirkungssequenzen (einschließlich von Sequenzen wie den Shine-Dalgarno-Sequenzen) des Laktose-Operons von E. coli („das Lac-System"), die entsprechenden Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Systems von E. coli („das trp-System"), eine Fusion des trp- und lac-Promotors („das tac-System"), die Hauptoperator- und Promotorbereiche von Lambdaphagen (O_LP_L und O_RP_R) und der Kontrollbereich des fd-Phagen-Hüllproteins. DNA-Fragmente, die diese Sequenzen enthalten, werden durch Spaltung mit Restriktionsenzymen aus der DNA herausgeschnitten, die aus den transluzierenden Phagen isoliert wurden, welche die lac- oder trp-Operone tragen, oder von der DNA von Lambda- oder fd-Phagen. Diese Fragmente werden dann manipuliert, um eine begrenzte Population von Molekülen zu erhalten, so dass die essentiellen Kontrollsequenzen sehr nahe am oder in nächster Nähe zum Initiationscodon der codierenden Sequenz gebunden werden können.
Das Fusionsprodukt wird dann in ein Kloniervehikel zur Transformation oder Transfektion des geeigneten Wirtes eingeführt, und das Ausmaß der Antigen-Produktion wird gemessen. So können Zellen ausgewählt werden, welche die effizienteste Expression ergeben. Alternativ dazu können Kloniervehikel, die das an ein Initiationscodon bzw. Startcodon gebundene lac-, trp- oder Lambda-P_L-Kontrollsystem tragen, eingesetzt und an ein Fragment fusioniert werden, das eine Sequenz enthält, die für eine MN-Protein oder -polypeptid codiert, so dass das Gen oder die Sequenz korrekt aus dem Startcodon des Kloniervehikels translatiert wird.
Der Begriff „rekombinantes Nukleinsäuremolekül" ist gemäß der vorliegenden Erfindung so definiert, dass damit eine Hybrid-Nukleotidsequenz gemeint ist, die zumindest zwei Nukleotidsequenzen umfasst, wobei die erste Sequenz normalerweise nicht gemeinsam mit der zweiten natürlich vorkommt.
Der Satz „Expressionskontrollsequenz" ist gemäß der vorliegenden Erfindung so definiert, dass eine Sequenz aus Nukleotiden gemeint ist, welche die Expression von Strukturgenen kontrolliert bzw. steuert und kontrolliert, wenn sie mit diesen Genen operativ verbunden ist.
Das Nachfolgende sind repräsentative Beispiele von gentechnisch veränderten MN-Proteinen dieser Offenbarung. Die Beschreibungen sind beispielhaft.
Expression des MN20-19-Proteins
Ein repräsentatives, rekombinant produziertes MN-Protein ist das MN20-19-Protein, das, wenn es in Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen (Spodoptera-frugiperda-Zellen; Clontech; Palo Alto, Ca (USA)) produziert wird, glycosyliert wird. Das MN20-19-Protein weist das vermeintliche Signalpeptid (AA 1–37) von SEQ. ID. NO.: 6 (1(A-C)) nicht auf, weist ein Methionin (Met) am N-Terminus zur Expression und ein Leu-Glu-His-His-His-His-His-His (SEQ. ID. NO.: 22) auf, das dem C-Terminus zur Aufreinigung hinzugefügt wurde.
Um den Anteil der MN-codierenden Sequenz für das GEX-3X-MN-Fusionsprotein in alternativen Expressionssystemen einzufügen, wurde ein Satz Primer für die PCR entwickelt. Die Primer wurden konstruiert, um Restriktionsstellen an jedem Ende der codierenden Sequenz bereitzustellen, ebenso wie in-frame Start- und Stoppcodons. Die Sequenzen der Primer, die auf die Restriktionsenzymspaltstellen und Expressionsgrenzmarkierungen hinweisen, sind unten dargestellt.
Primer #20:N-terminus
Primer #19:C-termnus
Die Primer nach SEQ. ID. NO.: 17 und 18 wurden dazu verwendet, die MN-codierende Sequenz zu amplifizieren, die im GEX-3X-MN-Vektor vorlag, unter Verwendung von Standard-PCR-Techniken. Das sich ergebende PCR-Produkt (das als MN20-19 bezeichnet wurde) wurde auf einem 0,5% Agarose/1X TBE-Gel elektrophoretisiert; die 1,3 kb Bande wurde ausgeschnitten; und die DNA unter Verwendung des Gene-Clean-II-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bio101; LaJolla, CA (USA)) gewonnen.
MN20-19 und Plasmid pET-22b wurden mit den Restriktionsenzymen NdeI und XhoI gespalten, Phenol-Chloroform-extrahiert und die geeigneten Banden durch Agarose-Gelelektrophorese wie oben wiedergewonnen. Die isolierten Fragmente wurden in einem Vektor:Insert-Verhältnis von 1:4 Ethanol co-präzipitiert. Nach Resuspension wurden die Fragmente unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase ligiert. Das sich ergebende Produkt wurde dazu verwendet, kompetente Novablue-E.-coli-Zellen (Novagen, Inc.) zu transformieren. Plasmid-Mini-Preps (Magic Minipreps; Promega) aus den sich ergebenden Ampicillin-resistenten Kolonien wurden auf das Vorhandensein des korrekten Inserts durch Restriktionskartierung gescreent. Die Einfügung des Genfragmentes in das pET-22b-Plasmid unter Verwendung der NdeI- und XhoI-Orte fügte einen 6-Histidin-Schwanz dem Protein hinzu, der für eine Affinitätsisolierung verwendet werden konnte.
Um MN20-19 zur Insertion in das Baculovirus-Expressionssystem vorzubereiten, wurde das MN-20-19-Genfragment aus pET-22b unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen XbaI und PvuI ausgeschnitten. Der Baculovirus-Shuttlevektor pBacPAK8 (Clontech) wurden mit XbaI und PacI gespalten. Die erwünschten Fragmente (1,3 kb für MN20-19 und 5,5 kb für pBacPAK8) wurden durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert, unter Verwendung von Gene Clean II wiedergewonnen und in einem Insert:Vektor-Verhältnis von 2,4:1 co-präzipitiert.
Nach Ligation mit 74-DNA-Ligase wurde die DNA dazu verwendet, kompetente NM522 E.-coli-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Plasmid-Mini-Preps von sich ergebenden Ampicillin-resistenten Kolonien wurden auf das Vorhandensein des korrekten Inserts durch Restriktionskartierung gescreent. Plasmid-DNA von einer geeigneten Kolonie und liniearisierte BacPAK6-Baculovirus-DNA (Clontech) wurden dazu verwendet, Sf9-Zellen durch Standardtechniken zu transformieren. Eine Rekombination erzeugte BacPAK-Viren, die die MN20-19-Sequenz trugen. Diese Viren wurden auf Sf9-Zellen ausplattiert und mit Agar überschichtet.
Die Plaques wurden aufgenommen und auf Sf9-Zellen ausplattiert. Die konditionierten Medien und Zellen wurden gesammelt. Eine kleine Teilmenge der konditionierten Medien wurde für das Testen beiseitegelegt. Die Zellen wurden mit PBS mit 1% Triton X100 extrahiert.
Die konditionierten Medien und die Zellextrakte wurden auf Nitrocellulosepapier Dot-geblottet. Der Blot wurde mit 5% fettarmer Trockenmilch in PBS blockiert. Der Mab M75 wurde dazu verwendet, das MN20-19-Protein in den Dot-Blots nachzuweisen. Ein Kaninchen-anti-Maus-Ig-HRP wurde dazu verwendet, gebundenen Mab M75 nachzuweisen. Die Blots wurden mit TMB/H₂O₂ mit einem Membranverstärker (KPL; Gaithersburg, MD (USA)) entwickelt. Zwei Klone, die die stärkste Reaktion auf den Dot-Blots erzeugten, wurden zur Expansion ausgewählt. Einer hiervon wurde dazu verwendet, MN20-19-Protein in High-Five-Zellen (Invitrogen Corp., San Diego, CA (USA); BTI-TN-5BI-4; abgeleitet von Trichoplusia ni Eierzellhomogenat) zu erzeugen. MN20-19-Protein wurde aus den konditionierten Medien aus den Virus-infizierten High-Five-Zellen aufgereinigt.
Das MN20-19-Protein wurde aus den konditionierten Medien durch Immunaffinitätschromatographie aufgereinigt. 6,5 mg Mab M75 wurden an 1 g Tresyl-aktiviertes Toyopearl^TM (Tosoh, Japan (Nr. 14471)) gekoppelt. Ungefähr 150 ml der konditionierten Medien wurden durch die M75-Toyopearl-Säule laufengelassen. Die Säule wurde PBS-gewaschen und das MN20-19-Protein wurde mit 1,5 M MgCl eluiert. Das eluierte Protein wurde darauf gegen PBS dialysiert.
Fusionsproteine mit einem C-terminalen Teil, der eine durch Fc oder PA ersetzte Transmembranregion einschließt
MN-Fusionsproteine, bei denen der C-terminale Teil, der die Transmembranregion einschließt, durch das Fe-Fragment von humanem IgG oder durch Protein A ersetzt ist, wurden konstruiert. Solche Fusionsproteine sind zum Identifizieren von MN-Bindungsprotein(en) von Nutzen. In solchen MN-Chimären ist der gesamte N-terminale Teil von MN für eine Interaktion mit heterologen Proteinen zugänglich und der C-terminale Marker dient zum einfachen Nachweis und Aufreinigung der Proteinkomplexe.
Fusionsprotein MN-Pa (Protein A)
In einem ersten Schritt wurde das 3'-Ende der MN cDNA, die die Transmembranregion des MN-Proteins codiert, deletiert. Das Plasmid pFLMN (beispielsweise pBluescript mit MN cDNA in voller Länge) wurde durch EcoRI gespalten und durch S1-Nuklease mit stumpfen Enden versehen. Eine anschließende Spaltung durch SacI hatte die Entfernung des EcoRI-SacI-Fragments zur Folge. Das deletierte Fragment wurde darauf durch eine Protein-A-codierende Sequenz ersetzt, die aus dem Plasmid pEZZ (bezogen von Pharmacia) abgeleitet war, das mit RsaI und SacI gespalten wurde. Das gewonnene MN-PA-Konstrukt wurde in einen eukaryontischen Expressionsvektor pSGSC (beschrieben in Beispiel 3) subkloniert, und war dann für Transfektionsexperimente fertig.
Fusionsprotein MN-Fc
Das Klonieren des Fusionsproteins MN-Fc war aufgrund der Verwendung eines genomischen Klones ziemlich kompliziert, der das Fc-Fragment von humanem IgG enthielt, das eine komplexe Struktur dahingehend aufwies, als es einen Enhancer, einen Promotor, Exons und Introns enthielt. Darüber hinaus war die vollständige Sequenz des Klons nicht verfügbar. Es war somit notwendig, das korrekte In-Phasen-Spleißen und Fusion von MN an das Fc-Fragment durch Zusatz einer synthetischen Spleiß-Donor-Stelle (SSDS) sicherzustellen, die gemäß den Spleißsequenzen des MN-Gens entwickelt wurde.
Das Konstruktionsverfahren war wie folgt:

1. Plasmid pMH4 (beispielsweise pSV2gpt, das einen genomischen Klon der humanen IgG-Fc-Region enthält) wurde durch BamHI gespalten, um ein 13-kb-Fragment zu erhalten, das Fc codiert. (In pSV2gpt wird das E. coli Xanthin-Guaninphosphoribosyltransferasegen (gpt) unter Verwendung des SV40 Early Promotors (P_E) exprimiert, der sich im SV40-Ursprung befindet (in pSV2gpt wird das E.-coli-Xanthin-Guaninphosphoribosyl-Transferasegen (gpt) unter Verwendung des SV40 Early Promotors (P_E) exprimiert, der sich im SV40-Ursprung befindet, unter Verwendung des SV40-Small-T-Intron, und der SV40-Polyadenylierungsstelle).
2. Zur selben Zeit wurde das Plasmid pFLMN (mit der Volle-Länge-MN-cDNA) durch SalI-EcoRI gespalten. Das freigesetzte Fragment wurde aufgereinigt und mit einem synthetischen Adapter EcoRI-BglII ligiert, der eine synthetische Spleiß-Donor-Stelle (SSDS) enthielt.
3. Simultan wurde das Plasmid pBKCMV durch SalI-BamHI gespalten. Danach wurde sich die Tatsache zu Nutzen gemacht, dass die kohäsiven BamHI-Enden (des Fc-codierenden Fragmentes) mit den BglII-Enden des SSDS kompatibel sind, und Fc wurde an MN ligiert. Das MN-Fc-Ligationsprodukt wurde dann in pBKCMV durch direktionales Klonieren durch die SalI- und BamHI-Stellen eingefügt.

Eine Verifizierung der korrekten Ausrichtung und In-Phasenfusion der gewonnenen MN-Fc-chimären Klone war dahingehend problematisch, als die Sequenz von Fc nicht bekannt war. Somit wurden funktionelle Konstrukte auf Basis der Ergebnisse von transienten eukaryontischen Expressionsanalysen ausgewählt.
Synthetische und biologische Produktion von MN-Proteinen und -polypeptiden
MN-Proteine und -polypeptide können nicht nur durch rekombinante Mittel, sondern auch durch Synthese oder andere biologische Mittel hergestellt werden. Die synthetische Bildung des Polypeptids oder Proteins erfordert eine chemische Synthetisierung der erwünschten Aminosäurekette durch Verfahren, die in der Technik wohl bekannt sind. Beispielhaft für andere biologische Mittel zur Herstellung des erwünschten Polypeptids oder Proteins ist die Unterwerfung eines längeren MN-Polypeptids oder -proteins unter eine selektive Proteolyse, die die erwünschte Aminosäuresequenz enthält; beispielsweise kann das längere Polypeptid oder Protein mit chemischen Reagenzien oder mit Enzymen gespalten werden.
Die chemische Synthese eines Peptids ist in der Technik konventionell und kann beispielsweise durch die Merrifield-Testphasensynthesetechnik erreicht werden (Merrifield, J., Am. Chem. Soc., 85: 2149–2154 (1963); Kent et al., Synthetic Peptides in Biology and Medicine, 29 ff., Hsg. Alitalo et al., (Elsevier Science Publishers 1985); und Haug, J. D., „Peptide Synthesis and Protecting Groupg Strategy", American Biotechnology Laboratory, 5 (1): 40–47 (Jan./Feb. 1987)).
Techniken der chemischen Peptidsynthese schließen die Verwendung automatischer Peptidsynthesegeräte ein, die kommerziell erhältliche geschützte Aminosäuren verwenden, beispielsweise Biosearch (San Rafael, CA (USA)) Modelle 9500 und 9600; Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA (USA)), Modell 430; Milligen (eine Abteilung der Millipore Corp.; Bedford, MA (USA)) Modell 9050; und DuPont's RAMP (Rapid Automated Multiple Peptide Synthesis) (DuPont Compass, Wilmington, DE (USA)).
Regulierung der MN-Expression und MN-Promotor
MN scheint ein neues regulatorisches Protein zu sein, das direkt in die Kontrolle der Zellproliferation und in die Zelltransformation involviert ist. In HeLa-Zellen wird die Expression von MN positiv durch die Zelldichte reguliert. Seine Konzentration wird durch persistierende Infektion mit LCMV erhöht. In Hybridzellen zwischen HeLa und normalen Fibroblasten korreliert die MN-Expression mit der Tumorigenität. Die Tatsache, dass MN nicht in nicht-tumorigenen Hybridzellen (CGL1) vorliegt, jedoch in einem tumorigenen Segreganten exprimiert, dem Chromosom 11 fehlt, weist darauf hin, dass MN durch einen vermeintlichen Suppressor in Chromosom 11 negativ reguliert wird.
Ein Beweis, der die regulatorische Rolle des MN-Proteins in der Erzeugung stabiler Transfektanten von NIH-3T3-Zellen stützt, die konstitutiv MN-Protein wie in Beispiel 3 beschrieben exprimieren, wurde gefunden. Als Folge der MN-Expression nahmen die NIH-3T3- Zellen Merkmale an, die mit einem transformierten Phänotyp assoziiert sind: veränderte Morphologie, erhöhte Sättigungsdichte, Proliferationsvorteil in Serum-reduzierten Medien, gesteigerte DNA-Synthese und Kapazität für Verankerungs-unabhängiges Wachstum. Weiterhin, wie in Beispiel 4 dargestellt, zeigte eine zytometrische Analyse von asynchronen Zellpopulationen an, dass die Expression von MN-Protein zu einem beschleunigten Fortschreiten von Zellen durch die G1-Phase führt, eine Reduktion der Zellgröße und dem Verlust einer Fähigkeit für den Wachstumsstopp unter nicht geeigneten Bedingungen. Ebenfalls zeigt Beispiel 4, dass MN-exprimierende Zellen eine gesenkte Empfindlichkeit gegenüber dem DNA-schädigenden Arzneistoff Mitomycin C zeigen.
Nicht-tumorigene menschliche Zellen, nämlich CGL1-Zellen, wurden ebenfalls mit der Volle-Länge-MN-cDNA transfiziert. Dasselbe pSGSC-MN-Konstrukt in Kombination mit pSV2-Neoplasmid wie verwendet, um die NIH-3T3-Zellen zu transfizieren (Beispiel 3) wurde verwendet. Auch war die Vorschrift dieselbe, außer dass die G418-Konzentration auf 1000 μg/ml erhöht wurde.
Von den 15 MN-positiven Klonen (getestet durch SP-RIA und Western-Blotting) wurden 3 für eine weitere Analyse ausgewählt. Zwei MN-negative Klone, die aus CGL1-Zellen isoliert wurden, transfiziert mit leerem Plasmid, wurden als Kontrollen zugesetzt. Eine initiale Analyse zeigt, dass die Morphologie- und Wachstumseigenschaften von MN-transfizierten CGL1-Zellen nicht dramatisch verändert werden, jedoch deren Proliferationsrate und Plattierungseffizienz wird erhöht.
MN cDNA und Promotor. Wenn die Promotorregion aus dem genomischen MN-Klon, isoliert wie oben beschrieben, an MN cDNA gebunden und in CGL1-Hybridzellen transfiziert wurden, war die Expression des MN-Proteins unmittelbar nach der Selektion nachweisbar. Sie ließ dann jedoch schrittweise nach, was somit auf die Wirkung eines Feedback-Regulators hinweist. Das vermeintliche regulatorische Element schien über den MN-Promotor zu wirken, weil, wenn die Volle-Länge-cDNA (die den Promotor nicht enthielt) zur Transfektion verwendet wurde, keine ähnliche Wirkung beobachtet wurde.
Ein „Antisense"-MN-cDNA/Promotor-Konstrukt wurde dazu verwendet, CGL3-Zellen zu transfizieren. Die Wirkung war die gegenteilige derjenigen der CGL1-Zellen, die mit dem „Sense"-Konstrukt transfiziert wurden. Während die transfizierten CGL1-Zellen Kolonien formten, die mehrere Male größer als die Kontroll-CGL1 waren, bildeten die transfizierten CGL3-Zellen viel kleinere Kolonien als die Kontroll-CGL3-Zellen.
Für diese Experimente wurde der Teil der Promotorregion, der an die MN cDNA durch eine BamHI-Stelle gebunden war, aus einem NcoI-BamHI-Fragment des MN-genomischen Klons (Bd3) abgeleitet und repräsentiert eine Region einiger hundert bp stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle. Nach der Ligation wurde die gebundene DNA in einen pBK-CMV-Expressionsvektor (Stratagene) eingeführt. Die erforderliche Orientierung der eingeführten Sequenz wurde durch direktionales Klonieren sichergestellt und anschließend durch Restriktionsanalyse verifiziert. Das Transfektionsverfahren war dasselbe, wie es beim Transfizieren der NH-3T3-Zellen verwendet wurde (Beispiel 3), jedoch war eine Co-Transfektion mit dem pSV2-Neoplasmid nicht notwendig, weil der Neoselektionsmarker bereits in den pBK-CMV-Vektor eingeschlossen war.
Nach zwei Wochen Selektion in einem Medium, das G418 enthielt, waren bemerkenswerte Unterschiede zwischen den Zahlen und Größen der Kolonien, die gewachsen waren, evident, wie es oben erwähnt wurde. Unmittelbar im Anschluss an die Selektion und das Klonieren wurden die MN-transfizierten CGL1- und CGL3-Zellen durch SP-RIA bezüglich einer Expression und Repression von MN jeweils getestet. Die isolierten transfizierten CGL1-Klone waren MN-positiv (obwohl die Konzentration niedriger war als die, die mit der Volle-Länge-cDNA erzielt wurde), wohingegen MN-Protein von den transfizierten CGL3-Klonen beinahe abwesend war. Jedoch begann in anschließenden Passagen die Expression von MN in transfizierten CGL1-Zellen schwächer zu werden und wurde dann blockiert, was vielleicht einen Beweis für einen Kontrollfeedback-Mechanismus darstellt.
Als Folge der sehr stark gesenkten Proliferation der transfizierten CGL3-Zellen war es schwierig, die Mehrzahl der klonierten Zellen zu expandieren (gemäß SP-RIA, derjenigen mit der niedrigsten Konzentration an MN), und sie gingen während des Passagierens verloren. Jedoch überwanden einige Klone dieses Problem und exprimierten wiederum MN. Es ist möglich, dass, wenn diese Zellen einmal eine höhere Menge erreichten, die Konzentration an endogen erzeugter MN mRNA gegenüber der Menge an ektopisch exprimierter Antisense-mRNA erhöht wurde.
Transformation und Reversion
Wie in den Beispielen 3 und 4 dargestellt ist, zeigen Vertebratenzellen, die mit MN cDNA in geeigneten Vektoren transfiziert wurden, eine auffällige morphologische Transformation. Transformierte Zellen können sehr klein sein, dicht gepackt und langsam wachsen, mit basophilem Zytoplasma und vergrößtertem Golgi-Apparat. Es wurde jedoch herausgefunden, dass transformierte Klone über die Zeit hinweg, beispielsweise innerhalb von 3–4 Wochen, zu einer nahezu normalen Morphologie zurückkehren, selbst wenn die Zellen MN-Proteine in hohen Konzentrationen produzieren. Das MN-Protein ist biologisch sogar in Hefezellen aktiv; abhängig von der Konzentration bzw. Stärke seiner Expression stimuliert oder verzögert es deren Wachstum und induziert morphologische Veränderungen.
Volle-Länge-MN-cDNA wurde in pGD, einem MLV-abgeleiteten Vektor, eingeführt, der zusammen mit Standard-kompetenten MLV (muriner Leukämievirus) einen infektiösen transmittierbaren Komplex bildet (pGD-MN + MLV). Dieser Komplex transformiert ebenfalls Vertebratenzellen, wie beispielsweise NIH-3T3-Zellen und Mausembryo-Fibroblasten BALB/c, die ebenfalls zu einer nahezu normalen Morphologie zurückkehren. Solche Revertanten enthalten wiederum MN-Protein und erzeugen den (pGD-MN + MLV) artifiziellen Viruskomplex, der seine transformierende Fähigkeit beibehält. Somit ist eine Reversion von MN-transformierten Zellen offensichtlich nicht auf einen Verlust, auf eine Stilllegung oder Mutation von MN cDNA zurückzuführen, sondern kann das Resultat der Aktivierung eines Suppressorgens (von Suppressorgenen) sein.
Nukleinsäuresonden und Test-Kits
Nukleinsäuresonden dieser Offenbarung sind solche, die Sequenzen umfassen, die der in 1(A–C) gezeigten MN cDNA komplementär oder im Wesentlichen komplementär sind oder zu anderen MN-Gensequenzen, wie beispielsweise der vollständigen genomischen Sequenz von 3(A–F) (SEQ. ID. NO.: 5) und der vermeintlichen Promotorsequenz (SEQ. ID. NO.: 27) von 6. Der Satz „im Wesentlichen komplementär" ist hierin so definiert, dass er die Bedeutung hat, wie sie in der Technik üblicherweise verstanden wird und wie sie somit im Kontext von Standardhybridisierungsbedingungen verwendet wird. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen kann so eingestellt werden, dass die Präzision der Komplementarität kontrolliert wird. Zwei Nukleinsäuren sind beispielsweise im Wesentlichen zuein ander komplementär, wenn sie aneinander unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.
Stringente Hybridisierungsbedingungen werden hierin als solche angesehen, die Standardhybridisierungsbedingungen, wie sie in der Technik als stringent angesehen werden, entsprechen. Es ist beispielsweise im Allgemeinen verständlich, dass stringente Bedingungen relativ salzarme und/oder Hochtemperaturbedingungen umfassen, wie sie beispielsweise durch 0,02 M bis 0,15 M NaCl bei Temperaturen von 50°C bis 70°C bereitgestellt werden. Weniger stringente Bedingungen, wie beispielsweise 0,15 M bis 0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von 20°C bis 55°C können durch Zusatz erhöhender Mengen an Formamid stringenter gemacht werden, was dazu dient, Hybrid-Duplexe zu destabilisieren, genauso wie es die erhöhte Temperatur tut.
Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen sind in Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 1.91 und 9.47–9.51 (Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 387–389 (Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY; 1982); Tsuchiya et al., Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, 71 (6): 721–725 (Juni 1991) beschrieben.
Bevorzugte Nukleinsäuresonden sind Fragmente der isolierten Nukleinsäuresequenzen, die MN-Proteine oder Polypeptide codieren.
Bevorzugt sind solche Sonden aus zumindest 29 Nukleotiden, besonders bevorzugt 50 Nukleotiden zusammengesetzt.
Nukleinsäuresonden müssen nicht an eine codierende Region von MN hybridisieren. Beispielsweise können Nukleinsäuresonden teilweise oder vollständig an eine nicht-codierende Region der genomischen Sequenz hybridisieren, die in 3(A–F) (SEQ. ID. NO.: 5) dargestellt ist. Eine konventionelle Technik kann dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob die Fragmente von SEQ. ID. NO.: 5 oder verwandte Nukleinsäuren dazu von Nutzen sind, MN-Nukleinsäuresequenzen zu identifizieren (siehe beispielsweise Benton und Davis, siehe oben und Fuscoe et al., siehe oben).
Homologiebereiche der MN-nt-Sequenz an andere Nicht-MN-nt-Sequenzen sind oben angegeben. Im Allgemeinen können Nukleotidsequenzen, die sich nicht in den Alu- oder LTR-artigen Regionen befinden, von vorzugsweise 29 oder mehr Basen oder noch mehr, vorzugsweise von 50 Basen oder mehr, routinemäßig getestet und gescreent werden, und es kann festgestellt werden, ob sie unter stringenten Bedingungen nur an MN-Nukleotidsequenzen hybridisieren. Weiterhin sind nicht alle Homologien innerhalb der genolischen Alu-artigen MN-Sequenzen Alu-Repeats so nahe, dass sie unter stringenten Hybridisierungsbedingungen ein Hybridisierungssignal ergeben. Der Prozentsatz der Homologie zwischen MN-Alu-artigen Regionen und einer Standard-Alu-J-Sequenz – sind wie folgt angegeben:
Nukleinsäuresonden können dazu verwendet werden, MN DNA und/oder RNA nachzuweisen, und können somit dazu verwendet werden, auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit von MN-Genen und Amplifikation(en), Mutation(en) oder genetische Umordnungen von MN-Genen in den Zellen eines Patienten zu testen. Beispielsweise kann eine Überexpression eines MN-Genes durch Northern Blotting und RNase-Schutzanalyse unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden. Genveränderungen wie Amplifikationen, Translokationen, Inversionen und Deletionen, um nur einige zu nennen, können unter Verwendung von Sonden zur in vitro-Hybridisierung an Chromosome aus Patientenzellen, gleichgültig ob in Metaphasen-Streuungen oder Interphasenkernen, nachgewiesen werden. Ein Southern Blotting kann ebenfalls mit den Sonden verwendet werden, um Amplifikationen oder Deletionen der MN-Gene nachzuweisen. Eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus(RFLP)-Analyse unter Verwendung dieser Sonden ist ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweisen von Genveränderungen, Mutationen und Deletionen. Diese Sonden können ebenfalls dazu verwendet werden, MN-Proteine und/oder Polypeptide ebenso wie Homologe oder nahe Homologe hierzu durch deren Hybridisierung an verschiedene mRNAs zu identifizieren, die aus MN-Genen in unterschiedlichen Geweben transkribiert wurden.
Die Sonden können somit diagnostisch/prognostisch von Nutzen sein. Die Sonden können in Test-Kits verkörpert werden, vorzugsweise mit geeigneten Mitteln, um zu ermöglichen, dass diese Sonden, wenn sie an ein geeignetes MN-Gen oder MN-mRNA-Target hybridisiert sind, visualisiert werden können. Solche Proben schließen Gewebsproben einschließlich Abstriche, Körperflüssigkeiten und Gewebs- und Zellextrakte ein.
PCR-Assays
Um relativ große genetisch Umordnungen nachzuweisen, können Hybridisierungstests verwendet werden. Um relativ kleine genetische Umordnungen nachzuweisen, wie kleine Deletionen oder Amplifikationen oder Punktmutationen, würde vorzugsweise eine PCR angewendet werden (US-Patente Nr. 4 800 159; 4 683 195; 4 683 202; und Kapitel 14 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, siehe oben).
Ein beispielhafter Assay würde zelluläre DNA von normalen und kanzerösen Zellen verwenden, wobei die DNA isoliert und unter Verwendung geeigneter PCR-Primer amplifiziert werden würde. Die PCR-Produkte würden vorzugsweise anfänglich auf einem Größentrennungsgel verglichen werden, um Größenveränderungen nachzuweisen, die für spezielle genetische Umordnungen Indikativ sind. Wenn keine Größenunterschiede bemerkt werden, können weitere Vergleiche fortgenommen werden, vorzugsweise unter Verwendung von beispielsweise einem PCR-Einstrang-Konformationspolymorphismus(PCR-SSCP)-Assay oder einen denaturierenden Gradienten-Gelelektrophoreseassay. (Siehe beispielsweise Hayashi, K., „PCR-SSCP: A Simple and Sensitive Method for Detection of Mutations in the Genomic DNA", in PCR Methods and Applications, 1: 34–38 (1991); und Meyers et al. „Detection and Localization of Single Base Changes by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis", Methods in Enzymology, 155: 501 (1987)).
Assays
Assays werden offenbart, um MN-Antigen oder MN-spezifische Antikörper in Vertebratenproben nachzuweisen und/oder zu quantifizieren, vorzugsweise in Säugetierproben, besonders bevorzugt in menschlichen Proben. Solche Proben schließen Gewebsproben, Körperflüssigkeiten, Gewebsextrakte und Zellextrakte ein. MN-Antigen kann durch Immunassay, immunhistochemische Färbung, Immunelektronen- und Elektronenrastermikroskopie unter Verwendung von Immungold neben anderen Techniken nachgewiesen werden.
Bevorzugte Gewebsproben zum Testen durch immunhistochemische Färbung schließen Zellabstriche, histologische Schnitte aus Biopsiegeweben oder -organen und Abdruck-Präparate neben anderen Gewebsproben ein. Solche Gewebsproben können in verschiedener Weise aufrechterhalten werden, sie können beispielsweise frisch, eingefroren oder Formalin-, Alkohol- oder Aceton- oder in anderer Weise fixiert und/oder in Paraffin eingebettet und deparaffinisiert werden. Biopsie-Gewebsproben können beispielsweise solche Proben sein, die durch Absaugen-, Stich-, Pinsel-, Kegel-, Chorionvillie-, endoskopische, Exzisions-, Inzisions-, Nadel-, Perkutanstanzung und Oberflächen-Biopsien neben anderen Biopsietechniken entfernt wurden.
Bevorzugte Zervixgewebsproben schließen Zervix- bzw. Gebärmutterhals-Abstriche, Konisierungsproben, histologische Schnitte aus Hysterektomie-Proben oder andere durch Biopsie gewonnene Gebärmutterhalsgewebsproben ein. Bevorzugte Mittel zur Gewinnung von Zervikalabstrichen schließen Routineabstrich, Abschab- oder Cytobrush-Techniken neben anderen Mitteln ein. Bevorzugter sind Cytrobrush- oder Abwischtechniken. Bevorzugt werden Zellabstriche auf Mikroskop-Objektträgern vorgenommen, beispielsweise mit 55% EtOH oder einem Alkohol-basierten Sprayfixativ fixiert und luftgetrocknet.
Papanicolaou-gefärbte Zervix-Abstriche (Pap-Abstriche) können durch die Verfahren dieser Offenbarung gescreent werden, beispielsweise für retrospektive Studien. Vorzugsweise würden Pap-Abstriche entfernt und mit markierten Antikörpern gegen MN-Antigen erneut angefärbt werden. Ebenfalls können Archivproben, beispielsweise zueinander passende Abstriche und Biopsie- und/oder Tumorproben für retrospektive Studien verwendet werden. Prospektive Studien können ebenfalls mit zueinander passenden Proben von Patienten durchgeführt wer den, die ein höheres als normales Risiko aufweisen, keine abnormale Zervix-Zytopathologie zu zeigen.
Bevorzugte Proben, in denen MN-Antigen beispielsweise durch Western Blotting oder Radioimmunassay getestet wird, sind Gewebs- und/oder Zellextrakte. Jedoch kann das MN-Antigen in Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden, die unter anderem folgende Flüssigkeiten einschließen: Blut, Serum, Plasma, Samen, Brustexsudat, Speichel, Tränen, Sputum, Schleim, Urin, Lymphe, Cytosol, Aszites, Pleuraleffusionen, Amnionflüssigkeit, Blasenwaschungen, bronchioalveolare Spülungen und zerebrospinale Flüssigkeit. Es wird bevorzugt, dass das MN-Antigen aus einem größeren Volumen an Körperflüssigkeit vor dem Testen konzentriert werden kann. Bevorzugte Körperflüssigkeiten zur Untersuchung würden vom Krebstyp abhängen, auf den man getestet hat, jedoch wären im Allgemeinen bevorzugte Körperflüssigkeiten Brustexsudat, Pleuraleffusionen und Aszites.
MN-spezifische Antikörper können durch serologisch aktive MN-Proteine/Polypeptide in Proben von solchen Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Lymphe, Schleim, Tränen, Urin, Spinalflüssigkeit und Speichel gebunden werden; jedoch werden solche Antikörper am üblichsten in Blut, Plasma und Serum, vorzugsweise in Serum, gefunden. Eine Korrelation der Ergebnisse aus den Assays zum Nachweis und/oder Quantifizieren von MN-Antigen und MN-spezifischen Antikörpern, die damit reaktiv sind, stellt ein bevorzugtes Profil des Erkrankungszustandes eines Patienten bereit.
Die Assays sind sowohl diagnostisch als auch/oder prognostisch, d. h. diagnostisch/prognostisch. Der Begriff „diagnostisch/prognostisch" ist hierin so definiert, dass er die folgenden Prozesse entweder einzeln oder kumulativ abhängig vom klinischen Kontext umfasst: Bestimmung des Vorhandenseins einer Erkrankung, Bestimmung der Art einer Erkrankung, die Unterscheidung einer Erkrankung von einer anderen, die Vorhersage des wahrscheinlichen Outcomes eines Krankheitszustandes, die Bestimmung der Perspektive bzw. Prognose, sich von einer Krankheit zu erholen, wie es durch die Art und Symptome eines Falles angezeigt ist, die Überwachung des Erkrankungsstatus eines Patienten, die Überwachung eines Patienten bezüglich des Wiederauftretens einer Erkrankung und/oder die Bestimmung der bevorzugten therapeutischen Vorschrift für einen Patienten. Die diagnostischen/prognostischen Verfahren dieser Offenbarung sind beispielsweise zum Screenen von Populationen auf das Vorhandensein einer neoplastischen oder prä-neoplastischen Erkran kung, zur Bestimmung des Risikos der Entwicklung einer neoplastischen Erkrankung, der Diagnose des Vorhandenseins einer neoplastischen und/oder prä-neoplastischen Erkrankung, zur Überwachung des Erkrankungszustandes von Patienten mit einer neoplastischen Erkrankung und/oder zur Bestimmung der Prognose für den Verlauf der neoplastischen Erkrankung von Nutzen. Beispielsweise scheint es, dass die Intensität der Immunfärbung mit MN-spezifischen Antikörpern mit dem Schweregrad einer Dysplasie korrelieren kann, die in getesteten Proben vorliegt.
Diese Entdeckung ist zum Screenen auf das Vorhandensein einer breiten Vielzahl von neoplastischen Erkrankungen wie oben angezeigt von Nutzen. Diese Offenbarung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Evaluieren der Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von malignen oder prä-malignen Zellen bereit, beispielsweise in einer Gruppe von Zellen, die frisch aus einem Wirt entfernt wurden. Ein solcher Assay kann zum Nachweis von Tumoren, zum Quantifizieren ihres Wachstums und bei der Unterstützung der Diagnose und Prognose der Erkrankung verwendet werden. Die Assays können ebenfalls dazu verwendet werden, das Vorhandensein einer Krebsmetastase nachzuweisen, ebenso wie die Abwesenheit oder Entfernung des gesamten Tumorgewebes im Anschluss an einen chirurgischen Eingriff, an eine Krebschemotherapie und/oder Bestrahlungstherapie zu bestätigen. Sie kann weiterhin dazu verwendet werden, die Krebschemotherapie und das Wiederauftreten eines Tumors zu überwachen.
Das Vorhandensein von MN-Antigen oder -Antikörpern kann unter Verwendung mehrerer wohl definierter diagnostischer Assays nachgewiesen und/oder quantifiziert werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kann jedes der konventionellen Immunassay-Formate anpassen, um das MN-Antigen und/oder -Antikörper nachzuweisen und/oder zu quantifizieren.
Viele Formate zum Nachweis von MN-Antigen und MN-spezifischen Antikörpern sind selbstverständlich verfügbar. Diese können Western Blots, ELISAs, RIAs, kompetitive EIAs oder duale Antikörpersandwich-Assays, immunhistochemische Färbung, neben anderen Assays sein, die alle üblicherweise in der Diagnostikindustrie verwendet werden. In solchen Immunassays ist die Interpretation der Ergebnisse auf der Annahme basiert, dass die Antikörper- oder Antikörperkombination nicht mit anderen Proteinen und Proteinfragmenten kreuzreagieren wird, die in der Probe vorliegen, und die mit MN nicht in Beziehung stehen.
Repräsentativ für eine Art eines ELISA-Testes für ein MN-Antigen ist ein Format, bei dem eine Mikrotiterplatte mit Antikörpern beschichtet wird, die gegen MN-Proteine/Polypeptide hergestellt werden, oder Antikörpern, die gegen Ganzzellen, die MN-Proteine exprimieren, hergestellt wurden, und hierzu wird eine Patientenprobe hinzugefügt, beispielsweise ein Gewebe oder ein Zellextrakt. Nach einer Inkubationsperiode, die es jedem Antigen ermöglicht, an die Antikörper zu binden, wird die Platte gewaschen und ein anderer Satz Anti-MN-Antikörper, der an ein Enzym gebunden ist, wird zugesetzt, inkubiert, um das Stattfinden einer Reaktion zu ermöglichen, und die Platte wird danach erneut gewaschen. Danach wird das Enzymsubstrat der Mikrotiterplatte zugesetzt und für eine Zeitspanne inkubiert, die es dem Enzym ermöglicht, auf das Substrat einzuwirken, und die Absorption bzw. Extinktion der Endpräparation wird gemessen. Eine große Extinktionsveränderung zeigt ein positives Ergebnis an.
Es ist für den Fachmann auf dem Gebiet der Immunassays ebenfalls klar, dass MN-Proteine und/oder Polypeptide zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Vorhandenseins von MN-Antigen in Körperflüssigkeiten, Geweben und/oder Zellen von Patienten verwendet werden können. Bei einer solchen Ausführungsform wird ein kompetitiver Immunassay verwendet, wobei das MN-Protein/Polypeptid markiert ist und eine Körperflüssigkeit zugesetzt wird, um um die Bindung des markierten MN-Protein/Polypeptids an die Antikörper, die für MN-Protein/Polypeptid spezifisch sind, zu konkurrieren.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein immunometrischer Assay verwendet werden, wobei ein markierter Antikörper gegen ein MN-Protein oder -Polypeptid hergestellt, verwendet wird. In einem solchen Assay ist die Menge an markiertem Antikörper, der mit dem Antigen-gebundenen Antikörper komplexiert, direkt proportional mit der Menge an MN-Antigen in der Probe.
Ein repräsentativer Assay zum Nachweisen von MN-spezifischen Antikörpern ist ein kompetitiver Assay, bei dem markiertes MN-Protein/Polypeptid von Antikörpern in einer Probe ausgefällt wird, beispielsweise in Kombination mit monoklonalen Antikörpern, die MN-Proteine/Polypeptide erkennen. Der Fachmann auf dem Gebiet würde jeden der konventionellen Immunassay-Formate so anpassen, dass er MN-spezifische Antikörper nachweisen und/oder quantifizieren kann. Der Nachweis der Bindung der Antikörper an die MN-Proteine/Polypeptide kann auf vielen Wegen erfolgen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, beispielsweise bei Menschen unter Verwendung von anti-humanem markierten IgG.
Ein beispielhaftes Immunassay-Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren von MN-Antigen in einer Vertebratenprobe umfasst die folgenden Schritte:

a) Inkubieren der Vertebratenprobe mit einem oder mehreren Antikörpersätzen (ein Antikörper oder Antikörper), die an MN-Antigen binden, wobei ein Satz markiert oder in anderer Weise nachweisbar ist;
b) Überprüfen der inkubierten Probe auf das Vorhandensein von Immunkomplexen, die MN-Antigen und die Antikörper umfassen.

Ein weiteres beispielhaftes Immunassay-Verfahren ist dasjenige, bei dem ein kompetitiver Immunassay dazu verwendet wird, MN-Antigen in einer Vertebratenprobe nachzuweisen und/oder zu quantifizieren, und wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Inkubieren einer Vertebratenprobe mit einem oder mehreren Sätzen an MN-spezifischen Antikörpern und einer bestimmten Menge an markiertem oder in anderer Weise nachweisbarem MN-Protein/Polypeptid, wobei das MN-Protein/Polypeptid um eine Bindung an die Antikörper mit MN-Antigen, das in der Probe vorliegt, konkurriert;
b) Überprüfen der inkubierten Probe zur Bestimmung der Menge an markiertem/nachweisbarem MN-Protein/Polypeptid, das an die Antikörper gebunden ist; und
c) Bestimmung aus den Ergebnissen der Überprüfung in Schritt b), ob MN-Antigen in der Probe vorliegt und/oder der Menge an MN-Antigen, die in der Probe vorliegt.

Wenn einmal Antikörper (einschließlich biologisch aktiver Antikörperfragmente), die eine geeignete Spezifität aufweisen, hergestellt wurden, ist eine breite Vielzahl immunologischer Assayverfahren zur Bestimmung der Bildung spezifischer Antikörper-Antigenkomplexe verfügbar. Zahlreiche kompetitive und nicht-kompetitive Proteinbindungsassays wurden in der wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben und eine große Anzahl solcher Assays sind kommerziell erhältlich. Beispielhafte Immunassays, die zum Nachweisen eines Serum- Antigens von Nutzen sind, schließen solche ein, die im US-Patent Nr. 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; und 4 098 876 beschrieben sind.
Antikörper, die in den Assays verwendet werden, können markiert oder unmarkiert sein. Unmarkierte Antikörper können in einer Agglutination verwendet werden; markierte Antikörper können in einer breiten Vielzahl von Assays verwendet werden, die eine breite Vielzahl von Markern bzw. Markierungen verwenden.
Geeignete Nachweismittel schließen die Verwendung von Markierungen wie beispielsweise Radionukliden, Enzymen, Coenzymen, fluoreszierenden Mitteln, chemilumineszierenden Mitteln, Chromogenen, Enzymsubstraten oder Co-Faktoren, Enzyminhibitoren, freien Radikalen, Teilchen, Farbstoffen und dergleichen ein. Solche markierten Reagenzien können in einer Vielzahl von wohl bekannten Assays verwendet werden, wie beispielsweise Radioimmunassays, Enzymimmunassays, beispielsweise ELISA, fluoreszierende Immunassays und dergleichen. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 3 766 162, 3 791 932; 3 817 837 und 4 233 402.
Immunassay-Test-Kits
Die oben ausgeführten Assays können in Test-Kits ausgeführt werden, um MN-Antigen- und/oder MN-spezifische Antikörper (einschließlich biologisch aktiver Antikörperfragmente hiervon) nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. Kits zum Nachweisen und/oder Quantifizieren von MN-Antigen können MN-Protein(e)/Polypeptid(e) und/oder MN-spezifische Antikörper, polyklonal und/oder monoklonal umfassen. Solche diagnostischen/prognostischen Test-Kits können ein oder mehrere Reihen bzw. Sätze von Antikörpern, polyklonal und/oder monoklonal, für ein Sandwichformat umfassen, wobei die Antikörper Epitope auf dem MN-Antigen erkennen und ein Satz wird in geeigneter Weise markiert oder ist in anderer Weise nachweisbar.
Test-Kits für ein Assay-Format, bei dem eine Konkurrenz zwischen einem markierten (oder in anderer Weise nachweisbaren) MN-Protein/Polypeptid und MN-Antigen in der Probe um die Bindung an einen Antikörper existiert, können die Kombination des markierten Proteins/Polypeptids und des Antikörpers in Mengen umfassen, die eine optimale Sensitivität und Genauigkeit bereitstellen.
Test-Kits für MN-spezifische Antikörper umfassen vorzugsweise markierte/nachweisbare MN-Protein(e) und/oder Polypeptid(e) und können weitere Bestandteile wie notwendig umfassen, wie beispielsweise Kontrollmittel, Puffer, Verdünnungsmittel und Detergentien. Solche Test-Kits können weitere geeignete Formate für konventionelle Assays aufweisen.
Ein Kit zur Verwendung in einem Enzym-Immunassay schließt typischerweise ein Enzym-markiertes Reagenz und ein Substrat für das Enzym ein. Dieses Enzym kann beispielsweise entweder an MN-spezifischen Antikörper oder an einen Antikörper gegen einen solchen MN-spezifischen Antikörper binden.
Herstellung von MN-spezifischen Antikörpern
Der Begriff „Antikörper" ist hier so definiert, dass er nicht nur ganze Antikörper sondern auch biologisch aktive Fragmente von Antikörpern einschließt, vorzugsweise Fragmente, die die Antigen-bindenden Regionen enthalten. Solche Antikörper können durch konventionelle Methodik und/oder gentechnische Veränderung hergestellt werden. Antikörperfragmente können gentechnisch vorzugsweise aus den variablen Regionen der leichten und/oder schweren Ketten (V_H und V_L), einschließlich der hypervariablen Regionen und noch mehr bevorzugt aus sowohl den V_H- als auch V_L-Regionen hergestellt werden. Beispielsweise umfasst der Begriff „Antikörper", wie hierin verwendet, polyklonale und monoklonale Antikörper und biologisch aktive Fragmente hiervon, der unter anderem die Möglichkeit von „univalenten" Antikörpern einschließt (Glennie et al., Nature, 295: 712 (1982)); Fab-Proteine, einschließlich Fab' und F(ab')₂-Fragmente, gleichgültig ob kovalent oder nicht-kovalent aggregiert; leichte und schwere Ketten alleine, vorzugsweise variable schwere und Leichtkettenregionen (V_H- und V_L-Regionen) und besonders bevorzugt einschließlich der hypervariablen Regionen (in anderer Weise bekannt als Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDRs) der V_H- und V_L-Regionen; F_C-Proteine; „Hybrid"-Antikörper, die zur Bindung von mehr als einem Antigen in der Lage sind; konstant-variable Regionchimären; „zusammengesetzte" Immunglobuline mit schweren und leichten Ketten unterschiedlichen Ursprungs; „veränderte" Antikörper mit einer verbesserten Spezifität und anderen Eigenschaften, wie sie durch Standardrekombinationstechniken hergestellt werden, und ebenfalls durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenesetechniken (Dalbadie-McFarland et al., PNAS (USA), 79: 6409 (1982)).
Für therapeutische und/oder Bildgebungsanwendungen kann es bevorzugt sein, dass die Antikörper biologisch aktive Antikörperfragmente sind, vorzugsweise gentechnisch veränderte Fragmente, besonders bevorzugt gentechnisch veränderte Fragmente aus den V_H- und/oder V_L-Regionen und noch mehr bevorzugt, die die hypervariablen Regionen hiervon umfassen.
Es existieren herkömmliche Techniken zur Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper, die in der Immunassay-Technik wohl bekannt sind. Immunogene zur Herstellung von MN-spezifischen Antikörpern schließen MN-Proteine und/oder -Polypeptide ein, vorzugsweise aufgereinigt, und MX-infizierte Tumorzelllinien, beispielsweise MX-infierte HeLa-Zellen, unter anderen Immunogenen.
Anti-Peptid-Antikörper werden ebenfalls durch herkömmliche Verfahren in der Technik hergestellt, wie es in den europäischen Patentveröffentlichungen Nr. 44 710 (veröffentlicht am 27. Januar 1982) beschrieben ist. Kurz gesagt, werden solche Anti-Peptid-Antikörper durch Selektieren eines Peptids aus einer MN-Aminosäuresequenz wie aus 1(A–C), deren chemischer Synthese, deren Konjugation bzw. Bindung an ein geeignetes immunogenes Protein und deren Injektion in ein geeignetes Tier, üblicherweise ein Kaninchen oder eine Maus, hergestellt; danach werden entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper hergestellt, wobei die Letzteren durch das Köhler-Milstein-Verfahren als Beispiel hergestellt werden.
Abgesehen von der konventionellen Hybridom-Technik können neuere Technologien zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Beispielsweise hat die Verwendung der PCR zum Klonieren und Exprimieren von Antikörper-V-Genen und die Phage-Display-Technologie zur Selektion von Antikörpergenen, die Fragmente mit Bindungsaktivitäten codieren, die Isolierung von Antikörperfragmenten aus Repertoires von PCR-amplifizierten V-Genen unter Verwendung immunisierter Mäuse oder Menschen geführt (Marks et al., Bio-Technology, 10: 779 (Juli 1992); Chiang et al., BioTechniques, 7 (4): 360 (1989); Ward et al., Nature, 341: 544 (12. Okt. 1989); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991); Clackson et al., Nature, 352: (15. August 1991); und Mullinax et al., PNAS (USA), 87: 8095 (Okt. 1990)).
Beschreibungen für die Herstellung von Antikörpern, wobei der Begriff hierin so definiert ist, dass er auch biologisch aktive Antikörperfragmente einschließt, durch rekombinante Techniken, ist in den US-Patenten Nr. 4 816 567 (erteilt am 28. März 1989); in der europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. (EP) 338 745 (veröffentlicht am 25. Okt. 1989); EP 368 684 (veröffentlicht am 16. Juni 1990); EP 239 400 (veröffentlicht am 30. September 1987); WO 90/14424 (veröffentlicht am 29. November 1990); WO 90/14430 (veröffentlicht am 16. Mai 1990); Huse et al., Science, 246: 1275 (8. Dezember 1989); Marks et al., BioTechnology, 10: 779 (Juli 1992); LaSastry et al., PNAS (USA), 86: 5728 (August 1989); Chiang et all, BioTechniques, 7 (40): 360 (1989); Orlandi et al., PNAS (USA), 86: 3833 (Mai 1989); Ward et al., Nature, 341: 544 (12. Oktober 1989); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991); und Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res., 19 (15), 4133 (1991) zu finden.
Repräsentative monoklonale Antikörper (= Mabs)
Monoklonale Antikörper zur Verwendung in den Assays können durch Verfahren gewonnen werden, die in der Technik wohl bekannt sind, siehe beispielsweise Galfre und Milstein, „Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures", in: Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques, 73, 1–46 (Langone und Vanatis (Hsg.); Academic Press (1981)); und in der klassischen Referenz, Milstein und Köhler, Nature, 256: 495–497 (1975)).
Obwohl repräsentative Hybridomas durch Fusion von murinen Zellinien, Human/human-Hybridomas (Olsson et al., PNAS (USA), 77: 5429 (1980)) und humane/murine Hybridomas (Schlom et al., PNAS (USA), 77: 6841 (1980); Shearman et al., J. Immunol., 146: 928–935 (1991); und Gorman et al., PNAS (USA), 88: 4181–4185 (1991)) gebildet werden, können diese ebenfalls durch andere Möglichkeiten hergestellt werden. Derartige humanisierte monoklonale Antikörper sind bevorzugte monoklonale Antikörper für therapeutische und Bildgebungsanwendungen.
Monoklonale Antikörper, die für diese Offenbarung spezifisch sind, können durch Immunisieren geeigneter Säugetiere, vorzugsweise Nagetiere, besonders bevorzugt von Kaninchen oder Mäusen, hergestellt werden, mit einem geeigneten Immunogen, beispielsweise MaTu-infizierten HeLa-Zellen, MN-Fusionsproteinen oder MN-Proteinen/Polypeptiden, die an ein Trägerprotein, falls notwendig, gebunden sind. Beispielhafte Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern dieser Erfindung sind unten beschrieben.
Die monoklonalen Antikörper, die gemäß dieser Offenbarung zum Identifizieren von MN-Proteinen/Polypeptiden von Nutzen sind, können in irgendeiner konventionellen Art und Weise markiert werden, beispielsweise mit Enzymen wie beispielsweise Meerrettichperoxididase (HRP), mit fluoreszierenden Verbindungen oder mit radioaktiven Isotopen wie beispielsweise ¹²⁵I neben anderen Markierungen. Ein bevorzugter Marker ist ¹²⁵I und ein bevorzugtes Verfahren zur Markierung der Antikörper erfolgt durch Verwendung von Chloramin-T (Hunter, W. M., „Radioimmunassay", in: Handbook of Experimental Immunology, Seiten 14.1–14.40 (D. We. Weir, Hsg., Blackwell, Oxford/London/Edinburgh/Melbourne; 1978)).
Repräsentative monoklonale Antikörper schließen Mabs M75, MN9, MN12 und MN7, wie sie unten beschrieben sind, ein. Monoklonale Antikörper dienen dazu, MN-Proteine/Polypeptide in verschiedenen labordiagnostischen Tests zu identifizieren, beispielsweise in Tumorzellkulturen oder in klinischen Proben.
Gegen HeLa-Zellen hergestellte Mabs
MAb M75. Der monoklonale Antikörper M75 (MAb M75) wird durch das Maus-Lymphozyten-Hybridoma VU-M75 erzeugt, das ursprünglich in der Sammlung von Hybridomas am Institut der Virulogie, Slowakische Akademie der Wissenschaften (Bratislava, Slowakische Republik) hinterlegt wurden und unter der ATCC-Hinterlegung HB11128 am 17. September 1992 in der American Type Culture Collection (ATCC) in Manassas, VA (USA) hinterlegt wurde. Die Produktion der Hybridoma VU-M75 ist in Zavada et al., WO 93/18152 beschrieben.
Der Mab M75 erkennt sowohl die nicht-glycosylierten GEX-3X-MN-Fusionsproteine als auch natives MN-Fusionsprotein, wie es in CGL3-Zellen gleich gut exprimiert wird. Mab M75 wurde durch Epitopkartierung als mit dem Epitop reaktiv dargestellt, das durch die Aminosäuresequenz von AA 62 bis AA 67 (SEQ. ID. NO.: 10) des in 1(A–C) dargestellten Proteins repräsentiert wird.
Gegen Fusionsprotein GEX-3X-MN hergestellte Mabs
Monoklonale Antikörper wurden ebenfalls gegen das MN-Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein (GEX-3X-MN) hergestellt. BALB/C-Mäuse wurden intraperitoneal gemäß Standardverfahren mit dem GEX-3X-MN-Fusionsprotein in Freund'schem Adjuvans herge stellt. Milzzellen der Mäuse wurden mit SP/20 Myelomzellen fusioniert (Milstein und Köhler, siehe oben).
Gewebskulturmedien auf den Hybridomas wurden gegen CGL3- und CGL1-Membranextrakten in einem ELISA gescreent, der HRP-markierte Kaninchen-Antimaus-Antikörper verwendete. Die Membranextrakte wurden auf Mikrotiterplatten aufgeschichtet. Ausgewählt wurden Antikörper, die mit dem CGL3-Membranextrakt reagierten. Ausgewählte Hybridomas wurden zweimal durch limitierende Verdünnung kloniert.
Die durch das gerade beschriebene Verfahren hergestellten monoklonalen Antikörper wurden durch Western Blots des GEX-3X-MN-Fusionsproteins charakterisiert und mit Membranextrakten aus den CGL1- und CGL3-Zellen. Repräsentativ für die monoklonalen Antikörper, die hergestellt wurden, sind die Mabs MN9, MN12 und MN7.
Mab MN9. Der monoklonale Antikörper MN9 (Mab MN9) reagiert mit demselben Epitop wie Mab M75, repräsentiert durch die Sequenz von AA 62 bis AA 67 (SEQ. ID. NO.: 10) von 1(A–C) des MN-Proteins. Wie Mab M75 erkennt Mab MN9 sowohl das GEX-3X-MN-Fusionsprotein als auch das native MN-Protein gleich gut.
Mabs, die dem Mab MN9 entsprechen, können reproduzierbar durch Screenen einer Reihe von monoklonalen Antikörpern hergestellt werden, die gegen ein MN-Protein/Polypeptid hergestellt wurden, wie beispielsweise das GEX-3X-MN-Fusionsprotein gegen das Peptid, das das Epitop für die monoklonalen Antikörper M75 und MN9 repräsentiert, d. h. SEQ. ID. NO.: 10. Alternativ könnte das Novatop-Sytem (Novagen) oder eine Konkurrenz mit dem hinterlegten monoklonalen Antikörper M75 verwendet werden, um Mabs zu selektieren, die mit den Mabs M75 und MN9 vergleichbar sind.
Mab MN12. Der monoklonale Antikörper MN12 (Mab MN12) wird durch das Maus-Lyphozytenhybridom MN 12.2.2 erzeugt, das unter der ATCC-Bezeichnung HB 11647 am 9. Juni 1994 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20120-22 (USA) hinterlegt wurde. Antikörper, die Mab MN12 entsprechen, können ebenfalls hergestellt werden, analog dem Verfahren, wie es oben für Mab MN9 dargelegt wurde, durch Screening einer Reihe von Antikörpern, die gegen ein MN-Protein/Polypeptid hergestellt wurden, gegen das Peptid, das das Epitop für Mab MN12 re präsentiert. Dieses Peptid ist AA55 bis AA60 von 1(A–C) (SEQ. ID. NO.: 11). Das Novatope-System könnte ebenfalls dazu verwendet werden, Antikörper zu finden, die für dieses Epitop spezifisch sind.
Mab MN7. Der monoklonale Antikörper MN7 (Mab MN7) wurde aus monoklonalen Antikörpern ausgewählt, die gegen nicht-glycosyliertes GEX-3X-MN wie oben beschrieben hergestellt wurden. Er erkennt das Epitop von MN, repräsentiert durch die Aminosäuresequenz von AA 127 bis AA 147 (SEQ. ID. NO.: 12) der 1(A–C) des MN-Proteins. Analog den oben beschriebenen Verfahren für die Mabs MN9 und MN12 können Mabs entsprechend Mab MN7 durch Selektieren von Mabs hergestellt werden, die gegen ein MN-Protein/Polypeptid hergestellt wurden, die mit dem Peptid mit SEQ. ID. NO.: 12 reaktiv sind oder durch die festgestellten alternativen Mittel.
Epitopkartierung
Eine Epitopkartierung wurde durch das Novatope-System durchgeführt, ein Kit, der kommerziell von Novagen, Inc. erhältlich ist (siehe als analoges Beispiel Li et al., Nature, 363: 85–88 (6. Mai 1993)). Kurz gesagt, wurde die MN cDNA in überlappende kurze Fragmente von ungefähr 60 Basenpaare geschnitten. Die Fragmente wurden in E. coli exprimiert und die E.-coli-Kolonien wurden auf Nitrocellulosepapier transferiert, lysiert und mit dem Mab von Interesse sondiert. Die MN cDNA von Klonen, die mit dem Mab von Interesse sequenziert wurden, und die Epitope der monoklonalen Antikörper wurden aus den überlappenden Polypeptiden abgeleitet, von denen sich herausgestellt hatte, dass sie mit jedem Mab reaktiv waren.
Therapeutische Verwendung von MN-spezifischen Antikörpern
Die MN-spezifischen Antikörper, gleich ob monoklonal und/oder polyklonal, vorzugsweise monoklonal und wie oben beschrieben, können therapeutisch in der Behandlung einer neoplastischen und/oder prä-neoplastischen Erkrankung verwendet werden, entweder alleine oder in Kombination mit chemotherapeutischen Arzneistoffen oder toxischen Mitteln wie beispielsweise Ricin A. Weiterhin bevorzugt zur therapeutischen Anwendung wäre ein biologisch aktives Antikörperfragment wie hierin beschrieben. Ebenfalls bevorzugte MN-spezifische Antikörper für solche therapeutische Verwendungen wären humanisierte monoklonale Antikörper. Die MN-spezifischen Antikörper können in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden, vorzugsweise dispergiert in einem physiologisch akzeptablen, nicht-toxischen flüssigen Trägerstoff.
Bildgebungsverwendung der Antikörper
Weiterhin können die MN-spezifischen Antikörper, wenn sie an ein Bildgebungsmittel, wie beispielsweise ein Radionuklid gebunden sind, zur Bildgebung verwendet werden. Biologisch aktive Antikörperfragmente oder humanisierte monoklonale Antikörper können zur Bildgebungsverwendung bevorzugt sein.
Das neoplastische Gewebe eines Patienten kann beispielsweise als Stellen transformierter Stammzellen von Tumoren und Lokalisierungen jeder Metastasen identifiziert werden. Antikörper, in geeigneter Weise markiert oder an ein Bildgebungsmittel gebunden, können in einem physiologisch akzeptablen Träger in einem Patienten injiziert werden, und die Bindung der Antikörper kann durch ein Verfahren nachgewiesen werden, das zur Bildgebung oder Markierung, beispielsweise durch Szintigraphie, geeignet ist.
Antisense-MN-Nukleinsäuresequenzen
MN-Gene werden hierin als vermeintliche Onkogene angenommen und die codierten Proteine werden dadurch als vermeintliche Onkoproteine betrachtet. Antisense-Nukleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen zu mRNA komplementär sind, die aus den MN-Genen transkribiert wird, wie sie durch die Antisense-Oligodesoxynukleotide ODN1 und ODN2 repräsentiert werden (SEQ. ID. NO.: 3 und 4) können zur Reduzierung oder Vorbeugung einer Expression des MN-Genes verwendet werden (Zamecnick, P. C., „Introduction: Oligonucleotide Base Hybridization as a Modulator of Genetic Message Readout", Seiten 1–6, Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, (Wiley-Liss, Inc., New York, NY, USA; 1991); Wickstrom, E., „Antisense DNA Treatment of HL-60 Promyelocytic Leukemia Cells: Terminal Differentiation and Dependence on Target Sequence", Seiten 7–24, ebd.; Leserman et al., „Targeting and Intracellular Delivery of Antisense Oligonucleotides Interfering with Oncogene Expression", Seiten 25–34, ebd.; Yokoyama, K., „Transcriptional Regulation of c-myc Protooncogene by Antisense RNA", Seiten 35–52, ebd.; van den Berg et al., „Antisense fos Oligodeoxyribonucleotides Suppress the Generation of Chromosomal Aberrations", Seiten 63–70, ebd.; Mercola, D., „Antisense fos and fun RNA", Seiten 83–114, ebd.; Inouye, Gene 72: 25–34 (1988); Miller and Ts'o, Ann. Reports Med. Chem., 23: 295–304 (1988); Stein und Cohen, Cancer Res., 48: 2659–2668 (1988); Stevenson und Inversen, J. Gen. Virol., 70: 2673–2682 (1989); Goodchild, „Inhibition of Gene Expression by Oligonucleotides", Seiten 53–77, Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (Cohen, J. S., Hsg.; CRC, Press, Boca Raton, Florida, USA; 1989); Dervan et al., „Oligonucleotide Recognition of Double-helical DNA by Triple-helix Formation", Seiten 197–210, ebd.; Neckers, L. M., „Antisense Oligodeoxynucleotides as a Tool for Studying Cell Regulation: Mechanisms of Uptake and Application to the Study of Oncogene Function", Seiten 211.232, ebd.; Leitner et al., PNAS (USA), 87: 3430–3434 (1990); Bevilacqua et al., PNAS (USA), 85: 831–835 (1988); Loke et al., Curr. Top. Micribiol. Immunol., 141: 282–288 (1988); Sarin et al., PNAS (USA), 85: 7448–7451 (1988); Agrawal et al., „Antisense Oligonucleotides: A Possible Approach for Chemotherapy and AIDS", International Union of Biochemistry Conference on Nucleic Acid Therapeutics (Jan. 13–17, 1991; Clearwater Beach, Florida, USA); Armstrong, L., Ber. Week, Seiten 88–89 (5. März 1990); und Weintraub et al., Trends, 1: 22–25 (1985)). Solche Antisense-Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise Oligonukleotide, hemmen durch Hybridisierung an die MN mRNA, insbesondere in Nachbarschaft der Ribosomen-Bindungsstelle und des Translationsstartpunktes, die Translation der mRNA. Somit kann die Verwendung solcher Antisense-Nukleinsäuresequenzen als eine Form der Krebstherapie betrachtet werden.
Bevorzugte Antisense-Oligonukleotide sind Gen-spezifische ODNs oder Oligonukleotide, die zum 5'-Ende der MN mRNA komplementär sind. Besonders bevorzugt sind die 29-mer ODN1 und 10-mer ODN2 (SEQ. ID. NO.: 3 und 4). Diese Antisense-ODNs sind für die vielen Antisense-Nukleinsäuresequenzen repräsentativ, die dazu dienen können, die MN-Genexpression zu inhibieren. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet kann geeignete Antisense-Nukleinsäuresequenzen bestimmen, vorzugsweise Antisense-Oligonukleotide, aus den Nukleinsäuresequenzen von 1(A–C) und 3(A–F).
Ebenfalls wie oben beschrieben, bildeten CGL3-Zellen, die mit einem „Antisense"-MN-cDNA/Promotorkonstrukt transfiziert waren, Kolonien, die viel kleiner waren als Kontroll-CGL3-Zellen.
Vakzinen
Es wird leicht erkennbar sein, dass MN-Proteine und -Polypeptide in Vakzine eingebaut werden können, die dazu in der Lage sind, eine protektive Immunität gegen eine neoplastische Erkrankung und eine dämmende Wirkung auf die tumorigene Aktivität zu induzieren. Die Leistungsfähigkeit eines repräsentativen MN-Fusionsproteins GEX-3X-MN als Vakzine in einem Rattenmodell ist in Beispiel 2 dargestellt.
MN-Proteine und/oder Polypeptide können synthetisiert oder rekombinant oder in anderer Weise biologisch hergestellt werden, so dass sie ein oder mehrere Aminosäuresequenzen umfassen, die ein oder mehrere Epitope der MN-Proteine entweder in monomerer oder multimerer Form umfassen. Diese Proteine und/oder Polypeptide können dann in Vakzinen eingebaut werden, die dazu in der Lage sind, eine protektive Immunität zu induzieren. Techniken zur Vergrößerung der Antigenität solcher Polypeptide schließen den Einbau in eine multimere Struktur, die Bindung an einen hoch immunogenen Proteincarrier, beispielsweise Keyhole-Limpet-Hämozyanin (KLH) oder Diphtherie-Toxid und die Verabreichung in Kombination mit Adjuvantien oder anderen Verstärkern der Immunreaktion ein.
Bevorzugte MN-Proteine/Polypeptide, die in einer Vakzine zu verwenden sind, wären gentechnisch veränderte MN-Proteine. Bevorzugte rekombinante MN-Proteine sind die GEX-3X-MN-, MN20-19-, MN-Fc- und MN-PA-Proteine.
Weitere beispielhafte Vakzinen schließen Vaccinia-MN (lebende Vakzinia-Viren mit Volle-Länge-MN-cDNA) und Baculovirus-MN (Volle-Länge-MN-cDNA eingefügt in den Baculovirus-Vektor, beispielsweise in Suspension infizierte Insektenzellen) ein. Unterschiedliche Vakzinen können kombiniert und die Vakzinierungs-Zeitspannen können verlängert werden.
Als eine bevorzugte beispielhafte Anwendung einer solchen Vakzine könnte die Verabreichung an Patienten zu sehen sein, deren MN-tragender Primärkrebs chirurgisch entfernt wurde. Die Vakzine kann eine aktive Immunität in dem Patienten induzieren und ein Rezidiv oder eine Metastasierung vermeiden.
Es wird weiterhin erkannt werden, dass Anti-Idiotyp-Antikörper gegen Antikörper gegen MN-Proteine/Polypeptide ebenfalls als Vakzinen von Nutzen sind und in ähnlicher Weise formuliert werden können.
Eine Aminosäuresequenz, die einem Epitop eines MN-Proteins/Polypeptids entweder in monomerer oder multimerer Form entspricht, kann ebenfalls durch chemische Synthesemittel oder durch Aufreinigung aus biologischen Quellen einschließlich gentechnisch modifizierten Mikroorganismen oder ihren Kulturmedien gewonnen werden (Siehe Lerner, „Synthetic Vaccines", Sci. Am. 248 (2): 66–74 (1983)). Das Protein/Polypeptid kann in einer Aminosäuresequenz mit anderen Proteinen/Polypeptiden kombiniert werden, einschließlich von Fragmenten anderer Proteine, wie beispielsweise, wenn sie als Fusionsprotein synthetisiert werden, oder gebunden an andere Antigenen oder nicht-antigene Polypeptide synthetischen oder biologischen Ursprungs. Es kann in einigen Fällen wünschenswert sein, ein MN-Protein oder Polypeptid an ein immunogenes und/oder antigenes Protein oder Polypeptid zu fusionieren, beispielsweise um die Leistungsfähigkeit einer MN-basierten Vakzine zu stimulieren.
Der Begriff „entsprechend einem Epitop eines MN-Proteins/Polypeptids" ist so zu verstehen, dass er die praktische Möglichkeit einschließt, dass in einigen Fällen Aminosäuresequenzvariationen des natürlich vorkommenden Proteins oder Polypeptids antigen sein können und eine protektive Immunität gegen eine neoplastische Erkrankung und/oder anti-tumorigene Wirkungen verleihen können. Mögliche Sequenzvariationen schließen ohne Beschränkung Aminosäuresubstitutionen, Verlängerungen, Deletionen, Trunkierungen, Interpolationen und Kombinationen hiervon ein. Solche Variationen fallen in den betrachteten Umfang der Offenbarung, vorausgesetzt, dass das Protein oder Polypeptid, das diese enthält, immunogen ist und Antikörper, die durch ein solches Polypeptid oder Protein angeregt werden, mit natürlich vorkommenden MN-Proteinen und Polypeptiden in ausreichendem Umfang kreuzreagieren, um eine protektive Immunität und/oder anti-tumorigene Aktivität bereitzustellen, wenn sie als Vakzine verabreicht werden.
Solche Vakzinzusammensetzungen werden mit einem physiologisch akzeptablen Medium kombiniert werden, einschließlich immunologisch akzeptabler Verdünnungsmittel und Träger, ebenso wie üblicherweise verwendeter Adjuvantien, wie beispielsweise vollständigem Freund'schen Adjuvans, Saponin, Alaun und dergleichen. Die Verabreichung wäre eine solche in immunologisch wirksamen Mengen der MN-Proteine oder -Polypeptide, vorzugsweise in Mengen, die Einheitsdosen von 0,01 bis 10 μg immunologisch aktiver MN-Proteine und/oder -Polypeptid pro Kilogramm des Körpergewichts des Empfängers bereitstellen würden. Die gesamten protektiven Dosen können sich von 0,1 bis ungefähr 100 μg Antigen erstrecken. Verabreichungswege, Antigen-Dosisanzahl und Häufigkeit der Injektionen sind lediglich Optimierungsbelange, die innerhalb des Umfangs des durchschnittlichen Fachwissens auf dem Gebiet liegen.
Die nachfolgenden Beispiele sind lediglich zu Veranschaulichungszwecken enthalten.
Beispiel 1
Immunhistochemische Färbung von Gewebsproben
Um den Gewebsverteilungsbereich und die Expression von MN-Proteinen zu studieren und auszuwerten, wurde der monoklonale Antikörper M75 dazu verwendet, immunhistochemisch eine Vielzahl von humanen Gewebsproben zu färben. Der primäre in diesen immunhistochemischen Färbeexperimenten verwendete Antikörper war der monoklonale M75-Antikörper. Ein biotinylierter zweiter Antikörper und Streptavidinperoxidase wurden dazu verwendet, die M75-Reaktivität in Schnitten von in Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Gewebsproben nachzuweisen. Ein kommerziell erhältlicher Amplifikationskit, insbesondere der DAKO LSAB^TM Kit (DAKO Corp., Carpinteria, CA (USA)), der zueinander passend verwendungsfertiges Blockierungsreagenz, sekundären Antikörper und Streptavidin-Meerrettichperoxidase bereitstellt, wurde in diesen Experimenten verwendet.
Die M75-Immunreaktivität wurde in multiplen Gewebsschnitten von Brust-, Darm-, Zervix-, Lungen- und normalen Geweben getestet. Solche multiplen Gewebsschnitte wurden aus Paraffinblöcken von Geweben ausgeschnitten, die als „Würze" bezeichnet wird, und die von der City of Hope (Duarte, CA (USA)) bezogen wurden. Kombiniert in einem viel-multiplen Gewebsschnitt waren normale, benigne und maligne Proben eines vorgegebenen Gewebes; beispielsweise um einen Kern von Gewebsproben von Brustkrebs aus unterschiedlichen Patienten eine ähnliche Anzahl benigner Brustgewebsproben und normale Brustgewebsproben kombiniert in einem solchen multiplen Brustgewebs-Schnitt. Die normalen multiplen Gewebsschnitte enthielten nur normale Gewebe von verschiedenen Organen, beispielsweise Leber, Milz, Lunge, Nieren, Nebenniere, Gehirn, Prostata, Pankreas, Schilddrüse, Eierstock und Testis.
Ebenfalls nach einer MN-Genexpression gescreent wurden multiple individuelle Proben von Zervixkrebs, Blasenkrebs, Nierenzellkrebs und Kopf- und Nackenkrebs. Solche Proben wurden von U. C. Davis Medical Center in Sacramento, CA, und von Dr. Shu Y. Liao (Department of Pathology; St. Joseph Hospital; Orange, CA (USA)) bezogen.
In diesen Experimenten verwendete Kontrollen waren die Zelllinien CGL3 (H/F-T-Hybridzellen) und CGL1 (H/F-N-Hybridzellen), von denen bekannt ist, dass sie sich jeweils positiv und negativ mit dem M75 monoklonalen Antikörper anfärben. Der monoklonale M75-Antikörper wurde in einer 1:5000-Verdünnung verdünnt, wobei das Verdünnungsmittel entweder PBS (0,05 M Phosphat-gepufferte Salzlösung (0,15 M NaCl), pH 7,2–7,4) oder PBS war, die 1% Protease-freie BSA als Proteinstabilisator enthielt.
Immnunhistochemische Färbevorschrift
Die immunhistochemische Färbevorschrift wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers für den DAKO LSABT^TM Kit befolgt. Kurz gesagt, wurden die Schnitte entwachst, rehybriert und blockiert, um eine unspezifische Reaktivität ebenso wie eine endogene Peroxidase-Aktivität zu entfernen. Jeder Schnitt wurde dann mit Verdünnungen des monoklonalen M75-Antikörpers inkubiert. Nachdem ungebundener M75 durch Spülen des Schnittes entfernt wurde, wurde der Schnitt nacheinander mit biotinyliertem Antimaus-IgG-Antikörper und Streptavidin konjugiert an Meerrettichperoxidase umgesetzt; ein Spülschritt war zwischen diesen beiden Reaktionen und nach der zweiten Reaktion eingeschlossen. Im Anschluss an die letzte Spülung wurde der Antikörper-Enzymkomplex durch Reaktion mit einem unlöslichen Chromogen (Diaminobenzidin) und Wasserstoffperoxid nachgewiesen. Ein positives Ergebnis wurde durch die Bildung eines unlöslichen rötlich-braunen Präzipitats am Ort der primären Antikörperreaktion angezeigt. Die Schnitte wurden dann gespült, mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert und auf ein Deckglas aufgetragen. Darauf wurden die Schnitte unter Verwendung einer Standardlichtmikroskopie überprüft.
Interpretation. Eine Ablagerung eines rötlich-braunen Präzipitats über der Plasmamembran wurde als Beweis genommen, dass der M75-Antikörper an ein MN-Antigen im Gewebe gebunden hatte. Die bekannte positive Kontrolle (CGL3) musste angefärbt sein, um den Assay zu validieren. Die Schnittdicke wurde in Erwägung gezogen, um die Färbeintensitäten zu ver gleichen, weil dickere Schnitte eine größere Färbeintensität unabhängig von anderen Assayparametern erzeugen.
Ergebnisse
Eine vorläufige Überprüfung von Zervixproben zeigte, dass 62 von 68 Plattenepithelzellkarzinomproben (91,2%) mit M75 positiv färbten. Zusätzlich färbten zwei von sechs Adenokarzinome und zwei von zwei adenosquamösen Krebsarten der Zervix ebenfalls positiv. In früheren Studien färbten 55,6% (10 von 18) von Zervikaldysplasien positiv. Insgesamt 9 Proben, die sowohl Zervikaldysplasien als auch -tumoren einschlossen, zeigten eine MN-Expression in normal erscheinenden Arealen des endozervikalen Drüsenepithels, üblicherweise an der Basalschicht. In einigen Proben zeigten Gegenden, die eine Dysplasie und/oder Malignität zeigten, keine MN-Expression, vohingegen mmorphologisch normal aussehende Areale eine Expression des MN-Antigens zeigten.
Eine M75-positive Immunreaktivität war am öftesten an der Plasmamembran von Zellen lokalisiert, wobei die auffälligste Färbung an den Kreuzungen zwischen benachbarten Zellen vorlag. Eine zytoplasmatische Färbung war ebenfalls in einigen Zellen evident; jedoch war die Plasinamembranfärbung in den häufigsten Fällen das Hauptkriterium der Positivität.
M75-positive Zellen neigten dazu, nahe Arealen zu sein, die eine Keratin-Differenzierung in Zervixproben zeigten. In einigen Proben waren die positiv färbenden Zellen im Zentrum von Nestern nicht-färbender Zellen lokalisiert. Oftmals existierte ein nur sehr geringer falls überhaupt offensichtlicher morphologischer Unterschied zwischen den färbenden Zellen und den nicht-färbenden Zellen. In einigen Proben waren die positiv färbenden Zellen mit benachbarten Arealen einer Nekrose assoziiert.
In den meisten der Plattenepithelkarzinome der Zervix war die M75-Immunreaktivität in ihrer Verteilung fokal, d. h. nur bestimmte Areale der Proben färbten. Obwohl die Verteilung einer positiven Reaktivität innerhalb einer gegebenen Probe ziemlich sporadisch war, war die Intensität der Reaktivität üblicherweise sehr stark. In den meisten der Adenokarzinomen der Zervix war das Färbemuster homogen, wobei die Hauptzahl der Proben positiv färbte.
Bei den normalen Gewebsproben wurde eine intensive, positive und spezifische M75-Immunreaktivität nur in normalen Magengeweben beobachtet, mit vermindernder Reaktivität im Dünndarm, dem Appendix und dem Dickdarm. Kein anderes normales Gewebe färbte für M75 extensiv positiv. Gelegentlich jedoch wurden Foki intensiver färbender Zellen in normalen Dünndarmproben (üblicherweise an der Basis der Krypten) beobachtet oder waren manchmal in morphologisch normal erscheinenden Arealen des Epithels oder von Zervikalproben, die eine Dysplasie und/oder Malignität zeigten, ersichtlich. In solchen normal erscheinenden Arealen von Zervixproben waren positive Färbungen in fokalen Gegenden der Basalschicht des ektozervikalen Epithels oder in der Basalschicht des endozervikalen Drüsenepithels zu sehen. In einer normalen Probe der menschlichen Haut wurde eine zytoplasmatische MN-Färbung in der Basalschicht beobachtet. Die Basalschichten dieser Epithelien sind üblicherweise Gegenden einer Proliferation, was nahelegt, dass die MN-Expression in das zelluläre Wachstum involviert sein kann. In einigen zervikalen durch Biopsie gewonnenen Proben wurde eine MN-Positivität in morphologisch normal erscheinendem Schichtzellepithel beobachtet, das manchmal mit Zellen assoziiert ist, die koilozytische Veränderungen durchmachen.
Einige Darmadenome (4 von 11) und Adenokarzinome (9 von 15) waren positiv gefärbt. Eine normale Darmprobe war an der Basis der Krypta positiv. Von 15 Dickdarmkrebsproben waren 4 Adenokarzinome und 5 metastatische Läsionen MN-positiv. Weniger maligne Brustkrebsarten (3 von 25) und Ovarialkrebsproben (3 von 15) waren positiv gefärbt. Von 4 Kopf- und Nackenkrebsarten waren 3 mit M75 sehr intensiv gefärbt.
Obwohl ein normales Magengewebe routinemäßig positiv war, waren 4 Adenokarzinome des Magens MN-negativ. Von 3 Blasenkrebsproben (1 Adenokarzinom, 1 nicht-papilläres transitionelles Zellkarzinom und 1 Plattenepithelzellkarzinom) war nur das Plattenzellkarzinom MN-positiv. Ungefähr 40% (12 von 30) Gewebsproben waren positiv; 2 von 4 undifferenzierten Karzinomen; 3 von 8 Adenokarzinomen; 2 von 8 Haferzellkarzinomen; und 5 von 10 Plattenepithelzellkarzinomen. 100% (4 von 4) der Nierenzellkarzinome waren MN-positiv.
Zusammengefasst wurde gezeigt, dass das MN-Antigen, wie durch M75 und Immunhistochemie in den oben beschriebenen Experimenten nachgewiesen, in Tumorzellen vorlag, am bemerkenswertesten in Geweben von Zevixkrebs. Das MN-Antigen ist ebenfalls in einigen Zellen normaler Gewebe zu finden und manchmal in morphologisch normal erscheinenden Arealen von Proben, die eine Dysplasie und/oder Malignität zeigen. Jedoch wird MN üblicherweise nicht extensiv in den meist normalen Geweben exprimiert, außer für Magengewebe, wo es extensiv exprimiert wird, und in den Geweben des unteren Gastrointestinaltraktes, in denen es weniger extensiv exprimiert wird. Die MN-Expression ist am öftesten an der zellulären Plasmamembran von Tumorzellen lokalisiert und kann eine Rolle in der intrazellulären Kommunikation und der Zelladhäsion spielen. Repräsentative Ergebnisse der Experimente, die wie oben beschrieben durchgeführt wurden, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2 Immunreaktivität von M75 in verschiedenen Geweben
Die in diesem Beispiel aufgezeichneten Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von MN-Proteinen in einer Gewebsprobe von einem Patienten allgemein von dem involvierten Gewebe abhängig ein Marker sein kann, der signalisiert, dass ein prä-neoplastischer oder neoplastischer Prozess auftritt. Somit kann man aus diesen Ergebnissen schließen, dass diagnostische/prognostische Verfahren, die das MN-Antigen nachweisen, besonders zum Screening von Patientenproben für mehrere Krebsarten von Nutzen sein kann, die dadurch in einem prä-neoplastischen Stadium oder in einem frühen Stadium vor einer offensichtlichen morphologischen Veränderung, die mit einer Dysplasie und/oder Malignität verbunden ist, nachgewiesen werden kann, die evident ist oder die auf einer weit verbreiteten Basis evident ist.
Beispiel 2
Vakzine – Rattenmodell
Wie oben in Beispiel 7 von WO 93/18152 dargestellt (internationale Veröffentlichungsdatum: 16. September 1993) wird in einigen Rattentumoren, beispielsweise der XC-Tumorzelllinie (Zellen von einem Rattenrhabdomyosarkom), ein Ratten-MN-Protein, das dem menschlichen MN-Protein verwandt ist, exprimiert. Somit wurde ein Modell geliefert, um die Antitumorimmunität zu studieren, die durch experimentelle MN-basierte Vakzine induziert wird. Die folgenden repräsentativen Experimente wurden durchgeführt.
9 bis 11 Tage alte Wistar-Ratten von mehreren Familien wurden randmisiert, es wurde ihnen intraperitoneal 0,1 ml entweder von Kontrollrattenserum (der C-Gruppe) oder Rattenserum gegen das MN-Fusionsprotein GEX-3X-MN (die IM-Gruppe) injiziert. Simultan wurde beiden Gruppen 10⁶-XC-Tumorzellen injiziert.
Vier Wochen später wurden die Ratten getötet und die Tumore gewogen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Jeder Punkt auf dem Graphen repräsentiert einen Tumor von einer Ratte. Die Differenz zwischen den beiden Truppen – C und IM – war durch Mann-Whitney-Rangsummentest (U = 84, α < 0,025) signifikant. Die Ergebnisse zeigen, dass die IM-Gruppe von Babyratten Tumore ungefähr von der Hälfte der Größe der Kontrollen entwickelte und 5 der 18 passiv immunisierten Ratten überhaupt keinen Tumor entwickelten, im Vergleich zu 1 von 18 Kontrollen.
Beispiel 3
Expression der Volle-Länge-MN-cDNA in NIH-3T3-Zellen
Die Rolle von MN in der Regulation der Zellproliferation wurde durch Exprimieren der Volle-Länge-cDNA in NIH-3T3-Zellen untersucht. Diese Zelllinie wurde ausgewählt, weil sie erfolgreich dazu verwendet wurde, die phänotypische Wirkung einer Anzahl von Proto-Onkogenen zu demonstrieren (Weinberg, R. A., Cancer Res., 49: 3713 (1989); Hunter, T., Cell, 64: 249 (1991)). Ebenfalls exprimieren 3T3-Zellen kein endogenes MN-verwandtes Protein, das durch Mab M75 nachweisbar ist.
Die Volle-Länge-MN-cDNA wurde durch Ligation der beiden cDNA-Klone unter Verwendung der einmal vorkommenden BamHI-Stelle gewonnen und aus pBluescript in KpnI-SacI-Stellen des Expressionsvektors pSGSC subkloniert. pSGSC wurde freundlicherweise von Dr. Richard Kettman (Department of Molecular Biology, Faculty of Agricultural Sciences, B-5030 Gembloux, Belgien) bereitgestellt. pSGSC wurde von pSGS (Stratagene) gewonnen, durch Einfügung eines Polylinkers, der aus einer Sequenz bestand, die mehrere benachbarte Stellen für die folgenden Restriktionsenzyme aufwies: ExoRI, XhoI, KpnI, BamHI, SacI, 3x TAG Stoppkodon und BglII.
Das rekombinante pSGSC-MN-Plasmid wurde in einem 10:1-Verhältnis (10 μg:1 μg) mit dem pSV2-Neoplasmid (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982)) co-transfiziert, das das Neo-Gen als Selektionsmarker enthält. Die Co-Transfektion wurde durch Kalziumphosphat-Präzipitationsmethode (Mammalian Transfection Kit; Stratagene) in NIH-3T3-Zellen durchgeführt, die einen Tag vorher in einer Dichte von 1 × 10⁵ pro 60 mm Schale ausplattiert wurden. Als Kontrolle wurden pSV2neo mit deren pSGSC co-transfiziert.
Die transfizierten Zellen wurden DMEM-Medium kultiviert, das mit 10% FCS und 600 μg ml^–1 G418 (Gibco BRL) für 14 Tage kultiviert wurden. Die G418-resistenten Zellen wurden nach Klonen selektiert, expandiert und bezüglich einer Expression der transfizierten cDNA durch Western Blotting unter Verwendung eines jodierten Mab M75 analysiert.
Für eine Einschätzung der Zellproliferation wurden die klonalen Zelllinien dreifach (2 × 10⁴ Zellen/Well) in 24-Well-Platten ausplattiert und in DMEM mit 10% FCS und 1% FCS je weils kultiviert. Das Medium wurde jeden Tag ausgetauscht und die Zellzahl wurde unter Verwendung eines Hämatozytometers gezählt.
Um die DNA-Synthese zu bestimmen, wurden die Zellen dreifach in 96-Well-Platten bei einer Dichte von 10⁴/Well in DMEM mit 10% FCS ausplattiert und es wurde ermöglicht, dass diese sich über Nacht anheften. Danach wurden die Zellen mit ³H-Thymidin für 24 Stunden markiert und die eingebaute Radioaktivität wurde gezählt.
Für den Verankerungs-unabhängigen Wachstumsassay wurden Zellen (2 × 10⁴) in 0,3% Agar in DMEM, der 10% FCS enthielt, suspendiert und auf 0,5% Agar-Medium in 60-mmm-Schalen überschichtet. Kolonien, die in weichem Agar bzw. Softagar gezüchtet wurden, wurden zwei Wochen nach dem Ausplattieren gezählt.
Mehrere klonale Zelllinien, die sowohl die 54- als auch 58-kD-Formen des MN-Proteins in Konzentrationen exprimieren, die mit solchen vergleichbar sind, die in LCMV-infizierten HeLa-Zellen zu finden sind, wurden gewonnen. Selektierte MN-positive Klone und negative Kontrollzellen (scheintransfiziert mit einem leeren pSGSC-Plasmid) wurden weiteren Analysen unterworfen, die die Charakterisierung ihres Phänotyps und ihres Wachstumsverhaltens zum Inhalt hatten.
Die MN-exprimierenden NIH-3T3-Zellen zeigten eine spindelförmige Morphologie und eine erhöhte Refraktilität; sie waren weniger an den festen Träger anhaftend und in ihrer Größe kleiner. Die Kontrolle (scheintransfizierte Zellen) wiesen eine flache Morphologie auf, die der der parentalen NIH-3T3-Zellen ähnlich war. Im Gegensatz zu den Kontrollzellen, die ausgerichtet wurden und mit einem geordneten Muster einen Monolayer bildeten, verloren die Zellen, die MN exprimierten, die Fähigkeit für einen Wachstumsstopp und wuchsen chaotisch aufeinander. Entsprechend waren die MN-exprimierenden Zellen dazu in der Lage, eine signifikant höhere (mehr als zweimal) Sättigungsdichte (Tabelle 3) zu erreichen, und waren weniger von Wachstumsfaktoren als die Kontrollzellen abhängig.
MN-Transfektanten zeigten ebenfalls raschere Verdopplungszeiten (um 15%) und eine gesteigerte DNA-Synthese (um 10%), wie es durch die Menge an [³H]-Thymidin bestimmt wurde, die im Vergleich zu Kontrollzellen eingebaut war. Zuletzt wuchsen NIH-3T3-Zellen, die MN-Protein exprimieren, auf Softagar. Der Durchmesser der Kolonien, die für 14 Tage gezüchtet wurden, bewegte sich von 0,1 bis 0,5 mm; jedoch war die Klonierungseffizienz der MN-Transfektanten ziemlich gering (2.4%). Obwohl dieser Parameter der NIH-3T3-Zellen weniger durch MN beeinträchtigt zu sein scheint als durch konventionelle Onkogene, sind alle anderen Daten mit der Idee konsistent, dass MN eine Rolle in der Zellwachstumskontrolle spielt. Tabelle 3 Wachstumseigenschaften von NIH-3T3-Zellen, die MN-Protein exprimieren

^aZur Berechnung der Verdopplungszeit wurde die Proliferationsrate expotentiell wachsender Zellen verwendet.
^bDie Sättigungszelldichte wurde aus der Zellanzahl 4 Tage, nachdem eine Konfluenz erreicht wurde, abgeleitet.
^cKolonien von mehr als 0,1 mm Durchmesser wurden am Tag 14 gescored. Die Klonierungseffizienz wurde als Prozentsatz von Kolonien pro Anzahl Zellen, die ausplattiert wurden, geschätzt, mit einer Korrektur bezüglich der Zelllebensfähigkeit.

Beispiel 4
Beschleunigung des G1-Übergangs und Abnahme der Mitomycin-C-Empfindlichkeit, die durch MN-Protein verursacht wurde
Für die in diesem Beispiel beschriebenen Experimente wurden die stabilen MN-Transfektanten von NIH-3T3-Zellen, die wie in Beispiel 3 beschrieben wurden, verwendet. Vier ausgewählte MN-positive Klone und vier Kontroll-scheintransfizierte Klone wurden entweder individuell oder in Pools verwendet.
Durchflusszytometrische Analysen von asynchronen Zellpopulationen. Zellen, die in dichten Kulturen gezüchtet wurden, wurden zu 1 × 10⁶ Zellen pro 60 mm Schale ausplattiert. Vier Tage später wurden die Zellen durch Trypsinisierung gesammelt, gewaschen, in PBS resuspendiert, durch tropfenweisen Zusatz von 70% Ethanol fixiert und durch Propidium-Jodlösung, die RNase enthielt, angefärbt. Eine Analyse wurde durch FACStar unter Verwendung der DNA-Zellzyklus-Analysesoftware (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ (USA)) durchgeführt.
Exponentiell wachsende Zellen wurden zu 5 × 10⁵ Zellen pro 60 mm Schale ausplattiert und wie oben zwei Tage später untersucht. Ein Vorwärtslicht-Streuung wurde zur Untersuchung der relativen Zellgrößen verwendet. Die Daten wurden unter Verwendung des Kolmogorov-Smirnov-Tests (Young, J. Histochem. Cytochem. 25: 935 (1977)) ausgewertet.
Die durchflusszytometrischen Analysen zeigten, dass klonale Populationen, die das MN-Protein konstitutiv exprimieren, einen gesenkten Prozentsatz an Zellen in der G1-Phase und einen erhöhten Prozentsatz von Zellen in G2-M-Phasen zeigten. Diese Unterschiede waren in Zellpopulationen auffälliger, die durch drei Passagen in hoch dichten Kulturen gewachsen waren, als in exponentiell wachsenden subkonfluenten Zellen. Diese Beobachtung unterstützt die Idee, dass das MN-Protein die Kapazität aufweist, die Kontakthemmung durcheinanderzubringen.
Ebenfalls beobachtet wurde eine Abnahme der Größe von MN-exprimierenden Zellen, die sowohl in exponentiell proliferierenden als auch hoch dichten Kulturen ersichtlich war. Es ist möglich, dass die MN-vermittelte Beschleunigung des G1-Überganges mit der oben erwähnten kürzeren Verdopplungszeit (um ungefähr 15%) von exponentiell proliferierenden MN-exprimierenden NIH-3T3-Zellen in Beziehung steht. Ebenfalls zeigten MN-exprimierende Zellen eine im Wesentlichen höhere Sättigungsdichte und niedrigere Serumerfordernisse als die Kontrollzellen. Diese Tatsachen legen nahe, dass MN-transfizierte Zellen die Fähigkeit aufwiesen, weiterhin zu proliferieren, trotz Raumbeschränkungen und verminderter Konzentrationen an Serumwachstumsfaktoren, wohingegen die Kontrollzellen in der G1-Phase angehalten wurden.
Limitierende Bedingungen. Die Proliferation von MN-exprimierenten und Kontrollzellen wurde sowohl in optimalen als auch limitierenden Bedingungen untersucht. Die Zellen wurden zu 2 × 10⁴ pro Well einer 24-Well-Platte in DMEM mit 10% FCS ausplattiert. Das Medium wurde in täglichen Intervallen bis zum Tag 4 verändert, wenn die Konfluenz erreicht war, und das Medium wurde nicht mehr länger erneuert. Lebensfähige Zellen wurden im Hämozytometer zu geeigneten Zeitpunkten unter Verwendung von Trypan-Blau-Farbstoffausschluss gezählt. Die Zahl der Zellen wurde gegen die Zeit geplottet, wobei jeder Plot-Punkt einen Durchschnittswert von dreifachen Bestimmungen repräsentiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Proliferation von MN-exprimierenden und Kontrollzellen während der ersten Phase ähnlich war, wenn das Medium täglich erneuert wurde, dass jedoch ein großer Unterschied in der Zahl lebensfähiger Zellen auftrat, nachdem das Medium nicht mehr erneuert wurde. Mehr als die Hälfte der Kontrollzellen war nicht dazu in der Lage, den nachteilhaften Wachstumsbedingungen zu widerstehen. Im Gegensatz hierzu fuhren MN-exprimierende Zellen zu proliferieren fort, sogar wenn sie einer zunehmenden Konkurrenz um Nährstoffe und Serumwachstumsfaktoren ausgesetzt waren.
Diese Ergebnisse wurden ebenfalls durch durchflusszytometrische Analyse von an Serum armen Zellen unterstützt, die für zwei Tage in einem Medium gezüchtet wurden, das 1% FCS enthielt. Während 83% der Kontrollzellen in der G0-G1-Phase akkumulierten (S = 5%, G2-M = 12%), kehrte die Expression des MN-Proteins teilweise die Verzögerung in G1 um, wie es durch die Zellzyklusverteilung von MN-Transfektanten (G0-G1 = 65%, S = 10%, G2-M = 26%) angezeigt wurde. Die Ergebnisse der oben beschriebenen Experimente legen nahe, dass das MN-Protein zur Freisetzung des G1-2-Checkpoints dienen könnte und es Zellen ermöglicht, unter nachteilhaften Bedingungen zu proliferieren.
MMC. Um diese Annahme zu testen, wurden nachteilhafte Bedingungen durch Behandlung von Zellen mit dem DNA-schädigenden Arzneistoff Mitomycin C (MMC) simuliert und danach im Anschluss an ihre Proliferation und Lebensfähigkeit. Der Mechanismus der Wirkung von MMC ergibt sich angenommenennaßen aus seiner intrazellulären Aktivierung und anschließenden DNA-Alkylierung und -Vernetzung (Yier und Szybalski, Science, 145: 55 (1964)). Normalerweise reagieren Zellen auf eine DNA-Schädigung durch einen Stopp ihres Zellzyklus, um die Defekte zu reparieren und vermeiden eine Akquisition einer genomischen Instabilität. Eine große Schädigung wird durch eine markante Zytotoxizität begleitet. Jedoch betreffen viele Studien (beispielsweise Peters et al., Int. J. Cancer, 54: 450 (1993)) das Auftreten von Arzneistoff-resistenten Zellen sowohl in Tumorzellpopulationen als auch nach der Einbringung von Onkogenen in nicht-transformierte Zelllinien.
Die Reaktion von MN-transfizierten NIH-3T3-Zellen gegenüber zunehmenden Konzentrationen an MMC wurde durch kontinuierliche [³H]-Thymidin-Markierung bestimmnt. Die Zellen wurden in 96-Well-Mikrotiterplattenkonzentrationen von 10⁴ pro Well ausplattiert und über Nacht in DMEM mit 10% FCS inkubiert, um sich anzuheften. Danach wurde das Wachstumsmedium durch 100 μl Medium ersetzt, das zunehmende Konzentrationen an MMC aus 1 μl/ml bis 32 μg/ml enthielt. Alle Arzneistoffkonzentrationen wurden in 3 kopierten Wells getestet. Nach 5 Stunden Behandlung wurde das MMC entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und frisches Wachstumsmedium ohne Arzneistoff wurde zugesetzt. Nach Über-Nacht-Wiedergewinnung wurden die Fraktionen der Zellen, die aktiv an der Proliferation teilnahmen, durch kontinuierliche 24-stündige Markierung mit [³H]-Thymidin bestimmt. Der Einbau durch die behandelten Zellen wurde mit demjenigen der Kontrollen, unbehandelten Zellen, verglichen, und die proliferierenden Fraktionen wurden als Prozentsatz des Einbaus der Kontrollen angesehen.
Die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen wurde 3 Tage später durch den Zelltiter 96 AQ nicht-radioaktiven Zellproliferationsassay (Promega) geschätzt, der auf der Bioreduktion von Methotrexat (MTX) zu einem wasserlöslichen Formazan basiert, das Licht bei 490 nm absorbiert. Der Prozentsatz überlebender Zellen wird aus den Werten der Extinktion abgeleitet, die nach der Subtraktion des Hintergrundes bzw. Störpegels gewonnen werden.
Die Kontroll- und MN-exprimierenden NIH-3T3-Zellen zeigten bemerkenswerte Unterschiede in ihrer Reaktion gegenüber MMC. Die Empfindlichkeit der MN-transfizierten Zellen schien beträchtlich niedriger als der Kontrollen in beiden Abschnitten der oben beschriebenen Experimente. Die Ergebnisse legen nahe, dass die MN-transfizierten Zellen dazu in der Lage waren, das negative Wachstumssignal, das durch MMC vermittelt wurde, aufzuheben.
ATCC-Hinterlegungen. Das unten aufgelistete Material wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-220 (USA) hinterlegt. Die Hinterlegungen wurden unter den Vorschriften des Budapester Vertrages bezüglich der internationalen Anerkennung hinterlegter Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den entsprechenden Vorschriften (Budapester Vertrag) vorgenommen. Die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur wird für 30 Jahre vom Tag der Hinterlegung ab sichergestellt. Die Hybridomas und Plasmide werden durch die ATCC unter den Vorschriften des Budapester Vertrages zugänglich gemacht werden und sind Gegenstand einer Überein kunft zwischen den Anmeldern und der ATCC, die eine uneingeschränkte Verfügbarkeit der hinterlegten Hybridoma und Plasmide für die Öffentlichkeit nach Erteilung eines Patentes aus der vorliegenden Anmeldung sicherstellt. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stammes soll nicht als Lizenz bzw. Erlaubnis zur Ausübung der Erfindung zum Verstoß gegen die Rechte angesehen werden, die durch die Autorität irgendeiner Regierung gemäß ihrer Patentgesetze garantiert werden.
Sequenzprotokoll

Claims

Isolierte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens 16 Nukleotide enthält und eine Nukleotisequenz aufweist, ausgewählt aus: a) der MN Promotornukleotidsequenz gemäß der beiliegenden 6, und Nukleotidsequenzen, die zur MN Promotornukleotidsequenz komplementär sind; und b) Nukleotidsequenzen, die zu wenigstens 80% mit den Nukleotidsequenzen von a) und den Komplementären dieser Nukleotidsequenzen homolog sind; wobei die isolierte Nukleotinsäure eine Promotoraktivität besitzt und/oder als Primer für eine Polymerasekettenreaktion zur Identifizierung des MN Promotors dient.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenzen von b) zu mindestens 90% homolog sind zu den Nukleotidsequenzen von a).
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt wird aus: a) der MN Promotorsequenz gemäß der beiliegenden Sequenz 6 und der hierzu komplementären Nukleotidsequenz; und b) Nukleotidsequenzen, die zu mindestens 80% zu den Nukleotidsequenzen von a) homolog sind.
Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei sie eine Länge von 16 bis 50 Nukleotiden, bevorzugt eine Länge von 19 bis 45 Nukleotiden, besitzt, und als Primer für eine Polymerasekettenreaktion für MN Nukleinsäuresequenzen dient.
Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei sie eine Länge von mindestens 27 Nukleotiden besitzt oder eine Länge von mindestens 29 Nukleotiden, oder eine Länge von 50 Nukleotiden, oder eine Länge von mindestens 100 Nukleotiden, oder eine Länge von mindestens 150 Nukleotiden.
Verfahren zum Nachweis von Mutationen in einem MN Promotor, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: Amplifizieren eines Fragments des MN-Promotors durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines Primers einer isolierten Nukleinsäure nach Anspruch 4; und Bestimmen, ob das Fragment ein oder mehrere Mutationen enthält.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.