ES2339461T3

ES2339461T3 - Gen y proteina mn.

Info

Publication number: ES2339461T3
Application number: ES05076222T
Authority: ES
Inventors: Jan Zavada; Silvia Pastorekova; Jaromir Pastorek
Original assignee: Institute of Virology (Slovak Academy of Science)
Current assignee: Institute of Virology (Slovak Academy of Science)
Priority date: 1994-06-15
Filing date: 1995-06-15
Publication date: 2010-05-20
Anticipated expiration: 2015-06-15
Also published as: HK1084148A1; EP1595947B1; DE69534246T2; EP0763110B9; DE69534246D1; EP0763110B1; EP1595947A1; JP2002515848A; ATE296883T1; DE69536047D1; ATE458043T1; EP0763110A2; JP3977416B2

Abstract

Un ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene actividad reguladora del promotor MN, contiene al menos 16 nucleótidos y tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las siguientes secuencias de nucleótidos: (a) la secuencia de nucleótidos del promotor MN según lo mostrado en la figura 6 anexa y las secuencias de nucleótidos complementarias a dicha secuencia de nucleótidos del promotor MN; y (b) las secuencias de nucleótidos que tienen una homología del al menos 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) y con los complementos de dichas secuencias de nucleótidos.

Description

Gen y proteína MN.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al área general de la Genética Médica y a los campos de la Ingeniería Bioquímica y la Inmunoquímica. Más específicamente, se refiere a la identificación de un nuevo gen, el gen MN, un gen celular que codifica a la proteína MN. Los inventores del presente documento descubrieron que las proteínas MN están asociadas con la tumorigenicidad. Las pruebas indican que la proteína MN parece representar un tipo potencialmente nuevo de oncoproteína. La identificación del antígeno MN, así como de los anticuerpos específicos del mismo, en muestras de pacientes proporciona la base para los análisis de diagnóstico/pronóstico del cáncer.

Antecedentes de la invención

Se detectó un nuevo agente cuasi-vírico que tenía propiedades bastante poco comunes por su capacidad para complementar mutantes del Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV) con la proteína G superficial lábil al calor en células HeLa (línea celular derivada del adenocarcinoma cervical humano) que habían sido co-cultivadas con células de carcinoma de mama humano. [Zavada et al., Nature Net Biol., 240: 124 (1972); Zavada et al., J. Gen. Virol., 24: 327 (1974); Zavada, J, Arch. Virol., 50: l (1976); Zavada, J., J. Gen. Virol., 63: 15-24 (1982): Zavada y Zavadova, Arch. Virol. 118: 189 (1991)]. El agente cuasi-vírico fue denominado MaTu, pues se suponía que derivaba de un tumor de mama humano.

Había un relevante interés médico por estudiar y caracterizar a MaTu, pues parecía que era un tipo completamente nuevo de parásito molecular de células vivas y que procedía, posiblemente, de un tumor humano. Zavada et al., Publicación internacional número WO 93/18152 (publicada el 1 de septiembre de 1993), describen la dilucidación de la naturaleza biológica y molecular de MaTu, que resultó en el descubrimiento del gen y de la proteína MN. Los inventores descubrieron que MaTu es un sistema de dos componentes que tiene un componente transmisible exógeno, MX, y un componente celular endógeno, MN. Se descubrió que el componente MN era un gen celular, que mostraba sólo muy poca homología con las secuencias de ADN conocidas. Se descubrió que el gen MN estaba presente en el ADN cromosómico de todos los vertebrados analizados y que su expresión estaba muy correlacionada con la tumorigenicidad.

El agente transmisible exógeno MX de MaTu se identificó como el Virus de la Coriomeningitis Linfocítica (LCMV) que infecta de manera continua a las células HeLa. Los inventores descubrieron que la expresión de MN en las células HeLa está regulada positivamente por la densidad celular y que también su nivel de expresión es aumentado por la infección continua con LCMV.

Los resultados de la investigación proporcionados en la presente memoria muestran que las células transfectadas con ADNc de MN sufren cambios que indican una transformación maligna. Otros descubrimientos de la investigación indican que la interrupción del control del ciclo celular es uno de los mecanismos mediante los que MN puede contribuir al complejo proceso del desarrollo tumoral.

En la presente memoria, se describen la clonación y la secuenciación del gen MN y la producción recombinante de proteínas MN. Se proporcionan la secuencia de ADNc de MN de longitud completa [SEC. ID. N.º 1], la secuencia de aminoácidos deducida de la misma [SEC. ID. N.º 2], una secuencia genómica de longitud completa para MN [SEC. ID. N.º 5], que incluye una secuencia promotora propuesta [SEC. ID. N.º 27]. El gen MN comprende once exones [SEC. ID. N.º 28-38] y diez intrones [SEC. ID. N.º 39-48]. También se describe en la presente memoria una región de 1,4 kilobases [SEC. ID. N.º 49] en la mitad de la secuencia genómica de MN, que tiene la característica de una típica isla rica en CpG y que contiene múltiples sitios de unión putativos para los factores de transcripción AP2 y Spl.

También se describen anticuerpos preparados frente a proteínas/polipéptidos. Las proteínas/los polipéptidos MN se pueden usar en los análisis serológicos según esta invención para detectar los anticuerpos específicos de MN. Además, en los inmunoanálisis según esta invención, se pueden usar proteínas/polipéptidos MN y/o anticuerpos reactivos con el antígeno MN para detectar y/o cuantificar el antígeno MN. Tales análisis pueden ser de diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad neoplástica/pre-neoplástica.

Resumen de la invención

En una realización, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene actividad reguladora del promotor MN, contiene al menos 16 nucleótidos y tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las siguientes secuencias de nucleótidos:

(a): la secuencia de nucleótidos del promotor MN según lo mostrado en la figura 6 anexa y las secuencias de nucleótidos complementarias a dicha secuencia de nucleótidos del promotor MN; y

(b): las secuencias de nucleótidos que tienen una homología del al menos 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) y con los complementos de dichas secuencias de nucleótidos.

Preferiblemente, tal ácido nucleico aislado comprende una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos:

(a1): secuencias de nucleótidos según lo indicado en la figura 6 anexa mediante solapamiento del nucleótido -159 al nucleótido -150 y del nucleótido -93 al nucleótido -84;

(a2): una secuencia de nucleótidos según lo indicado en la figura 6 anexa mediante solapamiento del nucleótido -67 al nucleótido -60;

(a3): secuencias de nucleótidos según lo indicado en la figura 6 anexa mediante solapamiento del nucleótido -214 al nucleótido -205 y del nucleótido -46 al nucleótido -37;

(a4): secuencias de nucleótidos según lo indicado en la figura 6 anexa mediante solapamiento del nucleótido -446 al nucleótido -440, del nucleótido -433 al nucleótido -426 y del nucleótido -35 al nucleótido -26; y

(b1): secuencias de nucleótidos que son complementarias a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a1) a (a4).

Más preferiblemente, tal ácido nucleico aislado comprende una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos:

: las secuencias de nucleótidos de (a1);

: la secuencia de nucleótidos de (a2);

: la secuencia de nucleótidos del nucleótido -46 al nucleótido -37 de (a3);

: la secuencia de nucleótidos del nucleótido -35 al nucleótido -26 de (a4);

: las secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias de nucleótidos de (a1) y (a2);

: la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del nucleótido -46 al nucleótido -37 de (a3); y

: la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del nucleótido -35 al nucleótido -26 de (a4); o

: comprende una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos:

: la secuencia de nucleótidos del nucleótido -46 al nucleótido -37 de (a3) y su secuencia complementaria; y

: la secuencia de nucleótidos del nucleótido -35 al nucleótido -26 de (a4) y su secuencia complementaria.

En otra realización, la presente invención proporciona un vector caracterizado porque comprende tal ácido nucleico aislado.

En otra realización más, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado caracterizado porque contiene al menos 16 nucleótidos y tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las siguientes secuencias de nucleótidos:

(a): las secuencias de nucleótidos de diez intrones de la secuencia genómica de MN indicada en la tabla I en relación con la figura 3 anexa y las secuencias de nucleótidos complementarias a las secuencias de nucleótidos de los diez intrones de la secuencia genómica de MN;

(b): la secuencia de nucleótidos del nucleótido 4.600 al nucleótido 6.000 de la figura 3 anexa y la secuencia de nucleótidos complementaria a la misma; y

(c): secuencias de nucleótidos que tienen una homología del al menos 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b).

Preferiblemente, en tal ácido nucleico aislado, las secuencias de nucleótidos de (c) tienen una homología del al menos 90% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b).

Preferiblemente, en tal ácido nucleico aislado, la dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre:

(a1): la secuencia de nucleótidos del tercer intrón de la secuencia genómica de MN indicada en la Tabla I en relación con la figura 3 anexa que se extiende del nucleótido 5.520 al nucleótido 5.650 y la secuencia de nucleótidos complementaria a la misma; y

(c1): secuencias de nucleótidos que tienen una homología del al menos 80% con las secuencias de nucleótidos de (a1).

Preferiblemente, tal ácido nucleico aislado es de 16 a 50 nucleótidos de longitud, más preferiblemente, es de 19 a 45 nucleótidos de longitud, y funciona como un cebador de la reacción en cadena de la polimerasa para las secuencias de ácidos nucleicos de MN.

Preferiblemente, tal ácido nucleico aislado es de al menos 27 nucleótidos de longitud o es de al menos 29 nucleótidos de longitud o es de al menos 50 nucleótidos de longitud o es de al menos 100 nucleótidos de longitud o es de al menos 150 nucleótidos de longitud.

En otra realización, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado caracterizado porque contiene al menos 150 nucleótidos y tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las siguientes secuencias de nucleótidos: la secuencia de nucleótidos del nucleótido 3.302 al nucleótido 3.771 de la figura 3 anexa y la secuencia de nucleótidos complementaria a la misma.

En otra realización más, la presente invención proporciona un vector caracterizado porque comprende tal ácido nucleico aislado.

Habiéndose indicado el ámbito de la presente invención, ahora se seguirá describiendo e ilustrando en contexto en términos más generales.

Esta invención se refiere al gen MN, a fragmentos del mismo y al ADNc relacionado, que son útiles, por ejemplo, para: 1) producir proteína/polipéptidos MN mediante ingeniería bioquímica; 2) preparar sondas de ácido nucleico para analizar la presencia el gen MN en células de un sujeto; 3) preparar cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) apropiados para su uso, por ejemplo, en análisis basados en la PCR o para producir sondas de ácido nucleico; 4) identificar proteínas y polipéptidos MN, así como homólogos o casi homólogos de los mismos; 5) identificar diversos ARNm transcritos a partir de los genes MN en diversos tejidos y líneas celulares, preferiblemente, humanos; y 6) identificar mutaciones en genes MN. La invención se refiere además a moléculas de ADN purificadas y aisladas que comprenden el gen MN o fragmentos del mismo, o ADNc relacionado o fragmentos del mismo.

De este modo, la invención, en un aspecto, se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas o polipéptidos MN, en las que las secuencias de nucleótidos de dichos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo constituido por:

(a): SEC. ID. N.º 1;

(b): secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas con SEC. ID. N.º 1 o con su complemento;

(c): secuencias de nucleótidos que difieren de SEC. ID. N.º 1 o de las secuencias de nucleótidos de (b) en la secuencia del codones debido a la degeneración del código genético. Además, tales secuencias de ácidos nucleicos se seleccionan de las secuencias de nucleótidos que, de no haber sido por la degeneración del código genético, se hibridarían con la SEC. ID. N.º 1 o con su complemento en condiciones de hibridación restrictivas.

Además, tales ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas o los polipéptidos MN también pueden incluir los ácidos nucleicos de MN de la secuencia genómica mostrada en la figura 3a-d; es decir, la SEC. ID. N.º 5, así como las secuencias que se hibridan con ella o con su complemento en condiciones restrictivas, o que se hibridarían con la SEC. ID. N.º 5 o con su complemento en tales condiciones, de no haber sido por la degeneración del código genético. De manera similar, se revelan las variantes degeneradas de las SEC. ID. N.º 1 y 5.

Además, esta invención se refiere a sondas de ácido nucleico que son fragmentos de los ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas o polipéptidos MN según lo descrito anteriormente. Preferiblemente, tales sondas de ácido nucleico están compuestas por al menos 29 nucleótidos, más preferiblemente, por al menos 50 nucleótidos, incluso más preferiblemente, por al menos 100 nucleótidos y todavía más preferiblemente, por al menos 150 nucleótidos.

Incluso además, esta invención se refiere a ácidos nucleicos aislados que contienen al menos veintisiete nucleótidos seleccionados del grupo constituido por:

(a): SEC. ID. N.º 1, 5 y 27-49 y que son complementarias a las SEC. ID. N.º 1, 5 y 27-49;

(b): secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación restrictivas estándar con una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: SEC. ID. N.º 1, 5 y 27-49 y los respectivos complementos de SEC. ID. N.º 1, 5 y 27-49; y

(c): secuencias de nucleótidos que difieren de las secuencias de nucleótidos de (a) y (b) en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que, de no haber sido por la degeneración del código genético, se hibridarían con los ácidos nucleicos de (a) y (b) en condiciones de hibridación restrictivas estándar. Además, esta invención se refiere a ácidos nucleicos de (b) y (c) que se hibridan parcial o completamente con las regiones no codificantes de SEC. ID. N.º 5 o con su complemento como, por ejemplo, secuencias que funcionan como sondas de ácido nucleico para identificar secuencias de ácidos nucleicos de MN. Se puede usar la tecnología convencional para determinar si los ácidos nucleicos de (b) y (c) o de los fragmentos de SEC. ID. N.º 5 son útiles para identificar las secuencias de ácidos nucleicos de MN, por ejemplo, según lo explicado en líneas generales en Benton y Davis, Science, 196: 180 (1977) y Fuscoe et al., Genomics, 5: 100 (1989). En general, tales ácidos nucleicos son de al menos 29 nucleótidos, más preferiblemente, de al menos 50 nucleótidos e incluso más preferiblemente, de al menos 100 nucleótidos. Un ejemplo de sonda de ácido nucleico preferida es la SEC. ID. N.º 55 (una sonda de 470 pb útil en los ensayos de protección frente a la RNasa).

Los equipos de análisis relacionados con esta invención pueden comprender las sondas de ácido nucleico reveladas que son útiles para el diagnóstico/pronóstico de la enfermedad neoplástica y/o pre-neoplástica. Los equipos de análisis preferidos comprenden medios para detectar o medir la hibridación de dichas sondas con el gen MN o con el producto de ARNm del gen MN, tales como medios de visualización.

También se pueden usar fragmentos de los ácidos nucleicos aislados revelados como cebadores PCR para amplificar segmentos de genes MN, y pueden ser útiles en la identificación de mutaciones en genes MN. Comúnmente, dichos cebadores PCR son oligonucleótidos, preferiblemente, de al menos 16 nucleótidos, pero pueden ser considerablemente más largos. Los ejemplos de cebadores pueden ser de aproximadamente 16 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente, de aproximadamente 19 nucleótidos a aproximadamente 45 nucleótidos.

Además, la invención se refiere al uso de tales cebadores PCR en procedimientos para detectar mutaciones en un gen MN aislado y/o fragmento(s) del mismo. Por ejemplo, tales procedimientos pueden comprender la amplificación de uno o más fragmentos de un gen MN mediante PCR y la determinación de si cualquiera de dichos uno o más fragmentos contiene mutaciones mediante, por ejemplo, la comparación del tamaño de los fragmentos amplificados con el de fragmentos correspondiente amplificados similarmente de genes MN conocidos como normales, usando un análisis de polimorfismos de configuración monocatenaria por PCR o un análisis electroforético sobre gel en gradiente desnaturalizante.

Esta invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas o polipéptidos MN que son unidos específicamente por anticuerpos monoclonales denominados M75 producidos por el hibridoma VU-M75 depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) situada en 12301 Parklawn Drive en Rockville, Maryland 20852 (EE.UU.) con el n.º ATCC HB 11128, y/o por anticuerpos monoclonales denominados MN12 producidos por el hibridoma MN 12.2.2 depositado en la ATCC con el n.º ATCC HB 11647.

Esta invención se refiere además a ácidos nucleicos aislados que contienen al menos dieciséis nucleótidos, preferiblemente, al menos veintinueve nucleótidos, más preferiblemente, al menos cincuenta nucleótidos, siendo dicho ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

(a): los ácidos nucleicos de MN contenidos en los plásmidos A4a, XE1 y XE3, que fueron depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de Rockville, Maryland, Estados Unidos de América, con los respectivos n.º ATCC 97199, 97200 y 97198;

(b): ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones restrictivas con los ácidos nucleicos de MN de (a); y

(c): ácidos nucleicos que difieren de los ácidos nucleicos de (a) o (b) en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético. Tales ácidos nucleicos aislados pueden ser, por ejemplo, cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La invención se refiere además a ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína MN, una proteína de fusión MN o un polipéptido MN que está ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión de un vector, huéspedes unicelulares, procariotas o eucariotas, que están transformados o transfectados con el mismo; y procedimientos para producir recombinantemente proteínas MN, proteínas de fusión MN y polipéptidos MN que comprenden transformar o transfectar huéspedes unicelulares con dicho ácido nucleico ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión, cultivar dichos huéspedes unicelulares transformados o transfectados tal que se expresen dichas pro-
teínas, proteínas de fusión o polipéptidos MN, y extraer y aislar dicha proteína, proteína de fusión o polipéptido MN.

Los ácidos nucleicos recombinantes que codifican proteínas de fusión MN se revelan como aquéllos constituidos esencialmente por una proteína MN o un polipéptido MN y una proteína o un polipéptido no MN, en los que la secuencia de nucleótidos de la parte del ácido nucleico que codifica la proteína o el polipéptido MN se selecciona del grupo constituido por:

(a): SEC. ID. N.º 1;

(b): secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas con SEC. ID. N.º 1 o con su complemento; y

(c): variantes degeneradas de SEC. ID. N.º 1 y de las secuencias de nucleótidos de (b);

en los que el ácido nucleico que codifica dicha proteína o dicho polipéptido MN contiene al menos veintinueve nucleótidos.

Dicha proteína o dicho polipéptido no MN puede ser, preferiblemente, no inmunogénico en seres humanos y no comúnmente reactivo con anticuerpos de los fluidos del cuerpo humano. Los ejemplos de tal secuencia de ADN es la región que codifica al péptido alfa de la betagalactosidasa y una secuencia que codifica la glutatión-S-transferasa o un fragmento de la misma. Sin embargo, en algunos casos, se puede preferir una proteína o un polipéptido no MN que sea serológicamente activo, inmunogénico y/o antigénico como la pareja de fusión de un antígeno MN. Además, en la presente memoria, se revelan tales proteínas/polipéptidos de fusión recombinantes que son sustancialmente puros y no naturales. Tales proteínas de fusión ejemplares son GEX-3X-MN, MN-Fc y MN-PA, descritas infra.

En las células HeLa y en los híbridos celulares de HeLa x fibroblastos (H/F-T) tumorigénicos, la proteína MN se manifiesta como una proteína "gemela" p54/58N; está glicosilada y forma oligómeros ligados mediante enlaces de tipo disulfuro. Según lo determinado por electroforesis sobre geles reductores, las proteínas MN tienen pesos moleculares en el intervalo de aproximadamente 40 kD a aproximadamente 70 kD, preferiblemente, de aproximadamente 45 kD a aproximadamente 65 kD, y más preferiblemente, de aproximadamente 48 kD a aproximadamente 58 kD. Sobre geles no reductores, las proteínas MN en forma de oligómeros tienen pesos moleculares en el intervalo de aproximadamente 145 kD a aproximadamente 160 kD, preferiblemente, de aproximadamente 150 kD a aproximadamente 155 kD, e incluso más preferiblemente, de aproximadamente 152 kD a aproximadamente 154 kD. En la figura 1, se muestra una secuencia de aminoácidos predicha para una proteína MN preferida [SEC. ID. N.º 2].

Otras determinadas proteínas u polipéptidos MN son ejemplificados por el péptido señal MN putativo mostrado como los treinta y siete primeros aminoácidos de la figura 1 [SEC. ID. N.º 6], los epítopos antigénicos MN preferidos [SEC. ID. N.º 10-16] y los dominios de la proteína MN representados en la figura 1 como los aminoácidos 38-135 [SEC. ID. N.º 50], 136-391 [SEC. ID. N.º 51], 414-433 [SEC. ID. N.º 52] y 435-459 [SEC. ID. N.º 53].

El descubrimiento del gen y de la proteína MN y, por tanto, de genes y proteínas MN sustancialmente complementarios codificados de ese modo, condujo al descubrimiento de que la expresión de las proteínas MN estaba relacionada con la tumorigenicidad. El hallazgo resultó en la creación de procedimientos que son de diagnóstico/pronóstico para el cáncer y las afecciones pre-cancerosas. Se proporcionan procedimientos y composiciones para identificar la aparición y la presencia de enfermedad neoplástica mediante la detección y/o la cuantificación de antígeno MN en muestras de pacientes, incluyendo secciones y frotis tisulares, extractos celulares y tisulares de vertebrados, preferiblemente, de mamíferos y, más preferiblemente, de seres humanos. Tal antígeno MN también se puede encontrar en fluidos corporales.

Las proteínas y los genes MN son de uso en la investigación relativa a los mecanismos moleculares de la oncogénesis, en el diagnóstico/pronóstico del cáncer, y se pueden usar en la inmunoterapia contra el cáncer. La presente invención es útil para detectar una amplia variedad de enfermedades neoplásticas y/o pre-neoplásticas. Los ejemplos de enfermedades neoplásticas incluyen carcinomas, tales como carcinomas de mama, de vejiga, de ovario, de útero, de cuello del útero, de endometrio, de células escamosas y carcinomas adenoescamosos; y cánceres de cabeza y cuello; tumores mesodérmicos, tales como neuroblastomas y retinoblastomas; sarcomas, tales como osteosarcomas y sarcoma de Ewing; y melanomas. Son de particular interés los cánceres de cabeza y cuello, los cánceres ginecológicos, incluyendo el cáncer de ovario, de cuello uterino, de vagina, de endometrio y de vulva; cáncer gastrointestinal, tal como cáncer de estómago, de colon y de esófago; cáncer del tracto urinario, tal como cáncer de vejiga y de riñón; cáncer de piel; cáncer de hígado; cáncer de próstata; cáncer de pulmón; y cáncer de mama. Son incluso más particularmente interesantes los cánceres ginecológicos; el cáncer de mama, los cánceres del tracto urinario, especialmente, el cáncer de vejiga; el cáncer de pulmón; y el cáncer de hígado. Todavía más particularmente interesantes son los cánceres ginecológicos y el cáncer de mama. Los cánceres ginecológicos de particular interés son los carcinomas de cuello uterino, de endometrio y de ovarios; más particularmente, tales cánceres ginecológicos incluyen carcinomas de células escamosas de cuello uterino, carcinomas adenoescamosos, adenocarcinomas, así como afecciones ginecológicas pre-cancerosas, tales como tejidos de cuello uterino metaplásticos y condilomas.

La invención se refiere además a la ingeniería bioquímica del gen MN, de fragmentos del mismo o de ADNc relacionado. Por ejemplo, se puede insertar dicho gen, un fragmento del mismo o ADNc relacionado en un vector de expresión adecuado, en el que esté ligado operativamente con una secuencia de control de la expresión; es posible transformar o transfectar células huésped, preferiblemente, unicelulares, con tal vector de expresión; y expresar una proteína/un polipéptido MN, preferiblemente, una proteína MN en el mismo. Tal proteína o polipéptido recombinante puede estar glicosilada o no glicosilada, preferiblemente, glicosilada, y se puede purificar hasta una pureza sustancial. La invención se refiere además a proteínas/polipéptidos MN que se preparan sintéticamente o biológicamente de otro modo.

Tales proteínas/polipéptidos MN se pueden usar en análisis para detectar el antígeno MN en muestras de pacientes y en análisis serológicos para analizar anticuerpos específicos de MN. Las proteínas/los polipéptidos MN revelados en la presente memoria son serológicamente activos, inmunogénicos y/o antigénicos. Se pueden usar además como inmunogenes para producir anticuerpos específicos frente a MN, policlonales y/o monoclonales, así como una respuesta inmune de las células T.

La invención también es relevante para los anticuerpos específicos frente a MN, que se pueden usar con fines de diagnóstico/pronóstico y terapéuticamente. Se prefieren los anticuerpos específicos frente a MN reactivos con los epítopos representados respectivamente por las secuencias de aminoácidos de la proteína MN mostradas en la figura 1 como se explica a continuación: del AA 62 a AA 67 [SEC. ID. N.º 10]; de AA 55 a AA 60 [SEC. ID. N.º 11]; de AA 127 a AA 147 [SEC. ID. N.º 12]; de AA 36 a AA 51 [SEC. ID. N.º 13]; de AA 68 a AA 91 [SEC. ID. N.º 14]; de AA 279 a AA 291 [SEC. ID. N.º 15]; y de AA 435 a AA 450 [SEC. ID. N.º 16]. Se prefieren más los anticuerpos reactivos con los epítopos representados por las SEC. ID. N.º 10, 11 y 12. Se prefieren incluso más los anticuerpos reactivos con los epítopos representados por las SEC. ID. N.º 10 y 11, como por ejemplo, los Acm M75 y MN12, respectivamente. Los más preferidos son los anticuerpos monoclonales reactivos con el epítopo representado por la SEC. ID. N.º 10.

También se prefieren los anticuerpos preparados frente a las proteínas MN producidas recombinantemente como, por ejemplo, GEX-3X-MN, MN 20-19, MN-Fc y MN-PA. También se prefieren los anticuerpos específicos frente a MN preparados frente a proteínas MN glicosiladas, tales como MN 20-19 expresado en células Sf9 infectadas por baculovirus.

Se depositó un hibridoma que produce un anticuerpo específico de MN representativo, el anticuerpo monoclonal M75 (Acm M75), con el número ATCC HB 11128 según lo indicado anteriormente. El anticuerpo M75 se usó para descubrir e identificar la proteína MN, y se puede usar para identificar fácilmente el antígeno MN en transferencias Western, en radioinmunoanálisis e inmunohistoquímicamente, por ejemplo, en muestras de tejidos recién tomadas, congeladas, fijadas en formalina, alcohol, acetona o fijadas de otro modo y/o embebidas en parafina y desparafinadas. Otro anticuerpo específico de MN representativo, el Acm MN12, es secretado por el hibridoma MN 12.2.2, que fue depositado en la ATCC con la denominación HB 11647.

Los anticuerpos específicos de MN se pueden usar, por ejemplo, en diagnósticos de laboratorio, usando microscopía de inmunofluorescencia o tinción inmunohistoquímica; como componente en los inmunoanálisis destinados a detectar y/o cuantificar el antígeno MN en, por ejemplo, muestras clínicas; como sondas para inmunotransferencia destinada a detectar el antígeno MN; en microscopía inmunoelectrónica con perlas de oro coloidales para la localización de proteínas y/o polipéptidos MN en células; y en ingeniería genética para la clonación del gen MN, de fragmentos del mismo o de ADNc relacionado. Tales anticuerpos específicos de MN se pueden usar como componentes de equipos de diagnóstico/pronóstico, por ejemplo, para su uso in vitro en secciones histológicas; tales anticuerpos también se pueden usar para diagnósticos/pronósticos in vivo, por ejemplo, tales anticuerpos se pueden marcar apropiadamente, como con un isótopo radiactivo adecuado, y usarlos in vivo para localizar metástasis mediante gammagrafía. Además, tales anticuerpos se pueden usar in vivo terapéuticamente para tratar pacientes con cáncer con o sin agentes tóxicos y/o citostáticos unidos a los mismos. Además, tales anticuerpos se pueden usar in vivo para detectar la presencia de enfermedad neoplástica y/o pre-neoplástica. Incluso además, tales anticuerpos se pueden usar para purificar por afinidad proteínas y polipéptidos MN.

Esta invención también se refiere a procedimientos para tratar la enfermedad neoplástica y/o la enfermedad pre-neoplástica que comprenden inhibir la expresión de genes MN mediante la administración de secuencias de ácidos nucleicos antisentido que sean sustancialmente complementarias al ARNm transcrito desde los genes MN. Dichas secuencias de ácidos nucleicos antisentido son aquéllas que se hibridan con tal ARNm en condiciones de hibridación restrictivas. Se prefieren las secuencias de ácidos nucleicos antisentido que son sustancialmente complementarias a las secuencias en el extremo 5' de la secuencia de ADNc de MN mostrada en la figura 1. Preferiblemente, tales secuencias de ácidos nucleicos antisentido son oligonucleótidos.

Esta invención también se refiere a vacunas que comprenden una cantidad inmunogénica de una/un o más proteínas y/o polipéptidos MN sustancialmente puros dispersada en un vehículo no tóxico fisiológicamente aceptable, cantidad que es eficaz para inmunizar a un vertebrado, preferiblemente, a un mamífero, más preferiblemente, a un ser humano, frente a una enfermedad neoplástica asociada con la expresión de proteínas MN. Dichas proteínas se pueden producir recombinante, sintética o biológicamente de otro modo. Un uso particular de dicha vacuna sería prevenir la reincidencia y/o la metástasis. Por ejemplo, se podría administrar a un paciente al que se le hubiera extirpado un tumor transportador de MN para evitar la recurrencia del tumor.

Los inmunoanálisis revelados se pueden realizar en equipos de análisis que comprenden proteínas/polipéptidos MN y/o anticuerpos específicos de MN. Tales equipos de análisis pueden estar en formatos en fase sólida, pero no se limitan a los mismos, pudiendo estar también en formato en fase líquida, y pueden estar basados en análisis inmunohistoquímicos, análisis ELISA, análisis de partículas, análisis radiométricos o fluorométricos bien no amplificados o amplificados, usando, por ejemplo, tecnología con avidina/biotina.

Abreviaturas

En la presente memoria, se usan las siguientes abreviaturas:

AA:: aminoácido

ATCC:: Colección Americana de Cultivos Tipo

pb:: pares de bases

BLV:: Virus de la Leucemia Bovina

ASB:: albúmina de suero bovino

BRL:: Laboratorios de Investigación de Bethesda

AC:: anhidrasa carbónica

CAT:: cloranfenicol acetiltransferasa

Ci:: curie

cm:: centímetro(s)

CMV:: citomegalovirus

rpm:: recuentos por minuto

Terminal C:: terminal carboxilo

ºC:: grados centígrados

DEAE:: dietilaminoetilo

DMEM:: medio de Eagle modificado por Dulbecco

EDTA:: etilendiaminotetraacetato

EIA:: inmunoanálisis enzimático

ELISA:: análisis de inmunoabsorción ligado a una enzima

F:: fibroblastos

SFB:: suero fetal bovino

ITCF:: isotiocianato de fluoresceína

GEX-3X-MN:: proteína de fusión MN glutatión-S-transferasa

H:: células HeLa

FEH:: fibroblastos embrionarios humanos

HeLa K:: tipo estándar de células HeLa

HeLa S:: mutante de Stanbridge HeLa D98/AH.2

H/F-T:: híbridos celulares de HeLa y fibroblasto que son tumorigénicos; derivados de HeLa D98/AH.2

H/F-N:: híbridos celulares de HeLa y fibroblasto que no son tumorigénicos; derivados de HeLa D98/AH.2

HRP:: peroxidasa de rábano picante

Inr:: iniciador

IPTG:: isopropil-beta-D-tiogalacto-piranósido

kb:: kilobase

pkb:: pares de kilobases

kD:: kilodalton(s)

LCMV:: Virus de la Coriomeningitis Linfocítica

LTR:: repetición terminal larga

M:: molar

mA:: miliamperio(s)

Acm:: anticuerpo monoclonal

ME:: mercaptoetanol

MEM:: medio esencial mínimo

min:: minuto(s)

mg:: miligramo(s)

ml:: mililitro(s)

mM:: milimolar

MMC:: mitomicina C

MLV:: Virus de la Leucemia Murina

N:: concentración normal

NEG:: negativo

ng:: nanogramo(s)

nt:: nucleótido

Terminal N:: terminal amino

ODN:: oligodesoxinucleótido

ORF:: marco de lectura abierto

PA:: proteína A

PBS:: solución salina tamponada con fosfato

PCR:: reacción en cadena de la polimerasa

PEST:: combinación de abreviaturas de una letra para prolina, ácido glutámico, serina, treonina

pl:: punto isoeléctrico

PMA:: forbol 12-miristato 13-acetato

POS:: positivo

Py:: pirimidina

RIA:: radioinmunoanálisis

RIP:: radioinmunoprecipitación

RIPA:: análisis de radioinmunoprecipitación

RNP:: ensayo de protección frente a la RNasa

SDRE:: elemento de respuesta a la dosis de suero

SDS:: dodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE:: electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio

SINE:: secuencia repetida intercalada corta

SSDS:: sitio donante de empalme sintético

SP-RIA:: radioinmunoanálisis en fase sólida

SSDS:: sitio donante de empalme sintético

SSPE:: NaCl (0,18M), fosfato de sodio (0,01 M), EDTA (0,001 M)

TBE:: tampón de electroforesis de Tris-borato/EDTA

TCA:: ácido tricloroacético

Medio TC:: medio de cultivo tisular

TMB:: tetrametilbencidina

Tris:: tris(hidroximetil)aminometano

\muCi:: microcurie(s)

\mug:: microgramo(s)

\mul:: microlitro(s)

\muM:: micromolar

VSV:: Virus de la Estomatitis Vesicular

X-MLV:: Virus de la Leucemia Murina Xenotrópica

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Líneas celulares

HeLa K:: tipo estándar de células HeLa; aneuploide, línea celular de tipo epitelial aislada de un adenocarcinoma cervical humano [Gey et al., Cancer Res., 12: 264 (1952); Jones et al., Obstet. Gynecol, 38: 945-949 (1971)] proporcionada por el Professor B. Korych, [Instituto de Microbiología Médica e Inmunología, Universidad Charles; Praga, República Checa]

HeLa D98/AH.2 (también HeLa S):: clon HeLa mutante que es deficiente en hipoxantina-guanina-fosforibosil transferasa (HGPRT^{-}) amablemente proporcionada por Eric J. Stanbridge [Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de California, Irvine, CA (EE.UU.)] y publicada en Stanbridge et al., Science, 215: 252-259 (15 de enero de 1982); pariente de los híbridos celulares H/F-N y H/F-T, también obtenidos en E. J. Stanbridge.

NIH-3T3:: línea celular fibroblástica murina publicada en Aaronson, Science, 237: 178 (1987).

XC:: células derivadas de un rabdomiosarcoma de rata inducido con sarcoma de rata inducido con el Virus del Sarcoma de Rous [Svoboda, J., Natl. Cancer Center Institute, Monográfico N.º 17, IN: "International Conference on Avian Tumor Viruses" (J.W. Beard ed.), pp. 277-298 (1964)], amablemente proporcionado por Jan Svoboda [Instituto de Genética Molecular, Academia Checoslovaca de Ciencias; Praga, República Checa]; y

CGL1:: híbrido celular H/F-N (derivado de HeLa D98/AH.2)

CGL2:: híbrido celular H/F-N (derivado de HeLa D98/AH.2)

CGL3:: híbrido celular H/F-T (derivado de HeLa D98/AH.2)

CGL4:: híbrido celular H/F-T (derivado de HeLa D98/AH.2)

Símbolos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos

En la presente memoria, se usan los siguientes símbolos para representar los nucleótidos:

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1

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(Tabla pasa a página siguente)

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Hay veinte aminoácidos principales, cada uno de los cuales se especifica por una disposición diferente de tres nucleótidos adyacentes (código de triplete o codón) y que están ligados entre sí en un orden específico para formar una proteína característica. En la presente memoria, se usa una convención de tres letras o de una letra para identificar dichos aminoácidos, como, por ejemplo, en la figura 1, como se explica a continuación:

2

Breve descripción de las figuras

La figura 1 proporciona la secuencia de nucleótidos de un clon CONK [SEC. ID. N.º 1] de MN de longitud completa aislado según lo descrito en la presente memoria. La figura 1 también expone la secuencia de aminoácidos predicha [SEC. ID. N.º 2] codificada por el ADNc.

La figura 2 compara los resultados de la inmunización de ratas neonatas frente a células tumorales XC con suero de rata preparado frente a la proteína de fusión MN glutatión-S-transferasa (GEX-3X-MN) (el grupo IM) con los resultados de la inmunización de ratas neonatas con sueros de rata control (el grupo C). Cada punto de la gráfica representa el peso tumoral de un tumor procedente de una rata. El ejemplo 2 detalla esos experimentos.

La figura 3a-d proporciona una secuencia genómica completa de 10.898 pb de MN [SEC. ID. N.º 5]. El recuento de bases es el siguiente: 2.654 A; 2.739 C; 2.645 G y 2.859 T. Los 11 exones se muestran en letras mayúsculas.

La figura 4 es un mapa de restricción del ADNc de MN de longitud completa. El marco de lectura abierto se muestra en un recuadro abierto. Las líneas continuas que figuran bajo el mapa de restricción ilustran los tamaños y las posiciones de dos clones de ADNc solapantes. Las flechas horizontales indican las posiciones de los cebadores R1 [SEC. ID. N.º 7] y R2 [SEC. ID. N.º 8] usados para la RACE del extremo 5'. Los sitios de restricción relevantes son BamHI (B), EcoRV (V), EcoRI (E), PstI (Ps), PvuII (Pv).

La figura 5 es un mapa del gen MN humano. Los recuadros rayados numerados representan los exones. El recuadro denominado LTR indica una región de homología con la LTR de HERV-K. Los recuadros vacíos son secuencias relacionadas con Alu.

La figura 6 es una secuencia de nucleótidos para el promotor propuesto del gen MN humano [SEC. ID. N.º 27]. Los nucleótidos se numeran a partir del sitio de iniciación de la transcripción según el ensayo de protección frente a la RNasa. Los posibles elementos reguladores están suprarrayados. Los sitios de inicio de la transcripción se indican con asteriscos (protección frente a la RNasa) y puntos (RACE). La secuencia del primer exón comienza con asteriscos.

La figura 7 proporciona un esquema del alineamiento de los clones genómicos de MN según su posición relacionada con el sitio de inicio de la transcripción. Todos los fragmentos genómicos, a excepción de Bd3, fueron aislados de una genoteca de Lambda FIX III derivada de células HeLa. El clon Bd3 fue derivado de un banco de cerebros fetales humanos.

La figura 8 muestra la construcción y la clonación de una serie de mutantes por eliminación en 5' de la región promotora putativa de MN ligada al gen CAT bacteriano.

Descripción detallada

En la presente memoria, se muestra el gen MN organizado en 11 exones y 10 intrones. En la presente memoria, se describen la clonación y la secuenciación del ADNc y secuencias genómicas de MN, y la ingeniería genética de proteínas MN, tales como las proteínas GEX-3X-MN, MN-PA, MN-Fc y MN 20-19. Las proteínas MN recombinantes se pueden purificar convenientemente mediante cromatografía de afinidad.

MN se manifiesta en células HeLa por una proteína gemela, la p54/58N. Las inmunotransferencias en las que se usó anticuerpo monoclonal reactivo con p54/58N (Acm M75) revelaron dos bandas en 54 kD y 58 kD. Esas dos bandas pueden corresponder a un tipo de proteína que difiere en el patrón de glicosilación o en cómo es procesada. En la presente memoria, la expresión "proteína gemela" indica p5a/58N.

La expresión de las proteínas MN parece ser el diagnóstico/pronóstico de la enfermedad neoplástica. Se descubrió que la proteína gemela MN, la p54/58N, se expresa en células HeLa y en híbridos celulares tumorigénicos de Stanbridge (H/F-T) [Stanbridge et al., Somatic Cell Genet, 7: 699-712 (1981); y Stanbridge et al., Sciences, 215: 252-259 (1982)], pero no en fibroblastos ni en híbridos celulares no tumorigénicos (H/F-N) [Stanbridge et al., id.]. En estudios anteriores publicados en Zavada et al., WO 93/18152, supra, se encontraron proteínas MN en inmunotransferencias preparadas a partir de carcinomas humanos de ovario, endometrio y cuello uterino, y en algunas neoplasias benignas (como papiloma de mama), pero no a partir de tejidos normales de ovario, endometrio, cuello uterino o placenta. El ejemplo 1 de la presente memoria proporciona más información sobre la investigación acerca de la expresión del gen MN, en la que se descubrió que el antígeno MN, detectado mediante tinción inmunohistoquímica, es prevalente en células tumorales de un número de cánceres, incluyendo carcinomas de cuello uterino, vejiga, cabeza y cuello, y células renales, entre otros. Además, los experimentos de tinción inmunohistoquímica del ejemplo 1 muestran que entre los tejidos normales analizados, sólo los tejidos normales de estómago mostraron rutinaria y ampliamente la presencia de antígeno MN. Además, se muestra en la presente memoria que el antígeno MN está a veces presente en zonas que parecen morfológicamente normales de muestras tisulares que presentan displasia y/o malignidad.

Gen MN: Clonación y secuenciación

La figura 1 proporciona la secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc de MN de longitud completa aislado según lo descrito más adelante [SEC. ID. N.º 1]. La figura 3a-d proporciona una secuencia genómica de MN completa [SEC. ID. N.º 5]. La figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos de un promotor MN propuesto [SEC. ID. N.º 27].

Se entiende que, debido a la degeneración del código genético, es decir, a que más de un codón codificará un aminoácido [por ejemplo, cada uno de los codones TTA, TTG, CTT, CTC, CTA y CTG codifica el aminoácido leucina (leu)], las variaciones de las secuencias de nucleótidos en, por ejemplo, las SEC. ID. N.º 1 y 5, en las que un codón está sustituido por otro, producirían una proteína o un polipéptido sustancialmente equivalente según esta invención. La totalidad de tales variaciones en las secuencias de nucleótidos del ADNc de MN y las secuencias de ácidos nucleicos complementarias pertenecen al ámbito de esta invención.

Se entiende además que las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria y mostradas en las figuras 1, 3a-d y 6, sólo representan las estructuras exactas de las secuencias de nucleótidos del ADNc, genómica y promotora aisladas y descritas en la presente memoria. Se espera que se encontrarán secuencias de nucleótidos ligeramente modificadas o que se puedan modificar mediante técnicas conocidas en la materia para codificar proteínas y polipéptidos MN sustancialmente similares u homólogos, por ejemplo, aquéllos que tienen epítopos similares, y se considera que tales secuencias de nucleótidos y proteínas/polipéptidos son equivalentes a efectos de esta invención. El ADN o el ARN que tiene codones equivalentes se considera en el ámbito de la invención, al igual que las secuencias de ácidos nucleicos sintéticas que codifican proteínas/polipéptidos homólogos o sustancialmente homólogos a las proteínas/polipéptidos MN, así como aquellas secuencias de ácidos nucleicos que se hibridarían con dichas secuencias ejemplares [SEC. ID. N.º 1, 5 y 27] en condiciones restrictivas, o que, de no haber sido por la degeneración del código genético, se hibridarían con dichas secuencias de nucleótidos de ADNc en condiciones de hibridación restrictivas. Se considera que las modificaciones y las variaciones de las secuencias de ácidos nucleicos según lo indicado en la presente memoria dan como resultado secuencias que son sustancialmente iguales a las secuencias de MN ejemplares y a los fragmentos de las mismas.

Clon de ADNc parcial

En Zavada et al., id., se describió el aislamiento de un clon de ADNc de MN parcial de 1.397 pb de longitud. Se preparó un banco de ADNc de Lambda gt11 de células HeLa infectadas con LMCV y se sometió a inmunorrastreo con Acm M75 en combinación con anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados con fosfatasa alcalina. Se cogió un clon positivo y se subclonó en el sitio NotI de pBlusecript KS [Stratagen; La Jolla, CA (EE.UU.)] creando así pBluscript-MN.

Se realizaron dos eliminaciones anidadas orientadas opuestamente usando el equipo Erase-a-Base^{TM} [Promega, Madison, WI (EE.UU.)] y se secuenciaron mediante el procedimiento didesoxi con un equipo de secuenciación de T7 [Pharmacia; Piscataway, NJ (EE.UU.)]. La secuenciación mostró un clon de ADNc parcial, siendo el inserto de una longitud de 1.397 pb. La secuencia comprende un marco de lectura abierto de 1.290 pb largo y una región sin traducir en 3' de 107 pb que contiene una señal de poliadenilación (AATAAA). Sin embargo, la secuencia que rodea el primer codón ATG del marco de lectura abierto (ORF) no se ajustaba a la definición de sitio de inicio de la traducción. Además, a raíz de una comparación del tamaño del clon MN con el del ARNm correspondiente en una transferencia Northern, se observó que el ADNc carecía de aproximadamente 100 pb del extremo 5' de su secuencia.

Clon de ADNc de longitud completa

Los intentos por aislar un clon de longitud completa del banco de ADNc original fracasaron. Por lo tanto, los inventores realizaron una amplificación rápida de los extremos de ADNc (RACE) usando los cebadores específicos de MN R1 y R2 [SEC. ID. N.º 7 y 8], derivados de la región 5' del clon de ADNc original. Se insertó el producto de la RACE en pBluescript, y se secuenció la población completa de plásmidos recombinantes con un cebador específico de MN, ODN1 [SEC. ID. N.º 3]. De ese modo, se obtuvo una secuencia fiable en el propio extremo 5' del ADNc de MN según lo mostrado en la figura 1 [SEC. ID. N.º 1].

Específicamente, se realizó una RACE usando un sistema de RACE de 5' [GIBCO BRL; Gaithersburg, MD (EE.UU.)] como se explica a continuación. Se usó 1 \mug de ARNm (el mismo usado anteriormente) como molde para la síntesis del ADNc de la primera cadena que fue cebado por el oligonucleótido antisentido específico de MN R1 (5'-TGGGGTTCTTGAGGATCTCCAGGAG-3') [SEC. ID. N.º 7]. Se precipitó dos veces el producto de la primera cadena en presencia de acetato de amonio, y se unió una cola C homopolimérica a su extremo 3' mediante TdT. Se amplificó entonces el ADNc con la cola mediante PCR usando un cebador anidado, R2 (5'-CTCTAACTT
CAGGGAGCCCTCTTCTT-3') [SEC. ID. N.º 8] y un cebador de ancla que se aparea con la cola homopolimérica (5'-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3') [SEC. ID. N.º 9]. Se digirió el producto amplificado con las enzimas de restricción BamHI y SalI, y se clonó en el plásmido pBluescript II KS. Tras la transformación, se purificó el ADN plasmídico a partir de la población completa de células transformadas y se usó como molde para la secuenciación con el cebador específico de MN OON1 [SEC. ID. N.º 3; un 29-mero 5' CGCCCAGTGGGTCATCTTCCCCAGAAGAG 3'].

En base a los resultados del análisis de RACE, se observó que la secuencia de ADNc de MN de longitud completa contenía un solo ORF que comenzaba en la posición 12, con un codón ATG que está en buen contexto (GCGCATGG) con la regla propuesta para la iniciación de la traducción [Kozak, J. Cell. Biol., 108: 229-241 (1989)]. [Véase más adelante el apartado "Mapeado del sitio de inicio de la transcripción del gen MN" para un buen mapeado del extremo 5' del gen MN]. La región no traducida de 3' rica en AT contiene una señal de poliadenilación (AATAAA) que precede el extremo del ADNc en 10 pb. Sorprendentemente, la secuencia del clon original, así como la de cuatro clones más obtenidos del mismo banco de ADNc, no reveló ninguna cola poli(A). Además, justo secuencia abajo de la señal de poli(A), se encontró un motivo ATTTA que se cree que contribuye a la inestabilidad del ARNm [Shaw y Kamen, Cell. 46: 659- 667 (1986)]. Ese hecho aumentó la posibilidad de que la falta de la cola poli(A) se deba a la degradación específica del ARNm de MN.

Clones genómicos

Para estudiar la regulación de MN, se aislaron clones genómicos de MN. Se aisló un clon genómico de MN (Bd3) de un banco de cósmidos humanos preparado a partir de cerebro fetal usando ambos ADNc de MN como sonda y los cebadores específicos de MN derivados del extremo 5' del ADNc ODN1 [SEC. ID. N.º 3, supra] y ODN2 [SEC. ID. N.º 4; 19-mero (5' GGAATCCTCCTGCATCCGG 3')]. El análisis secuencial reveló que el clon genómico cubría una región secuencia arriba de un sitio de inicio de la transcripción de MN y que acababa con el sitio de restricción de HamHI ubicado dentro del ADNc de MN. Se pueden aislar de manera similar otros clones genómicos de MN.

Para identificar la región genómica completa de MN, se preparó la genoteca humana en vector Lambda FIX I (Stratagene) a partir de ADN cromosómico de HeLa y se rastreó mediante la hibridación de placas usando ADNc de MAN según lo descrito a continuación. Se identificaron varios fagos recombinantes de MN independientes, se aislaron y se caracterizaron mediante mapeado de restricción y análisis de hibridación. Se seleccionaron cuatro recombinantes solapantes que cubrían toda la región genómica de MN, se digirieron y se subclonaron en pBluescript. Entonces se sometieron los subclones a eliminaciones anidadas bidireccionales y a secuenciación. Se reunieron y se analizaron las secuencias de ADN por ordenador usando el paquete de informático DNASIS.

Más adelante, se proporciona la información sobre el aislamiento de los clones genómicos que cubren toda la región genómica de MN. La figura 7 proporciona un esquema del alineamiento de los clones genómicos de MN según el sitio de inicio de la transcripción. Los plásmidos que contienen el clon A4a y los subclones XE1 y XE3 fueron depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) situada en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 (EE.UU.), el 6 de junio de 1995, respectivamente, con los n.º de depósito ATCC 97199, 97200 y 97198.

Aislamiento de clones de ADN genómico

Se preparó la genoteca de HeLa humana con Sau3AI en el vector Lambda FIX II [Stratagene; La Jolla, CA (EE.UU.)] según el protocolo del fabricante. El banco de cósmidos de cerebro fetal humano del cósmico SuperCos era de Stratagene. Se emplacaron fagos o las bacterias recombinantes a 1 x 10^{5} unidades formadoras de placa en placas Nunc de 22 x 22 cm o 5 x 10^{4} células en placas Petri de 150 mm, y se transfirieron las placas o las colonias a membranas Hybond N (Amersham). La hibridación se llevó a cabo con ADNc de MAN de longitud completa marcado con [P^{32}]PdCTP mediante el procedimiento de marcaje de ADN Multiprime (Amersham) a 65ºC en 6 x SSC, SDS al 0,5%, 10 x Denhardt y 0,2 mg/ml de ADN de esperma de salmón. Se lavaron los filtros dos veces en 2 x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC durante 20 min. Se expusieron los filtros secados a películas de rayos X y se recogieron los clones positivos. Se aislaron los fagos y las bacterias mediante 3-4 series secuenciales de rastreo.

Subclonación y secuenciación de ADN

Se subclonaron fragmentos de ADN genómico en un pBluescript KS y se generaron moldes para la secuenciación mediante eliminaciones anidadas en serie usando el sistema Erase-a-Base^{TM}. Se realizó una secuenciación mediante el procedimiento de terminación de la cadena con didesoxinucleótidos usando el equipo de secuenciación de T7 (Pharmacia). Se llevaron a cabo alineamientos y análisis de las secuencias de nucleótidos usando el paquete informático DNASIS (Hitachi Software Engineering).

Estructura de exón-intrón de la región genómica completa de MN

La secuencia completa de los clones en solapamiento contiene 10.898 pb (SEC. ID. N.º 5). La figura 5 representa la organización del gen MN humano, mostrando la ubicación de los 11 exones, así como de los 2 elementos de repetición Alu secuencia arriba y los 6 elementos de repetición Alu intrónicos. Todos los exones son pequeños, variando de 27 a 191 pb, a excepción del primer exón que es de 415 pb. Los tamaños de los intrones varían de 89 a 1.400 pb.

La siguiente tabla 1 enumera las secuencias donante y aceptora de empalme que configuran las secuencias de consenso de empalme que incluyen el motivo AG-GT [Mount, "A catalogue of splice junction sequences", Nucleic Acids Res. 10: 459-472 (1982)].

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TABLA 1 Estructura de exón-intrón del gen MN humano

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TABLA 1 (continuación)

4

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Una investigación sobre las secuencias relacionadas con el gen MN del banco de datos EMBL no reveló ninguna homología específica a excepción de 6 repeticiones de tipo Alu completas y las 2 parciales con homología con las secuencias Alu que varió del 69,8% al 91% [Jurka y Milosavljevic, "Reconstruction and analysis of human Alu genes", J. Mol. Evol. 32: 105-121 (1991)]. En el apartado de "Caracterización de la región flanqueadora de 5'" que figura más adelante, también se observa una secuencia de 222 pb próxima al extremo 5' de la región genómica muy homóloga a una región de la LTR de HERV-K.

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Mapeado del sitio de inicio de la transcripción del gen MN

En el intento anterior por localizar el sitio de inicio de la transcripción del gen MN mediante RACE (anterior), se obtuvo un fragmento PCR principal cuya secuencia colocaba al sitio de inicio 12 pb secuencia arriba del primer codón del ORF. Ese resultado se obtuvo probablemente debido a una amplificación preferencial de la forma más corta del ARNm. Por lo tanto, los inventores usaron un ensayo de protección frente a la RNasa (RNP) para obtener un buen mapeado del extremo 5' del gen MN. La sonda era una copia de ARN de 470 nucleótidos marcada uniformemente (nt -205 a +265) [SEC. ID. N.º 55], que fue hibridada con ARN total de células CGL3 y HeLa que expresaban MN y analizada sobre un gel de secuenciación. Ese análisis ha demostrado que la transcripción del gen MN se inicia en múltiples sitios, siendo el extremo 5' del transcripto más largo de MN 30 nt más largo que el caracterizado anteriormente mediante RACE.

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Ensayo de protección frente a la RNasa

Se prepararon sondas de ARN marcadas con ^{32}P con un equipo de transcripción de ARN (Stratagene). Se llevaron a cabo reacciones de transcripción in vitro usando 1 \mug del plásmido linealizado como molde, 50 \muCi de [P^{32}P]rUTP (800 Ci/mmol), 10 U de ARN polimerasa bien de T3 o de T7 y otros componentes del equipo de transcripción siguiendo las instrucciones del proveedor. Para el mapeado del extremo 5' del ARNm de MN, se subclonó el fragmento NcoI-BamHI de 470 pb (Ncol relleno con enzima de Klenow) del clon Bd3 (nt -205 a +265 con respecto al inicio de la transcripción) en los sitios EcoRV-BamHI de pBluescript SK+, se linealizó con HindIII y se marcó con ARN polimerasa de T3. Para el análisis del ARNm del extremo 3', se usó sonda preparada usando ARN polimerasa de T7 en un molde KS-dXE3-16 (uno de los clones de eliminación anidada del subclón XE3 de la región genómica de MN) digerido con Sau3AI (que corta el exón 11 en la posición 10.629). Se usaron aproximadamente 3 x 10^{5} rpm de sonda de ARN por cada reacción del ensayo de protección frente a la RNasa.

Los ensayos de protección frente a la RNasa (RNP) se realizaron usando un equipo de protección frente a la RNasa para lisados (USB/Amersham) según los protocolos del proveedor. En síntesis, se lisaron las células usando solución de lisis a una concentración de aproximadamente 10^{7} células/ml y se usaron 45 \mul de homogeneizado celular en las reacciones de hibridación de ARN/ARN con sondas de ARN marcadas con ^{32}P preparadas según lo descrito anteriormente. Tras las hibridaciones durante una noche a 42ºC, se trataron los homogeneizados durante 30 min a 37ºC con una mezcla de cóctel de RNasa. Los dúplex de ARN protegidos se trataron sobre geles de secuenciación desnaturalizantes de poliacrilamida/urea. Los geles fijados y secados se expusieron a una película de rayos X durante 24-72 horas.

Mapeado del sitio de terminación de la transcripción del gen MN

También se usó un ensayo de protección frente a la RNasa, según lo descrito anteriormente, para verificar el extremo 3' del ADNc de MN. Eso era importante con respecto al descubrimiento anterior de que el ADNc contiene una señal poli(A), pero carece de una cola poli(A), que se podría haber perdido durante la degradación propuesta del ARNm de MN debido a la presencia de un motivo de inestabilidad en su región 3' no traducida. El ensayo RNP del ARNm de MN con el fragmento del clon genómico XE3 que cubría la región de interés corroboró los datos obtenidos en la secuenciación del ADNc de MN, pues el extremo 3' del fragmento propuesto se correspondía con la última base del ADNc de MN (posición 10.752 de la secuencia genómica). Ese sitio también cumple el requisito sobre la presencia de una segunda señal en la secuencia genómica que es necesaria para la terminación de la transcripción y la poliadenilación [McLauchlan et al., Nucleic Acids Res., 13: 1347 (1985)]. El motivo TGTGTTAGT (nt 10.759-10.767) se corresponde bien tanto con la secuencia consenso como con la posición de la señal de los 22 pb secuencia abajo de la señal poli(A) (nt 10.737-10.742).

Caracterización de la región flanqueadora de 5'

Se descubrió que el clon genómico Bd3 aislado del banco de cósmidos de cerebro fetal humano cubre una región de 3,5 kb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen MN. No contiene una región codificante relevante. Hay dos repeticiones Alu situadas en las posiciones -2.587 a -2.296 [SEC. ID. N.º 56] y -1.138 a -877 [SEC. ID. N.º 57] (con respecto al inicio de la transcripción determinado mediante RNP). La secuencia próxima al extremo 5' es muy homóloga (identidad del 91,4%) a la región U3 de las repeticiones terminales largas de los retrovirus endógenos humanos HERV-K [Ono, M., "Molecular cloning and long terminal repeat sequences of human endogenous retrovirus genes related to types A and B retrovirus genes", J. Virol, 58: 937-944 (1986)]. El fragmento de tipo LTR es de una longitud de 222 pb con una cola rica en A en su extremo 3'. Lo más probable es que represente parte del retroposón no vírico de tipo SINE (secuencia repetida intercalada corta) derivado de HERV-K [Ono et al., "A novel human nonviral retroposon derived from an endogenous retrovirus", Nucleic Acids Res., 15: 8725-8373 (1987)]. No hay secuencias correspondientes a los elementos reguladores en este fragmento, pues la parte 3' de U3 y las regiones R y U5 enteras de la LTR están ausentes en el clon genómico Bd3, y el elemento sensible a los glucocorticoides, así como las secuencias básicas potenciadoras están más allá de la frontera de 5'.

Sin embargo, se identificaron dos potenciadores dependientes de los queratinocitos en la secuencia de secuencia abajo del fragmento de tipo LTR, en las posiciones -3.010 y -2.814. Esos elementos están implicados en la regulación transcripcional de los oncogenes E6-E7 de los virus del papiloma humano, y se cree que son responsables de su especificidad tisular [Cripe et al., "Transcriptional regulation of the human papilloma-virus-16 E6-E7 promoter by a keratinocyte-dependent enhancer, and by viral E2 trans-activator and repressor gene products: implications for cervical carcinogenesis", EMBO J, 6: 3745-3753 (1987)].

El análisis de la secuencia de nucleótidos de 5' del ADN con respecto al inicio de la transcripción (desde el nt -507) no reveló una caja TATA reconocible a la distancia esperada desde el comienzo del primer exón (figura 6). Sin embargo, la presencia de posibles sitios de unión para los factores de transcripción sugiere que esta región podría contener un promotor para el gen MN. Hay varias secuencias consenso para los factores de transcripción AP1 y AP2, así como para otros elementos reguladores, que incluyen un sitio de unión a p53 [Locker y Buzard, "A dictionary of transcription control sequences", J. DNA Sequencing and Mapping, 1: 3-11 (1990); Imagawa et al., "Transcription factor AP-2 mediates induction by two different signal-transduction pathways: protein kinase C and cAMP", Cell, 51: 251-260 (1987); El Deiry et al., "Human genomic DNA sequences define a consensus binding site for p53", Nat. Genet., 1: 44-49 (1992)]. Aunque la región promotora putativa contiene C+G en un 59,3%, carece de otros atributos de las islas ricas en CpG que son típicas de promotores sin TATA de los genes domésticos [Bird, "CpG-rich islands and the function of DNA methylation", Nature, 321: 209-213 (1986)]. Otra clase de genes que carecen de la caja TATA utiliza el elemento iniciador (Inr) como promotor. Muchos de estos genes no son constitutivamente activos, sino que son más bien regulados durante la diferenciación o el desarrollo. El Inr tiene una secuencia consenso de PyPyPy-CAPyPyPyPyPy [SEC. ID. N.º 23] y engloba el sitio de inicio de la transcripción [Smale y Baltimore, "The ``initiator'' as a transcription control element", Cell, 57: 103-113 (1989)]. Hay dos de tales secuencias consenso en el promotor putativo de MN; sin embargo, no se solapan con el inicio de la transcripción (figura 6).

En los experimentos iniciales, los inventores no pudieron demostrar la actividad del promotor en células de carcinoma humano HeLa y CGL3 que expresan MN, usando el fragmento Bd3 de 3,5 kb y series de sus mutantes por eliminación (desde el nt -933 a -30) [SEC. ID. N.º 58] fusionados con el gen de la cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) en un sistema transitorio. Esto podría indicar que bien la actividad del promotor de la región 5' con respecto al inicio de la transcripción de MN está por debajo de la sensibilidad del análisis de CAT o que son necesarios más elementos reguladores no presentes en los constructos de los inventores para dirigir la expresión del gen MN.

En cuanto a este hecho, se descubrió una interesante región en la mitad del gen MN. La región es de una longitud de aproximadamente 1,4 kb [nt 4.600-6.000 de la secuencia genómica; SEC. ID. N.º 49] y abarca desde la parte 3' del primer intrón hasta el final del quinto exón. La región tiene la característica de una isla rica en CpG típica, con un contenido de C+G del 62,8% y 82 dinucleótidos CpG: 131 dinucleótidos GpC. Además, hay múltiples sitios de unión putativos para los factores de transcripción AP2 y Spl [Locker y Buzard, supra; Briggs et al., "Purification and biochemical characterization of the promoter-specific transcription factor Sp-1", Science. 234: 47-52 (1986)] concentrados en el centro de esta zona. Particularmente, el tercer intrón de 131 pb de longitud contiene tres secuencias consenso de Spl y tres de AP2. Esos datos indican la posible implicación de esa región en la regulación de la expresión del gen MN. Sin embargo, la funcionalidad de esa región, así como otros elementos reguladores encontrados en el promotor MN en 5' propuesto, siguen por determinarse.

Análisis del promotor MN

Para definir las secuencias necesarias para la expresión del gen MN, se fusionó una serie de mutantes por eliminación de 5' de la región promotora putativa con el gen de la cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) bacteriana. [Véase la figura 8]. Se transfectaron los constructos de eliminación pMN-CAT usando un procedimiento de DEAE-dextrano para la expresión transitoria en células HeLa y CGL3. Se usaron esas células porque expresan de manera natural la proteína MN y, por tanto, deberían contener todos los factores de transcripción necesarios.

Tras 48 horas, se prepararon lisados celulares crudos y se evaluó la actividad de la CAT expresada según la acetilación de [^{14}C]cloranfenicol mediante cromatografía de capa fina. Sin embargo, no se detectó ninguna actividad de la CAT del promotor MN en las células HeLa ni en las células CGL3 en un sistema transitorio. Por otro lado, los plásmidos de CAT indicadores con promotores víricos (p. ej., pBLV-LTR + transactivador tax, pRSV CAT y pSV2 CAT), que sirvieron como controles positivos, proporcionaron señales potentes en el cromatograma. [pSV2 CAT porta el origen de SV40 y expresa la CAT desde el promotor temprano de SV40 (P_{\varepsilon}). pRSV CAT expresa la CAT desde el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) (P_{LTR})].

No se observó actividad de la CAT detectable en otros experimentos en los que se usaron cantidades crecientes de plásmidos transfectados (de 2 a 20 g de ADN por placa) y períodos prolongados de incubación de las células tras la transcripción. El aumento de la densidad celular tampoco mejoró los resultados (al contrario de las expectativas basadas en la expresión dependiente de la densidad de la proteína MN nativa de las células HeLa). Como los inventores habían encontrado secuencias consenso para los factores de transcripción AP2 y AP1 en el promotor MN putativo, estudiaron el efecto de sus inductores dexametasona (1 m) y el éster de forbol forbol 12-miristato 13-acetato (50 ng/ml de PMA) sobre la actividad de la CAT. Sin embargo, el promotor MN no fue sensible a esos compuestos.

Lo siguiente explica los resultados: - el promotor MN putativo que precede inmediatamente al sitio de inicio de la transcripción es muy débil y su actividad está por debajo de la sensibilidad de un análisis de la CAT estándar; - se necesitan más secuencias (p. ej., potenciadoras) para la transcripción de MN.

Para seguir arrojando luz sobre la regulación de la expresión de MN a nivel de la transcripción, se preparan constructos de manera análoga a los constructos de MN-CAT, en los que la región promotora de MN está secuencia arriba del gen de la neomicina fosfotransferasa diseñado genéticamente para la expresión en mamíferos. Entonces se transfectan tales constructos a células que son sometidas a la selección con G418. Luego se evalúa la actividad del promotor en base al número de colonias resistentes a G418 que se obtiene. Ese procedimiento tiene la capacidad de detectar la actividad de un promotor que sea de 50 a 100 veces más débil en comparación con los promotores detectables mediante un análisis de la CAT.

Secuencia de aminoácidos deducida

El ORF del ADNc de MN mostrado en la figura 1 tiene la capacidad de codificación de una proteína de 459 aminoácidos con un peso molecular calculado de 49,7 kD. La proteína MN tiene un pl estimado de aproximadamente 4. Según lo calculado mediante un análisis de las secuencias de aminoácidos, la estructura primaria deducida de la proteína MN se puede dividir en cuatro regiones diferentes. La región hidrófoba inicial de 37 aminoácidos (AA) se corresponde con un péptido señal. La proteína madura tiene una parte N-terminal de 377 AA, un segmento transmembrana hidrófobo de 20 AA y una región C-terminal de 25 AA. Alternativamente, se puede observar que la proteína MN tiene los cinco siguientes dominios: (1) un péptido señal [aminoácidos (AA) 1-37; SEC. ID. N.º 6]; (2) una región de homología con la cadena alfa del colágeno (AA 38-135; SEC. ID. N.º 50); (3) un dominio de la anhidrasa carbónica (AA 136-391; SEC. ID. N.º 51); (4) una región transmembrana (AA 414-433; SEC. ID. N.º 52); y (5) un terminal C intracelular (AA 434-459; SEC. ID. N.º 53). (Los números de los AA se adecuan a la figura 1).

Una comprensión más detallada de la estructura primaria de la proteína MN reveló la presencia de varias secuencias consenso. Se encontró un posible sitio de N-glicosilación en la posición 346 de la figura 1. Esta característica, junto con una región predicha que abarca la membrana, coincide con los resultados, en los que se observó que MN es una proteína N-glicosilada ubicada en la membrana plasmática. También se descubrió que la secuencia de la proteína MN deducida a partir del ADNc contiene siete elementos de la secuencia S/TPXX [SEC. ID. N.º 25 y 26] (uno de ellos está en el péptido señal) definidos por Suzuki, J. Mol. Biol., 207: 61- 84 (1989), como los motivos encontrados frecuentemente en las proteínas reguladoras de genes. Sin embargo, sólo dos de ellos están compuestos por los aminoácidos consenso sugeridos.

Los experimentos han demostrado que la proteína MN es capaz de unirse a cationes de cinc, como se muestra mediante una cromatografía de afinidad usando sefarosa quelante cargada con Zn. Se descubrió que la proteína MN inmunoprecipitada desde células HeLa por el Acm M75 tiene una actividad catalítica débil de la AC. El dominio de tipo AC de MN tiene una predisposición estructural a servir como sitio de unión para dominios solubles pequeños. Por lo tanto, la proteína MN podría mediar algún tipo de transducción de señales.

Se mostró, mediante cromatografía de afinidad con celulosa de ADN, que la proteína MN de células HeLa infectadas con LCMV se une a ADN de esperma de salmón bicatenario inmovilizado. La actividad de unión requiere tanto la presencia de cationes de cinc como la ausencia de un agente reductor en el tampón de unión.

Similitudes secuenciales

Se llevó a cabo el análisis por ordenador de la secuencia de ADNc de MN usando DNASIS y PROSID (Paquetes informáticos de Pharmacia). Se hicieron búsquedas en las bases de datos GenBank, EMBL, Protein Identification Resource y SWISS-PROT para encontrar todas las similitudes posibles entre las secuencias. Además, se realizó un búsqueda de las proteínas que compartían similitudes secuenciales con MN en el banco de datos MIPS con el programa FastA [Pearson y Lipman, PNAS (EE.UU.), 85: 2444 (1988)].

Se descubrió que el gen MN es claramente una nueva secuencia derivada del genoma humano. Las búsquedas de las similitudes entre las secuencias de aminoácidos en las bases de datos de proteínas revelaron como la homología más cercana un nivel de identidad secuencial (38,9% en 256 AA o 44% en un solapamiento de 170 AA) entre la parte central de la proteína MN [AA 136-391 (SEC. ID. N.º 51)] o 221-390 [SEC. ID. N.º 54] de la figura 1 y anhidrasas carbónicas (AC). Sin embargo, la homología secuencial global entre la secuencia de ADNc de MN y las secuencias de ADNc que codifican diferentes isoenzimas de AC está en un intervalo de homología del 48-50%, considerado como bajo por algunos expertos en la técnica. Por lo tanto, la secuencia de ADNc de MN no está estrechamente relacionada con ninguna de las secuencias de ADNc de AC.

Sólo las secuencias de nt muy estrechamente relacionadas que tengan una homología del al menos 80-90% se hibridaría entre sí en condiciones restrictivas. Una comparación secuencial entre la secuencia de ADNc de MN mostrada en la figura 1 y un ADNc correspondiente de la anhidrasa carbónica II (AC II) mostró que no hay tramos de identidad entre las dos secuencias que serían lo suficientemente largos como para permitir que un segmento de la secuencia de ADNc de la AC II que tuviera 50 o más nucleótidos se hibridara en condiciones de hibridación restrictivas con ADNc de MN, o viceversa.

Aunque las secuencias de aminoácidos deducidas de MN muestran cierta homología con las anhidrasas carbónicas conocidas, difieren de ellas en varios aspectos. Se conocen siete anhidrasas carbónicas [Dodgson et al. (eds.), "The Carbonic Anhydrases", (Plenum Press; Nueva York/Londres (1991)]. Todas las anhidrasas carbónicas conocidas son proteínas de aproximadamente 30 kD, más pequeñas que los productos relacionados con p54/58N del gen MN. Además, las anhidrasas carbónicas no forman oligómeros como lo hacen las proteínas relacionadas con MN.

La parte N-terminal de la proteína MN (AA 38-135; SEC. ID. N.º 50) muestra una identidad del 27-30% con la cadena alfa 1 del colágeno humano, que es un componente importante de la matriz extracelular.

Proteínas y/o polipéptidos MN

La expresión "proteínas y/o polipéptidos MN" (proteínas/polipéptidos MN) se define en la presente memoria como proteínas y/o polipéptidos codificados por un gen MN o por fragmentos del mismo. Un ejemplo de proteína MN preferida según esta invención tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la figura 1. Las proteínas/los polipéptidos MN preferidos son aquellas proteínas y/o aquellos polipéptidos que tienen una homología sustancial con la proteína MN mostrada en la figura 1. Por ejemplo, tales proteínas/polipéptidos MN sustancialmente homólogos/as son aquéllos/as que son reactivos/as con los anticuerpos específicos de MN de esta invención, preferiblemente, los Acm M75, MN12, MN9 y MN7 o sus equivalentes.

Un "polipéptido" es una cadena de aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos, y en la presente memoria, se considera que está compuesta por 50 o menos aminoácidos. Una "proteína" se define en la presente memoria como un polipéptido compuesto por más de 50 aminoácidos.

Las proteínas MN presentan varias características interesantes: la ubicación de la membrana celular, la expresión dependiente de la densidad celular en células HeLa, la correlación con el fenotipo tumorigénico de híbridos celulares somáticos de HeLa x fibroblasto y la expresión en varios carcinomas humanos entre otros tejidos. Como se demuestra en la presente memoria, por ejemplo, en el ejemplo 1, es posible encontrar la proteína MN directamente en secciones de tejido tumoral, pero en general no en tejidos homólogos normales (se señalan excepciones infra en el ejemplo 1, como en tejidos normales de estómago). MN también se expresa a veces en zonas que parecen morfológicamente normales de muestras tisulares que presentan displasia y/o malignidad. El conjunto de estas características sugiere una posible implicación de MN en la regulación de la proliferación, diferenciación y/o transformación celular.

Se puede apreciar que una proteína o un polipéptido producido por una célula neoplástica in vivo podría estar secuencialmente alterada con respecto al o a la producida por una célula tumoral en cultivo celular o por una célula transformada. De este modo, las proteínas y/o los polipéptidos MN que tienen secuencias de aminoácidos variables, incluyendo sin limitación, sustituciones, extensiones, eliminaciones y truncamientos de aminoácidos, y combinaciones de los mismos, pertenecen al ámbito de esta invención. También se puede apreciar que una proteína existente en fluidos corporales está sometida a procesos degenerativos, tales como, procesos proteolíticos; por tanto, es posible encontrar proteínas MN que estén significativamente truncadas y polipéptidos MN en fluidos corporales, tales como sueros. La expresión "antígeno MN" se usa en la presente memoria para englobar proteínas y/o polipéptidos MN.

Se apreciará además que la secuencia de aminoácidos de las proteínas y los polipéptidos MN se pueden modificar mediante técnicas genéticas. Puede haber eliminaciones o sustituciones de uno o más aminoácidos. Tales cambios en los aminoácidos pueden no provocar ningún cambio medible en la actividad biológica de la proteína o del polipéptido y dar como resultado proteínas o polipéptidos que pertenezcan al ámbito de esta invención, así como muteínas de MN.

Las proteínas y los polipéptidos MN de esta invención se pueden preparar en una variedad de modos según esta invención, como por ejemplo, recombinante, sintética o biológicamente de otro modo; es decir, mediante la escisión de proteínas y polipéptidos más largos enzimática y/o químicamente. Un procedimiento preferido para preparar proteínas MN es mediante procedimientos recombinantes. Más adelante, se describen procedimientos particularmente preferidos para producir recombinantemente proteínas MN relativos a las proteínas GEX-3X-MN, MN 20-19, MN-Fc y MN-PA.

Producción recombinante de proteínas y polipéptidos

Un procedimiento representativo para preparar las proteínas MN mostradas en la figura 1 o fragmentos de las mismas consistiría en insertar la longitud completa o un fragmento apropiado del ADNc de MN en un vector de expresión apropiado como se ejemplifica a continuación. En Zavada et al., WO 93/18152, supra, se describe la producción de una proteína de fusión GEX-3X-MN usando el clon de ADNc parcial (descrito anteriormente) en el vector pGEX-3X (Pharmacia). GEX-3X-MN no glicosilada (la proteína de fusión MN glutatión-S-transferasa) procede de células XL1-Blue. En la presente memoria, se describe la producción recombinante de tanto la proteína MN glicosilada expresada desde células de insecto como la proteína MN no glicosilada expresada desde E. coli usando el plásmido de expresión pEt-22b [Novagen Inc.; Madison, WI (EE.UU.)].

Sistemas de expresión de baculovirus. Se han desarrollado vectores de expresión de baculovirus recombinantes para la infección en varios tipos de células de insecto. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para, entre otros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mor, Drosphila melanogaster, Heliothis zea, Spodotera frugiperda y Trichoplusia ni [n.º de publicación vía PCT WO 89/04669.9; Wright, Nature, 321: 718 (1986); Fraser et al., In Vitro Cell Dev. Biol, 25: 225 (1989). Los procedimientos para introducir ADN exógeno en huéspedes de insecto son ampliamente conocidos en la técnica. Los procedimientos de transfección de ADN y de infección vírica habitualmente varían con el género del insecto que se vaya a transformar. Véase, por ejemplo, Autographa [Carstens et al., Virology, 101: 311 (1980)]; Spodoptera [Kang, "Baculovirus vectors for Expression of Foreign Genes", en: Advances in Virus Research. 35 (1988)]; y Heliothis (virescens) [PCT Pub. No. WO 88/02030].

Se puede emplear útilmente una amplia variedad de otras combinaciones de vectores de clonación en huéspedes en la clonación del ADN de MN aislado según lo descrito en la presente memoria. Los vehículos de clonación útiles pueden incluir, por ejemplo, secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, tales como diversos plásmidos bacterianos conocidos, tales como pBR322, otros plásmidos de E. coli y sus derivados, y plásmidos con un mayor espectro de huéspedes, tales como RP4, ADN de fago, tal como los numerosos derivados del fago Lambda, p. ej., NB989 y vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, tales como plásmidos que hayan sido modificados para emplear secuencias de control de la expresión de ADN de fago.

Los huéspedes útiles pueden ser eucariotas o procariotas, e incluyen huéspedes bacterianos, tales como E. coli y otras cepas bacterianas, levaduras y otros hongos, huéspedes animales o vegetales, tales como células animales o vegetales en cultivo, células de insecto y otros huéspedes. Por supuesto, no todos los huéspedes pueden ser igualmente eficientes. Los expertos en la técnica pueden realizar la selección concreta de la combinación de huésped-vehículo de clonación tras haber considerado debidamente los principios expuestos en la presente memoria sin alejarse del ámbito de esta invención.

El sitio concreto seleccionado para la inserción del fragmento de ADN seleccionado en el vehículo de clonación para formar una molécula de ADN recombinante está determinado por una variedad de factores. Estos incluyen el tamaño y la estructura de la proteína o del polipéptido que se vaya a expresar, la susceptibilidad de la proteína o del polipéptido deseado a la degradación endo-enzimática realizada por los componentes de las células huésped y la contaminación producida por sus proteínas, las características de la expresión, tales como la ubicación de los codones de inicio y de terminación, y otros factores reconocidos por aquéllos expertos en la técnica.

La molécula de ácido nucleico recombinante que contiene el gen MN, un fragmento del mismo o ADNc del mismo se puede emplear para transformar un huésped con el fin de permitir que el huésped (transformante) exprese el gen estructural o el fragmento del mismo y produzca la proteína o el polipéptido para el que codifica el ADN híbrido. La molécula de ácido nucleico recombinante también se puede emplear para transformar un huésped para permitir a ese huésped en replicación que produzca más moléculas de ácido nucleico recombinantes como fuente del ácido nucleico de MN y de fragmentos del mismo. La selección de un huésped apropiado para cualquiera de esos usos está controlada por un número de factores reconocidos en la técnica. Éstos incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector elegido, la toxicidad de los co-productos, la facilidad de recuperación de la proteína o del polipéptido deseado, las características de la expresión, la bioseguridad y los costes.

Cuando la célula huésped es una célula procariota, tal como E. coli, las células competentes que son capaces de absorber el ADN se preparan a partir de células cosechadas tras la fase de crecimiento exponencial y, posteriormente, tratadas mediante el procedimiento de CaCl_{2} mediante procedimientos ampliamente conocidos. También se puede realizar la transformación tras formar un protoplasto de la célula huésped.

Cuando el huésped usado es un eucariota, se pueden usar procedimientos de transfección, tales como el uso de un precipitado de fosfato de calcio, la electroporación, procedimientos mecánicos convencionales, tales como microinyección, inserción de un plásmido encapsulado en fantasmas de glóbulos rojos o en liposomas, el tratamiento de células con agentes tales como la lisofosfatidil-colina o el uso de vectores víricos, o similares.

El nivel de producción de una proteína o un polipéptido está determinado por tres factores principales: (1) el número de copias del gen o de la secuencia de ADN que lo codifica en la célula; (2) la eficacia con la que esas copias de gen y de secuencia son transcritas y traducidas; y (3) la estabilidad del ARNm. Las eficacias de la transcripción y de la traducción (que juntas comprenden la expresión) depende a su vez de las secuencias de nucleótidos, normalmente situadas delante de la secuencia codificante deseada. Esas secuencias de nucleótidos o las secuencias de control de la expresión definen, entro otras cosas, la ubicación en la que una ARN polimerasa interactúa para iniciar la transcripción (la secuencia promotora) y en la que los ribosomas se unen e interactúan con el ARNm (el producto de transcripción) para iniciar la traducción. No la totalidad de tales secuencias de control de la expresión funciona con una eficacia similar. Por tanto, resulta ventajoso separar las secuencias codificantes específicas de la proteína deseada de sus secuencias de nucleótidos adyacentes y, en cambio, fusionarlas con secuencias de control de la expresión conocidas para favorecer niveles más elevados de expresión. Habiéndose logrado esto, se puede insertar el fragmento de ADN recién diseñado genéticamente en un plásmido multicopia o en un derivado de bacteriófago para aumentar el número de copias del gen o de la secuencia en la célula y así aumentar aún más el rendimiento de la proteína expresada.

Se pueden emplear varias secuencias de control de la expresión. Éstas incluyen las secuencias de unión e interacción con el operador, el promotor y el ribosoma (incluyendo secuencias tales como las secuencias de Shine-Dalgarno) del operón lactosa de E. coli ("el sistema lac"), las secuencias correspondientes del sistema triptófano sintetasa de E. coli ("el sistema trp"), una fusión del promotor trp y lac ("el sistema tac"), las regiones del operador y del promotor principal del fago Lambda (O_{L}P_{L} y O_{R}P_{R}) y la región control de la cubierta proteínica del fago fd. Los fragmentos de ADN que contienen estas secuencias se escinden mediante escisión con enzimas de restricción del ADN aislado de fagos transductores que portan los operones lac o trp, o del ADN del fago Lambda o fd. Entonces se manipulan esos fragmentos para obtener una población limitada de moléculas tal que las secuencias controladoras esenciales se puedan unir muy estrechamente con, o en yuxtaposición con, el codón de iniciación de la secuencia codificante.

Luego se inserta el producto de fusión en un vehículo de clonación para la transformación o la transfección de los huéspedes apropiados y se mide el nivel de producción de antígeno. Así se pueden seleccionar las células que produzcan la expresión más eficaz. Alternativamente, se pueden emplear vehículos de clonación que porten el sistema de control lac, trp o PL de Lambda unido con un codón de iniciación y fusionarlos con un fragmento que contenga una secuencia que codifique una proteína o un polipéptido MN, tal que el gen o la secuencia sea traducido correctamente desde el codón de iniciación del vehículo de clonación.

La expresión "molécula de ácido nucleico recombinante" se define en la presente memoria como una secuencia de nucleótidos híbrida que comprende al menos dos secuencias de nucleótidos, no encontrándose la primera secuencia normalmente junto a la segunda en la naturaleza.

La expresión "secuencia de control de la expresión" se define en la presente memoria como una secuencia de nucleótidos que controla y regula la expresión de genes estructurales cuando está ligada operativamente con esos genes.

Los siguientes ejemplos son representativos de las proteínas MN diseñadas genéticamente de esta invención. Las descripciones son ejemplares y no pretenden limitar la invención de ningún modo.

Expresión de la proteína MN 20-19

Una proteína MN producida recombinantemente representativa de esta invención es la proteína MN 20-19 que, cuando se produce en células Sf9 infectadas con baculovirus [células de Spodoptera frugiperda; Clontech; Palo Alto, CA (EE.UU.)] está glicosilada. La proteína MN 20-19 carece del péptido señal putativo (AA 1-37) de SEC. ID. N.º 6 (Figura 1), tiene una metionina (Met) en el terminal N para la expresión y Leu-Glu-His-His-His-His-His-His [SEC. ID. N.º 22] añadido al terminal C para la purificación.

Para insertar la parte de la secuencia codificante de MN para la proteína de fusión GEX-3X-MN en sistemas de expresión alternativos, se diseñó un conjunto de cebadores para PCR. Los cebadores se construyeron para proporcionar sitios de restricción en cada extremo de la secuencia codificante, así como los codones de inicio y de terminación en marco. A continuación, se muestran las secuencias de los cebadores, indicándose los sitios de escisión de las enzimas de restricción y los puntos de referencia de la expresión.

Cebador n.º 20: terminal N,

5

Cebador n.º 19: terminal C

500

Los cebadores de SEC. ID. N.º 17 y 18 se usaron para amplificar la secuencia codificante de MN presente en el vector GEX-3X-MN usando técnicas de PCR estándar. Se sometió el producto PCR resultante (denominado MN 20-19) a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,5%/1 x TBE; se escindió la banda de 1,3 kb; y se recuperó el ADN usando el equipo Gene Clean II según las instrucciones del fabricante [Bio101; La Jolla, CA (EE.UU.)].

Se escindieron MN 20-19 y el plásmido pET-22b con las enzimas de restricción NdeI y XhoI, se extrajeron en fenol-cloroformo y se recuperaron las bandas apropiadas mediante electroforesis sobre gel de agarosa como se explica anteriormente. Los fragmentos aislados se co-precipitaron en etanol en una proporción de vector:inserto de 1:4. Tras la resuspensión, se ligaron los fragmentos usando ADN ligasa de T4. El producto resultante se usó para transformar células competentes de E. coli Novablue [Novagen, Inc.]. Se rastrearon minipreparaciones de plásmido [Magic Minipreps; Promega] de las colonias resistentes a la ampicilina resultantes en busca de la presencia del inserto correcto mediante mapeado de restricción. La inserción del fragmento génico en el plásmido pET-22b usando los sitios NdeI y XhoI añadió una cola de 6-histidina a la proteína que se podría usar para el aislamiento por afinidad.

Para preparar MN 20-19 para su inserción en el sistema de expresión de baculovirus, se escindió el fragmento de gen MN 20-19 de pET-22b usando las endonucleasas de restricción Xbal y Pvul. El vector lanzadera de baculovirus pBacPAK8 [Clontech] se escindió con Xbal y Pacl. Los fragmentos deseados (1,3 kb para MN 20-19 y 5,5 kb para pBacPAK8) se aislaron mediante electroforesis sobre gel de agarosa, se recuperaron usando Gene Clean II y se co-precipitaron en una proporción de inserto:vector de 2,4:1.

Tras la unión con ADN ligasa de T4, el ADN se usó para transformar las células de E. coli NM522 competentes (Stratagene). Se rastrearon minipreparaciones de plásmido de las colonias resistentes a la ampicilina resultantes en cuanto a la presencia del inserto correcto mediante mapeado de restricción. Se usaron el ADN plasmídico de una colonia apropiada y el ADN de baculovirus BacPAK6 linealizado [Clontech] para transformar células Sf9 mediante técnicas estándar. La recombinación produjo virus BacPAK que portaban la secuencia de MN 20-19. Se emplacaron esos virus sobre células Sf9 y se cubrieron con agar.

Se recogieron placas y se emplacaron sobre células Sf9. Se recogieron los medios acondicionados y las células. Se apartó una pequeña alícuota de los medios acondicionados para su análisis. Las células se extrajeron con PBS con Triton X100 al 1%.

Se realizó una transferencia puntual de los medios acondicionados y los extractos celulares sobre papel de nitrocelulosa. La transferencia se bloqueó con leche en polvo desnatada al 5% en PBS. Para detectar la proteína MN 20-19 en las transferencias puntuales, se usaron Acm M75. Para detectar el Acm M75 unido, se usó HRP de conejo anti-Ig de ratón. Las transferencias se desarrollaron con TMB/H_{2}O_{2} con un potenciador de membrana [KPL; Gaithersburg, MD (EE.UU.)]. Para la expansión, se seleccionaron dos clones productores de la reacción más potente en las transferencias puntuales. Uno se usó para producir la proteína MN 20-19 en células High Five [Invitrogen Corp., San Diego, CA (EE.UU.); STI-TN-SBI-4; derivado de homogeneizado de óvulos de Trichoplusia ni]. La proteína MN 20-19 se purificó de los medios acondicionados de las células High Five infectadas con el virus.

La proteína MN 20-19 se purificó de los medios acondicionados mediante cromatografía por inmunoafinidad. Se acoplaron 6,5 mg de Acm M75 a 1 g de Toyopearl^{TM} activado con Tresilo [Tosoh, Japón (#14471)]. Se trataron aproximadamente 150 ml de los medios acondicionados a través de la columna M75-Toyopearl. Se lavó la columna con
PBS y se eluyó la proteína MN 20- 19 con MgCl 1,5M. Luego se sometió a diálisis la proteína eluida frente a Pubs.

Proteínas de fusión con parte C-terminal que incluye la región transmembrana reemplazada por Fc o PA

Se construyeron proteínas de fusión MN en las que la parte C-terminal que incluye la región transmembrana está reemplazada por el fragmento Fc de la IgG humana o por proteína A. Tales proteínas de fusión son útiles para identificar proteína(s) de unión a MN. En tales quimeras de MN, toda la parte N-terminal de MN es accesible a la interacción con proteínas heterólogas, y la etiqueta C-terminal sirve para la fácil detección y purificación de complejos de proteínas.

Proteína de fusión MN-PA (proteína A)

En una primera etapa, se eliminó el extremo 3' del ADNc de MN que codificaba la región transmembrana de la proteína MN. Se escindió el plásmido pFLMN (p. ej., pBluescript con ADNc de MN de longitud completa) mediante EcoRI y se redondearon los extremos mediante nucleasa S1. La posterior escisión mediante SacI dio como resultado la eliminación del fragmento EcoRI-SacI. Entonces se reemplazó el fragmento eliminado por una secuencia codificante de la proteína A que derivaba del plásmido pEZZ (adquirido en Pharmacia) que había sido escindido con RsaI y SacI. Se subclonó el constructo de MN-PA obtenido en un vector de expresión eucariota pSG5C (descrito en el ejemplo 3), quedando entonces listo para los experimentos de transfección.

Proteína de fusión MN-Fc

La clonación de la proteína de fusión MN-Fc fue bastante complicada debido al uso de un clon genómico que contenía el fragmento Fc de la IgG humana que tenía una estructura compleja, pues contenía un potenciador, un promotor, exones e intrones. Además, no estaba disponible la secuencia completa del clon, por lo que era necesario garantizar el correcto corte y empalme en fase y la fusión de MN con el fragmento Fc mediante la adición de un sitio donante de empalme sintético (SSDS) diseñado según las secuencias de empalme del gen MN.

El procedimiento de construcción fue el siguiente:

1.: Se escindió el plásmido pMH4 (p. ej., pSV2gpt que contenía un clon genómico de la región Fc de la IgG humana) con BamHI para conseguir un fragmento que codificara Fc de 13 kb. [En pSV2gpt, el gen de la xantina-guanina-fosforibosil-transferasa (gbt) de E. coli se expresa usando el promotor temprano de SV40 (P_{E}) ubicado en el origen de SV40, el intrón T pequeño de SV40 y el sitio de poliadenilación de SV40].

2.: Al mismo tiempo, se escindió el plásmido pFLMN (con ADNc de MN de longitud completa) con SalI-EcoRI. Se purificó y se ligó el fragmento liberado con un adaptador sintético EcoRI-BglII que contenía un sitio donante de empalme sintético (SSDS).

3.: Simultáneamente, se escindió el plásmido pBKCMV con SalI-BamHZ: Entonces se aprovechó el hecho de que los extremos cohesivos de BamHI (del fragmento codificante de Fc) son compatibles con los extremos BglII de la SSDS y se ligó Fc a MN. Entonces se insertó el producto de la unión de MN-Fc en PBKCMV mediante la clonación direccional a través de los sitios SalI y BamHI.

La verificación de la correcta orientación y la fusión en fase de los clones quiméricos de MN-Fc obtenidos fue problemática, pues se desconocía la secuencia de Fc. De este modo, se seleccionan los constructos funcionales en base a los resultados de los análisis de expresión en eucariotas transitorios.

Producción sintética y biológica de proteínas y polipéptidos MN

Las proteínas y los polipéptidos MN de esta invención se pueden preparar no sólo mediante procedimientos recombinantes, sino también mediante procedimientos sintéticos y otros procedimientos biológicos. La formación sintética del polipéptido o de la proteína requiere sintetizar químicamente la cadena deseada de aminoácidos mediante procedimientos conocidos en la técnica. El ejemplo de otros procedimientos biológicos para preparar la proteína o el polipéptido deseado es someter a proteolisis selectiva una proteína o un polipéptido MN más largo que contenga la secuencia de aminoácidos deseada; por ejemplo, es posible la proteína o el polipéptido más largo con reactivos químicos o con enzimas.

La síntesis química de un péptido es convencional en la técnica y se puede realizar, por ejemplo, mediante la técnica de síntesis en fase sólida de Merrifield [Merrifield, J, Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963); Kent et al., "Synthetic Peptides in Biology and Medicine", 29f.f. eds. Alitalo et al., (Elsevier Science Publishers 1985); y Haug, J. D., "Peptide Synthesis and Protecting Group Strategy", American Biotechnology Laboratory. 5(1): 40-47 (En./Feb. 1987)].

Las técnicas de síntesis química de péptidos incluyen el uso de sintetizadores automáticos de péptidos que emplean aminoácidos protegidos comercialmente disponibles, por ejemplo, Biosearch [San Rafael, CA (EE.UU.)] Modelos 9500 y 9600; Applied Biosystems, Inc. [Foster City, CA (EE.UU.)] Modelo 430; Milligen [una división de Millipore Corp.; Bedford, MA (EE.UU.)] Modelo 9050; y Du Pont's RAMP (Rapid Automated Multiple Peptide Synthesis) [Du Pont Compass, Wilmington, DE (EE.UU.)].

Regulación de la expresión de MN y del promotor MN

MN parece ser una nueva proteína reguladora que está implicada directamente en el control de la proliferación celular y en la transformación celular. En las células HeLa, la expresión de MN se regula positivamente por la densidad celular. Su nivel es aumentado por la infección continua con LCMV. En los híbridos celulares entre HeLa y fibroblastos normales, la expresión de MN está relacionada con la tumorigenicidad. El hecho de que MN no esté presente en híbridos celulares no tumorigénicos (CGL1), pero que se exprese en secretor tumorigénico que carece del cromosoma 11, indica que MN es regulado negativamente por un supresor putativo en el cromosoma 11.

Se encontraron pruebas que apoyaban el papel regulador de la proteína MN en la generación de transfectantes estables de células NIH 3T3 que expresan constitutivamente la proteína MN según lo descrito en el ejemplo 3. Como consecuencia de la expresión de MN, las células NIH 3T3 adquirieron características asociadas con un fenotipo transformado: morfología modificada, mayor densidad de saturación, ventaja proliferativa en medios con suero reducido, mayor síntesis de ADN y capacidad para un crecimiento independiente del anclaje. Además, como se muestra en el ejemplo 4, los análisis de citometría de flujo de poblaciones celulares asíncronas indicaron que la expresión de proteína MN conduce a una progresión acelerada de células en la fase G1, la reducción del tamaño celular y la pérdida de capacidad para detener el crecimiento en condiciones inapropiadas. Además, el ejemplo 4 muestra que las células que expresan MN presentan una menor sensibilidad al fármaco mitomicina C que daña el ADN.

También se transfectaron células humanas no tumorigénicas, células CGL1, con ADNc de MN de longitud completa. Se usó el mismo constructo pSG5C-MN en combinación con el plásmido pSV2neo para transfectar las células NIH 3T3 (ejemplo 3). El protocolo también fue el mismo a excepción de que la concentración de G418 se aumentó hasta 1.000 \mug/ml.

De 15 clones positivos en MN (analizados mediante SP-RI y transferencia Western), se seleccionaron 3 para su posterior análisis. Se añadieron como controles dos clones negativos en MN aislados de células UGL1 transfectadas con plásmido vacío. El análisis inicial indica que la morfología y los hábitos de crecimiento de las células CGL1 transfectadas con MN no cambian de manera espectacular, pero que su velocidad de proliferación y su eficiencia de emplacamiento son aumentadas.

ADNc y promotor MN. Cuando se unió la región promotora del clon genómico de MN, aislado según lo descrito anteriormente, con ADNc de MN y se transfectó en híbridos celulares CGL1, la expresión de la proteína MN se hizo inmediatamente detectable tras la selección. Sin embargo, luego esto cesó gradualmente, indicando así una acción de un regulador de la retroalimentación. El elemento regulador putativo parecía estar actuando mediante el promotor MN, porque cuando se usó el ADNc de longitud completa (que no contenía el promotor) para la transfección, no se observó un efecto similar.

Se usó un constructo de ADNc de MN/promotor MN "antisentido" para transfectar las células CGL3. El efecto fue el contrario al de las células CGL1 transfectadas con el constructo "sentido". Mientras que las células CGL1 transfectadas formaron colonias varias veces mayores que el CGL1 control, las células CGL3 transfectadas formaron colonias mucho menores que las células CGL3 control.

Para esos experimentos, la parte de la región promotora que fue ligada al ADNc de MN por un sitio de BamHI fue derivada de un fragmento NcoI-BamHI del clon genómico de MN [Bd3] y representa una región unos cuantos cientos de pb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción. Tras la unión, se insertó el ADN unido en un vector de expresión de pBK-CMV [Stratagene]. La orientación necesaria de la secuencia insertada se garantizó mediante la clonación direccional y fue posteriormente verificada mediante análisis de restricción. El procedimiento de transfección fue el mismo que se usó en la transfección de las células NIH 3T3 (ejemplo 3), pero no fue necesaria la co-
transfección con el plásmido pSV2neo, pues el marcador de selección neo ya estaba incluido en el vector pBK-CMV.

Tras dos semanas de selección en un medio que contenía G418, las diferencias remarcables entre los números y los tamaños de las colonias desarrolladas fueron evidentes, como se indica anteriormente. Inmediatamente después de la selección y de la clonación, se analizaron las células CGL1 y CGL3 transfectadas con MN mediante SP-RIA para la expresión y la inhibición de MN, respectivamente. Los clones CGL1 transfectados aislados fueron positivos en MN (aunque el nivel fue menor del obtenido con el ADNc de longitud completa), mientras que la proteína MN estaba casi ausente de los clones CGL3 transfectados. Sin embargo, en los pasos posteriores, la expresión de MN en células CGL1
transfectadas comenzó a cesar, y luego fue bloqueada, probando quizás un mecanismo de retroalimentación de control.

Como resultado de la proliferación mucho inferior de las células CCL3 transfectadas, resultó difícil expandir la mayoría de las células clonadas (según la SP-RIA, aquéllas con los niveles más bajos de MN), y se perdieron en el tránsito. Sin embargo, algunos clones superaron el problema y volvieron a expresar a MN. Es posible que una vez que esas células alcanzaran una cantidad superior, aumentara el nivel de ARNm de MN producido endógenamente frente a la cantidad de ARNm antisentido expresado ectópicamente.

Transformación y reversión

Como se ilustra en los ejemplos 3 y 4, las células de vertebrado transfectadas con ADNc de MN en vectores adecuados muestran una transformación morfológica sorprendente. Las células transformadas pueden ser muy pequeñas, estar empaquetadas densamente, crecer lentamente, con citoplasma basófilo y aparato de Golgi aumentado. Sin embargo, se ha descubierto que los clones transformados vuelven con el tiempo, por ejemplo, en 3-4 semanas, a una morfología casi normal, incluso aunque las células puedan estar produciendo proteína MN a niveles elevados. La proteína MN es biológicamente activa incluso en células de levadura; en función del nivel de su expresión, estimula o retarda su crecimiento e induce a cambios morfológicos.

Se insertó ADNc de MN de longitud completa en pGD, un vector derivado del MLV, que junto con el MLV competente estándar (Virus de la Leucemia Murina), forma un complejo transmisible infeccioso [pGD-MN + MLV]. Ese complejo también transforma células de vertebrado, tales como las células NIH 3T3 y los fibroblastos de embrión de ratón Balb/c, que también vuelven a tener una morfología casi normal. Tales revertidores vuelven a contener proteína MN y producir el complejo de virus artificial [pGD-MN + MLV, que conserva su capacidad de transformación. De este modo, la vuelta a la normalidad de las células transformadas con MN no se debe aparentemente a una pérdida, un silenciamiento o una mutación del ADNc de MN, sino que puede ser el resultado de la activación de uno o varios genes supresores.

Sondas de ácido nucleico y equipos de análisis

Las sondas de ácido nucleico de esta invención son aquéllas que comprenden secuencias que son complementarias o sustancialmente complementarias a la secuencia de ADNc de MN mostrada en la figura 1 o a otras secuencias del gen MN, la secuencia genómica completa de la figura 3a-d [SEC. ID. N.º 5] y la secuencia promotora putativa [SEC. ID. N.º 27 de la figura 6]. La expresión "sustancialmente complementario/a" se define en la presente memoria con el significado ampliamente extendido en la técnica y, por tanto, usado en el contexto de las condiciones de hibridación estándar. Se puede ajustar el carácter restrictivo de las condiciones de hibridación para controlar la precisión de la complementariedad. Por ejemplo, dos ácidos nucleicos son sustancialmente complementarios entre sí si se hibridan entre sí en condiciones de hibridación restrictivas.

En la presente memoria, se considera que las condiciones de hibridación restrictivas configuran las condiciones de hibridación estándar entendidas en la técnica como restrictivas. Por ejemplo, se entiende en general que las condiciones restrictivas engloban condiciones salinas relativamente bajas y/o de temperatura elevada, tales como las proporcionadas por NaCl 0,02M a 0,15M a temperaturas de 50ºC a 70ºC. Se puede aumentar el carácter restrictivo de las condiciones menos restrictivas, tales como sal 0,15M a 0,9M a temperaturas que varían de 20ºC a 55ºC, añadiendo cantidades
crecientes de formamida, que sirve para desestabilizar los dúplex híbridos, como lo hace el aumento de temperatura.

En Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", páginas 1.91 y 9.47-9.51 (Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 1989); Maniatis et al., "Molecular cloning: A Laboratory Manual", páginas 387-389 (Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY; 1982); Tsuchiya et al., "Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology", 71(6): 721-725 (junio 1991), se describen condiciones de hibridación restrictivas ejemplares.

Las sondas de ácido nucleico preferidas de esta invención son fragmentos de las secuencias de ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas o polipéptidos MN según esta invención. Preferiblemente, esas sondas están compuestas de al menos veintinueve nucleótidos, más preferiblemente, nucleótidos.

No es necesario que las sondas de ácido nucleico de esta invención se hibriden con una región codificante de MN. Por ejemplo, las sondas de ácido nucleico de esta invención se pueden hibridar parcial o completamente con una región no codificante de la secuencia genómica mostrada en la figura 3a-d [SEC. ID. N.º 5]. Se puede usar tecnología convencional para determinar si los fragmentos de SEC. ID. N.º 5 o los ácidos nucleicos relacionados son útiles para identifi-
car las secuencias de ácidos nucleicos de MN. [Véase, por ejemplo, Benton y Davis, supra y Frusce et al., supra].

Arriba se indican las zonas de homología de la secuencia de nt de MN con otras secuencias de nt que no son de MN. En general, las secuencias de nucleótidos que no están en las regiones de tipo Alu o LTR, preferiblemente, de 29 bases o más, o incluso más preferiblemente, de 50 bases o más, se pueden analizar y rastrear rutinariamente, y encontrar que se hibridan en condiciones restrictivas sólo con secuencias de nucleótidos de MN. Además, no todas las homologías de las secuencias genómicas de MN de tipo Alu están tan cerca de las repeticiones Alu como para producir una señal de hibridación en condiciones de hibridación restrictivas. A continuación, se indica el porcentaje de homología entre las regiones de MN de tipo Alu y una secuencia Alu-J estándar:

\vskip1.000000\baselineskip

Región de homología de la secuencia genómica de MN

6

Las sondas de ácido nucleico de esta invención se pueden usar para detectar ADN y/o ARN de MN y, por tanto, se pueden usar para analizar la presencia o la ausencia de genes MN y la(s) amplificación(es), mutación(es) o reorganizaciones genéticas de los genes MN en las células de un paciente. Por ejemplo, la sobre-expresión de un gen MN se puede detectar mediante transferencia Northern y ensayos de protección frente a la RNasa usando sondas de esta invención. Las alteraciones génicas, como las amplificaciones, translocaciones, inversiones y eliminaciones, entre otras, se pueden detectar usando las sondas de esta invención para la hibridación in situ con cromosomas de las células de un paciente, bien en propagaciones metafase o en núcleos interfase. También se podría usar la transferencia Southern con las sondas de esta invención para detectar las amplificaciones o las eliminaciones de los genes MN. Los análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RALPH) usando dichas sondas es un procedimiento preferido para detectar las alteraciones, mutaciones y eliminaciones de los genes. También se pueden usar dichas sondas para identificar las proteínas y/o los polipéptidos MN, así como los homólogos o casi homólogos de los mismos mediante su hibridación con diversos ARNm transcritos desde genes MN en diferentes tejidos.

Por tanto, las sondas de esta invención pueden ser útiles con fines de diagnóstico/pronóstico. Dichas sondas se pueden realizar en equipos de análisis, preferiblemente, con los medios apropiados para garantizar la visualización de dichas sondas cuando estén hibridadas con un gen MN o una diana de ARNm de MN apropiado. Tales muestras incluyen muestras de tejidos, incluyendo frotis, fluidos corporales, y extractos tisulares y celulares.

Análisis PCR

Para detectar reorganizaciones genéticas relativamente grandes, se pueden usar ensayos de hibridación. Para detectar reorganizaciones genéticas relativamente pequeñas como, por ejemplo, pequeñas eliminaciones o amplificaciones, o mutaciones puntuales, se usaría preferiblemente una PCR. [Patentes estadounidenses nº. 4.800.159; 4.683.195; 4.683.202 y capítulo 14 de Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", supra].

Un análisis ejemplar usaría el ADN celular de células normales y cancerosas, ADN que sería aislado y amplificado empleando cebadores PCR apropiados. Los productos de la PCR se compararían, preferiblemente inicialmente, sobre un gel de calibración para detectar los cambios de tamaño indicadores de ciertas reorganizaciones genéticas. Si no se advierten diferencias en los tamaños, se pueden hacer otras comparaciones, preferiblemente usando, por ejemplo, un análisis de polimorfismos de configuración monocatenaria por PCR (PCR-SSCP) o un análisis electroforético sobre gel en gradiente desnaturalizante. (Véase, por ejemplo, Hayashi, K., "PCR-SSCP: A Simple and Sensitive Method for Detection of Mutations in the Genomic DNA", en PCR Methods and Applications, 1: 34-38 (1991); y Meyers et al., "Detection and Localization of Single Base Changes by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis", Methods in Enzymology, 155: 501 (1987)].

Análisis

Los análisis según esta invención fueron proporcionados para detectar y/o cuantificar el antígeno MN o los anticuerpos específicos de MN en muestras de vertebrados, preferiblemente, muestras de mamíferos, más preferiblemente, muestras de seres humanos. Tales muestras incluyen muestras de tejidos, fluidos corporales, extractos tisulares y extractos celulares. El antígeno MN se puede detectar mediante inmunoanálisis, tinción inmunohistoquímica, microscopía inmunoelectrónica y de barrido, usando partículas de oro inmunocitoquímicas entre otras técnicas.

Las muestras tisulares preferidas para su análisis mediante tinción inmunohistoquímica incluyen los frotis celulares, las secciones histológicas de tejidos u órganos de biopsia y las preparaciones estampadas entre otras muestras de tejidos. Tales muestras de tejidos se pueden mantener de forma muy diversa, por ejemplo, pueden ser recién preparadas, congeladas o fijadas en formalina, alcohol o acetona, o fijadas de otro modo y/o embebidas en parafina y desparafinadas. Las muestras de tejido de biopsia pueden ser, por ejemplo, aquellas muestras extirpadas mediante aspiración, mordisco, cepillado, cono, vellosidad del corion, endoscopia, extirpación, incisión, aguja, perforación percutánea y biopsias superficiales, entre otras técnicas de biopsia.

Las muestras de tejido cervical preferidas incluyen frotis cervicales, muestras de conificación, secciones histológicas de muestras de histerectomía u otras muestras de tejido cervical sometido a biopsia. Los procedimientos preferidos para obtener frotis cervicales incluyen técnicas habituales de limpieza, raspado o citoescobilla, entre otros procedimientos. Las técnicas más preferidas son la citoescobilla y la limpieza. Preferiblemente, los frotis celulares se preparan sobre placas de microscopio, se fijan, por ejemplo con EtOH al 55% o un pulverizado basado en alcohol fijador y se secan al aire.

Los frotis cervicales teñidos con Papanicolaou (frotis de Pap) se pueden rastrear mediante los procedimientos de esta invención, por ejemplo, para estudios retrospectivos. Preferiblemente, los frotis de Pap serían decolorados y se volverían a teñir con anticuerpos marcados frente al antígeno MN. También se pueden usar para estudios retrospectivos muestras de larga conservación como, por ejemplo, frotis y biopsias cotejados y/o muestras tumorales. También se pueden realizar estudios prospectivos con muestras cotejadas de pacientes que tengan un riesgo mayor de lo normal de presentar una citopatología cervical anómala.

Las muestras preferidas en las que analizar el antígeno MN mediante, por ejemplo, transferencia Western o radioinmunoanálisis, son extractos tisulares y/o celulares. Sin embargo, es posible detectar el antígeno MN en fluidos corporales, que pueden incluir entre otros fluidos: sangre, suero, plasma, semen, exudado de mama, saliva, lágrimas, esputo, mucosidad, orina, linfa, citosoles, ascitos, efusiones pleurales, fluido amniótico, lavados de vejiga, lavados bronquioalveolares y fluido cerebroespinal. Es preferible que el antígeno MN sea concentrado a partir de un volumen mayor de fluido cuerpo antes de su análisis. Los fluidos corporales preferidos para su análisis dependerían del tipo de cáncer para el que se esté realizando el análisis, pero en general, los fluidos corporales preferidos serían el exudado de mama, las efusiones pleurales y los ascitos.

Los anticuerpos específicos de MN se pueden unir mediante proteínas/polipéptidos MN serológicamente activos en muestras de fluidos corporales tales como sangre, plasma, suero, linfa, mucosidad, lágrimas, orina, fluido espinal y saliva; sin embargo, tales anticuerpos se encuentran más habitualmente en sangre, plasma y suero, preferiblemente, en suero. La correlación de los resultados de los análisis para detectar y/o cuantificar el antígeno MN y los anticuerpos específicos de MN reactivos con el mismo proporciona un perfil preferido del estado patológico de un paciente.

Los análisis de esta invención son tanto de diagnóstico como/o de pronóstico, i.e., de diagnóstico/pronóstico. El término "de diagnóstico/pronóstico" se define en la presente memoria para que englobe los siguientes procedimientos bien individual o conjuntamente en función del contexto clínico: determinación de la presencia de enfermedad, determinación de la naturaleza de una enfermedad, distinción de una enfermedad con respecto a otra, pronóstico del resultado probable de un estado patológico, determinación de la perspectiva de recuperarse de una enfermedad según lo indicado por la naturaleza y los síntomas de un caso, control del estado patológico de un paciente, control de un paciente en cuanto a la recurrencia de la enfermedad y/o determinación del régimen terapéutico preferido para un paciente. Los procedimientos de diagnóstico/pronóstico de esta invención son útiles, por ejemplo, para rastrear poblaciones en cuanto a la presencia de enfermedad neoplástica o pre-neoplástica, determinar el riesgo de desarrollar una enfermedad neoplástica, diagnosticar la presencia de enfermedad neoplástica y/o pre-neoplástica, controlar el estado patológico de los pacientes con enfermedad neoplástica y/o determinar el pronóstico en el transcurso de la enfermedad neoplástica. Por ejemplo, parece ser que la intensidad de la inmunotinción con anticuerpos específicos de MN puede estar relacionada con la gravedad de la displasia presente en las muestras analizadas.

La presente invención es útil en el rastreo de la presencia de una amplia variedad de enfermedades neoplásticas según lo indicado anteriormente. La invención proporciona procedimientos y composiciones para evaluar la probabilidad de la presencia de células malignas o pre-malignas, por ejemplo, en un grupo de células recién extraídas de un huésped. Tal análisis se puede usar para detectar tumores, cuantificar su crecimiento y ayudar en el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad. También se pueden usar los análisis para detectar la presencia de metástasis de cáncer, así como para confirmar la ausencia o la retirada de todo el tejido tumoral tras la cirugía, quimioterapia y/o radioterapia frente al cáncer. Se puede usar además para controlar la quimioterapia frente al cáncer y la reaparición de un
tumor.

La presencia de antígeno o anticuerpos de MN se puede detectar y/o cuantificar usando un número de análisis de diagnóstico bien definidos. Los expertos en la técnica pueden adaptar cualquiera de los formatos de inmunoanálisis convencionales para detectar y/o cuantificar antígeno y/o anticuerpos de MN.

Por supuesto, hay muchos formatos disponibles para la detección de antígeno MN y de anticuerpos específicos de MN. Aquéllos pueden ser las transferencias Western, los ELISA, los RIA, EIA competitivo o análisis de anticuerpos de tipo sándwich dual, la tinción inmunohistoquímica, entre otros análisis, siendo todos comúnmente usados en la industria de diagnóstico. En tales inmunoanálisis, la interpretación de los resultados se basa en el supuesto de que el anticuerpo o la combinación de anticuerpos no reaccionará de forma cruzada con otras proteínas y fragmentos de proteínas presentes en la muestra que no estén relacionados con MN.

Representativo de un tipo de análisis ELISA para el antígeno MN es un formato en el que se reviste una placa de microvaloración con anticuerpos dirigidos frente a proteínas/polipéptidos MN o anticuerpos dirigidos frente a células enteras que expresan proteínas MN, y añadiendo a ésta una muestra del paciente, por ejemplo, un tejido o un extracto celular. Tras un período de incubación que permita la unión de cualquier antígeno con los anticuerpos, se lava la placa y se añade otro conjunto de anticuerpos frente a MN ligado a una enzima, se incuba para permitir que tenga lugar la reacción y luego se vuelve a lavar la placa. Tras ello, se añade sustrato enzimático a la placa de microvaloración y se incuba durante un período de tiempo para permitir que la enzima ejerza su acción en el sustrato, y se mide la adsorbancia de la preparación final. Un cambio grande en la absorbancia indica un resultado positivo.

También resulta evidente para cualquier experto en la técnica de los inmunoanálisis que las proteínas y/o los polipéptidos MN se pueden usar para detectar y/o cuantificar la presencia de antígeno MN en los fluidos corporales, tejidos y/o células de pacientes. En una de tales realizaciones, se usa un inmunoanálisis de competición, en el que la proteína/el polipéptido MN se marca y se añade un fluido corporal para que compita en la unión de la proteína/del polipéptido MN marcado con los anticuerpos específicos frente a la proteína/polipéptido MN.

En otra realización, se puede usar un análisis inmunométrico en el que se use un anticuerpo marcado dirigido frente a una proteína o un polipéptido MN. En tal análisis, la cantidad de anticuerpo marcado que forma un complejo con el anticuerpo unido al antígeno es directamente proporcional a la cantidad de antígeno MN en la muestra.

Un análisis representativo para detectar los anticuerpos específicos de MN es un análisis de competición en el que la proteína/el polipéptido MN es precipitado por los anticuerpos en una muestra, por ejemplo, en combinación con anticuerpos monoclonales que reconocen proteínas/polipéptidos MN. El experto en la técnica podría adaptar cualquiera de los formatos de inmunoanálisis convencionales para detectar y/o cuantificar los anticuerpos específicos de MN. La detección de la unión de dichos anticuerpos con dicha proteína/dicho polipéptido MN se podría hacer mediante muchos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, p. ej., en seres humanos con el uso de IgG anti-humana marcada.

Un procedimiento de inmunoanálisis ejemplar de esta invención para detectar y/o cuantificar el antígeno MN en una muestra de vertebrado comprende las etapas de:

a): incubar dicha muestra de vertebrado con uno o más conjuntos de anticuerpos (un anticuerpo o anticuerpos) que se una con el antígeno MN, estando un conjunto marcado o siendo detectable de otro modo;

b): examinar la muestra incubada en cuanto a la presencia de complejos inmunes que comprendan antígeno MN y dichos anticuerpos.

Otro procedimiento de inmunoanálisis ejemplar según esta invención en aquél en el que se usa un inmunoanálisis de competición para detectar y/o cuantificar el antígeno MN en una muestra de vertebrado y en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:

a): incubar una muestra de vertebrado con uno o más conjuntos de anticuerpos específicos de MN y una cierta cantidad de una proteína/un polipéptido MN marcado o detectable de otro modo, en el que dicha proteína/dicho polipéptido MN compite por la unión con dichos anticuerpos con el antígeno MN presente en la muestra;

b): examinar la muestra incubada para determinar la cantidad de proteína/polipéptido MN marcado/detectable unido a dichos anticuerpos; y

c): determinar a partir de los resultados del examen de la etapa b) si el antígeno MN está presente en dicha muestra y/o la cantidad de antígeno MN presente en dicha muestra.

Una vez preparados los anticuerpos (incluyendo los fragmentos de anticuerpos biológicamente activos) con una especificidad adecuada, hay una amplia variedad de procedimientos de análisis inmunológico disponible para la determinación de la formación de complejos de anticuerpo-antígeno específicos. Se han descrito numerosos análisis de unión competitiva y no competitiva de proteínas en la bibliografía científica y de patentes, y hay un gran número de tales análisis comercialmente disponibles. Los inmunoanálisis ejemplares que son adecuados para detectar un antígeno en suero incluyen aquéllos descritos en las patentes estadounidenses n.º 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074 y
4.098.876.

Los anticuerpos empleados en análisis pueden estar marcados o no marcados. Los anticuerpos sin marcar se pueden emplear en aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden emplear en una amplia variedad de análisis, empleando una amplia variedad de marcadores.

Los procedimientos de detección adecuados incluyen el uso de marcadores tales como radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromógenos, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, radicales libres, partículas, colorantes y similares. Tales reactivos marcados se pueden usar en una variedad de análisis conocidos, tales como radioinmunoanálisis, inmunoanálisis enzimáticos, p. ej., ELISA, inmunoanálisis fluorescentes y similares. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.º 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837 y 4.233.402.

Equipos de inmunoanálisis

Los análisis anteriormente explicados en líneas generales se pueden realizar en equipos de análisis para detectar y/o cuantificar el antígeno MN y/o los anticuerpos específicos de MN (incluyendo fragmentos de anticuerpos biológicamente activos). Los equipos para detectar y/o cuantificar el antígeno MN pueden comprender proteína(s)/polipépti-
dos(s) MN y/o anticuerpos específicos de MN, policlonales y/o monoclonales. Tales equipos de análisis de diagnóstico/
pronóstico pueden comprender uno o más conjuntos de anticuerpos, policlonales y/o monoclonales, para un formato de tipo sándwich, en el que los anticuerpos reconocen los epítopos sobre el antígeno MN y un conjunto está marcado apropiadamente o es detectable de otro modo.

Los equipos de análisis para un formato analítico en el que haya competición entre una proteína/un polipéptido MN marcado (o detectable de otro modo) y un antígeno MN en la muestra, para la unión con un anticuerpo, pueden comprender la combinación de la proteína/del polipéptido marcado y el anticuerpo en cantidades que proporcionan una sensibilidad y una exactitud óptimas.

Los equipos de análisis para los anticuerpos específicos de MN comprenden preferiblemente proteínas(s) y/o polipéptidos(s) MN marcados/detectables y pueden comprender otros componentes según sea necesario, tales como controles, tampones, diluyentes y detergentes. Tales equipos de análisis pueden tener otros formatos apropiados para los análisis convencionales.

Un equipo para su uso en un inmunoanálisis enzimático incluye comúnmente un reactivo marcado con una enzima y un sustrato para la enzima. La enzima se puede unir, por ejemplo, bien con un anticuerpo específico de MN de esta invención o con un anticuerpo frente a tal anticuerpo específico de MN.

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Preparación de anticuerpos específicos de MN

El término "anticuerpos" se define en la presente memoria como el que incluye no sólo anticuerpos enteros, sino también fragmentos biológicamente activos de anticuerpos, preferiblemente, fragmentos que contienen regiones de unión antigénica. Tales anticuerpos se pueden preparar mediante la metodología convencional y/o mediante ingeniería genética. Los fragmentos de anticuerpos se pueden diseñar genéticamente, preferiblemente, procedentes de las regiones variables de las cadenas ligeras y/o pesadas (V_{L} y V_{H}), incluyendo las regiones hipervariables, e incluso más preferiblemente, procedentes de tanto las regiones V_{H} como las V_{L}. Por ejemplo, el término "anticuerpos", como se usa en la presente memoria, comprende anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos biológicamente activos de los mismos, incluyendo entre otras posibilidades anticuerpos "univalentes" [Glennie et al., Nature. 295: 712 (1982)]; proteínas Fab que incluyen fragmentos Fab' y F(ab')_{2} bien agregados covalente o no covalentemente; cadenas ligeras o pesadas sólo, preferiblemente, regiones variables de cadena pesada y ligera (regiones V_{H} y V_{L}) y, más preferiblemente, incluyendo las regiones hipervariables [conocidas también como regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dichas regiones V_{H} y V_{L}]; proteínas Fc; anticuerpos "híbridos" capaces de unirse a más de un antígeno; quimeras de regiones constante-variable; inmunoglobulinas "compuestas" con cadenas pesadas y ligeras de diferentes orígenes; anticuerpos "modificados" con una mejor especificidad y otras características preparadas mediante técnicas recombinantes estándar y también técnicas de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos [Dalbadie-McFarland et al., PNAS (EE.UU.), 79: 6409 (1982)].

Puede ser preferible para usos terapéuticos y/o de generación de imágenes que los anticuerpos sean fragmentos de anticuerpos biológicamente activos, preferiblemente, fragmentos diseñados genéticamente, más preferiblemente, fragmentos diseñados genéticamente de las regiones V_{H} y/o V_{L}, e incluso más preferiblemente, que comprendan las regiones hipervariables de los mismos.

Hay técnicas convencionales para preparar los anticuerpos policlonales y monoclonales conocidas en la técnica del inmunoanálisis. Los inmunogenes para preparar anticuerpos específicos de MN incluyen proteínas y/o polipéptidos MN, preferiblemente purificados, y células de líneas tumorales infectadas con MX, por ejemplo, células HeLa infectadas con MX, entre otros inmunogenes.

Los anticuerpos frente a péptidos también se elaboran mediante procedimientos convencionales en la técnica según lo descrito en la publicación de patente europea n.º 44.710 (publicada el 27 de enero de 1982). En síntesis, tales anticuerpos frente a péptidos se preparan seleccionando un péptido de una secuencia de aminoácidos de MN como la de la figura 1, sintetizándolo químicamente, conjugándolo con una proteína inmunogénica apropiada e inyectándolo en un animal apropiado, habitualmente un conejo o un ratón; entonces se forman los anticuerpos bien policlonales o monoclonales, los últimos mediante un procedimiento de Kohler-Milstein, por ejemplo.

Además de la tecnología de hibridomas convencional, se pueden usar tecnologías más recientes para producir los anticuerpos según esta invención. Por ejemplo, el uso de la PCR para clonar y expresar genes V de anticuerpo, y la tecnología de despliegue en fagos para seleccionar genes de anticuerpos que codifiquen fragmentos con actividades de unión ha dado como resultado el aislamiento de fragmentos de anticuerpos de repertorios de genes V amplificados mediante PCR usando ratones o seres humanos inmunizados. [Marks et al., BioTechnology, 10: 779 (julio de 1992) para referencias; Chiang et al., BioTechniques, 7(4): 360 (1989); Ward et al., Nature, 341: 544 (12 de octubre de 1989); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991); Clackson et al., Nature. 352: (15 de agosto de 1991); y Mullinax et al., PNAS (EE.UU.), 87: 8095 (Oct. 1990)].

Se pueden encontrar descripciones de la preparación de anticuerpos, cuyo termino se define en la presente memoria incluyendo los fragmentos de anticuerpos biológicamente activos, mediante técnicas recombinantes en la patente estadounidense n.º 4.816.567 (concedida el 28 de marzo de 1989); la publicación de solicitud de patente europea número (EP) 338.745 (publicada el 25 de octubre de 1989); el documento EP 368.684 (publicado el 16 de junio de 1990); el documento EP 239.400 (publicado el 30 de septiembre de 1987); el documento WO 90/14424 (publicado el 29 de noviembre de 1990); el documento WO 90/14430 (publicado el 16 de mayo de 1990); Huse et al., Science, 246: 1275 (8 de diciembre de 1989); Marks et al., BioTechnology, 10: 779 (Julio de 1992); La Sastry et al., PNAS (EE.UU.), 86: 5728 (Agosto 1989); Chiang et al.; BioTechniques, 7(40): 360 (1989); Orlandi et al., PNAS (EE.UU.), 86: 3833 (Mayo 1989); Ward et al. Nature, 341: 544 (12 de octubre de 1989); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991); y Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res., 19(15): 4133 (1991).

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Acm representativos

Los anticuerpos monoclonales para su uso en los análisis de esta invención se pueden obtener mediante procedimientos ampliamente conocidos en la técnica, por ejemplo, Galfre y Milstein, "Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures" en Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques, 73: 1-46 [Langone y Vanatis (eds); Academic Press (1981)]; y en la referencia clásica, Milstein y Kohler, Nature, 256: 495-497 (1975)].

Aunque los hibridomas representativos de esta invención se forman mediante la fusión de líneas celulares murinas, también se pueden preparar, entre otras posibilidades, hibridoma humano/humano [Olsson et al., PNAS (EE.UU.), 77: 5429 (1980)] e hibridomas humano/murino [Schlom et al., PNAS (EE.UU.), 77: 6841 (1980); Shearman et al. J. Immunol, 146: 928-935 (1991); y Gorman et al., PNAS (EE.UU.), 88: 4181-4185 (1991)]. Tales anticuerpos monoclonales humanizados serían los anticuerpos monoclonales preferidos para usos terapéuticos y de generación de imágenes.

Los anticuerpos monoclonales específicos de esta invención se pueden preparar mediante la inmunización de mamíferos apropiados, preferiblemente, roedores, más preferiblemente, conejos o ratones, con un inmunogén apropiado como, por ejemplo, células HeLa infectadas con MaTu, proteínas de fusión MN o proteínas/polipéptidos MN unidos a una proteína transportador, si fuera necesario. Más adelante se describen procedimientos ejemplares para producir los anticuerpos de esta invención.

Los anticuerpos monoclonales útiles según esta invención para identificar proteínas/polipéptidos MN se pueden marcar de cualquier manera convencional como, por ejemplo, con enzimas, tales como, la peroxidasa de rábano picante (HRP), compuestos fluorescentes o con isótopos radiactivos, tales como ^{125}I, entre otros marcadores. Un marcador preferido según esta invención es el ^{125}I, y un procedimiento preferido de marcaje de los anticuerpos es mediante el uso de cloramina-T [Hunter, W. M., "Radioimmunoassay", en: Handbook of Experimental Immunology, pp. 14.1-14.40 (D. W. Weir ed.; Blackwell, Oxford/Londres/Edinburgo/Melbourne; 1978)].

Los Acm representativos de esta invención incluyen los Acm M75, MN9, MN12 y MN7 descritos a continuación. Los anticuerpos monoclonales de esta invención sirven para identificar las proteínas/los polipéptidos MN en diversos análisis de diagnóstico de laboratorio como, por ejemplo, en cultivos de células tumorales o en muestras clínicas.

Acm preparados frente a células HeLa

Acm M75. El anticuerpo monoclonal M75 (Acm M75) es producido por el hibridoma linfocítico de ratón VU-M75, que fue depositado inicialmente en la colección de hibridomas del Instituto de Virología, Academia de Ciencias Eslovaca (Bratislava, Checoslovaquia) y depositada con la denominación de la ATCC de HB 11128 el 17 de septiembre de 1992 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) en Rockville, MD (EE.UU.). La producción del hibridoma VU-M75 se describe en Zavada et al., WO 93/18152.

El Acm M75 reconoce tanto la proteína de fusión GEX-3X-MN no glicosilada como la proteína MN nativa expresada de una manera igualmente satisfactoria en células CGL3. Se observó mediante mapeado de epítopos que el Acm M75 es reactivo con el epítopo representado por la secuencia de aminoácidos del AA 62 al AA 67 [SEC. ID. N.º 10] de la proteína MN mostrada en la figura 1.

Acm preparados frente a la proteína de fusión GEX-3X-MN

También se prepararon anticuerpos monoclonales de esta invención frente a la proteína de fusión MN-glutationa-S-transferasa (GEX-3X-MN). Se inmunizaron ratones Balb/c intraperitonealmente según procedimientos estándar con la proteína de fusión GEX-3X-MN en adyuvante de Freund. Se fusionaron células de bazo de los ratones con células de mieloma SP/20 [Milstein y Kohler, supra].

Se rastrearon medios de cultivo tisular de los hibridomas frente a extractos de membrana de CGL3 y CGL1 en un ELISA empleando anticuerpo de conejo anti-ratón marcado con HRP. Se revistieron los extractos de membrana sobre placas de microvaloración. Se seleccionaron los anticuerpos que habían reaccionado con el extracto de membrana de CGL3. Los hibridomas seleccionados se clonaron dos veces mediante dilución limitante.

Los Acm preparados mediante el procedimiento que se acaba de describir fueron caracterizados mediante transferencias Western de la proteína de fusión GEX-3X-MN y con extractos de membrana de las células CGL1 y CGL3. Los representativos de los Acm preparados son los Acm MN9, MN12 y MN7.

Acm MN9. El anticuerpo monoclonal MN9 (Acm MN9) reacciona con el mismo epítopo que el Acm M75, representado por la secuencia del AA 62 al AA 67 [SEC. ID. N.º 10] de la proteína MN de la figura 1. Como el Acm M75, el Acm MN9 reconoce de manera igualmente satisfactoria tanto la proteína de fusión GEX-3X-MN como la proteína MN nativa.

Los Acm correspondientes al Acm MN9 se pueden preparar reproduciblemente mediante el rastreo de una serie de Acm preparados frente a una proteína/un polipéptido MN, tal como la proteína de fusión GEX-3X-MN, frente al péptido que representa al epítopo para los Acm M75 y MN9; es decir, la SEC. ID. N.º 10. Alternativamente, se podría usar el sistema Novatope [Novagen] o la competición con el Acm M75 depositado para seleccionar los Acm comparables con los Acm M75 y MN9.

Acm MN12. El anticuerpo monoclonal MN12 (Acm MN12) es producido por el hibridoma linfocítico de ratón MN 12.2.2, que fue depositado con la denominación ATCC HB 11647 el 9 de junio de 1994 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 (EE.UU.). Los anticuerpos correspondientes al Acm MN12 también se pueden preparar análogamente al procedimiento explicado en líneas generales anteriormente para el Acm MN9, mediante el rastreo de una serie de anticuerpos preparados frente a una proteína/un polipéptido MN, frente al péptido que representa el epítopo del Acm MN12. Ese péptido es AA 55-AA 60 de la figura 1 [SEC. ID. N.º 11]. También se podría usar el sistema Novatope para encontrar los anticuerpos específicos de dicho epítopo.

Acm MN7. El anticuerpo monoclonal MN7 (Acm MN7) se seleccionó de entre los Acm preparados frente a GEX-3X-MN no glicosilada según lo descrito anteriormente. Reconoce el epítopo de MN representado por la secuencia de aminoácidos de AA 127 a AA 147 [SEC. ID. N.º 12] de la proteína MN de la figura 1. Análogamente a los procedimientos descritos anteriormente para los Acm MN9 y MN12, es posible preparar los Acm correspondientes al Acm MN7 seleccionando los Acm preparados frente a una proteína/un polipéptido MN que sean reactivos con el péptido que tenga la SEC. ID. N.º 12, o mediante los procedimientos alternativos expuestos.

Mapeado de epítopos

El mapeado de epítopos se realizó mediante el sistema Novatope, un equipo que está comercialmente disponible en Novagen Inc. [Véase, para un ejemplo análogo, Li et al., Nature, 363: 85-88 (6 de mayo de 1993)]. En síntesis, se cortó el ADNc de MN en fragmentos cortos en solapamiento de aproximadamente 60 pares de bases. Se expresaron los fragmentos en E. coli, y se transfirieron las colonias de E. coli a papel de nitrocelulosa, se lisaron y se sondaron con el Acm de interés. Se secuenció el ADNc de MN de los clones reactivos con el Acm de interés, y se dedujeron los epítopos de los Acm a partir de los polipéptidos en solapamiento encontrados como reactivos con cada Acm.

Uso terapéutico de los anticuerpos específicos de MN

Los anticuerpos específicos de MN de esta invención, monoclonales y/o policlonales, preferiblemente, monoclonales, y según lo explicado en líneas generales anteriormente, se pueden usar terapéuticamente en el tratamiento de la enfermedad neoplástica y/o pre-neoplástica, bien solos o en combinación con fármacos quimioterapéuticos o agentes tóxicos, tales como la ricina A. Aún más preferidos para un uso terapéutico serían los fragmentos de anticuerpos biológicamente activos según lo descrito en la presente memoria. También, los anticuerpos específicos de MN preferidos para tales usos terapéuticos serían anticuerpos monoclonales humanizados.

Los anticuerpos específicos de MN se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz, preferiblemente, dispersada en un vehículo líquido no tóxico fisiológicamente aceptable.

Uso de los anticuerpos para la generación de imágenes

Además, los anticuerpos específicos de MN de esta invenció, cuando están ligados a un agente de generación de imágenes, tal como un radionúclido, se pueden usar para la generación de imágenes. Los fragmentos de anticuerpos biológicamente activos o los anticuerpos monoclonales humanizados pueden ser preferidos para su uso en la generación de imágenes.

Es posible identificar un tejido neoplástico de un paciente como, por ejemplo, zonas de células madre transformadas, de tumores o de ubicaciones de cualquier metástasis. Es posible inyectar los anticuerpos, marcados apropiadamente o ligados a un agente de generación de imágenes, en un vehículo fisiológicamente aceptable a un paciente, y detectarse la unión de los anticuerpos mediante un procedimiento apropiado con el marcador o el agente de generación de imágenes, por ejemplo, mediante gammagrafía.

Secuencias antisentido de ácido nucleico de MN

Los genes MN se consideran, en la presente memoria, oncogenes putativos, y las proteínas codificadas por los mismos se consideran oncoproteínas putativas. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido sustancialmente complementarias al ARNm transcrito desde los genes MN, representadas por los oligodesoxinucleótidos antisentido ODN1 y ODN2 [SEC. ID. N.º 3 y 4] se pueden usar para reducir o evitar la expresión de MN. [Zamecnick, P.C., "Introduction: Oligonucleotide Base Hybridization as a Modulator of Genetic Message Readout", pp. 1-6, Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, (Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY, EE.UU.; 1991); Wickstrom, E., "Antisense DNA Treatment of HL-60 Promyelocytic Leukemia Cells: Terminal Differentiation and Dependence on Target Sequence", pp. 7-24, id.; Leserman et al., "Targeting and Intracellular Delivery of Antisense oligonucleotides Interfering with Oncogene Expression", pp. 25-34, id.; Yokoyama, K., "Transcriptional Regulation of c-myc Proto-oncogene by Antisense RNA", pp. 35-52, id.; van den Berg et al., "Antisense fos Oligodeoxyribonucleotides Suppress the Generation of Chromosomal Aberrations", pp. 63-70, id.; Mercola, D., "Antisense fos and fun RNA", pp. 83-114, id.; Inouye, Gene, 72: 25-34 (1988); Miller y Ts'o, Ann. Reports Med. Chem, 23: 295-304 (1988); Stein y Cohen, Cancer Res, 48: 2659-2668 (1988); Stevenson y Inversen, J. Gen. Virol, 70: 2673-2682 (1989); Goodchild, "Inhibition of Gene Expression by Oligonucleotides", pp. 53-77, Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (Cohen, J. S., ed; CRC Press, Boca Raton, Florida, EE.UU.; 1989); Dervan et al., "Oligonucleotide Recognition of Double-helical DNA by Triple-helix Formation", pp. 197-210, id.; Neckers, L. M., "Antisense Oligodeoxynucleotides as a Tool for Studying Cell Regulation: Mechanisms of Uptake and Application to the Study of Oncogene Function", pp. 211-232, id.; Leitner et al., PNAS (EE.UU.), 87: 3430-3434 (1990); Bevilacqua et al., PNAS (EE.UU.), 85: 831-835 (1988); Loke et al. Curr. Top. Microbiol, Immunol, 141: 282-288 (1988); Sarin et al., PNAS (EE.UU.), 85: 7448-7451 (1988); Agrawal et al., "Antisense Oligonucleotides: A Possible Approach for Chemotherapy and AIDS", International Union of Biochemistry Conference on Nucleic Acid Therapeutics (13-17 de enero de 1991; Clearwater Beach, Florida, EE.UU.); Armstrong, L., Ber. Week, pp. 88-89 (5 de marzo de 1990); y Weintraub et al., Trends, 1: 22-25 (1985)]. Tales secuencias de ácidos nucleicos antisentido, preferiblemente, oligonucleótidos, mediante la hibridación con el ARNm de MN, particularmente, en las proximidades del sitio de unión al ribosoma y del punto de inicio de la traducción, inhiben la traducción del ARNm. De este modo, se puede considerar el uso de tales secuencias de ácidos nucleicos antisentido como una forma de terapia contra el cáncer.

Los oligonucleótidos antisentido preferidos según esta invención son ODN específicos del gen u oligonucleótidos complementarios al extremo 5' del ARNm de MN. Los particularmente preferidos son el 29-mero ODN1 y el 19-mero ODN2 [SEC. ID. N.º 3 y 4]. Esos ODN antisentido son representativos de muchas secuencias de ácidos nucleicos antisentido que pueden funcionar para inhibir la expresión del gen MN. Los expertos habituales en la técnica podrían determinar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido apropiadas, preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido, de las secuencias de ácido nucleico de las figuras 1 y 3a-d.

También, según lo descrito anteriormente, las células CGL3 transfectadas con un constructo de ADNc de MN/pro-
motor MN "antisentido" formaron colonias mucho menores que las células CGL3 control.

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Vacunas

Será fácil entender que las proteínas y los polipéptidos MN de esta invención se pueden incorporar en vacunas capaces de inducir una inmunidad protectora frente a la enfermedad neoplástica y un efecto que haga perder la actividad tumorigénica. En el ejemplo 2, se muestra la eficacia de una proteína de fusión MN representativa, la GEX-3X-MN, como una vacuna en un modelo de ratas.

Las proteínas y/o los polipéptidos MN se pueden sintetizar o preparar recombinantemente o biológicamente de otro modo, para que comprendan una o más secuencias de aminoácidos correspondientes a uno o más epítopos de las proteínas MN bien en forma monomérica o multimérica. Entonces, se pueden incorporar esas proteínas y/o esos polipéptidos en vacunas capaces de inducir una inmunidad protectora. Las técnicas para aumentar la antigenicidad de tales polipéptidos incluyen la incorporación en una estructura multimérica, la unión con una proteína transportadora muy inmunogénica como, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH) o el toxoide de la difteria, y la administración en combinación con adyuvantes o cualquier otro potenciador de la respuesta inmune.

Las proteínas/los polipéptidos MN preferidos para su uso en una vacuna según esta invención serían proteínas MN diseñadas genéticamente. Las proteínas MN recombinantes preferidas son las proteínas GEX-3X-MN, MN 20-19, MN-Fc y MN-PA.

Otras vacunas ejemplares incluyen MN de vaccinia (virus vaccinia vivo con ADNc de MN de longitud completa) y MN de baculovirus (ADNc de MN de longitud completa insertado en un vector de baculovirus, p. ej., en suspensión de células de insecto infectadas). Se pueden combinar diferentes vacunas y los períodos de vacunación pueden ser prolongados.

Un uso ejemplar preferido de tal vacuna de esta invención sería su administración a pacientes cuyo cáncer primario portador de MN haya sido extirpado quirúrgicamente. La vacuna puede inducir una inmunidad activa en los pacientes y prevenir la reincidencia o la metástasis.

Se entenderá además que los anticuerpos anti-idiotípicos frente a los anticuerpos dirigidos frente a las proteínas/los polipéptidos MN también son útiles como vacunas y que se pueden formular de manera similar.

También se puede obtener una secuencia de aminoácidos correspondiente a un epítopo de una proteína/un polipéptido MN bien en forma monomérica o multimérica mediante procedimientos sintéticos químicos o mediante la purificación de fuentes biológicas, incluyendo microorganismo modificado genéticamente o sus medios de cultivo. [See Lerner, "Synthetic Vaccines", Sci. Am. 248(2): 66-74 (1983)]. La proteína/el polipéptido se puede combinar en una secuencia de aminoácidos con otras proteínas/otros polipéptidos, incluyendo fragmentos de otras proteínas, como, por ejemplo, cuando se sintetiza como una proteína de fusión, o ligar con otros polipéptidos antigénicos o no antigénicos de origen sintético o biológico. En algunos casos, puede ser deseable fusionar una proteína o un polipéptido MN con una proteína o un polipéptido inmunogénico y/o antigénico, por ejemplo, para estimular la eficacia de una vacuna basada en MN.

Se entenderá que la expresión "correspondiente a un epítopo de una proteína/un polipéptido MN" incluye la posibilidad práctica de que, en algunos casos, las variaciones de las secuencias de aminoácidos de una proteína o de un polipéptido natural puedan ser antigénicas o conferir una inmunidad protectora frente a la enfermedad neoplástica y/o efectos anti-tumorigénicos. Las posibles variaciones de las secuencias incluyen, sin limitación, sustituciones, extensiones, eliminaciones, truncamientos e interpolaciones de aminoácidos, y combinaciones de las mismas. Tales variaciones pertenecen al ámbito contemplado de la invención, siempre y cuando la proteína o el polipéptido que las contengan sea immunogénico, y que los anticuerpos generados por tal polipéptido o proteína reaccionen de forma cruzada con las proteínas y los polipéptidos MN naturales hasta un grado suficiente como para proporcionar una inmunidad protectora y/o una actividad anti-tumorigénica cuando se administren como una vacuna.

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Tales composiciones de vacuna se combinarán con un medio fisiológicamente aceptable, incluyendo diluyentes y vehículos inmunológicamente aceptables, así como adyuvantes comúnmente empleados, tales como el adyuvante completo de Freund, saponina, alumbre y similares. La administración sería en cantidades inmunológicamente eficaces de las proteínas o los polipéptidos MN, preferiblemente, en cantidades que proporcionen dosis unitarias de 0,01 a 10,0 microgramos de proteína y/o polipéptido MN inmunológicamente activo por kilogramo de peso corporal del receptor. Las dosis protectoras totales pueden variar de 0,1 a aproximadamente 100 microgramos de antígeno. Las vías de administración, la dosis de antígeno, el número y la frecuencia de las inyecciones son todas cuestiones de optimización que pertenecen al ámbito del experto habitual en la técnica.

Los siguientes ejemplos son únicamente a efectos ilustrativos, y no pretenden limitar la invención de ningún modo.

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Ejemplo 1 Tinción inmunohistoquímica de muestras de tejidos

Para estudiar y evaluar el intervalo de distribución de los tejidos y la expresión de las proteínas MN, se usó el anticuerpo monoclonal M75 para teñir inmunohistoquímicamente una variedad de muestras de tejido humano. El anticuerpo primario usado en estos experimentos de tinción inmunohistoquímica fue el anticuerpo monoclonal M75. Se usaron un segundo anticuerpo biotinilado y estreptavidina-peroxidasa para detectar la reactividad de M75 en secciones de muestras de tejidos fijadas en formalina y embebidas en parafina. En estos experimentos, se usó un equipo de amplificación comercialmente disponible, específicamente, el equipo DAKO LSAB^{TM} [DAKO Corp., Carpinteria, CA (EE.UU.)] que proporciona reactivo de bloqueo preparado cotejado, anticuerpo secundario y estreptavidina-peroxidasa de rábano picante.

Se analizó la inmunorreactividad de M75 según los procedimientos de esta invención en secciones de múltiples tejidos de mama, colon, cuello uterino, pulmón y tejidos normales. Se cortaron tales secciones de múltiples tejidos de los bloques de parafina de los tejidos denominados "salchichas" que fueron adquiridos en City of Hope [Duarte, CA (EE.UU.)]. Combinados en tal sección de múltiples tejidos, había muestras normales, benignas y malignas de un tejido dado; por ejemplo, se combinarían aproximadamente una veintena de muestras de tejidos de cánceres de mama de diferentes pacientes, un número similar de muestras de tejido de mama benigno y muestras de tejido de mama normal en una de tales secciones de múltiples tejidos de mama. Las secciones de múltiples tejidos normales sólo contenían tejidos normales de diversos órganos, por ejemplo, de hígado, bazo, pulmón, riñón, glándula suprarrenal, cerebro, próstata, páncreas, tiroides, ovario y testículos.

También se rastrearon en busca de la expresión del gen MN múltiples muestras individuales de cánceres de cervicales, cánceres de vejiga, cánceres de células renales y cánceres de cabeza y cuello. Tales muestras se obtuvieron en U.C. Davis Medical Center en Sacramento, CA y del Dr. Shu Y. Liao [Departamento de Patología St. Joseph Hospital; Orange, CA (EE.UU)].

Los controles usados en estos experimentos eran líneas celulares CGL3 (híbridos celulares H/F-T) y CGL1 (híbridos celulares H/F-N) de las que se sabe que tiñen respectivamente positiva y negativamente con el anticuerpo monoclonal M75. El anticuerpo monoclonal M75 se diluyó hasta una dilución de 1:5000, en la que el diluyente era bien PBS [solución salina tamponada con fosfato 0,05M (NaCl 0,15M), pH 7,2-7,4] o PBS que contenía ASB libre de proteasa al 1% como un estabilizador de proteínas.

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Protocolo de tinción inmunohistoquímica

El protocolo de tinción inmunohistoquímica se siguió según las instrucciones del fabricante del equipo DAKO LSAB^{TM}. En síntesis, se desenceraron las secciones, se rehidrataron y se bloquearon para eliminar la reactividad inespecífica, así como la actividad peroxidasa endógena. Entonces se incubó cada sección con diluciones del anticuerpo monoclonal M75. Una vez eliminado el M75 sin unir mediante el aclarado de la sección, se hizo reaccionar consecutivamente la sección con un anticuerpo IgG anti-ratón biotinilado y estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante; se incluyó una etapa de aclarado entre esas dos reacciones y después de la segunda reacción. Tras el último aclarado, se detectaron los complejos de anticuerpo-enzima mediante la reacción con un cromógeno insoluble (diaminobenzidina) y peróxido de hidrógeno. La formación de un precipitado marrón rojizo insoluble en la zona de la reacción del anticuerpo primario indicó un resultado positivo. Entonces se aclararon las secciones, se les realizó una tinción de contraste con hematoxilina, se deshidrataron y se taparon con el cubreobjetos. Entonces se examinaron las secciones usando microscopía de luz estándar.

Interpretación. El depósito de un precipitado marrón rojizo sobre la membrana plasmática se tomó como la prueba de que el anticuerpo M75 se había unido a un antígeno MN en el tejido. El control positivo conocido (CGL3) tenía que estar teñido para validar el análisis. Se tuvo en cuenta el espesor de las secciones para comparar las intensidades de tinción, pues las secciones más gruesas producen una mayor intensidad de tinción independientemente de otros parámetros de análisis.

Resultados

El examen preliminar de las muestras cervicales mostró que 62 de las 68 muestras de carcinoma de células escamosas (91,2%) se tiñeron positivamente con M75. Además, 2 de los 6 adenocarcinomas y 2 de los 2 cánceres adenoescamosos cervicales también se tiñeron positivamente. En estudios anteriores, el 55,6% (10 de 18) de las displasias cervicales se habían teñido positivamente. Un total de 9 muestras, incluyendo tanto displasias como tumores cervicales, mostraron cierta expresión de MN en zonas aparentemente normales del epitelio glandular endocervical, habitualmente, en la capa basal. En algunas muestras, mientras que las zonas que parecían morfológicamente normales mostraron una expresión del antígeno MN, las zonas que presentaban displasia y/o malignidad no mostraron la expresión de MN.

La inmunorreactividad positiva de M75 se localizó más a menudo en la membrana plasmática de las células, estando presente la tinción más notable en las uniones entre células adyacentes. La tinción citoplasmática también se hizo evidente en algunas células; sin embargo, se usó más a menudo la tinción de la membrana plasmática como criterio principal de resultado positivo.

Las células positivas en M75 tendían a estar cerca de las zonas que presentaban una diferenciación de la queratina en las muestras cervicales. En algunas muestras, las células de tinción positiva se localizaron en el centro de nidos de células sin teñir. Lo habitual es que hubiera muy poca, en caso de haberla, diferencia morfológica clara entre las células teñidas y las células no teñidas. En algunas muestras, las células de tinción positiva estaban asociadas con zonas adyacentes de la necrosis.

En la mayoría de los carcinomas de células escamosas cervicales, la inmunorreactividad de M75 tuvo una distribución focal, i.e., sólo se tiñeron ciertas zonas de la muestra. Aunque la distribución de la reactividad positiva en una muestra dada fue bastante esporádica, la intensidad de la reactividad fue habitualmente muy fuerte. En la mayoría de los adenocarcinomas cervicales, el patrón de tinción fue más homogéneo, estando la mayoría de la muestra teñida positivamente.

Entre las muestras de tejidos normales, sólo se observó inmunorreactividad positiva e intensa específica de M75 en los tejidos de estómago normales, disminuyendo la reactividad en el intestino delgado, el apéndice y el colon. Ningún otro tejido normal se tiñó positivamente de manera extensa para M75. Sin embargo, en ocasiones, se observaron focos de células intensamente teñidas en muestras de intestino normales (habitualmente, en la base de las criptas) y a veces, se observaron en zonas que parecían morfológicamente normales del epitelio de las muestras cervicales que presentaban displasia y/o malignidad. En tales zonas aparentemente normales de muestras cervicales, la tinción positiva se observó en zonas focales de la capa basal del epitelio ectocervical o en la capa basal del epitelio glandular endocervical. En una muestra normal de piel humana, se observó tinción de MN citoplasmática en la capa basal. Las capas basales de estos epitelios, habitualmente, son zonas de proliferación, lo que sugiere que la expresión de MN puede estar implicada en el crecimiento celular. En unas cuantas muestras de biopsia cervical, se observó un resultado positivo en MN en el epitelio escamoso estratificado de apariencia morfológicamente normal, a veces asociado con células sometidas a cambios coilocíticos.

Algunos adenomas (4 de 11) y adenocarcinomas (9 de 15) de colon se tiñeron positivamente. Una muestra de colon normal fue positiva en la base de las criptas. De las 15 muestras de cáncer de colon, 4 adenocarcinomas y 5 lesiones metastásicas dieron positivo en MN. Menos cánceres malignos de mama (3 de 25) y muestras de cáncer de ovario (3 de 15) se tiñeron positivamente. De los 4 cánceres de cabeza y cuello, 3 se tiñeron muy intensamente con M75.

Aunque el tejido de estómago normal dio positivo rutinariamente, 4 adenocarcinomas del estómago dieron negativo en MN. De las 3 muestras de cáncer de vejiga (1 adenocarcinoma, 1 carcinoma de células transitorias no papilares y 1 carcinoma de células escamosas), sólo dio positivo en MN el carcinoma de células escamosas. Aproximadamente el 40% (12 de 30) de las muestras de cáncer de pulmón fueron positivas; 2 de 4 carcinomas sin diferenciar; 3 de 8 adenocarcinomas; 2 de 8 carcinomas de células en granos de avena; y 5 de 10 carcinomas de células escamosas. Un cien por cien (4 de 4) de los carcinomas de células renales dio positivo en MN.

En resumen, se observó que el antígeno MN, detectado mediante M75 e inmunohistoquímica en los experimentos anteriormente descritos, está extendido en las células tumorales, más particularmente, en tejidos de cánceres cervicales. También se encontró antígeno MN en algunas células de tejidos normales y, a veces, en zonas que parecían morfológicamente normales de muestras que presentaban displasia y/o malignidad. Sin embargo, MN no se expresa, habitualmente, de manera extensa en la mayoría de los tejidos normales, a excepción de los tejidos de estómago, en los que se expresa ampliamente, y en los tejidos del tracto gastrointestinal inferior, en los que se expresa menos ampliamente. La expresión de MN se ubica más a menudo en la membrana plasmática celular de las células tumorales y puede desempeñar un papel en la comunicación intercelular o en la adhesión celular. En la tabla 2, se muestran los resultados representativos de los experimentos realizados según lo descrito anteriormente.

TABLA 2 Inmunorreactividad de M75 en diversos tejidos

7

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Los resultados registrados en este ejemplo indican que la presencia de proteínas MN en una muestra de tejido de un paciente pueden ser, en general, en función del tejido implicado, un marcador que señalice un proceso pre-neoplástico o neoplástico. De este modo, a partir de estos resultados, se puede concluir que los procedimientos de diagnóstico/pronóstico que detectan el antígeno MN pueden ser particularmente útiles en el rastreo de muestras de pacientes en busca de un número de cánceres que, de ese modo, pueden ser detectados en un estadio pre-neoplástico o en un estadio temprano antes de los cambios morfológicos obvios asociados con la displasia y/o la malignidad sean evidentes o sean evidentes de una manera generalizada.

Ejemplo 2 Vacuna: modelo en ratas

Como se muestra anteriormente, en el ejemplo 7 del documento WO 93/18152 (fecha de publicación internacional: 16 de septiembre de 1993), en algunos tumores de rata, por ejemplo, en la línea de células tumorales XC (células de un rabdomiosarcoma de rata), se expresa una proteína MN de rata relacionada con la MN humana. Por tanto, se ofreció un modelo para estudiar la inmunidad antitumoral inducida por las vacunas experimentales basadas en MN. Se realizaron los siguientes experimentos representativos.

Se aleatorizaron ratas Wistar de nueve a once días de vida de varias familias, se les inyectaron intraperitonealmente 0,1 ml de bien sueros de rata control (el grupo C) o de suero de rata frente a la proteína de fusión MN GEX-3X-MN (el grupo IM). Simultáneamente, se inyectaron a ambos grupos subcutáneamente 10^{6} células tumorales XC.

Cuatro semanas después, se sacrificaron las ratas y se pesaron sus tumores. Los resultados se muestran en la figura 2. Cada punto de la gráfica representa un tumor de una rata. La diferencia entre los dos grupos - C e IM - fue relevante según el test de orden de Mann-Whitney ( U = 84; \alpha < 0,025). Los resultados indican que el grupo IM de ratas neonatas desarrolló tumores de un tamaño de aproximadamente la mitad del de los controles y que 5 de las 18 ratas inmunizadas pasivamente no desarrollaron ningún tumor en absoluto, en comparación con 1 de los 18 controles.

Ejemplo 3 Expresión de ADNc de MN de longitud completa en células NIH 3T3

Se estudió el papel de MN en la regulación de la proliferación celular mediante la expresión de ADNc de longitud completa en células NIH 3T3. Se eligió esa línea celular porque se había usado con éxito en la demostración del efecto fenotípico de un número de proto-oncogenes [Weinberg, R. A., Cancer Res. 49: 3713 (1989); Hunter, T, Cell, 64: 249 (1991)]. Además, las células NIH 3T3 expresan proteína relacionada con MN no endógena que es detectable por el Acm M75.

El ADNc de MN longitud completa se obtuvo mediante la unión de los dos clones de ADNc usando el sitio de BamHI exclusivo y se subclonó desde pBluescript en sitios de KpnI-SacI del vector de expresión pSG5C. El pSG5C fue amablemente proporcionado por el Dr. Richard Kettman [Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Agrícolas, B-5030 Gembloux, Bélgica]. El pSG5C fue derivado de pSG5 [Stratagene] mediante la inserción de un poliligador que constaba de una secuencia que tenía varios sitios vecinos para las siguientes enzimas de restricción: EcoRI, XhoI, KpnI, BamHI, SacI, 3 veces el codón de terminación TAG y BglII.

Se co-transfectó el plásmido pSG5C-MN recombinante en una proporción de 10:1 (10 \mug: 1 \mug) con el plásmido pSV2neo [Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982)], que contiene el gen neo como un marcador de selección. La co-transfección se llevó a cabo mediante el procedimiento de precipitación en fosfato de calcio [Equipo de transfección en mamíferos; Stratagene] en células NIH 3T3 emplacadas un día antes a una densidad de 1 x 10^{5} por placa de 60 mm. Como control, se co-transfectó pSV2neo con pSG5C vacío.

Las células transfectadas se cultivaron en medio DMEM complementado con SFB al 10% y 600 \mug ml^{-1} de G418 [Gibco BRL] durante 14 días. Se seleccionaron clónicamente las células resistentes a G418, es expandieron y se analizaron en cuanto a la expresión del ADNc transfectado mediante transferencia Western usando Acm M75 yodado.

Para una estimación de la proliferación celular, se emplacaron las líneas celulares clónicas por triplicado (2 x 10^{4} células/pocillo) en placas de 24 pocillos y se cultivaron en DMEM con SFB al 10% y SFB al 1%, respectivamente. El medio se cambió todos los días y el recuento del número de células se realizó usando un hemacitómetro.

Para determinar la síntesis del ADN, se emplacaron las células por triplicado en una placa de 96 pocillos a una densidad de 10^{4}/pocillo en DMEM con SFB al 10% y se permitió la unión durante una noche. Luego se marcaron las células con ^{3}H-timidina durante 24 horas y se contabilizó la radiactividad incorporada.

Para el análisis del crecimiento independiente del anclaje, se suspendieron las células (2 x 10^{4}) en un agar al 0,3% en DMEM que contenía SFB al 10% y se cubrieron sobre medio agar al 0,5% en una placa de 60 mm. Se contaron las colonias desarrolladas en agar blando dos semanas después del emplacado.

Se obtuvieron varias líneas celulares clónicas que expresaban constitutivamente ambas formas de 54 y 58 kD de la proteína MN a niveles comparables con aquéllos encontrados en las células HeLa infectadas con el LCMV. Los clones positivos en MN seleccionados y las células de control negativo (transfectadas en falso con un plásmido pSG5C vacío) se sometieron a más análisis dirigidos a la caracterización de su fenotipo y su comportamiento de crecimiento.

Las células NIH 3T3 que expresaban MN mostraron una morfología en forma de eje y una mayor refracción; eran menos adherentes al soporte sólido y de un tamaño menor. El control (las células transfectadas en falso) tenían una morfología plana, similar a las células NIH 3T3 parentales. Al contrario de las células control que estaban alineadas y formaban una monocapa con un patrón ordenado, las células que expresaban MN perdieron la capacidad para detener el crecimiento y crecieron caóticamente una encima de la otra. Correspondientemente, las células que expresaban MN fueron capaces de alcanzar densidades de saturación significativamente superiores (más del doble) (Tabla 3), siendo menos dependientes de los factores de crecimiento que las células control.

Los transfectantes de MN también mostraron tiempos de doblaje más rápidos (un 15%) y mayor síntesis de ADN (un 10%) según lo determinado por la cantidad de [^{3}H]-timidina incorporada en comparación con las células control. Finalmente, las células NIH 3T3 que expresaron la proteína MN crecieron en agar blando. El diámetro de las colonias desarrolladas durante 14 días varió de 0,1 a 0,5 mm; sin embargo, la eficacia de clonación de los transfectantes de MN fue bastante baja (2,4%). Aunque ese parámetro de las células NIH 3T3 parece estar menos afectado por MN que por los oncogenes convencionales, el resto de los datos coincide con la idea de que MN desempeña un papel en el control del crecimiento celular.

TABLA 3

8

Ejemplo 4 Aceleración del tránsito de G_{1} y disminución de la sensibilidad a la mitomicina C provocadas por la proteína MN

Para los experimentos descritos en este ejemplo, se usaron los transfectantes de MN estables de las células NIH 3T3 generados según lo descrito en el ejemplo 3. Se usaron cuatro clones positivos en MN seleccionados y cuatro clones control transfectados en falso bien individualmente o en mezclas.

Análisis de citometría de flujo de poblaciones de células asíncronas. Se emplacaron células que habían sido desarrolladas en cultivo denso a 1 x 10^{6} células por placa de 60 mm. Cuatro días después, se recogieron las células por tripsinización, se lavaron, se volvieron a suspender en PBS, se fijaron mediante la adición en gotas de etanol al 70% y se tiñeron con solución de yodo propidio que contenía RNasa. El análisis se realizó mediante FACStar usando un programa informático de análisis del ciclo celular del ADN [Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ (EE.UU.)].

Se emplacaron células en crecimiento exponencial a 5 x 10^{5} células por placa de 60 mm y se analizaron según lo anterior 2 días después. Se usó una dispersión de luz hacia delante para el análisis de los tamaños celulares relativos. Los datos se evaluaron usando el test de Kolmogorov-Smirnov [Young, J. Histochem. Cytochem, 25: 935 (1977)].

Los análisis de citometría de flujo revelaron que las poblaciones clónicas que expresaban constitutivamente la proteína MN mostraban un menor porcentaje de células en fase G1 y un mayor porcentaje de células en las fases G2-M. Esas diferencias fueron más sorprendentes en las poblaciones de células desarrolladas en tres pasos en cultivos de alta densidad que en las células subconfluyentes que se desarrollaron exponencialmente. Esa observación respalda la idea de que la proteína MN tiene la capacidad de perturbar la inhibición por contacto.

También se observó una disminución del tamaño de las células que expresaban MN observadas tanto en cultivos en proliferación exponencial como en cultivos de alta densidad. Es posible que la aceleración mediada por MN del tránsito de G1 esté relacionada con el tiempo de doblaje más corto indicado anteriormente (en aproximadamente un 15%) de las células NIH 3T3 que expresaban MN en proliferación exponencial. Además, las células que expresaban MN mostraron una densidad de saturación sustancialmente mayor y menores requisitos de suero que las células control. Esos hechos sugieren que las células transfectadas con MN tenían la capacidad de continuar su proliferación a pesar de las limitaciones de espacio y los menores niveles de factores de crecimiento en suero, mientras que las células control fueron detenidas en la fase G1.

Condiciones limitantes. Se estudió la proliferación de las células que expresaban MN y de las células control tanto en condiciones óptimas como limitantes. Se emplacaron las células a 2 x 10^{4} por pocillo de una placa de 24 pocillos en DMEM con SFB al 10%. El medio se cambió a intervalos diarios hasta el día 4, cuando se alcanzó la confluencia, y a partir entonces ya no se volvió a renovar. Las células viables se contaron en un hemacitómetro a los tiempos apropiados usando una exclusión con tinte de azul de Tripano. Los números de células se representaron frente al tiempo, tal que cada punto de la gráfica representa un valor medio de la determinación por triplicado.

Los resultados demostraron que la proliferación de las células que expresaron MN y de las células control fue similar durante la primera fase, cuando el medio era renovado diariamente, pero que se produjo una gran diferencia en el número de células viables cuando se dejó de renovar el medio. Más de la mitad de las células control no pudieron soportar las condiciones de crecimiento no favorables. Por el contrario, las células que expresaban MN siguieron prolife-
rando incluso al ser expuestas a una competición creciente por los nutrientes y los factores de crecimiento en suero.

Esos resultados fueron apoyados además por el análisis de citometría de flujo de células privadas de suero desarrolladas durante dos días en medio que contenía SFB al 1%. Mientras que el 83% de las células control se acumuló en la fase G0-G1 (S = 5%; G2-M = 12%), la expresión de la proteína MN invirtió parcialmente el retraso en G1 según lo indicado por la distribución del ciclo celular de los transfectantes de MN (G0-G1 = 65%; S = 10%; G2-M = 26%). Los resultados de los experimentos anteriormente descritos sugieren que la proteína MN podría funcionar para liberar el punto de control de G1/S y permitir la proliferación de las células en condiciones no favorables.

MMC. Para analizar ese supuesto, se simularon condiciones no favorables tratando las células con el fármaco dañino para el ADN mitomicina C (MMC) y luego permitiendo su proliferación y su viabilidad. Se cree que el mecanismo de acción de la MMC es el resultado de su activación intracelular y la posterior alquilación y entrecruzamiento del ADN [Yier y Szybalski, Science, 145: 55 (1964)]. Normalmente, las células responden al daño del ADN mediante la detención de la progresión de su ciclo celular para reparar los defectos y evitar la adquisición de una inestabilidad genómica. Un daño grande está acompañado por una notable citotoxicidad. Sin embargo, muchos estudios [por ejemplo, Peters et al., Int. J. Cancer, 54: 450 (1993)], se refieren a la aparición de células resistentes al fármaco tanto en poblaciones de células tumorales como tras la introducción de oncogenes en líneas celulares no transformadas.

La respuesta de las células NIH 3T3 transfectadas con MN a las concentraciones crecientes de MMC se determinó mediante un marcaje continuo con [^{3}H]-timidina. Se emplacaron las células en una placa de microvaloración de 96 pocillos a una concentración de 10^{4} por pocillo y se incubaron durante una noche en DMEM con SFB al 10% para la unión. Entonces se sustituyó el medio de crecimiento por 100 \mul de medio que contenía concentraciones crecientes de MMC de 1 \mul/ml a 32 \mug/ml. Todas las concentraciones de fármaco fueron analizadas en pocillos por triplicado. Tras 5 horas de tratamientos, se retiró la MMC, se lavaron las células con PBS y medio de crecimiento recién preparado sin la adición del fármaco. Tras una recuperación de una noche, se determinaron las fracciones de células que estaban participando activamente en la proliferación mediante un marcaje de 24 h con [^{3}H]-timidina. Se comparó la incorporación de las células tratadas con la del control, las células sin tratar, tomándose las fracciones proliferantes como un porcentaje de la incorporación del control.

Tres días después, se estimó la viabilidad de las células tratadas mediante un ensayo de proliferación celular no radiactivo CellTiter 96 AQ [Promega] que estaba basado en la biorreducción del metotrexato (MTX) en un formazán hidrosoluble que absorbe la luz a 490 nm. El porcentaje de células supervivientes fue derivado de los valores de absorbancia obtenidos tras la sustracción del fondo.

El control y las células NIH 3T3 que expresaron MN mostraron diferencias notables en cuanto a sus respuestas a la MMC. La sensibilidad de las células transfectadas con MN pareció considerablemente inferior que la del control en ambos apartados de los experimentos descritos anteriormente. Los resultados sugirieron que las células transfectadas con MN pudieron anular la señal de crecimiento negativo mediada por la MMC.

Depósitos de la ATCC. El material que se enumera a continuación fue depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 (EE.UU.). Los depósitos se hicieron en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes y las regulaciones del mismo (Tratado de Budapest). El mantenimiento de un cultivo viable queda garantizado durante 30 años desde la fecha del depósito. La ATCC pondrá en disposición del público los hibridomas y los plásmidos en virtud de los términos del Tratado de Budapest, estando sometidos a un acuerdo entre los solicitantes y la ATCC, que garantiza la disponibilidad sin restricciones al público de los hibridomas y de los plásmidos depositados tras la concesión de la patente de la presente solicitud. La disponibilidad de la cepa depositada no será considerada como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados en virtud de la autoridad de ningún gobierno en conformidad con sus leyes de patentes.

9

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Institute of Virology Slovak Academy of Sciences

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(B): DIRECCIÓN CALLE: Dubravska Cesta 9

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(C): CIUDAD: Bratislava

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(E): PAÍS: Eslovaquia

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(F): CÓDIGO POSTAL: 84246

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Gen y proteína MN

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 86

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DIRECCIÓN: Clive FROUD

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(B): CALLE: Elkington and Fife

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(C): CIUDAD: Prospect House, 8 Pembroke Road

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(D): ESTADO: Sevenoaks, Kent

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(E): PAÍS: Inglaterra

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(F): CÓDIGO POSTAL: TN13 1XR

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(v): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US 95/07628

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN INTERNACIONAL: 15-JUNIO-1995

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Clive FROUD

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(B): NÚMERO DE REGISTRO:

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: CF/JF/F91380EP

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: +44 1732 458 881

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(B): TELEFAX: +44 1732 450 346

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1522 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): ENCADENAMIENTO: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 1:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 459 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Los 37 primeros aminoácidos representan el péptido señal y el resto de los aminoácidos representa la proteína madura

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 2:

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: SÍ

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 3:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCCAGTGG GTCATCTTCC CCAGAAGAG

\hfill

29

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 4:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAATCCTCC TGCATCCGG

\hfill

19

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10898 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 5:

13

14

15

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: Péptido señal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 6:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: Cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGGTTCTT GAGGATCTCC AGGAG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTAACTTC AGGGAGCCCT CTTCTT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA: la N significa inosina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGG NNGGGNNG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 10:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 55..60

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 11:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 12:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORM

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 36..51

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 13:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 14:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 279..291

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 15:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 16:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGCTAGCT CCATGGGTCA TATGCAGAGG TTGCCCCGGA TGCAG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGATCTCT TACTCGAGCA TTCTCCAAGA TCCAGCCTCT AGG

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: factor de transcripción AP-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCCCCACCC

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: elemento iniciador (Inr)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACCCCCAT

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: Sitio de unión a p53

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: El Deiry et al.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TÍTULO: "Human genomic DNA sequences define a consensus binding site for p53"

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: Nature Genetics

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 44-49

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA: 1992

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTAGTCC

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 22:

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia consenso iniciadora

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

YYYCAYYYYY

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: sitio de unión a p53

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: El Deiry et al.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TÍTULO: "Human genomic DNA sequences define a consensus binding site for p533"

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: Nature Genetics

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 44-49

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA: 1992

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCTTGCTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 25:

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 26:

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 540 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: Promotor MN propuesto

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 27:

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 445 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: primer exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 28:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: segundo exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGATGACCA GAGTCATTGG CGCTATGGAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 171 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: tercer exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 30:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 143 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cuarto exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 31:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: quinto exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 32:

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: sexto exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 33:

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 158 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: séptimo exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 34:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 145 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: octavo exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 35:

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: noveno exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCAGCTGAA TTCCTGCCTG GCTGCTG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 82 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: décimo exón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 37:

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACETERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 191 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: décimo primer exón de MN

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1174 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: primer intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 39:

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 193 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: segundo intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 40:

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 131 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: tercer intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 41:

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 89 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): cuarto intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 42:

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1400 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: quinto intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 43:

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1334 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: sexto intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 44:

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 512 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: séptimo intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 45:

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 114 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: octavo intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 46:

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 617 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: noveno intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 47:

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 130 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: décimo intrón de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 48:

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1401 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: Abarca la parte 3' del primer intrón hasta más allá del final del quinto exón

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 49:

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 98 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: Región de homología con la cadena alfa 1 del colágeno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 50:

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 256 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: dominio de la anhidrasa carbónica

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 51:

\vskip1.000000\baselineskip

52

520

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: región transmembrana

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 52:

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: terminal C intracelular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 53

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 170 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 54:

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 470 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 55

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 292 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: repetición Alu de la región genómica de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 56:

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 262 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: repetición Alu de la región genómica de MN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 57:

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 904 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 58:

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 292 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 59:

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 262 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 60:

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 294 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 61:

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 276 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 62:

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 289 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 63:

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 298 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 64:

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 65:

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 66:

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAAGGTAAG T

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGGTGAG A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTCGTGAG G

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGTGAG C

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGGTACC A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGGTCAG T

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCAGGTGGG C

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGGTACA G

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCTGGTGAG T

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia donante de consenso de empalme en 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATACAGGGGA T

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATACAGGGGA T

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCAGGCGA C

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGCAGTGCA A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCAGATCC A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCAGGAGG G

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACAGGCTC A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTAGCTCC A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCAGTCCA G

\hfill

11

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGCAGGTGA CA

\hfill

12

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: secuencia aceptora de consenso de empalme en 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 86:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACACAGAAGG G

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11

Claims

1. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene actividad reguladora del promotor MN, contiene al menos 16 nucleótidos y tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las siguientes secuencias de nucleótidos:

2. Un ácido nucleico aislado según lo reivindicado en la reivindicación 1, en el que comprende una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos:

3. Un ácido nucleico aislado según lo reivindicado en la reivindicación 2, en el que comprende una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos:

: las secuencias de nucleótidos de (a1);

: la secuencia de nucleótidos de (a2);

: la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del nucleótido -35 al nucleótido -26 de (a4).

4. Un ácido nucleico aislado según lo reivindicado en la reivindicación 2, en el que comprende una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos:

5. Un vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico aislado según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque contiene al menos 16 nucleótidos y tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las siguientes secuencias de nucleótidos:

(a): las secuencias de nucleótidos de los diez intrones de la secuencia genómica de MN indicada en la tabla 1 en relación con la figura 3 anexa y las secuencias de nucleótidos complementarias a las secuencias de nucleótidos de los diez intrones de la secuencia genómica de MN;

7. Un ácido nucleico aislado según lo reivindicado en la reivindicación 6, en el que las secuencias de nucleótidos de (c) tienen una homología del al menos 90% con las secuencias de nucleótidos de (a) y (b).

8. Un ácido nucleico aislado según lo reivindicado en la reivindicación 6, en el que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre:

(a1): la secuencia de nucleótidos del tercer intrón de la secuencia genómica de MN indicada en la Tabla 1 en relación con la figura 3 anexa que se extiende del nucleótido 5.520 al nucleótido 5.650 y la secuencia de nucleótidos complementaria a la misma; y

9. Un ácido nucleico aislado según lo reivindicado en la reivindicación 6, en el que es de 16 a 50 nucleótidos de longitud, preferiblemente, de 19 a 45 nucleótidos de longitud, y funciona como un cebador de la reacción en cadena de la polimerasa para las secuencias de ácidos nucleicos de MN.

10. Un ácido nucleico aislado según lo reivindicado en la reivindicación 6, en el que es de al menos 27 nucleótidos de longitud o es de al menos 29 nucleótidos de longitud o es de al menos 50 nucleótidos de longitud o es de al menos 100 nucleótidos de longitud o es de al menos 150 nucleótidos de longitud.

11. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque contiene al menos 150 nucleótidos y tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las siguientes secuencias de nucleótidos: la secuencia de nucleótidos del nucleótido 3.302 al nucleótido 3.771 de la figura 3 anexa y la secuencia de nucleótidos complementaria a la misma.

12. Un vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico aislado según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11.