JPH05508701A

JPH05508701A - 被分析物に結合するリガンドの同定方法

Info

Publication number: JPH05508701A
Application number: JP90515704A
Authority: JP
Inventors: コーバー，ローレンス　エム．
Original assignee: テラピン　テクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1989-10-31
Filing date: 1990-10-31
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: EP0500685A4; KR927003168A; JP2690193B2; WO1991006356A1; EP0500685A1; AU654940B2; US5133866A; AU6724990A; CA2072637A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】に　ム　るすがノドの６との　矢へ本出願は、１９８８年３月２４日付の米国特許出順環１７２．６２６号の包帯継続出願（ＦＷＣ）である、１９８９年５月１６日付の米国特許第３５５、０４２号の一部継続出願である、工９８９年１０月３１日付けの米国特許出順環４２９．７２１号の一部継続出願であり、１９８８年１０月１１日付の米国特許出順環２５５．９０６号の一部継続出願でもある。

１丘立団本発明は、例えば、特異的な被分析物用の、クロマトグラフィーおよび分析用のアフィニティーリガンドとして使用し得る特異的結合部分の選択法に関する。さらに詳細には、本発明は、性質の異なった低分子量の（＜７．５　ｋｄ）　ｒパラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ）Ｊの種々のセットから選択されるリガンドの、アフィニティーリガンドとしての使用に関し、このアフィニティーリガンドは、診断および治療、および、特に低い免疫原性の有毒な汚染物質のような、様々な被分析物の検出および精製のためのクロマトグラフィー技術、および、イムノアッセイのような結合アッセイ、に有用である。

１見艮歪本発明の方法で調製されるパラログは、クロマトグラフイ−での応用に特に有用である。このようなりロマトグラフィー分離の実践における、２つの主要な開発は、天然の産物の単離、混合物の成分分離、および複雑な組成物の分析を容易とするのにこの１０年間位のあいだに非常な重要性を有するようになった。この一つは、固定されたリガンドと所望の被分析物との間の特異的な相互作用に起因する結合特性上の大きな違いに分離または分析が依存しているアフィニティークロマトグラフィーに対して、特異的抗体のような、入手可能なリガンドの種類が増したことである。そしてこのもう一つは、吸着剤に対する複数の成分の結合の小さな違いに依存した連続的な分別によって、複数の成分の迅速で効率的な分離を可能とした高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の登場である。

ＨＰ　Ｌ　Ｃは、特異的アフィニティ一対として用いられるリガンドの多くに有害な条件を一般に用いるため、これらの開発物は、限られた範囲で重複しているに過ぎない。これらの技術で可能な被分析物の範囲で最も一般的に用いられるアフィニティーパートナ−は、特異的なイムノグロブリンあるいはその免疫反応性の断片であった。一般に、このタイプのリガンドは、ＦＩＰＬＣで用いられている条件では不安定である。）ＩＰＬＣではしばしば非水性の溶媒が用いられ、多くのアフィニティーリガンドを変性させ、そして、使用される高圧も、これらの多くの物質を破壊する。

Ｔ　ｃｈｎｉ　ａｓ　Ｃｈｅｍ’ｓｔｒ　第１２巻Ｅｄ鳳ｏｎｄ　Ｓ、Ｐｅｒｒｙら編集Ｓｅ　ａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆ’ｅａｔｉｏｎ第３版（１９７８＞　（Ｊ、　Ｗｉｌｅｙ）中のＭａｙ、　Ｓ、Ｗ、による初期の総説でまとめられたように、アフィニティーに基づいたクロマトグラフィーでは、様々な固体支持体および様々なアフィニティーリガンドを使用し得る。この総説は、ポリアクリルアミドゲル、混合ゲル、および種々のガラスおよびシリカ誘導体に加えて、特に多糖支持体に重点を置いて、アフィニティークロマトグラフィーに適した支持体に関して記載している。

これらの内では、シリカ誘導体のみがＨＰＬＣで広く使用されている。しかし、その結合特性を改変するための支持体の誘導体化の範囲は、種々の炭水化物リガンドあるいは他の簡単な分子の複合による疎水性の変化に限られていた。本発明は、一連の可能な被分析物から選択されたメンバーに対して特異的な必要なアフィニティー、および［１ＰＬＣの条件と両立し得る能力とを有するリガンドを得るための方法を提供することにより、ＨＰＬＣ法およびアフィニティー法との都合の良い融合を可能とする。

コレらのリガンドの選択に最大の多様性を持たせるために、如何なる場合にも目的とする分離が行えるように、適切なリガンドが得られるようにした。

他の研究書違も、様々な方法でＬＰＬＣ法とアフィニティー法との融合を試みた。Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｅ、Ａ、ら、肚往」皿（１９８４）ＬＱ４：１１３−１３３には、吸着される成分間の吸着部位に対する競合が、溶出剤による競合に置き換えられた、「置換」クロマトグラフィーが記載されている。分離される物質に対する特異的アフィニティーが異なった、シフロブ牛ストワンのような炭水化物を用いたクロマトグラフィー支持体もまた報告されている（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、Ｄ、Ｗ、ら、Ｊ　Ｃｈｒｏｍ　Ｓｃｉ　（１９ｇ４）　２２：４１１−４１５）。

加えて、精製されたチバクロン（Ｃ１ｂａｃｒｏｎ）染料のパネルが、クロマトグラフィー支持体の候補として用いられた（Ｂｕｒｔｏｎ。

Ｓ、　Ｊ、ら、Ｌ且■立ｕ山ｕ（１９８８）　４３５＋１２７−１３７＞。

本発明の方法で用いられるリガンドの例には、本明細書では「バラログ」と呼ぶ物質の一形態である、４−２０個のアミノ酸のペプチドの多様なセットが挙げられる。それに対して抗体が作成される抗原決定基あるいは抗原のエピトープに特異的に結合する、イムノグロブリンの一部分をバラログは模倣している。このエピトープに相補的なセグメントは、一般にバラトープと呼ばれ、そしてバラログ中のペプチド配列は、作成された抗体中に存在するものと同じである必要はないので、バラログ（あるいはバラトープアナログ）という用語を用いる。

特定の部分に対して推定上相補的なペプチドの合成および同定は、以前は非常に限定された範囲でしか行われていなかった。Ａｔａｓｓｉ、　Ｍ、Ｚ、らの、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９７７）　２５２＋１１７８４−８７８７には、リゾチームの抗原性部位に相補的なペプチドの、特異的な設計が記載されている。

リゾチームの３次元的な輪郭の知識により、推測される決定基に類似したディメンシコンおよび電子密度パターンのペプチドの合成が可能となった。この決定基を模倣したペプチドに、三次元構造および電子密度パターンが相補的と考えられる配列を調製することで、推定上相補的なペプチドが得られた。この擬似「パラトープ」ペプチドは、リゾチームの抗血清との反応を阻害し、そしてリゾチームに特異的に結合して、イムノグロブリン（ｏ＋ｙｏｇｌｏｂｉｎ）あるいは抗体を排除した。しかし、この性質は、この「パラトープ」と相補のペプチドに共有され、そして事実そのペプチドの方が優れていることが後に示された。同じ研究グループのその後の研究の結果、アセチルコリン特異的レセプターの結合部位、およびトリプシンの結合部位を有するペプチドが合成された（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、　Ｄ、Ｊ、ら、紅匹１１」（１９８４）　２２４：９９５−１０００；　Ａｔａｓｓｉ、Ｍ、Ｚ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　（１９８５）　２２６：４７７ −４８５）。

ペプチドバラトープまたはレセプターまたは酸素結合部位を模倣したは、抗原決定基あるいは決定基結合部分のいづれかに関連した既知の構造パラメーターに基づいている。

原子解析による結合部位を調べる異なったアプローチによる最近の研究で、抗体のイディオタイプ表面がマフピングでき、そしてこの表面の部分を模倣したペプチドを作成し得ることが示された。しかし、Ｊｅｒｎｅの仮説の予測に反し、イディオタイプおよびパラトープは正確には一致しなかった。５ｅｉｄｅｎ、　Ｍ、Ｖ、の、Ａｍ　Ａｓ５ｏｃ　Ｉｍ＋Ｉｕｎｏｌ　（１９８６）　１ｊｊ４：５８２−５８７；　Ｒｏｕｘ。

Ｋ、　Ｈ，らの、Ｐｒｏｅ　Ｎ　ｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳ　（１９８？）　８４：４９８４−４９８８゜最近、特異的な相互作用の特徴の知識無しに、相補的な成分に特異的に結合する、エピトープを模倣する方法が開示された。これに最も関連した研究は、Ｃｏｍｍｏｒｖｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｕｍ　Ｌａｂ０ｒａｔＯｒｉｅＳ　ｉｎ　ＡＬＩＳｔｒａｌｉａの、Ｇｅｙｓｅｎ　）１．Ｍ、らのものである、Ｇｅｙｓｅｎは、候補配列が抗体と特異的に結合する能力を経験的にテストし得る、複数の候補配列のパネルを調製する経験的な方法を考案した。Ｇｅｙｓｅｎのアプローチでは、候補ペプチドの各々ヲ、相対的に少ない量で、別々のポリエチレンの支持体ロッド上で独立して合成する。この支持体ロッドは、マイクロタイタートレイのウェルに個々に浸すのに都合の良いように配置されている。典型的には、９６種の（市販されているトレイの配列に対応した数）別々のペプチドが同時に合成し得る。

この９６種のペプチドは、標準的なラジオイムノアッセイあるいはＥＬＩＳＡを用いて同時に結合をもアッセイし得る。（例えば、ｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　（ＵＳＡ）　（１９８４）　８１：３９９８−４００２：　ＰＣＴ出願ＷＯ３６１００９９１およびｗｏｇａ１０６４８７を参照。）様々な候補ペプチドはまた、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、　Ｒ，のＰ　ｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃ■」虱（ＵＳＡ）　（１９８５）■：５１３１−５１３５の、Ｔ−バッグ法を用いて、独立した容器中で同時に合成し得る。

もしも遺伝子にコードされたアミノ酸の種類が満足のい（ものであれば、１０８９１０３４３０として１９８９年４月２０日に国際公開された、我々の以前の出願に記載されたように（９，３４を参照）、ランダムに作成したＤＮＡ配列から、この候補ペプチドを組換えで産生じ得る。このアプローチの特定の実施態様は、最近Ｄｅｖｌｉｎ、　Ｊ、らの５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）２４９：４Ｇ４ −４０５：　５ｃｏｔｔ、　Ｊ、に、の、同誌、　ｐｐ、　３８６−３９０に、公表された。

バラログに基づくクロマトグラフィーの一般的基礎は、出願人により記載されている（Ｋａｕｖａｒ、　Ｌ、らの、肛虹ｅｃｈ＋江坦吐（１９９０）　ｉ：２０４−２０７）。別の非ペプチド形態の候補パラログの複数の多様なセットの合成のための方法もまた利用可能である。従って、任意の部分がパネルのメンバーの間でｆ化し得、様々な性質を有する複数のモノマーユニットから複合分子として合成されたこれらの任意の部分が、候補パラログのセットの基礎を形成し得る。

合成分野でのこれらのおよび他の構成要素は、本明細書の発明の方法を行うために、そして、クロマトグラフィー用の基質の調製あるいは他の特異的結合への応用などに使用するために必要とされるリガンドを構築するための材料として製造上使用し得る。　（以下余白）及朋ｆｌ丞本発明はあらゆる選択された部分に対し、特異的に結合することが可能な物質を系統的に容易に選択することを可能にする。応用の一つとして、本発明はアフィニティークロマトグラフィーおよびＨＰＬＣの利点を組み合せることを可能にする、固相支持体を用いた有用な形態の分析用および調製用クロマトグラフィーを提供する。アフィニティーに基づいて、クロマトグラフィー分離および精製のための適切な基質を選択し、構築することにより、本発明の方法は成分の容易な分析、あるいは混合物からのそれらの精製また除去を可能にする効率的な条件で行うことができる。このような技術は、溶離液から有毒な廃棄物を除去すること、保存物中の毒素の量を測定すること、高濃度の無関係な混入物の存在下での低濃度の物質のレベルを分析すること、およびＨＰＬＣを含む調製法に、特に有用である。本発明は、特定の精製および分離上の画題に、または所望の結合アッセイに対して適切なパラログリガンドを探索する有効な手段を用いることによって、クロマトグラフィー技術を有効に用いることを可能にする。さらに、本発明の方法は、診断および治療を含む様々な局面に有用な、特異的に結合するパラログを提供し得る。加えて、本発明の多様なパラログパネルが利用できることは、全ての任意の被分析物に特徴的な結合プロフィールの構築を可能にすると同時に、情報となる相互作用マトリックスを提供して分子の相互作用、特にペプチド／ペプチド相互作用、を系統的に研究することを可能にする。

従って、一つの局面では、本発明は特定された部分、例えば被分析物、に対して特異的アフィニティーを有するバラログを得る方法に向けられる。本発明の方法は、前記部分に選択的に結合する能力について個々の候補パラログのパネルをスクリーニングする工程を包含し、ここで該候補パラログは、そのバラログの他の物質に対する結合能力を決める少なくとも２種のパラメーターについて、系統的に変化させた値を有する。さらに、候補パラログは、所定の部分に対して特異的な置換基を、含有し得る。置換基はこの特異性を、パラログ構造の残りの部分に依存し変化する量で示す。性質の系統的な変更は、スクリーニングを必要とする候補の数を大幅に減少させ、従って従来の方法に対して顕著な利点を提供する。

本発明はさらに、多様化されたセットに対して徐々に良くなり最適に至る近似値を与え、その結果、スクリーニングを必要とする候補の数をさらに減少させる手段を提供する。このようなスクリーニングはパネルの各メンバーを、結合させようとする部分で個々に試験することにより行い得、あるいはパネルの候補を同時にスクリーニングするために多数の試験部分を提供するキ・ットによって行い得る。

候補パラログは、モノマー成分から、ポリマー複合体のパラログ部分を、パラメーターの多様性を最大にするように予め決めておいた様式で合成することにより調製し得、あるいは、このようなバラログをランダムな混合物として合成し、そして多様化候補を、相補的なりガントの最適の近似値を有する多様化セットに結合させ、そしてそれからの溶出によって単離することによっても調製し得る。あるいは、経験的に得られた交差認識表の統計的分析を用いて、最適の多様化セットを同定し得る。

他の局面では、本発明はパラログパネルそれ自身、該バラログパネルをスクリーニングするための適切なキット、およびパネルと被分析物との反応あるいはパネル同志の交差反応で決定された、被分析物のプロフィールおよび相互作用マトリックスをもにも向けられる。本発明は他の面では、パネルのパラログの少なくとも一部分から調製された、勾配クロマトグラフィー用支持体、およびこれらの支持体を用いた分離方法に向けられる。

上述のように、クロマトグラフィーへの応用に加えて、正確な特異性を有する個々のパラログは、イムノアッセイ法における抗体またはその断片の代替物としても使用し得る。パラログはまた、疑似イデオタイブネットワーク（ＰＩＮ）プロファイリング方法における特定のハブテンと代替可能なメンバーを、ミモトーブのパネルでスクリーニングするためにも、抗体の代わりに使用し得る。ここでＰＩＮプロファイリング方法は前述の１９８９年４月２０日に公開されたＰＣＴ公開第ＷＯＦ３９１０３４３０号に記載されている。特異的に結合するパラログはまた、結合すべき部分が例えば治療上のレセプターである場合にも有用である。

図」しｍ咀図１は、ＦＯＲＴＲＡＮプログラムで作成された、３０個のペプチドの多様性セットの特性を示す。

図２は、パラログのパネルを１つの標識被分析物と反応させる典型的なＥＬ　Ｉ　ＳＡ結合アッセイの、一般的な結果を示す。

図３は、パラログのパネルを標識ペプチドの混合物と反応させる典型的なＥＬＩＳＡ結合アッセイの、一般的な結果を示す。

図４は、非標識の被分析物の存在下で、標識された混合物を用い、同じバラログパネルについて相当するアッセイを行った場合の、一般的な結果を示す。

図５は、所望の混合物の分離に適当なパラログリガンドを同定する、クロマトグラフィーキットの概略図を示す。

図６は、図５のキットを用い、マイクロタイタープレート上で行った同定の、工程図を示す。

図７は、一連の６種のパラログカラムにイースト細胞溶解物を適用した結果を示す。

図８は、実施例１に従い合成された、９０個の候補ペンタペプチドパラログのパネルを示す。

図９は、図４のパネル内での、疎水性指数および疎水性モーメントの変動を示す。

図１Ｏは、ＤＤＤのためのクロマトグラフィー用基質としての挙動に対する、ペプチドの環化の影響を示す。

図１１は、コンピューターで設計した、多様化ＤＮＡ配列のパネルを示す。

図１２はパラログの具体例がカルボキシメチルセルロースに、所定の程度まで類似していく能力を示す０図１３は、ＤＥＡＥに類似したパラログカラムの、分離後の処理技術としての使用を、模式的に示している。

図１４は、図１３に模式的に示した分離物の、ＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析を表す。

図１５は、イースト混合物のタンパク質と結合する能力に関して、チバクロンパネルとバラログパネルとを比較して示す。

図１６は、バラログパネルに対する単一のタンパク質の結合プロフィールを示す。

図１７は、モノクローナル抗体を単一のタンパク質として用いた、図１６と同様の結果を示す。

ｒｇＪ１８は、アフィニティ一定数を決定する際の、パラログＢ８５−２９に対するウシ血清アルブミンの結合等量線を示す。

図１９は、ＥＰＡで同定した１１種の７エノール汚染物に関して、パラログ支持体を含む様々なりロマトグラフィー支持体の溶出パターンを、比較して示す。

１１２０−２２は、３つの興なるジペプチドパラログを用いて、１１種のフェノール汚染物について得られた溶出パターンを示す。

日を　るための２本明細書で用いる用語「パラログ」は、モノマー単位から構成されるＩｆｆ＜７５００、または好ましくは（５０００、より好ましくは＜１ｏｏｏの短い「ポリマー」でありて、被分析物またはハプテンのような特定の部分に対して特異的アフィニティーを有するポリマーのことを言う。このアフィニティーに寄与する「ポリマー」は、もちろん、より大きな分子に含まれるか、または固相支持体に複合され得、そしてタンデムコピーとしても供給され得る。前述のように、ファージのコートタンパク質に結合させても、利点が得られ得る。

本発明のスクリーニング方法による選択のためには、個々のパラログは、パラログが他の物質に結合する能力に影響を与える少なくとも２つのパラメーターに関して、最大化された多様性を有するような、候補パラログのパネルのメンバーとして先ず合成される。従って、本発明のパラログはパネルの合理的な合成のために、パネルのメンバーの間で変化し得る個別のモノマーユニットの組み合わせにより構成されなげればならず、こうして、必要な膨大な多様性が調製物において生じる。この多様性は、パネルを形成するアプローチに依存し、個別のパネルメンバーの合成の設計を介したパラメー　″ターの系統的な変更により得られ得、あるいはランダムな混合物の合成によって達成し得る。

用語「最大の」多様性は、充分広い範囲にわたって、候補間の特性が変化することを言う。必要とされる範囲の広さは、意図する用途に依存して変化し得、そしてもちろん、理論的範囲の限界は、必ずしもそれ自身に達する必要はないが、任意の所望する程度にまで近づけ得る。

結果として得られるパラログは「ポリマー」であるが、ポリエチレンまたはポリプロピレンのようなホモポリマーである必要はなく、実際そうではあり得ない。

そして疑似ポモポリマー、即ち、例えば、個々のモノマーが変化するが基本的な結合は同一なまま残っているペプチドまたは核酸の場合のように、モノマー単位を結合するのに同一の型の結合が用いられているモノマー単位から構成されている、である必要はない。広範な様々なこのような複合ポリマー分子が、さらに以下に記載されているように、本発明のパラログパネルのメンバーとして使用され得るが、しかしこれらは全て、実際にスクリーニングし得るよりも非常に多くの候補についての合成を可能にする特徴を共有し、そのため本発明により提供される設計の系統的方法、および多様性サブセットの調製の必要性が生じる。

モノマー単位から構成される部分であることの利点の特徴は、例えば、ペプチドの場合に見られる。−次配列に６個のアミノ酸を含有するパラログが用いられる場合、唯２ｏ個の天然のアミノ酸を用いて６４００万種の可能な６量体が存在する。もちろん、ペプチドの合成はこれらの天然に存在するサブ単位に限定される必要はなく、フードされたアミノ酸のＤ一体および様々なコードされないアミノ酸、例えばβアラニン、アミノ−酪酸、シトルリン等もまた使用され得る。このようなコードされないアミノ酸が多数、周知である。実際、これらは、微生物の代謝物である「天然の」アミノ酸よりも安定であることが期待されるので、好適であり得る。

バラログは、免疫系で生じる多様性に匹敵する、空間的コンホメーションおよび電子分布パターンを提供する。バラログはこのように抗体疑似物であると概念化され得るが、しかしもちろん、バラログが結合することを意図される部分を投与すると、実際に全ての場合において（またはどのような場合ニモ）、バラログとコンホメーションおよびパターンの同じパラトープを有した免疫グロブリンが生じる必要はない。

選択された部分について、バラログに、類似した特異的アフィニティーを示す能力があれば充分である。

用語「特異的アフィニティー」は、選択された部分にバラログが特異的に結合する能力を指す、即ち、この部分とバラログとの間の相互作用の強度は、この選択、された部分上に存在するかもしれない他の物質とバラログとの間の相互作用よりも有効に大きく、その結果、バラログとの結合が、例えば被分析物と混入物との区別に使用し得る。特異的アフィニティーの典型的な値は、最小で１０３１／ｗ＋ｏｌｅからｔｏ’　１７ｍｏｌｅ、好ましくは１０８または１０”　ｌ／■ ｏｌｅのオーダーである。必要とされる値は、選択される部分が存在する環境、および随伴する物質との相対的な結合強度とその濃度に依存する。ある場合には、続く溶出が容易なため、低いアフィニティーが非常ニ適切またはむしろ好ましいが、しかしバラログが随伴する物質、特に高濃度で存在する物質とも強く結合する場合には、選択された部分からこれらの物質を分離するようにその結合を設定するために、高いアフィニティーが必要であり得る。

要約すると、それは、決定的となる随伴物質に対するアフィニティーと比較した、選択された部分のｍアフィニティーである。しかしながら、特異的アフィニティーは好ましくは、ｐｉまたは疎水性指数のような単独の一般化された性質から得られる結果であるよりもむしろ、選択される部分に対して相捕的なバラログに特徴的な、組み合わされた電荷／空間の配置の結果であるべきである。

標的物質または基質と「特異的に結合する置換基」という用語は、上記の「特異的アフィニティー」とは幾分異なる意味を有する。これは置換基が、あるクラスの基質を捕促回収する能力のことを指すが、そのクラスのメンバー同志を必ｆしも区別する必要はなく、好ましくは区別しない。従って、物質のサブセットに特異的に結合する置換基の例には、炭水化物および／または糖タンパク質に特異的に結合するボロネート残基；その補酵素を利用する酵素のクラスに選択的に結合する補酵素；およびその基質を利用する酵素に特異的に結合する、酵素の基質アナログ；が包含される。一般に、あるクラスの物質に特異的に結合する置換基は、クルードな混合物から所望の物質群をおおまかに同時に分離するために使用され、一方、クラスのメンバー同志を識別するためにはパラログパネルの系統的に変化させたパラメーターが用いられる。

置換基そのものが標的部分に結合する能力もまた、それが存在するバラログの構造にも影響される：従って該置換基を含有するバラログは、バラログが本来有する変化と、これらの変化する環境のもとて置換基が誘引する強度の変化との両者によって、あるクラスの標的部分のメンバー同志を識別する。

バラログに対する標的部分の結合アフィニティーの評価は、標準的な免疫学的方法を利用して行い得る。抗原と高アフィニティー抗体との相互作用のアフィニティーを測定する方法は標準的である；低アフィニティー抗体との相互作用は、例えばＴａｋｅｏ、　Ｋ、ら、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９７８）　１２１：２３０５−２３１０に記載のようにして測定し得る。Ｔａ　ｋ　ｅｏらは、ある種のオリゴサツカライドの特異的なミエローマタンパク質に対する結合定数を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、そしてタンパク質の移動度を測定する際にゲル中のオリゴサツカライドの性質および含有量を変化させて、測定する方法を記載している。

この方法はモル当り１０”ＩＯ’リットルの範囲の結合定数を得る場合に有用とされている。Ｖａｒｇａ、　Ｊ、Ｍ、ら、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９７４）　１１２：１５６５−１５７０は、相当する範囲での結合定数を、放射活性リガンドの結合を試験するために免疫グロブリンをグルタルアルデヒドで結合させたナイロン−ポリスチレンのウィスカーディスクを用いて、測定することを記載した。このように、結合を評価し結合定数を定量するために、マイクロタイターウ゛エルを用いた現行の標準的な希釈によるイムノアッセイ法に加えて、多数のプロトコールが存在する。

本発明は、パネルをスクリーニングして、免疫原性であり得るまたはあり得ない、広範な種類の選択された部分に対して特異的アフィニティーを有するバラログを得る手段を提供する。それ自身ペプチドであり、従って一次アミノ酸配列の配列上の重複部分に関して、「相補性」によるアプローチで個々のパラログを直接設計すること（Ｇｅｙｓｅｎの合成／分析方法に、＾ｔａｓｓｉの相補性設計アプローチを組み合わせた方法）を可能にする部分に加えて、結合させようとする部分はペニシリン、テトラサイクリン、ステロイド、ナブσ牛セン、テオフィリン、ビタミン、例えばビタミンＫＳ　ＤおよびＡ、のような薬物、様々な毒素、例えばＰＣＢ、ダイオキシン、およびテトラブロモエチレン、および特定の条件下で所定の分子立体配座または形状を有する任意のその他の化学物質を包含する、任意の起源のものであり得る。本発明の方法を用いて、事実上あらゆるタイプの部分またはそれらの所定の領域に対して、特異的なペプチドパラログが見い出され得る。

上述のように、パラログパネルはまた、バラログパネルそれ自身の中でクラスの個々のメンバーを識別する手段を提供すると同時に、同定される部分のクラスを回収する特異的な結合をする置換基も提供し得る。このアプローチの一つの応用として、ＤＬＩ　Ｆｏｎｔが米国特許第４．４９９．０８２号に開示したようなボロネート置換基が、例えば炭水化物それ自身および細胞表面上に見られるグリコプロティンを含むグリコプロティン、のような、炭水化物含有物質を選択的に結合するために使用し得る。カラムに固定化したボロネートは、例えばＭａｚｚｉｏ。

Ｊ、　Ｒ，ら、　ＢｉｏＣｈｒｏｍａｔｏ　ｒａ　ｈ　（１９８９）　４：１２４−１３０によって、グルツース含有分子の分離に関して報告されている。ボロネート残基は糖残基に含まれるシス　ジオールに特異的に反応すると考えられている。ボロネートのアフィニティーカラムは、正常と脱グリコジル化したヘモグロビンの分Ｈにも、Ｉ（ｌｅｎｋ。

Ｄ、Ｃ，ら、Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｗ（１９８２）２２：２０８８−２０９４により使用されティる。

ボロネートの残基は例えば上記に参照した特許に記載の、α−アミ／ボロネート誘導体化されたペプチド酸を利用することにより、容易にバラログパネルに含ませ得る。これらの化合物は弐Ｒ−ＣＨＢ（Ｏｔｌｈの残基に誘導体化されたＣ− 末端のアミド残基を有するペプチドである。この特許はさらに、　Ｃ１１２９（ＯＨ）２残基が窒素原子ではなく酸素原子に結合した従来技術のボロネートも参考としている。

同様に本発明に有用であるのは、ボロネート残基をＣ−末端アミド上の置換基としてではなく、側鎖に有するアミノ酸から、合成されるペプチドである。側鎖を誘導体化した改変したアミノ酸は、標準的な固相（あるいは液相）ペプチド合成で日常的に使用し得る。特異的に結合する置換基を含ませることは、本発明の方法を、クラス間で相違する結合によってグループのメンバー同志を識別し、そのことにより、相違結合が適用される群の系統的な回収を可能にすることに、適用することを可能にする。

ボロネートの使用はレクチンのような炭水化物結合性部分の、特異的結合置換基としての使用に類似している。これは、はとんどの細胞は表面の糖タンパク質により特徴付けられるので、細胞分離技術において特別な利点を有する。特異的に結合する置換基の包含は、次に、タンパク質、脂肪、等の他の成分を含有するクルードな混合物から、細胞を回収することを可能にし、引き続いて、バラログパネルの分別特性を用いて、集めた細胞を区別することを可能とする。バラログパネルの様々なグリコプロティン含有細胞に関する分別特性は、標的グリコース残基に特異的に結合する置換基の接近し易さの変化、およびパネル固有の多様性の両者の結果である。この一般的なアプローチの他の適用には、基質アナログを亜鉛イオン依存性のメタロプロテイナーゼを区別するのに使用するように、酵素の各クラスを回収するために補酵素または基質アナログへの接近のし易さを変化させることが包含される。

選択された部分に対するパラログを得ることは、ペプチドであれ非ペプチドであれ、候補のパラログペプチドの間でのスクリーニング手法によりアプローチし得る。このアプローチでは、他の物質と結合する能力に関する少なくとも２つのパラメーターについて最大に多様化された値を有する候補パラログのパネルが、スクリーニングのために調製される。このパネルは、従って、広範囲の電子雲パターンの変化物をカバーするように設計され、その結果、所望のパラログの近似体が得られる。その付近の別の候補を、微調製のためにさらにテストし得る。

理解されるように、パラログの他の物質に結合する能力を決定する電子雲パターンの範囲をカバーするために、少なくとも２つのパラメーターが、最大範囲全体でまたはそれより少なく変化させられなければならない。用語「最大範囲全体での変化」は、パラメーターが通常このパラメーターに見い出される有用な範囲をカバーする値を有し、その範囲が場合に依存し得ることを意味する。例えば、等電点ｐｌは、通常約２〜１２の範囲で変化し得る；この限界を超える理論値が確かに仮定され得るが、実際上、例えばｐ［Ｉ　Ｏに達するような点は殆ど存在しない。どのような種類の最大の変化が有用であるかは、当業者には明白である。

実際、トのパラメーターの値に有用な変化を有するパネルは既に存在する、クロマトグラフィー支持体は、例えばある範囲の疎水性で利用可能であり、イオン交換カラムがある範囲の荷電密度で利用可能である。

広範囲の結合アフィニティーをパネルに保証するために広（変化し得る、少なくとも２つのパラメーターの確認は、以下に詳しく記載するように、パネルの候補パラログの化学的性質に依存する。疎水性モーメントおよび波形因子のようなパラメーターは容易に候補ペプチドについて計算し得るが、例えば核酸のパネルは、ホモポリマー領域の数と間隔および対称性指数について変化し得る。誘導体化したポリサ・ツカライドは、側鎖および荷電分布が変化し得る。全ての場合にシいて、候補パネルは少なくとも２つのこのようなｌ＜ラメ−ターで最大に多様化し、こうして膨大な多様性を有するセットが誘導される。これは、唯一つのパラメーターが変化−１−るか（疎水性のみが変化するクロマトグラフィーの場合、またはｐｌのみが変化するアンホライト支持体の場合がこれに当たる）、または非常に小さな範囲にわたって特定されない変数値を有するか（例えば、シフロブ牛ストリンに晟づくクロマトグラフィー支持体、または染色色素に基づくアフィニティーマトリックスの場合）のどちらかである、従来のアプローチとは対照的である。

例えば、チバクロン色素のアナログである一連のアフィニティーリガンドに基づいた、タンパク質の分離に有用なりロマトグラフィー支持体を経験的に選択するためのキットが、ＩＣＮから市販されている。これらの色素は、非ポリマー性であり、非常に狭い範囲でしかその性質が変化しない。色素の非ポリマー性の性質のために、構成成分の性質の系統的な変化は、パネルのメンバー間にこのような広範囲の値を得る機会を与えない。これとは対照的に、本発明のパネルは少なくとも２つの特異的パラメーターにより特定された電子立体配置および電荷等高線地図によって、多様性の範囲が与えられる。

以下に詳しく記載するように、本発明のパネルの変化は３つの一般的方法で達成される＝２つまたはそれ以上のパラメーターの系統的な変化に基づいてパネルを設計する；相補的な最大に多様化された対向パネルに対して、ランダムに生成したパネルをスクリーニングする、これは系統的に２つのパラメーターを変化させた設計を介して達成される：または、ランダムなパネル同志で繰り返し行ったスクリーニングを統計的に分析する。この最後の選択枝は、２つのランダムなパネルのメンバーの交差反応に基づき選別した結果の「ブーツのストラップ」法であり、上記で参照したＰＣＴ出願ＷＯ３９１０３４３０に詳しく記載されている。

最大の変化を提供する能力の優れた結果は、色素に基づくパネルを以下の実施例６に記載の本発明のパネルとを比較することにより示される。

合成の観点から非常に好都合な一セットのポリマーは、ペプチドから構成される。なぜならば、天然に存在するコードされる残基およびその他の両方の、アミノアシル残基の特性は、ポリマー配列の群の合成に系統的な様式で非常に容易に組み入れられる範囲の特性を提供するからである。このようなペプチドは、もちろん、一般に認識されている方法を使用してアミド結合を他の形態に改変することにより、結合の性質をそれらが「疑似ペプチド」と見なされ得るように修飾し得る。特に、ペプチド結合は、当該分野に周知の方法により他のタイプの結合、例えば−ＣＨ２Ｎ［ｌ−１−ＣＨ２Ｓ−１−ＣＨ２ＣＨ２−１−ＣＨ−ＣＨ−（シスおよびトランス）　、−ＣＯＣｈ−１−Ｃｆｌ（ＯＲ）Ｃｆｈ−および−ＣＨ２ＳＯ−で置き換え得る。以下の参考文献はこれらの他の結合部分を包含するペプチドアナログの調製を記載している：５ｐａｔｏｌａ、Ａ、Ｐ、、Ｖｅｇａ　Ｄａｔａ（１９８３年３月）、Ｖｏｌ、１．　ｌ５ｓｕｅ　３．　−Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂａｃｋｂｏｎｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ＋（一般的総説）　：　５ｐａｔｏｌａ。

Ａ、Ｆ、、　ｉｎ　”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　Ｐｅｐｒｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−、Ｂ、　Ｗｅｉｓｔｅｉｎ、　ｅｄｓ、、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、　２６７　（１９ｇ３）　（一般的総説）：　Ｍｏｒｌｅｙ、　Ｊ、Ｓ、。

Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｅｉ　（１９８０）　ｐｐ、　４６３−４６８　（一般的総説）　；　Ｈｕｄｓｏｎ、Ｄ、ら、加重］」肛エユ匹上Ｒｅ５（１９７９）　１４：１７７−１８５　（−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−）；　５ｐａｔｏｌａ　Ａ、Ｆ　ら、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ　（１９８６）　３８：１２４３−１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）　；　■ａｎｎ、Ｍ、Ｍ、、Ｊ　ＣｈｅＩＩＳｏｃ　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ　１（１９８２）　３０７−３１４　＜−ＣＨ− ＣＨ−、シスおよびトランス）：　Ａｌｍｑｕｉｓｔ、　Ｒ，Ｇ、ら、　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｗ（１９８０）　２３＋１３９２−１３９８（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ、　Ｃ，ら、Ｔｅｔ　ａ　ｄ　ｏｎ　ｅ　ｔ（１９８２）２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；５ｚｅｌｋｅ、　Ｍ、ら、欧州特許出順環ＥＰ　４５６６５号（１９ｇｚ）　ＣＡ：９７：３９４０５　（１９８２）　（−Ｃ１ｌｌ（ＯＨ）ＣＨａ−）；　Ｈｏ１ｌａｄａｙ、　Ｍ、Ｗ、ら、ｈヵ１仙止四ＩＬｌｊｉｉ（ｉ９８３）　、Ｑ：４４０１−４４０４　（−ＣＨ（ＯＲ）ＣＨ２−）：およびＨｒｕｂｙ。

Ｖ、Ｊ、、　ハハ」旦（１９８２）　１１１８９−１９９（−ＣＨ２−５−）。

特ニーＣＨ２ＮＨ−１）Ｋ好ましい。

ペプチドはそれ自身は、例えば固相ペプチド合成の様な当該分野で良く知られた手段によって、化学的に合成し得る。

コノ合成は、α−アミノが保護されたアミノ酸を用いて、ペプチドのカルボキシル末端から開始する。他の保護基が適切である場合も含め、全てのアミノ基にｔ −ブチルオキシ−カルボニル（Ｂｏｃ）保護基が使用し得る。例えば、Ｂｏｅ− 保護されたＣ−末端残基をエステル化し、クロロメチル化されたポリスチレン樹脂支持体とし得る。このポリスチレン樹脂支持体は、好ましくは、ポリスチレンポリマーを特定の有機溶媒に対し完全に不溶性にする架橋剤として、約０．５〜２％のジビニルベンゼンを含有する、スチレンのコポリマーである。Ｓｔｅｗａｒｔら。

５ｏｌｉｄ−ｈａ　ｅ　Ｐ　ｔ゛ｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ　（１９６９）　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｒａａｎ　Ｃｏ。

、　Ｓａｎ　ＦｒａｎｃｉｓｅｏおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ　Ａｍ　Ｃｅｍ　Ｓｏｃ　１９６３）　８５：２１４９−２１５４を膠照。これらおよび他のペプチド合成法が、米国特許第３．８６２．９２５号、第３．８４２．０６７号、第３．９７２．８５９号および第４．１０５．６０２号にも例示されている。

合成は、手動の方法、あるいは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ　ＢｊｏＳｙｓｔｅｒａｓ　４３ＯＡペプチド合成機（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）またはＢｉｏｓｅａｒｃｈ　ＳＡＭ　ＩＩ自動ペプチド合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ、Ｃａ１ｔｆｏｒｎｊａ＞を、製造業者の提供する説明書の指示に従って、用い得る。

あるいは、ペプチドパラログは、良く知られた方法に従って調製された組換えＤＮＡ構築物の発現により産生じ得る。このような産生は大量に提供するために望ましく、そしてコードするＤＮＡの混合物を用いることにより、パラログの多数の実施態様が得られ得る。パラログの候補の複数のメンバーが産生されるが、混合物はただランダムなだけである。しかし、ペプチド配列は比較的短いので、組換え産生は容易である。完全にランダムなりＮＡ配列がパラログの合成に使用し得るが、一方、個々のヌクレオチド塩基ではな（トリプレットをランダムにすると、この方法はより効率的になり得る。加えて、組換え産生が特異的に設計されたパラログを産生ずるのに使用し得る。もちろん、これらのパラログは遺伝子にコードされるアミノ酸で構築されたものに限定されるか、あるいはこのようなアミノ酸から容易に形成され得るものに限定される。

ペプチドの環状型もまた一般に知られた方法を用いて得られ得る。クロマトグラフィーに適用するには、固相支持体に直鎖化合物を結合させた後に、分子内（分子間ではなく）の結合を推進するような環化反応を行うことが有利である。ジスルフィド結合は、システィンまたはシスティンアナロク残基を有するペプチドを、ジスルフィド結合を形成し得る試薬、例えば穏和な酸化条件で、反応させることにより形成される。

アミノ酸の側鎖を含むエステルおよびアミドは、適切な保護／脱保護プロトコールにより合成して得られ得る。脱保護に必要な条件はｇ！、護基によって変化することは理解される。Ｆ−■ＯＣは有機塩基であるピペリジンにより脱離するが、側鎖保護基は一般に塩基に安定な基で保護され、希トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に不安定である。他の一般に用いられる保護基ｔ−ＢｏｅはＴＦＡにより脱離するが、他の側鎖保護基は、例えば７ノ化水素のようなより強い条件での処理にのみ不安定なものが使用し得る。従って、保護試薬は、その基の相互作用が骨格鎖を形成する基から、除去され得、一方、側鎖のカルボキシル、アミン、およびヒドロキシル基、例えばリジンのアミン基、アスパラギン酸のカルボキシル、およびトレオニンのヒドロキシル基、がペプチド合成の間の脱保護に安定な基で保護される。ペプチドが合成された後、ペプチド鎖に例えば３〜４残基離れて存在するアミノ酸上のこれらの基の脱保護を行い、次にシンクロへ牛ジルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような標準的ペプチド結合形成試薬を用いた処理の結果、これらの３〜４アミノ酸の分子内ループを生じる。バラトープを模倣し、あるいは特異的結合を示す環状型のペプチドは、本出願人の１９８９年５月ｌＯ日に公開されたＰＣＴ出願ｆＯ＆９／９（１２３３に記載のように、「分子接着」の使用を介して三次元フンホメーシコンを制御することで得られ得る。また、例えばＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒａｃｋｔｏｒｄ、ＩＬから市販されている、ホモまたはへテロの二官能性リンカ−を用いて架橋を行い得る。

（以下余白）ペプチドバラログの別の改変では、個々のアミノ酸残基は、立体配座の拘束を導入したペプチド様部分により分離し得る。

例えば、下式の「アミノアシル」モノマーは、ペプチド合成時に「正常な」アミノアシル残基の開に使用し得る。

最大の変化が得られるためのパラメーターの選択は、バラログの性質に依存する。ペプチドであるパラログでは、あるいは、変化させた結合を有するペプチドおよび／または上述したそれらの環状型のペプチドのようなペプチドと関連した化合物では、少なくとも７種のそのようなパラメーターが変化のための有用な候補である。これらのパラメーターの内の２つは、すなわち疎水性指標および等電点は立体配座にはあまり依存しない。これらの内の５つは、立体配座に依存し、疎水性モーメント（ペプチドの両親媒性または極性および非極性残基の分布の非対称性の尺度）；側鎖の双極子モーメント電荷の分布の非対称性の尺度）；波形因子（本発明者により定義されるもので、表面の輪郭、例えば、らせんのバックボーンに沿った大きなｇｌｌｔａの分散および分布、の変化を測る）；芳香性（パラログに含まれる芳香族残基間のπ−π相互作用の尺度）；および荷電原子間の直線距離が含まれる。これらのパラメーターを、順に議論してゆく。

等電点ｐ＋は、その公知の慣用的な意味を有し、対象の分子が電気的に中性であるｐＨを指す。ｐＩは、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような、中性ｐＨで正に荷電している塩基性アミノ酸の数を増すことにより、より高い値に変更し得る。

ｐＩは、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような中性ｐＨで負に荷電している酸性アミノ酸の相対的な数を増すことにより、より低い値に変更し得る。正および負に荷電している基を均衡させることにより、または非荷電アミノアシル残基を使うことによって、中間のｐＩ値を達成し得る。遺伝子にコードされるアミノ酸は、参考とすることが簡便なために使用したが、任意な適切なアミノアシル残基が、遺伝子によりコードされているかどうかにかかわらず、天然かどうかにかかわらず、および、ＤまたはＬまたはメソ型であるかにかかわらず、使用し得ることは、もちろん理解される。

構造と関連付けた疎水性指数の議論は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｄ、Ｒ，Ｍ、ら、Ｆａｒａｄａ　Ｓ　ｔｍ　Ｃｈｅｔａ　Ｓｏｃ　（１９８２）　１７：１０９ −１２０およびＪａｎｉｎ、　Ｊ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）　２７ユ：４９１−４９２の中に見い出し得る。もちろん、この疎水性に関する指数は、フェニルアラニン、バリン、インロイシン、その他のような疎水性残基の数を増すことにより、変化し得る。より低い疎水性指数への変更は、親水性または荷電アミノ酸を使用して行い得る。この疎水性モーメントは、ペプチドの両親媒性の特性によって決定され、残基の周期的疎水性を調節することにより、変化させ得る（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｄ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８４）　８１：１４０−１４４；　Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｄ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２＞　２９９：３７１−３７４＞。両親媒性の特性は、ペプチドの２次または３次立体配座に関係し、ある分子が水溶性であり、他の分子が疎水性であるという、分子の特性または外観に現れる。この特性および残基の立体配座を考慮に入れると、このパラメーターは、容易に調節し得る。側鎖の双極子モーメントは、正または負に荷電したアミノ酸残基の存在または配置による電荷パターンを反映する。

波形因子は、大きな置換基の分布および表面輪郭上でのその影響を反映する。

より詳細には、疎水性指数（ｈｉ）は、ペプチド中のアミノ酸の、アミノ酸構成成分の個々の疎水性指数の和である。ｎ個のアミノ酸のペプチドについて数式化すると、下式になる：ｉ＝１立体配座に依存するパラメーターは、それぞれの場合に、適切な特性関数のフーリエ変換演算子、すなわち周期の周期性の成分の強度δを用い、同様なアプローチにより計算し得る。ここで「δ」は、α−へワックス（１００°）またはβ− シート（１７０’　）に一致するように定義される。適切なδ値は、ペプチドに通常仮定される立体配座に依存するか、あるいはペプチドの設計者に制御される値を採用する。

しかし、１つのセットのメンバーの中での付与したパラメーター間の一般的な関係は、立体配座についてなされた仮定に関わらず、あまり変化しない。従って、セットの全てのメンバーが、例えばα−へワックス立体配座であると仮定して上記パラメーターを計算すると、パターンについて得られる多様性は、たとえペプチドが実際にはα−へソックスの形でなくても、あまり変化しない。この結果は、通常の意図した立体配座を得るためには不十分な長さの非常に短いペプチドに関する場合、特に重要である。

従って、疎水性モーメント（ｈ■）、双極子モーメント（ｄａ）、および波形因子（ｃｆ）の、３つのパラメーターの計算は以下のように示される：（ｐ＾千４〇；０ンここで、ｈ−の場合、Ｈはｈｉであり、ｄａの場合、■はｐＨ７での全体的な電荷であり、ｃｆの場合■は体積である。

上述したように、これらのパラメーターを次に計算するのに必要な、コードされるアミノ酸の特性値を計算するのに必要な個々のアミノ酸の特性値を、表１に示す。

（以下余白）コルよＬユＡｌａ　Ａ　Ｏ，２５Ｘ　Ｏ９Ｌ５　６Ａｓｐ　Ｄ　−０，７２コＪ６　−１　１２４．５　６Ｇｌｕ　Ｅ　−０，６２４，２５−１１５５，１６Ｐｈｅ　Ｆ　Ｏ，６１Ｘ　Ｏ２０３，４４Ｇｌｙ　Ｇ　Ｏ，１６Ｘ　Ｏ６６，４７Ｈｉｓ　Ｈ −０，４０６，０＋０．１　１６７、コ　コニ１ｅ　工　０．７：ｌ　Ｘ　Ｏ１６８，８４Ｌｙｓ　Ｋ　−１，ｌＯ１０，５３＋４　１７１３　７Ｌａｕ　Ｌ　Ｏ，５３Ｘ　Ｏ１，６７，９７Ｍａｔ　Ｍ　Ｏ，２６Ｘ　Ｏ１７０，８２Ａｓｎ　Ｎ　−０，６４Ｘ　Ｏ１コ５．２　４Ｐｒｏ　Ｐ　−０，０７Ｘ　Ｏ１２９，３５Ｇｉｎ　Ｑ　−０，６９Ｘ　Ｏ１６Ｌ１　４Ａｒｇ　Ｒ−１７６１２，４８＋１　２１０．９　４Ｓａｒ　Ｓ　−０，２６Ｘ　Ｏ９９，１ＢＴｈｒ　Ｔ　− ０，１８Ｘ　ＯＬ２２．１　６Ｖａｌ　Ｖ　Ｏ，５４Ｘ　Ｏ１４Ｌ７　６Ｔｒｐ　Ｗ　Ｏ，３７Ｘ　Ｏ２３７Ｊ　２ＴＹｒ　Ｙ　Ｏ，０２１０，０７０２０３，６３ＣＤ１′″Ｆ−偉ｂ）第６のパラメーターである芳香性は、芳香族アミノ酸を含有させることにより提供され、そのようなアミノ酸には、天然のアミノ酸では、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、これらの天然残基のＤ型、およびＰ−アミ７安息香酸およびフェニルまたはナフチル−β−アラニンのような他のコードされないアミノ酸がある。被分析物に遭遇した場合、得られたバラログの芳香性は、芳香核の間のπ−π相互作用が電子震配置を変化するので、含まれている芳香族残基の数のみでなく、分子の立体配座にも依存する。芳香性は、それ自身芳香性の性質の物質を分離するとき、特に重要な特性である。下記の実施例９で説明されるように、環境保護委員会により特別の問題として指摘された１１のフェノール含有汚染物のクラスの様々なメンバーは、芳香性を有するバラログを使用して、都合良く分離および同定ができ、そして適切なバラログがパネル内の前記芳香性の変化により同定し得る。

第７の変数である荷電原子間の距離もまた、立体配座依存性である。予期される立体配座および荷電した基の性質に基づくコンビコーター設計のモデルを、予め決定された配置を有するバラログを設計するために使用し得る。この変数は、ペプチドに応用し得、また誘導体化した炭水化物にも応用し得る。事実、ペプチドに基づくバラログは、よく知られたりａマドグラフィーの支持体であるジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）　（離れた正の荷電を提供する）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭ）上の様々な複数の荷電部分を模倣し、あらかじめ決定された配置の負に荷電した原子を与えるように、設計し得る。配置のそのような変化は、サイズ分別法に基礎を提供、および様々なりＮＡ断片のようなポリマー性荷電分子の分離に、特に有用である。

ペプチドバラログの設計はさらに、α−ヘリックスの形成を促進し、そして立体配座を安定化させるシスティン残基間のジスルフィド結合の形成をするα−アミノイソ酪酸（ＡＩＢＡ）の能力、特定残基の既知の特性を利用し得る。バラログは非生物学的技術を使って合成し得るので、所望する特性を賦与するのに有利な、特異的に設計された側鎖を有するアミノ酸またはそのアナログが使用し得る。

最初の候補パネルは簡便にするため、約９０−１００ペプチドまたは関連する化合物から構成し得る。これは、市販のマイクロタイタープレートおよびタンパク質合成機のロフト（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）全体のデザインを反映し、所望のバラログの特性を作成する充分な個々の試験を提供するために便利な数である。この合成は、従来の、通常得られる方法を使って行われる。

選択されたパラメーターに最大の多様性を有するセフ）を設計するためにい（つかの方法を使用し得る。１つのプロトコールでは、例えば最初に形成されるバラログは、各位置がランダムに選択されたアミノ酸を有する。次の候補もまた、ランダムな選択により構築され、２つあるいはそれ以上の測定され計算されたパラメーターについて、最初の候補との差異が比較される。これらのパラメーターに実質的な違いがあるかどうかにより、この候補ペプチドは残されるか、あるいは棄却される。より多くの候補がテストされるにつれて、その候補が、セ・７トの中で既に保持を保証しているものに充分近い特性を有する可能性、および、構成要素がセット中に残される前に形成されスクリーニングされる必要のある候補の数が、当然大きくなる。このプロセスは、最後の１つが受け入れられた後に、多くの候補を試験しても受け入れられなくなるまで、続（。一般に、予期されるパターンは、下記のように示される。

ここで、形成および選択のプロセスは、表示されている領域のどこかで、停止する。

４８８！の最終パネルを得るためには、手による最終の細かい調整を可能とするために、約９６の種々の候補を最初に与えることが好ましい。例えば、バックボーンの双極子モーメントと比較した、側鎖の双極子モーメントが、考慮し得る。

全ての変化させたパラメーターで特性の分布が存在するように、すなわち、Ｘ値をグラフ上の゛ｃｕｍｂｅｒｓｏｍｅ−領域より決定し、各ペプチドが他の全てと最低Ｘ％（０〜１００の単位スケール範囲に規格化した後）異なるように、最終パネルを再び見直すべきである。従って、各ペプチドは、２つあるいはそれ以上のパラメーターの少な（とも１つに関して、セット中の他の全てのペプチドと実質的に違う。このアプローチは、計算が合成よりも簡単であるために有利である。しかし、完全な多様性は、立体配座の熱による変動により、決定できない部分がある。

平均６個のアミノ酸からなる、３０のポリペプチドの多様なセットの調整のための、このアプローチの実践のためのコンピューターによる減少の結果を、図１に示す。この例では、５つの全てのパラメーターが評価された。このプログラムは、ランダムなペプチド配列を創製し、そのために５つのパラメーターを計算し、以前創製された配列に類似する特性を有するものは棄却した。各パラメーターの至適な値を確立する試行の後、５つの範囲の全てを３つに分割し、その結果、３５で定義されるすなわち２４３の特異な特性の組み合わせ（−ｂｉｎｓ−）が確立された。提案された６°厘ｅｒｓの最初の約２００のランダムな配列から、２４３の内の５０ｂｉｎｓが満たされた。続いて次の５０を轡たすためには、約２．０００以上の別の配列を試験することが必要とされ、そしてさらに別の何千もの配列は、はんの約十個の新しい組合せの創製にしか寄与しない。ランダムに創製された配列の独立した複数のセットで、同じサブセットのｂｉｎｓが満たされることが見いだされ、このことは、全ての組み合わせがこれらのモノマーで物理的に達成されるわけではない、例えば、１つのペプチドが同時に高度に疎水性でかつ高度に荷電し得ない、ことを意味する。

図１に示したように、等電点および疎水性の変化は、Ｘ軸およびＹ軸に従って、それぞれプロットされる。菌内の記号は、疎水性、体積、荷電の各要素の分布を示す立体配座依存性のパラメーターが、Ｘは高、波線は中、モして０は低であることを示す。従って、この図は、ランダムなセットが都合良く設計されることを示している。

前述したように、コンピューターによる設計即ち系統的な設計に関して、ある種のありえないパラメーターの組み合わせが存在する、例えば、同じパラログが、同時に高度に荷電されかつ高度に疎水性では容易にありえない、ことが認識されている。適切な数のペプチドのみが、上記の結合に関連する全ての既知の特性を良くカバーするものを提供するために必要とされることが見い出された。これは、ペプチドと抗体の相互作用の結合にはほとんど影響を与えずに、天然のアミノ酸配列の膨大な変化が可能であるという以前の研究と一致する。Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ，Ａ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２＞２９９：５９２−５９６；　Ｇｅｙｓｅｎ。

Ｈ，Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８４）　８１：３９９８−４００２゜ペプチドのあるいは他のパラログパネルの最終的選択は、例えば５元または７元のペプチド空間の、近づき易い部分の、サンプリングの均等性を改善するために、一般に機械を用いずに行われる。

多様なパネルの調製のための第二のアプローチは、アイソエレクトリックフォーカシング用の両性電解質の調製に使用されるものと類似している。これらの両性電解質を調製するために、典型的には、負電荷を与えるためにはスルフォネート、そして正電荷を与えるためにはアミノ官能基である荷電官能基に連結させることにより、デキストランを誘導体化スる。この反応でランダムな分布の誘導体が製造される。得られた両性電解質は、次に単一のパラメーターｐ■のある範囲で、アイソエレクトリックフォーカシングにより選別され、リガンドが得られる。

この別のアプローチを本明細書の発明で応用するために、この化合物はランダムに合成されたポリマーであり、次にそれらのポリマーは、少な（とも２つのパラメーターの設計された系統的な変化で調製される、最大の多様性のセットを有する候補パラログと結合するそれらの能力により、分離される。従って、例えば上述したように、ペプチドまたは候補パネル部分としてのそれらに関連した化合物を使用して、最初のあるいはモデルの多様性パラログパネルをいったん設計すると、このパネルの多様性は、非ペプチド成分のポリマーを含む他の物質の混合物を、このランダムな混合物のメンバーとモデルパラログパネル中の各候補ペプチドとを特異的に結合させることによって、多様なセットに分離するために使用し得る。これにより、モノマーユニ、トの変化によるランダムに変化し得る、膨大な多様性を宵するパネルの合成がポリマーに対しても可能となるが、そのポリマーに対して、それらの化学的タイプに関連した特定の２つのパラメーターの分析的評缶は困難である。

従って、ペプチドの場合には、芳香性パラメーターおよび電荷間の直線距離の系統的な直接計算は、他の５つのパラメーターの分布の計算よりも実行に値し、これらの特性に多様性を有するパネルは、これらの特性の変化を有するランダムに創製された候補の中から、例えばｐｌおよび側鎖の対称性によるパネルの多様性を使用して、分離し得る。

この方法の範囲には、２つのランダムに創製されたパネルの相互作用の繰り返しを含む。多様性が両方に付加されるようにするため、パネルを交互に、互いに他に対してチェックする。例えばパネルＡからの各候補は、パネルＢに関してプロフィールを作成される。以前試験された候補と類似のプロフィールをもつ候補は、棄却する、あるいは、別の言い方をすれば、パネルＢに関して類似のプロフィールを有する候補のグループの内の、多くて１つが残される。これによって、多様で、そしてメンバーの数を太き（減少させたパネルＡ°が得られる；次にパネルＢを、今や多様となったパネルＡ゛でスクリーニングし、そして同様な選別プロセスで、類似のプロフィールを宵する１つのグループの候補メンバーのみがパネルＢ°に残される。一般に、パネルＢ°は、パネルＡ゛よりも広い範囲の多様性を有する。このプロセスを次に逆転し、パネルＢ“に対して残っているパネルＡ゛のメンバーラスクリーニングし、そしてこのプロセスを、所望の度合の多様性が得られるまで続ける。簡潔に言えば、最初候補パネルは、計算によるか、または単に多様性の大きいセットからのランダムな選択によるかのいずれかで、得られる。この多様性の大きいセットは次に、最初のセ・／トに対する異なる結合により分類される：このセットの充分に分離されたメンバーは次に、最大の多様性を有するセットへの次の近似として使用される。

パラログはペプチドまたはそれらの近縁物すら構成される必要はないと、以前に記載した。ペプチドに関して上述した特性に類似した少な（とも２つの尺度に多様性が得られる別の実施態様もまた使用し得る。唯一の必要条件は、パラログがその特性を系統的に変異し得るように、可変部分から構成されなければならない、という点である。例えば、核酸配列は、様々なタンパク質に対して、翼なる特異的結合特性を有することが知られている。事実、遺伝子発現の調節は、遺伝子物質中の特定の配列に特異的親和性を有する、これらの特異的結合タンパク質により起こると理解されている（例えば、Ｔｊｉａｎ、　Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）　２４５：３７１−３７８を参照）。ｐｌおよび疎水性指数のようなペプチドの多様性に関連した多くのパラメーターが、この場合には変更が難かしく、範囲内の値が都合よく作成し得るＧＣ／ＡＴ比のような他のパラメーターを作りた。全体的なＧＣ／ＡＴ比に加えて、１本鎖上でのＧＣと訂の配置および変化、　（ＡＡＡＡおよびＧＧＧＧのような）ホモポリマーの伸張の数および配置、および鎖の中の対称領域の性質および配置もまた変化し得る。対称領域の場合、例えばＧＡＴＸＡＴＣのような相補型（ａｙａｄ−ｔｙｐｅ）の対称性（パリンドローム配列とよく誤認される）を示すものは、塩基対形成による鎖内ルーズの形成をすることが知られており、幾つかの制限酵素を含むダイマータンパク質によって認識される部位の中でも、また特徴的であることが知られている。

ＧＡＴＴＡＧのような本物のパリンドロームは、特性に異なる効果を有する。前述したものは多くのパラメーターを提供し、どのような場合でも、それらのうちのどの２つも本発明のパラログパネルを製造するために最大に変化させ得る。核酸は容易に合成されるので、候補パラログとしてこれらのボッマー化合物を使用することには、大きな利点がある。また、核酸／タンパク質の特異的相互作用が起こることが知られているので、ランダムに構成された核酸混合物を、前述の多様なペプチドパネルの個々のメンバーへの結合によって、分離し得る。

さらに、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）の宵月性は、タンパク質を含む任意の標的分子に特異的に結合する、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列の合成を可能とした。従って、候補パラログの最大の多様性のペプチドパネルに対応する逆のパネルは、これらの方法（７ｕｅｒｋ、　Ｃ１ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）　２４９：５Ｏ５−５１０；　Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、　Ｈ，Ｄら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９９０）　３４６：８１８−８２２）を利用することによって構築し得る。このプロセスもまた、繰り返し得る。異なるペプチドのパネルへの候補核酸の結合は、より多様な第２の核酸パネルを与える。

予め決定された配列および随意な配列の核酸ポリマーを構築する方法は、充分に確立されている。原理的には適切なりＮＡフラグメントを、天然材料から分離し、本発明の方法に従って使用し得るが、必要な多様性を有する新規な特性を持った核酸配列を設計および合成することが明らかに好ましい。市販の方法には、本発明のパラログを現すのに充分な長さ以上のＤＮＡフラグメントの、固相に基づく合成を含む。

同様なアプローチは、ポリエチレンとポリエチレングリコールとのサブユニットの組合せのように、親水性と疎水性の成分のコポリマーによって形成されるもののような、別の形態のパラログの調製に都合がよい。別の親水性／疎水性またはメタクリル酸のような潜在的に荷電したモノマーユニットは、これらの構築物の中に使用し得る。例えば、ＰＥＧとポリ塩化ビニルのコポリマー、およびメタクリル酸とプロピレンのコポリマー、などを形成し、そして次に、最大の多様性を有する実施態様に分離し得る。

同様に、炭水化物をは、様々なランダムな水準で、硫酸およびアミンのような荷電基で誘導体化し得、そして、ｐＩのみではないそれらの多様な特性によって分離することで、これらのセットに、例えば置換クロマトグラフィーで使用するための、より細かい分別能力を与え得る。様々な特性を有するホスホジグリセリドもまた構築し得る。

もちろん、パネルメンバー中の多様性は、全てのパネルメンバーが同じ一般的属性、即ちペプチド、炭水化物、核酸など、であるとき、最も簡単に計算し得るが、目的が、記号の操作ではなく、電子雲パターンに最大の多様性を有するパネルであるため、なぜパネルがこれらの代表的なパラログタイプの混合物を使用して構築され得なかったのか、理論的な理由はない。従って、選択されるパラメーターの多様性が維持される限す、パラログ候補パネルは、ペプチド、炭水化物、コポリマーを合理的に包含し得る。

従って、簡便に利用し得る最も所望するパラログを得るためのスクリーニングのプロセスにかけ得る最大の多様性を有するパネルを提供することが、本発明の機能である。このパネルは、スクリーニング法を行うためのキットとしてパッケージし得る。そのようなキットのさらなる詳細は、下記に示したスクリーニング法の記載の通りである。

エムＬユニ二り基１つのアプローチでは、最も有利な候補パラログのためのパネルのスクリーニング法は、繰り返し使用し得る。なぜなら、特異的親和性の検出に使われる、結合に基づくアッセイが、一般に可逆的であり、その結果試験組成物を引き続き、固形支持体に結合したまま残るパラログパネルから、実質的に除去し得るからである。そのようなアッセイを回収可能な形態で、または固形支持体に結合して行う必要はないが、そうすることは非常に便利である。

パラログをクロマトグラフィーのアフィニティーリガンドとする、一つの意図された使用法では、再利用できることは、特に便利である。なぜなら、一連の提案された溶出溶媒システム中で、相対的結合強度を系統的に試験し得るからである。

例えば、上昇していく濃度のメタノールを含む一連の溶液、または溶出グラジェントをシミュレートした上昇する塩濃度の溶液中での結合強度が使用し得る。このタイプの試験では、多（のパラログの挙動の比較を、多くの溶出条件下で、経験的に試験し得る。パラログＹを、ただ１つのみの溶媒または温度条件で試験した場合に、好ましい特異的アブィニティーレベルを有するようであっても、パラログＸで得られた結合アフィニティーグラジェントが、所望する溶出条件下で、パラログＹで得られた結合アフィニティーグラジェントよりも好ましいものであり得ることは非常に重要なことである。・従って、テストパネルの再使用可能性は、クロマトグラフィー法の使用をシミュレートした１つのパターンの条件下で、最良のパラログの選択を可能とする。

このパネルは試験のために作成されているが、このパネルを次に、選択された部分に対するメンバーの特異的アフィニティーに関して試験する。理論的には、その部分を標識し、パネルの個々のパラログメンバーに結合した標識の相対量を゛検出することによって、直接行い得る。このアプローチを用いて、図２に示したものと類似したパターンが得られる。図２に示したように、パネルの各メンバーに結合した標識の量（Ｙ座標）は、パネルのメンバー全部（Ｘ座標）に対して示される。標識量の変動が、その部分に対する各パラログのアフィニティーに依存して得られる。酵素活性のような「標識」または、部分の他の検出可能な特性もまた使用し得る。

この検出方法の代替法は、ある場合には、より実際的である。この代替法では、特異的アフィニティーは、未標識部分と、標識したペプチドまたは他の適切なリガンドとの競合によってアッセイされる。部分が存在しない場合には、標識した混合物自体により全てのパラログに過剰のまたは過少の等価な結合が得られるように、この混合物は充分な量のメンバーを含まなければならない。パネルのメンバーに対する未標識物質の結合の検出のための、この一般的なアプローチは、１９８９年４月２０日に公表された、ＰＣＴ公表ＷＯ３９１０３４３０に、より詳細に記載されている。

要約すると、必要な数ランダムなリガンド（おおよそ、５００−１０００のオーダー、しかしより少ない数で充分な場合もある）の混合物を、適切な方法で標識し、例えば、ペプチドの場合は、Ｂｏｌｔｏｎ、　Ａ、Ｅ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　（１９７３）　５２９−５３９に記載され、そしてＩｃＮ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販の１２５１を用いる７　シ）Ｌｒ　Ｅつ素化法、を使用して標識される。混合物は、個々のメンバーを合成し、そしてそれらを混合することによって直接に調製し得、あるいはより簡便に、大きなタンパク質あるいは他のポリマーをランダムな小さなペプチドまたは池のオリゴマーに加水分解して、Ｒ復し得る。１つのアプローチは、例えば、イースト溶解物のトリプシンによる部分加水分解物（Ｃ１ｅｖｅＩａｎｄ、　Ｄ、Ｗ、ら、Ｊ旧ｏＩ　Ｃｈｅｗ　（１９７７）　２５２：１１０２−１１０６）を利使用している。この方法は、混合物として標識し得、または例えば、ＳＤＳゲル電気泳動を使って分離し、それらの結合を個々にアッセイ場合には、１ｍｍｕｎｏｄｙｎｅ（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｗ、Ｎ、、Ａｎａｌ　Ｂｉ。

ｃｈｅ＋ｏ　（１９８１）　１１２：１９５−２０３）のようなテスト支持体に転写し得る、多数（のペプチドを提供する。

パネル中の全ての候補バラログに関して、充分な結合が起こることを確認することが、標識リガンド混合物を利用する際に必要である。パネル全体にこの等価な結合を行わせる条件もまた、経験的に確立しなければならない。完全な状況では、リガンド混合物は、図３Ａに示したように全てのパネルメンバーに均等に結合する。しかし、もっと頻繁には、図３Ｂに示したように、類似のレベルの結合のみが見られる。このことは、被分析物と競合させるための、完全に有効な基礎を与える。競合物を付加した場合の結果の解釈は、結合値を、競合を評価する前の同じ値に規格化することによって、単純化し得る。

標識したりがノド混合物が、選択された部分が存在しない場合に全ての候補リガンドにおおよそ等価に結合する、あるいは同様の結合が標準化された場合、被分析物のような、所望する部分の存在下でスクリーニングを繰り返す。この部分に対する特異的親和性を育する、それらの候補は、標識したリガンド混合物との複合の低下を示し、この低下はこの部分に対する候補の特異的アフィニティーに比例する。典型的な競合のパターンを、図４に示した。両座様の意味は、他の図と同様である。しかし、選択された部分に最大のアフィニティーを有するバラログは、この図が、パラログに対する選択された部分と標識リガンド混合物との競合を示しているので、最低のレベルの標識を示す。部分が競合する能力を評価することで、標識の取り込みに最大の減少を示すパラログを、選択された部分との結合に最も好ましいパラメーターを有するものとして、選択する。

このスクリーニングのプロセスを、最終的に選択されるパラログの分子形態および電荷分布パターンを微調整するために、最初のパネルで最大の特異的アフィニティーまたは最も望ましい溶出パターンの挙動を示したメンバーの特性の中間ニングは、要求される特異的アフィニティーの度合いまたはクロマトグラフィー挙動が得られる迄、任意の数のパネルで、任意の数の回数、繰り返し得る。バラログパネルの電子雲パターンは、選択された部分に対するパラログのアフィニティーを最適化するために、系統的に操作し得：もしこのパラログをクロマトグラフィー法でアフィニティーリガンドとして使用する場合、親和性が大きすぎて溶出が困難なものは望まれ得ず、適切なパターンが選択されるべきである。立体配座制御の効果もまた、前述したように、使用し得る。

別の実施態様では、パラログは、固体支持体への連合により、それらの意図した使用をシミュレートするための方法でハノケージし、支持体を次に図５に模式的に示したように、クロマトグラフィーのミ二カラムとしてパッケージする。多様な候補バラログを提示する所望の数のカラムをは次に、タンパク質または所望する被分析物を含む他の混合物と接触させる。通過容積を捨て、次にカラムを、濃厚塩のような適切な溶出溶媒で溶出する。溶出液を次に、目的の被分析物が存° 　在するかしないかに関して検査する。

図５に示した画では、溶出液を、タンパク質混合物からの被分析物吸着のパターンを調べるために、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。図に示したように、多様なパラログのセットは、テストサンプルとして使用した複雑な混合・物から、興なるタンパク質を吸着および溶出し得る。

図６は、図５中に最も単゛純な形態で略示したアプローチの模式図を、同様に模式的に、しかし幾分詳細に示している。

図６に示したように、サンプルを、図６０に示したように、小型゛クロマトグラフィーカラムのセットがついたマイクロタイ多−プレートのウェルの中に、所望ならば複数のピペットデリバリ−チップを使って入れる。これらのミ二カラムを、これも図６Ｃに示したように、通過液を１回集するための別のマイクロタイタープレートと並置する。図６Ａに示したように、サンプルを入れた後、未結□合の）、ラフシラン、を、液体をミ二カラムを通して受容プレートに押し出すためにプレート層を遠心し収集する（図６８）。未結合のフラクシヨンを、所望ならば保存し、あるいは捨てる。このミ二カラムを次に、任意の都合の良いバフファーまたは他の溶出液を使用して溶出し、そしてその溶出液フラクシヨンを遠心によって回集する。未結合のフラクシヨンを含む通過容積および吸着したフラクシヨンを含む溶出液の、いずれかまたは両方を、示したように平行サンプルを使ってＳＤＳゲル上で分析し得る。ゲルを展開させるための任意の方法が使用し得；銀染色が、その一般的な適用性のために、好まれる。

底部が膜製のマイクロタイタープレートは、例えばＰａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから、市販されている。これらのマイクロタイタープレートは、ウェルの底部に、固体支持体の沈澱層を支持し得る膜を含む。この膜は真空あるいは遠心分離によって圧力差が付加されない限り、流体を透過させない。したがって、ウェル中の吸着剤は、適当な溶液を加え、その後必要な圧力勾配を生じさせて溶液をカラムに通過させることにより、擬似クロマトグラフィーのカラムとして試験され得る。

このアプローチをイーストの加水分解物および一連の６つのパラログのカラムに適用した結果が図７に示されている。

この図示された実験においてはイースト（Ｓｉｇ＋ａａ　Ｙ−２８７５）の全細胞のライゼートをＤＥＡＥセルロースで部分的に精製し、５゜からｌ５Ｏａ＋Ｍの間のＮａＣｌでＤＥＡＥに結合した部分を単離し、ｌｏｎｇ／ｌでそして１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩバッファー、ｐＨ７，５に対して透析した。沈澱層１１当り２μ■ｏｌのパラログで誘導されたＡｆｆｉｇｅｌ　（ＢｉｏＲａｄ）の一連のミ二カラム中で、０．１５ｔｌのベッドボリュームに１００μｌのサンプルを適用した。結合していないタンパク質を洗い流した後、カラムを２５０ｍＭのＮａＣ１で溶出し、そして結合タンパク質のパターンをＳＤＳゲル電気泳動によって分析した。

図７のレーン１はカラムにロードした物質から得られたパターンを示し；レーン２は誘導化しない支持体をカラムに用いた場合の混合物の溶出の結果を示し；実際にはタンパク質は何も溶出されず、電気泳動のゲルは６５ｋｄにおいて共通した２重縞の銀染色の人工的産物を示した。

この人工的産物は、遍在するケラチンタンパク質と酸化されたジチオスレイトールと結合によるものと考えられている。

残りの６つのレーン３−８の結果から、異なるタンパク質が異なるパラログに吸着および溶出されることがわかる。

試験するパネルについての他の立体配置もまた、熱論使用し得る。

本発明のスクリーニングの方法を、種々の治療用、分析用、診断用および他の適用に使用し得る特定のパラログを確認するために使用するのに加え、このスクリーニングの方法を分子間の相互作用を示すマトリックスを作成るのにも用いる。

したがって、あらゆる所望の変化を有する別のパネルに関しての、全パネルにわたる反応性のパターンから、この相互作用の強度を示す多数のデータの点が生み出される。例えば、１５メンバーのパラログの候補パネルを１５メンバーの試験パネルと交差反応させると、相互作用の強度の変化を説明する構造形態に相関し得る２２５個（１５２）のデータの点が生じる。相関係数を計算し、そして利用可能な最高の多様性を保持したサブセ・ｌトの選択に使用し得る。このような交差結合表はまた、交差反応パネルに関して１つのパネルの全てのメンバーが一様に結合するのが望ましい、図４に示されるような競争的結合のパネルの調製においても、有用である。

されたパラログの選択された部分に適切で特異的なアフィニティーを有するパラログが本発明の方法に従って見い出されると、この特異的アフィニティーが必要とされる状況の全てで、選択されたパラログの適用は適切である。汚染物質から被分析物を分離するための、クロマトグラフィーの支持体上に特異的に結合するリガンドとしての利用に加え、選択された部分に特異的に結合するパラログの能力を、パラログを、この驚異的相互作用に依存したイムノアッセイに類似したアッセイで特異的結合試薬として用いることにより、使用され得る。

加えて、選択された部分がレセプターあるいは池の生物学的な標的であれば、パラログは種々の薬理学用および治療用への適用、例えばＱＳＡＲおよびコンビニ −ターによるモデルの作成のために、情報およびデータを提供する、に有用である。

目的の分析物に対して満足な特性を有するパラログが選択される、クロマトグライーに使用する場合、パラログを、この技術分野で周知の一般的な手段を用いて固体支持体に結合する。典型的な固相支持体は、ボリサ・ｌカライド支持体、アクリルアミドゲル、シリカ支持体、アルミナ等の、市販されている典型的なりロマトグラフィー支持体の範囲全般を含む。

粒子状のクロマトグラフィーの支持体に加えて、メンブランタイプの支持体もまた一般に用いられることは注目すべきである。多数のクロマトグライー用のメンプランが、市販されている。所望ならばリンキングアームを固体支持体とパラログリガンドとの間に導入することを含め、広範な結合技術もまた利用し得る。少なくとも３−９個の炭素に等しい長さのリンキングアームの利用は、いくつかの例では、被分析物にリガンドへ近づき易さを付与するために、有用である。

加えて、パラログの支持体上の配置を、回収される被分析物および他の物質に対する望ましい度合のアフィニティを与えるために、制御し得る。リガンドを随意に配置する能力は、特定のカラムの理論段数をコントロールし得る点において育益である。アフィニティリガンドの密度が高くなるほど得られる理論段数も高くなる。本発明のリガンドは大抵のアフィニティリガンドに比べ、比較的小さい分子であるので、同じ大きさのカラムで可能な理論段数は相応して高くなる。パラログは、それらが反応し得る固相支持体上の特異的な分子モチーフに結合するよう設計される。固体支持体に物質を度合させる方法は、ｌＦｊ　１ｃｈｅｋ、　Ｍ−ら、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　（１９）４）　３４＋４７５−４７１に記載されるような、ヒドラジド誘導体化した支持体への結合、あるいＪｔＥｂｅｒｌｅ、Ａ、Ｎ、ら、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　＋＊ｏｌ　（１９ＪＩ５）　Ｑ成する、光開裂し得る部分の使用が含まれる。

得られた基質は、目的の被分析物に対する結合が特異的なパラログに複合された固相支持体（粒子あるいはメンプラン）からなり、次にクロマトグラフィーの基質に一般的な方法で使用し得る。粒子支持体を、カラムに充填し、もしくはフィルター層に置き、被分析物を含有する組成物が基質に接触した時に、分析物を吸着し得るようにする。パ゛ラログは比較的安定なリガンドであるので、調製物および本発明の基質で充填したカラムは、ＨＰＬＣ用に設計された装置に含み得る。

アフィニティに基づくクロマトグライーをＨＰＬＣに適用する利点は、特にクロマトグラフィー法を調製用のスケールで行う場合には過大評価することは容易ではない。調製用の方法の分解能は、カラムのサイズを大きくするか、あるいは下向きの溶出液の強度を調節して溶出時間をより長くする、理性のない方法よりもむしろ、カラムの特性を基礎として達成する必要がある。溶出溶媒の複雑性あるいは量を増す全ての調節は、分離スケールにおいては、深刻な不利益となる。例えば、高価な溶媒および複雑な混合プロトコルは、全部ｒｌＯ−１００ｍｌが分析の操作として必要な場合、合理的である；分離のプロトコルでよくあるように、何百ガロンが必要とされる場合、それらは高価でかつ問題のものとなる。コストを下げるために、溶媒を回収する必要があるだけでなく、これだけで高価なプロセスであるのに、さらにＦＡ製された産物からそれを除去する必要がある。

加えて、調製用クロマトグラフィーによって精製された物質は通常カラムに回収されて、充分に分別される必要がある）　ので、複雑な溶出のプロトコルは、回収相におけるカラムの再平衡を必要とする、さらなる欠点を有している。速（再平衡にすることは、多くの工業上の場合のように、大規模で分析物を分離する場合にも才た、有利である。

前記の理由により、通常分析操作は、分離の基礎となるのが吸着剤の選択性である場合・・すなわち、アフィニティクロマトグラフィーのアプローチに基づ（場合にだけ、スケールを自在にすることができる。

特に好ましいプロトコルの１つとしては、標的の分析物のアフィニティが変化する、通常は増加する、一連のパラログを有するよう、カラムを構成し得る。分析物をカラム間にわたって移動させるときに、結合のアフィニティを連続させることは、分解能を改良するのに有効である。典型的な実施態様としては、カラムを標的に対して非常に低いアフィニティを有するパラログのリガンドから始め：続いてパラログのアフィニティを増加させる。目的の分析物がより容易にカラムを通過するゆえに、混入物が遅れて出て来る。

したがって、パラログのリガンドを有する基質を充填したカラムは、分析用および調製用のいずれかの手段として使用でき、またパラログが誘導された基質のカラムを使用することは、好ＷＳ合で有効であり、従来のクロマトグラフィーのアプローチにとって代わるものとなる。分析物が薬剤である場合、パラログが誘導された基質は、体液から薬剤を吸着する特異的な試薬として使用でき、次いで薬剤を分析物のために回収できる。分析物が廃棄物中に検出される毒物である場合、基質は検出用に用いられ、また混合物から毒物を除去することもできる。分析物が低収率で得られる目的物である場合、吸着剤がバッチ操作あるいは標準的なりロマトグラフィーの技術を用いて生成物を単離するのに用い得る。

別の吸着剤をさらに使用することによって、分析物の確認法を改良することができる。例えばＴＬＣを行う伝統的な分析物の確認法は、しばしば同じプレート上で角度を９０度にして、２種またはそれ以上の溶媒系を使用する。分析物は、ポジティブな確認のための両方の系の参照Ｒｒ値と一致するに違いない。

多様な吸着剤のパネルも同様に、分析物の確認に使用し得るプロフィルを生み出す。

大部分のパラログがキラルな分子であるから、パラログを基礎としたカラムがエナンチオマーの混合物の直接分離、および他の牛うルの調製に使用され得ることは注目すべきである。

毒物に特異的なアフィニティの特性を有するパラログもまた、インビトａおよびインビボの捕そく剤として使用することにより有用であり得る。例えば１つの実施態様として、パラログの複合したラテックスビーズを解毒剤として腸あるいは血流に運んだり、ある゛いはもっと一般的な体外における適・用にも用いられる。もう一つの実施態様として、特にパラログ−薬剤の組合せが、生理学的輸送に関連するレセプターに結合するパラログの能力を利用し得る特性を提供する場合、例えば薬剤が血液脳関門を通過しなければならないか、あるいは固相の腫瘍組織に侵入しなければならない場合、このような形態が特異的に、しかし適度なアフィニティでパラログに結合する薬剤の運搬系として用い得る。

上記に記載したように、選択されたパラログが、特にクロマトグラフィーにおいて固相支持体に複合されて使用される場合、パラログは固相に結合した形態で使用されるとは限らない。適当な組成および性質のパラログは、標準的なイムノアッセイにおいて、相応する抗体あるいはそのフラグメントに代えても用いられ得る。このような方法で用いる場合、パラログはプロトコルに因って標識され、またはされない。たとえば、典型的なサンドイッチアッセイにおいてはパラログでコートされたマイクロタイターのウェルは抗原用のサンプルを試験するのに用いられる。ここで、パラログに結合した抗原はその後、異なるエピトープに特異的な、標識形態の抗体を用いて、あるいは別のパラログの標識された形態によって標識される。あるいは、標識されたパラログは、固相支持体に結合させた抗原用のサンプルにおいて、あらゆる分析物の抗体と競争反応させるのに用いられる。

この技術で充分に理解されるように、固相に基づく、あるいは凝集に基づくイムノアツセイについての特定の種々のプロトコルは、当業者に広くかつ充分に理解される。　５゜パラログの単一物あるいは単純な混合物を固相支持体に結合させるのに加えて、勾配型の支持体は、混合物のメンバーを支持体に分配させることにより、調製され得る。したがって、一連のアフィニティは、支持体の表面あるいは長さに沿って組立て、基質を最良に吸着し得るように変化させることができる。例えば前記のアプローチは、特にＤＮＡ配列決定のゲルに使用するのに好ましいものである。標準的なゲル系は、５Ｏ−５１ｂｐのフラグメントに対し、数センチメートルの分離を与えるが、この１０倍の大きさの７ラグメントに対しては、１０分の１ミリメーターしかなく、このことが、一つのゲルから得られる配列の情報量を制限している。アフィニティを変えるバラログのＤＮＡに対する分配から生じる、パラログのアフィニティの勾配を有するゲルは、サイズ分離パラメーターを、単独で、もしくはこの問題を補償するよう試みられた他の先行技術を改変したものとの組合せで補償する。パラログの種々のＤＮＡ断片に対するアフィニチイの調節は、正に荷電した原子間の直線距離を変えることによって容易に成し得る。このゲルは通常の方法で構成し、もしくはニトロセルロースあるいはセルロース酢酸エステルの膜上の薄い表面として構成し得る。

バラログパネルそれ自体は、図２．４および１６に示されるような適切なプロフィルを得ることによる、分析物の特徴付けにさらに用いられる。この方法で得られる特徴付けの水準は、クロマトグラフィーの分析（２次元であっても）を用いることによって先行技術で通常得られるものを越えるものである。

以下の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明はこれに限定されない。

及亘五エバラログパネルの　計８８個のペンタペプチドのパネルを、疎水性の減少および疎水性モーメントの周期的変化をもとに設計した。図８は合成された番号１−８８のペンタペプチドを、Ｇｅｙｓｅｎ、　Ｈ，Ｍ、、　ｅｔ　ａｔ。

、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９８４）　（上記）の方法による合成で用いる８個のコントロールと共にリストで示し；図９は疎水性指数およびこのパネルにわたる疎水性モーメントを示している。

このパネルは、Ｇｅｙｓｅｎの技術（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌｓ）を市販用に変形したものあるいは他の好都合な多重ペプチド合成のフォーマットを用いて合成される。その後こ（７）／４ネルを、標識できるタンパク質でプローブして結合パターンを確立する。うまくいきそうな候補バラログが適当な数で得られる場合は、これらのうまくいきそうな候補バラログをルーチンのペプチド合成法を用いて、その配列を照合し、かつさらにクロマトグラフィーの操作を行い得るのに充分な量で合成する。このペプチドを支持体Ａｆｆｉｇｅｌ　１０　（ＢｉｏＲａｄ）に結合させてカラムに詰める、もしくはシリカをベースとした支持体Ｕｌｔｒａ−Ａｆｒｉｎ（ｔｙ”″（Ｂｅｃｋｒａａｎ）　（ここでペプチドを合成する）上にこのペプチドを残し得るようにしてクロマトグラフィーの支持体を得る。

このパラログが必要とされる特異なアフィニティを育するかを確証するため、リガンドとしてパラログのアミノ酸をかき混ぜた状態を用いた類似のカラムを調製し得る。分析物は多くの場合、このパラログを含むカラムに結合するが、かき混ぜた状態のペプチドを含むカラムには結合しない。Ａｔｔａｓｉの引例（上記）では、このようなかき混ぜが結合を破壊し得ると確証されている。

Ｌ立五主ニ１１久旦至止Ａ、３つの異なる特性を宵するパラログＫＮＲＧＦに、ＫＧＹＬＹＬＹにおよびＧＫＵＩＵｒＵＫ　（ここでＵ−バラアミ７安息香酸であり、他の記号は標準のアミノ酸コードを参照する）は、それぞれ有効なりジン残基を含んでおり、ｐＨ６，５でＮ末端アミノ基を介してＮ〜ヒドロキシスクシンイミドからあらかじめ誘導されたＢａｋｅｒ−ｂｏｎｄ　ＣＢＸビーズに付着された。結合後、リジン残基を同種二宮脂性架橋試薬ジフルオロ−ジニトロベンゼンを用いて分子内結合させた。反応をモニターするのには、色の変化を用いた（架橋剤と１箇所が反応した場合は淡黄色を呈し；完全に架橋した場合は暗黄色を呈する）。ビーズはスラリーの充填剤を用いて、標準のステンレススチール製のクロマトグラフィー用カラムに充填される。

Ｂ、環化は３つの主なメカニズムによってパラログの特性を変える。第１に、環化は基本骨格の配座自由度を減少させ；第２に、環化は分析物が挿入し得る部分空洞を生じさせ；そして第３に、環化は分析物によって感知される芳香性の基準を変える。架橋剤自身はまた、有用な芳香性を導入する。

図１０は、環化後上記Ａ項と同様にして調製したカラムにおける、疎水性分析物の殺虫剤ＤＤＤのクロマトグラムを、エタノールアミンでブロックした非誘導型およびＮＨＳ−誘導型ＣＢＸの吸着剤を用いたコントロールと併せて示した。図に示すように、ＤＤＤのピークが以下の順に支持体から溶出されるニブロック化したＣＢＸ、環化したＧ［［ＪＩＵＩＵＫ、環化したＫＧＹＩ、Ｙｌ、ＹＫおよびＫＮＩ？ＧＦに血五ユ々のＤＮＡパネルの１１君図１１は、４つの特性：合計のＧ／Ｃの割合：　Ｇ／Ｃ領域の数；直接の対称の量：および相補鎖の（ｄｙａｄ）対称の量、について種々の値を有する核酸を生み出すために設計された、コンビニ−ターのプログラムを図示する。それぞれの特性について、低い値はｌの値とし、高い値は２の値とした。プログラムを用いることによって、これら４つの特性において最大の多様性を示す１６−メンバーのパネルが設計された。その結果を図１０に示す図に示すように、それぞれの２０量体を合成するために、第１行が、生み出された配列、および次の４行は、特性の記述子を計算するのに使用されるパラメータを与える。

ｂｉｎ番号は４つの特性の１および２の称号のパターンによって特徴付けられる：これらの称号に関連する特性の実測値は、次の行に示される。

こうして設計された２０置体は、次に、適当な支持体に結合し、およびバラログパネルを組み立てるために、標準の固相法の技術を用いて合成される。

友立五土戸　の４　を　したポリマーのバラログの　み　て以下のアミノ酸配列：Ｂ８Ｓ−４：　Ａｔｂ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡｓｐＢ８５−２２：　Ａｉｂ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｔ−ＯｒｎＢ８５−３１：　Ａｉｂ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−＾５ｐ−Ａｓｐ−ＣｙｓＢ８５−４０：　Ａｉｂ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｏｒｎ−Ｏｒｎ−Ｏｒｎ−ＣｙｓＢ８５−３７：　Ａｉｂ−Ｃｙｓ−Ｏｒｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｏｒｎ−Ｃｙｓ−を有するＢ８Ｓ −４；　Ｂ８Ｓ−２２；　Ｂ８５−３１；　Ｂ８５−４０およびＢ８５−３７の一連のパラログを設計した。これらのペプチドを実施例１に記載した方法に従って合成した。このパラログをｐＨ７，５でＡｆｆｉｇｅｌｌｏに結合させ、そしてＰａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　５ｆｌｅｎｔ　Ｍｏｎ１ｔｏｒ”９６− ウェルの流動マイクロプレートに、そのウェルに１７５μｌの結合支持体の沈澱ベッドポリコームを充填することにより加えた。

クルードなイーストのライゼート（Ｓｉｇ■ａ）について、そのライゼートをＴＥバッフｙ　−（Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中、ＤＥＡＥセルロースで処理することにより核酸の画分を遊離した後、ＣＭセルａ− スに結合させ、そして５００ｍＭ　Ｎａ１ｌを加えたＴＥバッフγ−で溶出した。得られた、ＹＸ／ＤＣ−５００と名付られた溶解性のタンパク質を凍結乾燥により３倍に濃縮し、そしてＴＥバッファーに対し透析した。

そのタンパク賀溶液の一部分（５０μｍ）を、マルチチャンネルピペッタ−を用いてそれぞれのウェルに加えた。その後、１５０μｌの充填用バッファーで３回、次に１００μｌの溶出用バッファーで２回、それぞれ洗浄した。この溶出用バッファーは２５０ｍＭ　Ｍａｉｌを加えたＴＥである。溶出物を受容用のマイクロタイタープレートに集め、そしてＳＤＳゲル電気泳動に加えて銀染色法によって可視化した。

図１２は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ）もしくハ本発明の種々のパラログをミ二カラムに用いた場合の結果を比較したものである。図かられかるように、特定のタンパク質との結合に関するＣＭの挙動は、パラログに似ている。例えば、Ｂ８５−４０およびＢ８５−３７は、２８および約３５ｋｄのタンパク質バンドについてのＣＭの結果に類似した結果を与え；一方で、８８５−３１およびＢ８５−２２はこれらのタンパク質に関して異なる挙動を示すが、約５５ｋｄに対応する位置で溶出するバンドに関してはより類似した挙動を示す。したがって、目的の成分のバンドに関するＣＭの挙動は、最大化も最小化もされ得る。

裏立五旦後　′としてのパラログの　の同じ吸着剤（この場合ＤＥＡＥ）あるいは異なる吸着剤（この場合Ａ　１ｂ−Ｃｙｓ−Ｏｒｎ−Ｏｒｎ−Ｏｒｎ−Ｏｒｎ−Ｃｙｓの構造を有するＢ８５−２９のパラログ）において、最初のクロマトグラフィー分離からのピークの活性画分を再ランした効果を本実施例で比較する。クルードなイーストのライゼートをＤＥＡＥに加え、そして急勾配の塩濃度勾配を溶出液に用いて溶出した。９０ｍＭと１１０ｅＭの間に溶出したフラクションを、次に１ｍｌのオーブングラビテイ− カラム中、緩やかな塩勾配を溶出液に用いてＤＥＡＥおよびＢｕｓ−２９のいずれかの吸着剤のカラムにかけた。第１のＤＥＡＥカラムで９ｂＭと１１０ｍＭの間に溶出したタンパク質の大部分が第２のＤＥＡＥカラムでもそのように溶出し続けた。しかしながらその物質の約３分の１は平行した８８５−２９のカラムに結合せず、結合タンパク質が広範囲のＮａＣ１濃度で溶出された。これらの結果を図式化したのが図１３であり、図１３を５ＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した実際の結果を図１４に示す。

図１３からＤＥＡＥについて、第１と第２のカラムで大体同じ結果が得られることがわかる；しかし、Ｂ８Ｓ−２９のカラムにおける９０−１１０＋＋Ｍの画分の箪２および第３の分離に関してはさらなる分離が得られた。これはまた、パラログ８８５−２９カラムが少なくとも数種のタンパク質の成分を比較的きれいに分離している、図１４のＳＯＳの分析によって得られた、様々なタンパク質のパターンからもわかる。

実ｍ立バラログパネル・チバクロンパネルの　のイーストの抽出物ＹＸ／ＤＣ−５００を一連のパラログが誘導されたカラムに加え、そして上記に記載したようにＳＤＳ　ＰＡＧＨによって溶出物を評価した。ＩｃＮ　Ｃｈｒｏｍａｔａｋｉｔ”に含有されるシバクロン染料のシリーズに結合した支持体を用いて同様の測定を行った。図１５Ｂかられかるように、チバクロンを含有するキットのほぼ全ての成分が、吸着および溶出されたタンパク質に類似のパターンを示した。種々のタンパク質バンドに関して、黄−２、緑−■、膏−１および青−２だけが残りの成分（および互いに）に対し有意な差を示した。図１５Ａかられかるように、バラログパネルを用いることにより、はるかに多様な結果を得た。さらに、互いに他の染料よりも互いに他のパラログに対して、抽出物のより多くの割合が結合することから、パラログが広範囲に適用し得るのがわかる。

爽亘五Ｌンバク　のプロ７　ルの゛ＹＸ／ＤＣ−５００混合物の代わりに、血清アルブミン（ＢＳＡ）、チトクロームＣ５およびフルオレセイン、Ｈ，ＩＩおよびペプチドＬＰＤＧＧＹに対して作成されたモノクローナル抗体のうちの、いずれかの過負荷量を用いた他は実施例６の手順を繰り返し用いた。

上記に記載した手順で、１５バラログが誘導されたＡｆｆｉｇｅｌ支持体にこれらのサンプルを充填した。吸着されたタンパク質をＬＭ　ＮａＣ１を加えたＴＥで溶出した。

≠トクロームＣおよびＢＳＡの場合についてはＢｉｏＲａｄ　Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染料結合アッセイを用いてタンパク質の濃度を測定した。

これらの結果を図１６に示す。互いに全く異なる２つの試験タンパク質のプロフィルである。図（ＤはＤＥＡＥを表し、ＣはＣＭセルロースを表し、そしてＢはエタノールアミン“でブロツクされたＡｆ４ｉｇｅｌ　１０を表す）かられかるように、ＢＳＡはパラログ４、５および１１にうまく結合し；チトクロームＣは結合しない：チトクロームＣは残りのバラログのシリーズにかなりうま（結合するがＢＳＡは結合しない；しかじ、チトクロームｃはバラログｌおよび２に対する結合が少ないのが認められた。

モノクロナール抗体がこの試験で用いられる場合、ＥＬＩＳＡ法の７ノセイを用いて、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　ＶＭａｘマイクロプレートリーダーによりアルカリ性ホスファターゼｉｊｉｍ反応産物を検出して通過画分の、および溶出された抗体を測定した。

この測定は変性しない抗体だけを測定する。図１７に示すように３つの抗体全てが互いに異なるかなり複雑なプロフィルを与える。　（抗フルオレセインおよび抗にＬＨ抗体は、精製されたＩｇＧであり；抗ＬＰＤＧＧＹはラン胎児の血清を含有する培地の上澄みからのＩｇＭである。）このプロフィルは分析物の精製および確認のための診断検査を提供する。

爽良丘ｌアフィニティ　の実施例７の手順およびバラログＢ８５−２９を用いて、ウシ血清アルブミンの結合等量線を、カラムに加えられたタンパク質の初期濃度を変えることにより決定した。図１８かられかるように、２．５Ｘ　１０６＋ｏｌ−’の値が得られ、それは同じバッファーの条件下におけるＤＥＡＥについてと大体同じであった。

１監１１フェノール　゛　のためのバラログ　パネル図１９は、環境のハザードとしてＥＰＡが同定している１１個のフェノール性汚染物質を分離する種々の吸着剤の能力を示す。

図１９で示されたこれらのフェノールの構造を、クロマトグラフィーのカラムに、種々の吸着剤を用いアセトニトリルの勾配で溶出したパターンと併せて、図１９に示した。ＣＢＸビーズを用いて、適当なバラログをカラムに複合させることによりカラムを調製した。用いたバラログはＧ　１ｙ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＡ−Ｐｈｅ−ＰＡＢＡ−Ｐｂｅ−ＰＡＢＡ−Ｌｙｓの構造を宵するＢ６９−９２：　ＰＡＢＡ−インロイシン；　ＰＡＢＡ−アラニン；およびＰＡＢＡ−メチオニンであった。シクロデキストリンカラムの他に、標準的なＣ−１８およびシクロへ牛シルカラムをコントロールとして用いた。

図１９に示すように、シクロデキストリンカラムで（白丸；それらは全（保持されない）あるいは、フェノールそれ自体を除いてはＣ−１８カラムでこれらのフェノールの保持時間にはほとんど変化はなかった（２２−２８分）。シクロヘキシルが誘導されたカラムを用いた場合、かなりの変化があった。バラログＢ６９ −９２を含有す石カラム（黒い三角）は、しかしながら、シクロへキシルカラムによって充分に区別できない（２，４−ジニトロフェノールを除いて）分子の部分に、保持時間における適度な変化を与えた。図２０−２２は、ＨＰＬＣ条件下において、上記に記載した３つのバラログが誘導されたＣＢＸカラムで、１１個のフェノールを溶出したパターンを示す。これらはＰＡＢＡ−１１ｅ（図２０　）　；　ＰＡＢＡ−Ａｌａ　（図２１）；およびＰＡＢＡ−Ｍｅｔ　（図２２）である。

Ｂｅｃｋｍａｎ　ＨＰＬＣは、１２６個のプログラム作成が可能な溶媒のモジュールおよび１５８個のＤｒｏｄｅ　Ａｒｒａｙ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　Ｍｏｄｕｌｅを装備しており、また処理データはＢｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄ　ＳｏｆｔｗａｒｅＲ６ｖ、　５．０を用いてＴａｎｄｙ　３００ＯＮＬコンピユーターで行った。高純度の等級の溶媒は、使用前にヘリウムで散布した。

バラロクヲ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＥＤＣでエステル化した、ＣＢＸビーズの結合相におけるカルボン酸群を用いて、１５ｕ　ＣＢＸ　シリカ（Ｊ、Ｔ、　Ｂａｋｅｒ）で合成した。ｐＨ７，５のＰＢＳの溶解したＮ末端アミノ酸を、エステル化したビーズに加えて安定なアミド結合を得た。つながれたアミノ酸のカルボン酸末端をエステル化し、そしてその操作を繰り返してペプチド結合の形態を得た。ペプチドはシリカＩｇ当り結合ペプチド８゜−１００ａｍｏｆで結合させた。コントロールとして用いた”ブロックされた”カラムはＢａｋｅｒ　ＣＢＸビーズをエステル化し、続いてエタノールアミンを付加させることにより調製した。

約１．５グラムのカラム充填剤を１０■Ｌのメタノールに懸濁させてカラムを調製した。２μ難のフィルター７リフトを有する５ｃ■Ｘ４．６ｍｍ　ｉｄ、のカラムを２０■Ｌの高圧力ラム充填管に取り付けた。懸濁液をカラム充填管に加え、続いて充分なメタノールでリサーバーを満たした。カラムをまず１６０ｐｓｉの窒素ガスを用いて充填した。リサーバーを再び満たし；５０■Ｌのメタノール全量をそれぞれのカラムに加圧し、そして次に、カラム充填装置をＨＰＬＣに取り付けた。毎分２＋ｓＬの流速で、毎分９ｍＬまで増加させながらメタノールをカラムに汲み上げた。逆圧が安定したのでカラムの充填を完了した。

図２０−２２の比較でわかるように、バラログの選択によって全く異なる溶出パターンが得られる。ＰＡＢＡ−インロイシンおよびＰＡＢＡ−７ラニン（図２０および２１）の両方から、１１個の使用成分のうち少なくとも６つの分離ピークが得られる。

さらにＰＡＢＡ−ＡｌａおよびＰＡＢＡ−ｌｉｅのいずれかを用いた０８カラムとの比較が、下記の表Ａに示されている。結果から試験したフェノールのすべてについてＣ８の保持時間は５分以下であることがわかる。しかしながら、ＰＡＢＡ−ＡｌａおよびＰＡＢＡ−１１ｅの両方は、より長い保持時間を与えることによって、この群のＦＩＧ、　１八０ラロ２＋ｑフＦＩＧ、７ＦＩＧ、８６くノζ−ｔ＞ｌ−’ｈａＩＩｔｙ、　Ｊｆｉ−＞ｆＨｙ、　ｄｙａｄｂｉｎｑ＋９％　Ｈ＊ｚ。

ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣｋｋＴＧｘｘｘｘｘｘｘＣｋＴＴＧｘｘｘ１１１１１１２２２２：３コ３３４４４４４４ｘｘｘｘｘＴＡＡＡＴｘｘｘｘｘＡＴＴ！’Ａ＾ＴＴＣ入入ＣＴ入ＣＴＡＡＴＣＡＴＴＣＣ（ｘｃ−ｔニーｖ＞１−構成ｅｓ軟Ｊ１に之７範ｄｙａｄｂｉｎ　句６亀　灯ｐ。

ＦＩＧ、　１２ＤＥＡＥ　Ｎｏ、　Ｉ　ＤＥＡＥ　Ｎｏ　ＩＴｅｒｒａＳｏｒｂ　Ｎｏ、ＩＦＩＧ、１Ｂ（−Ｚト坤：ｅ、’ｌＺＩ　ＹＸ／Ｃ１ｔｏｏ　亘う勤　Ｘｌ０ＦＩＧ、　＋５ −２　、おｅｍ４ｙ）　（１゜８，８゜職ＮＳ　５ＥＴ）−嘩鳥縮ＪＦＩＧ、　＋７ ”　＋（ｎｍｏｌｅｓ）咬九覆ＰＡＢＡ　−ｌ１ｅｃｌｒＬ充４ＰＡＢＡ　−ＡｌａＦＩＧ　２１吸′に、八ＰＡＢＡ−ＭｅｔＦＩＧ　２２国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．第一の部分の環境中に存在する別の部分と比較して、第一部分に対して特異的な親和性を有するパラログを、同定するための方法であって：パネルの個々の候補パラログを、該第一部分に選択的に結合する能力に関して、スクリーニングする工程であって、ここで、該候補パラログが、パラメーターの各々がパラログの他の物質に結合する能力を決定する、および／あるいは該パラメーターの組合せが他の物質に結合するパラログの能力を決定する、系統的に変化する少なくとも二つのパラメーターの値を有する、工程、を包含する方法。
２．前記パネルの前記候補パラログが、少なくとも３つのパラメーターの、系統的に変化する値を有する、請求項１に記載の方法。
３．前記パネルの前記候補ペプチドが、少なくとも４つのパラメーターの、系統的に変化する値を有する、請求項２に記載の方法。
４．前記パネルの前記候補ペプチドが、少なくとも５つのパラメーターの、系統的に変化する値を有する、請求項３に記載の方法。
５．前記パラメーターが、疎水性指数、等電点、疎水性モーメント、側鎖の双極子モーメント、芳香族性指数、荷電電子間の直線距離、および波形因子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
６．前記候補パラログが、少なくとも４アミノ酸残基の、環状あるいは直鎖状のペプチドであり、ここで、該ペプチドが、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、一ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−、からなる群から選択される結合で、結合を置換された、一つあるいはそれ以上のペプチド結合の改変を任意に含み得る、請求項１に記載の方法。
７．前記パラログが、５個から１５個のアミノ酸を包含する、請求項６に記載の方法。
８．前記パラメーターが、疎水性指数、等電点、疎水性モーメント、側鎖の双極子モーメント、芳香族性指数、荷電電子間の直線距離、および波形因子、からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
９．前記環状ペプチドが、ジスルフィド、エステル、およびアミドからなる群から選択される共有結合で形成される、請求項６に記載の方法。
１０．前記環状ペプチドが、二官能性リンカーを用いて形成される、請求項６に記載の方法。
１１．前記ペプチドが、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノシクロへキシルカルボキシレート、および１−カルボキシ−４−アミノフラン、からなる群から選択される残基を少なくとも一つ包含する、請求項６に記載の方法。
１２．前記候補パラログが、核酸である、請求項１に記載の方法。
１３．前記パラメーターが、ＡＴ／ＧＣ比、一本鎖上のＡＴおよびＧＣの配置、ホモポリマー性の伸張の数および配置、相補鎖の対称性の無さ、およびパリンドロームの対称性の無さからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
１４．前記候補パラログが、親水性および疎水性のモノマーユニットを包含する合成ポリマーである、請求項１に記載の方法。
１５．前記疎水性モノマーユニットがエチレンクロライド基を供与し、前記親水性モノマーユニットがエチレングリコール基を供与する、請求項１４に記載の方法。
１６．前記候補パラログが、正および／あるいは負に荷電した基で誘導体化された炭水化物である、請求項１に記載の方法。
１７．前記パラメーターが、等電点、側鎖の双極子モーメント、および荷電電子間の直線距離からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
１８．前記炭水化物がデキストランであり、そして、前記荷電した基が硫酸基および／あるいはアミノ基である、請求項１６に記載の方法。
１９．前記候補パラログが、フォスファチジルジグリセライドである、請求項１に記載の方法。
２０．前記候補パラログの各々が、さらに標的物質に予め定められた特異的結合をする置換基を包含する、請求項１に記載の方法。
２１．前記置換基がボロネート残基であり、そして、前記標的物質が炭水化物あるいは糖タンパク質である、請求項２０に記載の方法。
２２．前記置換基が補酵素であり；そして、前記標的物質が該酵素である；請求項２１に記載の方法。
２３．前記置換基が酵素の基質アナログであり、そして、前記標的物質が該酵素である、請求項２０に記載の方法。
２４．前記スクリーニング工程が、前記パネル中の各候補パラログとの結合について前記第一部分が標識混合物と競合する能力を評価することで行われ、該混合物が前記パネル中の全ての候補パラログと結合可能である、請求項１に記載の方法。
２５．前記スクリーニング工程が、特異的に結合する物質が吸着される条件下で、前記第一部分を包含する試料を、固体支持体に結合した候補パラログを各テスト部分が含有する複数のテスト部分を通過させ、未結合部分を回収し、吸着した全ての物質を溶出し、および該第一部分が固体支持体に結合した候補パラログに特異的結合を示したかどうかを決定するために、未結合あるいは溶出した物質中に該第一部分が存在するかしないかを検出すること、で行われる、請求項１に記載の方法。
２６．前記テスト部分が、ミニクロマトグラフカラムである、請求項２５に記載の方法。
２７．前記テスト部分が、底がメンブレンのマイクロタイタープレートに含まれている、請求項２５に記載の方法。
２８．前記スクリーニングが、各候補パラログが前記第一部分に結合する能力を個々にテストすることで行われる、請求項１に記載の方法。
２９．前記パネルが、前記パラメーターの値の全範囲内にわたって前記パラメーターの予め定められた値に従って個々の候補パラログを合成することで調製される、請求項１に記載の方法。
３０．前記パラメーターが、疎水性指数、等電点、疎水性モーメント、側鎖の双極子モーメント、芳香族性指数、荷電電子間の直線距離、および波形因子からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
３１．前記パネルが、前記候補パラログのランダムな混合物を合成し、そして、該パラログを一連のリガンドに対する結合能力で選別することで調製され、該リガンドが、少なくとも二つの、該リガンドが他の物質に結合する能力を決定する、前記パラメーターに系統的に変化した値を有する、請求項１に記載の方法。
３２．前記パネルが、前記候補パラログのランダムな混合物を合成し、該パラログをランダムな一連のリガンドに対する結合能力で選別することで調製され、そして、該一連のリガンドに対して相異なった結合プロフィールを示したパラログのみを残す、請求項１に記載の方法。
３３．別の成分を含んだ試料中の被分析物に対するアフィニティークロマトグラフィーを行うのに有用なパラログを同定する方法であって、該パラログが、該別の成分と比較して該被分析物に特異的なアフィニティーを有し：該候補パラログが、パラメーターの各々がパラログの他の物質に結合する能力を決定する、および／あるいは、パラメーターの組合せがパラログが他の物質に結合する能力を決定する少なくとも二つのパラメーターの、系統的に変化する値を有する、パネルの個々の候補パラログを、該被分析物に対して選択的に結合する能力に関してスクリーニングする工程、を、包含する方法。
３４．前記方法がさらに、前記パラログが固体支持体に結合した場合にも前記能力が残存しているかどうかテストする工程を包含する、請求項３３に記載の方法。
３５．前記パネルの前記候補パラログが、固体支持体に結合されている、請求項３３に記載の方法。
３６．前記パラメーターが、疎水性指数、等電点、疎水性モーメント、側鎖の双極子モーメント、芳香族性指数、荷電電子間の直線距離、および波形因子、からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
３７．前記候補パラログの各々がさらに、標的物質に対すして予め定められた特異的な結合をする置換基を包含する、請求項３３に記載の方法。
３８．前記スクリーニング工程が、特異的に結合する物質が吸着される条件下で、前記被分析物を含有する試料を、固体支持体に結合した候補パラログを各テスト部分が含有する複数のテスト部分を通過させ、未結合部分を回収し、吸着した全ての物質を溶出し、および該被分析物が固体支持体に結合した候補パラログに特異的結合を示したかどうかを決定するために、未結合あるいは溶出した物質中に該被分析物が存在するかしないかを検出して、行われる、請求項３３に記載の方法。
３９．前記テスト部分が、ミニクロマトグラフカラムである、請求項３８に記載の方法。
４０．前記テスト部分が、底がメンブレンのマイクロタイタープレートに含まれている、請求項３８に記載の方法。
４１．パラメーターの各々が他の物質に結合するパラログの能力を決定する、および／あるいは、該パラメーターの組合せが他の物質に結合するパラログの能力を決定する、少なくとも二つのパラメーターに系統的に変化させた値を個々の候補パラログが有する、ポリマー性のパラログのパネル。
４２．前記パネルの前記候補パラログが、少なくとも３つのパラメーターに系統的に変化する値を有する、請求項４１に記載のパネル。
４３．前記パネルの前記候補パラログが、少なくとも４つのパラメーターに系統的に変化する値を有する、請求項４１に記載のパネル。
４４．前記パネルの前記候補パラログが、少なくとも５つのパラメーターに系統的に変化する値を有する、請求項４１に記載のパネル。
４５．前記候補パラログが、少なくとも４アミノ酸残基の、環状あるいは直鎖状のペプチドであり、ここで、該ペプチドが、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、− ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、− ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合で、結合を置換された、一つあるいはそれ以上のペプチド結合の改変を任意に含み得る、請求項４１に記載のパネル。
４６．前記パラメーターが、疎水性指数、等電点、疎水性モーメント、側鎖の双極子モーメント、芳香族性指数、荷電電子間の直線距離、および波形因子からなる群から選択される、請求項４５に記載のパネル。
４７．前記候補パラログが、核酸である、請求項４１に記載のパネル。
４８．前記候補パラログが、親水性および疎水性のモノマーユニットを包含する合成ポリマーである、請求項４１に記載のパネル。
４９．前記候補パラログが、正および／あるいは負に荷電した基で誘導体化された炭水化物である、請求項４１に記載のパネル。
５０．前記候補パラログが、組換え的に産生されたペプチドである、請求項４１に記載のパネル。
５１．前記ペプチドがランダムなＤＮＡ配列から創生され、そして、前記変化するパラメーターがパラログの別のパネルに対するスクリーニングにより得られる、請求項５０に記載のパネル。
５２．前記パラログの別のパネルが、パラメーターの各々がパラログが他の物質に結合する能力を決定する、および／あるいは、パラメーターの組合せがパラログが他の物質に結合する能力を決定する、少なくとも二つのパラメーターに設計的な変化を有する、請求項５１に記載のパラログ。
５３．前記系統的に変化する値が、前記パネルにわたって前記二つのパラメーターの値の変化を設計することにより得られる、請求項４１に記載のパネル。
５４．前記系統的に変化する値が、パラログの別のパネルに対して前記パネルをスクリーニングすることにより得られる、請求項４１に記載のパネル。
５５．前記パラログの別のパネルが、パラメーターの各々がパラログが他の物質に結合する能力を決定する、および／あるいは、パラメーターの組合せがパラログが他の物質に結合する能力を決定する、少なくとも二つのパラメーターに設計的な変化を有する、請求項５４に記載のパネル。
５６．前記候補パラログの各々がさらに、標的物質に対すして予め定められた特異的な結合をする置換基を包含する、請求項４１に記載のパネル。
５７．前記置換基がボロネート残基であり、そして、標的物質が炭水化物あるいは糖タンパク質である、請求項５６に記載のパネル。
５８．前記置換基が、補酵素あるいは酵素の基質アナログであり；標的物質が該酵素である、請求項５６に記載のパネル。
５９．前記置換基が、前記候補パラログの上に予め定められた表面密度で包含される、請求項５６に記載のパネル。
６０．目的部分と結合させるのに有用なパラログを同定するためのキットであって、該キットが個々の候補パラログのパネルを包含し、該候補パラログが、パラメーターの各々がパラログが他の物質に結合する能力を決定する、および／あるいは、パラメーターの組合せがパラログが他の物質に結合する能力を決定する、少なくとも二つのパラメーターに系統的に変化する値を有する、キット。
６１．前記個々の候補パラログのパネルが、異なった候補パラログを各テスト部分が有するーセットのテスト部分、を包含する請求項６０に記載のキット。
６２．前記各テスト部分が、マイクロクロマトグラフィーカラムである、請求項６０に記載のキット。
６３．前記各テスト部分が、底がメンブレンのマイクロタイクープレートに含まれる、請求項６０に記載のキット。
６４．前記個々の候補パラログの各々がさらに、標的物質に予め定められた特異的結合をする置換基、を包含する請求項６０に記載のキット。
６５．前記目的部分に対する標識された競合物、をさらに包含する請求項６０に記載のキット。
６６．メンバーが、パラメーターの各々がパラログが他の物質に結合する能力を決定する、および／あるいは、パラメーターの組合せがパラログが他の物質に結合する能力を決定する、少なくとも二つのパラメーターに系統的に変化する値を有する、パラログのパネルのメンバーの少なくとも一部を、予め定められたパターンで分布して有するする固体支持体、を包含する、クロマトグラフィー用の支持体グラジエント。
６７．前記パラメーターが、疎水性指数、等電点、疎水性モーメント、側鎖の双極子モーメント、芳香族性指数、荷電電子間の直線距離、および波形因子からなる群から選択される、請求項６６に記載の支持体グラジエント。
６８．表面の糖タンパク質に基づいて細胞を分離する方法であって、分離される細胞を含む試料を、請求項１の方法で同定されたパラログが結合された固体支持体に接触させる工程、ここで、該パラログは、分離される細胞のサブセットに対し特異的な結合親和性を有する、を包含する方法。
６９．前記パラログがさらに、糖タンパク質に特異的に結合する置換基を包含する、請求項６８に記載の方法。
７０．前記置換基が、ボロネート基である、請求項６９に記載の方法。
７１．分子のセット間の相互作用を記述するデータ処理システムに使用するマトリックスであって、該マトリックスは、二つの分子のパネルを交差反応させることにより得られ、ここで、該分子は、パラメーターの各々がバラログが他の物質に結合する能力を決定する、および／あるいは、パラメーターの組合せがパラログが他の物質に結合する能力を決定する、少なくとも二つのパラメーターに系統的に変化する値を有する、マトリックス。
７２．前記分子が、ペプチドあるいはタンパク質である、請求項７１に記載のマトリックス。
７３．候補アナログのパネルをさらに多様化させる方法であって、請求項７１のマトリックスに、データ処理システム中で、多変量解析を導入すろ工程、を包含する方法。
７４．選択した部分に対する標識競合物を設計するための方法であって、請求項７１のマトリックスに、データ処理システム中で、多変量解析を導入する工程、を包含する方法。