JP2002500623A

JP2002500623A - スプルーティタンパク質およびコーディング配列

Info

Publication number: JP2002500623A
Application number: JP52181998A
Authority: JP
Inventors: ハコーヘン，ニール; エイクラスノー，マーク
Original assignee: ザボードオブトラスティーズオブザリーランドスタンフォードジュニアユニヴァーシティー
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2002-01-08
Also published as: WO1998020032A1; EP0960123A4; EP0960123A1; CA2269641A1; US6060275A

Abstract

(57)【要約】新分類の哺乳動物スプルーティタンパク質を開示する。該タンパク質はそのアミノ酸配列のシステイン領域がヒトのスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性を有し、スプルーティ２タンパク質の全長配列はSEQ ID NO:８により確認される。また、さらに開示するのは（1）スプルーティタンパク質を含有する製剤、（2）該タンパク質をコード化するDNA配列、（3）DNAコーディング配列を含有するベクターおよび遺伝子治療組成物、および(4)哺乳動物被験体において活性哺乳動物スプルーティタンパク質の異常レベルにより特徴づけられる症状またはそれに関連する危険因子を検出する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】スプルーティタンパク質およびコーディング配列本出願は1996年11月７日に出願した米国仮出願No．60/030,232の利益を請求する。技術分野本発明はFGFシグナリング経路のモジュレーター、特にFGF−介在内皮管分枝形成、例えば、毛細血管分枝形成（脈管形成）および気管分枝のモジュレーター、およびその使用方法に関する。発明の背景正常な毛細血管は内皮細胞と血管周囲細胞から成り、血液を全身の組織に輸送する働きをする。血管新生または脈管形成とは既存の血管から新たな毛細血管の増殖と発達である。脈管形成は血管系の初期形成ならびに生殖および創傷治癒にとって本質的なものである。しかし、種々の腫瘍性癌、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、リューマチ性関節炎および乾癬を含む未調節の持続性血管新生により特徴づけられる症状がある。それ故、脈管形成の分子原理を理解することが望ましく、それが未調節の持続性血管新生により特徴づけられる癌などの症状、あるいは創傷治癒などの脈管形成の増大を必要とする症状を処置するための治療計画を立案する基礎となる。発明の要約本発明はその一側面において、単離した組換えスプルーティ（sprouty）ポリペプチドを包含し、該ポリペプチドは(1)タンパク質であって、そのアミノ酸配列のシステインに富む領域が、全長配列がSEQ ID NO:８により確認されるヒトのスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性をるタンパタ質、または（2）それから誘導されるペプチドであって、少なくとも１０個のアミノ酸を有するペプチドから成るものである。例示としてのタンパク質はSEQ ID NO:８に実質的に一致する配列を有するヒトスプルーティ２タンパク質、SEQ ID NO:６に実質的に一致する配列を有するヒトスプルーティ１タンパク質、およびSEQ ID NO:１１に実質的に一致する配列を有するヒトスプルーティ３タンパク質を包含する。該タンパク質は例えば患者の充実性腫瘍の治療に使用できるが、その場合、腫瘍の増殖を阻害するのに有効なタンパク質量を患者に投与する。この治療法において、該タンパク質は、約１５０nm未満の平均サイズを有し、その表面をポリエチレングリコールでコーティングしてあるリポソームに包含させるのがよい。他の側面において、本発明はスプルーティポリペプチドをコード化する単離したDNAフラグメントを包含し、該ポリペプチドは(1)そのアミノ酸配列のシステインに富む領域が、全長配列がSEQ ID NO:８により確認されるヒトのスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性を有するタンパク質、または（2）それから誘導されるペプチドであって、少なくとも１０個のアミノ酸を有するペプチドである。例示としての配列は、（1）SEQ ID NO:８に実質的に一致する配列を有するヒトスプルーティ２タンパク質をコード化する配列、例えば、SEQ ID NO:７により確認されるDNA配列、（2）SEQ ID NO:６に実質的に一致する配列を有するヒトスプルーティ１タンパク質をコード化する配列、例えば、SEQ ID NO:５により確認される領域を含むDNA配列、および(3)SEQ ID NO:１１に実質的に一致する配列を有するヒトスプルーテイ３タンパク質をコード化する配列、例えば、SEQ ID NO:１０により確認される領域を含むDNA配列を包含する。関連する側面において、本発明は組換え発現ベクターを包含し、該ベクターは上記DNAコーディング配列、およびフラグメントに結合して、選択した宿主中で該タンパク質の発現を促進することのできる操作可能な調節配列から成る。該ベクターは細胞のトランスフェクションに使用するために、ポリカチオンとの複合体として約１５０nm未満のサイズの縮合粒子を形成させ、細胞からのスプルーティタンパク質の分泌を増加させる。該複合体は腫瘍細胞表面に特異的に結合し得る標的部分をさらに含む。該ベクターで形質転換した哺乳動物細胞も開示する。さらに他の側面において、本発明は哺乳動物被験体において活性な哺乳動物スプルーティタンパク質の異常レベルにより特徴づけられる症状またはそれに関連する危険因子を検出する方法を包含する。該方法は被験体からゲノムDNAまたはc DNAを取得し、該DNAまたはcDNAについて、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:７およびSE Q ID NO:１１により同定される遺伝子から成る群より選択されるヒトスプルーティ遺伝子に関して突然変異の有無を試験することを包含する。本発明はまた哺乳動物被験体において活性な哺乳動物スプルーティタンパク質の異常レベルにより特徴うけられる症状またはそれに関連する危険因子を検出する方法を包含し、該方法は被験体の組織または器官から体液を採取すること、該体液を上記型のヒトスプルーティタンパク質に対する抗体と反応させ、タンパク質−抗体複合体を形成し、次いで、かかる複合体の存在を確認することを含む。本発明のこれらの目的および他の目的ならびに特徴は、以下の詳細な記載を添付の図面と組合わせて読むことにより、より完全に明らかなものとなろう。図面の簡単な説明図１A、１Bおよび１Cは発生分化途上ショウジョウバエの気管系における単細胞分枝の模式図である。第５気管単位につき第１２期（図１A）、第１６期（図１B）および第３齢幼生（図１C）を示す。図２A〜２Hは野生型（＋）およびSpryΔ⁵突然変異胚における異所性背面（DB ）および神経節（GB）分枝を示す顕微鏡写真である。図２A、２C、２Eおよび２Gは胚全体を示す。図２B、２D、２Fおよび２Hはクローズアップを示す。図３A〜３Lは細胞の分布および野生型(+)およびSpryΔ５突然変異気管系における分枝マーカーの発現を示す。図３A、３B、３Eおよび３Fは背面分枝の顕微鏡写真である。図３Cおよび３Dは神経節分枝の透写図である。図３Kおよび３Lは野生型（図３K）およびSpryΔ⁵（図３L）幼虫背面分枝の顕微鏡写真である。図４A、４Bおよび４Cは細胞質β−gal（ガル）の発現（Spry⁺）または発現の欠損（Spry^-）により識別されるSpryおよび野生型細胞のモザイククローンの顕微鏡写真である。図５A〜５DはSpryゲノム座（図５A）、Spry発現パターン（図５B）、Spry DNA とアミノ酸配列（図５C）、およびSpry配列の線列（図５D）を示す。図６A、６Bおよび６CはSpry（赤）およびノッチ（Notch）（緑）タンパク質の細胞レベル下の位置関係を示す第１４期胚の顕微鏡写真である。図７A〜７Hはショウジョウバエ胚におけるSpry−lacZ（図７A〜７D、７Fおよび７H）およびSpry mRNA（図７Eおよび７G）発現の経時変化を示す顕微鏡写真である。図８A、８Bおよび８Cはショウジョウバエ胚におけるSpryタンパク質の異所性発現の効果を示す顕微鏡写真である。図９A〜Pは実施例９に詳説したショウジョウバエ胚におけるBn1経路上のSpry 突然変異の影響を説明する顕微鏡写真である。図９A〜EはSpryおよびpntの発現に際してのSpry突然変異の影響を示す。図９A〜９KはDSRFの発現に際してのSpry 突然変異の影響を示す。図９L〜NはYanの発現に際してのSpry突然変異の影響を示す。図９０および９PはSpryの上昇したレベルの影響を示す。図１０A〜Fは実施例１０に詳説したSpry発現に際してのBn1経路突然変異の影響を示す。図１０AはBn−１を発現する野生型細胞におけるDBの発生を図示したものである。図１０BはSpry⁹¹⁴³マーカーの免疫染色により可視化した発生下のD BにおいてSpry発現に際してのBn1経路変異体の影響を説明するものである。図１１はBN1−Spry調節回路の図式モデルを表す。図１２A〜Cは細胞培養（実施例１１）におけるSpryタンパク質、ショウジョウバエSpryおよびヒトSpry2の発現に対応するウエスターンブロットの結果を表す。ここで図１２Aは６６ｋＤのショウジョウバエSpryに対応し、図１２Bは３５〜４０ｋＤでのhSpry2タンパク質を示し、図１２CはショウジョウバエSpryを発現する均一化細胞の１００Kペレットおよび上清に相当する。図１３は完全なショウジョウバエSpryおよびヒトSpry2の整列したアミノ酸配列、およびヒトSpry １、ヒトSpry ３、マウスSpry １およびマウスSpry ４タンパク質の部分配列を示す。発明の詳細な記載 I．定義ポリペプチド配列またはフラグメントは、他のポリペプチド配列またはフラグメントから「誘導」し、その場合、それは誘導されるフラグメントの対応する領域と同じアミノ酸残基の配列をもつ。ポリヌクレオチド配列またはフラグメントは、他のポリヌクレオチド配列またはフラグメントから「誘導」し、その場合、それは誘導されるフラグメントの対応する領域と同じ核酸残基の配列をもつ。もし第一のフラグメントまたはその補体が選択的なハイブリッド形成条件下に第二の二重鎖ポリヌクレオチドハイブリッドを形成し得るならば、第一のポリヌクレオチドフラグメントは第二のポリヌクレオチドフラグメントに「選択的にハイブリッド形成可能」である。第一および第二フラグメントは一般に少なくとも１５個の長さのヌクレオチドであり、好ましくは、少なくとも１８〜２０個の長さのヌクレオチドである。ここで定義する選択的なハイブリッド形成条件とは〜 1.1Mの塩中、〜４５℃でハイブリッド形成し、次いで、0.3Mの塩中、３７℃で少なくとも１度洗浄することである。２以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドフラグメントは、２以上のフラグメントをそれらが互いに対応するように並べたときに、もしそのヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基がそれぞれ少なくとも総塩基または残基位置について特定の率で一致するならば、それらは少なくとも一定率の「配列同一性」を有する。「実質的に精製された」とはポリヌクレオチド、ポリペプチド、または関連化合物（例、抗Spry抗体）が、関係のないあるいは混在する成分（例、血清細胞、タンパク質、および非−抗Spry抗体）から分離されて少なくとも部分的に精製されたことをいう。問題の化合物または成分の単離または精製方法および手法を以下に記載する（例、融合タンパク質のアフィニティー精製およびSpryポリペプチドの組換え産生）。「Spryポリヌクレオチド」という用語は（1）スプルーティポリペプチドをコード化する単離されたDNAフラグメントをいい、該ポリペプチドは(a)タンパク質であって、そのアミノ酸配列のシステインに富む領域が、全長配列がSEQ ID NO: ８により確認されるヒトのスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性を有するタンパク質、または（b）それから誘導されるペプチドであって、少なくとも１０個のアミノ酸を有するペプチドから成るものである。もう一つの選択肢として、該用語は少なくとも３０個、好ましくは少なくとも１００個の長さのヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、その領域がSEQ ID NO:１、SEQ ID NO:５、 SEQ ID NO:７で表される配列またはその一つの配列の補体と選択的にハイブリッド形成可能なポリヌクレオチドをいう。「Spryポリヌクレオチド」とは、（a）タンパク質であって、そのアミノ酸配列のシステインに富む領域が、全長配列がSEQ ID NO:８により確認されるヒトのスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性を有するタンパク質、または（b）それから誘導されるペプチドであって、少なくとも１０個のアミノ酸を有するペプチドから成るポリペプチドをいう。 II．過剰な気管分枝を引起こすスプルーティ・アレレの同定実施例１に詳述した変異誘発の研究はパンチップ−２（Pantip−２）気管マーカーの発現パターンに関係する遺伝子を同定するために実施した。Pantip−２気管マーカーは６３D1,2のP[lacZ]挿入断片であり、そこではそれらが気管を形成するに従い、ベーターガラクトシダーゼマーカータンパク質が発現される（サマコブリス（Samakovlis）ら、1996）。初期の挿入断片（2683）はホモ接合生存可能であり、正常な気管分枝パターンを示した。１００種のP−要素切除アレレはトランスポザーゼの導入により生成させ、致死性と胚気管表現型につき評点した。回収した１２の致死性切除アレレの内、３種（sproutyΔ⁵、sproutyΔ⁶⁴、およびs proutyΔ⁵⁵）は下記のごとく余分の気管分枝を示し、単一の相補性群を代表した。実施例２に詳述するように、SpryΔ⁵/SpryΔ⁵胚は１６胚期で殆どの一次分枝（背側分枝、側方前方幹と側方後方幹および神経節分枝）からの正常な発生の1. 5ないし２倍の微細分枝となった。また、内蔵分枝からの正常な発生の〜３０％以上の分枝となった（図２、表１）。余分の気管分枝が気管ネットワーク全体の多くの部位に発生していた（図２C、G）が、無秩序に分布はしていなかった。むしろ、余分の分枝は二次的および末期の分枝が通常形成される部位の周辺に群生していた（図２B、H）。一次分枝パターンはSpry変異体に影響されていなかった。一次分枝はすべてその正常な長さに成長し、発生の適切な時点でその目的部位に達していた。他の切除アレレ（SpryΔ⁶⁴、SpryΔ⁵⁵）は同様の表現型を示したが、SpryΔ⁵⁵は他のものよりも弱かった。優性眼部表現型（クラマー（Kramer）ら、1995）を抑制する変異のための非関連選抜において回収された５種のEMS−誘導Spryアレレ（Spry²⁵⁴、Spry²¹¹、Spr y²²⁶、Spry^G5、Spry^F7）は、６３D領域において同一の遺伝子間隔に地図化され、SpryΔ⁵と同じ気管表現型をもっていた（表１）。Spry²⁵⁴は試験したが、気管機能と致死性に対し３種の当初Spryアレレには相補しなかった。EMS変異体のすべてについて分子分析した結果Spryコーディング配列に損傷を確認した。８種のSpry突然変異すべてがDf(3L)1226、Df(3L)1227、Df(3L)Hr119、Df(3L)H r232を含む６３D領域における欠損のために幼生の死をもたらす。 SpryΔ⁵ホモ接合体はSpryΔ⁵/Df(3L)1226およびSpryΔ⁵/Df(3L)Hr298のように気管表現型として厳密に作用するが、このことはSpryΔ⁵が強い機能喪失性であるか無効なアレレであることを表している（表１）。発生途上の気管系におけるSpryの遺伝子モザイク分析を下記実施例４に記載したように実施し、どの細胞中でSpry遺伝子が分枝を阻害するように機能するかを決定した。ホモ接合性SpryΔ⁵変異体クローンは一般気管lacZマーカーを担持するSpryΔ⁵染色体およびSpry⁺染色体間のFLP−介在有糸分裂組換え（スーおよびルビン（Xu and Rubin），1993）を用い、SpryΔ⁵/＋動物において産生した。Sp ryΔ⁵ /SpryΔ⁵変異体気管細胞はlacZマーカーの発現不在により確認した。ショウジョウバエSpry（Dro Spry）cDNAは実施例５記載のとおりにクローン化した。Dro Spryのゲノム構造、発現パターンおよびcDNAとアミノ酸の配列を図５ A~５Dに示す。図５AはDro Spryゲノム座および遺伝子構造の図式を示す。3種のc DNAを単離し、ゲノム・サザーン、PCRおよびＤＮＡ配列決定によりその領域のゲノム・コンティーグ（contig）上に地図化した。エクソンを四角形で示す。黒地四角形は読み取り枠であり、白抜き四角形は非翻訳領域である。８kbのHindIII/BamHIゲノムフラグメントを胚芽ショウジョウバエcDNAライブラリーのスクリーニングに用いた。３つのサイズ分類に入る７種のcDNAクローンを単離した。分類の振り分けは交差ハイブリッド形成および制限酵素分析ならびに配列決定により確認した。cDNAフラグメントを消化したゲノムファージＤＮＡにハイブリッド形成することによりエクソンを地図化した。イントロン/エクソンの境界をｃＤＮＡからのプライマーを用いるゲノムＤＮＡのPCR分析により、また、ケノムDNAの関連する領域を配列決定することにより決定した。図５CはｃＤＮＡクローン12.2のポリヌクレオチド配列（SEQ ID NO:１）および翻訳されたアミノ酸配列（SEQ ID NO:２）を示す。タンパク質配列の分析が示唆するところによると、Spryタンパク質は新規な１２４残基のシステインに富む領域を含む６３kDの膜結合または分泌タンパク質である（SEQ ID NO:４）。該１２４残基の領域はSEQ ID NO:３として本明細書に表される配列によってコード化される。 III．Spry タンパク質の性質 A．側生芽阻害シグナルをコード化するSpry 側生芽阻害は特定の発生運命を採用するために選択された等力価細胞群内の１個の細胞が、その同じ発生運命を採用しないように周辺を阻害する過程である。側生芽阻害が存在しない場合には、該選択細胞を切除することにより、あるいは側生芽シグナリング経路の成分を不活性化することにより、等力価群内の他の細胞は同じ発生運命を採用する。本明細書に提示するデータは上皮管分枝に際しての側生芽阻害シグナルとしてのスプルーティの機能を支持する。図２A〜Hに示すように、正常な分枝部位周辺に生じる余分の気管分枝はSpry機能喪失変異体に発生する。余分の分枝は形態学またはマーカー発現により（図３A〜３L）正常の分枝と識別可能であり、非分枝化細胞が分枝化の発生運命に変わることにより生じる。さらに、Spryは分枝形成細胞に発現され、遺伝子モザイク分析は該遺伝子がこれらの細胞に必要であり、かつ、非自律的に作用して周辺細胞が分枝化するのを阻害する（図４A〜４C）。最後に、Spry遺伝子は推定上のシグナルペプチドとシステインに富む長鎖ドメインをもつタンパク質をコード化し（図５C）、免疫局在化の研究において小胞中とプラズマ膜に当該タンパク質を検出した(図６A〜６C)が、このことはSpryが分泌または膜関連タンパク質であることを示している。これらのデータはSpryタンパク質が側生芽阻害シグナルまたはその本質的な成分であることを証明している。気管系外の分枝化の阻害におけるSpryの役割は、 Spryが気管系に加えて幾つかの発生途上ショウジョウバエ組織において発現され、少なくともこれら組織のあるものにおいて阻害シグナリング経路で機能すると思われることを示すデータにより支持される。 Spry変異体胚において、余分の気管分枝は分枝形成の正常部位近くに芽を出す。異所性分枝を生ずる細胞は正常な分枝形成細胞と区別し得ず、正常の非分枝化細胞を分枝形成予定のものに転換することにより生じる。モザイククローンの分析はSpryが周辺細胞による分枝の形成を阻害するために正常分枝形成細胞に必要とされることを示していた。Spryは１２４残基のシステインに富むドメインを含む新規膜関連または分泌タンパク質をコード化し、該タンパク質は分枝化細胞発生運命へのスイッチを阻害し、気管上皮内の適当な位置に微細な分枝が形成されるのを制限するのに役立つ。 B．Bn 1 シグナリングの範囲を制限するSpry 本明細書に記載の遺伝子系統群を支持して行われたさらなる実験が示すところによると、SpryはショウジョウバエにおいてBn 1シグナリングの範囲を制限するインヒビターをコード化し、それによってFGFシクナリングセンターに近接する先端位置への二次的出芽を制限する（実施例９および１０）。分枝のない遺伝子（bn 1）は分枝事象において重要な役割を演じる線維芽細胞増殖因子（FGF）同族体をコード化する（サザーラント（Sutherland）ら、1996 ）。Bn1は分枝化にとって必要であり、新しい分枝が出芽する位置である気管嚢を取巻く細胞の個々の集団に活発に発現される。分泌された増殖因子は息のない FGFレセプター（Bt1）、すべての気管細胞上に発現されるレセプターキナーゼ（ RTK）を活性化し（グルイザーおよびシロ（Glazer and Shilo）、1991;リー(Lee )ら、1996）、一次分枝形成に際し気管細胞移動を先導する。Bn1はまた分枝パターン化における二次的役割を有する。これは増殖下一次分枝の終末に近い細胞における分枝化の後期プログラムを誘導し、この方法で二次分枝化の頂端片寄りに寄与する。この機能は典型的なRTKシグナリングカスケードにより形質導入されるように思われる（リー（Lee）ら、1996；サザーランド（Sutherland）ら、199 6；ハコーエン（Hacohen）、1997）が、このカスケードはYan、すなわち、ETSドメイン転写因子（レイおよびルビン（Lai and Rubin、1992）のMAPK依存性分解、および下流エフェクター遺伝子、すなわち、もう一つのETSドメイン転写因子であるポインテッド（pointed）およびブリスタード/プルーンド（blistered/pr uned）の誘発において最高潮に達する。なお、後者はDSRF、すなわち哺乳動物の血清応答因子のショウジョウバエ同族体をコード化している（ギルミン（Guille min）ら、1996）。 Spry⁺がBn1経路を制限することにより機能しているのか、あるいは何か他の方法で分枝化を防御しているのかを決定するために、Bn1経路における下流エフェクター（pnt、Yan、DSRF遺伝子）上のSpry突然変異の影響を試験した（実施例９）。Spry変異体において、試験した５つすべての下流エフェクター（pnt、Yan、 DSRF、末端−２、−３、−４）は、異所性分枝を後に形成する前柄チョーク細胞を含む拡張ドメインにおいて発現した（図９B、E、GおよびI）。DSRFマーカーは正常分枝化細胞におけると同時に活性化された（図９J、K）。Spry変異体において、YanはpntおよびDSRF発現の拡張ドメインと同時に起こる拡張ドメインにおいて分解された（図９L、M）。これらの知見はSpry機能喪失突然変異がこのBn1経路において既知の下流エフェクターすべてを高揚させることを示している。さらに、Spry遺伝子産物を１０〜１２胚芽期に過剰発現するように設計した機能状態の獲得か下流エフェクターの正常誘発およびBn1による分枝化をブロックした（図９０、P）。これらの結果は Spryが遺伝子的にBn1経路の競合アンタゴニストとして機能することを明らかにしている。本発明を支持するために実施したさらなる実験はSpry発現がBn1シグナリング経路によって誘導されることを示している(実施例１０)。 IV．Spry ポリペプチド図１３はショウジョウバエSpryおよびhSpry2（ヒトSpry2）タンパク質の直線化した全長のアミノ酸配列、およびhSpry1、hSpry3、mSpry1（マウスSpry1）とm Spry4タンパク質の部分配列の線列を示す。この図で特に対象となる領域は残基番号３８０と４２４の間であり、ここでアミノ酸残基番号とはショウジョウバエタンパク質のアミノ酸番号をいう。この領域はまたSpryタンパク質の最もシステインに富む領域としてここではいい、当該図の３８０〜５０３領域により規定されるより大きなシステインに富む領域とは区別する。図の3種のヒトSpryタンパク質（上の３列）において、最もシステインに富む領域の４５アミノ酸配列は、 SEQ ID NO:１７、１８と１９によってそれぞれ示されるhSpry２、ｈSpry1および hSpry3に対して同定される。この３つの領域は25/45の配列同一性、すなわち、約５５％の配列同一性を有する。より一般的に、本明細書において定義されるSpryポリペプチドは、そのシステインに富む領域が、その全配列がSEQ ID NO:８により同定されるヒトスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。 SpryポリペプチドはまたSpryタンパク質から誘導され、少なくとも１０個のアミノ酸の配列を有するペプチドを包含する。すなわち、該ペプチドは上に定義したようにSpryタンパク質の１０マーに相当する１０個のアミノ酸を含む。好ましくは、該ペプチドは少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個のSpryタンパク質からの連続したアミノ酸を含む。 Spryポリペプチドは組換えによりまたは合成的に製造し得る。組換え生産の例は「材料と方法」に記載するか、この場合、pGEX−誘導プラスミド（pGEX−４T −２、ファルマシア・バイオテック、ピスカタウエイ、ニュージャーシーから入手）を用い抗体産生用Spryポリペプチドを発現する。該pGEXプラスミド（スミス（Smith）ら、1988）およびその誘導体はグルタチオン−S−トランスフェラーゼと枠内に融合したクローン化挿入断片のポリペプチド配列を発現する。組換えpG EXプラスミドは適切な大腸菌株に形質転換することが可能であり、融合タンパク質の生産はIPTG（イソプロピル−チオガラクトピラノシド）を付加することにより誘導することができる。可溶化組換え融合タンパク質は、次いで、誘導培養物の細胞溶解物から、標準法（オウスベル（Ausubel）ら、1988）に従いグルタチオン・アガロースアフィニティークロマトグラフィーを用い精製することができる。アフィニティークロマトグラフィーはβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（ラムダgt11クローンにより産生されるものなど）を単離するのに採用してもよい。融合タンパは表面にβ−ガラクトシダーゼ抗体を結合した固相担体に細胞分解物を通過させることにより単離する。ヒト２９３細胞中の哺乳動物EF−１αプロモーターの制御下、ショウジョウバエSpryおよびヒトSpry2の発現を実施例１１に記載する。上記のように産生させた単離組換えポリペプチドを標準的はタンパク質精製手法により精製する。これらの手法は分画沈殿法、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーである。組換え法に加えて、Spryタンパク質またはポリペプチドは抗−Spry抗体を用いるなど、アフィニティに基づく方法により選択した細胞から単離することができる（下記）。さらに、Spryペプチドは当業者既知の方法を用いて化学的に合成してもよい。本発明のポリペプチドは抗体産生を含む多くの方法に用いることができる。該ポリペプチドは未修飾の形で用いてもよいし、適切な担体分子、例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキホール・リンペット・ヘモシアニン（KLH）(例えば、ピアース、ロックフォード、イリノイから入手可能)などと結合してもよい。 V．Spry ポリヌクレオチド本明細書に定義するSpryポリヌクレオチドは上に定義したSpryタンパク質あるいはSpryタンパク質から誘導されペプチドをコーディングするポリヌクレオチドであって、該タンパク質は、そのシステインに富む領域が、その全配列がSEQ ID NO:８により同定されるヒトスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を意味するものであり、該ペプチドは少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５〜２０個のアミノ酸を有するものである。すなわち、該ペプチドは上に定義したSpryタンパク質の１０マー配列に相当する１０個のアミノ酸を含む。NCBIとBLASTのサーチを組合わせたデータベースは密接に関連したタンパク質を検出しなかった。しかし、発現配列標識（dbEST）データベースをサーチしたところ、本明細書においてhSpry（SEQ ID NO:５、６）（クローン142025、I MAGE集合体クローン、レノン（Lennon）ら、1996）、hSpry2（SEQ ID NO:７、８、９）（クローン40262）、およびhSpry3（SEQ ID NO:１０、１１；クローンXAP 128）として参照する３種のヒト同族体を同定した。完全コーディング配列をhSp ry2（40262）（SEQ ID NO:７）について決定し、部分配列は重複ｃＤＮＡ（1420 25、78383および727987）からのhSpry1（SEQ ID NO:５）につて決定した。 hSpry2配列は３５ｋＤの質量をもつ３１５残基のペプチドを予測させる。それはSpryについて高い保存性（２２Spryシステインの内２１が５１％の同一性を保存）を有するシステインに富むドメインおよびN末端領域にSpryと類似のさらに２つの短い伸長部を含んでいる。hSpry1およびhSpry3はシステインに富むドメインについて高い保存性を示し、入手可能な配列において他の系列群メンバーと５１〜７０％の同一性を有する。スプルーティ遺伝子系列群の一部であることが判明したさらなるマウスESTはm Spry1、SEQ IDNO:１２、１３（907842）、mSpry2、SEQ IDNO:１４（819774）、およびmSpry4、SEQ IDNO:１５、１６（919795）を包含していた。ショウジョウバエSpry配列をもつ全長hSpry2配列およびhSpry1とhSpry3の部分配列の線列を図５Dに示す。図５Dに言及すると、同一性は灰色で強調してあり、点々は線列を最大にするために挿入したギャップを表す。括弧内の番号は示されていないSpry残基の数を示す。システインに富むドメインおよびSpryと相同性の２つの短鎖領域を四角で囲んである。システインに富むドメインにおいて、Spryに対する同一性は、hSpry1 が５１％（１０９残基の内５６残基）、hSpry2が５１％（１２４残基の内６４残基）、そしてhSpry3が６０％（４５残基の内２７残基）であり、互いの同一性は〜５７ないし７０％である。星印はSpry中のシステインを示し、（＊）は、hSpr y2中には保存されていない１個のシステインを示す。これらの結果は、新たな保存システインに富むドメインがタンパク質中で重要な役割を演じていることを示唆する。 hSpry1およびhSpry2の全長クローンは本明細書の説明（特に、配列情報）を既知の分子生物学技法と組合わせて用いることにより、当業者が単離し得るものである。例えば、重複クローンは、期の適切な（例、胚期）上皮細胞から作製される無作為プライマーまたはオリゴ(dT)−プライマーヒトcDNAライブラリーをスクリーニングする際のヒトのクローン（例、hSpry1Aクローン（SEQ ID NO:５）またはhSpry2A（SEQ ID NO:７））またはそのフラグメントの一つをプローブとして採用することにより取得することができる。かかるライブラリーは、例えば、クロテック（パロアルト、カリフォルニア）から入手可能である。陽性のクローンを単離し、配列決定し、そして新しい配列情報を次回スクリーニングのプローブを産生するために使用する。クローンの適切な領域からのフラグメントを、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または制限エンドヌクレアーゼでの切断により作製することができる。これらのフラグメントは、例えば、ラムダgt10において作製されるライブラリー選抜における放射標識プローブとして用いることができる。特に、クローン挿入断片の５ 'および３'末端配列は付加的重複クローンを同定するためのプローブとして有用である。もし全長ｃＤＮＡがライブラリーから単離されないならば、周知の技法を用いて重複クローンを一緒にスプライスし、全長挿入断片を作製する（オウスベル（ Ausubel）ら、1988；サムブルーク（Sambrook，J.）ら、1989）。例えば、全長配列を２つの挿入断片間の重複領域のユニークエンドヌクレアーゼ制限部位に対する配列分析プログラム、例えば、「MACVECTOR」（IBI、ニューヘブン、コネチカット）により分析する。該クローンはエンドヌクレアーゼにより消化して該ベクターから挿入断片を単離し、エンドヌクレアーゼは重複領域において切断する。消化した挿入断片は調製用ゲル上単離し、精製し、結合して２起源の挿入断片を範囲とする挿入断片を形成させる。 VI．診断応用 Spryタンパタ質およびコーディング配列がもつ用途は、（1）Spry遺伝子に突然変異が存在するか否かを検出すること、および（2）一定の組織または器官に存在するSpryタンパク質のレベルを検出することであるが、それらは、例えば、一定の組織または器官に一次もしくは二次腫瘍として存在する充実性腫瘍などである。 A．Spry 遺伝子突然変異の有無１以上のSpry遺伝子内に突然変異を検出することは、（1）分枝化メカニズムにより影響される癌などの病原性状態に至る個々の遺伝的素質を決定するために、または（2）治療の基礎として癌などの既存症状における欠陥Spry遺伝子の可能な役割を検出するために興味のあることである。前者の場合には、簡便な組織原からの体細胞、例えば、血液細胞をゲノムＤＮＡの起源として採用する。後者の場合には、ｃＤＮＡを病原細胞、好ましくは例えば、腫瘍細胞から入手し、Sp ry遺伝子転写物の評価並びに該遺伝子のコーディング領域における突然変異の有無評価を可能とする。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを得る方法は周知である（例えば、サムブルーク（Sambrook）ら、1989参照）。突然変異の有無は多様な利用可能技法の一つにより決定することができる。一方法において、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは既知コーディング配列から選択したプライマーを用いてPCRにより増幅する（ムリス（Mullis）,1987；ムリスら、 1987；サイキ（Saiki））。一般に、プライマーは全長コーディング配列または既知の大きさのコーディング配列フラグメントを増幅するために選択する。増幅したフラグメントは次いで分画し、標準法、例えば、ジデオキシ終止配列決定またはハイブリッド形成による配列決定法により配列決定する。代わり得るのはサザンブロッティング法であり、この方法により一定のプローブ配列を含む制限酵素ＤＮＡ消化物中のフラグメントを同定するか、あるいは制限−フラグメント長の多形性（RFLP）を分析する。この技法ではRFLPバンドにより制限切断部位での点突然変異、および欠失、付加または転移突然変異を検出することができる。全体としての固体群に存在する突然変異が既知となり、カタログに収載されるようになって、多くの既知突然変異中の一つを迅速に検出する方法が使用可能となったのは有り難いことである。例えば、２００もの異なる突然変異が嚢胞性繊維症と関係がある。プローブ結合法により既知標的配列を同定する方法が報告されている（ウー（Wu）ら、1989；ホワイトリー（Whitely）ら、1989；ランデクレン（Lundegren）ら、1988；ウイン−ディーン（Winn-Deen）ら、1991）。一つの方法は、オリゴヌクレオチド結合アッセイ（OLA）として知られ、対象となる標的領域に及ぶ２つのプローブまたはプローブ要素を標的領域とハイブリッド形成させる。プローブ要素がプローブ要素の向き合った末端で隣接する標的塩基と相補（塩基対形成）する場合、２つの要素は、例えば、リガーゼでの処理により連結反応して結合する。連結したプローブ要素を次いでアッセイし、標的配列の存在を証明する。この方法の改良法では、連結したプローブ要素が一対の相補プローブ要素に対し鋳型として働く。２つの相補性対プローブ要素の存在下、連続したサイクルの変性、再アニーリングおよび連結反応により、標的配列を幾何学的に増幅し、極微少量の標的配列の検出および/または増幅を可能とする。この方法はリガーゼ連鎖反応（LCR）ともいう。一定の組織中Spry遺伝子転写物のレベルは、例えば、定量的PCR法により定量することができるが、その場合試験ｃＤＮＡの混合物および正常（対照）ＤＮＡの混合物を並行して増幅し、次いで、例えば、ケル上での分画および増幅したＤＮＡ，対照ＤＮＡと試験標識ＤＮＡ中の放射標識ＤＮＡの定量により相対量を比較した。Ｂ．Spry タンパク質のレベル測定 Spryタンパク質の有無、または一定サンプル、例えば、腫瘍サンプル中のSpry タンパク質のレベルを測定することは、一定の条件、例えば、癌などの病因症状がSpryタンパク質の異常レベルによるものか、あるいは該タンパク質の不活性型によるものかを決めるのに有用である。該Spryタンパク質は一般に対象組織または器官の細胞外液、例えば、充実性腫瘍において測定する。 Spryタンパク質レベルの検出は、好ましくは、試験サンプルを選択したSpryタンパク質に対して特異的な抗体と混合することにより実施する。「材料と方法」に記載したように、抗体はウサキなどの宿主動物を精製したポリペプチドまたは融合タンパク質（例えば、上記のグルタチオン−S−トランスフェラーゼを用いて産生）で免疫することにより調製することができる。宿主の血清または血漿を適当な時間間隔に従い収集し、その血消をポリペプチドに対する特異的な抗体につき試験する。免疫した動物のガンマグロブリン分画またはIgG抗体は、例えば、飽和硫酸アンモニウム沈殿法を使用することにより、またはDEAEセファデックスクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、または他のポリクローナル抗体産生に関する当業者既知の技法により入手することができる。別法として、精製した抗原性ポリペプチドまたは融合抗原タンパク質をモノクローナル抗体産生のために使用してもよい。この場合、免疫した動物から脾臓またはリンパ球を取り出し、不死化するか、あるいは当業者既知の方法によりハイブリドーマを作製するのに用いる（ハーロウ（Harlow，E.）ら、1988参照）。不死化細胞により分泌された抗体は（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA ）またはウエスターンブロットを用いて）スクリーニング化、所望特異性の抗体を分泌するクローンを決定する（例えば、オウスベル（Ausubel）ら、1988参照）。液状サンプルを該抗体と反応させてタンパク質/抗体複合体を形成させ、混合物につき複合体の存在/量をアッセイする。このアッセイについて適当な種々のイムノアッセイ方式が既知である。単離したタンパク質の比活性をアッセイすることもまた望ましい。これを実施するには、例えば、試験サンプルを処理して干渉物質、例えば、FGFを除去し、精製したまたは部分的に精製したサンプルのSpryタンパク質活性または、例えば、上記のようにSpryタンパク質活性をアッセイする。アッセイの結果は、試験が活性Spryタンパク質の欠除を示すと仮定して、該タンパタ質が低レベルで産生されるか、あるいは活性型で産生されるので、下記の方法に従って１種以上のSpryタンパク質のレベルを補うための、または増加させるための治療計画立案に使用する。 VII．治療応用腫瘍が無制限に増殖するのは血管形成に依存し、血管形成因子の放出または抗 −血管形成因子の喪失による血管形成の誘発が腫瘍形成における重要なステップであることが知られている。ある種動物の腫瘍は血管形成を阻害すると退化するという証明が、腫瘍増殖における血管形成の役割に対する注目すべき証拠を提供している（オ・レイリー（O'Reilly）ら、1994）。 A．Spry タンパク質治療治療応用の１つにおいて、本発明はSpryペプチドまたはポリペプチドを投与することにより、上皮管の分枝化、例えば、血管形成を阻害する方法を含む。この方法において、Spryペプチド（例、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:６またはSEQ ID NO:８として表される配列をもつペプチド）の薬理的有効量が治療の必要な患者の細胞（例、腫瘍細胞）に送達される。特に、本発明の方法は関連する新生血管形成または血管形成をもつ増殖途上充実性腫瘍のヒト患者を治療するのに用いることができる。本発明の方法および組成物を用いる治療に適した癌のタイプは、充実性腫瘍癌、例えば、肺癌、結腸−直腸癌、乳癌、尿路癌、頚部癌、胆管癌、脳癌、絨毛癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、肝臓癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、睾丸癌、甲状腺癌、および腎臓癌を包含する。この治療を受け得る他の疾患の状態は、例えば、網膜内での血管増殖により起こる糖尿病性網膜症を含む。この方法に従うと、スプルーティポリペプチドまたはそのフラグメント（[sty pep]）は患者に対して、好ましくは患者の腫瘍部位において、証明されるように、新生血管形成を阻害し、腫瘍増殖を阻害するのに十分な量で投与する。該Spryタンパク質は技術上既知の様々の方法、例えば、経口、鼻腔注入、眼内、非経口、および肛門および/または膣坐剤投与法により投与する。さらに、該s typepはそれが脈管外血流を経て標的部位に到達するような方法で投与してもよい。脈管外投与は既知の方法により該治療ペプチドを腫瘍に直接注入するか、または移植することにより実施する。例えば、該ペプチドはポリー２−ヒドロキシエチルメタアクリレートまたはメチレンビニルアセテート・コポリマーなどの徐放性ポリマーと組合わせることができる。皮膚癌に対しては、該ペプチドを局所用軟膏と組合わせて直接腫瘍表面に塗付する。その他の有用な手法としては、肺腫瘍に投与するエアロゾル形態に該ペプチドを製剤化して、エアロゾル送達の呼吸器療法士が使用する標準的装置を用いて投与する。充実性腫瘍を外科的に取り除く場合、移植片を除去した腫瘍部位に埋め込み、同じ部位に再生する腫瘍の血管形成を阻害する。腫瘍の拡大を減じるのに投与量は腫瘍の大きさおよび部位により変わる。量は１マイクログラム（μg）から１ミリグラム（mg）の範囲である。好ましい量は通常投与１回当たり１００μgないし８００μgの範囲であると信じられる。一般にその量を腫瘍の増殖を遅延させるに十分な腫瘍部位に投与する。この目的に必要な量は標準手法によりモニターすることができる。インヒビターを投与したにもかかわらず腫瘍がなお増殖し続ける場合には、追加量を投与する。好ましくは、十分な投与量を用いて腫瘍サイズの増加を実質的に止めるか、あるいはある場合には腫瘍サイズを縮小させる。かかる結果は関与する腫瘍の部位およびタイプにより多くの方法で観察することができる。これらの方法は、表面腫瘍の目視観察、動悸、放射線測定（例えば、肺腫瘍に対するX−線、乳癌用乳房X線像などの使用）、コンピューター断層撮影法スキャナー（CATスキャン）での超音波の使用、磁気共鳴影像法、放射性ヌクレオチド走査、および特定腫瘍型をモニターするのに用いる他の標準的臨床技術を包含する。充実性腫瘍に加えて、本発明のインヒビターは血管形成機能不全を含む他の疾患の治療薬として使用することができる。これらの疾患としては、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、血管形成緑内障、乾癬、血管線維腫、免疫性および非免疫性炎症（リューマチ性関節炎を含む）、動脈硬化プラーク内の毛細管増殖、血管腫、カポジ肉腫、子宮内膜炎、および創傷治癒における不要瘢痕形成などである。使用すべき量は血管形成発生部位で血管形成を部分的にまたは完金に防止するのに十分な量であるべきである。技術上既知の幾つかの方法を用い、かかるペプチドまたはポリペプチドを送達してもよい。代表的な送達法は標準的既知法を用いて選択したペプチドを充填したリポソーム（例えば、融合誘導リポソーム）を使用する。リポソームはさらにその表面に抗原、抗体またはウイルスなどの標的に向かう部分もしくはリガンドを含むように構築して、適切な組織、例えば、腫瘍などへの送達を容易にしてもよい。かかる標的に向かわせる方法は既知である（例えば、ベタゲリー（Betage ri）ら、1993）。該リポソームは、例えば、直接注入など、技術上既知の方法により組織に送達される。好ましいリポソームは約１５０nm未満の平均サイズを有し、腫瘍領域での毛細血管床を経て血管外遊出を可能とし、また、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーで表面を被覆することがリポソームの循環半減期を引き延ばすのに有効であり、腫瘍部位へのリポソームの移動を可能とするのに十分である。典型的な投与法では、治療化合物を治療期間一定の間隔で標的細胞に送達するが、これは医帥の参加のもとに決定する。例えば、治療ペプチドを約１μgと約１００μgの間の量で含むボーラス注入により毎日１回ないし数回送達する。もし該ペプチドが被包体（例、リポソーム）に容れてあるならば、送達する懸濁液の量は、選択したペプチドの薬学的有効量が送達されるように調整する。 B．遺伝子治療本発明はまた、例えば、血管形成における上皮管分枝化を阻害するのに適した遺伝子治療法と組成物を包含する。この観点において、Spryポリペプチド（例、 SEQ ID NO:６またはSEQ ID NO:８）をコード化するＤＮＡ配列は、分枝形成の阻害か望ましい組織（例、腫瘍）においてコーディング配列を発現するのに適した発現ベクターにクローン化される。発現ベクターの構築に有用な分子技術および方法は技術上周知である（例えば、オウスベル（Ausubel）ら、1988；サムブルーク（Sambrook）ら、1989）。多数のかかるベクターが既知である。それらは典型的には少なくとも１つの制限部位を含み、そこに所望のコーディング配列を挿入することができるが、同様に、組織特異的プロモーターを操作可能にコーディング配列に結合させ、細胞中のコーディング配列の転写を制御する。癌治療に用いる例示としての組織特異プロモーターは肝臓を標的とするα-フェトプロテイン・プロモーター、およびB−細胞新生物などの免疫グロブリン・エンハンサーを発現する新生物向けの短鎖メタロチオネイン・プロモーターを含む。該構築物は適当な動物モデル、例えば、オスノウスキー（Ossnowski）ら（199 1）のヌード・マウス・モデルなどの腫瘍モデルに移入することにより試験することができる。当業者周知の多くの方法はいずれも、本発明の遺伝子治療ベクターを選択した標的組織細胞、例えば、腫瘍細胞に導入するのに使用することができる。例えば、該ベクターはウイルス介在遺伝子運搬体を用い導入してもよい。この技法において、宿主細胞はハイブリッド・ベクター（選択したウイルス配列と共にSpryをコード化する構築物）を含む成熟ビリオンで感染させることにより移入する。宿主細胞に移入するのに用いるピリオンは、好ましくは複製能欠損しており、その結果ウイルスは宿主細胞中で複製することができない。該ビリオンは培養宿主細胞をヘルパーウイルスで同時感染することにより調製される。同時感染に続いて、該ビリオンを単離し（例えば、塩化セシウム遠沈）、残余のヘルパーウイルスを不活性化する（例えば、加熱により）。得られる成熟ビリオンは本発明の構築物またはキメラ遺伝子を含み、ヘルパーウイルスの不在下、宿主細胞を感染させるのに用いることができる。あるいは、ヘルパーウイルスを含まない高力価の複製能欠損組換えウイルスは、ウイルスが欠陥性となるこれらの成分を含む細胞株をパッケージングする際に産生することができる。別法として、ベクター構築物は遺伝子治療組成物として調製することができるか、例えば、ＤＮＡベクターとポリカチオン試薬、例えば、ポリリジンとで、好ましくは化学量論的電荷中和を生じるのに十分な量、例えば、１：１の電荷比で複合体形成させる。該ポリカチオンはさらに標的試薬、例えば、腫瘍を標的とする腫瘍−抗原−特異結合試薬と結合させる。サイズが４０〜１５０nmのこの型のＤＮＡ−ポリリジン−標的部分複合体を産生する方法は周知である。治療用複合体は種々の方法、例えば、静脈注射、カテーテル送達、または腫瘍塊への直接注入、または組織または血液細胞のex vivoトランスフェクションなどにより投与することができる。以下に実施例により説明するが、これらは決して本発明の制限を意図するものではない。材料と方法特に断りのない限り、すべての試薬はシグマ・ケミカル・カンパニー（セントルイス、ミズーリ）から購入した。以下に用いた略号は以下のとおりである。PAGE：ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動；SDS：ドデシル硫酸ナトリウム；BSA：ウシ血清アルブミン。 A．ハイの種および遺伝 Spry座の3種P−要素挿入断片（Spry²⁶⁸³、Spry¹⁸¹⁴およびSpry⁹¹⁴³）をエンハンサー・トラップ・スクリーンに同定し、パンチップ−２（Pantip−２）マーカーと呼称した（サマコブリス（Samakovlis）ら、1996）。Spry²⁶⁸³はホモ接合生存可能であり、正常の気管分枝形成を示す。Spry²⁶⁸³およびSPTy¹⁸¹⁴は６３D1、 2にP[lacZ，w＋]要素（ビール（Bier）ら、1989）を含む。Spry⁹¹⁴³）はP[lacZ ，ry＋]要素を含む。 B．抗体、BrdUおよびTUNEL染色胚をホルムアルデヒド中で固定し、メタノール中脱ビテリン化し、次いで記載の抗体で染色した（サマコブリス（Samakovlis）ら、1996）。胚は以下の抗体で染色した：無名の気管内腔抗原に対するマウスIgM mAb ２A12（１：５；サマコブリス（Samakovlis）ら、1996）；ベータ−ガラクトシダーゼに対するウサギポリクローナル抗血清（１：１５００；カッペル、ダーハム、NC）；ショウジョウバエ血清応答因子に対するマウスIgG mAb（１：１０００；ギレミン（Guillemin ）ら、1996）；ノッチタンパク質に対するマウスIgG mAb（１：３０００）。ビオチン−、Cy5−、Cy3−またはFITC−結合二次抗体をジャクソン・イムノリサーチ（ウエスト・グローブ、ペンシルバニア）より入手し、１：３００で用いた。 HR Pの組織化学を「ベクタステイン（VECTASTAIN）」ABCキット（ベクター・ラボラトリー、バーリンガム、カリフォルニア）で実施した。５−ブロモデオキシウリジン（BrdU）および末端デオキシリボヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（TdT）−介在ビオチン−16−dUTPニックエンド標識（TUN EL）染色を、第１０〜１６期からの野生型およびSpryΔ⁵胚を用いて、前記のように実施した（サマコブリス（Samakovlis）ら、1996）。 C．Spry 突然変異体の分子分析 Spry切除突然変異体の欠陥を、Ｐ要素挿入部位、完全Ｐ[lacＷ]要素およびSpr y cDNA12.2に側面を接するゲノムフラグメントでプローブした野生型と突然変異ケノムＤＮＡをゲノムサザーンブロット分析により決定した。EMS−誘導変異体の突然変異を同定するために、Spry遺伝子座の完全コーディング配列と１２２bp のフランキングＤＮＡは、突然変異体からのゲノムＤＮＡをＰＣＲ−増幅し、その産物のサイクル配列決定（フェントモル・サイクル配列決定、プロメガ）により決定した。ゲノムＤＮＡはDf(３L)HR119上のSpryEMS−アレレをもつ第３齢幼生から単離した（リス（Lis）ら、1983）。２つの独立したPCR産物を各アレレにつき配列決定した。 D．抗体産生および染色 Spry 12.2ｃＤＮＡの全長（ヌクレオチド(nt)１３２３〜３０９８）、N−末端（nt １５０９〜２７０８）およびC−末端（nt ２７７２〜３０９８）コーディング・フラグメントをPCRにより増幅し、pGEX−4T−２（ファルマシアビオテック、ピスカータウエイ、ニュージャーシー）のGSTコーディング配列の３'位に挿入した。Spry融合タンパク質をグルタチオン・アフィニティー・クロマトグラフィー（ファルマシア）により精製し、ジョスマンラボ（Josman Labs、ナパ、カリフォルニア）にてウサギとマウスに注射した。抗血清を全長GST−Spry融合タンパク質結合アガロースビーズ（ピアス・ケミカル、ロックフォード、イリノイ）を用い、アッフィニティー精製した。抗血清は０〜２時間固定した胚に対して４℃で一夜予め吸着させ、用いた。上清は１：５００〜１：１０００として胚染色に、また、１：５０００〜１：１００００としてイムノブロットに用いた。抗血清２６Aは全長Spry融合タンパク質を用いて産生させた。融合タンパク質0 .25マイクログラムをフロインドアジュバント中２週間隔で５回注射した。最終注射後１週目に血清を採取した。実施例１ Spry 突然変異誘発正常な気管分枝形成を示す変異体Spry²⁶⁸³（上記「材料と方法」参照）を以下のように突然変異誘発に使用した。Spry²⁶⁸³のP[lacW]挿入断片の切除をトランスポザーゼ供給のためにΔ２−３を有する第三染色体に交雑することにより起こした。個々の切除事象からの１００匹の白色眼オスを単離し、Ubx−lacZ導入遺伝子をもつ平衡染色体上に平衡系統として確立した。これら系統の成体子孫について第３染色体上の致死性変異の存在を評点した。各系統から収集した胚を気管内腔抗体mAb２A12および抗β−ガラクトシダーゼ抗血清で染色し、DIC顕鏡下気管欠陥を評点した。１００切除系の内、１２がホモ接合致死性であり、５が時に逸脱を伴った致死性、２４が準致死性、５６が生存した。３つの切除アレレ（５、６４、５５）が致死性の相補群を形成し、その領域での欠失により致死性であり、同様の劣性気管欠陥を示した。染色体欠失Df(3L)Hr232、Df(3L)Hr119およびDf(3L)Hr298(ホールウイルおよびボンナー（Wohlwill and Bonner）、1991）およびDf(3L)1226およびDf(3L)1227 （リンズレイおよびジム（Lindsley and Zimm）、1992）は６３D1,2領域の被いをとる。1226はSpryアレレの致死性または気管表現型を補完せず、サザン分析はそれがSpryエクソンを除去することを示した。Hr298は気管表現型に対してSpry を補完しなかったが、致死性または分子の障害については試験しなかった。Hr32 2、119および1227は致死性および気管表現型に対してSpryアレレを部分的に補完した。５種のEMS−誘発Spryアレレ（Spry²⁵⁴、Spry²¹¹、Spry²²⁶、Spry^G5、Spry^F7 ）は光受容体R2およびR5においてセブン−アップ（seven-up）の異所性発現により引起こされるラフ型眼部表現型の優先サプレッサーに対する選抜において同定された（クラマー（Kramer）ら、1995）。使用された末端細胞lacZマーカーはTerm-1（pruned/SRF、（ギレミン（Guille min）ら、1996）、Term-2、Term-3、およびTerm-4（サマコブリス（Samakovlis ）ら、1996）であった。Spry発現をモニターするために用いたエンハンサートラップはSpry⁹¹⁴³であったが、それが最強のlacZ発現力をもっていた。他のSpryエンハンサートラップ系は同じ発現パターンを示し、すべてがSpry cDNAプローブを用いる全封入mRNAのin situ発現と一致した（実施例７）。string-lacZ系（エドガー（Edgar）ら、1994）は分裂気管細胞においてlacZ発現力をもつ。細胞死に必要な幾つかの遺伝子を取り除くH99/TM6bの欠失（ホワイト（White）ら、199 4）は細胞死を除くために用いた。実施例２ Spry 突然変異体胚の異所性分枝形成気管形態学上Spry突然変異体の効果をmAb2A12での免疫組織化学内腔染色により評価した。代表的な結果を図１および２にそれぞれ図式により、また顕微鏡写真により提示する。発生分化する野生型ショウジョウバエ気管系の第５気管単位を図１A、１Bおよび１Cに異なる発生分化段階で図式化する。第５気管単位は他の繰返し気管単位のように、単細胞分枝を経て分化する。気管内腔を黒で縁取り、気管細胞の核を灰色とし、微細分枝を形成する細胞の核を黒塗りとする。第１２期に（図１A）、固定した位置から６本の一次分枝が成長してくる。第１６期までに（図１B）、一次分枝がその最終位置に達し、個々の末端細胞が微細（二次）分枝を形成し始める。第３齢幼生において（図１C）、各末端細胞が分岐し最終分枝を形成する。上に考察したように、この正常分枝パターンが中断される。図２A/２Bおよび２E/２Fは第１６期の野生型（＋）胚におけるかかる一次および二次分枝の全胚/クローズアップ顕微鏡写真である。図２C/２Dおよび２G/２H はSpryΔ⁵（Spry）胚の相当する分枝を示す。胚両側の背側分枝（DB）は図２A〜２Dに示した背側図に見ることができる。SpryΔ⁵胚における余分の分枝に注目（図２C/２D）。図２Bは１本の細い分枝（矢印）を有する野生型の１背側分枝のクローズアップを示す。SpryΔ⁵の対応する背側分枝は３本の細い分枝を有する（図２D）。図２E/２Fおよび２G/２Hは神経節分枝（GB）を示す腹部の図である。図２Fおよび２Hは野生型（図２F）の１本の細い分枝をもつ１本の神経節分枝およびSpry Δ⁵の２本の細い分枝（図２H）のクローズアップを示す。すべての異所性微細分枝は正常分枝の近傍に見出されることに注目。焦点面外側にある内腔を図２A、２C、２Eおよび２Gに破線でマークする。図２G（図２A、２C、２Eおよび２Gに対し共通）および図２H（図２B、２D、２Fおよび２Hに対し共通）の目盛り線は１０μmである。５種のEMS−誘発Spryアレレ（Spry²⁵⁴、Spry²¹¹、Spry²²⁶、Spry^G5、Spry^F7）は優性眼部表現型を抑制する突然変異のための無関係な選抜において回収された（クラマー（Kramer）ら、1995）。アレレのすべては６３D領域の同じ遺伝子間隔に地図化し、SpryΔ⁵と同じ気管表現型を有していた（表１、下記）。Spry²⁵⁴ を試験したが、気管機能および致死性に対する３つの最初のSpryアレレに補完しなかった。EMS変異体の分子分析はSpry254コーディング配列の損傷を確認した（下記参照）。８つのSpry突然変異すべてが、Df(3L)1226、Df(3L)1227、Df(3L)Hr119、Df(3L )Hr232を含む６３D領域の欠失により幼生の死に至った。SpryΔ⁵ホモ接合体はSp ryΔ⁵/Df(3L)1226およびSpryΔ⁵/Df(3L)Hr298のように気管表現型として厳正に振る舞ったが、このことはSpryΔ⁵が強い機能喪失または無効のアレレであることを述べている（表１、下記）。表１ Spryアレレにおける気管欠陥 * 一次背側分枝（DB）または神経節（GB）当たりのDSRF−発現微細分枝細胞の平均数。胚をmAb２A12で染色すると気管内腔が目視化され、抗SRFでは分枝細胞に印が付き、抗−β−galではTM3染色体からのUbx-lacZを発現する平衡胚からホモ接合型変異体を識別する。 ** ｎ＝計数された気管セグメントの数実施例３野生型（＋）およびSpryΔ⁵変異体気管系における細胞の分布と分枝化マーカーの発現野生型（＋）およびSpryΔ⁵変異体気管系における細胞の分布と分枝化マーカーの発現を比較した。その結果を図３A〜３Lに示す。図３Aおよび３Bは野生型（図３A）およびSpryΔ⁵（図３B）胚における全気管lacZマーカーの背側分枝発現を示す顕微鏡写真である。図３Cおよび３Dは野生型（図３C）およびSpryΔ⁵（図３D）胚の神経節分枝において、そのような発現をまとめて示す透視図である。矢印は微細分枝細胞を示す。図３E〜３Jはショウジョウバエ血清応答因子（DSRF）マーカーを使用する顕微鏡写真であり、該マーカーは野生型肝とSpryΔ⁵胚双方における微細分枝形成細胞の核に発現される。図３Eは野生型胚の背側図であり、２つの一次背側分枝であって、各分枝に１つの末端細胞（矢印）を有する。図３Fは第１６期のSpryΔ⁵ 胚の背側図であり、それぞれが２つの末端マーカー発現細胞をもつ背側分枝を示す。図３Gは１つの末端細胞を有する第１６期の野生型神経節分枝を示す。図３Hは２つの末端細胞を有する第１６期のSpryΔ⁵神経節分枝を示す。図３１は１つの末端細胞を有する、末端マーカーが動き始める時点での第１３期野生型神経節分枝を示す。図３Jは２つの末端細胞を有する第１３期のSpryΔ⁵神経節分枝を示す。図３Kは２つの野生型幼生背側分枝（DB）の幼生図顕微鏡写真を示し、分枝それぞれは広範に分岐した分枝を生じる１つの末端細胞をもつ（矢印）。図３LはS pryΔ⁵型幼生背側分枝末端細胞の顕微鏡写真であり、そこで２つの末端細胞はさらに分枝を生じる。図３A（図３A〜Dに対し共通）、図３E（図３E〜Fに対し共通）および図３H（図３G、Jに対し共通）の目盛り線は５μmである。図３L（図３K 〜Lに対し共通）の目盛り線は１０μmである。実施例２のデータと共に、上記の結果が示すのは、SpryΔ⁵変異体における余分の分枝化は正常群の分枝形成細胞により形成される分枝数の増大よりも、むしろ分枝形成細胞数の増大によるものであった。すべての気管細胞に発現される核マーカーをもつSpryΔ⁵変異体胚を染色すると、分枝形成細胞数が並行して増大することと、各細胞が余分の分枝と関係していることを示した（図３B、D）。この結果はSpry変異体の余分の分枝化が過剰な細胞増殖から生じ、細胞死または他の組織からの細胞の移入を減じたことを示唆するものではない。変異体中のさらなる細胞分裂が余分の分枝化細胞を産生したとは思われない。その理由は、微細分枝を形成した典型的なヘミセグメント（Tr5）における総細胞数はSpryΔ⁵ 変異体において〜２０から〜３０に増加したが、気管細胞の総数はそれに対応して増加しなかったことを細胞計数か示したからである（野生型Tr5（n=６）では７８＋/−４細胞、対してSpryΔ⁵Tr5（n=3）では７３＋/−３）。さらに、BrUでの標識または分裂細胞においてlacZを発現するstring-lacZマーカーでの標識によりさらなる分裂細胞はSpryΔ⁵胚に検出されなかった。余分の分枝化細胞もまた通常の細胞死の抑制により生じることはありそうにない。その理由は、細胞死が野生型気管の発生途上で起こるとは考えられず（サマコブリス（Samakovlis）ら、1996）、余分の分枝もすべての通常細胞死を防止するH99欠失変異体には観察されなかった（ホワイト（White）ら、1994）からである。しかし、上の結果は、余分の分枝化細胞が非分枝化気管細胞を分枝形成細胞に変換すると生じることを示している。図３Fおよび３Hに示したように、Spry変異体の異所性分枝化細胞は正常の二次および終末分枝マーカーを発現し、これらのマーカーは正常の分枝形成細胞と同時に活性化された（図３J）。野生型気管の対応する位置の細胞はこれらのマーカーを発現しなかった（図３E、３Gおよび３ I）。Spry変異体における異所性分枝化細胞も正常分枝化細胞と同じ発生プログラムに従ったが、長い細胞質突起を並行方向に延ばし、幼生中に末端分枝の広範なネットワークを形成した（図３Kおよび３L）。このように、すべての入手可能な基準によって、SpryΔ⁵変異体における異所性分枝形成細胞が正常分枝形成細胞と識別し得た。実施例４発生途上気管系におけるSpryの遺伝子モザイク分析発生途上気管系におけるSpryの遺伝子モザイク分析を実施し、どの細胞においてSpry遺伝子が分枝化を阻害するように機能するのかを決定した。動原体近傍に FLP組換え部位（FRT）を担持する第３染色体の左腕上にSpryΔ⁵変異体を組換えた（スーおよびルビン（Xu and Rubin，1993）。1-eve-1、すべての気管細胞に発現される６１EのlacZエンハンサートラップマーカー（ペリモン（Perrimon）ら、1991）を別のFRT第３染色体上に組換えた。1-eve-1-FRT染色体を、熱ショック・コントロールの下にFLPリコンビナーゼを担うhsFLP;Dr/TM3ryハエに交差させた。hsFLPおよび1-eve-1-FRTを担持する得られる子孫をSpryΔ⁵−FRT/TM3に交差させ、hsFLP;1-eve-1-lacZ FRT/SpryΔ⁵−FRTとした。 hsFLP;1-eve-1-lacZ FRT/SpryΔ⁵−FRT胚を第１０後期および第１２前期に２５℃で収集し、AEL（産卵後）５時間および６時間目に２回３７℃で熱ショック処理した。１０時間後（第１５および１６期）クローンを固定し、mAb２A12内腔抗体および抗−β−ガラクトシダーゼ抗血清で染色、観察した。細胞質β−ガラクトシダーゼ（β‐gal）を発現する1-eve-1からの気管細胞はSpry⁺として同定した。β−ガラクトシダーゼ（β‐gal）を発現しなかったが、しばしば薄い内腔しみをもった細胞はSpry―として同定した（SpryΔ⁵/SpryΔ⁵）。３６種のクローンを背側および神経節気管分枝に同定した。該クローンと周辺細胞を気管の欠陥について注意深く試験した。クローンは〜１２％が正しい遺伝子型の胚であることが判明した。少数のクローンをその背側分枝（DB）において試験したが、その分析は、構造か簡単であったこと、また、細胞同定と分枝化の運命を決めるのか容易であったため、神経節分枝（GB）に焦点を絞った。野生型胚では、GBは腹面の神経索に向かって成長する７個の細胞から成っている。リード細胞（GB1）は常に二次および終末マーカーを発現し、微細分枝を形成するが、一方他の６個の細胞（GB2〜7 ）は二次および末端マーカーを発現せず、分枝も形成しない。模範となる結果を図４A、４Bおよび４Cの顕微鏡写真に示すか、これは細胞質 β‐galの発現（Spry＋）または発現欠如（Spry―）によって識別されるSpry細胞と野生型細胞のモザイククローンを示す。図４Aは神経節分枝の先導細胞（GB1 ）においてβ‐galの発現がない場合のGB2から生じる異所性分枝を示す。近傍セグメントはβ‐gal発現するGB1細胞を有していたが、異所性分枝はもたなかた。２９種のかかるクローンを分析した。図４Bは神経節分枝の第二細胞（GB2）にβ ‐gal発現が存在しなかった場合には異所性分枝も認められなかった状況を説明するものである。４種のかかるクローンを分析した。図４Cには、背面分枝の先導細胞（DB1）にβ‐gal発現がない場合に、異所性分枝がDB3およびDB4から生じるのが見られる。4種のクローンのみがGB2〜7に見出されたか、恐らくこれは細胞が群がって空間で重なり合ったためである。腹面神経索の縁を白の破線でマークしてある。目盛り線は１０μmである。上の結果はSpryが非自律的に作用して気管分枝化を阻害することを証明する。 GB1細胞がSpry−であった２９種のクローンにおいて、異所性分枝は常に近傍GB2 細胞に存在していた（図４A）。さらに、非先導細胞（GB２〜７）がSpry^-であった逆型の4種のクローンの内３種は、神経節分枝が余分の分枝をもたず正常と思われた（図４B）。この型の特に情報量の多いSpry^-の１クローンはリード細胞を除くすべての細胞を包含していた。これは異所性分枝をもたない正常な神経節分枝を形成した。このように、このデータは、Spry⁺が神経節分枝のGB1細胞に必要であり、非自律的に作用して近傍細胞の分枝化を阻害することを示す。背面分枝（DB）に対するデータはさらに制限されたが、これらは神経節分枝からの結果を支持した。背面分枝（DB1）のリード細胞がSpry^-であった４種のクローンにおいて、近傍細胞は異所性分枝を形成するように思われた。図４Cに示したクローンにおいては、例えば、DB３およびDB４細胞は不適切に分枝を伸ばした。 GB1細胞が突然変異体であったSpry^-クローンには２つの子期せざる特徴があった。第一に、異所性分枝の枝は動物全体がSpry^-であった場合と同じ結果の経路に従わない傾向があった。分枝は一般に腹面神経索から背いたが（図４A）、一方、Spry^-胚の余分の分枝は正常に索に入り込んだ（図２C）。このことはモザイク中のSpry⁺細胞が分枝の道筋発見に幾分影響していたことを物語っている。第二に、GB1細胞からの正常分枝の枝は、GB1細胞はSpry^-であるが、近傍細胞（GB2 〜7）がSpry＋であるクローンにおいて阻害されると思われた。このことはSpry⁺ も細胞自律機能をもち、そのSpry⁺近傍による分枝化の阻害を防止することを示唆するが、この解釈はSpry⁺タンパク質が異所的に発現される下記の実験により支持される。実施例５ Spry 座のゲノム分析とｃＤＮＡクローニングＡ．ゲノム・クローニング Spry²⁶⁸³中のＰ−要素挿入断片に隣接するゲノムＤＮＡを標準のプロトコール（ベレン（Bellen）ら、1989）に従いプラスミド・レスキューにより回収し、次いで、ゲノムＤＮＡをBamHIまたはEcoRIで消化した。BamHIレスキュープラスミド（５B）からの８kB HindIII/BamHIゲノムフラグメントをプローブとして用い、EMBL３のショウジョウバエ・ゲノムライブラリーから〜１０５ファージを選抜した。ケノムファージを単離し、制限マッピングおよびサザーンブロット上相互に、また、プラスミド・レスキューとの交差ハイブリッド形成によりコンティーグに入れた。結果を図５Aに要約するが、ここではSpryゲノム座と遺伝子構造の図式を示す。EcoRI（R）とSalI（S）の制限部位のゲノム地図はBamHIプラスミド・レスキューおよび重なり合うゲノムファージクローン（Φ3.5、1.1、1.2；パネルの下部に示した）から組み立てて、上部の横線上に表す。当初のP要素Spry²⁶⁸³の挿入は三角形でマークしてあるが、これはクラスI ｃＤＮＡの上流0.6kbに位置している。開始点（０kb）はSpry転写単位が始まる場所であり、ｃＤＮＡ最大クラスの５ ’末端の地図化に基づいている。３つの別個のｃＤＮＡ型を単離し、ゲノム・サザーン、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定を使用して該領域のゲノム・コンティーグ上に地図化した。エクソンは四角形で示す。黒地四角形は読み取り枠であり、白抜き四角形は非翻訳領域である。最長のｃＤＮＡにおいて、読取り枠は1.2kbの５'UTRが先行し、ポリA尾部をもつ２００bpの３'UTRが続く。２つの強い突然変異体（SpryΔ⁵およびSpryΔ⁶⁴）の欠失の範囲を短い縦線で示す。共通の５'エクソンはこれらの変異体において欠失している。 B．ｃＤＮＡの単離および特性化上記の８kb HindIII/BamHIゲノムフラグメントはまた、λgt１１におけるサイズ‐選択９〜１２時間の胚ｃＤＮＡライブラリーから〜１０⁶ファージを選抜するために使用した（ジン（Zinn）ら、1988）。単離した１１種のｃＤＮＡクローンは３つのサイズに分類した。クラスＩ（3.2kb；クローン3.1、12.2）、クラス II（2.8kb；クローン2.4、3.5、11.1、12.4、13.1、13.2、13.3、13.5）およびクラスIII（1.7kb；クローン11.3）。これらのサイズ分類は図５Aに示した３つのスプライス型に相当する。クラスの割振りは交差ハイブリッド形成と制限酵素分析により証明された。幾つかのｃＤＮＡ（クローン12.2、11.3および13.3）はサンガー・ジデオキシ配列決定法を用い、両鎖について配列決定した（ユナイテッド・ステート・バイオケミカル、クリーブランド、オハイオ）。エクソンはｃＤＮＡフラグメントを消化したケノムファージＤＮＡにハイブリッド形成することにより地図化した。イントロン/エクソンの境界はｃＤＮＡからのプライマーを用いるPCR分析により、また、ゲノムＤＮＡの関連領域の配列決定により決定した。これらのｃＤＮＡはSpry転写単位に相当するものとして以下のように証明した。第一に、3.2kbのｃＤＮＡをプローブとして用いる全封入mRNAのin situハイブリッド形成が、４つの現存のSpryエンハンサートラップ系に対して見出されたla cZパターンに厳密に相応する発現パターンを検出した（実施例７）。また、発生途上の気管系における発現はSpry機能の遺伝子モサイク分析と矛盾がなかった（実施例４）。第二に、Spry突然変異の分子分析は８種すべてのSpryアレレにおける同定された転写単位の欠失と非センス突然変異を明らかにした。２つの強い突然変異体（SpryΔ⁵およびSpryΔ⁶⁴）においては、すべてのスプライス型に共通の５'エクソンが欠失しており（図５A）、より弱い切除アレレ（SpryΔ⁵⁵）ではこのエクソンを含む複雑な転移があった。EMSアレレの配列分析は５種のアレレ（Spry²⁵⁴、Spry²¹¹、Spry²²⁶、Spry^G5、Spry^F7）各々において非センスまたはフレームシフト突然変異を明らかにしたが、これらは下記の保存モチーフのすべてまたは殆どを欠失する切端ポリペプチドに至った。第三に、クローン化ｃＤＮＡの異所性気管発現は、遺伝子分析から期待されたとおり、気管分枝化を阻害した。そして最後に、Spryタンパク質に対して起こした抗血清を用いたが、SpryΔ 5眼部成虫原基にSpryタンパク質は検出されなかった。図５CはｃＤＮＡクローン12.2のポリヌクレオチド配列を示す。５'−および３ '−非翻訳領域は小文字で指定した。ATGに先行する４つのヌクレオチド、CTAC、は共通の開始部位［C/A］AA[A/C]に対する３/４塩基に匹敵する。幾つかの停止コドンがATG上流に位置し枠組みを造っている。単一塩基非センス突然変異の位置は、変化する塩基上に灰色の円でマークする。突然変異体の変化は以下の通りである：２２６においてC₂₀₅₅→T；２１１においてC₂₂₅₃→T；G５においてG₂₇₁₀ →A；F７においてC₂₄₆₆→T。Spry²⁵⁴は２２３７〜２２４３に小さな欠失（灰色楕円形）およびA₂₂₃₆の次に２つのヌクレオチド（TA）の挿入を有する。図５Cに示すように、クローン12.2は２つのエクソンから成り、該エクソンは細い矢印の部分（nt 1126とnt 1127の間）で結合している。第二の（2.2kb）エクソンは単一の長い読取り枠（ORF）を含む。nt 467とnt 468の間の幅広い矢印はもう一方の開始部位を表し、ここでより小さなクラスII（ｃＤＮＡ13.3など）の転写物を生成する。公開時に欠落Ｃ．スプルーティ同族体の同定組合わせデータベースのNCBI BLAST検索では密接に関係するタンパク質を検出しなかった。しかし、発現配列標識（dbEST）データベースをサーチしたところ、本明細書においてhSpry（SEQ ID NO:５、６）（クローン142025、IMAGE集合体クローン、レノン（Lennon）ら、1996）、hSpry2（SEQ ID NO:７、８、９）（クローン40262）、およびhSpTy3（SEQ ID NO:１０、１１；クローンXAP128）として参照する３種のヒト同族体を同定した。完全コーディンク配列をhSpry2（4026 2）（SEQ ID NO:７）について決定し、部分配列は重複ｃＤＮＡ（142025、78383 および727987）からのhSpry1（SEQ ID NO:５）につて決定した。 hSpry２配列は３５ｋＤの質量をもつ３１５残基のペプチドを予測させる。それはSpryについて高い保存性（２２Spryシステインの内２１が５１％の同一性を保存）を有するシステインに富むドメインおよびN末端領域にSpryと類似のさらに２つの短い伸長部を含んでいる。hSpry1およびhSpry3はシステインに富むドメインについて高い保存性を示し、入手可能な配列において他の系列群メンバーと５１〜７０％の同一性を有する。スプルーティ遺伝子系列群の一部であることが判明したさらなるマウスESTはm Spry1、SEQ ID NO:１２、１３（907842）、mSpry２、SEQ IDNO:１４（819774）、およびmSpry４、SEQ IDNO:１５、１６（919795）を包含していた。ショウジョウバエSpry配列をもつ全長hSpry2配列およびhSpry1とhSpry3の部分配列の線列を図５Dに示す。 D．ノーザン分析上記の８kb HindIII/BamHIゲノムフラグメントおよびｃＤＮＡクローン12.2を用い、展開した胚ｍＲＮＡのノーザンブロットを探査した。ｍＲＮＡは、0〜1.5 、1.5〜5、5〜11、11〜16、16〜22時間の胚から２５℃で総ＲＮＡを標準フェノール/クロロホルム抽出し（サムブルーク（Sambrook）ら、1989）、次いで、オリゴ‐dT常磁性ビーズ（プロメガ、マジソン、ウイスコンシン）上で選択することにより調製した。ポリA＋ＲＮＡを「ハイボンド（HYBOND）」フィルター（アマーシャム、アーリントン・ハイツ、イリノイ）に移し、放射標識ｃＤＮＡ12.2 または８kbクローンで探査した。模範となる結果を図５Bに示す。3.2および4.4kbの間の種をｃＤＮＡ12.2プローブを用い検出した。図から評価され得るように、ｍＲＮＡは気管発生か始まった直後に始動し、気管発生の全期間を通して発現し続けた。実施例６ Spry タンパク質の血漿膜への局在化 Spryタンパク質の分布をアフィニティー精製した抗血清２６Aにて分析した。該抗血清は全長Spryタンパク質に対して起こした。この抗血清は胚の内在性Spry 発現パターンを再現性よく検出するには十分に感受性でなかったが、特定の発現は細胞内小胞およびSpryが機能していることを示しす発生途上眼部原基の細胞膜に検出された。気管細胞中のSpryの細胞下局在部位を決めるために、GAL4/UAS系を用いてC38; UAS−Spry胚に過剰発現させた。背側躯幹および分枝を第１４期に抗血清２６Aで染色し、図６Aに赤染色として示した。同じ背側躯幹を抗ノッチ抗体で染色し、緑で示した（図６B）。２つの画像をSpryとノッチタンパク質が共存局在するのを表す黄色染色により図６C併合して示す。図６Aおよび６Bの目盛り線は５μmである。図から認識し得るように、Spry（赤）染色は気管細胞の表面またはその近傍に局在していた。さらに、この染色はコントロール・トランスメンブランタンパク質・ノッチの（緑色）染色と共存局在していた（図６Bおよび６C）。これらのデータはSpryが膜結合または分泌タンパク質であるという結論を支持する。実施例７分枝形成気管細胞におけるSpry発現レベル Spryの胚発現パターンを3.2kb（クローン12.2）SpryｃＤＮＡをプローブとして用い、全封入in situハイブリッド形成により、また、上記３つのSpryエンハンサートラップ挿入断片の分析により決定した。エンハンサートラップ挿入断片はｍＲＮＡ発現を厳密に模倣しているが、大きな細胞分解性を付与する。 In situハイブリッド形成を標準法を用いて、野生型胚を固定、加工処理することにより実施した（タウツおよびファイフル（Tautz and Pfeifle）、1989）。上記、８kb HindIII/BamHIゲノムフラグメントおよび3.2kbのｃＤＮＡクローン（クローン12.2）をランダムプライミングによりジゴキシゲニン標識ヌクレオチドで標識し、胚の探査に使用した。結果を図７A〜７Hに示す。図７A〜７Dの顕微鏡写真は背側分枝のSpry⁹¹⁴³胚におけるSpry-lacZ発現の経時変化を示す。図７Eは内蔵分枝（VB）と（G）中線グリア（MG、破線円）における第１４期でのSpry mRNA発現を示す。図７FはVBおよび（H）MGにおける第１５/１６期でのSpry-lacZ発現を示す。矢印は第１５期以前にはmRNA発現により検出し得ないGB1染色を示す。図７Gおよび７Hは中線グリア細胞のSpry発現を示す。図７A（図７A〜Dに共通）および図７G(図７E〜Hに共通)は５μmである。結果はSpryが気管系および中線グリア（図７H）、VNCにおけるニューロンの一群、背部血管、扁桃細胞、眼部成虫原基を含む他の組織において特異的に発現されることを示す。気管発現は先ず発芽し始めたすべての一次分枝に検出され、二次および最終末端分枝を形成し続ける一次分枝細胞に高レベルで維持された。背側分枝における発現を図７A〜Dに示す。第１２期に、Spryが２つの細胞（DB1、２）において背側分枝の先導縁に、また、２つのより基部細胞（DB3、４）に余り強くなく発現された（図７A）。第１３期には、２つの先導分枝細胞に高い発現性でSpry発現の勾配があったが（図７B）、それぞれが別々の分枝を形成するように分離し始めた。第１３期から１５期には、SpryがDB1細胞中最も強く発現され（図７C）、最終的にはこの細胞だけに発現された（図７D）。これは後期胚（１６/１７期）において、また、幼生期間全般にわたって微細な末端細胞を形成し続ける細胞である。まとめとして、これらの結果はSpryが分枝形成気管細胞において高レベルで発現されることを示している。実施例８気管分枝化でのSpry異所性発現の影響 GAL4-UAS発現系（ブランドおよびぺリモン（Brand and Perrimon）、1993）を使用し、発生途上気管系全般について一定レベルでのSpry発現の影響を試験した。形質転換系統がUAS要素の制御下Spryを含むように作製されたが、以下のようにGAL4タンパク質により推進することができる。全Spry ORFを含むcDNA12.2からの2.2kb EcoRIフラグメントをプロモーターとG al14 UAS結合部位の下流EcoRI部位でpUASTベクター（ブランドおよびペリモン（ Brand and Perrimon）、1993）に挿入し、pUAST−SpryS 2.2を産生させた。構築物をｐΔ２〜３（トランスポザーゼ発現プラスミド、ロバートソン（Robertson ）ら、1988）と共にｗ¹¹¹⁸胚に注入した。６つの独立した系統が産生され、第３染色体UAS−Spry 4.1上の挿入を過剰発現実験のために使用した。同様の結果を独立した挿入UAS−Spry 1.3により得た。用いたGal4ドライバー系統hsGal４（ブランドおよびペリモン（Brand and Perrimon）、1993）およびC38、第１３期初期以降から発現される全気管ドライバーであった（リンおよびグッドマン（Lin and Goodman）、1994）。結果を図８A、８Bおよび８Cに示す。図８Aは末端細胞（矢印）における野生型 DSRF（末端細胞マーカー）の発現を示す。図８BはhsGal４ドライバーでの初期（１０/１１期）Spry誤発現がDSRFの発現（第１４期に示される）および引き続いての末端細胞分枝を抑制することを示す。図８Cは後時点（１２期）でのSpry発現が第１４期に示されるDSRFの異所性発現および幾つかのセグメントにおいて末端分枝の枝（第１６期の挿入写真）に至ることを示す。図８A（図８A〜８Cに共通）の目盛り線は５μm、図８Cの挿入写真は１０μmである。認識し得るように、Spry発現が第１１期および第１２期において熱ショックGa l４により誘導されたとき、気管系全般の分枝が阻害されたが、これはDSRF末端分枝マーカーの発現によりアッセイされた（図８B）。これはSpry機能喪失変異体において観察された過剰分枝化の生じることを期待させた。驚くべきことに、Spryの発現が第１３期でまたはhsGALドライバーもしくは気管特異ドライバーの使用を超えて誘導されたとき、分枝は阻害されなかった。事実、余分のDSRF−発現細胞が幾つかの胚中に時折見出された（図８C）。このように、高レベルのSpryが早期に発現すると、分枝化プログラムを阻害するが、一方、第１３期以降での発現は逆に分枝化を促進する。下記のモデルはこれらの結果を満足するが、Spryが２つの機能をもつことを前提とする。すなわち、分枝化のインヒビターとしての細胞非自律性機能および阻害活性に対して発現細胞を正常に防御する細胞自律性機能である。実施例９ Bn1 シグナリング経路における下流エフェクター上Spry突然変異の影響 A．一般法二次および末端分枝化遺伝子は、周辺組織におけるBn1 FGFの局在化発現により一次分枝の増殖終末点で誘導される（サザーランド（Sutherland）ら、1996）。Spry突然変異体の異所性分枝は通常分枝に誘導される細胞の直ぐ側に位置する前柄細胞により形成されるので、余分の分枝がBn1経路の過活性から生じ得る。 Spry⁺がBn1経路を制限することで機能するのか、あるいは他のある様式で分枝を防御するのかを決めるために、以下の実験を実施した。すなわち、後期分枝化事象を調節するBn1経路においてSpry突然変異が下流のエフェクター（pnt、Yan 、DSRF遺伝子）に与える影響を試験した。結果を図９A〜Pに相当するコンピューター作成画像で説明する。 B．ハエの株および遺伝以下の無効もしくは強い機能喪失アレレを用いた。Bn1^P1（サザーランド（Sut herland）ら、1996）、btl^LG18およびbtl^LG19（クラム（Kalmbt）ら、1992）、p ntΔ⁸⁸（ショルツ（Scholz）ら、1993)、およびyan⁵⁴³³。用いられるP[lacZ]エンハンサートラップマーカーはpnt⁷⁸²⁵（サマコブリス（Samakovlis）ら、1996 ）、btl^6-81a（ビール（Bier）ら、1989；サマコブリスら、1996）、yan^P（レイおよびルビン（Lai and Rubin、1992）、Terminal-１（pruned/DSRF）、−２、 −３および−４（ギレミン（Guillemin）ら、1996；サマコブリスら、1996）、1 -eve-1（ぺリモン（Perrimon）ら、1991）、およびSpry⁹¹⁴³。Spry⁹¹⁴³は、他の Spryエンハンサートラップ系も同じパターンを示しはするか、それが最強のlacZ 発現を有する故に選択した。エドガー（B．Edgar）からのstring-lacZ導入遺伝子P[w+] STGb6Cを気管細胞分裂のモニター用に使用した。 C．抗体 Yanに対するmAb A2 ８B12（１：５） D．Spry および他の遺伝子のin vivo誤発現採用したGal4ドライバー系はhsGal4（ブランドおよびペリモン（Brand and Pe rrimon）、1993）、およびC38（リンおよびグッドマン（Lin and Goodman）、19 94）およびTrGal４であったか、これらは第１３期以降すべての気管細胞においてGAL４を発現する。 UAS−Spry系は完全Spryコーディング配列を含むｃＤＮＡからの2.2kb EcoRIフラグメントをPエレメントベクターｐUASTに挿入し、形質転換体を生成させることにより構築した。第二（UAS−Spry4.1＃２）および第三（UAS−Spry1.3および UAS−Spry−6.2）染色体を用い、同様の結果を得た。他のUAS株はUAS-pntP1.3( クレース（Klaes）ら、1994)；およびUAS-Bn1(サザーランド（Sutherland）ら、 1996）であった。 hsGal４ドライバーでの実験のために、卵を２５℃で〜７時間集め、２５℃で４時間加齢し、３７℃で２０分間、２度熱ショックを与えるが、それぞれ1.5時間で回復させ、次いで、２５℃で６時間加齢した。C38およびTrGal４での実験には、卵は２５℃で６時間集め、２９℃で９時間加齢した。１．Bn1 −誘導遺伝子pntおよびSpryの発現へのSpry突然変異の影響試験した１つのエフェクターは幾つかのレセプター・チロシン・キナーゼ（RT K）経路の下流標的であるpntであった（ブランナー（Brunner）ら、1994；オ・ネイル（O'Neill）ら、1994；ガベイ（Gabay）ら、1996）。Pntの発現は一次分枝の末端でBn1により誘導され、二次および末端分枝化を促進する（サマコブリス（Samakovlis）ら、1996；サザーランド（Sutherland）ら、1996；図２A、D）。図９（A〜E）はBnI−誘導遺伝子pntおよびSpryの発現へのSpry突然変異の影響を説明する。Pnt⁷⁸²⁵およびSpryΔ⁵⁵エンハンサートラップマーカー（上記）をレポーターとして用い、mAb2A12を気管内腔を標識するために用いた。図９Aは野生型DB、第１６期に相当し、ここでは高レベルのpnt発現がDB1にのみ見られる。図９BはSpryΔ⁵ホモ接合体に相当する。Pntは異所性にDB３に誘導される。図９CはSpryΔ⁵⁵/SpryΔ⁶⁴の機能喪失突然変異体を説明する。結果はSp ryレポーターが異所性にDB３に誘導されることを述べる。図Dは野生型GB、第１６期に相当する。高レベルのpnt発現がDB1にのみ見られる。図９EはSpryΔ⁵ホモ接合体に相当するが、ここではpntが異所性にDB２に誘導される。２．DSRF 発現へのSpry突然変異の影響図９F〜KはSpry突然変異がDSRF、末端分枝化を制御するBn1-誘導遺伝子の発現に与える影響を説明する。図９Fは野生型DB、第１６期に相当する。DSRFの発現（mAb2-161）はDB1にのみ見られる。図９GはSpryΔ⁵ホモ接合体に相当する。DRSFは異所性にDB３に誘導される。図９Hは野生型GB、第１６期に相当する。DSRFはGB1にのみ見られる。図９ IはSpryΔ⁵ホモ接合体に相当する。DSRFは異所性にDB２に誘導される。図９Jは野生型GB、第１３期に相当し、DSRFがDB1に丁度発現され始めたところを示す。m Ab2A12抗原は未だ現われていない。図９KはSpryΔ⁵ホモ接合体のGB、第１３期に相当する。DSRFはGB1と同時にGB２に誘導される。同様の結果は他の３つの末端分枝マーカー（末端−２、−３および‐４）についても得られた。要約すると、DSRF遺伝子および他の３つのマーカー遺伝子（末端‐２、−３および‐４）は増殖する一次分枝の終末で誘導され、末端分枝化を促進する（図９ F、９H）。しかし、Spry突然変異体において、５種すべてのエフェクターは後に異所性分枝を形成する前柄細胞含有の拡大ドメイン中に発現された（図９B、E、 G、I）。さらに、DSRFマーカーは正常分枝化細胞においてと同時に活性化された（図９J、K）。３．Yan 発現へのSpry突然変異の影響 Bn1シグナリングのもう一つの重要な目標はYan転写因子である。他のRTK経路（オ・ネイル（O'Neill）ら、1994；リベイおよびルビン（Rebay and Rubin）、 1995；ガベイ（Gabay）ら、1996）におけるように、Bn1経路の活性化はYanのMAP K−依存性リン酸化および分解に導くが、これは気管分枝化の後のプログラムを活性化するのに必要である（ハコーエン（Hacohen）、1997）。 Yan発現へのSpry突然変異の影響を図９L〜Nに説明する。野生型において、Bn1 シグナリングはDB1およびDB2においてYanの分解に導く。図９LはSpryΔ⁵突然変異体においてYan(mAb A2 ８B12）もDB3（星印）にて分解されることを説明する。DB1およびDB３の位置を示すために、胚をDSRFについて染色する（mAb2-161）。図９MはDSRFチャンネルのない図９Lと同一である。図９Nはyan-lacZエンハンサートラップマーカーyan^Pの発現がSpryΔ⁵突然変異体において変化しないことを示し、Spryの影響が転写後であることを暗示している。LおよびNの線は５μm に相当する。要約すると、Yanは成長する一次分枝の先端細胞においてのみ通常分解される。Spry突然変異体において、YanはpntとDSRFの発現の拡張したドメインと一致する拡張ドメインにおいて分解された（図９L、９M）。yan-lac施写レポーターは正常に発現され続けるか、これは他のRTK経路におけるように、Yanのダウンレギュレーションは転写後事象であったことを暗示している（図９N）。上の結果は、Spry機能喪失突然変異がこのBn1経路において既知下流エフェクターのすべてを高めることを証明している。４．Spry 上昇レベルの影響図９Oおよび９PはSpry上昇レベルの影響を述べている。図９Oは３種の野生型１４期胚のDBに相当し、DB１細胞中でのDSRFの発現を示す（矢印）。図９PはSpr y発現を誘導するために第１０後期に熱ショックを受けた１４期のhsGal４/UAS− Spry4.1胚の同様の図を表す。DSRFは発現されず（矢印）、末端分枝化も阻害される。Spryの発現が後の第１３または１４期に誘導されたとき、分枝化は通常阻害されず、余分の分枝化細胞も時には観察された。要約すると、Spry遺伝子産物を胚期１０または１２の間に過剰発現した巧みに設計された機能獲得条件は、下流エフェクターの正常誘導およびBn1による分枝化を厳しくブロックした（図９O、P）。逆もまた真である。Bn1の過剰な発現はS pr yの抵抗を克服することが可能であり、気管系全体を通して二次および末端分枝化を誘発することができる（サザーランド（Sutherland）ら、1996）。このように、SpryはBn1経路の競合アンタゴニストとして遺伝的に振る舞う。実施例１０ Bn1 シグナリング経路によるSpry発現の誘導 Spryを発現する気管細胞はBn1を発現する表皮性および中胚葉細胞の小さなクラスターに密接して位置しており（サザーランド（Sutherland）ら、1996参照；図１０Aに図式化）、Spryの発現パターンはBn1により誘導されるpntおよび他の遺伝子のものに近似している（サマコブリス（Samakovlis）ら、1996）。これらの観察が示唆したことは、SpryはまたBn1経路により誘導されるに違いないということである。この仮説を試験するために、bn1経路突然変異体のSpry発現に及ぼす影響を探査した。その結果を図１０Aに参照して図１０B〜Fに表す。図１０Aは増殖するDBの末端近くのBn1−発現細胞（上部円）のクラスターを示す図式である（サザーランドら、1996）。分泌されたBn1（点線）は一次分枝の出芽（第１２期）および成長（第１４期）を引起こす。分泌されたBn1はまた、二次（１６期）および末端分枝（幼生）の形成に続く一次分枝（緑色）の終末において、細胞中の二次および末端分枝（pntおよびDSRF）を促進する遺伝子の発現を誘導する。図１０B〜Fは発生途上DBにおいて、Bn1経路突然変異体がSpry発現に及ぼす影響を図示するが、Spry 9143マーカーを免疫染色する事により可視化した。実験の詳細は上の実施例９記載のとおりである。図１０B、CおよびEはSpryを発現しない分枝を示すために内腔抗血清でさらに染色した結果を示す。図１０Bは野生型、第１２期の胚に相当し、２種の正常Spr y−発現細胞DB1および２を示す（ただし、Lu＝DBの内腔）。図１０CはbtILG19突然変異体に相当する。DBは増殖せず、気管細胞はSpryを発現しない。同じ胚の扁桃細胞でのSpry発現は影響されない（挿入図）。図１０DはUAS-Bn 1/+;hsGal4/ ＋胚に相当し、そこでBn1が偏在して発現された。Spryはすべての気管細胞に誘発される。図１０EはpntΔ⁸⁸、第１５期の胚に相当する。気管細胞はSpryを発現し得ない。図１０FはUAS‐pntP1.3/+;hsGal4/+胚を示し、ここでpnt P1タンパク質が偏在して発現された。Spryはすべての気管細胞において誘導されるが、発現は多分リプレッサーYanのために正常発現ドメイン外では低い。要約すると、当初の仮説と矛盾なく、Bn1およびbtl突然変異体において、Spry は発現されないか、発現されたとしても弱い（図１０C）。さらに、BtlレセプターがBn1の偏在的発現によってすべての気管細胞において活性化されたとき、Spr yは気管系全般に高レベルで始動した（図１０D）。下流のエフェクターpntもSpr yの発現を必要とし（図１０E）,Spryの発現はpnt P1タンパク質が偏在して発現されたとき、その正常な発現ドメイン外で活性化された。このように、Spryの発現はそれが阻害するシグナリング経路により誘発される。Bn1-Spry調節回路の図式モデルを図１１に示す。実施例１１哺乳動物細胞でのSpryタンパク質発現および局在化ショウジョウバエのSpryおよびヒトSpry2をヒト293細胞中哺乳動物EF-１αプロモーターの制御下、以下のように発現した。ショウジョウバエおよびヒトSpry2遺伝子のコーディング領域をポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、EF-１αプロモーターの下流pEF-BOSに挿入した。３'プライマーはFLAG（サンタ・クルズ・バイオテクノロジー）またはHA（バブコ）エピトープに対する抗体で発現したタンパタ質を検出するための枠内エピトープ標識（ショウジョウバエのSpry用FLAG；ヒトSpry2用HA）を含んでいた。ショウジョウバエSpryの発現は、全長SPTyタンパク質に対してウサギで起こした抗体（３２C）でも検出された。 Spry遺伝子を含むpEF-BOSプラスミドは標準法により２９３の細胞に移入した。細胞を収獲し、標準溶解バッファー（50mMヘペス、pH7.4、125mM NaCl、１％トリトンX-100）中氷上２０分溶解した。別に、細胞をスクロース・バッファー（50mMヘペス、pH7.4、0.25Mスクロース）中、ダンス（dounce）ホモゲナイザーで均一化した。核と細胞破片を2,000rpmで遠沈し、廃棄した。膜（ペレット）を 100,000rpmで可溶フラクション（上清）から分離した。溶解物またはフラクションを SDSサンプルバッファーと混合し、10〜12％ポリアクリルアミドゲル上走行させ、次いでニトロセルロースに移し、５％ミルクでブロックし、一次および二次抗体と培養し、ECLで染色した。タンパク質は適切なエピトープ標識またはタンパク質に対する抗体を用い、細胞溶解物のウエスターンブロット上検出した。ウエスターンブロットを図１２A 〜Cに示す。図１２Aは抗‐FLAG抗体によって認識された６６kDのショウジョウバエSpryバンドの検出を示す。図１２Bは２９３細胞における３５〜４０kDのhSpry ２を抗‐HA抗体により検出したものに相当する。図１２CはショウジョウバエSpr yを発現する均一化細胞の１００K rpmペレットと上清に相当する。両タンパク質はこの非相同系において効率的に発現された。両発現タンパク質の分子量は予測したサイズに似ており、ショウジョウバエSpryについては〜６３ kD、hSpryについては〜３５kDであった。細胞ホモジネートの標準分画は、ショウジョウバエSpryが殆ど例外なく細胞の膜分画に見出されることを明らかにした。本発明は特定の方法と態様を参照して記載してあるが、多様な改良と変更が本発明から離れずになし得るものであることは当然である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク質であって、そのシステインに富む領域が、全長配列がSEQ ID NO: ８により確認されるヒトのスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそれから誘導されるペプチドであって、少なくとも１０個のアミノ酸を有するペプチドから成ることを特徴とする単離された組換えスプルーティ・ポリペプチド。２．該システインに富む領域がSEQ ID NO:１７と少なくとも５０％の配列同一性を有することを特徴とする請求の範囲第１項記載のスプルーティ・タンパク質。３．該タンパク質がSEQ ID NO:８に実質的に一致する配列を有するヒト・スプルーティ２・タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のスプルーティ・タンパク質。４．該タンパク質がSEQ ID NO:６に実質的に一致する配列を有するヒト・スプルーティ１・タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のスプルーティ・タンパク質。５．該タンパク質がSEQ ID NO:１１に実質的に一致する配列を有するヒト・スプルーティ３・タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のスプルーティ・タンパク質。６．腫瘍増殖を阻害するのに十分なタンパク質量を患者に投与することにより、患者の充実性腫瘍の治療に使用することを特徴とする請求の範囲第１項記載のタンパク質。７．SEQ ID NO:８に実質的に一致する配列を有するヒト・スプルーティ２・タンパク質、SEQ ID NO:６に実質的に一致する配列を有するヒト・スプルーティ１・タンパク質、およびSEQ ID NO:１１に実質的に一致する配列を有するヒト・スプルーティ３・タンパク質から選択されることを特徴とする請求の範囲第６項記載のタンパク質。８．約１５０nm未満の平均サイズを有し、その表面をポリエチレングリコールでコーティングしてあるリポソームに包含させることを特徴とする請求の範囲第６項記載のタンパク質。９．(1) タンパク質であって、そのアミノ酸配列のシステインに富む領域が、全長配列がSEQ ID NO:８により確認されるヒトのスプルーティ２タンパク質のSE Q ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性を有するタンパク質、または(2 ) それから誘導されるペプチドであって、少なくとも１０個のアミノ酸を有するペプチドから成ることを特徴とするスプルーティー・ポリペプチドをコード化する単離したＤＮＡフラグメント。 10．該システィンに富む領域がSEQ ID NO:１７と少なくとも５０％の配列同一性を有するスプルーティ・タンパク質をコード化することを特徴とする請求の範囲第９項記載のＤＮＡフラグメント。 11．SEQ ID NO:８に実質的に一致する配列を有するヒト・スプルーティ２・タンパク質をコード化することを特徴とする請求の範囲第９項記載のＤＮＡフラグメント。 12．そのコーディング配列がSEQ ID NO:７に実質的に一致することを特徴とする請求の範囲第１１項記載のＤＮＡフラグメント。 13．SEQ ID NO:６に実質的に一致する配列を有するヒト・スプルーティ１・タンパク質をコード化することを特徴とする請求の範囲第９項記載のＤＮＡフラグメント。 14．そのコーディンク配列がSEQ ID NO:５に実質的に一致することを特徴とする請求の範囲第１３項記載のＤＮＡフラグメント。 15．SEQ ID NO:１１に実質的に一致する配列を有するヒト・スプルーティ３・タンパク質をコード化することを特徴とする請求の範囲第９項記載のＤＮＡフラグメント。 16．そのコーディング配列がSEQ ID NO:１０に実質的に一致することを特徴とする請求の範囲第１５項記載のＤＮＡフラグメント。 17．ＤＮＡフラグメントおよび調節配列から成る組換え発現ベクターであって、該ＤＮＡフラグメントは哺乳動物スプルーティ・タンパク質をコード化し、該タンパク質はそのアミノ酸配列のシステインに富む領域がヒトのスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO:１７と少なくとも４０％の配列同一性を有するタンパク質であり、該スプルーティ２タンパク質の全長配列はSEQ ID NO:８により確認されるものであり、該調節配列が該フラグメントに操作可能に結合し、選択した宿主において該タンパク質の発現を促進することができるものであることを特徴とする発現ベクター。 18．該ベクターを細胞のトランスフェクションに使用するためにポリカチオンとの複合体として約１５０nm未満のサイズの縮合粒子を形成させ、細胞からのスプルーティタンパク質の産生を増加させることを特徴とする請求の範囲第１７項記載のベクター。 19．該複合体が腫瘍細胞表面に特異的に結合し得る標的部位をさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１７項記載のベクター。 20．請求の範囲第１７項記載のベクターで形質転換した哺乳動物細胞。 21．哺乳動物被験体において活性な哺乳動物スプルーティ・タンパク質の異常レベルにより特徴づけられる症状またはそれに関連する危険因子を検出する方法であって、被験体からゲノムDNAまたはcDNAを取得し、該DNAまたはcDNAについて、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:７およびSEQ ID NO:１１により同定される遺伝子から成る群より選択されるヒトスプルーティ遺伝子に関して突然変異の有無を試験することを特徴とする方法。 22．哺乳動物被験体において活性な哺乳動物スプルーティ・タンパク質の異常レベルにより特徴づけられる症状またはそれに関連する危険因子を検出する方法であって、被験体の組織または器官から体液を採取し、該体液をヒトスプルーティ・タンパク質に対する抗休と反応させるが、該タンパク質はそのアミノ酸配列のシステインに富む領域がヒトのスプルーティ２タンパク質のSEQ ID NO: １７と少なくとも４０％の配列同一性を有するタンパク質であり、該スプルーティ２タンパク質の全長配列はSEQ ID NO:８により確認されるものであり、該反応によりタンパク質−抗体複合体を形成し、次いで、かかる複合体の存在を確認することを特徴とする方法。