JP2001522222A - 線虫のｕｎｃ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログおよび該ホモログまたはその機能的等価物をコードする核酸配列を同定する。適当なベクター中の核酸配列を使用して、脊椎動物ホモログまたは該脊椎動物ホモログが構成要素であるシグナル伝達経路に関与する別のタンパク質のインヒビターまたはエンハンサーを同定するのに有用な細胞、組織または生物をトランスフェクションまたは形質転換する。同定されたインヒビターまたはエンハンサーのいずれかが医薬組成物または神経疾患、急性外傷性傷害などの病状を治療するための医薬の調製に含有されることができ、かつ神経再生を促進し、転移または接触阻害の喪失を抑制する。

Description

【発明の詳細な説明】 線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ 本発明は、線虫（C.elegans）のＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログおよび該ホ モログをコードするｃＤＮＡ配列またはその機能的同等物に関する。本発明はま た細胞作用を調節する化合物を同定するプロセス、同定された化合物および該遺 伝子またはタンパク質を機能不全にする病態を同定するためのプロセスおよびア ッセイに加えてそれらを含む医薬組成物に関する。 細胞運動性、細胞の形状および軸索の細胞成長またはタンパク質の細胞成長の 指向性の調節は、単細胞生物および多細胞生物の両方の形態形成および機能にお ける必須の特徴である。これらのプロセスの調節は、例えば、チロシンキナーゼ 受容体（ＲＴＫ）シグナル伝達経路など、またはその下流にある細胞内経路（Ｎ −ＣＡＭＳおよびインテグリンなどの細胞接着分子を含む他の細胞外受容体と共 有している）が過剰刺激される多様な疾患状態に妨害される。 細胞移動の指向性および潜在性をコントロールする細胞外分子細胞表面タンパ ク質および細胞該分子のうちのいくつかが同定されるが、関与するプロセスは一 般的には理解されていない。 一般に、細胞突起の長期にわたる移動（また成長円錐の伸長としても知られる ）は段階を追った事象であり、それによって各伸長の前後で、好ましい方向で伸 長する細胞突起を安定させるか、または所定の方向で突起を伸展するラメリポジ ウムを引き起こすことを細胞に教える環境中でシグナルを感知する細胞の移動す る側の端の構造物の形成が起こる。アクチン細胞骨格の局在化した安定および微 小管のプラス端領域との結合は、方向的な伸展の選択に従う一般的な細胞生物学 的なプロセスである。これらのプロセスを目指して結合する微小管は以前には同 定されていなかった。本発明者らは驚くべきことに線虫のＵＮＣ-５３タンパク 質およびその脊椎動物ホモログが微小管の結合、特に微小管のプラス端との結合 に関与することを見出した。 「ｕｎｃ-５３」と称される自由生活の線虫（Caenorhabditis elegans）から の遺伝子は、以前に同定されクローニングされていた（要約、国際線虫会議、１ ９９１年６月１−５日、マジソン、ウィスコンシン、５８、ボガエルト（Bogaer t）およびゴー（Goh））。本発明者らは細胞移動の指向性を調節するおよび／ま たは線虫の細胞の形状を調節するシグナルトランスデューサーまたはシグナルイ ンテグレーターとしてＵＮＣ−５３を同定した（ＷＯ ９６／３８５５５）。Ｕ ＮＣ−５３タンパク質活性の増加が、細胞の移動の正しい向きでの細胞突起の伸 展に比例することが見出された。ｕｎｃ−５３遺伝子は、例えばアダプタータン パク質であるＳＥＭ-５/ＧＢＲ-２を介してのように、ＲＴＫからのシグナルを 高用量−依存形式において、指向性成長円錐伸展または安定化をコントロールす る機構に伝達するシグナル伝達分子をコードする。 線虫ＵＮＣ−５３変異体の遺伝的および実験的分析は、ｕｎｃ−５３遺伝子中 の変異体が移動する細胞の一般的能力を影響しないが、むしろ前後の特異的な信 号のもとで移動する細胞の能力に影響を及ぼすのである。ＵＮＣ−５３活性の減 少により、ＵＮＣ−５３変異体での排泄腔で観察されたランダムの伸長の周期の 指向性によって指示されるように、成長円錐伸長の方向の喪失および成長円錐伸 長の減少となる。 ＵＮＣ−５３の機能はその用量または活性に非常に敏感である。機能減退は、 筋肉細胞中のＵＮＣ−５３のトランスジェニック発現を用いて発現の増加が、増 加した方向の移動へと導かれるのに対して特異的シグナルに対して比例して減少 する。データは、正しい方向での成長円錐の伸長となるシグナル受領によって生 体内の機能的指向性シグナルのインテグレーターとして、ＵＮＣ−５３が機能す るという結論へと導かれる。 ＵＮＣ−５３のある遺伝子対は、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達経路で のＳＥＭ−５線虫変異体の性筋芽細胞の移動の欠陥を増強する（スターン（Ster n）ら、１９９３、mol．Biol．cell、４、１１７５−１１８８）。遺伝学による と、ＵＮＣ-５３およびＳＥＭ-５は性筋移動を調節するために協調するが、遺伝 学的実験はこれが直接分子相互作用の結果であるとは認めていない。本発明者ら は、以前にsem-５/ＧＲＢ-２結合部位になりうるものを同定し、２タイプの生化 学的実験でＵＮＣ-５３が物理的にＳＥＭ-５と相互作用することを示した。 本発明者らは、ＵＮＣ-５３は、アタプタータンパク質ＳＥＮ-５/ＧＲＢ-２を介 して方向移動のための細胞外シグナルを成長円錐の方向上の伸長または安定化を 調節する機構へと伝達するシグナル伝達分子をコードすると結論付けている。 証拠のうちのいくつかはＵＮＣ-５３が細胞外シグナルとアクチン細胞骨格を 結合させるアダプターとして作用するであろうことを示している。最初に、ＵＮ Ｃ-５３は皮質アクチン結合タンパク質にホモロジーを示し、イン・ビトロでＦ- アクチンと結合することができることを示した。さらに、哺乳類細胞におけるＵ ＮＣ-５３の発現はＦ-アクチン細胞骨格における変化へと導かれる。ＵＮＣ-５ ３の非常に低い発現レベルはフィロポディアの数および細胞表面から突き出てい るアクチン微小突起の数を増加させる。ＵＮＣ-５３を発現する細胞はまた、増 加した神経突起の伸長および細胞運動性を示した。従って、ＵＮＣ-５３はまた 移動のアクチベーターとして機能する。 すべての利用可能なデータを考慮する際に、以下のＵＮＣ-５３の実施可能な 作用機構を処理することができる。 指向性成長円錐伸長の選択および活性化は、局在化したシグナルまたは指向性 シグナルを読み取る受容体（例えはチロシンキナーゼシグナル）に、ＳＥＭ-５/ ＧＲＢ２複合体を介してＵＮＣ-５３の局所的活性によって説明することができ る。成長円錐の支配における変化は、最も強いシグナルを受ける成長円錐の領域 に局在するアクチン斑点の形成によって先行する（ベントレイ（Bentley）およ びオコノーア（O'Connor）ら、Curr．Op．Neuro Biol．１９９４、第４巻、４３ −４８）。ＵＮＣ-５３は、剃れ自身のアクチン結合または架橋特性によってこ れらのアクチン斑点の形成に直接関与するであろう。別法として活性化されたＵ ＮＣ-５３は、（例えばそのヌクレオチド結合ドメインなど）いまだ同定されて いないエフェクターにシグナルをトランスデュースするであろう。例えば、小Ｇ ＴＰ-結合タンパク質ｃｄｃ４２または関連タンパク質の活性化は小アクチン斑 点の形成ならびに小フィロポディアの形成へと導く。ｕｎｃ-５３経路はｃｄｃ ４２または下流経路を共有するであろうシグナルトランスデューサーの両方の上 流にあるだろう。 従って、本発明者らは類似のタンパク質が例えば脊椎動物などの高等生物にお いて存在する場合に調査をしようと決断した。 本発明者らは、ＵＮＣ-５３に大量の構造ホモロジーを持つ脊椎動物、特にヒ トおよびマウスにおける遺伝子ファミリーの同定を記載した。本発明者らは、驚 くべきことに、線虫からのＵＮＣ-５３のヌクレオチドドメインと脊椎物からの ＵＮＣ-５３が、同様に運動性を活性化し、機能的等価性を確立することを見出 した。さらに、これらのドメインはイン・ビトロでＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換 することができることを示している。発明者らはまた、細胞分化、形態形成およ び疾患におけるＵＮＣ-５３の役割を示唆する正常ヒト組織に比較して形質転換 した細胞株におけるＲＮＡ転写物における変化をも見出した。さらに、イン・ビ トロアッセイおよびトランスジェニックモデルはまた、ＵＮＣ-５３活性の薬理 学的モジュレーターを同定し、ＵＮＣ-５３と相互作用するタンパク質を同定す るためのアッセイを記載している。 本発明の第１の態様により、線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物タンパ ク質ホモログまたはその機能的等価物、その誘導体または生物学的前駆体を提供 し、そのタンパク質ホモログは、図２に例示するように線虫のＵＮＣ-５３タン パク質に統計学的に有意なホモロジーを持つアミノ酸配列を含む。従って、本発 明で、誘導体とは変異体誘導体、誘導、内部欠失、スプライシング変異体および ムテインを意味するととるべきである。 本発明の第２側面では、線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物タンパク質 ホモログを、図９aに例示するように配列ホモロジーブロック（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ またはＥ）の１またはそれ以上のものを持つか、または図１２aにおけるＦブロ ックを含み、または統計学的に有意なホモロジーを持つ配列である。 好ましくは、該脊椎動物ホモログがヒトタンパク質またはマウスタンパク質で ある。 本発明のさらに別の側面により、線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物タ ンパク質ホモログを提供し、そのタンパク質は保存アミノ酸変化においてのみ有 意に広がる図９aから図１２aのブロックとは異なる、１またはそれ以上のＡ、Ｂ 、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ配列を持つアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる側面に おいてさえ、図９ｂにおいて示すように第１位から６０１３位のヌクレオチド配 列 によってコードされるアミノ酸配列を持つ脊椎動物タンパク質を提供する。図１ １ｄにおいて例示するヌクレオチド配列によってコードするアミノ酸配列を持つ 脊椎動物タンパク質またはそのホモログの生物学的前駆体を提供する。 本発明のさらなる側面により、図２８に例示したようなプロサイト（prosite ）特徴に応答するアミノ酸配列を持つ脊椎動物タンパク質を上記ホモロジーブロ ックの各々のために提供する。有利なことにプロサイト特徴は線虫のＵＮＣ-５ ３タンパク質に統計学的に有意なホモロジーを有するタンパク質を同定するため に使用することができる（ルーシー（Luethy）ら、１９９４、Protein Science ，３，１３９−１４６）。 本発明のさらなる側面には図９ｂまたは図１１ｄに示すようなアミノ酸配列ま たは１またはそれ以上の保存アミノ酸変化においてのみ有意に広がるこれらの図 面に支援されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む本発明により脊椎動物 ホモログを含む。 本発明のさらに別の側面において、核酸分子を提供し、好ましくはＤＮＡであ り、線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機能的等価誘 導体、断片または本発明による該ホモログの生物前駆体を提供する。好ましくは 該ＤＮＡはｃＤＮＡであり、該ｃＤＮＡは図９ｂに示される配列の第１〜６０１ ３位を少なくとも含む。別法として、該ｃＤＮＡは図１１ｄに例示される配列を 含むかもしれない。また本発明により、当業者には良く知られた条件である厳し いストリンジェンシー条件のもとで核酸またはＤＮＡ配列にハイブリダイズする ことができる核酸配列も本発明により提供される。 該発明によるｃＤＮＡは宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションする ために使用される発現ベクターに含まれ、例えば動物または植物細胞、細菌細胞 または昆虫細胞などの細菌または真核生物細胞に源があろう。したがって、有利 なことに、一度線虫のＵＮＣ-５３の脊椎動物ホモログのゲノムに対応するｃＤ ＮＡが、例えば逆転写酵素など、細胞の範囲、組織または器官は適当な発現ベク ターに選択したｃＤＮＡクローンの以下の取り込みでトランスフェクションする であろう。本発明の発現ベクターには、線虫またはヒト、マウスのうちの１種類 、またはウイルス起源、およびときに例えば緑色蛍光タンパク質などの受容体分 子 をコードする配列である。 本発明は、それゆえ、さらに線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモロ グ、またはそのホモログの機能的等価物、断片、誘導体または生物学的前駆体、 トランスジェニック細胞、組織または器官を含む。本明細書で使用する「線虫の ＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログを発現することができるトランスジ ーン」なる語句は、同じ機能および／または活性を有する線虫のＵＮＣ-５３タ ンパク質の脊椎動物ホモログの発現へと導かれる適当な核酸配列を意味する。該 トランシジーンは例えば、適当な脊椎動物から単離されるゲノム核酸またはｃＤ ＮＡを含む合成核酸を含んでいてよい。「トランスジェニック生物体、組織また は細胞」なる語句は、ゲノムまたは染色体外状態に安定して統合される外在核酸 を含む器官、組織または細胞の一部を含んで意味する。 好ましくは、トランスジェニック細胞はＣＯＳ細胞、HepＧ２細胞、ＭＣＦ-７ またはＮ４神経芽細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞または結腸直腸または癌腫細胞ま えたは繊維芽細胞などのようなヒト由来細胞をのいずれか１つを含む。トランス ジェニック生物体は、昆虫、ヒト以外の動物または植物および好ましくは線虫ま たは関連線虫類かもしれない。好ましくは、トランスジーンは脊椎動物ホモログ をコードする核酸配列を含むかまたは上記の発明により該遺伝子の機能的な断片 を含む。トランスジーンは好ましくは本発明による発現ベクターを含む。 本明細書で使用する「機能的断片」なる語は線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の 脊椎動物ホモログまたは機能的な等価物または誘導体または該タンパク質の生物 学的前駆体をコードする遺伝子の断片を意味するととるべきである。 さらに本発明によりヒトではない脊椎動物変異体生物体またはＵＮＣ-５３タ ンパク質の脊椎動物ホモログをコードする野生型遺伝子における変異体を有する 細胞を製造する方法であり、変異体は細胞作用または細胞運動性の調節または細 胞移動の形態または方向または微小管プラス端変異性またはそこに局在するタン パク質複合体の機能および局在性に影響を及ぼし、その方法には該生物体または 細胞のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログ中で誘発された変異体を含む 。これらの変異体生物体または細胞はこれらの細胞機能へ化合物の影響を同定す るようにスクリーニングするのに使用されるかもしれない。線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはｃＤＮＡまたはそれ をコードするゲノムＤＮＡまたはその機能的等価物、誘導体、該ホモログの断片 または生物学的前駆体は薬物として有利に利用されることでき、また障害の治癒 または神経再生を促進する薬剤の調製に使用することができ、慢性の神経変性障 害の治療または急性外傷性傷害または細胞または上皮の極性を必要とする生理学 的事象に使用されてよい。本発明者らはまたＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物 ホモログが細胞の形質転換した状態での役割を担っていることを見出した。した がって、脊椎動物ホモログ、その優性陽性または陰性の変異体またはそのインヒ ビターは細胞中の接触阻害を軽減するために有利に使用されるかもしれない。典 型的には、上記の健康状態は哺乳類動物において治療され、一層好ましくはＵＮ Ｃ−５３タンパク質またはその代わりにそのようなタンパク質をコードする核酸 のいずれかによって好ましくはヒトにおいて治療される。別法として、該ＵＮＣ −５３ホモログに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その発現を妨害す るように使用されることができる。使用されるであろう他の核酸配列の例に、ｍ ＲＮＡの３'未翻訳領域を含み、ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログを コードする。 ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機能的等価物、断片ま たは生物学的前駆体は、適当な担体、希釈剤または賦形剤とともに製薬学的に許 容し得る担体に組み入れることができる。医薬組成物は有利に、さらにまたはそ の代わりに、上記に定義した本発明による核酸配列を含むであろう。 本発明はまたある化合物が細胞作用、増殖、形質転換、細胞形状または細胞運 動性、細胞移動の方向、または微小管プラス端の調節のインヒビターまたはエン ハンサーであるか否かを決定する方法を提供する。好ましくは、該方法は該化合 物が該トランスジェニック細胞のその経路はＵＮＣ−５３タンパク質のホモログ 、または機能的等価物、誘導体、脊椎動物ホモログの断片または生物前駆体は、 インビターまたは同様のエンハンサーまたは該細胞中の剰余シグナル伝達である か否かであるシグナル伝達経路のインヒビターまたはエンハンサーを含むか否か を決定することができる。。本発明はまた、該シグナル伝達におけるタンパク質 が線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは機能的等価物、断片 ま たは該脊椎動物ホモログの生物前駆体であることを決定する方法を提供する。 好ましくは、スクリーニングすべき表現型の変化には、細胞の形状における変 化または細胞運動性における変化を含む。本発明の方法の１態様によりトランス ジェニック細胞が使用される場合、Ｎ４神経芽細胞腫細胞は使用されるかもしれ ず、そのような態様において、スクリーニングされるべき表現型は、フィロポデ ィアの増殖または波うち膜による運動における変化または細胞接着、または微小 管細胞骨格におけるいずれかの変化、または微小管のプラス端領域上のタンパク 質の局在における任意の変化またはアポトーシスなどの細胞死におけるいずかの 変化などの別の変化でありえる。本発明の本方法の別の態様において、トランス ジェニック細胞はＭＣＦ−７乳癌細胞を含むかもしれない。そのような態様中の 典型としては、スクリーニングすべき表現型の変化には、ファゴキネシス（phag okinesis）またはフィロポディアの形成の程度を含む。本発明の本側面の別の態 様において、トランスジェニック細胞はＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むかもしれない。 そのような態様において典型である病巣の形成の接触阻害の喪失を含む。本発明 による方法はまた、上記の本発明による変異細胞または変異生物体を利用するこ とができるかもしれず、そこでは変異細胞は、組織培養またはイン・ビボで増殖 することができるか、または野生型ｕｎｃ−５３遺伝子における変異を生体内に 保有する。 本発明において、「表現型の変化」は上記にて定義した細胞、組織、成体内周 期中の任意の適当な時点での変化から得られる任意の表現型であり得、その変化 は例えば、増殖、生存能力、形態、行動、動作、細胞移動または細胞プロセスま たは細胞の成長円錐の伸展および生体形状、移動動作、走化性、接触阻害、生殖 行動などのトランスジーンの発現に帰するであろう。表現型の変化は、好ましく はＦ−アクチン細胞骨格微小管ネットワークおよび微小管のプラス端安定性また はその上のタンパク質または外来性または遺伝子導入的に導入した組織化学マー カーまたはタンパク質のリポーター遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼまたは 緑色蛍光タンパク質などを含む生存性のインジケーターを測定するなどによって 、直接的に述べられるであろう。 上記本発明による方法によって同定可能な化合物、細胞形状または運動性また は細胞移動の方向の調節などの上記で同定したプロセスのエンハンサーは、薬物 として使用することができ、または別法として薬物の調製において使用すること ができ、神経再生の促進、血管再生または傷害治癒、または慢性神経変性疾患ま たは急性外傷性傷害、または繊維症の治療に使用できるかもしれない。神経再生 を促進する例には、例えば、外傷および脊髄外傷後の末梢神経再生が含まれる。 ある化合物が、細胞形状などの調節の阻害であるような上記の方法により、薬 物として使用される化合物または実質的に軽減する細胞を含む疾患の広がりなど の細胞を含む実質的な疾患のため、例えば癌の広がりなど、接触阻害の喪失を軽 減する。有利なことに、上記の方法によりインヒビターまたはエンヘンサーとし て同定されるであろういずれかの化合物はまた、それぞれの化合物および製薬学 的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を含む。 細胞運動性形状、細胞増殖または細胞移動の方向、微小管結合またはそのプラ ス端領域のインヒビターまたはエンハンサーとして同定される化合物の作用の特 定のメカニズムは制限されるものではない。好ましくは、その化合物はシグナル 伝達経路のインヒビターまたはエンハンサーとして作用する。該化合物は類似の 経路にも、または線虫のＵＮＣ−５３脊椎動物ホモログにも直接的に作用するか もしれない。例えば、該化合物の作用の方法は、ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎 動物ホモログとの直接相互作用、ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログのリン酸化ま たは脱リン酸化を調節するためのプロセスとの相互作用またはｕｎｃ−５３遺伝 子の活性を調節するプロセスまたは転写後または翻訳後の修飾のためのプロセス との相互作用を含むかもしれない。 好ましくは、該化合物は本発明の方法によりインヒビターまたはエンハンサー として目に見える細胞、組織または生体の表現型の相違により同定される。組織 化学的マーカーまたはリポーター遺伝子を遺伝子導入的に導入した外来遺伝子を 含む生存能力の別のインジケーターが使用されるかもしれない。 本発明のさらなる局面により、線虫のＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログまたは その機能的等価物、誘導体断片またはリポーター分子をコードする核酸配列に作 動可能に結合した該ホモログの生物学的前駆体をコードする遺伝子のプロモータ ー配列を含むように構築されるトランスジェニック細胞または組織培養をも提供 する。好ましくは、例えば抗生物質耐性、β−ガラクトシダーゼまたは分光光度 計、蛍光光度計、蛍光または放射線活性などの視覚的調査により、モニターされ るであろうリポーター分子をコードするリポーター配列を含む。 本発明は、該化合物が線虫におけるＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログ、機能的 等価物、誘導体断片または該ホモログの生物前駆体をコードする遺伝子の転写物 のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定する方法をも提供し、そ の方法には以下の工程： （a）上記のように本発明によるトランスジェニック細胞と該化合物を接触さ せ、 （b）該リポーター分子のレベルをモニターし、ＵＮＣ−５３タンパク質の脊 椎動物ホモログ、または該ホモログの機能的断片およびリポーター分子をコード する遺伝子のプロモーター配列を有するトランスジェニック細胞を含む調節を化 合物の不在下で、本モニタリング工程から得た結果と比較する を含む。 本発明の本局面の方法の１態様において、該リポーター分子はメッセンジャー ＲＮＡを含むかもしれない。 線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは機能的等価物、該ホ モログの誘導体または生物前駆体をコードする遺伝子の転写エンハンサーとして 同定された化合物はまた、薬物としても利用され、または神経再生、血管新生ま たは傷害治癒を促進させ、または慢性的神経変性疾患または急性外傷性傷害また は繊維症の治療のための薬物の調製に使用されるかもしれない。さらに、そのよ うな化合物は、製薬学的に許容し得る担体、希釈剤またはその賦形剤を含む医薬 組成物に含まれると考えられる。転写のインヒビターとして同定された任意の化 合物は、有利なことに、癌または転移または接触阻害の喪失などの細胞を含む疾 患の蔓延を緩和することに使用されるかもしれない。 本発明はまた、化合物が細胞増殖、形質転換、細胞運動性または形状または細 胞移動性の方向を調節するエンハンサーまたはインヒビターであるか否かを決定 するキットを提供する。そのキットは少なくとも１つのトランスジェニック細胞 または変異細胞または上記の本発明によるトランスジェニックまたは変異ヒト以 外の生物および野生型細胞または同じ型の生物体または細胞株または組織培養お よび該細胞または生物体と該化合物を接触させる方法を含む。 本発明により、ある化合物が線虫のＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログまたは機 能的等価物、誘導体または断片をコードする遺伝子の転写インヒビターまたはエ ンハンサーであるか否かを決定するためのキットをも提供し、そのキットには、 トランスジェニック細胞または本発明による細胞および該細胞と該化合物を接触 させる手段を含む。 本発明の目的のためには、「ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログまたは該ホモロ グの機能的断片をコードする遺伝子」なる語句には、図９ｂまたは１１ｄにて示 される核酸配列または別個にスプライシングされたアイソフォームおよび核酸配 列の転写開始部位を含み、その配列にはＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモ ログをコードし、機能的等価物、誘導体、断片または該タンパク質の生物学的前 駆体をコードする。 本発明はまた、ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログが要素であるシグナル伝達経 路において活性である脊椎動物の遺伝子または該遺伝子の断片を同定する方法を 提供する。好ましい方法には、本明細書で定義するように、適当なｃＤＮＡライ ブラリーヌクレオチド配列にハイブリダイズするかまたは上記の本発明によるｃ ＤＮＡ配列のいずれかの１つのｃＤＮＡクローンと統計学的に有意にホモロジー を持つ遺伝子を同定するために、適当なストリンジェンシー条件下で、適当なｃ ＤＮＡにハイブリダイズすることを含む。 さらに、本発明により、線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログま たはその機能的等価物、該脊椎動物ホモログの断片または生物学的前駆体が要素 である細胞のシグナル伝達経路において活性であるタンパク質を同定する方法を 提供する。本発明の本局面により、本方法は； （a）該細胞の抽出物をＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは機 能的等価物、該タンパク質の断片または生物学的前駆体に接触させ、 （b）抗体／ＵＮＣ−５３複合体の脊椎動物ホモログを同定し、ついで （c）抗体のほかのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合した任 意のタンパク質を同定するために複合体を分析する ことを含む。 ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログは、それゆえ、シグナル伝達経路 に関与する他のタンパク質の領域に結合するであろう。また、シグナル伝達経路 に関与するタンパク質の全体領域の配列を同定することも可能である。 ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログに対する抗体は、当業者に知られているであ ろう公知の技術により製造されるかもしれない。例えば、ポリクローナル抗体は 、例えば、マウスなどの宿主動物に本発明によるタンパク質のタンパク質または エピトープおよび免疫血清を回収することによって、接種することにより調製さ れるであろう。 本発明のこの局面はさらに別のタンパク質または以下の方法が含むＵＮＣ−５ ３が要素である細胞のシグナル伝達経路中で活性であるタンパク質を同定する方 法： （a）上記の方法でＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合した最 初に同定されたタンパク質に対する抗体を形成し、 （b）該抗体と細胞抽出物を接触させ、 （c）抗体／タンパク質複合体を同定し、 （d）抗体のほかの第１タンパク質に結合した別のタンパク質のいずれかを同 定するための複合体を分析し、 （e）工程（a）から（d）までをときに繰り返して該経路中の別のタンパク質 を同定する、を含む。 本発明の本局面により、該抗体は、シグナル伝達経路中で、ＵＮＣ−５３タン パク質の脊椎動物ホモログまたはその機能的等価物に結合することによる工程を 開始する。別のタンパク質は結合した抗体またはＵＮＣ−５３タンパク質に対す る錯体を見出し、ついで該経路に関与するタンパク質とさらに相互作用すること を同定するために使用できる。 ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログまたはその機能的等価物誘導体または生物学 的前駆体が線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログを用いることによ る要素である細胞のシグナル伝達経路に関与したタンパク質を同定することがで きるかもしれない。本発明のこの局面により、本方法は： （a）細胞抽出物を線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは 機能的等価物、断片または該ホモログの生物学的前駆体と接触させ、 （b）形成されたＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ／タンパク質複 合体を同定し、ついで （c） 同じＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ以外のタンパク質に 結合する任意のタンパク質を同定するために複合体を分析する を含む。 本方法はまた、有利なことに、上記で使用した細胞の抽抽出物をＵＮＣ−５３ タンパク質の脊椎動物ホモログでなく、工程（b）および（c）を反復する工程（ c）から同定された任意のタンパク質と接触させることによって細胞のシグナル 伝達経路にて別のタンパク質を同定するために使用することができる。 細胞中のシグナル伝達経路中のタンパク質を同定するために使用されるであろ う他の方法は、当業者に良く知られた方法、例えばウエスタンブロットを含むで あろう。細胞抽出物をゲル上に流し、タンパク質を分離し、続いてナイロン膜上 へブロッティングする。ついでこれらの膜は、ビオチンまたは放射線標識したタ ンパク質および例えばストレプトアビジンまたはアルカリホスファターゼコンジ ュゲート抗体などで可視化した任意のタンパク質コンジュゲートに接触した標識 を持つＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログを含む培地中などでインキュベートされ るであろう。 本発明はまた、上記方法で、細胞移動の速度および方向または細胞増殖または 形状の調節に関与するタンパク質または断片を認識する抗体を結合する調製のた めのプロセスを提供する。 ＵＮＣ−５３の適当な脊椎動物ホモログ（またはその機能的な等価物）に結合 するためのモノクローナル抗体はコーラー(Kohler R.)およびミルシュタイン（M ilstein C.）（１９７５）Nature ２５６、４９５〜４９７に記載される公知の 技術によって調製されるであろう。 線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機能的等価物ま たは誘導体または生物学的前駆体が要素であるような細胞のシグナル伝達経路に 関与するタンパク質を同定するために使用されるであろう他の方法は、トゥー・ ハイブリッド・ベクター法を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用を調べる のに関与する。この方法は当業者に良く知られており、チエン（Chien）ら（１ ９９１）によって最初に酵母で開発された。この技術はリポーター遺伝子を活性 化させる転写因子のイン・ビボでの機能的再構築に基づくものである。一層とり わけ、該技術は適当な宿主にＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを持つ転 写因子によって調節されるプロモーターのコントロール下でリポーター遺伝子を 含むＤＮＡ構築物を提供し、および本発明による核酸配列の断片またはすげての 最初の融合をコードする最初のハイブリッドＤＮＡ配列、少なくとも１つの第２ のハイブリッドＤＮＡ配列で宿主中で発現し、最初の融合組み入れられない転写 因子の結合および活性化ドメインと一緒に調べられるべきタンパク質を衛浮いて イン・ビボ結合するタンパク質をコードするライブラリー該ＤＮＡ結合ドメイン または該転写因子の活性化ドメインいずれか；宿主細胞中の他のリポーター遺伝 子の存在の検出によって本発明のタンパク質を調べるべきタンパク質の任意の結 合を検出し；時に結合タンパク質をコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列を 単離する。 そのような技術の例は酵母中のＧＡＬ４タンパク質を利用する。ＧＡＬ４は酵 母中のガラクトシダーゼ代謝の転写アクチベーターであり、かつ該ガラクトシダ ーゼ代謝遺伝子の上流アクチベーターならびにタンパク質結合ドメインに結合す る分離タンパク質を保有する。ヌクレオチドベクターは構築できそうであり、そ のうちにはＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド残基を含む ものである。これらの結合ドメイン残基は、例えばＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモ ログをコードする配列などの配列をコードする公知のタンパク質に融合されるよ うである。その他のベクターにはＧＡＬ４のタンパク質結合ドメインをコードす る残基を含む。これらの残基を問題となる脊椎動物のシグナル伝達経路から好ま しくは試験タンパク質をコードする残基に融合させる。ＵＮＣ−５３タンパク質 の脊椎動物ホモログと試験されるべきタンパク質の間の相互作用は、該ベクター が形質転換された欠乏酵母細胞のＧＡＬ-４転写因子中のリポーター分子の転写 の活性化を導く。好ましくは、β−ガラクトシダーゼなどのリポーター分子が酵 母ガラクトシダーゼ代謝遺伝子の転写の回復に関して活性化される。本方法はシ グナル伝達経路に関与するタンパク質または調べられるべき類似または剰余経路 と相互作用を可能にする。 該細胞のシグナル伝達経路において同定された任意のタンパク質は、それが例 えば哺乳類動物であろうものであるが、製薬学的に許容し得る担体、希釈剤また は賦形剤とともに医薬組成物にも含まれるであろう。 本発明はまた、線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは機能 的等価物、該タンパク質の断片または誘導体を提供し、上記の本発明によるｃＤ ＮＡの任意を有するｃＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクショ ンした細胞を培養することを含む。該細胞は、有利には動物、昆虫または植物細 胞であろう。 ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは機能的等価物、該ホモログ の誘導体または断片を製造するための特に好ましいプロセスには、昆虫細胞を用 いることが含まれる。従って、本発明は線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動 物ホモログまたは該ＵＮＣ−５３タンパク質の機能的等価物、断片、誘導体また は生物学的前駆体を製造するための方法を提供し、その方法は組換えバキュロウ イルスベクターでトランスフェクションした昆虫細胞を培養し、該ベクターは、 ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは機能的等価物、断片またはそ のバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流の生物学的前駆体を含み、 発現したタンパク質を回収する。都合良く、本方法は回収するタンパク質の大量 を製造する。該昆虫細胞は例えば、Spodoptera frugiperda由来であるかまたはD rosophila Melanogester であってよい。 本発明により、定義された核酸配列には同一の拡散並びに特に同類のコドン（ 同じアミノ酸を明記する異なるコドン）という結果となる塩基における置換に含 まれる天然の核酸配列からの変異体の任意の少数の塩基も含み、それは保存アミ ノ酸置換における縮重コードのためである。「核酸配列」なる語句はまた、上記 の塩基変異に関する定義を与えられる任意の一本さＤＮＡに相補的な配列を含む 。 さらに、本発明で定義されたタンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸配列に は同一のアミノ酸配列ならに保存アミノ酸置換（側鎖に結合するアミノ酸による 置換）を含む天然に存在するアミノ酸配列からの変異である。天然のアミノ酸か ら変化するアミノ酸配列を免疫学的に同一である。そのようなポリペプチドは核 酸配列に対応することによってコードされるであろう。 本発明のさらなる側面は、本発明による核酸の少なくとも１５ヌクレオチドの アミノ酸配列、好ましくは１５から５０ヌクレオチドにわたる本発明を提供する であろう。 これらの配列は、複製などを開始するためにプローブまたプライマーとして都 合良く使用してよい。そのような核酸配列は当該技術分野において良く知られた 技術により製造されるかもしれず、例えば組換えまたは合成方法による。それら はまた本発明による核酸の存在の検出に関する診断キットなどにて使用されるか もしれない。これらの試験は一般的に、ハイブリダイゼーション条件下のサンプ ルと該プローブを接触させ、該サンプル中のプローブと任意の核酸の間の２量体 形成の存在に関して検出する工程を含む。本発明による核酸配列は、また、サン ブルック（Sambrook）ら、（モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・ マニュアル(Molecular cloning:a laboratory manual)、１９８９）に記載され るような組換えまたは合成方法を用いて製造されるかもしれない。有利なことに は、ヒト遺伝子対変異体または本発明によるＤＮＡの多型性は、例えば異なる集 団からの個体の範囲からのＤＮＡライブラリーをプロービングすることによって 同定されるかも知れない。さらに、本発明の核酸およびプローブは当業者に良く 知られた技術、例えばサンガー・ジデオキシ・チェイン・ターミネーター法（Sa nger Dideoxy chain termination method）、ある種の増殖障害に対する任意の 疾病素質を確認するかもしれない方法を用いて患者から得たゲノムＤＮＡをシー クエンシングするために使用されるかもしれない。 ある化合物が線虫のＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログ、機能的等価物、該脊椎 動物ホモログの誘導体または断片の発現のインヒビターまたはエンハンサーであ るかどうかはまた、該化合物とのホモログを発現させ、該化合物と接触していな いコントロール細胞に比較して表現型の変化をモニターする細胞を接触させるこ とを含む方法を提供する。 好ましくは、該細胞は、上記のようにトランスジェニック細胞である。別に、 該細胞は接触阻害の喪失を受けるかもしれない。 好ましくは、該ｍＲＮＡ配列は該脊椎動物ホモログをコードするｍＲＮＡの３ '未翻訳領域を含む。 別法として、試験すべき化合物はタンパク質であるかもしれない。好ましくは 、該タンパク質は該脊椎動物ホモログの機能を阻害するのに潜在的に適している アミノ酸配列を持つタンパク質を含み、かつ好ましくは本明細書に記載される方 法によって同定されるタンパク質を含む。 本発明はまた、例えば、製薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤とと もに上記により同定されたアンチセンス核酸などの化合物を含む医薬組成物を含 む。 核酸配列または本発明のこの局面により同定されたタンパク質を薬剤として使 用するか、または薬剤として調製する。というのは、接触阻害の喪失またはＵＮ Ｃ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは機能的等価物、断片、誘導体また は該ホモログの生物前駆体によって媒介される癌の治療のためである。 本発明により、上記の核酸が使用のため線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎 動物ホモログ、機能的等価物、誘導体、断片または該ホモログの生物学的前駆体 をコードする遺伝子の発現を阻害するための薬剤の調製に使用されるよう定義さ れる。 本発明の更なる側面により、ＬＭＢＰ受託番号第ＬＭＢＰ３５９４号の下に寄 託したプラスミドｐＣＢ２０１を提供し、それぞれＬＭＢＰ受託番号第ＬＭＢＰ １６０１ＣＢ号および第ＬＭＢＰ１６０３ＣＢ号の下に寄託したプラスミドｐＣ Ｂ２０１でトランスフェクションした細胞株ＭＣＦ−７およびＮＩＨ／３Ｔ３細 胞株を提供する。本発明により、さらにHu−ＵＮＣ−５３／１をコードするファ ージラムダ３ｂを提供し、第ＬＭＢＰ１６０４ＣＢ号（または３５９５号）の下 で寄託している。また、受託番号第ＬＭＢＰ３７６２号の下に寄託したプラスミ ドｐＬＭ１、ｐＬＭ４（受託番号第ＬＭＢＰ３７６３号）、ｐＥＧＦＰ７２（受 託番号第ＬＭＢＰ３７６４号）およびｐＣＢ５０１（受託番号第ＬＭＢＰ３７６ ５号）をも提供する。Hu−ＵＮＣ−５３／２遺伝子の断片を含むＢａｃ第ＬＭＢ Ｐ３７７３号）を含むクローンを提供し、受託番号第ＬＭＭＰ−１６６３ ＣＢ号の下に寄託された線虫ヒトキメラＵＮＣ−５３遺伝子を含む虫株を提供す る。 本発明により、さらに提供されるのは、脊椎動物細胞中で線虫のＵＮＣ−５３ の脊椎動物ホモログの発現を検出するアッセイであり、細胞またはその抽出物を 該脊椎動物ホモログ、機能的等価物、その誘導体または生物学的前駆体に対する 抗体に接触させ、その抗体はリポーター分子に融合し、未結合抗体を除去し、つ いで該リポーター分子の存在に関してモニタリングする。 好ましくは該リポーター分子は、例えばフルオロセインなどの蛍光体またはそ の他ストレプトアビジンなどの酵素にコンジュゲートした抗体である。 ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、またはその機能的等価物、誘導 体、断片または生物学的前駆体をコードする遺伝子の発現を検出する方法も提供 し、その方法には核酸に特異的なプローブまたは該脊椎動物ホモログまたはその 機能的等価物、断片または生物学的前駆体をコードするかまたは対応するタンパ ク質配列を細胞抽出物に接触させ、そのプローブはリポーターに結合し、該リポ ーターの存在を分析するものである。 好ましくは、該プローブはＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、また はその機能的等価物、誘導体、断片または生物学的前駆体をコードする該遺伝子 から転写されたｍＲＮＡの領域に相補的な配列である。 好ましくは該相補的な配列は該ｍＲＮＡの３'または５'未翻訳領域である。好 ましくは該リポーターはdig標識、蛍光体、ハプテン、または放射線標識であっ てよい。 別法として、該プローブはＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、また はその機能的等価物、誘導体、断片または生物学的前駆体に特異的な抗体を含む 。 好ましくは、リポーターは例えばフルオロセインなどの蛍光体または代わりに ストレプトアビジンなどの酵素にコンジュゲートした抗体である。 上記のように、線虫のＵＮＣ−５３タンパク質が微小管、特に微小管（＋）端 に限局していることを見出した。それゆえ、請求項１〜９のいずれかにより、そ の微小管またはそのプラス端領域に対するＵＮＣ−５３またはその脊椎動物のホ モログの結合のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定する方法を 本発明のさらなる側面によって提供され、その方法には、（a）該化合物をＵＮ Ｃ−５３タンパク質または該脊椎動物ホモログを発現するリポーター分子に作動 可能に結合したタンパク質トランスジェニック細胞、組織または生物体に接触さ せ、（b）該化合物と接触させない工程（a）による細胞に比較して該リポーター 分子の局在に関してスクリーニングすることを含む。 上記方法により同定可能な化合物は、本発明の一部も構成する。微小管または そのプラス端領域とＵＮＣ−５３またはその脊椎動物ホモログの結合または限局 のインヒビターとして同定されるような化合物は、細胞を誘発する疾患の広がり を緩和し、転移または接触阻害の喪失を緩和するのに使用されるかもしれない。 さらに、ＵＮＣ−５３またはその脊椎動物ホモログの微小管またはそのプラス端 とのけ都合のエンヘンサーとして同定された化合物は例えば、神経再生、血管再 生または傷の治癒の促進または慢性神経変性疾患または急性外傷性障害または繊 維症疾患の治療に使用されてよい。ついで、これらの化合物は医薬組成物中に製 薬学的に許容し得る担体、その希釈剤または賦形剤とともに含まれてよい。 本発明によりＵＮＣ−５３またはそのホモログのが微小管またはそのプラス端 領域との結合のインヒビターまたはエンハンサーであるかどうかを決定するため のキットを提供し、そのキットには、本発明によりＵＮＣ−５３およびリポータ ー分子または宿主またはトランスジェニック細胞を発現する少なくとも１つのト ランスジェニック細胞およびコントロールとして使用するための同じタイプの少 なくとも１つの細胞および少なくとも１つのトランスジェニック細胞のうちの１ つと該化合物を接触させる方法を含む。上記のインヒビターまたはエンハンサー または微小管結合として同定された化合物は、組成物中に含まれ、ついで本発明 により該化合物を微小管またはそのプラス端領域にターゲティングされ、線虫の ｕｎｃ−５３タンパク質またはその脊椎動物ホモログに結合するかもしれない。 そのような組成物はまた、例えば、適当なトランスフェクションまたは形質転換 剤を含むかもしれない。 本発明のさらなる側面により、細胞微小管またはそのプラス端領域にタンパク 質をターゲティングする方法を提供し、その方法には、本発明によりＵＮＣ−５ ３またはその脊椎動物ホモログを発現することができる配列を含むトランスジー ンを宿主細胞、組織または生物体に導入し、その配列はキメラタンパク質が発現 され、結果的に微小管またはそのプラス端領域に該タンパク質をターゲティング するようにターゲティングされる該タンパク質をコードする配列に作動可能に結 合する。さらに別の本発明の側面でさえ、本発明によるＵＮＣ−５３またはその 脊椎動物ホモログを共有結合的に修飾する分子を同定する方法を含み、該方法に は、a）細胞またはＵＮＣ−５３またはその脊椎動物ホモログまたはタンパク質 の共有結合修飾の指標の存在下での候補ＵＮＣ−５３修飾酵素を含む酵素の混合 物を接触させ、b）工程a）からの任意の共有結合的に修飾したＵＮＣ−５３タン パク質を同定し、c）該修飾工程に関与する該分子を同定することを含む。その ような指標は³²Ｐであるかもしれない。 さらに本発明により提供されるのは、本発明によるＵＮＣ−５３またはその脊 椎動物ホモログの毒性を緩和または増強する化合物またはアポトーシスを軽減ま たは増強する化合物を同定する方法である。前者には、該化合物を本発明のトラ ンスジェニック細胞、組織または生物体に接触させ、微小管またはそのプラス端 近辺のリポーター分子の存在をモニターすることを含む。アポトーシスの場合、 該方法には、細胞死に影響を及ぼす化合物のモニタリングを含む。 本発明は、さらに以下に添付の図面を参照することにより、例示するのみに限 る以下の例から一層明瞭に理解されるであろう。 図１は、ＬＭＢＰ受託番号第３４８６号の下に寄託された線虫のＵＮＣ−５３ タンパク質の全長をコードするプラスミドｐＴＢ７２の配列を示す。 図２は、線虫からのＵＮＣ−５３タンパク質の全長を示す。 図３は、公知の最も長いＣｅ−ＵＮＣ−５３ｃＤＮＡのＯＲＦを有するGeneba nkのＥＳＴ部門のTblastnサーチである。ｔｂ３−Ｍ５は２つのＥＳＴ'ｓがCe- ＵＮＣ-５３の推定coild-coil領域にホモロジーがあることがわかった。 図４は、Ｃｅ−ＵＮＣ−５３のヌクレオチド結合ドメインの一部によるGeneba nkのデータベースのサーチを示す。Ｃｅ−ｕｎｃ−５３を含む線虫のコスミドを 除くタンパク質と統計学的有意差は同定されていない。 図５は、ＥＳＴ gb：Ｒ４１０７１の３枠翻訳を示す。 ２つの別個の枠でのＣｅ−ＵＮＣ−５３とのホモロジー領域に下線を付してあ る。ホモロジーの区画間の空間はＣｅ−ＵＮＣ−５３のものと類似の大きさであ る。ヒトにおけるこの領域の連続した再クローニングおよび再シークエンシング によりgb：Ｒ４１０７１のシークエンシングの誤りを多数同定し、Ｃｅ−ＵＮＣ −５３と一層ホモロジーがあるかまたは半線形であるＯＲＦを同定した（図１２ 中のアラインメント参照）。 図６は、Ce−ｕｎｃ-５３/１ｃＤＮＡコスミド３ｂでのGenebankのＥＳＴ部門 のＢＬＡＳＴＮサーチである。 図７は、Ｈｕ−ＵＮＣ−５３／１：ｈｕ−ＵＮＣ−５３／１のｃＤＮＡ３ｂの ９６１アミノ酸ＯＲＦで９６１アミノ酸ＯＲＦＴＢＬＡＳＴＮサーチ残りのデー タベースに比較して、独特の組み合わせを形成する。 図８aは、本作業中に単離されたＨｕ−ＵＮＣ−５３／１の３'末端の異なるｃ ＤＮＡクローンの長さおよび重複部位および組織期限を示す模式図である。 図８bは、Ｈｕ−ＵＮＣ−５３／１の３'末端を示し、そのＥＳＴクローンは本 データーベースに示されている。 図９aは、EcoRＩポリリンカーＧＡＡＴＴＣを含むＨｕ−ＵＮＣ−５３/１のク ローン３ｂの注釈付き配列表である。Ｈｕ−ＵＮＣ−５３/１の推定オープンリ ーディングフレームを以下の配列として挙げる。ＡＢＣＤおよびＥの区画は、Ｈ ｕ−ＵＮＣ−５３/１に類似であり、Ｈｕ−ＵＮＣ−５３/１およびＨｕ−ＵＮＣ −５３/２間で異なっている領域および３'未翻訳リーダー配列は矢印と標識によ って示されている。 図９ｂは、この瞬間で利用できるＨｕ−ＵＮＣ−５３/１の注釈付き配列表で ある。Ｈｕ−ＵＮＣ−５３/１の推定オープンリーディングフレームであるｐＬ Ｍ１、ｐＬＭ３、ｐＬＭ４、ｐＣＢ２５１，ｐＬＭ５およびｐＣＢ２０１、ホモ ロジー区画Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ、Ｈｕ−ＵＮＣ−５３/１およびＨｕ−ＵＮ Ｃ−５３/２間で異なっている領域の位置、ｐｈｈ１４−３、ｐＣＢ２１２、ｐ ＣＢ２１０−１４、ｐｈｈ３ｂ、ｐｈ１５、ＨＵ５３ｒｖ１、ＨＵ５３ｒｖ２、 ＨＵ５３ｒｖ３およびＨＵ５３ｒｖ４の逆プライマーの位置、ペプチドＢ７２６ ２８（２８＝１）、Ｂ７２６２７、Ｂ７２６２６およびＢ７２６２５を以下の配 列に列挙する。 図１０は、ｍｕ−ＵＮＣ−５３/１のｇｂＡ０４９１２４（ＥＳＴ４７９１６ ７）クローンのインサートの注釈付き配列表である。オープンリーディングフレ ームおよび３'未翻訳配列を矢印で記している。 図１１aは、Ｈｕ−ＵＮＣ−５３/２のｇｂＨ０９０３６（ＥＳＴ４６０３７） クローンのインサートの注釈付き配列表である。 図１１ｂは、ＲＴ−ＰＣＲにより伸展させられたＨｕ−ＵＮＣ−５３/２の新 規ＤＮＡ配列である。このＤＮＡ配列はＥＳＴ−４６０３７には存在しておらず 、図１１aの１１０９を超えたＯＲＦの位置から１８〜１７９３のＯＲＦへと超 える。 図１１ｃは、Ｈｕ−ＵＮＣ−５３/２の３'および５'伸展がいかにしてなされ るかをまとめている。 図１１ｄは、Ｈｕ−ｕｎｃ−５３/２の配列を集めている。囲った配列は、実 験方法セクションに記載した個々の伸展工程に使用したプライマー配列である。 図１１eは、図１１ｃにまとめられた伸展の配列を示している。 図１１ｆは、ｈｕ−ＵＮＣ−５３/２に観察される４つの別の開始部位を示す 配列情報を示す。 図１２は、ｈｕ−ＵＮＣ−５３/２のαアクチンドメインのＣ−末端にて６８ ０aaで開始するGenebankのＥＳＴ部門のTblastnサーチの例示である。 図１２aは、線虫のＵＮＣ−５３の利用可能な配列およびｈｕ−ＵＮＣ−５３/ １およびｈｕ−ＵＮＣ−５３/２のアミノ酸アラインメントの例示である。 １２ｂは、Ｃｅ‐ｕｎｃ−５３およびｈｕ−ｕｎｃ−５３/１（上段）および ｈｕ−ｕｎｃ−５３/１およびｈｕ−ｕｎｃ−５３/２の類似プロットの例示であ る。 図１３は、ｐｃＤＮＡ３.１−ＨＩＳ発現ベクター中にクローニングされたＨ ｕ−ＵＮＣ−５３/１からのホモロジー区分Ｅを含むｐＣＢ２０１発現ベクター の注釈付き配列表である。ＨＩＳおよびＴ７−タグ、ｈｕ−ＵＮＣ−５３/１お よびＯＲＦを修飾するために使用するＰＣＲプライマーにしるしを付けた。 図１４は、ｈｕ−ＵＮＣ−５３/１およびｍｕ−ＵＮＣ−５３/１の類似部位の ライン面とを示すダイヤグラムである。 図１５は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１にクローニングされたＣｅ−ＵＮＣ −５３／１の部位を含む発現ベクターｐＣＤＵ３の注釈付き配列表である。上段 のＯＲＦはポリリンカーベクターで開始する。下段のＯＲＦは最初のメチオニン から開始し、Ｃｅ−ＵＮＣ−５３／１の一部である。 図１６は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１にクローニングされたＣｅ−ＵＮＣ −５３／１の部位を含む発現ベクターｐＣＤＵ４の注釈付き配列表である。上段 のＯＲＦはポリリンカーベクターで開始する。下段のＯＲＦは最初のメチオニン から開始し、Ｃｅ−ＵＮＣ−５３／１の一部である。 図１７は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１にクローニングされたＣｅ−ＵＮＣ −５３／１の部位を含む発現ベクターｐＣＤＵ２の注釈付き配列表である。上段 のＯＲＦはポリリンカーベクターで開始する。下段のＯＲＦは最初のメチオニン から開始し、Ｃｅ−ＵＮＣ−５３／１の一部である。 図１８は、偽トランスフェクションしたＭＣＦ−７細胞（位相差像（phase co ntrast image））に比較して、ｐＣＢ２０１（上段）でトランスフェクションし たＭＣＦ−７細胞を例示する。該コントロール細胞を組織培養プラスチック上に 広げてフィロポディアは殆ど成長しないことを示す。トランスフェクションした 細胞は、わずかに丸くなっているので、少し小さく見え、細胞１個当たり多数の フィロポディアが増殖する（矢）。 図１９は、ｐｃＤＮＡ３.１（１９a）、ｐＣＤＵ４（１９ｂ）、ｐＣＤＵ３（ １９ｃ）、ｐＣＤＵ２（１９ｄ）およびｐＴＢ７２（１９e）でトランスフェク ションしたＭＣＦ−７細胞の位相差像。 図２０は、ｐｃＤＮＡ３．ＬａｃＺ（上段パネル）およびｐＣＢ２０１（中断 および下段パネル）でトランスフェクションしたＭＣＦ−７のＦ−アクチンパタ ーン（ＴＲＩＴＣ−ファロイジン（Phalloidin））である。 図２１は、ｐｃＤＮＡ３.１（２１a）、ｐＣＤＵ４（２１ｂ）、ｐＣＤＵ３（ ２１ｃ）、ｐＣＤＵ２（２１ｄ）およびｐＴＢ７２（２１e）でトランスフェク ションしたＭＣＦ−７細胞のＦ−アクチンパターンファロイジン（ＴＲＩＴＣ− ファロイジンで可視化）である。 図２２は、ｐｃＤＮＡ３.１（２２a）、ｐＣＤＵ４（２２ｂ）、ｐＣＤＵ３ （２２ｃ）、ｐＣＤＵ２（２２ｄ）およびｐＴＢ７２（２２e）でトランスフェ クションしたＮ４神経芽細胞の位相差像である。 図２３は、ｐｃＤＮＡ３.１（２３a）、ｐＣＤＵ４（２３ｂ）、ｐＣＤＵ３（ ２３ｃ）、ｐＣＤＵ２（２３ｄ）およびｐＴＢ７２（２３e）でトランスフェク ションしたＮ４神経芽細胞のＦ−アクチンパターン（ＴＲＩＴＣ−ファロイジン ）である。 図２４は、ｐＣＢ２０１でトランスフェクションすることによるＮＩＨ３Ｔ３ 細胞の単層で誘発された小（上段）、中（中段）および大病巣（下段）の位相差 増を示す。 図２５（c）は、プローブ１ｑ３４および１ｑ３１におけるhu−ｕｎｃ−５３ ／１の染色体位置を示す図２５aおよび２５ｂでプロービングしたヒト中期染色 体を示す。本質的に、同じ技術を顕微鏡図２５ｆにおいて示されるのと同様に染 色体位置１１ｑ１５（２５dおよびe）に遺伝子hu−ｕｎｃ-５３/２を割り当てる のに使用する。 ２５aおよび２５ｄの文字列は、International System for Human Cytogenic Nomenclature １９８５からのものである。２５bおよび２５eの文字列における 相対的なバンドの位置および腕の比率は実際の染色体の計測から由来したもので あり、Cytogenet Cell Genet ６５：２０６−２１９(１９９４)出展である。 図２６は、正常ヒト組織および癌細胞株におけるＨＵ-Unc-５３／１およびＨ Ｕ-Unc-５３／２の発現パターンである。 図２７は、プラスミドｐＮＰ３の配列マップである。 図２８は、ＵＮＣ-５３の脊椎動物ホモログを定義し同定するために使用され ることができるプロサイト特徴の例示リストである。 図２９は、プラスミドｐＥＧＦＰsacの注釈付き配列マップである。ＧＦＰ-線 虫ＵＮＣ-５３sac融合タンパク質および線虫ＵＮＣ-５３sac断片を示す。 図３０は、プラスミドｐＥＧＦＰ７２の配列マップであり、線虫ｕｎｃ５３断 片が示されている。 図３１は、プラスミドｐＥＧＦＰsmaの注釈付き配列マップである。ＧＦＰ-線 虫ｕｎｃ-５３sma融合タンパク質および線虫ｕｎｃ５３sma断片を示す。 図３２は、プラスミドｐＥＧＦＰeclの注釈付き配列マップである。ＧＦＰ-線 虫ｕｎｃ５３ecl融合タンパク質および線虫ｕｎｃ５３ecl断片を示す。 図３３は、プラスミドｐＥＧＦＰxbaの注釈付き配列マップである。ＧＦＰ-線 虫ＵＮＣ-５３xba融合タンパク質および線虫ｕｎｃ５３xba断片を示す 図３４は、プラスミドｐＬＭ４の注釈付き配列マップである。hu１-ｕｎｃ５ ３／１のオープンリーディングフレームおよびＧＦＰを示す。 図３５は、プラスミドｐＮＰ８の配列マップである。 図３６は、線虫Unc５３の微小管結合を示したものであり、線虫Ｕｎｃ５３を 発現するｐＴＢ７２で一次的にトランスフェクションしたHepＧ２細胞に示され ているものである。パネルＡ：ＹＬ１/２を用いてHepＧ２細胞の微小管染色、パ ネルＢ：rab４を用いた線虫ＵＮＣ-５３染色。 図３７は線虫Unc５３を発現するｐＴＢ７２で一次的にトランスフェクション したヒト細胞株での微小管プラス端結合を例示したものである。線虫のUnc５３ をmab-１６-４８で染色した。パネルＣ：微小管結合を示すＣＯＳ細胞、パネル Ｂ：微小管プラス端結合を示す細胞、パネルＡ：微小管プラス端結合を示すHep Ｇ２細胞。 図３８は、ＧＦＰ-線虫Unc５３融合タンパク質を発現するｐＥＧＦＰ７２で一 次的にトランスフェクションしたＮ４細胞での微小管結合を例示したものである 。ＧＦＰフルオレセンスを生体内で観察した。パネルＡ：線虫Unc５３融合タン パク質の微小管結合、パネルＢ：ＧＦＰ-線虫ｕｎｃ５３融合タンパク質の微小 管プラス端結合。 図３９は、ＧＦＰ-線虫Unc-５３融合タンパク質を発現するｐＥＧＦＰ７２で 一次的にトランスフェクションしたＮ４細胞での微小管結合を例示したものであ る。微小管はパラホルムアルデヒドで固定した後、ＹＬ１／２で染色した。パネ ルＡ：ＧＦＰ−線虫ｕｎｃ５３融合タンパク質の微小管結合。パネルＢ：チュー ブリン染色。パネルＣ：パネルＡプラスパネルＢ：ＧＦＰ-線虫ｕｎｃ-５３融合 タンパク質およびチューブリンの共存が黄色として見られる。 図４０は、ＧＦＰ-線虫ｕｎｃ５３sma融合タンパク質を発現するｐＥＧＦＰsm a で一次的にトランスフェクションしたＮ４細胞での微小管結合を例示したもので ある。パネルＡ：ＧＦＰ-線虫ｕｎｃ５３sma融合産物の微小管結合。パネルＢ： 低いレベルで発現するＧＦＰ-線虫ｕｎｃ５３sma融合産物の中心体結合。 図４１は、ＧＦＰ-線虫ｕｎｃ５３ecl融合タンパク質を発現するｐＥＧＦＰec lで１次的にトランスフェクションしたＮ４細胞での微小管結合を例示したもの である。Ａ：ＧＦＰ-線虫ｕｎｃ５３ecl融合産物の微小管結合。パネルＢ：低い レベルで発現するＧＦＰ-線虫ｕｎｃ５３ecl融合産物の中心体結合。 図４２は、それぞれｐＥＦＰxbaおよびｐＥＦＧＰsacで一次的にトランスフェ クションしたＮ４細胞でのＧＦＰのフルオレセンスの例示。 図４３は、ＧＦＰ-Hu-ＵＮＣ５３/１融合タンパク質を発現するｐＬＭ４で１ 次的にトランスフェクションしたＮ４細胞での微小管結合を例示したものである 。パネルＡ：ＧＦＰ-ＨＵ-ＵＮＣ-５３／１融合タンパク質の微小管結合。パネ ルＢ：ＧＦＰ-Hu-ＵＮＣ-５３／１融合タンパク質の微小管プラス端結合。パネ ルＣ：分割細胞（分割の終了）におけるＧＦＰ-Hu-ＵＮＣ-５３／１の微小管の 結合。 図４４は、プラスミドｐＮＰ９の配列の例示である。 図４５は、血清２８.１で染色した黒色腫Ｇ３６１細胞中の免疫蛍光の例示で ある。パネルＡ：Hu−ＵＮＣ-５３/１の微小管プラス端結合。パネルＢ：成長円 錐伸展におけるhu１-ＵＮＣ-５３の微小管プラス端結合。 図４６は、一次的にｐＬＭ４でトランスフェクションし、血清２８.１で染色 したＮ４細胞中の免疫蛍光の例示である。パネルＡ：ＧＦＰ-Hu−ＵＮＣ-５３/ １癒合タンパク質のフルオレセンス。パネルＢ：血清２８.１の免疫蛍光。 図４７は、微小管（＋）端、該微小管および異なる構築物のｆ−アクチン細胞 骨格結合特性の概観である。 図４８は、変異体ｕｎｃ-５３における分枝ＡＬＮニューロンの救済を例示す る。 生体の後方におけるトランスジーンpA/ＧＦＰでＧＦＰフルオレセンス中で可 視化したＡＬＮニューロンの軸索、（ｃ）細胞体。a）野生型、前方の軸索（aa ）は、頭部に達するまでその体に沿って直線的に背部側索上を移動し、後方 軸索（ap）は尾まで移動する；ｂ）ｕｎｃ-５３（n１５２）、前部軸索は短く、 陰門領域の前で停止し、背部の脊髄に向かう共側作分枝を多数形成する；ｃ）ｕ ｎｃ-５３（n１５２）、pA/ｕｎｃ-５３前方軸索はa）の野生型におけるように 頭部Ｔに直線的に移動する。スケールバーは１０μｍを示す。 図４８a：は、線虫とｕｎｃ-５３遺伝子のヒト１ホモログの間のキメラ融合の 例示である。推定ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＴＰ）の領域をＵＮＣ-５３の ヒト１ホモログ(Ｈ１)の同領域により線虫ｃＤＮＡにおいて置換する。該ｃＤＮ Ａはｕｎｃ-５３のプロモーター領域Ａ（pA）の下であり、ＡＬＮ側枝ニューロ ンにおいて発現を強化する。 図４８ｂ：は、キメラミニ遺伝子線虫／ヒトｐＡ／ｕｎｃ-５３−Ｈ１が部分 的に側索ニューロンＡＬＮおよびＰＬＮの縦長移動における欠点を救済している ことを示す。比較された４つの株は：wt;ｕｎｃ-５３（n１５２）；ｕｎｃ５３ （n１５２）、pA/ｕｎｃ-５３；ｕｎｃ-５３（n１５２）、pA/ｕｎｃ-５３-Ｈ１ である。観察された表現型は３つのクラスに分類される： る。数字はパーセンテージである。観察された軸策の数は、最終行に記載してあ る。線虫遺伝子およびヒトホモログ(ｕｎｃ-５３−Ｈ１)間のキメラ融合は部分 的に変異体表現型を救済する。キメラ遺伝子はヒトホモログ１（Ｈ１）の同領域 によって線虫ｃＤＮＡの推定ヌクレオチド結合領域（ＮＴＰ）を置換することに よって製造される。 図４９は、プラスミドｐＬＭ５の配列の説明である。 図５０は、プラスミドｐＬＭ６の配列の説明である。 図５１は、プラスミドｐＬＭ１１の配列の説明である。 図５２は、プラスミドｐＣＢ２５１の配列マップである。 図５３は、プラスミドｐＮＰ１０の配列マップである。 図５４は、プラスミドｐＣＢ５０１の配列マップである。 図５５は、プラスミドｐＴＢ１１５の配列マップである。 図５６は、プラスミドｐＰＤ９５.７５の配列マップである。 図５７は、クローンＸ１６の配列マップである。 図５８は、プラスミドｐＬＭ３の配列マップである。 上記のプラスミドおよび細胞株は１９７７年４月２８日のブダペスト条約の規定 によりベルギー国、ＧＥＮＴ、Ｂ９０００ラボラトリウム・ブーア・モレキュラ イアービオロジー−プラスミデンコレクティブ（Laboratorium voor moleculair e biologie-plasmidencollective）(ＬＭＢＰ)のベルギアン・コーディネーテッ ド・コレクションズ・オブ・マイクロオーガニズムズ（Belgian Coordinated Co ordinated Collections of Microorganisms(ＢＣＣＭ)で寄託された。 本発明は現在、制限するのではない以下の実施例を参照して記載される。線虫ＵＮＣ-５３のヒトホモログの同定 パブリックドメインデータベース（ＥＳＴ、Genbank、ＥＭＢＬ、スイスプロ ットおよびＰＩＲ）に対するce-ＵＮＣ-５３配列での伸展サーチ（図１および２ ）は統計学的に有意なホモロジー（１０e-８の最も低い期待値（ｓｓｐ）が一般 的にアミノ酸レベルで有意であると認められている）を明らかにした。２つのＥ ＳＴsgｂＨ０９０３６ヒトｃＤＮＡクローンおよびbgＡＡ０４９１２４（ｓｓｐ ＝８.６−５）マウスｃＤＮＡクローンはタンパク質二次構造に貢献している共 通モチーフ「コイルド・コイル（coiled coil）」領域にホモロジーを示した（ 図３）。 すべての他の候補となるスコアはバックグランドレベルであった（ｓｓｐ＝０ .２１）。ＥＳＴｓでありそうな注意深い調査により、ホモ・サピエンスからＥ ＳＴ gb:Ｒ４１０７１を同定し、５３の低スコアおよび有意でない０.３３確率 スコア（図４）を得た。驚くべきことに、本発明者らはCe−ＵＮＣ-５３ヌクレ オチド結合ドメインと潜在的に有意なホモロジー見出し、多数のフレームシフト を提供し、配列の誤りを仮定した。 本発明者らはヒト心臓およびヒト肺ｃＤＮＡからおよびヒトゲノムＤＮＡから 得られる得られるgb：Ｒ４１０７１の一部を増幅、クローニングおよびシークエ ンシングし、かつクローンgb：Ｒ４１０７１は調べた領域において１０の別個の 誤りを有することを見出した。５つの別のヌクレオチドをその配列に沿って飛散 し、２つのヌクレオチド置換が同定され、ついでgb：Ｒ４１０７１は本発明者ら のクローン（図５）において存在する３つのヌクレオチドを欠如していた。得ら れた新規の配列は短い２つのヌクレオチドを得て、イン・フレームの２つのＵＮ Ｃ-５３-類似領域を示した。得られたゲノム断片は、この断片のヌクレオチド１ ６２における約５００bpの椎間配列の存在を示す対応するｃＤＮＡクローンより 大きい（全長７００bp）。ＰＣＲＩＩベクター（インビトロゲン）にクローニン グした増幅したｃＤＮＡ断片およびｐＣＲ２３１と名づけられ、ｃＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。 本発明者らがＰＣＲによって入手したクローンの概念上の翻訳は、データベー ス上のすべての公知のタンパク質およびＤＮＡ配列に対してblastおよびtblastn を用いてスクリーニングした。統計学的に有意な類似性を提供するクローンは、 Ce-ＵＮＣ-５３であった（図６）。このヒトクローンおよびCe-ＵＮＣ-５３は従 って、公知の配列の残りに比較して独特のホモログを形成し、それにより統計学 的な関連性および本発明者らの発見の新規性を示唆した。本発明者らはこのヒト 遺伝子をhu-ＵＮＣ-５３／１と名づけた。ヒト心臓およびヒト結腸腺癌ｃＤＮＡ ライブラリーを一層長いｃＤＮＡを同定するためのｐＣＲ２３１プローブでプラ スミドロービングした。それらクローンは３７０６bpの線形配列を与えて重複す る（図８および２６）。この配列は９５９アミノ酸オープンリーディングフレー ムをクローンの開始から示した。５'未翻訳領域の不在は、ｍＲＮＡが５'を伸長 するであろうことを示す。 hu-ＵＮＣ-５３／１およびその概念上の翻訳でのパブリックドメインデータベ ースの配列アラインメントサーチは、たいていが５'ＵＴＲ領域に対応する連続 したＥＳＴ'ｓを同定した（図７および８）。驚くべきことに、hu-ＵＮＣ-５３ ／１はまた、Ce-ＵＮＣ-５３ hu-ＵＮＣ-５３／１における推定コイルド・コイ ルに類似のｃＤＮＡクローンgbＨ０９０３６およびgbＡＡ０４９１２４を同定し 、さらに第３の少し類似のＥＳＴ gbＲ２１０２３を同定した。gbＨ０９０３６ 、gbＡＡ０４９１およびgbＲ２１０２３の挿入はメルク協会から入手し、シーク エンシングした。 gbＡＡ０４９１２４は利用可能なアミノ酸６０４を越えるHu-ＵＮＣ-５３/１ に９５％より多く同一であり（図１０）およびHu-ＵＮＣ-５３／１のマウスオー ソロガス遺伝子である。gbＨ０９０３６のインサートは明らかにhu-ＵＮＣ-５３ ／１に類似であるが、異なる遺伝子座由来である。それゆえ、本発明者らはgbＡ Ａ０４９１２４により同定された遺伝子をMu-ＵＮＣ-５３／１と命名し、gbＨ０ ９０３６により同定された遺伝子をHu-ＵＮＣ-５３／１と命名した（図１１）。 高い類似性の５ドメインはＵＮＣ-５３遺伝子ファミリーをマークする Ce-ＵＮＣ-５３およびここで同定された脊椎動物ホモログは独特の新規タンパ ク質ファミリーを形成し、パブリックドメインにおける残りのタンパク質からか け離れている。推定されたオープンリーディングフレームのアラインメントは Hu-ＵＮＣ-５３／１およびHu-ＵＮＣ-５３／２はCe−ＵＮＣ-５３から等距離に ある。最も高いホモロジーはce-ＵＮＣ-５３領域のカルボキシ末端アミノ酸にお いて見出される。保存されたＧＸＸＧＫＳ/Ｔボックスの存在は、ヌクレオチド 結合機能を示唆する。しかしながら、このドメインは全体として公知のヌクレオ チドのクラスには属さない。 現在知られているＵＮＣ-５３のタンパク質ファミリーの中での類似性は、利 用可能な配列（９５９アミノ酸）のたいていで５ブロックより多くおよび図１２ aで同定される更なるブロックで最高である。これらのブロックは図２８に示さ れるように割り当てられた用法配列であり得、または異なるファミリーメンバー 間のアラインメントに基づく重量マトリクスを割り当てることが可能である。Ce -５３の切断(truncated)構築物を用いて、これらのドメインの機能的関連が記さ れた。 Hu- ＵＮＣ-５３／１およびHu-ＵＮＣ-５３／２は転写単位複合体である。 １．癌細胞株ＲＮＡブロットはHu-Ｕｎｃ-５３／１でプロービングした。 いくつかの癌細胞株（黒色腫Ｇ３６１、肺癌Ａ５４９、結腸腺癌ＳＷ４８０、 バーキットリンパ腫ＤＲji、白血病Molt４、リンパ芽腫性白血病Ｋ５６２、HeLa Ｓ３およびポリ骨髄細胞性白血病ＨＬ６０）から得たポリ−Ａ＋ＲＮＡのノー ザンブロットはｐＨＨ３bの全インサートを用いてプロービングした。バーキッ トリンパ腫ＤＲji、白血病Molおよびポリ骨髄細胞性白血病ＨＬ６０株において は発現が全く検出されないかまたは弱い発現しか検出されなかった。５つの別個 の転写物は残りの癌細胞株中で検出された：転写物１および２は９.５kbより大 きく、転写物３および４は６〜７kbであり、第５の転写物は約６kbである。転写 物１および２は、すべての発現細胞株において存在する。転写物３および４は黒 色腫Ｇ３６１、肺癌Ａ５４９および結腸腺癌ＳＷ４８０に限られ、黒色腫Ｇ３６ １および結腸腺癌ＳＷ４８０においては優性である。転写物５はリンパ芽腫性白 血病Ｋ５６２およびHeLa Ｓ３細胞に限定されており、HeLa Ｓ３細胞で優性であ る。 ２．癌細胞株ＲＮＡブロットはＨＵ−ＵＮＣ-５３／２でプロービングした。 癌細胞株ノーザンブロットの同様のセットは、プライマーＥＳＴ４６０３７の６５２bp断片でプロービングした。ＨＵ−ＵＮＣ-５３／２ は黒色腫Ｇ３６１、結腸腺癌ＳＷ４８０、リンパ芽腫性白血病Ｋ５６２およびHe La Ｓ３細胞において発現した。肺癌Ａ５４９、バーキットリンパ腫ＤＲji、白 血病Molt４およびポリ骨髄細胞性白血病ＨＬ６０株においては発現が全く検出さ れなかった。興味深いことに、２つの転写物の大きさだけがリンパ芽腫性白血病 Ｋ５６２およびHeLa Ｓ３細胞、黒色腫Ｇ３６１および結腸腺癌ＳＷ４８０の９. ５kbより大きい転写物において約７kbあたりに検出できた。 ３．ＨＵ-Unc-５３/１でプロービングした正常ヒト組織 正常ヒト組織から得たポリ−Ａ＋ＲＮＡのノーザンブロットをファージＨＨ３ ｂの全体のインサートを用いてプロービングした。すべての組織において発現レ ベルは低く、最も高いレベルは心臓および胎盤、数倍低いレベルで脳および睾丸 、さらに低いレベルで骨格筋、膵臓、胸腺、結腸、小腸、卵巣および前立腺であ る。末梢血液白血球、肺、肝臓、腎臓、脾臓における発現は殆どない。 ４．Hu-ＵＮＣ-５３／２でプロービングした正常ヒト組織 同様のブロットの組み合わせをプライマー ＳＴ４６０３７の６５２bp断片でプロービングした。すべての組織において発現 は低く、中でも腎臓が最も高いレベルであり、それよりは心臓、胎盤、骨格筋お よび膵臓で低いレベルを呈した。脳と肝臓における発現は殆ど検出されなかった 。 hu-Unc-５３/１およびhu-Unc-５３/２ホモログは明らかに高度に遺伝子を調節 し、強い組織特異性を示し、かつおそらくはさらなる調節機構（すなわち、異な るプロモーターの異なるスプライシング）を示す。ｈｈ１５プローブにより同定 されたＲＮＡからの別のタンパク質は、カルボキシ末端ヌクレオチド結合ドメイ ンをおそらく共有する。Ce-ＵＮＣ-５３は複雑な遺伝子座にあり、複雑な転写単 位にあると示された。異なる転写物は、異なるシグナルおよび受容体、異なる組 織および異なる移動の方向に関してシグナル伝達経路の機能的な多様性が必 要であることを確実にするメカニズムであると考えられている。 新規転写物の存在または癌細胞株における発現レベルにおける観察された変化は 、施設におけるhu-Unc-５３/１およびhu-Unc-５３/２またはその細胞の形質転換 した状態の維持のための役割を示唆する。 Ce-Unc- ５３/１およびHu-Unc-５３/１のヌクレオチド結合ドメインで トランスフェクションした細胞での表現型上の変化 線虫の全長Ce-Unc-５３、マウス神経芽細胞またはヒトＭＣＦ−７乳癌細胞の 異所性発現はフィロポディアの増殖を増やし、運動性を高めることへ導くことを 見出した（未公開）。Ce-Unc-５３タンパク質の構造は、例えばシグナル伝達経 路（ＧＲＢ結合、リン酸化などにより）と調整するドメインによって、触媒ドメ インが正または負に調節されている大キナーゼまたはダイナミン（dynamin）の 構造を暗示する。それゆえ、発明者らはそれ自体によってヌクレオチドドメイン がマイクロフィラメント細胞骨格および運動性または波うち膜による運度ＵＮＣ -５３において観察された変化を含むことができるか否かを試験しようと決定し た。 Ce-Unc-５３/１およびHu-Unc-５３/１のヌクレオチド結合ドメインを結合する ヌクレオチドをコードするｃＤＮＡ断片は、ＣＭＶプロモーターで哺乳類発現ベ クターにクローニングした（実験手法参照）。 ｐＣＢ２０１（図１３）、Ｎ−末端hisおよびＴ７エピトープタグはhu-ＵＮＣ -５３/１ｃＤＮＡｈｈ１５で、インフレームで融合させられた。ｐＣＤＵ３には 大きなCe-Unc-５３断片を含み、ちょうど保存された"ＶＩＥＬＫＩＥＬ"ドメイ ン（図１２）の前から開始する。 空のｐｃＤＮＡ３ベクターまたはｐｃＤＮＡ３.１-His-LacZ（大腸菌β−ガラ クトシダーゼのための哺乳類動物発現ベクター）はコントロールベクターとして 使用された（偽トランスフェクション）。偽およびトランスフェクションしたＮ ４およびＭＣＦ−７間の差異は、Ｆ-アクチンの時間経過分析、ファゴキネシス および免疫細胞化学的特徴付けができる位相差顕微鏡およびノマルスキ（Nomars ki）顕微鏡を用いて分析した。 マウスＮ４神経芽腫細胞における表現型の変化 Ｎ４神経芽腫細胞はコントロール構築物ｐｃＤＮＡ３.１および線虫ＵＮＣ-５ ３構築物ｐＴＢ７２、ｐＣＤＵ２、ｐＣＤＵ３およびｐＣＤＵ４で安定してトラ ンスフェクションされた。空の発現ベクターでトランスフェクションしたクロー ンの集団は均一であり、野生型Ｎ４細胞に類似であった。それに対照的に、ｐＴ Ｂ７２、ｐＣＤＵ２,ｐＣＤＵ３およびｐＣＤＵ４でトランスフェクションした クローンの１／４〜５０％（それぞれ図１、１７、１５および１６参照）がはっ きりした表現型を保持した： １．野生型またはｐｃＤＮＡ３でトランスフェクションしたＮ４細胞（偽トラ ンスフェクションとして称する）は神経突起の増殖と呼ばれる伸展とともに中心 的な細胞体を示す。該集団の５％未満はラメラを保有する。現在、それら集団は 一般的に細胞体に位置し、神経突起の逆側にある（図２２a）。該ラメラはｈプ ラスミド差洗浄のアクチンスパイクパターンを示す。アクチン繊維の限られた分 枝が野生型またはｐｃＤＮＡ３トランスフェクションＮ４細胞において観察され る。側分枝は一層小さく、主たるアクチン分枝からはっきりと区別されるかもし れない（図２３a）。 ２．ホモロジーブロックＥを宿すｐＣＤＵ４で安定してトランスフェクション したＮ４細胞は、野生型Ｎ４の全体的な形態と同じ形態を示す（神経突起増殖と ともい細胞体も）。しかしながら、それらは頻度が高く、ラメラの形成のレベル を示す（図２２ｂ）。Ｆ-アクチン微小スパイクを含むこれらのラメラは、細胞 体と神経突起の増殖の両方で見出した（図２３ｂ）。野生型Ｎ４細胞は、それに 対照的に神経突起の増殖にラメラをめったに展示しない。 ３．Ｎ４細胞はｐＣＤＵ３で安定してトランスフェクションし、ホモロジーブ ロックＣ、ＤおよびＥをコードし、ＴＲＩＴＣ-ファロイジンで標識したラメラ 形成のさらに高いレベルを示し、該細胞はＦ-アクチンファイバーで囲まれてい るようであり、Ｆ-アクチンマイクロスパイクの束よりなる（図２３c）。これら のラメラの存在は、完全にその細胞の一般的外見を修飾してしまう。それらは平 らであるようであり、集団の９０％において、その細胞体と徐々に次から次へと 出てくるような大きな神経突起と区別は不可能である（図２２ｃ）。野生型様薄 い神経突起様の精製が存在するなら、それらは多数頻度高く分枝し、細胞の周辺 全体にあるであろう。 ４．ホモロジーブロックＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥをコードするｐＣＤＵ２でト ランスフェクションしたＮ４細胞の全体的な形態は野生型細胞に似ている。とい うのは、細胞体および神経突起生成は明らかに区別可能でありえるからである。 しかしながら、ｐＣＤＵ２トランスフェクションした細胞はさらに神経突起の生 成を示し、特に成長の終焉時には、これらは長くて多数枝分かれしたものである 。異なる細胞の神経突起の生成物が接触する場合、枝分かれは多く観察され、ネ ットワークの外見を与える（図２２ｄ）。ｐＣＤＵ２でトランスフェクションし たＮ４細胞は、長い放射線状のＦ-アクチンフィラメント（微小突起）の束を示 し、特に先端で分枝が見られる。手型アクチンスパイク間の空間は、たいていア クチンで埋められ、その結果小さいラメラ様構造となる。細胞間のネットーク様 分枝も束と成ったアクチン構造とラメラ様充填特徴の両方を示す。これらの高密 度でＦ-アクチン構造は時々細胞体上に見られ、該細胞のネットワーク様外観を 増強する（図２３ｄ）。 ５．プラスミドｐＴＢ７２で安定してトランスフェクションしたＮ４細胞は、 線虫ＵＮＣ-５３タンパク質全長をコードし、野生型細胞よりも剛直な構造を持 ち、最も紡錘様およびトライアングル様細胞として見られやすいようである。こ れらの細胞の角は手型ラメラ構造のレベル増加を示している。この特異的な表現 型は、該細胞が低密度で成長している場合に最もよく見られる（図２２e、図２ ３e）。 ヒト乳癌ＭＣＦ-７細胞における表現型の変化 ＭＣＦ-７細胞は安定してｐＴＢ７２、ｐＣＤＵ２、ｐＣＤＵ３、ｐＣＤＵ４ およびｐＣＢ２０１で安定してトランスフェクションされた。Lac-Ｚ-現ベクタ ーでトランスフェクションしたクローン集団は均一であり、野生型ＭＣＦ-７細 胞に類似である。対照的に、ｐＴＢ７２、ｐＣＤＵ２、ｐＣＤＵ３、ｐＣＤＵ４ およびｐＣＢ２０１でトランスフェクションされたクローンの〜３０％−５０％ は、上記のようにＮ４細胞として分析されたはっきりした表現型を有した： １．野生型および偽(ｐｃＤＮＡ３)トランスフェクションＭＣＦ-７細胞は異 型である。概して、それらは細胞周辺またはラメラによって囲まれた細胞群であ る。厚いフィロポディアと同様に胴は観察されることができる（図１９a）。該 細胞がＦＩＴＣ-またはＴＲＩＴＣ結合ファロイジンで染色される場合、Ｆ-アク チンアクチンストレス繊維が観察されることができ、しばしば細胞体を囲む環状 で見られる（図２０aおよび２１a）。細胞がこのように集められる場合、アクチ ンは細胞体の端に存在する。細胞の１０％未満が放射線上のＦ-アクチン微小突 起で満ちたフィロポディアを示す。時間経過分析において、該細胞は、細胞の端 で波うち膜運動を制限され非常に静かである。 ２．ｐＣＤＵ４でトランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞は、ホモロジーブ ロックＥをコードし、野生型細胞に比べて２つの主たる表現型上の差異を示す。 これらの細胞は、一層平坦であり、パンケーキ様の外見となる一層拡張されたラ メラ仮足を保持している。クローンの中には、野生型より多くのフィロポディア （図１９ｂ）を示すものもある。放射線状に組織されたＦ-アクチン繊維は、周 辺細胞を囲むラメラ中で明らかに観察することができる。これらのストレス繊維 は、野生型構造に類似しているが、環状方向より一層放射線状を保有している。 フィロポディアにおいては明らかに非組織化されたアクチンパッチの束の増加が 見られる（図２１b）。 ３．ｐＣＤＵ３でトランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞は、ホモロジーブ ロックＣ、ＤおよびＥをコードし、厳密に異なり、一定の形状を示す。該細胞は 一層集合しているので、野生型よりも一層小さく見える。すべての細胞は細胞体 を取り囲むフィロポディアを持つ（図１９c）。形態学的に、これらのフィロポ ディアは、Ｎ４神経芽腫細胞において観察されたように同じ「手形様」外見を持 つ。そのようなフィロポディアは偽トランスフェクションＭＣＦ-７細胞におい て殆ど観察されない。これらのフィロポディアは、Ｆ-アクチン繊維で満たされ ている。野生型細胞に比較して、きれいなアクチンストレス繊維が減少している （図２１c）。時間経過分析において、単独細胞ならびに細胞集団は、野生型細 胞の単独または集団よりも一層動的に浪打運動をするように見られる。細胞表面 上のフィロポディアの生成の「半減期」は、トランスフェクションした細胞で一 層短く、存在するフィロポディアの数もいつでも多い。 ４．ｐＣＢ２０１でトランスフェクションした細胞（ヒトを除くｐＣＤＵ４に 構造的に類似である）は、観察された表現型と波うち膜運動の活性とフィロポデ ィアの生成はｐＣＤＵ３より一層高いことを除いてｐＣＤＵ３でトランスフェク ションした細胞の表現型と殆ど区別がつかない表現型を持つ（図１８）。 ５．ｐＣＤＵ２でトランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞はホモロジーブロ ックＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥをコードし、その全体的な形態はｐＣＤＵ３でトラ ンスフェクションした細胞の形態と類似している。該細胞は一層集められ、野生 型および偽トランスフェクション細胞よりも多くのフィロポディアを示す（図１ ９ｄ）。フィロポディアは、一層長くなりがちな細胞体の周りにあるが、アクチ ン組織中で差異を示す。小さいフィロポディアは、ｐＣＤＵ３でトランスフェク ションした細胞において見られるアクチンの束と同じものを保有する。長いフィ ロポディアにおいて、該アクチン束は一層平衡であり、細胞体のまわりを放射線 状である（図２１ｄ）。 ６．ｐＴＢ７２で安定してトランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞は、ＵＮ Ｃ-５３タンパク質の全長をコードし、究極に集合し、かつ野生型細胞より一層 接着する傾向がある。該細胞は、ソーセージまたは管様形状で群集となり増殖す る。中心の細胞体の３倍以上の表層で大きく非常に薄いラメラの存在は、ｐＴＢ ７２でトランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞に独特である第２の形態上の特 徴を形成する。これらのシートは位相差顕微鏡下で観察するのは困難であるが、 ファロイジン染色した場合には非常に明瞭である。該ラメラは細胞または細胞群 の一側面から突き出し、野生型ＭＣＦ-７の「大きな」ものと異なり、薄くて長 い十字型アクチン繊維で満たされている（図２１e）。 これらの実験は以下の結果の組み合わせを導く：（図４７は線虫のＵＮＣ-５ ３中でのドメインスワッピング実験のデータをまとめている） １．Ce-ＵＮＣ-５３またはHu-ＵＮＣ-５３／１ドメインでトランスフェクショ ンしたマウスおよびヒト細胞はＦ-アクチン細胞骨格における変化（ラメラ仮足 、手型様フィロポディアおよび細胞表面上での「髪様」微小突起における増加お よび「Ｆ-アクチン繊維環」の関連した減少によって示されるように、その運動 性作用の性質と力学に明らかな影響を及ぼすことを示している）。 ２．この効果は異なる種および組織起源の２つの細胞型において見出されてい る：ＭＣＦ-７細胞（上皮細胞由来のヒト乳癌細胞）およびマウスＮ４神経芽腫 細胞である。ｐＣＢ２０１、ｐＣＤＵ３およびｐＣＤＵ４は、野生型Ｎ４細胞の にて頻繁に見られるが野生型ＭＣＦ-７細胞においては不在であるフィロポディ アの型をＭＣＦ-７細胞中で誘発し、Ｎ４細胞中では「正常」であるがＭＣＦ-７ 細胞においては異常であるような運動性作用のこれらの構築物による活性化を示 唆する。これにより、既存のプロセスの崩壊に対するような特異的な下流のプロ セスの活性化を示唆する。細胞タイプの中にはフィロポディアおよびラメラ仮足 を持つタンパク質の細胞型とともに移動することを好む細胞もあることがよく知 られている。 ３．ｐＣＢ２０１、ｐＣＤＵ３およびｐＣＤＵ４の発現は、実質的に同様のＦ -アクチン再構成およびフィロポディアとラメラ仮足の増大した生成物を与える 。しかしながら、ｐＣＢ２０１およびｐＣＤＵ３はｐＣＤＵ４よりこのプロセス においてかなり活性である。 ４．ｐＣＢ２０１は、ｐＣＤＵ４より非常に潜在的にフィロポディアの成長の アクチベーターになりやすく、線虫と脊椎動物の間の大きな進化的距離を考慮し て予期されるものである。 ５．これらの実験は、ＵＮＣ-５３のホモロジードメインＥ（推定ヌクレオチ ド結合ドメイン）をＦ-アクチン再構成およびフィロポディア／ラメラ仮足成長 を活性化する「ドメイン」として同定する。アミノ末端ホモロジーＡ、Ｂ、Ｃ、 Ｄの全身的な負かはドメインＥに存在する表現型の質および量的調節に導く。 ６．ホモロジードメインＣおよびＤ（ｐＣＤＵ３）は「ホモロジードメインＥ (ｐＣＤＵ４/ｐＣＢ２０１)に存在する基礎活性を増強する」。 ７．ホモロジードメインＢおよびＣ（ｐＣＤＵ２）はドメインＥの表現型を質 的に修飾し、ｐＣＤＵ３トランスフェクションした細胞より異なる液体のラメラ 仮足形成をへと導く。ラメラ仮足およびフィロポディアの形成を２つの関連する ラメラ仮足の形成に関して異なるRas−様Ｇ−タンパク質ＲＡＣおよびフィロポ ディアの形成にＣＤ４２を必要とする異なるシグナル伝達経路によって媒介され る。 ８．ヒトファミリーメンバーにおいて単離され同定されていない、さらに７０ ０アミノ酸を加えたホモロジードメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを含むｐＴＢ７２は 、一層限局したフィロポディアの産物と異なる形態学を与える。 ９．ｐＴＢ７２（線虫ＵＮＣ-５３全長）、ｐＣＤＵ３、ｐＣＤＵ４およびｐ ＣＢ２０１の発現レベルは、非常に低い。観察された効果はそれゆえ、優勢な負 の効果によるわけではないようである（他の細胞要素の化学式通りの枯渇のよう な）かまたはＵＮＣ-５３またはその断片によって媒介されるアクチン細胞骨格 における構造上の変化によるものではないようである。 ＵＮＣ-５３における多ドメイン生物体に対するデータは、アミノ末端ドメイ ンはドメインＥの活性に関して正（たとえばｐＣＤＵ３）および負（例えばｐＣ ＤＵ２）のコントロールを与え、該細胞（ｐＣＤＵ２、ｐＴＢ７２）中の新規活 性または活性の局在へと導く。ＵＮＣ-５３ファミリーの遠く関連したメンバー のヌクレオチド結合ドメイン（ＮＴＢ）が同様尾仮説を誘導するという本発明者 らの観察は、ＵＮＣ-５３ファミリーのこのドメインの一般的役割を示唆してい る。ＵＮＣ-５３の製薬学的モジュレーターおよびＵＮＣ-５３経路の要素を同定する ための細胞アッセイ 線虫またはヒト起源のｕｎｃ-５３配列のいずれかを含むプラスミド構築物で トランスフェクションした哺乳類およびヒト細胞が偽またはトランスフェクショ ンしていない親細胞に比較して明らかで特異的、かつ類似の変化を示すことが観 察された。これらの変化は細胞骨格、特にＦ-アクチン細胞骨格の機能、細胞移 動および直接的に細胞運動性に関連し、細胞運動性におけるインテグレーター機 能を果たすことができるＵＮＣ-５３遺伝子ファミリーを反映することに関連す る。 トランスフェクションにより得られ、これらの細胞での機能的なアッセイから 得られる細胞手段はＵＮＣ-５３の導入後に典型的に観察される運動性表現型の 特徴付けが可能になるだけではなく、それらは（１）ｕｎｃ-５３ファミリーメ ンバーの発現、か（２）ｕｎｃ-５３およびｕｎｃ-５３シグナル伝達経路におけ る要素の細胞性機能のいずれかで妨害される製薬学的化合物をスクリーニングす るために、容易に適応させることができる。 製薬学的モジュレーターの２クラスが認識される。 第１のクラスは、ＵＮＣ-５３のインヒビターまたはｕｎｃ-５３経路であり、 ｕｎｃ-５３トランスジーンまたはその側面によって誘発される記載された表現 上の変化を元に返す。 第２に製薬学的スティミュレーター、例えばトランスフェクションしていない 細胞において記載された「ｕｎｃ-５３」表現型を模擬するが認識され、誘発さ れる化合物のようなものを認識される。そのような化合物は既知のｕｎｃ-５３ 遺伝子の発現レベルの誘発または非コントロールによるか、またはｕｎｃ-５３ 遺伝子ファミリーの内在性（しかし同定されていない）メンバーを活性化するこ とによってそのようにされるかもしれない。本明細書での標的となる応用は、傷 および組織の修復、特に神経変性および神経可塑性などの特定の疾患である。 認識された化合物の性質の性質は小（生物）分子、バイオ分子（ペプチド、セ ンスまたはアンチセンス（オリゴー）ヌクレオチドまたはその化学的修飾）であ りえる。別法としてｕｎｃ-５３遺伝子ファミリーまたは例えばエピトープタグ 付き、枯渇、補集合または変異原ヌクレオチド構築物などの修飾されるプラスミ ド、ｐＴＢ７２、ｐｃＤＵ３、ｐｃＤＵ４、ｐｃＤＵ２、ｐＣＢ２０１またはそ の修飾物などの配列類似性に基づくｕｎｃ−５３ファミリーの新規メンバーに関 連する細胞または遺伝子の類似機能効果をもつ新規のｕｎｃ-５３−非関連遺伝 子をスクリーニングする際の遺伝子配列を含む一連のプラスミドヌクレオチド構 築物としてみなされることができるかもしれない。 クレームで認識する細胞アッセイは、３つの細胞株で例示される：ヒト乳癌細 胞株ＭＣＦ-７、マウス神経細胞株Ｎ４およびマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ-３Ｔ３ 細胞である。薬理学的アッセイは高度にスクリーニングモードにおある末端点の 定量化に焦点を当てている。多くのコンピューターにより、（セミー）自動化が 該分野において公知であり、本発明者らの研究室においても現在応用されている 。観察された表現型の細かい区別立てが与えられると第１の焦点が表現型または その局面を査定する形態学的アッセイに与えられる。Hu- ＵＮＣ-５３/１のヌクレオチド結合ドメインがＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞にお ける形質転換活性を保有する 生化学的遺伝子学的分析は、ＧＲＢ-２中のＵＮＣ-５３機能が細胞運動性をコ ントロールするシグナル伝達経路を媒介することを示唆する。癌細胞株中の変化 したhu-ＵＮＣ-５３/１ｍＲＮＡパターンの発生は、hu-ＵＮＣ-５３/１がそれら の細胞の形質転換した状態における役割を果たすか否かを調査する気にさせた。 それに、本発明者らはhu-ＵＮＣ-５３/１およびCe-ＵＮＣ-５３のＮＩＨ/３Ｔ ３細胞を形質転換するためのヌクレオチド結合ドメインの能力を試験した。ｐＣ Ｂ２０１構築物（hu-ＵＮＣ-５３）は波うち膜運動および細胞運動性を誘発し、 ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションされた。陽性コントロールはMycおよ びH-rasを誘発した。陰性コントロールは空のadn Rac １Ｎ１７およびcdc４２Ｎ １７を含んだ。 Ｇ４１８選択を生き残った細胞は接触阻害の喪失（焦点として成長する能力） に関してアッセイした。陽性コントロールは多数の焦点を製造することができた ２つの良く知られた癌原遺伝子MycおよびH-rasの組み合わせを含む。Ce-ＵＮＣ- ５３およびhu-ＵＮＣ-５３／１両方のヌクレオチド結合ドメインはこのアッセイ における焦点を誘発することができる（図２４および表１）。これはＵＮＣ-５３の機能が運動性の活性化に限られないことを示唆している。 ＵＮＣ-５３はこのさらなる機能をシグナル伝達経路を同定るように活性化する ことにより行った。癌原遺伝子は「コントロール」ドメインおよび「活性化」ド メインが癌原遺伝子ウイルス中の遺伝子の一部の染色体再配列によるかまたは組 み込みによって分離される。例えば、Erbチロシンキナーゼ受容体、OstRac-１の ヌクレオチド交換因子。 Hu-ＵＮＣ-５３/１は染色体１ｑ３１.１に局在する クローンＦ２２６（ＢＡＣＨ-１３５(０１４)）、ゲノム・システムズ、イン ク（Genome Systems，Inc.））はｐＣＲ２３１をプローブとして用いてヒト ゲノムＢＡＣライブラリーから単離し、hu-ＵＮＣ-５３/１遺伝子座から得られ るべき配列分析によって確認された。Ｆ２２６クローンから精製したＤＮＡはni ckトランスレーションによってジゴキシゲニンｄＵＴＰで標識された。標識した プローブを切断したヒトＤＮＡと組み合わせ、５０％ホルムアミド、１０％デキ ストランサルフェートおよび２×ＳＳＣを含む溶液中のＰＨＡ刺激末梢血リンパ 球から得た正常中期染色体にハイブリダイズする。特異的なハイブリダイゼーシ ョンシグナルを蛍光化した抗ジゴキシゲニン抗体でインキュベートした後、ハイ ブリダイズしたスライドＤＡＰＩでカウンター染色した。最初の実験は、Ａ群染 色体の長腕の特異的ラベリングという結果となった。第２実験は以前に１ｐ３４ にマッピングし、染色体１の動原体特異的プローブで同時ハイブリダイゼーショ ンすることによって確認された無名のプローブがＦ２２６に同時ハイブリダイズ したという結果となった。実験は染色体１の長腕および短腕の特異的標識という 結果となった。１０の特異的にハイブリダイズする染色体の計測はＦ２２６は染 色体腕１ｑのテロメアに結合した異種染色体-同種染色体から５２％離れている 位置にあり、１ｑ３１に対応する。８０中期細胞の総量で７２の既存の特異的標 識で分析された（図２５）。 １ｑ３１のＤＮＡ配列の増加は初期嚢腫（Genes Chromosom Cancer １２：２ １３−２１９（１９９１））の１０％より多く見出されている。染色体１ｑ３１ −ｑ３２の染色体腕上のＦ１３Ｂ遺伝子座付近に位置する推定腫瘍サプレッサー 遺伝子は、脳髄芽腫の病原に関係しているようである（Int．J．Cancer ６７： １１-１５（１９９６））。染色体Ｉのこの領域における異型接合性の喪失はヒ ト肝細胞芽腫の発達において影響される。１ｑ３１の部分的なトリソミーは患者 から単離したEwing's Sarcoma細胞株を見出した(cancer Genet Cytogenet １２: １-１９(１９８４))。Hu- ＵＮＣ-５３/２は染色体１１ｐ１５.１に位置している Hu-ｕｎｃ-５３/２に関するＢＡＣからのＦ３２９クローンからのＤＮＡはニ ックトランスレーションによりジゴキシゲニンｄＵＴＰで標識され、Ｆ２２６で のHu-ｕｎｃ-５３/１のＦＩＳＨのために使用した実験セッティングで応用した 。Ｆ３２９での最初の実験は、サイズ、形態およびバンドパターンに基づき染色 体 １１であると信じられるＣ群の染色体の中短腕の特異的標識となった。 染色体１１ｐ１５は、ヒト悪性腫瘍、初期乳がん（Aliら、Science ２３８:１ ８５−１８８８（１９８７））；ウィンクビスト(Win１vist１)ら、Cancer Res ．５３、４４８６−４４８８（１９９３））ならびにウィルム腫瘍（（Dowdy） ら、Science ２５４、２９３-２９５（１９９１）；コウェル（Cowell）ら、Br ．J．Cancer ６７、１２５９−１２６１（１９９３））、卵巣および精巣悪性腫 瘍（ロズ（Lothe）ら、Genes Chromosomes Cancer ７、９６−１０１（１９９３ ）；ヴァイツェル(Weitzel)ら、Gynecol．Oncol．５５、２４５−２５２（１９ ９４））、胃癌（バッファ（Baffa）ら、Cancer Res．５６、２６８−２７２（ １９９６））、肺癌（ルードヴィッヒ（Ludwig）ら、Int．J．Cancer ４９、６ ６１−６６５（１９９１）；フォン（Fong）ら、Genes Chromosomes Cancer（１ ９９４））副腎および肝臓の小児腫瘍（ビルン（Byrne）ら、Genes Chromosomes Cancer ８、１０４−１１１（１９９３））の変異において異型接合性(ＬＯＨ) の喪失を示す領域である。ＬＯＨが存在し、多発性ヒト癌の１１p１５で頻繁に 見出されることは、この領域における一群の腫瘍サプレッサー遺伝子または単独 の腫瘍サプレッサーのいずれかの存在を示唆する（セイジンガー（Seizinger） ら、Cytogenet．Cell genet．５８、１００８０−１００９６（１９９１））。 染色体移動実験は、染色体番号１１が、ヒト乳癌（ネグリニ（Negrini）ら、Can cer Res．５５、３００３−３００７（１９９５））およびウィルム腫瘍細胞（ ドゥディー（Dowdy）ら、Science ２５４、２９３−２９５（１９９１））の両 者の腫瘍発生性を抑圧することができることを示し、HeLa細胞中の腫瘍発生性を 抑圧することに責任を負っている遺伝子（ＨＴＳ１またはＳＴ５）であろう（リ ッキー（Lichy）ら、Cell Growth Diff．３、５４１−５４８（１９９２））。 １１０１５の異常点はまた、肺癌を含む多様な他の癌において同定された（コン ドウ（Kondo）ら、Oncogene９、３０６３−３０６５（１９９４））、ミエロイ ド白血病（トランスロケーション）（ナカムラ（Nakamura）ら、Nat．Genet．１ ２、Nat．Genet．１２、１５４−１５８（１９９６））、悪性星状細胞腫（欠失 ）（ファルツ（Fults）ら、Genomics １４、７９９−８０１（１９９ ２））、横紋筋肉腫（スクラブル(Scrable)ら、Nature ３２９、６４５−６４７ （１９８７））および肝臓細胞癌腫（フジモリ（Fujimori）ら、Cancer Res．５ １、８９−９３（１９９１））；ウォン（Wang）ら、Cell Genet．４８、７２− ７８（１９８８））。最近、ヒト乳癌において変異し、非培養初期ヒト乳癌にお いて欠失した遺伝子ＴＳＧ１０１をクローニングした（リ（Li）ら、Cell ８８ 、１４３−１５４（１９９７）。 ヒトＵＮＣ−５３ＳのＤＮＡ配列を用いた診断アッセイ ヒト組織のノザンブロットにおけるヒトｕｎｃ−５３転写物の発現と形質転換 した細胞株における発現は異なっており、３つの疾患に関して結合した遺伝子座 である得る１ｑ３１におけるhu-ｕｎｃ-５３／１の染色体遺伝子座における発現 の差異は、癌発生におけるhu−ｕｎｃ-５３の潜在的な示唆を示す。ＦＩＳＨに おいて、hu-ｕｎｃ-５３／１または／２完全なＤＮＡ配列またはその断片の完全 なＤＮＡ配列を用いることにより、これらの遺伝子は図２６に例示するように、 患者中で診断されることができる。同様に、診断用ＰＣＲアッセイにおけるこれ らのhu-ｕｎｃ-５３の使用はhu-ｕｎｃ-５３またはその断片の過剰発現を決定付 けるのに使用することができる。 顕微鏡表現型ＵＮＣ-５３トランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞に 関するアッセイ 偽およびｕｎｃ-５３トランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞を培養皿中に低 密度で播種し、容器に接着させた。生きた細胞またはカルノフスキー（Karnovsk y）の固定液での化学的固定の後での異なる時点での光学顕微鏡による検査は、 ｐＣＢ２０１において、ＭＣＦ-７トランスフェクションされた培養は、その境 界に多くのフィロポディアを持つ丸い形の細胞体である。対して、偽またはトラ ンスフェクションしていない細胞は優性である「平坦な」表現型で、フィロポデ ィアは殆どないかまたは全くない。質的な測定により、表現型におけるこの移動 の統計学的有意差を確認する（以下の表２）。 (*)クローンは２世代継代し、凍結させて保存したものであった。解凍した細胞 を一定濃度でトリプシン化し、単層頒布し、フラスコに播種し、基質に一終夜か ら４８時間まで接触させることが認められた。培養をカルノフスキー固定により 固定し、位相差顕微鏡を用いて調べた。同様の実験において、ゲニチシン（geni ticin）に対する耐性が確認された。 (**)値は顕微鏡視野当たりの細胞として発現されている。自動時間経過を用いた波うち膜運動および運動作用に関するアッセイ 細胞における動的な変化は当該技術分野において良く知られている。星状細胞 腫細胞におけるアクチン波うち膜運動などまたは例えば繊維症における細胞の活 性が全世界ネットワークで(http://www.stc.cmu.edu/ＣＬＩＭＩＢhp/Imggallpg /Moviespg/actinruffle.mov)または（http;//util.ucsf.edu/mitchi/Movies/mig ration.html）にて評価することができる。ｕｎｃ-５３でのトランスフェクショ ンの結果である動的変化が、時間経過ビデオ配列において最も良く認められるこ とができる。高倍率で「フィロポディア」の表示は、非常に程度が高い動的な行 動での微小突起の羅列を示す。粗い視覚推測は偽トラスフェクションＭＣＦ-７ 細胞に比較して、これらの現象は、pcＢ２０１トランスフェクション細胞におい て少なくとも１０倍の増加であると示唆している。ＮＩＨ-イメージにおけるこ れらのクローンの動きは本発明者らまたは出願人から要求されることができる。 時間経過ビデオイメージング可能性は、ＭＣＦ-７中のｕｎｃ-５３−誘発表現 型を認識するために最も有益な方法であり、薬理学的文脈において非常に完全な スクリーニングに従う。５分を圧縮した実時間は、例えば１２ウェルプレートに おけるpcＢ２０１トランスフェクションＭＣＦ-７細胞の運動性作用の強度を定 量するために十分な情報を供給する。さらに、アルゴリズムは時間内に適当に存 在する２つのイメージ中の細胞を比較することによって細胞の「運動領域」を自 動的に測定することができる当該技術分野にて記載されている（バン・ラレベッ ク（Van Learebeck）、１３、１−８）。ＭＣＦ-７細胞中のｕｎｃ-５３誘発Ｆアクチン補充を可視化するアッセイ 培養は化学的に固定し、洗浄剤で抽出され、ついでファロイジンを用いてＦ- アクチン（フィラメント−アクチン）のために蛍光で標識し（ウィーランド（Wi eland）ら、１９８５、Int．J．peptide & protein Res、２１３−１０）、ＵＮ Ｃ-５３トランスジーンでトランスフェクションするための劇的な表現型変化に 一層特異的な方法で示した。画像取り込みとＦ-アクチンパターンの分析を用い ることにより、当該技術分野において良く知られている画像分析アルゴリズムに より自動的な方法、Ｆ-アクチンフィラメントの位置、核部位に対して相対的な 基本的構造および分析を評価することができる。そのようなアルゴリズムは表現 型上の変化を区別することができ、したがって、トランスジーン誘発表現型の薬 理学的インヒビターの効果は偽または未トランスフェクション細胞中のｕｎｃ- ５３様表現型である。ｕｎｃ-５３誘発指向性および運動性の定量のためのファゴキネシスアッセイ 方法は実験の節で述べる。ファゴキネシスアッセイ中の異なる運動性作用を有 する２つの細胞集団が観察された。以下の表３において、ファゴキネシスアッセ イ中で線形の軌道を生み出す偽およびＵＮＣ-５３トランスフェクションＭＣＦ- ７の断片が示される。偽トランスフェクションＭＣＦ-７細胞において、６１％ の細胞が丸い軌道を描き（短および長軸は２倍の差異よりは小さい）、３９％の 細胞が「線形」軌道を生み出した（短および長軸は２倍の差異よりは大きい）。 pcＢ２０１トランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞は、「線形」の軌道を示す 細胞の断片が５０％までの増加を生み出した。断片の線形軌道における増加は全 配列Ce-ＵＮＣ-５３と配列でトランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞に関して 製造した。 さらに、培養容器の軌道の５０％中間領域の有意な増加が偽トランスフェクシ ョンしたＭＣＦ-７細胞に比べてpcＢ２０１中において観察された（表２）。こ れらの観察はＭＣＦ-７細胞中にｐＴＢ７２トランスフェクション同様pcＢ２０ １は、イン・サイチュ移動を増加させることができる。例えば、分布の増加、波 うち膜運動、または丸い集団中の非指向性運動性の他の形態によって。さらに、 ＭＣＦ-７細胞におけるCe-ＵＮＣ-５３トランスジーンは非指向性運動性（丸い 軌道）から断片が由来し、指向性移動（線形軌道）へと駆り立てられる。従って クローン２は指向性またはＵＮＣ-５３に関して細胞運動性の定量に製薬学的化 合物の影響を刺激するための分析をする手段を提供する。 微小管または微小管プラス（＋）端に対する細胞中のｕｎｃ-５３の 局在化のためのアッセイ ＵＮＣ-５３sは微小管上に存在することが示され、好ましくは細胞の微小管（ ＋）−端上に存在する。この局在はＵＮＣ-５３ファミリータンパク質の重要な 特徴を代表し、タンパク質のタンパク質においてはめったに観察されない。突然 変異が続くタンパク質ＡＰＣ中の微小管（＋）−端結合の不在は、結腸癌におけ るＡＰＣの役割において暗示されている（スミス（Smith）ら、１９９４、Cance r Res.、５４、３６７２）。アナロジーにおいて、適当なＵＮＣ-５３の機能は また、細胞中のその特異的な局在に依存するかもしれない。実施例で使用し た方法は、特にＵＮＣ-５３の微小管（＋）端結合に影響を及ぼす化合物のため の一連のアッセイのための基礎を形成する微小管により同時局在に関する基礎を 形成する。当業者は、ＵＮＣ-５３タンパク質の微小管への典型的な局在は、容 易に認識され、従って、有る化合物での処理がこのＵＮＣ-５３の局在に影響を 及ぼすかどうかの解釈に十分な解釈があることを良く知っている。さらにその上 、記載された方法の組み合わせにより（co-localization）当業者により方法を 記載され、「実験的手法」における方法によって例示される−微小管および微小 管（＋）端結合を廃止（または促進）することができる化合物を明白に確認する ことができる。 そのようなアッセイは、細胞株に適切である培養条件において化合物でＵＮＣ -５３を発現する細胞株の細胞培養を接触し、例えば、蛍光顕微鏡（ＧＦＰ-キメ ラ用）または細胞培養を固定し、免疫組織化学染色をＵＮＣ-５３（または断片 ）に関して行うことによって、イン・サイチュでＵＮＣ-５３（またはその断片 ）のインキュベーションおよび最終的な観察が行われる。同時局在に関して、Ce -ＵＮＣ-５３またはHu-ＵＮＣ-５３または蛍光検出ＧＦＰ-ＵＮＣ-５３キメラに 関する免疫組織化学が連続して行われたものと組み合わせて細胞または細胞株の 微小管に関する免疫組織化学の方法などが連続して行われた。線虫−ＵＮＣ-５３は微小管プラス端またはＧＴＰ−チューブリンに好んで結合 する。 ＵＮＣ-５３の生化学的特徴付けにより、ＵＮＣ-５３はＳＥＭ-５/ＧＲＢ-２ のＳＨ３結合ドメインに結合し、イン・ビトロでＦ-アクチンに結合することが 示された。ＧＲＢ２は細胞の皮質に限局され、細胞運動性の調節に関与するであ ろうと報告された。Ce-ＵＮＣ-５３のイン・ビボのサブ細胞性局在を決定するた めに、本発明者らは、一次的にＣＯＳ、HepＧ２およびＭＣＦ７細胞を全長Ce-Ｕ ＮＣ-５３ｃＤＮＡを含む発現構築物であるｐＴＢ７２でトランスフェクション した。本構築物は以前にＮ４神経芽細胞腫およびＭＣＦ７細胞中の細胞運動性を 活性化させるべく示したものである。本構築物はＣＯＳ細胞中で一次的に高い発 現を与え、ＭＣＦ-７においては、中程度から高い発現レベルを示し、HepＧ２細 胞中では中程度から低い発現レベルを与えた。ＵＮＣ-５３、チューブリン およびＦ-アクチンを可視化するために、トランスフェクションした細胞を抗−C e-ＵＮＣ-５３ mab １６-４８-２、ウサギ抗−ＵＮＣ-５３ポリクローナル、抗 −チューブリンmabＹＬ１/２チューブリンおよび蛍光標識したファロイジンの多 様な組み合わせで染色した。 全体的な微小管細胞骨格を持つＵＮＣ-５３同時局在発現の高いレベルで、し かし低い発現レベルで、ＵＮＣ-５３シグナルはプラス端で微小管の末端領域に 限局されている。非常に少ない発現の場合、該細胞の知覚に点様パターンを生み 出す。 Ce-ＵＮＣ-５３のＭＴＢプラス端ドメインをマッピングするために、本発明者 らはCe-ＵＮＣ-５３のアミノ末端が欠失されるpcDU２（図１７）およびpcDU３( 図１５)を製造した。これらの構築物ＵＮＣ-５３に対応するタンパク質は異なる ｕｎｃ-５３プロモーターからイン・ビボで作られると考えられている。免疫局 在化以前の一時的なトランスフェクションはこれらのタンパク質が細胞質性であ りえることを示した。Ｎ４神経芽細胞およびＭＣＦ７細胞における安定したトラ ンスフェクションにおいて、細胞にとってはもはや有害ではないが、フィロポデ ィア形成の活性化を非常に増加させる原因である可能性を示した。本発明者らは 、従って、（１）運動性の活性化からのCe-ＵＮＣ-５３毒性と（２）運動性の活 性化からの微小管結合を結び付けなかった。線虫およびヒト１ＵＮＣ５３の微小管結合の分析 線虫ＵＮＣ-５３の微小管結合ドメインを単離するために、Ｎ-末端ＧＦＰ融合 を行った。融合産物上でのＣ-末端欠失は微小管結合がタンパク質のＮ-末端半分 に局在化されていることを明らかにした。ＧＦＰ融合はまた、本タンパク質の微 小管結合特性を分析するためにヒト１-ＵＮＣ-５３で構築された。微小管との結 合は確認された。マウス抗血清を使用して、黒色腫株Ｇ３６１の微小管プラス端 上のそのままのＵＮＣ-５３の存在を示した。該抗体のエピトープ認識を一時的 にｐＬＭ４で発現された哺乳類細胞での免疫組織化学実験、ＧＦＰ-hu-１-ＵＮ Ｃ-５３融合タンパク質の発現によって確認した。結果 １．数種の細胞株においてｐＴＢ７２を一時的にトランスフェクションする場 合、線虫はマイクロチューブおよび好ましくはチューブリン繊維のプラス端ＵＮ Ｃ-５３と結合する。Ｎ４およびＭＣＦ-７細胞株中のプラスミドｐＣＤＵ３およ びｐＣＤＵ２のトランスフェクションは微小管同時局在化の観察という結果とな らなかった。ｐＣＤＵ４は、mab１６‐４８抗体(ＬＭＢＰ受託番号１３８３ＣＢ )を用いて全く染色せずという結果となり、そのことはこの抗体に対するエピト ープがｐＣＤＵ４によって発現された断片の外側に局在すると結論する。 微小管結合ドメインがタンパク質のＮ-末端に位置する可能性がある。この理 由として、本発明者らは線虫ＵＮＣ-５３配列の全長を有するＮ-末端ＧＦＰ融合 物および多様なＣ-末端欠失誘導体を構築した。これらの断片はＵＮＣ-５３のア ミノ酸１３９から７６０までのＮ-末端部位をコードする。 さらにその上、hu-１-ＵＮＣ-５３のクローニングした断片も微小管と結合す ることができるか否かを分析するために、hu１-Unc-５３タンパク質を持つＧＦ Ｐ融合をコードするプラスミドを構築し、ついで哺乳類動物細胞に導入した。こ の構築物の誘導体も構築した。 ２． a）Ｎ４神経芽細胞腫株における線虫Unc-５３ＧＦＰ融合の一時的発現 ｐＥＧＦＰ７２で一時的にトランスフェクションしたＮ４細胞はＧＦＰの融合 タンパク質および線虫ｕｎｃ-５３全長配列をコードした。逆顕微鏡において、 ＧＦＰ分子の蛍光は生体細胞において、行った。融合分子の低から中程度レベル で発現した細胞は１８時間から３０時間後の正常な形態を示した。これらの細胞 において、微小管とのＧＦＰ融合タンパク質の同時局在は明らかに示すことがで きる（図３８a）。低いがしかしなお顕著なＧＦＰ傾向を示した細胞中で、特異 的な微小管プラス末端結合が観察され得た（図３８b）。ＧＦＰ融合タンパク質 を高レベルで発現する細胞はマイクロフィラメントが可視化を困難にするよう処 理された。プラスミドｐＴＢ７２を用いてUnc-５３の一時的発現において、該タ ンパク質が細胞中で無毒であることが以前に観察された。ｐＥＧＦＰ７２での一 時的なトランスフェクション実験は同じ観察を与え、Unc５３タンパク質の少な くとも２つの特徴がＧＦＰ融合タンパク質において保存されていることを示し、 １つは微小管結合であり、該タンパク質の毒性が保存されていることを示した。 トランスフェクションされた細胞はパラホルムアルデヒドで固定し、チューブ リンは抗体ＹＬ１/２および抗マウス−ＣＹ３（ジャクソン・ラブズ（Jackson l abs））を用いて染色した。推定アッセイ 哺乳類細胞、本件ではＮ４をリポリヌクレオチドフェクション剤（lipofectＡ ＭＩＮＥ）を用いて、懸濁中に表層と接触しないようにトランスフェクションし た。ｐＥＧＦＰ７２でそれらの細胞をトランスフェクションした後、トランスフ ェクションされた細胞懸濁液は２４および/または９６ウェルプレート中で希釈 されることができ、表面にそれらを接触させることができた。各ウェルはスクリ ーニングすべきコレクションの異なる化合物を含んでいてもよい。２４時間後、 プレートは自動的に蛍光レベルに関してスクリーニングした。ＧＦＰ-線虫ＵＮ Ｃ-５３融合タンパク質の毒性を捨てた化合物を含むウェルは高レベル蛍光を示 す。融合産物に全く影響を持たない化合物が全くまたは低レベルの蛍光しか示さ ない。 ｂ）切り出されたＧＦＰ-線虫ＵＮＣ-５３融合タンパク質の一時的な発現 微小管結合が線虫ＵＮＣ-５３タンパク質において実際に起こるか否かをアッ セイするために、多様なＣ-末端欠失が構築された。ＧＦＰとの融合における線 虫ＵＮＣ-５３のＮ-末端部位の７６０アミノ酸から６７０アミノ酸をコードする ｐＥＧＦＰsmaおよびｐＥＧＦＰeclのトランスフェクションは、生体細胞におい て可視化されることができるように微小管結合という結果となった。微小管との 結合は、線虫ＵＮＣ-５３タンパク質の全長を発現する際に観察されるよりは少 ないが、明らかに繊維が観察された（図４０aおよび４１a）一層多量の蛍光が見 られる。これは、微小管結合が一層少ないことによるか、または融合タンパク質 の不安定性によるものであり得る。微小管との結合は、パラフォルムアルデヒド による固定の後でもメタノールによる固定の後でも観察することはできず、これ らのタンパク質の微小管ネットワークでの弱い結合または融合タンパク質の不安 定可能性の余分な指標を与える。低発現レベルで、中心体でＧＦＰ融合タンパク 質の結合は明らかに検出することができた（図４０bおよび４１b）。中心体は最 も高い微小管濃度で細胞中に局在する。 欠失構築物では全くプラス端結合は観察され得ず、それは細胞がＧＦＰ癒合タ ンパク質を低レベルで発現する場合でさえもであった。非常に低レベルの発現の 場合、中心体は明らかに検出することができた。 Ｎ４細胞をｐＥＧＦＰsacまたはｐＥＦＰＸbaでトランスフェクションした場 合、ＧＦＰとの融合において線虫ＵＮＣ-５３のＮ-末端部位の１３９アミノ酸お よび２５６アミノ酸をコードし、微小管結合は全く観察されなかった。これは線 虫ＵＮＣ-５３のＮ-末端の少なくとも６７０アミノ酸が微小管結合を保有するた めに必要であることを示している（図４２aおよび４２b）。 ｃ）ＧＦＰ-hu-ＵＮＣ-５３/１融合タンパク質および欠失融合体の一時的な発 現 プラスミドｐＬＭ４を一時的にＮ４神経芽細胞腫細胞にトランスフェクション し、ついでＧＦＰ蛍光を生体細胞で観察した。ＧＦＰとの融合において、hu１- ＵＮＣ-５３の利用可能な配列のＧＦＰ蛍光は微小管レベルで局在した。さらに 、低レベルの発現では、中心体および特異的なプラス端結合が見られる。ＧＦＰ との融合において線虫ＵＮＣ-５３誘導体で観察されるように、ｐＥＧＦＰsmaお よびｐＥＧＦＰeclにより発現され、ＧＦＰ結合はＧＦＰとの融合における線虫 のＵＮＣ-５３断片の全長によって観察されるようにあまり密集していないよう である。観察された融合タンパク質の不安定性は、微小管に対して少ししか結合 しないことまたは融合タンパク質の分解（図４３）のためであり得る。 d）黒色細胞腫瘍株Ｇ３６１上およびＮ４のｐＬＭ４上での一時的トランスフェ クションに関する免疫蛍光 導入 ノーザン実験は黒色細胞腫瘍株Ｇ３６１が線虫ＵＮＣ-５３のヒト１およびヒ ト２ホモログの両者に豊富に発現した。該タンパク質がこの細胞株に局在し得る か否かを調べるために、マウス血清の集合をこの細胞株に関して試験した。その 観察がhu-ＵＮＣ-５３認識のためであるか否かを証明するために、人造ではなく 、陽性血清をＧＦＰ−hu−１−Ｕｎｃ融合を発現するｐＬＭ４で一時的にトラン スフェクションしたＮ４細胞に応用した。 結果 以前にペプチド(ＤＮＲＴＬＰＫＫＧＬＹＲＹ)を注入したマウスからの２８. １と呼ばれた血清はパラホルムアルデヒドで固定されたＧ３６１細胞上での免疫 局在化実験に関して使用した。微小管プラス端結合は明らかに観察された。さら に、指向性移動を示す細胞において、成長円錐伸展が観察されたように、多数の 染色が成長円錐の先端において見られることができる（図４５）。微小管結合タ ンパク質がHu１-ＵＮＣ-５３タンパク質と同一であるか否か認識するためＮ４細 胞を一時的にプラスミドｐＬＭ４でトランスフェクションし、ついでパラホルム アルデヒドで固定し、血清２８.１で染色した。トランスフェクションされた細 胞のみが２８.１染色を支援し、そのことは該２８.１抗体がHu１-ＵＮＣ-５３- ＧＦＰ融合タンパク質を認識した（図４６）。これは血清２８.１によるＧ３６ １の成長円錐における微小管プラス端の染色がすくなくともヒト１および／また はヒト２ホモログの認識によるものであることを確認していると結論付けた。黒 色腫癌株Ｇ３６１における線虫ＵＮＣ−５３のヒトホモログの過剰な発現がヒト プラス端上で位置することを結論付けた。結論 a）ｐＥＧＦＰ７２により発現されるＧＦＰ−線虫ＵＮＣ−５３融合タンパク 質はＵＮＣ−５３活性を示す b）ｐＥＧＦＰ７２により発現されるＧＦＰ−線虫ＵＮＣ−５３融合タンパク 質は微小管結合を示す。 c）ｐＥＧＦＰ７２により発現されるＧＦＰ−線虫ＵＮＣ−５３融合タンパク 質は微小管プラス端結合により発現される。 c）プラスミドｐＥＧＦＰsmaおよびｐＥＧＦＰeclより発現されたＧＦＰ−線 虫ＵＮＣ−５３（欠失変異体）-融合タンパク質は微小管結合を示す。 d）プラスミドｐＥＧＦＰsmaおよびｐＥＧＦＰeclより発現されたＧＦＰ−線 虫ＵＮＣ−５３（欠失変異体）-融合タンパク質は微小管結合を示さない。 e）プラスミドｐＥＧＦＰxbaおよびｐＥＧＦＰsacより発現されたＧＦＰ−線 虫ＵＮＣ−５３（欠失変異体）-融合タンパク質は微小管結合を示さない f）プラスミドｐＬＭ４により発現したＧＦＰ-hu１-ＵＮＣ-５３融合タンパク 質は微小管結合を示す。 g）プラスミドｐＬＭ４により発現したＧＦＰ-hu１-ＵＮＣ-５３融合タンパク 質は微小管プラス端結合を示す。 i）血清２８.１は一時的にトランスフェクションした神経芽細胞腫細胞Ｎ４に おいてプラスミドｐＬＭ４により発現したようにＧＦＰ-hu１-ＵＮＣ-５３融合 タンパク質を認識する。 j）黒色腫細胞株における発現された線虫−ＵＮＣ−５３のヒトホモログ（少な くともＧＦＰ-hu１-ＵＮＣ-５３である）が微小管プラス端と結合する。実験的手法 材料 ＰＣＲ-ＲＡＣＥ実験に使用したオリゴヌクレオチドはユーロゲンティー（Eur ogentee）（ベルギー）にて合成された。放射性化合物は、アマシャム（Amersha m）から入手した。ｐＣＤＮＡ３.１真核生物発現ベクター、ヒト１ＧＴ １０ ｃ ＤＮＡライブラリー、マラソン−ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ、ヒトノーザンブロットお よびＴ７-tagモノクローナル抗体をインビトロゲン（Invitrogen）から購入した 。Ｎ４、ＭＣＦ７およびＮＩＨ３Ｔ３細胞をヤンセン・リサーチ細胞バンクから 検索した。 ＰＣＲ-ＲＡＣＥ条件 １．急速スクリーニングヒトｃＤＮＡライブラリーパネルを使用して、ＥＳＴク ローンgb..Ｒ４１０７１を増幅させた。使用したプライマーは、 ヒトゲノムＤＮＡも鋳型として使用した（１００ng/反応）。増幅条件は以下で あった：９４℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒、ついでこのサイクル を３５回繰り返して最終的に、７２℃で２０分間の最終伸長。このＰＣＴ断片を ベクターｐＣＲ２.１においてクローニングした。得られたプラスミドをｐＣＲ ２３１と称した。 ヒト心臓クローンをまた、以下の条件を用いてヒト心臓マラソンｃＤＮＡから ＲＡＣＥ-ＰＣＲにより製造した；９４℃で１分、７０℃で３０秒、７２℃で３ 分３０秒、ついでこのサイクルを３５回繰り返して最終的に、KlenTaq ＤＮＡ ポリメラーゼ（インビトロゲンから購入した）で７２℃で２０分間の最終伸長。 マウスホモログに関して、総ＲＮＡを記載されるようにＮ４マウス細胞から入 手した。最初鎖ｃＤＮＡを２μgrのＲＮＡからReady To-GoｃＤＮＡキット（フ ァルマシア）を用いて合成した。使用したプライマーは 増幅条件以下である：９４℃で１分、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒、ついで このサイクルを３５回繰り返して最終的に７２℃で２０分間の最終伸長。すべて の増幅産物はｐＣＲＩＩ-１にサブクローニングし、いくつかの独立クローンを 配列によって分析した。 ２．ヒト心臓／結腸腺癌ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーおよびヒト結腸腺癌ｃＤＮＡライブラリーを標 準的プラークハイブリダイゼーション法により、プローブとしてｐＣＲ２３１bp を用いてスクリーニングした。 ３．ＰＣＲを用いての５'伸長 λＨＨ３bクローンの５'末端に対するホモロジーを有する３つのプライマーを 製造した： ヒト心臓からのｃＤＮＡ増幅したライブラリー（クローンテク（Clonetech）） 上で３つの入り組んだＰＣＲ反応中でのλgt１０rvプライマー と共に使用した。その反応混合物は各プライマーを２５pmol、各ｄＮＴＰの１ｍ Ｍ、１μlのKlenTaqポリメラーゼ混合物（５０倍）および０.１ngＤＮＡを含む 。最初のＰＣＲのためのサイクルパラメーターは：９４℃で３分、９４℃で１分 、５１℃で１分、ついで７２℃で３分のサイクルを３５回繰り返し、最終的に、 ＨＵ５３rv１およびλgt１０rvをプライマーとして使用し、で７２℃で１０分間 の最終伸長である。kの最初のＰＣＲ産物の０.４μlを以下のパラメーターで組 み入れたプライマーの０.４μlを増幅した：９４℃で３分、９４℃で１分、５２ ℃ で１分、ついで７２℃で３分３０秒のサイクルを３８回繰り返し、最終的に７２ ℃で１０分間の最終伸長であった。第２の組み入れたＰＣＲ反応をＨＵ５３rv１ およびλgt１０rvをプライマーとして使用し、１/５０に希釈した精製２.４kb断 片の０.４μlに関して行った：９４℃で３分、９４℃で１分、５６℃で１分、つ いで７２℃で３分３０秒のサイクルを３５回繰り返し、最終的に７２℃で１０分 間の最終伸長であった。７７４kb増幅産物をｐＣＲ２.１にサブクローニングし 、プラスミドｐＣＢ２１０-１４となった。そのクローン断片をシークエンシン グにより分析した。この断片を５'方向に６９９bp伸長させた（図９参照）。 ４．ＰＣＲを用いた５'伸長 プライマーＨＵ５３rv４ をクローンｐＣＢ２１０-１４の５'末端に関して設計され、λgt１０rvと共に使 用し、以下のパラメーターでヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーの断片を増幅した： ９４℃で３分、９４℃で１分、６０℃で１分、ついで７２℃で３分３０秒のサイ クルを３５回繰り返し、最終的に７２℃で１０分間の最終伸長であった。８８７ bp断片をｐＣＲ２.１にサブクローニングし、プラスミドｐＣＢ２１２を得た。 そのクローン断片をシークエンシングにより分析した。この断片を５'方向に７ ６７bp伸長させた（図９参照）。 ５．プローブとしてｐＣＢ２１２の０.８kbインサートを用いたヒト心臓ライブ ラリースクリーニング EcoRＩ消化および精製したクローンｐＣＢ２１２をプローブとして使用し、標 準的プラークハイブリダイゼーション法を用いて、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリ ーをスクリーニングした（クローンテク）。陽性のファージをさらに２回プラー クスクリーニングにより精製した。λＤＮＡのインサート（キアゲン・ラムダ・ キットを用いて製造）をシークエンシングによって分析した。このｐＨＨ１４- ３はｐＣＢ２１２、ｐＣＢ２１０-１４およびλＨＨ３bの３'末端(４３４bp)を 重複する２６６３bpという結果となった（図９参照）。ＥＳＴ４６０３７からのＨＵ-Ｕｎｃ-５３/２の３'および５'伸展 MashU −Merck ＥＳＴ４６０３７ ＥＳＴ４６０３７配列を運搬する形質転換した細胞をリサーチ・ジェネティッ クス（Research Genetics）に注文した。プラスミドＤＮＡを標準的プロトコー ルを用いて単離し（キアゲン・プラスミド・ＤＮＡ単離用キット）、インサート の配列を決定した。 ＲＡＣＥによるＥＳＴ４６０３７の３'伸展 Marathon-Ready ｃＤＮＡｓ（クローンテク）はＲＡＣＥ実験における鋳型と して使用するために準備したアダプター−ライゲーションした二本鎖ｃＤＮＡの 前もって作成した「ライブラリー」である。５ml Marathon-Ready ｃＤＮＡを通 常の５０mlＲＡＣＥに鋳型として使用した。ＲＡＣＥ混合物は１×KlenTaqＰＣ Ｒバッファー、０.２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１×アドバンテージKlenTaqポリメラー ゼ混合液（クローンテク）、０.１５ｍＭ ＡＰ１アダプタープライマーおよび０ .１５ｍＭ ＲＡＣＥ遺伝子特異的プライマーを含んだ。増殖条件は以下の通りで ある： ９４℃で１分、９４℃で３０秒、７２℃で４分を５サイクル、９４℃で３０秒お よび７０℃で４分、９４℃で３０分および６８℃で４分を２５サイクルであった 。ＲＡＣＥ産物をＡＰ２アダプターおよび遺伝子特異的組み込みＰＣＲプライマ ーとともにＰＣＲ中に鋳型として使用した。特別に組み込んだＰＣＲ断片をｐＣ Ｒ２.１にクローニングし（ＴＡクローニングキット、インビトロゲン）、イン サートの配列を決定した。 遺伝子特異的プライマー（ＥＳＴ４６０３７-Ｆ１） 特異的プライマー（ＥＳ４６０３７-Ｆ２） Marathon ｃＤＮＡライブラリー：ヒト胎盤。MashU-Merck ＥＳＴ ９２３７９３ ＥＳＴ９２３７９３配列を運搬する形質転換した細胞をリサーチジェネティク スに注文した。プラスミドＤＮＡを標準的プロトコールを用いて単離し（キアゲ ンプラスミドＤＮＡ単離用キット）、インサートの配列を決定した。ＲＡＣＥ断片１．４および３．７、ＥＳＴ４６０３７の５'伸長 方法は以前に記載した。遺伝子特異的プライマー（ＥＳＴ４６０３７−Ｒ１） 組み込み遺伝子特異的プライマー（ＥＳＴ４６０３７−Ｒ２） ブラリー：ヒト胎盤。ＲＡＣＥ断片Ｂ２.１、Ｄ２.１、Ｈ２.１；ＥＳＴ４６０３７の５'伸長 方法は以前に記載した。遺伝子特異的プライマー（９７０１０７０９） 組み込み遺伝子特異的プライマー（９７０１０７０８） ブラリー：ヒト胎盤（断片Ｂ２.１）。 ヒトHeLaＳ３（断片Ｄ２.１）ヒト結腸腺癌ＳＷ４８０（断片Ｈ２.１）。 ＰＣＲ断片Ｅ２.３、Ｃ２.３ ＥＳＴ４８５０６８はＨＵ-ＵＮＣ-５３/１の５'末端と同様ではあるが同一で はない。１つの３'ＥＳＴ４８５０６８プライマーと１つの５'ＨＵ-ＵＮＣ-５３ /２プライマーからなるプライマーの組は、断片を増幅させるＰＣＲに使用した 。1gt１０ヒト胎盤急速スクリーニングライブラリー(断片Ｃ２.３)またはヒトHe LaＳ３ Marathon ｃＤＮＡ(断片Ｅ２.３)をＰＣＲで鋳型として使用した。５０m lの反応混合液は１×ＰＣＲ ＩＩバッファー（パーキン−エルマー）、１.５ｍ ＭMgCl２、０２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０１５ｍＭの順方向および逆方向プライマー 、２.５Ｕ AmpliTaq Gold(パーキン−エルマー）および１mlの鋳型を含む。サイ クルパラメーターは９５℃で５分、９４℃で４５秒、６５℃で４５秒、６５℃で ４５秒および７２℃で２分を３５サイクルであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲ ルから切り出し、ゲル抽出用キット（キアゲン）を用いて精製し、その１mlを上 記と同様の条件を用いて第２回目のＰＣＲで使用した。そのＰＣＲ産物を精製し （キアゲンＰＣＲ精製キット）、直接シークエンシングした。 プライマー： ＰＣＲ断片Ｅ１.３−３ ＥＳＴ０１２２２は相同であるが、ＨＵ-Ｕｎｃ-５３/１の５'末端と同一では ない。１つの３'ＥＳＴ０１２２２プライマーと１つの５'ＨＵ-Ｕｎｃ-５３/２ プライマーからなるプライマーの組は、この断片を増幅させるＰＣＲに使用した 。ヒトHeLaＳ３ Marathon ｃＤＮＡをＰＣＲで鋳型として使用した。５０mlの反 応混合液は１×ＰＣＲ ＩＩバッファー（パーキン−エルマー）、１.５ｍＭMgCl ２、０.０２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０.１５ｍＭの順方向および逆方向プライマー、 ２.５Ｕ AmpliTaq Gold（パーキン−エルマー）および１mlの鋳型を含む。サイ クルパラメーターは９５℃で５分、９４℃で４５秒、６５℃で４５秒、６５℃で ４５秒および７２℃で２分を３５サイクルであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲ ルから切り出し、ゲル抽出用キット（キアゲン）を用いて精製し、その１mlを上 記と同様の条件を用いて第２回目のＰＣＲで使用した。そのＰＣＲ産物を精製し （キアゲンＰＣＲ精製キット）、ｐＣＲＢ２.１にクローニングした。そのイン サートの入れＵＮＣ-５３Ｔを決定した。ＲＡＣＥ断片Ａ２.２-２、Ｂ２.１-４、Ｄ２.１-５；５'伸長 方法は以前に記載した。遺伝子特異的プライマー（９７０４１７０１） 組み込み遺伝子特異的プライマー（９７４１７０２） ブラリー：ヒト胎盤（断片Ａ２.１-２）。 ヒトHeLaＳ３（断片Ｂ２.１-４） ヒト結腸腺癌ＳＷ４８０（断片Ｄ２.１−５）。翻訳−開始スプライシング変異体、断片Ｄ４.１-１、Ｊ４.１.４、Ｇ４.１.１、 Ｆ４.１.２ ４つの異なる翻訳開始スプライシング変異体を５'ＲＡＣＥによって検出した。 方法は以前に記載した。遺伝子特異的プライマー（９７０８０８０３） 組み込み遺伝子特異的プライマー（９７０８０８０４） Marathon ｃＤＮＡライブラリー：ヒト結腸腺癌ＳＷ４８０（断片Ｄ４.１-１） 遺伝子特異的プライマー（９７０８０８０１） 組み込み遺伝子特異的プライマー（９７０８０８０２） Marathon ｃＤＮＡライブラリー： ヒト黒色腫（断片Ｊ４.１.４）。 ヒトHeLaＳ３（断片Ｇ４.１.１） ヒト胎盤（断片Ｆ４.１.２）。ＤＮＡシークエンシング ＰＣＲ増幅産物およびｃＤＮＡクローンをpBluescriptベクター（ストラタジ ーン（Stratagen））またはＰＣＲ-ＩＩaベクター（インビトロゲン）のいずれ かにサブクローニングし、修飾したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ、 ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（Sequenase）、（United States Bio chemicdal））でダイデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により 手動でシークエンシングするか、または蛍光ターミネーターキット（パーキン・ エルマー）を用いてアプライド・バイオシステムズ・３７３・ＤＮＡシークエン サーで自動的にシークエンシングした。ＲＮＡブロット ヒト多組織ノーザン（ＭＴＮ-１、クローンテク）は、８種類の異なるヒト組 織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓）であり、各レーン２ mgのポリＡ＋ＲＮＡにて含まれ、かつＭＴＮ-ＩＩヒト多組織ノーザンは脾臓、 胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、結腸および末梢白血球からの各レーン２mgの ポリＡ＋ＲＮＡに含み、製造者の指示によりハイブリダイズし、０.１％×ＳＳ Ｃ:０.２％ＳＤＳ中で５５℃にて洗浄した。また、クローンテクより、ヒト癌細 胞株からのポリＡ＋ＲＮＡブロット(メラノーマＧ３６１、肺癌Ａ５４９、結腸 腺癌ＳＷ４８０、バーキットリンパ腫Molt４Raji、リンパ芽球性白血病Ｋ５６２ 、HeLa Ｓ３および前骨髄球性白血病ＨＬ６０)を調べた。プラスミドの構築 プラスミドｐＣＤＵ２（図１７）をｐＴＢ７２から２.８ｋｂApaＩ-NarＩ断片 をクローニングすることによって構築し、後者の制限部位はクレノウ酵素でブラ ントエンドにされ、ｐｃＤＮＡ３はEcoRＶおよびApaＩで消化した。ｐＣＤＵ２ はホモロジーブロックＣ、ＤおよびＥをコードした。プラスミドｐＣＤＵ３（図 １５）はｐＴＢ７２から１.９ｋｂApaＩ-NdeＩ断片をクローニングすることによ って構築し、後者の制限部位はクレノウ酵素でブラントエンドにされ、ｐｃＤＮ Ａ３はEcoRＶおよびApaＩで消化した。ｐＣＤＵ３はホモロジーブロックＡ、Ｂ 、Ｃ、ＤおよびＥをコードした。プラスミドｐＣＤＵ４（図１６）はｐＴＢ７２ から１.４ｋｂApaＩ-StyＩ断片をクローニングすることによって構築し、後者の 制限部位はクレノウ酵素でブラントエンドにされ、ｐｃＤＮＡ３はEcoRＶおよび ApaＩで消化した。ｐＣＤＵ４はホモロジーブロックＥをコードした。 真核生物細胞におけるヒトＵＮＣ-５３のドメインの発現 １．ｐＣＢ２０１：真核生物細胞His-tag、Xpress Ab tag発現ベクターにクロ ーニングした線虫ＵＮＣ-５３遺伝子のｐＣＤＵ４発現構築物に対するヒト１ホ モログの同等構築物。 適切なBamHＩ部位をhh１５fwプライマー で増幅することによってｐＨＨ１５オープンリーディングフレーム上で操作した 。ついで、増幅した断片を移動させてBamHＩおよびEcoRＩで消化したｐＣＤＮＡ ３.１.His-A-ベクターとした。ｐＣＢ２０１（図１３）と呼ばれるこの新規プラ スミドは、His-tagおよびまたＴ７エピトープtagその後４９アミノ酸アミノ末端 断片によってヒトホモログの１２５５〜１６２７のアミノ酸配列が続くものを含 む融合タンパク質コードするｃＤＮＡを製造する。ｐＣＢ２０１はまた、配列に よりチェックされ、Ｎ４、ＭＣＦ７およびＮＩＨ３Ｔ３細胞中で行われる適当な トランスフェクション実験において、nが使用された。 ２．ｐＬＭ５：真核生物細胞His-tag、Xpress Ab tag発現ベクターにクローニ ングされたｐＣＤＵ３発現構築物に対するヒト１ホモログの同等構築物。 ファージＨＨ３bをXhoＩを用いて線形化する。BamHＩおよびXbaＩ制限部位は Ｕ３-Ｂfw をプライマーとして使用して、ｐＨＨ３bオープンリーディングフレームに関し て製造した。ついで、この増幅した断片をBamHＩおよびXbaＩで消化して、pBlue script ＫＳに移動する。このｐＣＢ３００と名付けたプラスミドのシークエン シングは、ＤＮＡ配列の４２３７位置でのグアニンからアデニンへの変化のため にセリンからアスパラギンへとアミノ酸が変化することを示した。この欠点は、 ｐＬＭ１（下記参照）の１４１８bp断片（NarＩおよびXbaＩを酵素として使用す る）を同酵素で消化したｐＣＢ３００にクローニングすることによって修復した 。ｐＬＭ６（図５３）と名付けられたこのプラスミドのＨＨ３ｂ断片は、ついで BamHＩおよびXbaＩを用いて除去して同酵素で消化したｐｃＤＮＡ３.1/HisＡと した。この新規プラスミドはｐＬＭ５（図５２）と名付けられ、His-tagおよび Ｔ７エピトープtagを宿している４９アミノ酸アミノ末端断片、続いてＨＵ-ＵＮ Ｃ-５３／１の１０６９〜１６２７アミノ酸が続くものからなる融合タンパク質 をコードするｃＤＮＡを製造する。プラスミドｐＬＭ５は、シークエンシングに よってチェックし、Ｎ４細胞中で行われた一時的および安定したトランスフェク ション実験に関して使用した。該プラスミドｐＬＭ１はPvuＩＩを用いて製造さ れ、ｐＨＨ１４-３の部分的なBamHＩ消化断片およびファージＨＨ３ｂのBamHＩ およびSpeＩ消化断片をSmaＩおよびSpeＩで消化したpBluescript ＫＳにクロー ニングした。ｐＬＭ１はこの瞬間に、利用可能なＨＵ-ＵＮＣ-５３の完全な転写 物を含む（図９参照）。 ３．ｐＣＢ２５１：真核生物細胞His-tag、Xpress Ab tag発現ベクターにクロ ーニングしたｐＣＤＵ２発現構築物に対するヒト１ホモログの同等構築物。 ファージＨＨ３ｂをXhoＩを用いて線形化した。BamHＩおよびXbaＩ制限部位を ライマーとして用いてｐＨＨ３bオープンリーディングフレーム上で製造した。 ついで、増幅した断片をｐＣＲ２.１に移動させた。このプラスミドをｐＣＢ２ ５０と名付けた。ｐＨＨ３ｂ断片をBamHＩおよびXbaＩを用いてｐＣＢ２５０か ら除去し、同酵素を用いてｐｃＤＮＡ３.１／HisＣにクローニングした。このｐ ＣＢ２５１（図５５）と名付けたプラスミドをシークエンシングによってチェッ クした。ｐＣＢ２５１はHis-tagおよびＴ７エピトープtagを宿す４９アミノ酸ア ミノ末端断片ののちにＨＵ-ＵＮＣ-５３／１の部分的転写物のアミノ酸８２８か ら１６２７が続くものからなる融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを製造する 。ｐＣＢ２５１をＮ４細胞中で行われた一時的および安定したトランスフェクシ ョン実験に関して使用した（図５６参照）。 ４．ｐＬＭ３：真核生物細胞His-tag、Xpress Ab tag発現ベクターにクローニ ングしたHu-Unc５３１の部分的転写物 ｐＬＭ１をEcoRＶおよびXbaＩを用いて消化した。この断片をｐｃＤＮＡ３.１ ／HisＢにクローニングし、同酵素で消化した。ｐＬＭ３はHis-tagおよびＴ７エ ピトープtagを宿す４９アミノ酸アミノ末端断片ののちに、その時に利用できる ＨＵ-ＵＮＣ-５３／１の転写物のアミノ酸１から１６２７が続くものからなる融 合タンパク質をコードするｃＤＮＡを製造する。ｐＣＢ２５１をＮ４細胞中で行 われた一時的および安定したトランスフェクション実験に関して使用した。 ５．真核生物細胞ＧＦＰ発現ベクターにクローニングされたＨＵ-Ｕｎｃ-５３ /１の部分的転写物 ｐＬＭ１をClaＩおよびXbaＩを用いて消化した。この断片をｐＥＧＦＰ-c１に クローニングし、AccＩおよびXbaＩで消化した。このプラスミドをｐＬＭ４と名 付けた。このプラスミドは、ＨＵ-Ｕｎｃ-５３／１の転写物のアミノ酸１から１ ６２７が続くＧＦＰを含む融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを製造する。ｐ ＬＭ４をＮ４細胞中で行われた一時的および安定したトランスフェクション実験 に関して使用した（図４３および４６参照）。 ＭＣＦ-７細胞の安定したトランスフェクション： 細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ;ギブコ（GibcoＢＲＬ））および１００ Ｕ/mlペニシリン（ギブコ）および１００μg/mlストレプトマイシン）を補った 標準培養培地（ダルベッコＭＥＭ（Durbecco's ＭＥＭ）、４５０mg/lグルコー ス、８６２mg/l Ｌ-アラニル−Ｌ-グルタミン、１１０mg/lピルビン酸ナトリウ ム；ギブコ）を用いて７５cm²フラスコ中に２×１０⁶細胞の密度で播種した。 その培養物を１０％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で約７０％のコンフルエンシーに達 するまで（約１８時間）増殖させた。その培養培地を除去し、１０％ＦＣＳを補 った１０mlＭＥＭ-ＨＥＰＥＳ（ギブコ）を細胞に加えた。その細胞をさらに３ ７℃で４時間標準的な無菌大気中でインキュベートした。ＤＮＡ−CaCl₂を同時 に０．１×ＴＥ(１ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７.２、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８ )３０μgＤＮＡと０.１ml１.２５Ｍ CaCl₂/ＨＥＰＥＳ(１.２５Ｍ CaCl２、０. １２５Ｍ ＨＥＰＥＳ;ｐＨ７.０５)を混合することによって調製した。０.１× ＴＥを加えて最終容量を０.５mlにした。ＤＮＡ−CaCl₂を０.５ml ＢＳ/ＨＥＰ ＥＳ(２５ｍＭＨＥＰＥＳ、０.２５Ｍ NaCl、０.０１ＫＣｌ、１.４ｍＭ Na₂HPO₄ 、０.０１Ｍグルコース、ｐＨ７.０５)に滴下して加え、後者の液を通して無菌 の通気をピペッティングにより行った。ＤＮＡ−Ca₃(PO₄)₂沈殿を３７℃で１０ 分間静置した。ＤＮＡ−Ca₃(PO₄)₂沈殿をボルテックスし、細胞にＨ₂Ｏにストッ クした１００μlの０.０１Ｍクロロキニン（シグマ）とともに加えた。無菌標準 大気中で３７℃で４時間のインキュベートの後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳ で洗浄した（ギブコ）。培地２５mlを加え、細胞を１０％ＣＯ₂雰囲気中で静置 した。４８次間のインキュベートの後、細胞をクローン選択の２週間前に(６０ ０μg/mlＧ４１８(ダチェファ（Duchefa）)回収し、希釈し、培養した。偽トラ ンスフェクションしたＭＣＦ-７をβ−ガラクトシダーゼトランスジーンに関し て陽性であった。ＭＣＦ-７における安定したトランスフェクションはジェネテ ィシンの不在下で、４回細胞を継代することによって評価し、ついで選択用剤に 再び曝した。これらの実験において、ＵＮＣ-５３または偽トランスフェクショ ンした細胞が増殖し、一方未トランスフェクションしたＭＣＦ-７細胞は非常に ゆっくりとした速度で増殖した。Ｎ４神経芽細胞腫細胞の安定したトランスフェクション 細胞を１０％ウシ胎児血清、０.１４％Na₂ＣＯ₃、２ｍＭグルタミンおよび １００Ｕ/mlペニシリン（ギブコ）および１００μg/mlストレプトマイシン）を 補った標準培養培地（ＭＥＭ Rege３;ギブコＢＲＬ）を用いて２５cm²フラスコ 中に２×１０⁶細胞の密度で播種した。その培養物を１０％ＣＯ₂雰囲気中、３７ ℃で終夜増殖させた。トランスフェクション混合物を６００μlオプティメン１( optimen １)中の１２μgＤＮＡを６００μlオプティメン１中の３６μlLipofect ＡＭＩＮＥ（ギブコ）に加えることによって調製した。これは最初の溶液を第２ 溶液に滴下添加して行われた。混合物を１.８mlのオプティメン１を加えた後、 室温で、３０分間静置した。しばらくその細胞培養をオプティメン１で２回洗浄 し、トランスフェクション混合物３mlを加えた。その培養物を標準的な無菌大気 中で静置した。４時間後、３mlまたは標準的な培養培地を加え、３７℃で１０％ のＣＯ₂下でその培養物を静置した。１８時間後、その培養物をＰＢＳで洗浄し 、ついで新鮮な通常の培養培地を加えた。さらに２４時間後、細胞をクローン選 択の２週間前に（７５０μg/mlＧ４１８）回収し、希釈し、培養した。免疫蛍光の細胞の固定 培地をカバースリップを含む９cm²ウェルから除去した。ＰＨＥＭ（１g/lグル コース、０.４g/l ＫＣl、８g/l NaCl、０．０６g/l ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０４７５ g/lＮＨ₂ＰＯ₄、０．３５g/l NaHCO₃、１．５１g/l ＰＩＰＥＳ、０．７６g/l ＥＧＴＡ、０．１９g/l MgCl₂；ｐＨ６）中の４％パラホルムアルデヒド溶液（ シグマ）を室温で３０分間添加した。固定溶液を除去し、ついでカバースリップ をＰＨＥＭにより１０分間の洗浄を３回行った。ついで、カバースリップを０. ５％Triton-Ｘ１００（Serva）を含むＰＨＥＭ中に３０分間置き、その後スライ ドをＰＨＥＭにより１０分間、洗浄を３回行った。ついでカバースリップを０. ２％Tween（シグマ）を含むＰＢＳ(０.１４Ｍ NaCl、２.７ｍＭＫＣｌ、１０ｍ Ｍ ＮＨ₂ＰＯ₄、１．８ｍＭ ＫＨＰＯ₄、ｐＨ７.３）下で少なくとも４℃で１時 間置いた。 免疫蛍光染色 そのカバースリップをチューブリンおよび/またはmab １６‐４８‐２モノク ローナル抗体またはＵＮＣ-５３の抗−ＵＮＣ-５３（ｇｐ４８）ポリクローナル 抗体ニ対するＹＬ １/２である適当に希釈した３５μlの抗体上で転換した。そ のスライドを４℃で少なくとも１８時間静置した。ついで１次抗体の剰余分をＰ ＢＳ-Tweenで１０分間、３回洗浄することによって取り除いた。そのスライドを ついで第２抗体で第１次抗体同様に処理した。Ｆ-アクチンをインキュベーショ ンバッファーにＴＲＩＴＣまたはＦＩＴＣ結合したファロイジンを含むことによ って標識した。第２抗体上で逆にされたスライドは室温で約１時間そのままにさ れた。ついでそのスライドをＰＢＳ-Tweenで１０分間、３回洗浄し、１回はＰＢ Ｓで洗浄した。カバースリップをヘルツォーク（Herzog）らにより記載された培 地スライドにマウントした。（Cell Biology:a laboratory handbook、１９９４ 、アカデミック・プレス、３５５−３６０）。少なくとも２時間後、スライドを 分析にかけるべく準備した。 時間経過分析 細胞培養物の反応および増殖の移動の分析は、温度制御ステージ（３７℃）を 備えた位相差顕微鏡下でコンフルエントに達していない培養物を置くことによっ て行われた。画像はマッキントッシュppc ８１００ランニングＮＩＨ画像１.６ ０版中のＳＣＩＯＮ ＬＧ３断片に結合したＣＣＤカメラ（ＣＯＨＵ ４９１２） を用いて記録した。画像を同間隔で１５秒から１分の間にて、１時間半から２時 間かけて記録した。画質の向上および再生はＮＩＨ画像において行った。 ファゴキネシス 多数の細胞型が金コロイドコート培養プラスチックまたはガラスの上を移動し 、置換しまたは移動の間金の芝をファゴサイトシスすることが示された。そのま ま残された軌道は砂防の運動性および／または移動の定性および定量測定である 。基本的な方法は、他の場所（アルブレッハー−ブレラー（Albrechr-Buehler） 、Cell、１１：３９５、ゼッター（Zetter）、１９８０；Nature ２８５：４１ ；オキーフェ（O'Keefe）ら、１９８３；J．Invest．Dermatol.、８５：１３０ ）に詳細に記載されている。培養皿をアルブレヒト−ブレーラーにより記載され た（１９７７）ようにゼラチンおよび金でコートした。Ｕｎｃ−５３および偽ト ランスフェクションしたＭＦＣ−７をプレートに低密度で播種し、プレートに接 着することができるようにさせ、終夜動き回らせた。 細胞を化学的に該プレートに固定し、洗浄し、自然乾燥させた。金の芝の画像 を自動化ビデオ顕微鏡を用いて取り込んだ；ウェルの複合画像を作成し、単細胞 ファゴキネシスの路をＳＣＩＬ^TMソフトウェアにおける自家製方法を用いて測定 した。 線虫−Ｕｎｃ-５３は微小管プラス端またはＧＴＰ-チューブリンに好んで結合 する １．ｐＥＧＦＰ-Ｃ１における線虫ｃＤＮＡのクローニングおよびＣ末端欠失 誘導体の構築 a）ＧＦＰ-ＵＮＣ-５３ Ｎ-末端融合の構築： ＰＣＲ実験をｐＴＢ７２を鋳型とし、およびｃｐ１７ て使用して標準的条件下で行った。得られた０.４kb断片は線虫ＵＮＣ-５３のＮ -末端断片をコードし、ベクターpCR２.１においてクローニングし（オリジナル ＴＡクローのヌクレオチドキット、インビトロゲン）、プラスミドｐＴＡ１７１ ８を得た。０.４kb断片をBglＩＩ-SacＩＩ断片として単離し同酵素で消化したｐ ＥＧＦＰ-Ｃ１（クローンテク）においてクローニングした。得られたプラスミ ドはｐＥＧＦＰsacと名付けられた（図２９）。ｐＥＧＦＰsacはC.e.Ｕｎｃ-５ ３のＮ−末端１３アミノ酸をＧＦＰと融合してコードする。 b）全長ＧＦＰ-C.e.ＵＮＣ-５３の構築 プラスミドｐＴＢ７２（図１に示す）をSacＩＩおよびApaＩ制限酵素で消化し た。得られた４.５kbｃＤＮＡ断片は線虫Ｕｎｃ-５３のＣ-末端断片をコードし 、プラスミドｐＥＧＦＰsac（図２９）にクローニングし、同酵素で消化し、プ ラスミドｐＥＦＧＰ７２（図３０）を得た。プラスミドｐＥＧＦＰは全長の線虫 Ｕｎｃ-５３と融合したＧＦＰをコードする。 c）ｐＥＧＦＰsac以外のＧＦＰ-線虫ＵＮＣ-５３融合タンパク質のＮ-末端欠 失の構築 ｐＥＧＦＰ７２をSmaＩで消化した。得られた７.０kb断片を再度ライゲーショ ンし、大腸菌中で形質転換し、プラスミドｐＥＧＦＰsmaを得た（図３１）。こ の プラスミドは融合ＧＦＰ中のCe-Ｕｎｃ-５３の最初の７６０アミノ酸をコードす る。 ｐＥＧＦＰ７２を制限酵素Ec１１３６ＩＩおよびSmaＩで消化し、ライゲーシ ョンの後プラスミドを得て、６.７kb断片の大腸菌中での形質転換体をｐＥＧＦ Ｐecl（図３２）と名付けた。このプラスミドはＧＦＰ融合における線虫Ｕｎｃ- ５３のＮ-末端６７０アミノ酸をコードする。ｐＥＧＦＰ７２をさらにSmaＩおよ びXbaＩで消化した。後者部位をクレノウポリメラーゼにより平滑末端にした。 得た５．4kbの断片を再度ライゲーションし、大腸菌中で形質転換した。得たプ ラスミドをｐＥＧＦxba（図３３）と名付けた。このプラスミドは融合ＧＦＰ中 のCe-Ｕｎｃ-５３のＮ-末端２５６アミノ酸をコードした。 ２．hu-１-ｕｎｃ-５３−ＧＦＰ融合体および欠失誘導体の構築 ５.４kbのhu１-ｕｎｃ-５３断片をｐＬＭ１（図５４）からのClaＩ−XbaＩ断 片として単離し（図５４）、AccＩおよびXbaＩで消化したｐＥＧＦＰ-Ｃ１中に クローニングした。ｐＥＧＦＰ-Ｃ１は大腸菌ＧＭ４１（Hfa Ｈ、dam-３、thi- １、rel-１）であった。これはXbaＩ制限部位を制限酵素消化に利用できるよう にする。得たプラスミドをｐＬＭ４（図３４）と名付けた。 ３．Ｎ４細胞中のＧＦＰ蛍光の可視化 Ｎ４神経細胞芽腫株はLab Tek充填カバーグラス(Nalge Nunc International) において播種し、lipofectＡＭＩＮＥ（ギブコＢＲＬ）を用いてトランスフェク ションした。１８時間後、充填したカバーガラスは逆相顕微鏡に載せ、ＧＦＰ蛍 光が可視化された。 ４．ＧＦＰ融合発現細胞の抗体での染色 構築されたＧＦＰ融合でのトランスフェクションはまた、６−ウェルプレート でカバーグラスの上で行われた。パラホルムアルデヒドまたはメタノール−アセ トン固定の後、細胞をアクチン細胞骨格に関してＴＲＩＴＣ-ファロイジンで、h u-ＵＮＣ-５３に関しては血清２８.１で、チューブリンに関してはＹＬ１/２抗 体で染色することができた。ついで可視化をアキソプラン（Zeiss microscope） で行った。 キメラｕｎｃ-５３遺伝子の効果の製造法および観察法 １．ｕｎｃ-５３線虫遺伝子におけるプロモーターの定義： 線虫ｕｎｃ-５３遺伝子における位置１５６２１〜１８４１５へゲノム領域は プロモーターＡと呼ばれ、クローニングし、ＧＦＰ遺伝子のｃＤＮＡに融合させ た（クローンpA/ＧＦＰまたはｐＮＰ１０）(図５１参照)。この構築物を野生型 虫（Ｎ２）に注入する。トランスジェニック株は多様なニューロンにおけるＧＦ Ｐを発現する：ＢＤＵニューロン両者、ＡＬＮおよびＰＬＮニューロン両者、Ｐ ＤＥニューロン両者、ＰＶＭニューロン両者、ＰＶＰおよびＰＶＱの先駆ニュー ロンの２組および４陰門細胞である。その発現はそれらニューロンの軸索が成長 する、肺発生初期に開始する。 ２．Unc−５３（n１５２）対立遺伝子における変異表現型 野生型虫（Ｎ２）において、ＡＬＮおよびＰＬＮニューロンの２組はそれぞれ 尾から頭部へと縦に真っ直ぐの株で軸索を伸ばす（図５０a参照）。ｕｎｃ−５ ３（n１５２）対立遺伝子において、軸索は一層短く、背腹方向においてしばし ば枝を伸ばす（図５０b参照）。そのニューロンをＵＮＣ-５３（n１５２）虫に 注入した構築物pA/ＧＦＰで可視化する。 ３．ミニ遺伝子pA/ｕｎｃ-５３はＡＬＮまたはＰＬＮニューロンの伸長欠点を 救済する： 線虫ｕｎｃ-５３遺伝子からのプロモーターＡは線虫ｕｎｃ-５３遺伝子のｃＤ ＮＡ（クローンpA/ｕｎｃ-５３、またはｐＮＰ９）に融合させた。この構築物を ｕｎｃ-５３（n１５２）変異虫にＡＬＮおよびＰＬＮニューロンを可視化するた めに上記記載した構築物を共に注入した。ｕｎｃ-５３変異体におけるそれらニ ューロンの伸長欠点はプロモーターＡの下でのｕｎｃ-５３ｃＤＮＡの発現によ って完全に救済される（図５０および５１b参照）。 ４．線虫およびヒトｕｎｃ-５３遺伝子の間のドメイン交換 ｕｎｃ-５３ファミリーの脊椎動物および虫のメンバーが機能的に同等か否か を調べるために、本発明者らは虫のける変異表現型を救済するためのヒト遺伝子 の能力を試験した。本発明者らは虫タンパク質のＣ−末端推定ヌクレオチド結合 ドメインをヒト１遺伝子の相同断片で置き換えた。 クローンpA/ｕｎｃ-５３は線虫ＮＴＰアーゼドメインのＵＮＣ-５３のゲノム 上で２９８００位のHpaＩ部位から欠失したものであり、ついでヒト−１遺伝子 （ｕｎｃ-５３Ｈ１）の同等ドメインによって置換される（図５１参照）。得た クローンはpA/ＵＮＣ-５３Ｈ１と命名される。このクローンがｕｎｃ-５３（n１ ５２）変異体に注入されるとき、トランスジェニック虫はＡＬＮおよびＰＬＮニ ューロンの伸長における欠陥は優位であるが不完全な欠陥の救済を示す（図５１ b参照）。軸索は一層長く、しばしば直系における陰門領域まで背面への枝分か れはもはやなく伸長する。この結果は、ヒトｕｎｃ-５３ホモログのＮＴＰアー ゼ領域が線虫のＮＴＰアーゼ領域を機能的に置換することができることを示す。 救済の程度を定量的に分析し、ついで図５１bにて要約した： 比較された４つの株は： wt；ｕｎｃ-５３(n１５２);ｕｎｃ-５３(n１５２)、pA/ｕｎｃ-５３；ｕｎｃ-５ ３(１５２)、pA/ｕｎｃ-５３-Ｈ１である。 観察された多様な表現型は３つの大きなクラスに一緒にもたらされている： ≪野生型≫軸索は真っ直で枝分かれなく、ついで頭部へと移動する； ≪陰門≫軸索は真っ直で枝分かれなく、ついで陰門部で停止する； ≪変異体≫軸索は短く、陰門部領域にまで達さず、かつ副行分枝を有する。図は パーセンテージとして示されている。観察された軸索の数を以下表に示す。 データは、線虫/ヒトキメラミニ遺伝子pA/ｕｎｃ-５３-Ｈ１が部分的にＡＬＮ およびＰＬＮニューロンの軸索移動の欠損青救済し、ヒトと虫の間の欠点を救済 する。トランスジェニック細胞株は、少なくとヒトＵＮＣ-５３遺伝子の最少部 分の移動に関してストラタジーンクローニングアッセイする ＩＩ．材料と方法 １−クローニング： a）pAB/ＧＦＰ（ｐＮＰ３−図２７） ＧＦＰの遺伝子をcpn３オリゴ−ヌクレオチド をプラスミドｐＰＤ９５．７５（図５９）上でＰＣＲによって増幅させ、単独の SplＩ制限部位でｕｎｃ-５３のエクソン１２に融合して５'部位で挿入し、３' 部位で終止コドンとポリアデニル化部位を含む。ＰＣＲ増幅産物をそれぞれｐＢ Ｓベクター(クローンｐＮＰ２)におけるサブクローニングし、それぞれcpn３お よびcpn５オリゴヌクレオチドに含まれ、HindＩＩＩおよびBamHＩ部位によって 方向つけられる。ついでＧＦＰをSplＩぶいでｐＮＰ２クローンから切り出し、 Ｘ１６クローンに組み入れ（図６０）、XhoＩによって消化されたファージＳ４ から出る。Ｘ１６クローンは、ｐＢＳのＸｈｏＩでクローングされたｕｎｃ−５ ３の１６６２１位〜２４８９１位のゲノム配列を含む。 b)pAB/ＵＮＣ-５３（ｐＮＰ８-図３５） Ｘ１６クローンのＡＢプロモーター領域（PstＩとSplＩの間）をｐＴＢ１１５ クローンに挿入（図５８）し、そのPstＩとSplＩの間の領域はmec-７遺伝子のプ ロモーターおよびＵＮＣ-５３遺伝子の開始領域を除去した。 c）pA/ＧＦＰ（ｐＮＰ１０−図５６） プロモーター領域Ａは、PstＩ部位とNheＩ部位の間のＸ１６クローンから得て 、PstＩとXbaＩの間の部位におけるＧＦＰを含むｐＰＤ９５.７５に組み入れた 。 d）pA/ｕｎｃ-５３(ｐＮＰ９−図４４) プロモーター領域ＡはPstＩ部位とBstＩ部位の間のＸ１６クローンから得て、 PstＩ部位とBstXＩ部位の間の領域はmec-７遺伝子のプロモーターおよび遺伝子 Ｘ１６クローンから得て、ＵＮＣ-５３遺伝子の開始部位を含む。 e）pA/ＵＮＣ-５３−Ｈ１（ｐＣＢ５０１−図５７） クローンpA/ＵＮＣ-５３（ｐＮＰ９）を線虫のＵＮＣ-５３遺伝子の３'領域Hp aＩ部位とNcoＩ部位の間から欠失させた。Ｈ１ＵＮＣ-５３遺伝子の３'領域をオ リゴヌクレオチドＵ４Ａfw ＣＲによって増幅し、HpaＩ部位とXbaＩで消化した。Ｔ４ポリメラーゼによる充 填段階の後、ライゲーションは完全な目的に影響する。 ２−注入 従来の注入技術が使用され（ファイア（Fire,A.）、１９８６、メロ（M ello G.））ら、Journal Mello G.およびファイア、１９９５）。雌雄同体成体 で若いものを２つの多核性生殖腺に注入する。使用したＤＮＡを標準的方法で（ キアゲン）調製した後、塩化リチウムで沈殿させる。すべての塩を排除するため の多大な漱ぎ段階の後、該ＤＮＡを水に再懸濁させる。注入溶液は注入バッファ ーの１００ng/ilの濃度で異なるＤＮＡを含む：遺伝子rol-６（クラメール（kra mer J.）ら、、１９９０、mello C.ら、１９９１）の優性対立遺伝子su１００６ を含むプラスミドｐＲＦ４が形質転換同じマーカーとして使用する。注入した雌 雄同体のローラー表現型の子孫を単離する。これらの形質転換体の約１０％は安 定した株を精製し、そこでは注入された異なるＤＮＡｓが結合して不安定な染色 体外配列として分離するであろうミニ染色体を形成する。得られたすべてのトラ ンスジェニック株をＰＣＲによって注入されたＤＮＡの存在に関してベクターの 特異的なプライマーおよび遺伝市中のプライマー（結果は示さず）を用いて試験 した。 ３．顕微鏡 線虫を、Nomarskiレンズ、４０×Neofluar、６３×Plan-Apochromat、１００ ×Plan-Apochromat対物レンズとともに提供されたＺＥＩＳＳ Axioplan顕微鏡下 で観察する。蛍光観察のための蛍光源は水銀球である。異なるＺＥＩＳＳフィル ターを使用する： −ＧＦＰ蛍光下の観察にはＦＩＴＣフィルター：５８８nmの青色励起線、５１５ −５６5nmのバンド塔かフィルターを通して放射； −ＴＲＩＴＣに結合した第２抗体で標識した抗体の観察には：５４６nmのバンド 透過フィルターを通しての励起、５９０nmの長透過フィルターを通して放射。 画像の取得はＣＣＤカメラおよびマッキントッシュコンピューターを用いたＮＩ Ｈ画像プログラムの手段によってもたらされる。画像をアドベ・フォトショップ ・プログラム（Adobe Photoshop Program）を用いて処理する。配列表 以下の配列が本明細書中で参照される： 配列番号：１は図９bに説明されるＵＮＣ-５３タンパク質のヒトホモログ１の アミノ酸配列である。配列番号：２は図１１dに説明されるＵＮＣ-５３タンパク質のヒトホモログ２ のアミノ酸配列である。 配列番号：３は図９bに説明されるhu-１-ｕｎｃ-５３遺伝子の核酸配列である 。 配列番号：４は図１１dに説明されるhu-２-ｕｎｃ-５３遺伝子の核酸配列であ る。 配列番号：５は図９に説明される受託番号第ＬＭＢＰ ３５９５号下に寄託さ れたλファージクローン３ｂの核酸配列である。配列番号：６は図５４に説明される受託番号第ＬＭＢＰ ３７６２号下に寄託 されたプラスミドｐＬＭ１の核酸配列である。 配列番号：７は図３４に説明される受託番号第ＬＭＢＰ３７６３号下に寄託さ れたプラスミドｐＬＭ４の核酸配列である。 配列番号：８は図３０に説明される受託番号第ＬＭＢＰ３７６４号下に寄託さ れたプラスミドｐＥＧＦＰ７２の核酸配列である。 配列番号：９は図５７に説明される受託番号第ＬＭＢＰ３７６５号下に寄託さ れたプラスミドｐＣＢ５０１の核酸配列である。 配列番号：１０は受託番号第ＬＭＢＰ３５９４号下に寄託されたプラスミドｐ ＣＢ２０１の核酸配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ０７Ｋ 14/435 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 1/15 14/46 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/68 (Ｃ１２Ｐ 21/02 // Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 デレーイメーケル，マルク ベルギー、ベー―2340ベールセ、トゥルン ホウトセウェッヒ30番、ヤンセン・ファル マシューティカ・ナムローゼ・フェンノー トシャップ (72)発明者 フェルハッセルト，ペーテル ベルギー、ベー―2340ベールセ、トゥルン ホウトセウェッヒ30番、ヤンセン・ファル マシューティカ・ナムローゼ・フェンノー トシャップ (72)発明者 プュジョル，ナタリー・ジャンヌ・レイモ ンド フランス、エフ―34000モンペリエ、アブ ニュ・デュ・ペール・スーラ213番 (72)発明者 マエルテン，リュック・ジャック・シモン ベルギー、ベー―8200ブルッヘ、フィー ル・アイテルステン26番 (72)発明者 ライテン，ワルテル ベルギー、ベー―2340ベールセ、トゥルン ホウトセウェッヒ30番、ヤンセン・ファル マシューティカ・ナムローゼ・フェンノー トシャップ (72)発明者 ヘールツ，ヒューゴ ベルギー、ベー―2340ベールセ、トゥルン ホウトセウェッヒ30番、ヤンセン・ファル マシューティカ・ナムローゼ・フェンノー トシャップ (72)発明者 ファンデケルクホーフェ，ジョエル・ステ ファーン ベルギー、ベー―8210ロッペム、ローデ・ ブーケンドレーフ27番 (72)発明者 ゲイセン，ヨハン ベルギー、ベー―2340ベールセ、トゥルン ホウトセウェッヒ30番、ヤンセン・ファル マシューティカ・ナムローゼ・フェンノー トシャップ (72)発明者 ボガエール，ティエリー・アンドレ・オリ ビエ・エディ ベルギー、ベー―8500コルトレイク、ウォ ルフェンドレーフ26ヘー番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．タンパク質が、図２中に説明された線虫（C.elegans）の該ＵＮＣ−５３タ ンパク質のアミノ酸配列に統計学的に有意なホモロジーを有するアミノ酸配列を 含む、線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機能的等価 物、誘導体または生物学的前駆体。 ２．タンパク質が図９aに説明されるように配列ブロックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄまたは Ｅ、または図１２aにおける配列ブロックＦの１またはそれ以上を含むかまたは それに統計学的に有意なホモロジーを保有する配列を含むのアミノ酸配列を含む線虫 のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物タンパク質ホモログ。 ３．そのタンパク質が保存アミノ酸変化においてのみ見られる図９aまたは図１ ２aの配列ブロックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥと異なる１またはそれ以上の配列 ブロックを保有するアミノ酸配列を含む線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動 物タンパク質ホモログ。 ４．配列番号：３に説明されるヌクレオチド１〜６０１３位により示されるヌク レオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有する脊椎動物タンパク質。 ５．請求項２にクレームされるようなホモロジーの該配列の各々に関して、図２ ８に説明されるような１またはそれ以上の前部位特性を含むアミノ酸配列を含む 脊椎動物タンパク質。 ６．ヒトタンパク質またはマウスタンパク質である請求項１から６のいずれか１ つにクレームされるようなアミノ酸配列を含む脊椎動物タンパク質。 ７．配列番号：４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配 列を有する脊椎動物タンパク質。 ８．配列番号：１に示されるアミノ酸配列または配列番号：１に示される配列と １またはそれ以上の保存されたアミノ酸変更において異なるアミノ酸配列を含む 請求項１から７のいずれか１つに記載の脊椎動物タンパク質ホモログ。 ９．配列番号：２に示されるアミノ酸または配列番号：２に示されるアミノ酸配 列と１またはそれ以上の保存されたアミノ酸変更において異なるアミノ酸配列を 含む請求項１から７のいずれか１つに記載の脊椎動物タンパク質ホモログ。 １０．請求項１から９のいずれかに記載の線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎 動物ホモログをコードするｃＤＮＡ。 １１．配列番号：１に示されるアミノ酸または１またはそれ以上の保存されたア ミノ酸のみ配列番号：１に示されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列をコード するヌクレオチドの配列を含む請求項１０に記載のｃＤＮＡ。 １２．配列番号：２に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドの配列または １またはそれ以上の保存アミノ酸変更のみ配列番号：２で示されるアミノ酸配列 と異なるアミノ酸配列を含む請求項１０に記載のｃＤＮＡ。 １３．ｃＤＮＡが配列番号：３に示される配列の少なくともヌクレオチド１〜６ ０１３位を含む請求項１０または１１のいずれかに記載のｃＤＮＡ。 １４．配列番号：４に説明されるヌクレオチド配列を含む請求項１０または１２ に記載のｃＤＮＡ。 １５．厳しいストリンジェンシー条件下で請求項１０から１４のいずれかに記載 のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる核酸分子。 １６．請求項１０から１４のいずれかにクレームされるｃＤＮＡを含むＤＮＡ発 現ベクター。 １７．請求項１から９のいずれかに記載の線虫のＵＮＣ-５３タンパク質のプロ モーターまたはその脊椎動物ホモログを含む請求項１６に記載のベクター。 １８．該プロモーター配列が線虫のＵＮＣ-５３タンパク質のマウスまたはヒト ホモログをコードする遺伝子由来のもである請求項１７に記載のベクター。 １９．リポーター分子をコードする配列をさらに含む請求項１６から１８いずれ かに記載のベクター。 ２０．該リポーター分子が蛍光体である請求項１９に記載のベクター。 ２１．請求項１６から２０のいずれかに記載のベクターで形質転換するかまたは トランスフェクションした宿主細胞。 ２２．請求項１９または２０のいずれかに記載のベクターで形質転換するかまた はトランスフェクションした宿主細胞。 ２３．細胞が細菌細胞などの原核生物細胞または真菌類、動物、植物または昆虫 細胞などの真核生物細胞を含む請求項２１または２２に記載の宿主細胞。 ２４．請求項１から９のいずれかに記載のタンパク質を発現することができるト ランスジーンを含むトランスジェニック細胞、組織または生物体。 ２５．ＣＯＳ細胞、Hep Ｇ２、ＭＣＦ-７細胞、Ｎ４マウス神経芽細胞腫細胞、 ＮＩＨ３Ｔ３細胞または結腸腺癌またはヒト由来細胞を含む請求項２４に記載の トランスジェニック細胞、組織または生物体。 ２６．該トランスジーンが請求項１６から２０のいずれかに記載のベクターを含 む請求項２４または２５に記載のトランスジェニック細胞、組織または生物体。 ２７．該トランスジーンが請求項１９または２０に記載のベクターを含む請求項 ２４から２６に記載のトランスジェニック細胞、組織または生物体。 ２８．該生物体が昆虫、菌類、ヒトではない哺乳類、植物または線虫のいずれか を含む請求項２４から２６のいずれかに記載のトランスジェニック細胞、組織ま たは生物体。 ２９．突然変異が細胞作用または細胞運動性の調節または形状または細胞移動性 の方向に影響を及ぼす変異体脊椎動物ヒト以外の生物体を製造する方法であって 、線虫ＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする野生型遺伝子に おいて突然変異を誘発することを含む。 ３０．神経再生、血管再生、傷の治癒を促進するための薬剤としての使用、また は慢性神経変性疾患の治療または急性外傷性外傷または繊維症疾患の治療のため の線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物タンパク質ホモログまたはその機能 的等価物、誘導体、断片または生物学的先駆体。 ３１．該脊椎動物ヒトホモログが請求項１から９のいずれか１つにクレームされ る請求項３０にクレームされた使用のための線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊 椎動物タンパク質ホモログ。 ３２．神経再生、血管再生、傷の治癒を促進するための、または慢性神経変性疾 患または急性外傷性外傷または繊維症疾患治療のための薬剤の製造における線虫 のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物タンパク質ホモログまたはその機能的等価 物、誘導体、断片または生物学的先駆体の使用。 ３３．該タンパク質ホモログが請求項１から９のいずれか１つにクレームされて いる請求項３２に記載の線虫ＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物タンパク質ホモ ログの使用。 ３４．製薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤とともに線虫のＵＮＣ- ５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、またはその機能的等価物、誘導体、断片ま たは該脊椎動物タンパク質の生物学的前駆体を含む医薬組成物。 ３５．請求項１から９のいずれかに記載の線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎 動物ホモログを含む請求項３４にクレームされている医薬組成物。 ３６．薬剤として使用するための線虫のＵＮＣ-５３の脊椎動物ホモログ、また はその機能的等価物、断片、誘導体または該脊椎動物ホモログの生物学的前駆体 をコードする核酸配列。 ３７．該配列が請求項１０から１４のいずれかにクレームされるｃＤＮＡ配列ま たは該ｃＤＮＡ配列の機能的断片である請求項３６に記載の核酸配列。 ３８．神経再生、血管再生または傷の治癒を促進するための、または慢性神経変 性疾患または急性外傷性外傷または繊維症疾患の治療のための薬剤の製造におけ る線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物タンパク質ホモログまたはその機能 的等価物、誘導体、断片または生物学的先駆体をコードする核酸配列の使用。 ３９．該配列が請求項１０から１４のいずれかにクレームされるｃＤＮＡ配列で あるかまたは該核酸配列の機能的断片である請求項３８に記載の核酸配列の使用 。 ４０．請求項３６または３７に記載の核酸配列および製薬学的に許容し得る担体 、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。 ４１．該核酸配列が請求項１０から１４のいずれかにクレームされるｃＤＮＡ配 列である請求項４０に記載の医薬組成物。 ４２．化合物が細胞作用、増殖、細胞形状または運動性の調節、細胞移動性の方 向の調節のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定する方法であっ て、該方法には該化合物を請求項２１から２３に記載の宿主細胞または請求項２ ４から２７のいずれかにクレームされるトランスジェニック細胞と接触させ、該 細胞内の表現型変化をスクリーニングすることを含む。 ４３．ＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機能的断片、誘導 体、断片またはその脊椎動物ホモログの生物学的先駆体が該細胞内の類似または 重複シグナル伝達経路のインヒビターまたはエンハンサーである該化合物が該ト ランスジェニック細胞のシグナル伝達経路のインヒビターまたはエンハンサーで あるか否か、を決定することができる請求項４１に記載の方法。 ４４．該化合物が線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、その機能 的等価物、断片、誘導体または該脊椎動物ホモログの生物学的先駆体のインヒビ ターまたはエンハンサーであるか否かを決定することができる請求項４３に記載 の方法。 ４５．スクリーニングされるべき表現型の変化が細胞増殖、または形状または細 胞運動性における変化である請求項４２から４４のいずれかに記載の方法。 ４６．スクリーニングされるべき該表現型変化がフィロポディアの増殖、波うち 膜作用、細胞接着、接触阻害または神経突起増殖の長さである請求項４２から４ ４のいずれかに記載の方法。 ４７．該トランスジェニック細胞がＮ４神経芽細胞腫細胞であり、スクリーニン グされるべき表現型の変化が神経突起増殖の長さである請求項４２から４４のい ずれかにクレームされる方法。 ４８．該トランスジェニック細胞がＭＣＦ-７乳癌細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞 であり、スクリーニングされるべき表現型変化がファゴキネシスまたは接触阻害 の程度である請求項４２から４４のいずれかにクレームされる方法。 ４９．該化合物を請求項２４から２８のいずれかに記載のトランスジェニック生 物体または請求項２９に記載の方法により製造される変異体生物に投与し、該生 物体内の表現型変化をスクリーニングすることを含む化合物が細胞の形状、細胞 増殖または運動性の調節、または細胞移動の方向の調節のインヒビターまたはエ ンハンサーであるか否かを決定する方法。 ５０．該方法が該化合物が線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログま たはその機能的断片、誘導体、断片またはその脊椎動物ホモログの生物学的先駆 体が要素であるような、または該細胞内の類似または重複シグナル伝達経路のイ ンヒビターまたはエンハンサーである該化合物が該トランスジェニックまたは変 異体細胞のシグナル伝達経路のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを 決定することができる請求項４９に記載の方法。 ５１．該方法が、該化合物がＵＮＣ-５３タンパク質そのものの脊椎動物ホモロ グまたはその機能的等価物、断片、誘導体または脊椎動物ホモログの前駆体のイ ンヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定することができる請求項５０ に記載の方法。 ５２．神経再生、血管再生または傷の治癒を促進するための、または慢性神経変 性疾患または急性外傷性外傷または繊維症疾患の治療のための薬剤としての使用 のための、細胞形状、または細胞の増殖または運動性または細胞移動の方向の調 節のエンハンサーとして請求項４２から５１のいずれか１つに記載の方法により 同定可能な化合物。 ５３．神経再生、血管再生または傷の治癒を促進するための、または慢性神経変 性疾患または急性外傷性外傷または繊維症疾患の治療用薬剤の調製における細胞 形状または細胞の増殖または運動性または細胞移動の方向の調節のエンハンサー として請求項４２から５１のいずれか１つに記載の方法により同定可能な化合物 の使用。 ５４．請求項４２にから５１のいずれかに記載の方法により同定される化合物を 含む医薬組成物、そのための製薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤。 ５５．細胞を誘発する疾患の蔓延または転移または接触阻害の喪失を緩和するた めの薬剤としての使用のため、細胞運動性、増殖、または形状、または細胞移動 の方向の調節のインヒビターとして請求項４２から５１のいずれか１つに記載の 方法により同定可能な化合物。 ５６．細胞を誘発する疾患の蔓延または転移もしくは接触阻害の喪失の緩和用薬 剤の製造における請求項５５に記載の化合物の使用。 ５７．請求項５５にクレームされる化合物を含む医薬組成物、およびそのための 製薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤。 ５８．（a）該化合物を請求項２２または２７のいずれかに記載の細胞と接触さ せ、ついで（b）該リポーター分子のレベルをモニターし、細胞が該化合物と接 触していない請求項２２から２７に記載の細胞を含むコントロールとモニター工 程から得られる結果を比較することを含む化合物が線虫のＵＮＣ-５３タンパク 質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の転写のインヒビターまたはエンハン サーであるか否かの方法。 ５９．検出されたリポーター分子がｍＲＮＡまたは緑色蛍光体タンパク質である 請求項５８にクレームされる方法。 ６０．神経再生、血管再生または傷の治癒を促進するための、または慢性神経変 性疾患または急性外傷性外傷または繊維症疾患の治療のための線虫のＵＮＣ-５ ３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその遺伝子の機能的断片をコードする遺 伝子の転写物のエンハンサーとして請求項５８または５９に記載の方法により同 定可能な化合物。 ６１．神経再生、血管再生または傷の治癒を促進するための、または慢性神経変 性疾患または急性外傷性外傷または繊維症疾患の治療のための線虫のＵＮＣ-５ ３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその遺伝子の機能的断片をコードする遺 伝子の転写物のエンハンサーとして請求項５８または５９に記載の方法により同 定可能な化合物の使用。 ６２．請求項６０の化合物を含む医薬組成物および製薬学的に許容し得る担体、 希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。 ６３．細胞誘発疾患、転移、または接触阻害を緩和するための線虫のＵＮＣ-５ ３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその遺伝子の機能的断片をコードする遺 伝子の転写物のインヒビターとして請求項５８または５９に記載の方法により同 定可能な化合物の使用。 ６４．細胞誘発疾患、転移、または接触阻害を緩和するための薬剤の製造におい て、線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその遺伝子の機能 的断片をコードする遺伝子の転写物のインヒビターとして請求項５８または５９ に記載の方法により同定可能な化合物の使用 ６５．請求項６３に記載の化合物を含む医薬組成物、そのための製薬学的に許容 し得る担体、希釈剤または賦形剤。 ６６．該化合物に接触させるべき請求項２２から２５のいずれか１つにクレーム される少なくとも１つのトランスジェニック細胞およびコントロールとして使用 されるべき請求項２１から２８に記載の少なくとも１つの細胞および該化合物を 該少なくとも１つのトランスジェニック細胞と接触させる手段を含む、該化合物 が細胞運動性、増殖または形状または細胞移動の方向の調節のエンハンサーまた はインヒビターであるか否かを決定するためのキット。 ６７．該化合物が線虫ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機 能的断片をコードする遺伝子の転写産物のインヒビターまたはエンハンサーであ るか否かを決定するためのキットであり、そのキットには該化合物を該細胞に接 触させる手段としての請求項２１から２５のいずれか１つにクレームされる少な くとも１つの細胞を含む。 ６８．請求項２９にクレームされる方法により製造されたヒトではない脊椎動物 変異体または請求項２４から２８にクレームされるトランスジェニック生物体お よび該脊椎動物変異体生物の野生型を少なくとも１つ含む該化合物が、線虫のＵ ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、機能的等価物、誘導体、断片または 生物学的前駆体の活性のエンハンサーまたはインヒビターか否かを決定するため のキット。 ６９．ＵＮＣ−５３またはその機能的等価物、誘導体またはその生物学的前駆体 をコードする核酸配列の１５〜５０ヌクレオチド間の適当なオリゴヌクレオチド 配列、ＤＮＡライブラリーに請求項１０から１４のいずれかに記載のｃＤＮＡに 統計学的に有意なホモロジーを有する遺伝子を同定するためのストリンジェンシ ーの適当な条件下でハイブリダイズする線虫のＵＮＣ−５３遺伝子の脊椎動物ホ モログ、またはその機能的断片を同定する方法。 ７０．該方法が： （a）該細胞抽出物を線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、その 機能的等価物、断片、誘導体または該タンパク質の生物学的前駆体に対する抗体 と接触させ、 （b）抗体／脊椎動物複合体を同定し、ついで （c）該抗体以外の線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合す る任意のタンパク質を同定するために該複合体を分析する ことを含む、線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機能 的な等価物、断片または該脊椎動物ホモログの生物学的前駆体が要素である細胞 のシグナル伝達経路において活性であるタンパク質を同定する方法であって、線 虫 のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機能的な等価物、断 片または該脊稚動物ホモログの生物学的前駆体が要素である細胞のシグナル伝達 経路において活性であるタンパク質を同定する方法。 ７１、該方法が： （a）請求項７０に記載の線虫のＵＮＣ−５３タンパク質脊椎動物ホモログに結 合した第１に同定されたタンパク質に対する抗体を形成し、 （b）細胞抽出物を該抗体に接触させ、ついで抗体／タンパク質複合体を同定し 、 （c）該複合体を該抗体以外の第１タンパク質に結合したさらなる任意のタンパ ク質を同定するために分析し、ついで （d）（a）から（c）の工程を該経路でさらにタンパク質を同定するために任意 に繰り返すことを含むＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機 能的等価物、断片または該タンパク質の生物学的前駆体が要素である細胞のシグ ナル伝達経路において活性である更なるタンパク質を同定する方法。 ７２．該方法が： （a）該細胞抽出物を線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、また はその機能的等価物、誘導体または該脊椎動物ホモログの生物学的前駆体と接触 させ、 （ｂ）形成されたＵＮＣ−５３タンパク質／タンパク質複合体の任意の脊椎動物 ホモログを同定し、ついで （ｃ）該複合体をＵＮＣ−５３タンパク質の同じ脊椎動物ホモログ以外のＵＮＣ −５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合した任意のタンパク質を同定するた めに複合体を分析することを含む、線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホ モログ、またはその機能的な等価物、断片または該ホモログタンパク質の生物学 的前駆体が要素である細胞のシグナル伝達経路において活性であるタンパク質を 同定する方法。 ７３．細胞抽出物を使用されたＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ＵＮＣ−５３ ホモログと全く同一ではない工程（c）から同定される任意のタンパク質と接触 させ、該細胞のシグナル伝達経路に関与するさらなる任意のタンパク質を同定す るように工程（b）および（c）を繰り返すことを含む請求項７２に記載の方法。 ７４．該方法が： （a）ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって調節 されたプロモーターのコントロール下でリポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を 有する適当な宿主細胞を提供し、 （b）請求項１０から１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列およびＤＮＡ結合ドメ インまたは転写因子の活性化ドメインのいずれかの断片の第１融合またはすべて をコードする第１ハイブリッドＤＮＡを該宿主細胞中に発現し、 （c）ＤＮＡ結合または最初の融合に組み込まれない転写因子のＤＮＡ結合ドメ インまたは活性化ドメインと共に調査されるべき少なくとも１つの推定結合タン パク質第２ハイブリッドＤＮＡ配列を発現し、 （d）請求項１から９のいずれかに記載のタンパク質で調査されるタンパク質の 任意の結合を宿主細胞中の任意のリポーター遺伝子産物を検出することによって 検出することを含む、線虫ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログが要素で ある細胞のシグナル伝達経路に関与するタンパク質を同定する方法。 ７５．神経再生、血管再生または傷の治癒を促進するための、または慢性神経変 性疾患または急性外傷性外傷または繊維症疾患の治療のための薬剤としての使用 のために請求項７０から７４のいずれか１つの方法によって同定されるタンパク 質。 ７６．神経再生、血管再生または傷の治癒を促進するための、または慢性神経変 性疾患または急性外傷性外傷または繊維症疾患の治療のための薬剤の製造におけ る請求項７０から７４の任意の１つの方法によって同定されたタンパク質の使用 。 ７７．請求項７０から７４のいずれか１つに記載の方法によって同定されるタン パク質を含む医薬組成物、そのための製薬学的に許容し得る担体、希釈剤または 賦形剤。 ７８．請求項２１から２８の任意の細胞を培養し、ついで発現されたＵＮＣ−５ ３タンパク質の該脊椎動物ホモログを回収することを含む線虫のＵＮＣ−５３タ ンパク質の脊椎動物ホモログ、その機能的断片、誘導体または生物学的前駆体を 製造する方法。 ７９．ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、その機能的断片、誘導体ま たは該脊椎動物ホモログの生物学的前駆体、バキュロウイルスポリヘドリンプロ モーターの下流をコードするＤＮＡインサートを含む組換えバキュロウイルスベ クターでトランスフェクションした昆虫細胞を培養し、発現されたＵＮＣ−５３ タンパク質の該脊椎動物ホモログを回収することを含む線虫のＵＮＣ−５３タン パク質の脊椎動物ホモログ、その機能的断片、誘導体または該脊椎動物ホモログ の生物学的前駆体の製造方法。 ８０．図１５に示される配列を含むヌクレオチド配列。 ８１．図１６に示される配列を含むヌクレオチド配列。 ８２．図１７に示される配列を含むヌクレオチド配列。 ８３．該ホモログを発現する細胞を該化合物に接触させ、該化合物に接触させて いないコントロール細胞に比較して表現型変化をモニターすることを含む線虫の ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログまたはその機能的等価物、誘導体または脊椎動 物ホモログの発現のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを検出する方 法。 ８４．該細胞が請求項２１から２８のいずれかに記載の細胞を含む請求項８３に 記載の方法。 ８５．該細胞が接触阻害の喪失を受ける請求項８３に記載の方法。 ８６．該化合物が試験すべき化合物が核酸を含む脊椎動物ホモログの発現のイン ヒビターであるか否かを決定することができる請求項８３から８５のいずれかに 記載の方法。 ８７．該核酸配列がアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む請求項８６に記 載の方法。 ８８．該ｍＲＮＡ配列が該脊椎動物ホモログをコードするｍＲＮＡの３'未翻訳 領域を含む請求項８７に記載の方法。 ８９．試験すべき化合物が該脊椎動物ホモログの阻害機能に潜在的に適している アミノ酸配列を有するタンパク質を含む請求項８３から８５のいずれかに記載の 方法。 ９０．該タンパク質が、請求項７０から７４に記載の方法のいずれかにより同定 されるタンパク質を含む請求項８９による方法。 ９１．製薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤とともに請求項８３から ８９のいずれかにより同定される化合物を含む医薬組成物。 ９２．線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、機能的等価物、断片 、誘導体または生物学的前駆体によって媒介される接触阻害の喪失または癌腫の 治療において使用するための請求項８６から８８のいずれかに記載の方法により 同定される核酸配列。 ９３．線虫のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、機能的等価物、断片 、誘導体または生物学的前駆体によって媒介される接触阻害の喪失または癌腫の 治療のための薬剤の調製における請求項８６から８８のいずれか１つに記載の方 法により同定される核酸配列の使用。 ９４．線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子発 現を阻害するための薬剤の調製における使用のための請求項９２による核酸。 ９５．pcB２０１でトランスフェクションし、ＬＭＢＰ受託番号第１６０３ＣＢ 号として寄託されているＮＩＨ３Ｔ３細胞株。 ９６．ＬＭＢＰ受託番号第３５９４号下に寄託されている配列番号：１０のプラ スミドｐＣＢ２０１。 ９７．プラスミドpcB２０１でトランスフェクションし、ＬＭＢＰ受託番号第１ ６０１ＣＢ号として寄託されているＭＣＦ-７細胞株。 ９８．細胞またはその細胞抽出物を該脊椎動物ホモログ、または機能的等価物、 誘導体またはその生物学的前駆体に対する抗体と接触させ、その抗体はリポータ ー分子と結合し、未結合抗体を除去し、該リポーター分子の存在に関してモニタ ーすることを含む、線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログの発現を 検出するアッセイ。 ９９．該リポーター分子が適当な蛍光体または検出可能な酵素でコンジュゲート された抗体である請求項９８に記載のアッセイ。 １００．該脊椎動物ホモログまたは機能的等価物、断片または生物学的前駆体を コードするか、または一致する核酸またはタンパク質配列に特異的であるプロー ブを該プローブがリポーターに結合する細胞抽出物と接触し、ついで該リポータ ーの存在を分析することを含む、線虫のＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモ ログまたはその機能的等価物、誘導体、断片または生物学的前駆体をコードする 遺伝子の発現を検出する方法。 １０１．該プローブがＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは機能的 等価物、誘導体またはその生物学的前駆体をコードする遺伝子から転写されたｍ ＲＮＡの領域に相補的である配列を含む請求項１００に記載の方法。 １０２．該相補的配列が該ｍＲＮＡの３'または５'未翻訳領域である請求項１０ １に記載の方法。 １０３．該リポーターが放射性標識を含む請求項１００または１０２に記載の方 法。 １０４．該プローブが、該ＵＮＣ-５３タンパク質の脊椎動物ホモログに特異的 である抗体またはその機能的等価物、誘導体、断片またはその生物学的前駆体を 含む請求項１００に記載の方法。 １０５．該リポーターが検出可能な蛍光体または酵素でコンジュゲートされた抗 体を含む請求項１０４に記載の方法。 １０６．ＬＭＢＰ受託番号第３５９５号下に寄託されている配列番号：５のファ ージλクローン３ｂ。 １０７．該方法が： （ａ）該化合物をリポーター分子に作動可能に結合するＵＮＣ−５３タンパク質 または該脊椎動物ホモログを発現するトランスジェニック細胞、組織または生物 体に接触させ、 （ｂ）該化合物と接触しなかった工程（ａ）に記載の細胞と比較して該リポータ ー分子の局在をスクリーニングする ことを含む、該化合物が請求項１から９のいずれかに記載のＵＮＣ−５３または その脊椎動物ホモログの微小管またはそのプラス端領域への結合のインヒビター またはエンハンサーであるか否かを決定する方法。 １０８．請求項１０７に記載の方法により同定される化合物。 １０９．細胞を誘発する疾患の蔓延または転移または接触傷害の喪失を緩和にお ける使用のための局在またはＵＮＣ−５３その脊椎動物ホモログの微小管または そのプラス端領域との結合のインヒビターとして請求項１０７に記載の方法によ って同定可能な化合物。 １１０．神経再生、血管再生または傷の治癒を促進するための、または慢性神経 変性疾患または急性外傷性外傷または繊維症疾患の治療に使用するため、ＵＮＣ −５３その脊椎動物ホモログの微小管またはそのプラス端領域との結合のインヒ ビターとして請求項１０７に記載の方法によって同定可能な化合物 １１１．請求項１０８または１０９に記載の化合物およびその製薬学的に許容し 得る担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。 １１２．ＵＮＣ−５３およびリポーター分子または請求項２０〜２４のいずれか に記載の細胞を発現する少なくとも１つのトランスジェニック細胞およびコント ロールとして使用するためのｄ少なくとも１つのＵＮＣ-５３発現トランスジェ ニック細胞およびリポーター分子または請求項２０から２４のいずれかに記載の 細胞であり、コントロールとして使用するための同細胞型の少なくとも１つの細 胞および該化合物を該少なくとも１つのトランスジェニック細胞の１つと接触さ せるための手段を含む、請求項１から９のいずれかに記載のＵＮＣ−５３または その脊椎動物ホモログと微小管またはそのプラス端領域の結合のエンハンサーま たはインヒビターであるか否かを決定するためのキット。 １１３．線虫のＵＮＣ-５３またはＵＮＣ-５３または該脊椎動物ホモログと微小 管またはプラス端領域に該化合物を標的に使用するための微小管およびプラス端 領域とＵＮＣ-５３および該脊椎動物ホモログの結合のインヒビターまたはエン ハンサーとして同定された化合物に結合した請求項１から９のいずれかに記載の 脊椎動物ホモログを含む組成物。 １１４．さらに細胞形質転換またはトランスフェクション剤を含む請求項１１３ に記載の組成物。 １１５．宿主細胞、組織または生物体に請求項１から９のいずれかに記載のＵＮ Ｃ-５３またはその脊椎動物ホモログを発現することができ、標的化されるべき タンパク質をコードする配列に作動可能に結合した結果、キメラを発現し、該微 小管またはプラス端領域に該配列を標的化することになる配列を含むトランスジ ーンを導入し、細胞微小管またはそのプラス端領域にタンパク質を標的化する方 法。 １１６．a）ＵＮＣ-５３または該脊椎動物ホモログを発現する細胞からの抽出物 か、またはタンパク質の共有結合修飾の表示の存在下で酵素を修飾する候補ＵＮ Ｃ-５３を含む酵素の混合物のいずれかを接触させ、 b）工程a）からの任意の共有結合的に修飾したＵＮＣ-５３タンパク質を同定し 、 c）該修飾工程に関与する該分子を同定する ことを含む、請求項１から９のいずれかに記載のＵＮＣ-５３またはその脊椎動 物ホモログを共有結合的に修飾する分子を同定する方法。 １１７．該指標が³²Ｐを含む請求項１１２に記載の方法。 １１８．該化合物を請求項２７に記載の細胞、組織または生物体と接触させ、つ いで該微小管またはそのプラス端領域近辺のリポーター分子の存在をモニターす ることを含む、請求項１から９のいずれかに記載のＵＮＣ−５３またはその脊椎 動物ホモログの毒性を緩和するかまたは増強する化合物を同定する方法。 １１９．受託番号第ＬＭＢＰ ３７６２号下に寄託された配列番号：６に記載の プラスミドｐＬＭ１。 １２０．受託番号第ＬＭＢＰ３７６３号下に寄託された配列番号：７に記載のプ ラスミドｐＬＭ４。 １２１．受託番号第ＬＭＢＰ３７６４号下に寄託された配列番号：８に記載のプ ラスミドｐＥＧＦＰ７２。 １２２．受託番号第ＬＭＢＰ３７６５号下に寄託された配列番号：９に記載のプ ラスミドｐＣＢ５０１。 １２３．受託番号第ＬＭＢＰ−１６６３ＣＢ号下に寄託された線虫ヒトＵＮＣ- ５３キメラ遺伝子を含む虫株。 １２４．請求項１から３のいずれかに記載の脊椎動物ホモログがマウスホモログ であるもの。 １２５．図１４に説明される配列を持つ請求項１２５に記載のホモログ。