JP2690193B2 - 被分析物に結合するリガンドの同定方法 - Google Patents

被分析物に結合するリガンドの同定方法

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願との相互関係 本出願は、1988年３月24日付の米国特許出願第172,62
6号の包帯継続出願（FWC）である、1989年５月16日付の
米国特許第355,042号の一部継続出願である、1989年10
月31日付けの米国特許出願第429,721号の一部継続出願
であり、1988年10月11日付の米国特許出願第255,906号
の一部継続出願でもある。
技術分野 本発明は、例えば、特異的な被分析物用の、クロマト
グラフィーおよび分析用のアフィニティーリガンドとし
て使用し得る特異的結合部分の選択法に関する。さらに
詳細には、本発明は、性質の異なった低分子量の（＜7.
5kd）「パラログ（Paralogs）」の種々のセットから選
択されるリガンドの、アフィニティーリガンドとしての
使用に関し、このアフィニテキーリガンドは、診断およ
び治療、および、特に低い免疫原性の有毒な汚染物質の
ような、様々な被分析物の検出および精製のためのクロ
マトグラフィー技術、および、イムノアッセイのような
結合アッセイ、に有用である。
背景技術 本発明の方法で調製されるパラログは、クロマトグラ
フィーでの応用に特に有用である。このようなクロマト
グラフィー分離の実践における、２つの主要な開発は、
天然の産物の単離、混合物の成分分離、および複雑な組
成物の分析を容易とするのにこの10年間位のあいだに非
常な重要性を有するようになった。この一つは、固定さ
れたリガンドと所望の被分析物との間の特異的な相互作
用に起因する結合特性上の大きな違いに分離または分析
が依存しているアフィニティークロマトグラフィーに対
して、特異的抗体のような、入手可能なリガンドの種類
が増したことである。そしてこのもう一つは、吸着剤に
対する複数の成分の結合の小さな違いに依存した連続的
な分別によって、複数の成分の迅速で効率的な分離を可
能とした高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）の登場
である。HPLCは、特異的アフィニティー対として用いら
れるリガンドの多くに有害な条件を一般に用いるため、
これらの開発物は、限られた範囲で重複しているに過ぎ
ない。これらの技術で可能な被分析物の範囲で最も一般
的に用いられるアフィニティーパートナーは、特異的な
イムノグロブリンあるいはその免疫反応性の断片であっ
た。一般に、このタイプのリガンドは、HPLCで用いられ
ている条件では不安定である。HPLCではしばしば非水性
の溶媒が用いられ、多くのアフィニティーリガンドを変
性させ、そして、使用される高圧も、これらの多くの物
質を破壊する。
Techniques of Chemistry第12巻 Edmond S.Perryら編
集Separation and Purification第３版（1978）（J.Wil
ey）中のMay.S.W.による初期の総説でまとめられたよう
に、アフィニティーに基づいたクロマトグラフィーで
は、様々な固体支持体および様々なアフィニティーリガ
ンドを使用し得る。この総説は、ポリアクリルアミドゲ
ル、混合ゲル、および種々のガラスおよびシリカ誘導体
に加えて、特に多糖支持体に重点を置いて、アフィニテ
ィークロマトグラフィーに適した支持体に関して記載し
ている。
これらの内では、シリカ誘導体のみがHPLCで広く使用
されている。しかし、その結合特性を改変するための支
持体の誘導体化の範囲は、種々の炭水化物リガンドある
いは他の簡単な分子の複合による疎水性の変化に限られ
ていた。本発明は、一連の可能な被分析物から選択され
たメンバーに対して特異的な必要なアフィニティー、お
よびHPLCの条件と両立し得る能力とを有するリガンドを
得るための方法を提供することにより、HPLC法およびア
フィニティー法との都合の良い融合を可能とする。
これらのリガンドの選択に最大の多様性を持たせるた
めに、如何なる場合にも目的とする分離が行えるよう
に、適切なリガンドが得られるようにした。
他の研究者達も、様々な方法でHPLC法とアフィニティ
ー法との融合を試みた。Peterson,E.A.ら、Meth Enz（1
984）104:113−133には、吸着される成分間の吸着部位
に対する競合が、溶出剤による競合に置き換えられた、
「置換」クロマトグラフィーが記載されている。分離さ
れる物質に対する特異的アフィニティーが異なった、シ
クロデキストリンのような炭水化物を用いたクロマトグ
ラフィー支持体もまた報告されている（Armstrong,D.W.
ら、J Chrom Sci（1984）22:411−415）。加えて、精製
されたチバクロン（Cibacron）染料のパネルが、クロマ
トグラフィー支持体の候補として用いられた（Burton,
S.J.ら、J Chromatog（1988）435:127−137）。
本発明の方法で用いられるリガンドの例には、本明細
書では「パラログ」と呼ぶ物質の一形態である、４−20
個のアミノ酸のペプチドの多様なセットが挙げられる。
それに対して抗体が作成される抗原決定基あるいは抗原
のエピトープに特異的に結合する、イムノグロブリンの
一部分をパラログは模倣している。このエピトープに相
補的なセグメントは、一般にパラトープと呼ばれ、そし
てパラログ中のペプチド配列は、作成された抗体中に存
在するものと同じである必要はないので、パラログ（あ
るいはパラトープアナログ）という用語を用いる。
特定の部分に対して推定上相補的なペプチドの合成お
よび同定は、以前は非常に限定された範囲でしか行われ
ていなかった。Atassi,M.Z.らの、J Biol Chem（1977）
252:8784−8787には、リゾチームの抗原性部位に相補的
なペプチドの、特異的な設計が記載されている。リゾチ
ームの３次元的な輪郭の知識により、推測される決定基
に類似したディメンジョンおよび電子密度パターンのペ
プチドの合成が可能となった。この決定基を模倣したペ
プチドに、三次元構造および電子密度パターンが相補的
と考えられる配列を調製することで、推定上相補的なペ
プチドが得られた。この擬似「パラトープ」ペプチド
は、リゾチームの抗血清との反応を阻害し、そしてリゾ
チームに特異的に結合して、イムノグロブリン（myoglo
bin）あるいは抗体を排除した。しかし、この性質は、
この「パラトープ」と相補のペプチドに共有され、そし
て事実そのペプチドの方が優れていることが後に示され
た。同じ研究グループのその後の研究の結果、アセチル
コリン特異的レセプターの結合部位、およびトリプシン
の結合部位を有するペプチドが合成された（McCormick,
D.J.ら、Biochem J（1984）224:995−1000;Atassi,M.
Z.、Biochem J（1985）226:477−485）。ペプチドパラ
トープまたはレセプターまたは酸素結合部位を模倣した
は、抗原決定基あるいは決定基結合部分のいづれかに関
連した既知の構造パラメーターに基づいている。
原子解析による結合部位を調べる異なったアプローチ
による最近の研究で、抗体のイディオタイプ表面がマッ
ピングでき、そしてこの表面の部分を模倣したペプチド
を作成し得ることが示された。しかし、Jerneの仮説の
予測に反し、イディオタイプおよびパラトープは正確に
は一致しなかった。Seiden,M.V.の、Am Assoc Immunol
（1986）136:582−587;Roux,K.H.らの、Proc Natl Acad
Sci USA（1987）84:4984−4988。
最近、特異的な相互作用の特徴の知識無しに、相補的
な成分に特異的に結合する、エピトープを模倣する方法
が開示された。これに最も関連した研究は、Commonweal
th Serum Laboratories in Australiaの、Geysen H.M.
らのものである。Geysenは、候補配列が抗体と特異的に
結合する能力を経験的にテストし得る、複数の候補配列
とパネルを調製する経験的な方法を考案した。Geysenの
アプローチでは、候補ペプチドの各々を、相対的に少な
い量で、別々のポリエチレンの支持体ロッド上で独立し
て合成する。この支持体ロッドは、マイクロタイタート
レイのウエルに個々に浸すのに都合の良いように配置さ
れている。典型的には、96種の（市販されているトレイ
の配列に対応した数）別々のペプチドが同時に合成し得
る。この96種のペプチドは、標準的なラジオイムノアッ
セイあるいはELISAを用いて同時に結合をもアッセイし
得る。（例えば、Proc Natl Acad Sci（USA）（1984）8
1:3998−4002:PCT出願WO86/00991およびWO86/06487を参
照。） 様々な候補ペプチドはまた、Houghten,R.のProc Natl
Acad Sci（USA）（1985）82:5131−5135の、Ｔ−バッ
ク法を用いて、独立した容器中で同時に合成し得る。
もしも遺伝子にコードされたアミノ酸の種類が満足の
いくものであれば、WO89/03430として1989年４月20日に
国際公開された、我々の以前の出願に記載されたように
（p.34を参照）、ランダムに作成したDNA配列から、こ
の候補ペプチドを組換えで産生し得る。このアプローチ
の特定の実施態様は、最近Devlin,J.らのScience（199
0）249:404−405:Scott,J.K.の、同誌,pp.386−390に、
公表された。
パラログに基づくクロマトグラフィーの一般的基礎
は、出願人により記載されている（Kauvar,L.らの、Bio
Techniques（1990）８:204−207）。別の非ペプチド形
態の候補パラログの複数の多様なセットの合成のための
方法もまた利用可能である。従って、任意の部分がパネ
ルのメンバーの間で変化し得、様々な性質を有する複数
のモノマーユニットから複合分子として合成されたこれ
らの任意の部分が、候補パラログのセットの基礎を形成
し得る。
合成分野でのこれらのおよび他の構成要素は、本明細
書の発明の方法を行うために、そして、クロマトグラフ
ィー用の基質の調製あるいは他の特異的結合への応用な
どに使用するために必要とされるリガンドを構築するた
めの材料として製造上使用し得る。
発明の開示 本発明はあらゆる選択された部分に対し、特異的に結
合することが可能な物質を系統的に容易に選択すること
を可能にする。応用の一つとして、本発明はアフィニテ
ィークロマトグラフィーおよびHPLCの利点を組み合せる
ことを可能にする、固相支持体を用いた有用な形態の分
析用および調製用クロマトグラフィーを提供する。アフ
ィニティーに基づいて、クロマトグラフィー分離および
精製のための適切な基質を選択し、構築することによ
り、本発明の方法は成分の容易な分析、あるいは混合物
からのそれらの精製または除去を可能にする効率的な条
件で行うことができる。このような技術は、溶離液から
有毒な廃棄物を除去すること、保存物中の毒素の量を測
定すること、高濃度の無関係な混入物の存在下での低濃
度の物質のレベルを分析すること、およびHPLCを含む調
製法に、特に有用である。本発明は、特定の精製および
分離上の問題に、または所望の結合アッセイに対して適
切なパラログリガンドを探索する有効な手段を用いるこ
とによって、クロマトグラフィー技術を有効に用いるこ
とを可能にする。さらに、本発明の方法は、診断および
治療を含む様々な局面に有用な、特異的に結合するパラ
ログを提供し得る。加えて、本発明の多様なパラログパ
ネルが利用できることは、全ての任意の被分析物に特徴
的な総合プロフィールの構築を可能にすると同時に、情
報となる相互作用マトリックスを提供して分子の相互作
用、特にペプチド／ペプチド相互作用、を系統的に研究
することを可能にする。
従って、一つの局面では、本発明は特定された部分、
例えば被分析物、に対して特異的アフィニティーを有す
るパラログを得る方法に向けられる。本発明の方法は、
前記部分に選択的に結合する能力について個々の候補パ
ラログのパネルをスクリーニングする工程を包含し、こ
こで該候補パラログは、そのパラログの他の物質に対す
る結合能力を決める少なくとも２種のパラメーターにつ
いて、系統的に変化させた値を有する。さらに、候補パ
ラログは、所定の部分に対して特異的な置換基を、含有
し得る。置換基はこの特異性を、パラログ構造の残りの
部分に依存し変化する量で示す。性質の系統的な変更
は、スクリーニングを必要とする候補の数を大幅に減少
させ、従って従来の方法に対して顕著な利点を提供す
る。
本発明はさらに、多様化されたセットに対して徐々に
良くなり最適に至る近似値を与え、その結果、スクリー
ニングを必要とする候補の数をさらに減少させる手段を
提供する。このようなスクリーニングはパネルの各メン
バーを、結合させようとする部分で個々に試験すること
により行い得、あるいはパネルの候補を同時にスクリー
ニングするために多数の試験部分を提供するキットによ
って行い得る。
候補パラログは、モノマー成分から、ポリマー複合体
のパラログ部分を、パラメーターの多様性を最大にする
ように予め決めておいた様式で合成することにより調製
し得、あるいは、このようなパラログをランダムな混合
物として合成し、そして多様化候補を、相補的なリガン
ドの最適の近似値を有する多様化セットに結合させ、そ
してそれからの溶出によって単離することによっても調
製し得る。あるいは、経験的に得られた交差認識表の統
計的分析を用いて、最適の多様化セットを同定し得る。
他の局面では、本発明はパラログパネルそれ自身、該
パラログパネルをスクリーニングするための適切なキッ
ト、およびパネルと被分析物との反応あるいはパネル同
志の交差反応で決定された、被分析物のプロフィールお
よび相互作用マトリックスをもにも向けられる。本発明
は他の面では、パネルのパラログの少なくとも一部分か
ら調製された、勾配クロマトグラフィー用支持体、およ
びこれらの支持体を用いた分離方法に向けられる。
上述のように、クロマトグラフィーへの応用に加え
て、正確な特異性を有する個々のパラログは、イムノア
ッセイ法における抗体またはその断片の代替物としても
使用し得る。パラログはまた、疑似イデオタイプネット
ワーク（PIN）プロファイリング方法における特定のハ
プテンと代替可能なメンバーを、ミモトープのパネルで
スクリーニングするためにも、抗体の代わりに使用し得
る。ここでPINプロファイリング方法は前述の1989年４
月20日に公開されたPCT公開第WO89/03430号に記載され
ている。特異的に結合するパラログはまた、結合すべき
部分が例えば治療上のレセプターである場合にも有用で
ある。
図面の簡単な説明 図１は、FORTRANプログラムで作成された、30個のペ
プチドの多様性セットの特性を示す。
図２は、パラログのパネルを１つ標識被分析物と反応
させる典型的なELISA結合アッセイの、一般的な結果を
示す。
図３は、パラログのパネルを標識ペプチドの混合物と
反応させる典型的なELISA結合アッセイの、一般的な結
果を示す。
図４は、非標識の被分析物の存在下で、標識された混
合物を用い、同じパラログパネルについて相当するアッ
セイを行った場合の、一般的な結果を示す。
図５は、所望の混合物の分離に適当なパラログリガン
ドを同定する、クロマトグラフィーキットの概略図を示
す。
図６は、図５のキットを用い、マイクロタイタープレ
ート上で行った同定の、工程図を示す。
図７は、一連の６種のパラログカラムにイースト細胞
溶解物を適用した結果を示す。
図８は、実施例１に従い合成された、90個の候補ペン
タペプチドパラログのパネルを示す。
図９は、図４のパネル内での、疎水性指数および疎水
性モーメントの変動を示す。
図10は、DDDのためのクロマトグラフィー用基質とし
ての挙動に対する、ペプチドの環化の影響を示す。
図11は、コンピューターで設計した、多様化DNA配列
のパネルを示す。
図12はパラログの具体例がカルボキシメチルセルロー
スに、所定の程度まで類似していく能力を示す。
図13は、DEAEに類似したパラログカラムの、分離後の
処理技術としての使用を、模式的に示している。
図14は、図13に模式的に示した分離物の、SDS PAGE分
析を表す。
図15は、イースト混合物のタンパク質と結合する能力
に関して、チバクロンパネルとパラログパネルとを比較
して示す。
図16は、パラログパネルに対する単一のタンパク質の
結合プロフィールを示す。
図17は、モノクローナル抗体を単一のタンパク質とし
て用いた、図16と同様の結果を示す。
図18は、アフィニティー定数を決定する際の、パラロ
グB85−29に対するウシ血清アルブミンの結合等量線を
示す。
図19は、EPAで同定した11種のフェノール汚染物に関
して、パラログ支持体を含む様々なクロマトグラフィー
支持体の溶出パターンを、比較して示す。
図20−22は、３つの異なるジペプチドパラログを用い
て、11種のフェノール汚染物について得られた溶出パタ
ーンを示す。
発明を実施するための形態 本明細書で用いる用語「パラログ」は、モノマー単位
から構成されるMW＜7500または好ましくは＜5000、より
好ましくは＜1000の短い「ポリマー」であって、被分析
物またはハプテンのような特定の部分に対して特異的ア
フィニティーを有するポリマーのことを言う。このアフ
ィニティーに寄与する「ポリマー」は、もちろん、より
大きな分子に含まれるか、または固相支持体に複合され
得、そしてタンデムコピーとしても供給され得る。前述
のように、ファージのコートタンパク質に結合させて
も、利点が得られ得る。
本発明のスクリーニング方法による選択のためには、
個々のパラログは、パラログが他の物質に結合する能力
に影響を与える少なくとも２つのパラメーターに関し
て、最大化された多様性を有するような、候補パラログ
のパネルのメンバーとして先ず合成される。従って、本
発明のパラログはパネルの合理的な合成のために、パネ
ルのメンバーの間で変化し得る個別のモノマーユニット
の組み合わせにより構成されなければならず、こうし
て、必要な膨大な多様性が調製物において生じる。この
多様性は、パネルを形成するアプローチに依存し、個別
のパネルメンバーの合成の設計を介したパラメーターの
系統的な変更により得られ得、あるいはランダムな混合
物の合成によって達成し得る。
用語「最大の」多様性は、充分広い範囲にわたって、
候補間の特性が変化することを言う。必要とされる範囲
の広さは、意図する用途に依存して変化し得、そしても
ちろん、理論的範囲の限界は、必ずしもそれ自身に達す
る必要はないが、任意の所望する程度にまで近づけ得
る。
結果として得られるパラログは「ポリマー」である
が、ポリエチレンまたはポリプロピレンのようなホモポ
リマーである必要はなく、実際そうではあり得ない。そ
して疑似ホモポリマー、即ち、例えば、個々のモノマー
が変化するが基本的な結合は同一なまま残っているペプ
チドまたは核酸の場合のように、モノマー単位を結合す
るのに同一の型の結合が用いられているモノマー単位か
ら構成されている、である必要はない。広範な様々なこ
のような複合ポリマー分子が、さらに以下に記載されて
いるように、本発明のパラログパネルのメンバーとして
使用され得るが、しかしこれらは全て、実際にスクリー
ニングし得るよりも非常に多くの候補についての合成を
可能にする特徴を共有し、そのため本発明により提供さ
れる設計の系統的方法、および多様性サブセットの調製
の必要性が生じる。
モノマー単位から構成される部分であることの利点の
特徴は、例えば、ペプチドの場合に見られる。一次配列
に６個のアミノ酸を含有するパラログが用いられる場
合、唯20個の天然のアミノ酸を用いて6400万種の可能な
６量体が存在する。もちろん、ペプチドの合成はこれら
の天然に存在するサブ単位に限定される必要はなく、コ
ードされたアミノ酸のＤ−体および様々なコードされな
いアミノ酸、例えばβアラニン、アミノ−酪酸、シトル
リン等もまた使用され得る。このようなコードされない
アミノ酸が多数、周知である。実際、これらは、微生物
の代謝物である「天然の」アミノ酸よりも安定であるこ
とが期待されるので、好適であり得る。
パラログは、免疫系で生じる多様性に匹敵する、空間
的コンホメーションおよび電子分布パターンを提供す
る。パラログはこのように抗体疑似物であると概念化さ
れ得るが、しかしもちろん、パラログが結合することを
意図される部分を投与すると、実際に全ての場合におい
て（またはどのような場合にも）、パラログとコンホメ
ーションおよびパターンの同じパラトープを有した免疫
グロブリンが生じる必要はない。選択された部分につい
て、パラログに、類似した特異的アフィニティーを示す
能力があれば充分である。
用語「特異的アフィニティー」は、選択された部分に
パラログが特異的に結合する能力を指す、即ち、この部
分とパラログとの間の相互作用の強度は、この選択され
た部分上に存在するかもしれない他の物質とパラログと
の間の相互作用よりも有効に大きく、その結果、パラロ
グとの結合が、例えば被分析物と混入物との区別に使用
し得る。特異的アフィニティーの典型的な値は、最小で
103l/moleから104l/mole、好ましくは108または1010l/m
oleのオーダーである。必要とされる値は、選択される
部分が存在する環境、および随伴する物質との相対的な
結合強度とその濃度に依存する。ある場所には、続く溶
出が容易なため、低いアフィニティーが非常に適切また
はむしろ好ましいが、しかしパラログが随伴する物質、
特に高濃度で存在する物質とも強く結合する場合には、
選択された部分からこれらの物質を分離するようにその
結合を設定するために、高いアフィニティーが必要であ
り得る。要約すると、それは、決定的となる随伴物質に
対するアフィニティーと比較した、選択された部分の相
対的なアフィニティーである。しかしながら、特異的ア
フィニティーは好ましくは、pIまたは疎水性指数のよう
な単独の一般化された性質から得られる結果であるより
もむしろ、選択される部分に対して相補的なパラログに
特徴的な、組み合わされた電荷／空間の配置の結果であ
るべきである。
標的物質または基質と「特異的に結合する置換基」と
いう用語は、上記の「特異的アフィニティー」とは幾分
異なる意味を有する。これは置換基が、あるクラスの基
質を捕促回収する能力のことを指すが、そのクラスのメ
ンバー同志を必ずしも区別する必要はなく、好ましくは
区別しない。従って、物質のサブセットに特異的に結合
する置換基の例には、炭水化物および／または糖タンパ
ク質に特異的に結合するボロネート残基；その補酵素を
利用する酵素のクラスに選択的に結合する補酵素；およ
びその基質を利用する酵素に特異的に結合する、酵素の
基質アナログ；が包含される。一般に、あるクラスの物
質に特異的に結合する置換基は、クルードな混合物から
所望の物質群をおおまかに同時に分離するために使用さ
れ、一方、クラスのメンバー同志を識別するためにはパ
ラログパネルの系統的に変化させたパラメーターが用い
られる。置換基そのものが標的部分に結合する能力もま
た、それが存在するパラログの構造にも影響される；従
って該置換基を含有するパラログは、パラログが本来有
する変化と、これらの変化する環境のもとで置換基が誘
引する強度の変化との両者によって、あるクラスの標的
部分のメンバー同志を識別する。
パラログに対する標的部分の結合アフィニティーの評
価は、標準的な免疫学的方法を利用して行い得る。抗原
と高アフィニティー抗体との相互作用のアフィニティー
を測定する方法は標準的である；低アフィニティー抗体
との相互作用は、例えばTakeo,K.ら，J Immunol（197
8）121:2305−2310に記載のようにして測定し得る。Tak
eoらは、ある種のオリゴサッカライドの特異的なミエロ
ーマタンパク質に対する結合定数を、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用い、そしてタンパク質の移動度を測
定する際にゲル中のオリゴサッカライドの性質および含
有量を変化させて、測定する方法を記載している。この
方法はモル当り102−106リットルの範囲の結合定数を得
る場合に有用とされている。Varga,J.M.ら，J Immunol
（1974）112:1565−1570は、相当する範囲での結合定数
を、放射活性リガンドの結合を試験するために免疫グロ
ブリンをグルタルアルデヒドで結合させたナイロン−ポ
リスチレンのウィスカーディスクを用いて、測定するこ
とを記載した。このように、結合を評価し結合定数を定
量するために、マイクロタイターウェルを用いた現行の
標準的な希釈によるイムノアッセイ法に加えて、多数を
プロトコールが存在する。
本発明は、パネルをスクリーニングして、免疫原性で
あり得るまたはあり得ない、広範な種類の選択された部
分に対して特異的アフィニティーを有するパラログを得
る手段、すなわち同定する手段を提供する。用語「同定
する」は、パネルを構成する複数のパラログ中から、所
望のアフィニティー（親和性）を有するパラログを選び
出すことをいう。それ自身ペプチドであり、従って一次
アミノ酸配列の配列上の重複部分に関して、「相補的」
によるアプローチで個々のパラログを直接設計すること
（Geysenの合成／分析方法に、Atassiの相補性設計アプ
ローチを組み合わせた方法）を可能にする部分に加え
て、結合させようとする部分はペニシリン、テトラサイ
クリン、ステロイド、ナプロキセン、テオフィリン、ビ
タミン、例えばビタミンＫ、ＤおよびＡ、のような薬
物、様々な毒素、例えばPCB、ダイコキシン、およびテ
トラブロモエチレン、および特定の条件下で所定の分子
立体配座または形状を有する任意のその他の化学物質を
包含する、任意の起源のものであり得る。本発明の方法
を用いて、事実上あらゆるタイプの部分またはそれらの
所定の領域に対して、特異的なペプチドパラログが見い
出され得る。
上述のように、パラログパネルはまた、パラログパネ
ルそれ自身の中でクラスの個々のメンバーを識別する手
段を提供すると同時に、同定される部分のクラスを回収
する特異的な結合をする置換基も提供し得る。このアプ
ローチの一つの応用として、Du Pontが米国特許第4,49
9,082号に開示したようなボロネート置換基が、例えば
炭水化物それ自身および細胞表面上に見られるグリコプ
ロテインを含むグリコプロテインのような、炭水化物含
有物質を選択的に結合するために使用し得る。カラムに
固定化したボロネートは、例えばMazzio,J.R.ら，BioCh
romatography（1989）４:124−130によって、グルコー
ス含有分子の分離に関して報告されている。ボロネート
残基は糖残基に含まれるシス ジオールに特異的に反応
すると考えられている。ボロネートのアフィニティーカ
ラムは、正常と脱グリコシル化したヘモグロビンの分離
にも、Klenk,D.C.ら、Chin Chem（1982）22:2088−2094
により使用されている。ボロネートの残基は例えば上記
に参照した特許に記載の、α−アミノボロネート誘導体
化されたペプチド酸を利用することにより、容易にパラ
ログパネルに含ませ得る。これらの化合物は式Ｒ−CHB
（OH）２の残基に誘導体化されたＣ−末端のアミド残基
を有するペプチドである。この特許はさらに、CH2B（O
H）２残基が窒素原子ではなく酸素原子に結合した従来
技術のボロネートも参考としている。
同様に本発明に有用であるのは、ボロネート残基をＣ
−末端アミド上の置換基としてではなく、側鎖に有する
アミノ酸から、合成されるペプチドである。側鎖を誘導
体化した改変したアミノ酸は、標準的な固相（あるいは
液相）ペプチド合成で日常的に使用し得る。特異的に結
合する置換基を含ませることは、本発明の方法を、クラ
ス間で相違する結合によってグループのメンバー同志を
識別し、そのことにより、相違結合が適用される群の系
統的な回収を可能にすることに、適用することを可能に
する。
ボロネートの使用はレクチンのような炭水化物結合性
部分の、特異的結合置換基としての使用に類似してい
る。これは、ほとんどの細胞は表面の糖タンパク質によ
り特徴付けられるので、細胞分離技術において特別な利
点を有する。特異的に結合する置換基の包含は、次に、
タンパク質、脂肪、等の他の成分を含有するクルードな
混合物から、細胞を回収することを可能にし、引き続い
て、パラログパネルの分別特性を用いて、集めた細胞を
区別することを可能とする。パラログパネルの様々なグ
リコプロテイン含有細胞に関する分別特性は、標的グリ
コース残基に特異的に結合する置換基の接近し易さの変
化、およびパネル固有の多様性の両者の結果である。こ
の一般的なアプローチの他の適用には、基質アナログを
亜鉛イオン依存性のメタロプロテイナーゼを区別するの
に使用するように、酵素の各クラスを回収するために補
酵素または基質アナログへの接近のし易さを変化させる
ことが包含される。
選択された部分に対するパラログを得ることは、ペプ
チドであれ非ペプチドであれ、候補のパラログペプチド
の間でのスクリーニング手法によりアプローチし得る。
このアプローチでは、他の物質と結合する能力に関する
少なくとも２つのパラメーターについて最大に多様化さ
れた値を有する候補パラログのパネルが、スクリーニン
グのために調製される。このパネルは、従って、広範囲
の電子雲パターンの変化物をカバーするように設計さ
れ、その結果、所望のパラログの近似体が得られる。そ
の付近の別の候補を、微調製のためにさらにテストし得
る。
理解されるように、パラログの他の物質に結合する能
力を決定する電子雲パターンの範囲をカバーするため
に、少なくとも２つのパラメーターが、最大範囲全体で
またそれより少なく変化させられなければならない。用
語「最大範囲全体での変化」は、パラメーターが通常こ
のパラメーターに見い出される有用な範囲をカバーする
値を有し、その範囲が場合に依存し得ることを意味す
る。例えば、等電点pIは、通常約２〜12の範囲で変化し
得る；この限界を超える理論値が確かに仮定され得る
が、実際上、例えばpH0の達するような点は殆ど存在し
ない。どのような種類の最大の変化が有用であるかは、
当業者には明白である。実際、単一のパラメーターの値
に有用な変化を有するパネルは既に存在する、クロマト
グラフィー支持体は、例えばある範囲の疎水性で利用可
能であり、イオン交換カラムがある範囲の荷電密度で利
用可能である。
広範囲の結合アフィニティーをパネルに保証するため
に広く変化し得る、少なくとも２つのパラメーターの確
認は、以下に詳しく記載するように、パネルの候補パラ
ログの化学的性質に依存する。疎水性モーメントおよび
波形因子のようなパラメーターは容易に候補ペプチドに
ついて計算し得るが、例えば核酸のパネルは、ホモポリ
マー領域の数と間隔および対称性指数について変化し得
る。誘導体化したポリサッカライドは、側鎖および荷電
分布が変化し得る。全ての場合において、候補パネルは
少なくとも２つのこのようなパラメーターで最大に多様
化し、こうして膨大な多様性を有するセットが誘導され
る。これは、唯一つのパラメーターが変化するか（疎水
性のみが変化するクロマトグラフィーの場合、またはpI
のみが変化するアンホライト支持体の場合がこれに当た
る）、または非常に小さな範囲にわたって特定されない
変数値を有するか（例えば、シクロデキストリン基に基
づくクロマトグラフィー支持体、または染色色素に基づ
くアフィニティーマトリックスの場合）のどちらかであ
る、従来のアプローチとは対照的である。
例えば、チバクロン色素のアナログである一連のアフ
ィニティーリガンドに基づいた、タンパク質の分離に有
用なクロマトグラフィー支持体を経験的に選択するため
のキットが、ICNから市販されている。これらの色素
は、非ポリマー性であり、非常に狭い範囲でしかその性
質が変化しない。色素の非ポリマー性の性質のために、
構成成分の性質の系統的な変化は、パネルのメンバー間
にこのような広範囲の値を得る機会を与えない。これと
は対照的に、本発明のパネルは少なくとも２つの特異的
パラメーターにより特定された電子立体配置および電荷
等高線地図によって、多様性の範囲が与えられる。以下
に詳しく記載するように、本発明のパネルの変化は３つ
の一般的方法で達成される:2つまたはそれ以上のパラメ
ーターの系統的な変化に基づいてパネルを設計する；相
補的な最大に多様化された対向パネルに対して、ランダ
ムに生成したパネルをスクリーニングする、これは系統
的に２つのパラメーターを変化させた設計を介して達成
される；または、ランダムなパネル同志で繰り返し行っ
たスクリーニングを統計的に分析する。この最後の選択
肢は、２つのランダムなパネルのメンバーの交差反応に
基づき選別した結果の「ブーツのストラップ」法であ
り、上記で参照したPCT出願WO89/03430に詳しく記載さ
れている。最大の変化を提供する能力の優れた結果は、
色素に基づくパネルを以下の実施例６に記載の本発明の
パネルとを比較することにより示される。
合成の観点から非常に好都合な一セットのポリマー
は、ペプチドから構成される。なぜならば、天然に存在
するコードされる残基およびその他の両方の、アミノア
シル残基の特性は、ポリマー配列の群の合成に系統的な
様式で非常に容易に組み入れられる範囲の特性を提供す
るからである。このようなペプチドは、もちろん、一般
に認識されている方法を使用してアミド結合を他の形態
に改変することにより、結合の性質をそれらが「疑似ペ
プチド」と見なされ得るように修飾し得る。特に、ペプ
チド結合は、当該分野に周知の方法により他のタイプの
結合、例えば−CH2NH−、−CH2S−、CH2CH2−、−CH＝C
H−（シスおよびトランス）、−COOH2−、−CH（OH）CH
2−および−CH2SO−で置き換え得る。以下の参考文献は
これらの他の結合部分を包含するペプチドアナログの調
製を記載している:Spatola,A.F.,Vega Data（1983年３
月）,Vol.1,Issue 3,“Peptide Backbone Modification
s"（一般的総説）;Spatola,A.F.,in“Chemistry and Bi
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州特許出願第EP 45665号（1982）CA:97:39405（1982）
（−CH（OH）CH2−）;Holladay,M.W.ら，Tetrahedron L
ett（1983）24:4401−4404（−CH（OH）CH2−）；およ
びHruby,V.J.,Life Sci（1982）31189−199（−CH2−Ｓ
−）。特に−CH2NH−が好ましい。
ペプチドはそれ自身は、例えば固相ペプチド合成の様
な当該分野で良く知られた手段によって、化学的に合成
し得る。この合成は、α−アミノが保護されたアミノ酸
を用いて、ペプチドのカルボキシル末端から開始する。
他の保護基が適切である場合を含め、全てのアミノ基に
ｔ−ブチルオキシ−カルボニル（Boc）保護基が使用し
得る。例えば、Boc−保護されたＣ−末端残基をエステ
ル化し、クロロメチル化されたポリスチレン樹脂支持体
として得る。このポリスチレン樹脂支持体は、好ましく
は、ポリスチレンポリマーを特定の有機溶媒に対し完全
に不溶性にする架橋剤として、約0.5〜２％のジビニル
ベンゼンを含有する、スチレンのコポリマーである。St
ewartら，Solid−Phase Peptide Synthesis（1969）W.
H.Freeman Co.,San FranciscoおよびMerrifield,J Am C
hem Soc（1963）85:2149−2154を参照。これらおよび他
のペプチド合成法が、米国特許第3,862,925号、第3,84
2,067号、第3,972,859号および第4,105,602号にも例示
されている。
合成は、手動の方法、あるいは、例えばApplied BioS
ystems 430Aペプチド合成機（Foster City,Californi
a）またはBiosearch SAM II自動ペプチド合成機（Biose
arch,Inc.San Rafael.California）を、製造業者の提供
する説明書の指示に従って、用い得る。
あるいは、ペプチドパラログは、良く知られた方法に
従って調製された組換えDNA構築物の発現により産生し
得る。このような産生は大量に提供するために望まし
く、そしてコードするDNAの混合物を用いることによ
り、パラログの多数の実施態様が得られ得る。パラログ
の候補の複数のメンバーが産生されるが、混合物はただ
ランダムなだけである。しかし、ペプチド配列は比較的
短いので、組換え産生は容易である。完全にランダムな
DNA配列がパラログの合成に使用し得るが、一方、個々
のヌクレオチド塩基ではなくトリプレットをランダムに
すると、この方法はより効率的になり得る。加えて、組
換え産生が特異的に設計されたパラログを産生するのに
使用し得る。もちろん、これらのパラログは遺伝子にコ
ードされるアミノ酸で構築されたものに限定されるか、
あるいはこのようなアミノ酸から容易に形成され得るも
のに限定される。
ペプチドの環状型もまた一般に知られた方法を用いて
得られ得る。クロマトグラフィーに適用するには、固相
支持体に直鎖化合物を結合させた後に、分子内（分子間
ではなく）の結合を推進するような環化反応を行うこと
が有利である。ジスルフィド結合は、システインまたは
システインアナログ残基を有するペプチドを、ジスルフ
ィド結合を形成し得る試薬、例えば穏和な酸化条件で、
反応させることにより形成される。アミノ酸の側鎖を含
むエステルおよびアミドは、適切な保護／脱保護プロト
コールにより合成して得られ得る。脱保護に必要な条件
は保護基によって変化することは理解される;F−mocは
有機塩基であるピペリジンにより脱離するが、側鎖保護
基は一般に塩基に安定な基で保護され、希トリフルオロ
酢酸（TFA）に不安定である。他の一般に用いられる保
護基ｔ−BocはTFAにより脱離するが、他の側鎖保護基
は、例えばフッ化水素のようなより強い条件での処理に
のみ不安定なものが使用し得る。従って、保護試薬は、
その基の相互作用が骨格鎖を形成する基から、除去され
得、一方、側鎖のカルボキシル、アミノ、およびヒドロ
キシル基、例えばリジンのアミノ基、アスパラギン酸の
カルボキシル、およびトレオニンのヒドロキシル基、が
ペプチド合成の間の脱保護に安定な基で保護される。ペ
プチドが合成された後、ペプチド鎖に例えば３〜４残基
離れて存在するアミノ酸上のこれらの基の脱保護を行
い、次にジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）のよ
うな標準的ペプチド結合形成試薬を用いた処理の結果、
これらの３〜４アミノ酸の分子内ループを生じる。パラ
トープを模倣し、あるいは特異的結合を示す環状型のペ
プチドは、本出願人の1989年５月10日に公開されたPCT
出願WO89/90233に記載のように、「分子接着」の使用を
介して三次元コンホメーションを制御することで得られ
得る。また、例えばPierce Chemical Co.,Rockford,IL
から市販されている、ホモまたはヘテロの二官能性リン
カーを用いて架橋を行い得る。
ペプチドパラログの別の改変では、個々のアミノ酸残
基は、立体配座の拘束を導入したペプチド様部分により
分離し得る。例えば、下式の「アミノアシル」モノマー
は、ペプチド合成時に「正常な」アミノアシル残基の間
に使用し得る。
あるいは 最大の変化が得られるためのパラメーターの選択は、
パラログの性質に依存する。ペプチドであるパラログで
は、あるいは、変化させた結合を有するペプチドおよび
／または上述したそれらの環状型のペプチドのようなペ
プチドと関連した化合物では、少なくとも７種のそのよ
うなパラメーターが変化のための有用な候補である。こ
れらのパラメーターの内の２つは、すなわち疎水性指標
および等電点は立体配座にはあまり依存しない。これら
の内の５つは、立体配座に依存し、疎水性モーメント
（ペプチドの両親媒性または極性および非極性残基の分
布の非対称性の尺度）；側鎖の双極子モーメント電荷の
分布の非対称性の尺度）；波形因子（本発明者により定
義されるもので、表面の輪郭、例えば、らせんのバック
ボーンに沿った大きな側鎖の分散および分布の、変化を
測る）；芳香性（パラログに含まれる芳香族残基間のπ
−π相互作用の尺度）；および電荷原子間の直線距離が
含まれる。これらのパラメーターを、順に議論してゆ
く。
等電点pIは、その公知の慣用的な意味を有し、対象の
分子が電気的に中性であるpHを指す。pIは、リジン、ア
ルギニンまたはヒスチジンのような、中性pHで正に荷電
している塩基性アミノ酸の数を増すことにより、より高
い値に変更し得る。pIは、アスパラギン酸またはグルタ
ミン酸のような中性pHで負に荷電している酸性アミノ酸
の相対的な数を増すことにより、より低い値に変更し得
る。正および負に荷電している基を均衡させることによ
り、または非荷電アミノアシル残基を使うことによっ
て、中間のpI値を達成し得る。遺伝子にコードされるア
ミノ酸は、参考とすることが簡便なために使用したが、
任意な適切なアミノアシル残基が、遺伝子によりコード
されているかどうかにかかわらず、天然かどうかにかか
わらず、および、ＤまたはＬまたはメソ型であるかにか
かわらず、使用し得ることは、もちろん理解される。
構造と関連付けた疎水性指数の議論は、Eisenberg、
D.R.M.ら、Faraday Symp Chem Soc（1982）17:109−120
およびJanin,J.、Nature（1979）277491−492の中に見
い出し得る。もちろん、この疎水性に関する指数は、フ
ェニルアラニン、バリン、イソロイシン、その他のよう
な疎水性残基の数を増すことにより、変化し得る。より
低い疎水性指数への変更は、親水性または荷電アミノ酸
を使用して行い得る。この疎水性モーメントは、ペプチ
ドの両親媒性の特性によって決定され、残基の周期的疎
水性を調節することにより、変化させ得る（Eisenberg,
D.ら、Proc Natl Acad Sci USA（1984）81140−144;Eis
enberg,D.ら、Nature（1982）299:371−374）。両親媒
性の特性は、ペプチドの２次または３次立体配座に関係
し、ある分子が水溶性であり、他の分子が疎水性である
という、分子の特性または外観に現れる。この特性およ
び残基の立体配座を考慮に入れると、このパラメーター
は、容易に調節し得る。側鎖の双極子モーメントは、正
または負に荷電したアミノ酸残基の存在または配置によ
る電荷パターンを反映する。波形因子は、大きな置換基
の分布および表面輪郭上でのその影響を反映する。
より詳細には、疎水性指数（hi）は、ペプチド中のア
ミノ酸の、アミノ酸構成成分の個々の疎水性指数の和で
ある。ｎ個のアミノ酸のペプチドについて数式化する
と、下式になる： 立体配座に依存するパラメーターは、それぞれの場合
に、適切な特性関数のフーリエ変換演算子、すなわち周
期の周期性の成分の強度δを用い、同様なアプローチに
より計算し得る。ここで「δ」は、α−ヘリックス（10
0゜）またはβ−シート（170゜）に一致するように定義
される。適切なδ値は、ペプチドに通常仮定される立体
配座に依存するか、あるいはペプチドの設計者に制御さ
れる値を採用する。
しかし、１つのセットのメンバーの中での付与したパ
ラメーター間の一般的な関係は、立体配座についてなさ
れた仮定に関わらず、あまり変化しない。従って、セッ
トの全てのメンバーが、例えばα−ヘリックス立体配座
であると仮定して上記パラメーターを計算すると、パタ
ーンについて得られる多様性は、たとえばペプチドが実
際にはα−ヘリックスの形でなくても、あまり変化しな
い。この結果は、通常の意図した立体配座を得るために
は不十分な長さの非常に短いペプチドに関する場合、特
に重要である。
従って、疎水性モーメント（hm）、双極子モーメント
（dm）、および波形因子（cf）の、３つのパラメーター
の計算は以下のように示される： ここで、hmの場合、Ｈはhiであり、dmの場合、ＨはpH
7での全体的な電荷であり、cfの場合Ｈは体積である。
上述したように、これらのパラメーターを次に計算す
るのに必要な、コードされるアミノ酸の特性値を計算す
るのに必要な個々のアミノ酸の特性値を、表１に示す。
第６のパラメーターである芳香性は、芳香族アミノ酸
を含有させることにより提供され、そのようなアミノ酸
には、天然のアミノ酸では、フェニルアラニン、チロシ
ン、およびトリプトファン、これらの天然残基のＤ型、
およびＰ−アミノ安息香酸およびフェニルまたはナフチ
ル−β−アラニンのような他のコードされないアミノ酸
がある。被分析物に遭遇した場合、得られたパラログの
芳香性は、芳香核の間のπ−π相互作用が電子雲配置を
変化するので、含まれている芳香族残基の数のみでな
く、分子の立体配座にも依存する。芳香性は、それ自身
芳香性の性質の物質を分離するとき、特に重要な特性で
ある。下記の実施例９で説明されるように、環境保護委
員会により特別の問題として指摘された11のフェノール
含有汚染物のクラスの様々なメンバーは、芳香族を有す
るパラログを使用して、都合良く分離および同定がで
き、そして適切なパラログがパネル内の前記芳香性の変
化により同定し得る。
第７の変数である電荷原子間の距離もまた、立体配座
依存性である。予期される立体配座および荷電した基の
性質に基づくコンピューター設計のモデルを、予め決定
された配置を有するパラログを設計するために使用し得
る。この変数は、ペプチドに応用し得、また誘導体化し
た炭水化物にも応用し得る。事実、ペプチドに基づくパ
ラログは、よく知られたクロマトグラフィーの支持体で
あるジエチルアミノエチルセルロース（DEAE）（離れた
正の荷電を提供する）およびカルボキシルメチルセルロ
ース（CM）上の様々な複数の荷電部分を模倣し、あらか
じめ決定された配置の負に荷電した原子を与えるよう
に、設計し得る。配置のそのような変化は、サイズ分別
法に基礎を提供、および様々なDNA断片のようなポリマ
ー性荷電分子の分離に、特に有用である。
ペプチドパラログの設計はさらに、α−ヘリックスの
形成を促進し、そして立体配座を安定化させるシステイ
ン残基間のジスルフィド結合の形成をするα−アミノイ
ソ酪酸（AIBA）の能力、特定残基の既知の特性を利用し
得る。パラログは非生物学的技術を使って合成し得るの
で、所望する特性を賦与するのに有利な、特異的に設計
された側鎖を有するアミノ酸またはそのアナログが使用
し得る。
最初の候補パネルは簡便にするため、約90−100ペプ
チドまたは関連する化合物から構成し得る。これは、市
販のマイクロタイタープレートおよびタンパク質合成機
のロッド（Cambridge Research Biochemicals）全体の
デザインを反映し、所望のパラログの特性を作成する充
分な個々の試験を提供するために便利な数である。この
合成は、従来の、通常得られる方法を使って行われる。
選択されたパラメーターに最大の多様性を有するセッ
トを設計するためにいくつかの方法を使用し得る。１つ
のプロトコールでは、例えば最初に形成されるパラログ
は、各位置がランダムに選択されたアミノ酸を有する。
次の候補もまた、ランダムな選択により構築され、２つ
あるいはそれ以上の測定され計算されたパラメーターに
ついて、最初の候補との差異が比較される。これらのパ
ラメーターに実質的な違いがあるかどうかにより、この
候補ペプチドは残されるか、あるいは棄却される。より
多くの候補がテストされるにつれて、その候補が、セッ
トの中で既に保持を保証しているものに充分近い特性を
有する可能性、および、構成要素がセット中に残される
前に形成されスクリーニングされる必要のある候補の数
が、当然大きくなる。このプロセスは、最後の１つが受
け入れられた後に、多くの候補を試験しても受け入れら
れなくなるまで、続く。一般に、予期されるパターン
は、下記のように示される。
ここで、形成および選択のプロセスは、表示されてい
る領域のどこかで、停止する。
48種の最終パネルを得るためには、手による最後の細
かい調整を可能とするために、約96の種々の候補を最初
に与えることが好ましい。例えば、バックボーン双極子
モーメントと比較した、側鎖の双極子モーメントが、考
慮し得る。全ての変化させたパラメーターで特性の分布
が存在するように、すなわち、Ｘ値をグラフ上の“cumb
ersome"領域より決定し、各ペプチドが他の全てと最低
Ｘ％（０〜100の単位スケール範囲に規格化した後）異
なるように、最終パネルを再び見直すべきである。従っ
て、各ペプチドは、２つあるいはそれ以上のパラメータ
ーの少なくとも１つに関して、セット中の他の全てのペ
プチドと実質的に違う。このアプローチは、計算が合成
よりも簡単であるために有利である。しかし、完全な多
様性は、立体配座の熱による変動により、決定できない
部分がある。
平均６個のアミノ酸からなる、30のポリペプチドの多
様なセットの調整のための、このアプローチの実践のた
めのコンピューターによる減少の結果を、図１に示す。
この例では、５つの全てのパラメーターが評価された。
このプログラムは、ランダムなペプチド配列を創製し、
そのために５つのパラメーターを計算し、以前創製され
た配列に類似する特性を有するものは棄却した。各パラ
メーターの至適な値を確立する試行の後、５つの範囲の
全てを３つに分割し、その結果、35で定義されるすなわ
ち243の特異な特性の組み合わせ（“bins"）が確立され
た。提案された6mersの最初の約200のランダムな配列か
ら、243の内の50binsが満たされた。続いて次の50を満
たすためには、約2,000以上の別の配列を試験すること
が必要とされ、そしてさらに別の何千もの配列は、ほん
の約十個の新しい組合せの創製にしか寄与しない。ラン
ダムに創製された配列の独立した複数のセットで、同じ
サブセットのbinsが満たされることが見いだされ、この
ことは、全ての組み合わせがこれらのモノマーで物理的
に達成されるわけではない、例えば、１つのペプチドが
同時に高度に疎水性でかつ高度に荷電し得ない、ことを
意味する。
図１に示したように、等電点および疎水性の変化は、
Ｘ軸およびＹ軸に従って、それぞれプロットされる。図
内の記号は、疎水性、体積、荷電の各要素の分布を示す
立体配座依存性のパラメーターが、Ｘは高、波線は中、
そして０は低であることを示す。従って、この図は、ラ
ンダムなセットが都合良く設計されることを示してい
る。
前述したように、コンピューターによる設計即ち系統
的な設計に関して、ある種のありえないパラメーターの
組み合わせが存在する、例えば、同じパラログが、同時
に高度に荷電されかつ高度に疎水性では容易にありえな
い、ことが認識されている。適切な数のペプチドのみ
が、上記の結合に関連する全ての既知の特性を良くカバ
ーするものを提供するために必要とされることが見い出
された。これは、ペプチドと抗体の相互作用の結合には
ほとんど影響を与えずに、天然のアミノ酸配列の膨大な
変化が可能であるという以前の研究と一致する。Lerne
r,R.A.,Nature（1982）299:592−596;Geysen,H.M.ら、P
roc Natl Acad Sci USA（1984）813998−4002。
ペプチドのあるいは他のパラログパネルの最終的選択
は、例えば５元または７元のペプチド空間の、近づき易
い部分の、サンプリングの均等性を改善するために、一
般に機械を用いずに行われる。
多様なパネルの調製のための第二のアプローチは、ア
イソエレクトリックフォーカシング用の両性電解質の調
製に使用されるものと類似している。これらの両性電解
質を調製するために、典型的には、負電荷を与えるため
にはスルフォネート、そして正電荷を与えるためにはア
ミノ官能基である荷電官能基に連結させることにより、
デキストランを誘導体化する。この反応でランダムな分
布の誘導体が製造される。得られた両性電解質は、次に
単一のパラメーターpIのある範囲で、アイソエレクトリ
ックフォーカシングにより選別され、リガンドが得られ
る。この別のアプローチを本明細書の発明で応用するた
めに、この化合物はランダムに合成されたポリマーであ
り、次にそれらのポリマーは、少なくとも２つのパラメ
ーターの設計された系統的な変化で調製される、最大の
多様性のセットを有する候補パラログと結合するそれら
の能力により、分離される。従って、例えば上述したよ
うに、ペプチドまたは候補パネル部分としてのそれらに
関連した化合物を使用して、最初のあるいはモデルの多
様性パラログパネルをいったん設計すると、このパネル
の多様性は、非ペプチド成分のポリマーを含む他の物質
の混合物を、このランダムな混合物のメンバーとモデル
パラログパネル中の各候補ペプチドとを特異的に結合さ
せることによって、多様なセットに分離するために使用
し得る。これにより、モノマーユニットの変化によるラ
ンダムに変化し得る、膨大な多様性を有するパネルの合
成がポリマーに対しても可能となるが、そのポリマーに
対して、それらの化学的タイプに関連した特定の２つの
パラメーターの分析的評価は困難である。
従って、ペプチドの場合には、芳香性パラメーターお
よび電荷間の直線距離の系統的な直接計算は、他の５つ
のパラメーターの分布の計算よりも実行に値し、これら
の特性に多様性を有するパネルは、これらの特性の変化
を有するランダムに創製された候補の中から、例えばpI
および側鎖の対称性によるパネルの多様性を使用して、
分離し得る。
この方法の範囲には、２つのランダムに創製されたパ
ネルの相互作用の繰り返しを含む。多様性が両方に付加
されるようにするため、パネルを交互に、互いに他に対
してチェックする。例えばパネルＡからの各候補は、パ
ネルＢに関してプロフィールを作成される。以前試験さ
れた候補と類似のプロフィールをもつ候補は、棄却す
る、あるいは、別の言い方をすれば、パネルＢに関して
類似のプロフィールを有する候補のグループの内の、多
くて１つが残される。これによって、多様で、そしてメ
ンバーの数を大きく減少させたパネルＡ′が得られる；
次にパネルＢを、今や多様となったパネルＡ′でスクリ
ーニングし、そして同様な選別プロセスで、類似のプロ
フィールを有する１つのグループの候補メンバーのみが
パネルＢ′に残される。一般に、パネルＢ′は、パネル
Ａ′よりも広い範囲の多様性を有する。このプロセスを
次に逆転し、パネルＢ′に対して残っているパネルＡ′
のメンバーをスクリーニングし、そしてこのプロセス
を、所望の度合の多様性が得られるまで続ける。簡潔に
言えば、最初候補パネルは、計算によるか、または単に
多様性の大きいセットからのランダムな選択によるかの
いずれかで、得られる。この多様性の大きいセットは次
に、最初のセットに対する異なる結合により分類され
る；このセットの充分に分離されたメンバーは次に、最
大の多様性を有するセットへの次の近似として使用され
る。
パラログはペプチドまたはそれらの近縁物から構成さ
れる必要はないと、以前に記載した。ペプチドに関して
上述した特性に類似した少なくとも２つの尺度に多様性
が得られる別の実施態様もまた使用し得る。唯一の必要
条件は、パラログがその特性を系統的に変異し得るよう
に、可変部分から構成されなければならない、という点
である。例えば、核酸配列は、様々なタンパク質に対し
て、異なる特異的結合特性を有することが知られてい
る。事実、遺伝子発現の調節は、遺伝子物質中の特定の
配列に特異的親和性を有する、これらの特異的結合タン
パク質により起こると理解されている（例えば、Tjian,
R.ら、Science（1989）245:371−378を参照）。pIおよ
び疎水性指数のようなペプチドの多様性に関連した多く
のパラメーターが、この場合には変更が難かしく、範囲
内の値が都合よく作成し得るGC/AT比のような他のパラ
メーターを作った。全体的なGC/AT比に加えて、１本鎖
上でのGCのATの配置および変化、（AAAAおよびGGGGのよ
うな）ホモポリマーの伸張の数および配置、および鎖の
中の対称領域の性質および配置もまた変化し得る。対称
領域の場合、例えばGATXATCのような相補的（dyad−typ
e）の対称性（パリンドローム配列とよく誤認される）
を示すものは、塩基対形成による鎖内ループの形成をす
ることが知られており、幾つかの制限酵素を含むダイマ
ータンパク質によって認識される部位の中でも、また特
徴的であることが知られている。GATTAGのような本物の
パリンドロームは、特性に異なる効果を有する。前述し
たものは多くのパラメーターを提供し、どのような場合
でも、それらのうちのどの２つも本発明のパラログパネ
ルを製造するために最大に変化させ得る。核酸は容易に
合成されるので、候補パラログとしてこれらのポリマー
化合物を使用することには、大きな利点がある。また、
核酸／タンパク質の特異的相互作用が起こることが知ら
れているので、ランダムに構成された核酸混合物を、前
述の多様なペプチドパネルの個々のメンバーへの結合に
よって、分離し得る。
さらに、ポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）
の有用性は、タンパク質を含む任意の標的分子に特異的
に結合する、DNA（またはRNA）配列の合成を可能とし
た。従って、候補パラログの最大の多様性のペプチドパ
ネルに対応する逆のパネルは、これらの方法（Tuerk,C.
ら、Science（1990）249:505−510;Ellington,H.D.ら、
Nature（1990）346:818−822）を利用することによって
構築し得る。このプロセスもまた、繰り返し得る。異な
るペプチドのパネルへの候補核酸の結合は、より多様な
第２の核酸パネルを与える。
予め決定された配列および随意な配列の核酸ポリマー
を構築する方法は、充分に確立されている。原理的には
適切なDNAフラグメントを、天然材料から分離し、本発
明の方法に従って使用し得るが、必要な多様性を有する
新規な特性を持った核酸配列を設計および合成すること
が明らかに好ましい。市販の方法には、本発明のパラロ
グを現すのに充分な長さ以上のDNAフラグメントの、固
相に基づく合成を含む。
同様なアプローチは、ポリエチレンとポリエチレング
リコールとのサブユニットの組合せのように、親水性と
疎水性の成分のコポリマーによって形成されるもののよ
うな、別の形態のパラログの調製に都合がよい。別の親
水性／疎水性またはメタクリル酸のような潜在的に荷電
したモノマーユニットは、これらの構築物の中に使用し
得る。例えば、PEGとポリ塩化ビニルのコポリマー、お
よびメタクリル酸とプロピレンのコポリマー、などを形
成し、そして次に、最大の多様性を有する実施態様に分
離し得る。
同様に、炭水化物をは、様々なランダムな水準で、硫
酸およびアミンのような荷電基を誘導体化し得、そし
て、pIのみでないそれらの多様な特性によって分離する
ことで、これらのセットに、例えば置換クロマトグラフ
ィーで使用するための、より細かい分別能力を与え得
る。様々な特性を有するホスホジグリセリドもまた構築
し得る。
もちろん、パネルメンバー中の多様性は、全てのパネ
ルメンバーが同じ一般的属性、即ちペプチド、炭水化
物、核酸など、であるとき、最も簡単に計算し得るが、
目的が、記号の操作ではなく、電子雲パターンに最大の
多様性を有するパネルであるため、なぜパネルがこれら
の代表的なパラログタイプの混合物を使用して構築され
得なかったのか、理論的な理由はない。従って、選択さ
れるパラメーターの多様性が維持される限り、パラログ
候補パネルは、ペプチド、炭水化物、コポリマーを合理
的に包含し得る。
従って、簡便に利用し得る最も所望するパラログを得
るためのスクリーニングのプロセスにかけ得る最大の多
様性を有するパネルを提供することが、本発明の機能で
ある。このパネルは、スクリーニング法を行うためのキ
ットとしてパッケージし得る。そのようなキットのさら
なる詳細は、下記に示したスクリーニング法の記載の通
りである。
スクリーニング法 １つのアプローチでは、最も有利な候補パラログのた
めのパネルのスクリーニング法は、繰り返し使用し得
る。なぜなら、特異的親和性の検出に使われる、結合に
基づくアッセイが、一般に可逆的であり、その結果試験
組成物を引き続き、固形支持体に結合したまま残るパラ
ログパネルから、実質的に除去し得るからである。その
ようなアッセイを回収可能な形態で、または固形支持体
に結合して行う必要はないが、そうすることは非常に便
利である。
パラログをクロマトグラフィーのアフィニティーリガ
ンドとする、一つの意図された使用法では、再利用でき
ることは、特に便利である。なぜなら、一連の提案され
た溶出溶媒システム中で、相対的結合強度を系統的に試
験し得るからである。例えば、上昇していく濃度のメタ
ノールを含む一連の溶液、または溶出グラジエントをシ
ミュレートした上昇する塩濃度の溶液中での結合強度が
使用し得る。このタイプの試験では、多くのパラログの
挙動の比較を、多くの溶出条件下で、経験的に試験し得
る。パラログＹを、ただ１つのみの溶媒または温度条件
で試験した場合に、好ましい特異的アフィニティーレベ
ルを有するようであっても、パラログＸで得られた結合
アフィニティーグラジエントが、所望する溶出条件下
で、パラログＹで得られた結合アフィニティーグラジエ
ントよりも好ましいものであり得ることは非常に重要な
ことである。従って、テストパネルの再使用可能性は、
クロマトグラフィー法の使用をシミュレートした１つの
パターンの条件下で、最良のパラログの選択を可能とす
る。
このパネルは試験のために作成されているが、このパ
ネルを次に、選択された部分に対するメンバーの特異的
アフィニティーに関して試験する。理論的には、その部
分を標識し、パネルの個々のパラログメンバーに結合し
た標識の相対量を検出することによって、直接行い得
る。このアプローチを用いて、図２に示したものと類似
したパターンが得られる。図２に示したように、パネル
の各メンバーに結合した標識の量（Ｙ座標）は、パネル
のメンバー全部（Ｘ座標）に対して示される。標識量の
変動が、その部分に対する各パラログのアフィニティー
に依存して得られる。酵素活性のような「標識」また
は、部分の他の検出可能な特性もまた使用し得る。
この検出方法の代替法は、ある場合には、より実際的
である。この代替法では、特異的アフィニティーは、未
標識部分と、標識したペプチドまたは他の適切なリガン
ドとの競合によってアッセイされる。部分が存在しない
場合には、標識した混合物自体により全てのパラログに
過剰のまたは過少の等価な結合が得られるように、この
混合物は充分な量のメンバーを含まなければならない。
パネルのメンバーに対する未標識物質の結合の検出のた
めの、この一般的なアプローチは、1989年４月20日に公
表された、PCT公表WO89/03430に、より詳細に記載され
ている。
要約すると、必要な数ランダムなリガンド（おおよ
そ、500−1000のオーダー、しかしより少ない数で充分
な場合もある）の混合物を、適切な方法で標識し、例え
ば、ペプチドの場合は、Bolton,A.E.ら、Biochem J（19
73）529−539に記載され、そしてICN Radiochemicalsか
らの市販の125Iを用いるアシルヨウ素化法、を使用して
標識される。混合物は、個々のメンバーを合成し、そし
てそれらを混合することによって直接に調製し得、ある
いはより簡便に、大きなタンパク質をあるいは他のポリ
マーをランダムな小さなペプチドまたは他のオリゴマー
に加水分解して、調製し得る。１つのアプローチは、例
えば、イースト溶解物のトリプシンによる部分加水分解
物（Cleveland,D.W.ら、J Biol Chem（1977）252:1102
−1106）を利使用している。この方法は、混合物として
標識し得、または例えば、SDSゲル電気泳動を使って分
離し、それらの結合を個々にアッセイ場合には、Immuno
dyne（Burnette,W.N.,AnalBiochem（1981）112195:20
3）のようなテスト支持体に転写し得る、多数くのペプ
チドを提供する。
パネル中の全ての候補パラログに関して、充分な結合
が起こることを確認することが、標識リガンド混合物を
利用する際に必要である。パネル全体にこの等価な結合
を行わせる条件もまた、経験的に確立しなければならな
い。完全な状況では、リガンド混合物は、図3Aに示した
ように全てのパネルメンバーに均等に結合する。しか
し、もっと頻繁には、図3Bに示したように、類似のレベ
ルの結合のみが見られる、このことは、被分析物と競合
させるための、完全に有効な基礎を与える。競合物に付
加した場合の結果の解釈は、結合値を、競合を評価する
前の同じ値に規格化することによって、単純化し得る。
標識したリガンド混合物が、選択された部分が存在し
ない場合に全ての候補リガンドにおおよそ等価に結合す
る、あるいは同様の結合が標準化された場合、被分析物
のような、所望する部分の存在下でスクリーニングを繰
り返す。この部分に対する特異的親和性を有する、それ
らの候補は、標識したリガンド混合物との複合の低下を
示し、この低下はこの部分に対する候補の特異的アフィ
ニティーに比例する。典型的な競合のパターンを、図４
に示した。両座標の意味は、他の図と同様である。しか
し、選択された部分に最大のアフィニティーを有するパ
ラログは、この図が、パラログに対する選択された部分
と標識リガンド混合物との競合を示しているので、最低
のレベルの標識を示す。部分が競合する能力を評価する
ことで、標識の取り込みに最大の減少を示すパラログ
を、選択された部分との結合に最も好ましいパラメータ
ーを有するものとして、選択する。
このスクリーニングのプロセスを、最終的に選択され
るパラログの分子形態および電荷分布パターンを微調整
するために、最初のパネルで最大の特異的アフィニティ
ーまたは最も望ましい溶出パターンの挙動を示したメン
バーの特性の中間の特性を有する別のパネルによって繰
り返す。このスクリーニングは、要求される特異的アフ
ィニティーの度合いまたはクロマトグラフィー挙動が得
られる迄、任意の数のパネルで、任意の数の回数、繰り
返し得る。パラログパネルの電子雲パターンは、選択さ
れた部分に対するパラログのアフィニティーを最適化す
るために、系統的に操作し得：もしこのパラログをクロ
マトグラフィー法でアフィニティーリガンドとして使用
する場合、親和性が大きすぎて溶出が困難なものは望ま
れ得ず、適切なパターンが選択されるべきである。立体
配座制御の効果もまた、前述したように、使用し得る。
別の実施態様では、パラログは、固体支持体への連合
により、それらの意図した使用をシミュレートするため
の方法でパッケージし、支持体を次に図５に模式的に示
したように、クロマトグラフィーのミニカラムとしてパ
ッケージする。多様な候補パラログを提示する所望の数
のカラムをは次に、タンパク質または所望する被分析物
を含む他の混合物と接触させる。通過容積を捨て、次に
カラムを、濃厚塩のような適切な溶出溶媒で溶出する。
溶出液を次に、目的の被分析物が存在するかしないかに
関して検査する。
図５に示した画では、溶出液を、タンパク質混合物か
らの被分析物吸着のパターンを調べるために、SDS−PAG
Eによる分析を行った。図に示したように、多様なパラ
ログのセットは、テストサンプルとして使用した複雑な
混合物から、異なるタンパク質を吸着および溶出し得
る。
図６は、図５中に最も単純な形態で略示したアプロー
チの模式図を、同時に模式的に、しかし幾分詳細に示し
ている。図６に示したように、サンプルを、図6Cに示し
たように、小型クロマトグラフィーカラムのセットがつ
いたマイクロタイタープレートのウェルの中に、所望な
らば複数のピペットデリバリーチップを使って入れる。
これらのミニカラムを、これも図6Cに示したように、通
過液を回集するための別のマイクロタイタープレートと
並置する。図6Aに示したように、サンプルを入れた後、
未結合のフラクションを、液体をミニカラムを通して受
容プレートに押し出すためにプレート層を遠心し収集す
る（図6B）。未結合のフラクションを、所望ならば保存
し、あるいは捨てる、このミニカラムを次に、任意の都
合の良いバッファーまたは他の溶出液を使用して溶出
し、そしてその溶出液フラクションを遠心によって回集
する。未結合のフラクションを含む通過容積および吸着
したフラクションを含む溶出液の、いずれかまたは両方
を、示したように平行サンプルを使ってSDSゲル上で分
析し得る。ゲルを展開させるための任意の方法が使用し
得；銀染色が、その一般的な適用性のために、好まれ
る。
底部が膜製のマイクロタイタープレートは、例えばPa
ll Corporationから、市販されている。これらのマイク
ロタイタープレートは、ウェルの底部に、固体支持体の
沈殿層を支持し得る膜を含む。この膜は真空あるいは遠
心分離によって圧力差が付加されない限り、流体を透過
させない。したがって、ウェル中の吸着剤は、適当な溶
液を加え、その後必要な圧力勾配を生じさせて溶液をカ
ラムに通過させることにより、擬似クロマトグラフィー
のカラムとして試験され得る。
このアプローチをイーストの加水分解物および一連の
６つのパラログのカラムに適用した結果が図７に示され
ている。この図示された実験においてはイースト（Sigm
a Y−2875）の全細胞のライゼートをDEAEセルロースで
部分的に精製し、50から150mMの間のNaClでDEAEに結合
した部分を単離し、10mg/mlでそして10mM Tris HClバッ
ファー、pH7.5に対して透析した。沈澱層1ml当り２μmo
lのパラログで誘導されたAffigel（BioRad）の一連のミ
ニカラム中で、0.15mlのベッドボリュームに100μｌの
サンプルを適用した。結合していないタンパク質を洗い
流した後、カラムを250mMのNaClで溶出し、そして結合
タンパク質のパターンをSDSゲル電気泳動によって分析
した。
図７のレーン１はカラムにロードした物質から得られ
たパターンを示し；レーン２は誘導化しない支持体をカ
ラムに用いた場合の混合物の溶出の結果を示し； 実際にはタンパク質は何も溶出されず、電気泳動のゲル
は65kdにおいて共通した２重縞の銀染色の人工的産物を
示した。この人工的産物は、遍在するケラチンタンパク
質と酸化されたジチオスレイトールと結合によるものと
考えられている。残りの６つのレーン３−８の結果か
ら、異なるタンパク質が異なるパラログに吸着および溶
出されることがわかる。
試験するパネルについての他の立体配置もまた、無論
使用し得る。
本発明のスクリーニングの方法を、種々の治療用、分
析用、診断用および他の適用に使用し得る特定のパラロ
グを確認するために使用するのに加え、このスクリーニ
ングの方法を分子間の相互作用を示すマトリックスを作
成るのにも用いる。
したがって、あらゆる所望の変化を有する別のパネル
に関しての、全パネルにわたる反応性のパターンから、
この相互作用の強度を示す多数のデータの点が生み出さ
れる。例えば、15メンバーのパラログの候補パネルを15
メンバーの試験パネルと交差反応させると、相互作用の
強度の変化を説明する構造形態に相関し得る225個（1
52）のデータの点が生じる。相関係数を計算し、そして
利用可能な最高の多様性を保持したサブセットの選択に
使用し得る。このような交差結合表はまた、交差反応パ
ネルに関して１つのパネルの全てのメンバーが一様に結
合するのが望ましい、図４に示されるような競争的結合
のパネルの調製においても、有用である。
選択されたパラログの使用 選択された部分に適切で特異的なアフィニティーを有
するパラログが本発明の方法に従って見い出されると、
この特異的アフィニティーが必要とされる状況の全て
で、選択されたパラログの適用は適切である。汚染物質
から被分析物を分離するための、クロマトグラフィーの
支持体上に特異的に結合するリガンドとして利用を加
え、選択された部分に特異的に結合するパラログの能力
を、パラログを、この驚異的相互に依存したイムノアッ
セイに類似したアッセイで特異的結合試薬として用いる
ことにより、使用され得る。
加えて、選択された部分がレセプターあるいは他の生
物学的な標的であれば、パラログは種々の薬理学用およ
び治療用への適用、例えばQSARおよびコンピューターに
よるモデルの作成のために、情報およびデータを提供す
る、に有用である。
目的の分析物に対して満足な特性を有するパラログが
選択される、クロマトグラフィーに使用する場合、パラ
ログを、この技術分野で周知の一般的な手段を用いて固
体支持体に結合する。典型的な固相支持体は、ポリサッ
カライド支持体、アクリルアミドゲル、シリカ支持体、
アルミナ等の、市販されている典型的なクロマトグラフ
ィー支持体の範囲全般を含む。粒子状のクロマトグラフ
ィーの支持体に加えて、メンブランタイプの支持体もま
た一般に用いられることは注目すべきである。多数のク
ロマトグラフィー用のメンブランが、市販されている。
所望ならばリンキングアームを固体支持体とパラログリ
ガンドとの間に導入することを含め、広範な結合技術も
また利用し得る。少なくとも３−９個の炭素に等しい長
さのリンキングアームの利用は、いくつかの例では、被
分析物にリガンドへ近づき易さを付与するために、有用
である。
加えて、パラログの支持体上の配置を、回収される被
分析物および他の物質に対する望ましい度合のアフィニ
ティを与えるために、制御し得る。リガンドを随意に配
置する能力は、特定のカラムの理論段数をコントロール
し得る点において有益である。アフィニティリガンドの
密度が高くなるほど得られる理論段数も高くなる。本発
明のリガンドは大抵のアフィニティリガンドに比べ、比
較的小さい分子であるので、同じ大きさのカラムで可能
な理論段数な相応して高くなる。パラログは、それらが
反応し得る固相支持体上の特異的な分子モチーフに結合
するよう設計される。固体支持体に物質を複合させる方
法は、Wilchek,M.ら、Meth Enzymol（1974）34:475−47
9に記載されるような、ヒドラジド誘導体化した支持体
への結合、あるいはEberle,A.N.ら、Meth Enzymol（198
5）109:129−156に記載されたような支持体と反応する
反応種を生成する、光開裂し得る部分の使用が含まれ
る。
得られた基質は、目的の被分析物に対する結合が特異
的なパラログに複合された固相支持体（粒子あるいはメ
ンブラン）からなり、次にクロマトグラフィーの基質に
一般的な方法で使用し得る。粒子支持体を、カラムに充
填し、もしくはフィルター層に置き、被分析物を含有す
る組成物が基質に接触した時に、分析物を吸着し得るよ
うにする。パラログは比較的安定なリガンドであるの
で、調製物および本発明の基質で充填したカラムは、HP
LC用に設計された装置に含み得る。
アフィニティに基づくクロマトグラフィーをHPLCに適
用する利点は、特にクロマトグラフィー法を調製用のス
ケールで行う場合には過大評価することは容易ではな
い。調製用の方法の分解能は、カラムのサイズを大きく
するか、あるいは下向きの溶出液の強度を調節して溶出
時間をより長くする、理性のない方法よりもむしろ、カ
ラムの特性を基礎として達成する必要がある。溶出溶媒
の複雑性あるいは量を増す全ての調節は、分離スケール
においては、深刻な不利益となる。例えば、高価な溶媒
および複雑な混合プロトコルは、全部で10−100mlが分
析の操作として必要な場合、合理的である；分離のプロ
トコルでよくあるように、何百ガロンが必要とされる場
合、それらは高価でかつ問題のものとなる。コストを下
げるために、溶媒を回収する必要があるだけでなく、こ
れだけで高価なプロセスであるのに、さらに調製された
産物からそれを除去する必要がある。
加えて、調製用クロマトグラフィーによって精製され
た物質は通常カラムに回収されて、充分に分別される必
要があるので、複雑な溶出のプロトコルは、回収相にお
けるカラムの再平衡を必要とする、さらなる欠点を有し
ている。速く再平衡にすることは、多くの工業上の場合
のように、大規模で分析物を分離する場合にもまた、有
利である。
前記の理由により、通常分析操作は、分離の基礎とな
るのが吸着剤の選択性である場合‥すなわち、アフィニ
ティクロマトグラフィーのアプローチに基づく場合にだ
け、スケールを自在にすることができる。
特に好ましいプロトコルの１つとしては、標的の分析
物のアフィニティが変化する、通常は増加する、一連の
パラログを有するよう、カラムを構成し得る。分析物を
カラム間にわたって移動させるときに、結合のアフィニ
ティを連続させることは、分解能を改良するのに有効で
ある。典型的な実施態様としては、カラムを標的に対し
て非常に低いアフィニティを有するパラログのリガンド
から始め；続いてパラログのアフィニティを増加させ
る。目的の分析物がより容易にカラムを通過するゆえ
に、混入物が遅れて出て来る。
したがって、パラログのリガンドを有する基質を充填
したカラムは、分析用および調製用のいずれかの手段と
して使用でき、またパラログが誘導された基質のカラム
を使用することは、好都合で有効であり、従来のクロマ
トグラフィーのアプローチにとって代わるものとなる。
分析物が薬剤である場合、パラログが誘導された基質
は、体液から薬剤を吸着する特異的な試薬として使用で
き、次いで薬剤を分析物のために回収できる。分析物が
廃棄物中に検出される毒物である場合、基質は検出用に
用いられ、また混合物から毒物を除去することもでき
る。分析物が低収率で得られる目的物である場合、吸着
剤がバッチ操作あるいは標準的なクロマトグラフィーの
技術を用いて生成物を単離するのに用い得る。
別の吸着剤をさらに使用することによって、分析物の
確認法を改良することができる。例えばTLCを行う伝統
的な分析物の確認法は、しばしば同じプレート上で角度
を90度にして、２種またはそれ以上の溶媒系を使用す
る。分析物は、ポジティブな確認のための両方の系の参
照Rf値と一致するに違いない。多様な吸着剤のパネルも
同様に、分析物の確認に使用し得るプロフィルを生み出
す。
大部分のパラログがキラルな分子であるから、パラロ
グを基礎としたカラムがエナンチオマーの混合物の直接
分離、および他のキラルの調製に使用され得ることは注
目すべきである。
毒物に特異的なアフィニティの特性を有するパラログ
もまた、インビトロおよびインビボの捕そく剤として使
用することにより有用であり得る。例えば１つの実施態
様として、パラログの複合したラテックスビーズを解毒
剤として腸あるいは血流に運んだり、あるいはもっと一
般的な体外における適用にも用いられる。もう一つの実
施態様として、特にパラログ−薬剤の組合せが、生理学
的輸送に関連するレセプターに結合するパラログの能力
を利用し得る特性を提供する場合、例えば薬剤が血液脳
関門を通過しなければならないか、あるいは固相の腫瘍
組織に侵入しなければならない場合、このような形態が
特異的に、しかし適度なアフィニティでパラログに結合
する薬剤の運搬系として用い得る。
上記に記載したように、選択されたパラログが、特に
クロマトグラフィーにおいて固相支持体に複合されて使
用される場合、パラログは固相に結合した形態で使用さ
れるとは限らない。適当な組成および性質のパラログ
は、標準的なイムノアッセイにおいて、相応する抗体あ
るいはそのフラグメントに代えても用いられ得る。この
ような方法で用いる場合、パラログはプロトコルに因っ
て標識され、またはされない。たとえば、典型的なサン
ドイッチアッセイにおいてはパラログでコートされたマ
イクロタイターのウェルは抗原用のサンプルを試験する
のに用いられる。ここで、パラログに結合した抗原はそ
の後、異なるエピトープに特異的な、標識形態の抗体を
用いて、あるいは別のパラログの標識された形態によっ
て標識される。あるいは、標識されたパラログは、固相
支持体に結合させた抗原用のサンプルにおいて、あらゆ
る分析物の抗体と競争反応させるのに用いられる。この
技術で充分に理解されるように、固相に基づく、あるい
は凝集に基づくイムノアッセイについて特定の種々のプ
ロトコルは、当業者に広くかつ充分に理解される。
パラログの単一物あるいは単純な混合物を固相支持体
に結合させるのに加えて、勾配型の支持体は、混合物の
メンバーを支持体に分配させることにより、調製され得
る。したがって、一連のアフィニティは、支持体の表面
あるいは長さに沿って組立て、基質を最良に吸着し得る
ように変化させることができる。例えば前記のアプロー
チは、特にDNA配列決定のゲルに使用するのに好ましい
ものである。標準的なゲル系は、50−51bpのフラグメン
トに対し、数センチメートルの分離を与えるが、この10
倍の大きさのフラグメントに対しては、10分の１ミリメ
ーターしかなく、このとこが、一つのゲルから得られる
配列の情報量を制限している。アフィニティを変えるパ
ラログのDNAに対する分配から生じる、パラログのアフ
ィニティの勾配を有するゲルは、サイズ分離パラメータ
ーを、単独で、もしくはこの問題を補償するよう試みら
れた他の先行技術を改変したものとの組合せで補償す
る。パラログの種々のDNA断片に対するアフィニティの
調節は、正に荷電した原子間の直線距離を変えることに
よって容易に成し得る。このゲルは通常の方法で構成
し、もしくはニトロセルロースあるいはセルロース酢酸
エステルの膜上の薄い表面として構成し得る。
パラログパネルそれ自体は、図２、４および16に示さ
れるような適切なプロフィルを得ることによる、分析物
の特徴付けにさらに用いられる。この方法で得られる特
徴付けの水準は、クロマトグラフィーの分析（２次元で
あっても）を用いることによって先行技術で通常得られ
るものを越えるものである。
以下の実施例は本発明を説明するものであるが、本発
明はこれに限定されない。
実施例１ パラログパネルの設計 88個のペンタペプチドのパネルを、疎水性の減少およ
び疎水性モーメントの周期的変化をもとに設計した。図
８は合成された番号１−88のペンタペプチドを、Geyse
n,H.M.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA（1984）（上
記）の方法による合成で用いる８個のコントロールと共
にリストで示し；図９は疎水性指数およびこのパネルに
わたる疎水性モーメントを示している。
このパネルは、Geysenの技術（Cambridge Research B
iochemicals）を市販用に変形したものあるいは他の好
都合な多重ペプチド合成のフォーマットを用いて合成さ
れる。その後このパネルを、標識できるタンパク質でプ
ローブして結合パターンを確立する。うまくいきそうな
候補パラログが適当な数で得られる場合は、これらのう
まくいきそうな候補パラログをルーチンのペプチド合成
法を用いて、その配列を照合し、かつさらにクロマトグ
ラフィーの操作を行い得るのに充分な量で合成する。こ
のペプチドを支持体Affigel 10（BioRad）に結合させた
カラムに詰める、もしくはシリカをベースとした支持体
Ultra−AffinityTM（Beckman）（ここでペプチドを合成
する）上にこのペプチドを残し得るようにしてクロマト
グラフィーの支持体を得る。
このパラログが必要とされる特異なアフィニティを有
するかを確証するため、リガンドとしてパラログのアミ
ノ酸をかき混ぜた状態を用いた類似のカラムを調製し得
る。分析物は多くの場合、このパラログを含むカラムに
結合するが、かき混ぜた状態のペプチドを含むカラムに
は結合しない。Attasiの引例（上記）では、このような
かき混ぜが結合を破壊し得ると確証されている。
実施例２ パラログの環化 A.3つの異なる特性を有するパラログKNRGFK、KGYLYLYK
およびGKUIUIUK（ここでＵ＝パラアミノ安息香酸であ
り、他の記号は標準のアミノ酸コードを参照する）は、
それぞれ有効なリジン残基を含んでおり、pH6.5でＮ末
端アミノ基を介してＮ−ヒドロキシスクシンイミドから
あらかじめ誘導されたBaker−bond CBXビーズに付着さ
れた。結合後、リジン残基を同種二官能性架橋試薬をジ
フルオロ−ジニトロベンゼンを用いて分子内結合させ
た。反応をモニターするのには、色の変化を用いた（架
橋剤と１箇所が反応した場合は淡黄色を呈し；完全に架
橋した場合は暗黄色を呈する）。ビーズはスラリーの充
填剤を用いて、標準のステンレススチール製のクロマト
グラフィー用カラムに充填される。
B.環化は３つの主なメカニズムによってパラログの特性
を変える。第１に、環化は基本骨格の配座自由度を減少
させ；第２に、環化は分析物が挿入し得る部分空洞を生
じさせ；そして第３に、環化は分析物によって感知され
る芳香性の基準を変える。加工剤自身はまた、有用な芳
香性を導入する。図10は、環化後上記Ａ項と同様にして
調製したカラムにおける、疎水性分析物の殺虫剤DDDの
クロマトグラムを、エタノールアミンでブロックした非
誘導型およびNHS−誘導型CBXの吸着剤を用いたコントロ
ールと併せて示した。図に示すように、DDDのピークが
以下の順に支持体から溶出される：ブロック化したCB
X、環化したGKUIUIUK、環化したKGYLYLYKおよびKNRGF
K。
実施例３ 種々のDNAパネルの設計 図11、４つの特性：合計のG/Cの割合;G/C領域の数；
直接の対称の量；および相補鎖の（dyad）対称の量、に
ついて種々の値を有する核酸を生み出すために設計され
た、コンピューターのプログラムを図示する。それぞれ
の特性について、低い値は１の値とし、高い値は２の値
とした。プログラムを用いることによって、これら４つ
の特性において最大の多様性を示す16−メンバーのパネ
ルが設計された。その結果を図10に示す図に示すよう
に、それぞれの20量体を合成するために、第１行が、生
み出された配列、および次の４行は、特性の記述子を計
算するのに使用されるパラメータを与える。bin番号は
４つの特性１および２の称号のパターンによって特徴付
けられる；これらの称号に関連する特性の実測値は、次
の行に示される。
こうして設計された20量体は、次に、適当な支持体に
結合し、およびパラログパネルを組み立てるために、標
準の固相法の技術を用いて合成される。
実施例４ 所定の特性を模倣したポリマーのパラログの組み立て 以下のアミノ酸配列： B85−4: Aib−Asp−Asp−Asp−Asp−Asp B85−22: Aib−Ｄ−Phe−Asp−Asp−Ser−Ser−Orn B85−31: Aib−Cys−Asp−Asp−Asp−Asp−Cys B85−40: Aib−Cys−Asp−Orn−Orn−Orn−Cys B85−37: Aib−Cys−Orn−Asp−Asp−Orn−Cys. を有するB85−4;B85−22;B85−31;B85−40およびB85−3
7の一連のパラログを設計した。これらのペプチドを実
施例１に記載した方法に従って合成した。このパラログ
をpH7.5でAffigel 10に結合させ、そしてPall Corporat
ion Silent MonitorTM96−ウェルの流動マイクロプレー
トに、そのウェルに175μｌの結合支持体の沈澱ベッド
ボリュームを充填することにより加えた。
クルードなイーストのライゼート（Sigma）につい
て、そのライゼートをTEバッファー（Tris−HCl、pH7.
5、1mM EDTA）中、DEAEセルロースで処理することによ
り核酸の画分を遊離した後、CMセルロースに結合させ、
そして500mM NaClを加えたTEバッファーで溶出した。得
られた、YX/DC−500と名付けられた溶解性のタンパク質
を凍結乾燥により３倍に濃縮し、そしてTEバッファーに
対し透析した。
そのタンパク質溶液の一部分（50μｌ）を、マルチチ
ャンネルピペッターを用いてそれぞれのウェルに加え
た。その後、150μｌの充填用バッファーで３回、次に1
00μｌの溶出用バッファーで２回、それぞれ洗浄した。
この溶出用バッファーは250mM NaClを加えたTEである。
溶出物を受容用のマイクロタイタープレートに集め、そ
してSDSゲル電気泳動に加えて銀染色法によって可視化
した。
図12は、カルボキシメチルセルロース（CM）もしくは
本発明の種々のパラログをミニカラムに用いた場合の結
果を比較したものである。図からわかるように、特定の
タンパク質との結合に関するCMの挙動は、パラログに似
ている。例えば、B85−40およびB85−37は、28および約
35kdのタンパク質バンドについてのCMの結果に類似した
結果を与え；一方で、B85−31およびB85−22はこれらの
タンパク質に関して異なる挙動を示すが、約55kdに対応
する位置で溶出するバンドに関してはより類似した挙動
を示す。したがって、目的の成分のバンドに関するCMの
挙動は、最大化も最小化もされ得る。
実施例５ 後分離技術としてのパラログの支持体の使用 同じ吸着剤（この場合DEAE）あるいは異なる吸着剤
（この場合Aib−Cys−Orn−Orn−Orn−Orn−Cysの構造
を有するB85−29のパラログ）において、最初のクロマ
トグラフィー分離からのピークの活性画分を再ランした
効果を本実施例で比較する。クルードなイーストのライ
ゼートをDEAEに加え、そして急勾配の塩濃度勾配を溶出
液に用いて溶出した。90mMと110mMの間に溶出したフラ
クションを、次に1mlのオープングラビティーカラム
中、緩やかな塩勾配を溶出液に用いてDEAEおよびB85−2
9のいずれかの吸着剤のカラムにかけた。第１のDEAEカ
ラムで90mMと110mMの間に溶出したタンパク質の大部分
が第２のDEAEカラムでもそのように溶出し続けた。しか
しながらその物質の約３分の１は平行したB85−29のカ
ラムに結合せず、結合タンパク質が広範囲のNaCl濃度で
溶出された。これらの結果を図式化したのが図13であ
り、図13をSDS−PAGEで可視化した実際の結果を図14に
示す。
図13からDEAEについて、第１と第２のカラムで大体同
じ結果が得られることがわかる；しかし、B85−29のカ
ラムにおける90−110mMの画分の第２および第３の分離
に関してはさらなる分離が得られた。これはまた、パラ
ログB85−29カラムが少なくとも数種のタンパク質の成
分を比較的きれいに分離している、図14のSDSの分析に
よって得られた、様々なタンパク質のパターンからもわ
かる。
実施例６ パラログパネル対チバクロンパネルの多様化の比較 イーストの抽出物YX/DC−500を一連のパラログが誘導
されたカラムに加え、そして上記に記載したようにSDS
PAGEによって溶出物を評価した。ICN ChromatakitTMに
含有されるシバクロン染料のシリーズに結合した支持体
を用いて同様の測定を行った。図15Bからわかるよう
に、チバクロンを含有するキットのほぼ全ての成分が、
吸着および溶出されたタンパク質に類似したパターンを
示した。種々のタンパク質バンドに関して、黄−２、緑
−１、青−１および青−２だけが残りの成分（および互
いに）に対し有意な差を示した。図15Aからわかるよう
に、パラログパネルを用いることにより、はるかに多様
な結果を得た。さらに、互いに他の染料よりも互いに他
のパラログに対して、抽出物のより多くの割合が結合す
ることから、パラログが広範囲に適用し得るのがわか
る。
実施例７ タンパク質のプロフィルの決定 YX/DC−500混合物の代わりに、血清アルブミン（BS
A）、チトクロームＣ、およびフルオレセイン、KLHおよ
びペプチドLPDGGYに対して作成されたモノクローナル抗
体のうちの、いずれかの過負荷量を用いた他は実施例６
の手順を繰り返し用いた。上記に記載した手順で、15パ
ラログが誘導されたAffigel支持体にこれらのサンプル
を充填した。吸着されたタンパク質を1M NaClを加えたT
Eで溶出した。
チトクロームＣおよびBSAの場合についてはBioRad Co
omassie染料結合アッセイを用いてタンパク質の濃度を
測定した。これらの結果を図16に示す。互いに全く異な
る２つの試験タンパク質のプロフィルである。図（Ｄは
DEAEを表し、ＣはCMセルロースを表し、そしてＢはエタ
ノールアミンでブロックされたAffigel 10を表す）から
わかるように、BSAはパラログ４、５および11にうまく
結合し；チトクロームＣは結合しない；チトクロームＣ
は残りのパラログのシリーズにかなりうまく結合するが
BSAは結合しない；しかし、チトクロームＣはパラログ
１および２に対する結合が少ないのが認められた。
モノクローナル抗体がこの試験で用いられる場合、EL
ISA法のアッセイを用いて、Molecular Devices VMaxマ
イクロプレートリーダーによりアルカリ性ホスファター
ゼ標識反応産物を検出して通過画分の、および溶出され
た抗体を測定した。この測定は変性しない抗体だけを測
定する。図17に示すように３つの抗体全てが互いに異な
るかなり複雑なプロフィルを与える。（抗フルオレセイ
ンおよび抗KLH抗体は、精製されたIgGであり；抗LPDGGY
はウシ胎児の血清を含有する培地の上澄みからのIgMで
ある。）このプロフィルは分析物の精製および確認のた
めの診断検査を提供する。
実施例８ アフィニティ定数の測定 実施例７の手順およびパラログＢ−85−29を用いて、
ウシ血清アルブミンの結合等量線を、カラムに加えられ
たタンパク質の初期濃度を変えることにより決定した。
図18からわかるように、2.5×106mol-1の値が得られ、
それは同じバッファーの条件下におけるDEAEについてと
大体同じであった。
実施例９ フェノール性汚染物質のためのパラログ分離パネル 図19は、環境のバザードとしてEPAが同定している11
個のフェノール性汚染物質を分離する種々の吸着剤の能
力を示す。図19で示されたこれらのフェノールの構造
を、クロマトグラフィーのカラムに、種々の吸着剤を用
いアセトニトリルの勾配で溶出したパターンと併せて、
図19に示した。CBXビーズを用いて、適当なパラログを
カラムに複合させることによりカラムを調製した。用い
たパラログはGly−Lys−PABA−Phe−PABA−Phe−PABA−
Lysの構造を有するB69−92;PABA−イソロイシン;PABA−
アラニン；およびPABA−メチオニンであった。シクロデ
キストリンカラムの他に、標準的なＣ−18およびシクロ
ヘキシルカラムをコントロールとして用いた。
図19に示すように、シクロデキストリンカラムで（白
丸；それらは全く保持されない）あるいは、フェノール
それ自体を除いてはＣ−18カラムでこれらのフェノール
の保持時間にはほとんど変化はなかった（22−28分）。
シクロヘキシルが誘導されたカラムを用いた場合、かな
りの変化があった。パラログB69−92を含有するカラム
（黒い三角）は、しかしながら、シクロヘキシルカラム
によって充分に区別できない（2,4−ジニトロフェノー
ルを除いて）分子の部分に、保持時間における適度な変
化を与えた。図20−22は、HPLC条件下において、上記に
記載した３つのパラログが誘導されたCBXカラムで、11
個のフェノールを溶出したパターンを示す。これらはPA
BA−Ile（図20）;PABA−Ala（図21）；およびPABA−Met
（図22）である。
Backman HPLCは、126個のプログラム作成が可能な溶
媒のモジュールおよび168個のDiode Array Detector Mo
duleを装備しており、また処理データはBeckman System
Gold Software Rev.5.0を用いてTandy 3000NLコンピュ
ーターで行った。高純度の等級の溶媒は、使用前にヘリ
ウムで散布した。
パターンを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびED
Cでエステル化した、CBXビーズの結合相におけるカルボ
ン酸群を用いて、15u CBXシリカ（J.T.Baker）で合成し
た。pH7.5のPBSの溶解したＮ末端アミノ酸を、エステル
化したビーズに加えて安定なアミド結合を得た。つなが
れたアミノ酸のカルボン酸末端をエステル化し、そして
その操作を繰り返してペプチド結合の形態を得た。ペプ
チドはシリカ1g当り結合ペプチド80−100μmolで結合さ
せた。コントロールとして用いた“ブロックされた”カ
ラムはBaker CBXビーズをエステル化し、続いてエタノ
ールアミンを付加させることにより調製した。
約1.5グラムのカラム充填剤を10mLのメタノールに懸
濁させてカラムを調製した。２μｍのフィルターフリッ
トを有する5cm×4.6mm id.のカラムを20mLの高圧カラム
充填管に取り付けた。懸濁液をカラム充填管に加え、続
いて充分なメタノールでリサーバーを満たした。カラム
をまず160psiの窒素ガスを用いて充填した。リサーバー
を再び満たし;50mLのメタノール全量をそれぞれのカラ
ムに加圧し、そして次に、カラム充填装置をHPLCに取り
付けた。毎分2mLの流速で、毎分9mLまで増加させながら
メタノールをカラムに汲み上げた。逆圧が安定したので
カラムの充填を完了した。
図20−22の比較でわかるように、パラログの選択によ
って全く異なる溶出パターンが得られる。PABA−イソロ
イシンおよびPABA−アラニン（図20および21）の両方か
ら、11個の使用成分のうち少なくとも６つの分離ピーク
が得られる。
さらにPABA−AlaおよびPABA−Ileのいずれかを用いた
C8カラムとの比較が、下記の表Ａに示されている。結果
から試験したフェノールのすべてについてC8の保持時間
は５分以下であることがわかる。しかしながら、PABA−
AlaおよびPABA−Ileの両方は、より長い保持時間を与え
ることによって、この群の化合物の少なくとも相当数
を、きれいに分離し得るようにする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開86／6487（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，82，Ｐ5131−5135（1985)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】被分析物に対して特異的な親和性を有する
    非ペプチドポリマー性（＜7.5kD）パラトープアナログ
    を、同定するための方法であって： パネルの個々の非ペプチド性パラトープアナログを、該
    被分析物に選択的に結合する能力に関して、試験する工
    程であって、 ここで、該パネルは、該パラトープアナログが、パラメ
    ーターの各々が他の物質に結合する該アナログの能力を
    決定する、および／あるいは該パラメーターの組合わせ
    が他の物質に結合する該アナログの能力を決定する、系
    統的に変化する少なくとも二つのパラメーターの値を有
    するように、そして、該個々のアナログが、該パラメー
    ターに関して最大に多様化されるように、調製されてい
    る、工程、 を包含する方法。
  2. 【請求項２】前記パラメーターが、疎水性指数、等電
    点、疎水性モーメント、側鎖の双極子モーメント、芳香
    族性指数、荷電原子間の直線距離、および波形因子から
    なる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記アナログが、 AT/GC比、一本鎖上のATおよびGCの配置、ホモポリマー
    性伸張の数および配置、相補鎖の対称性の無さ、および
    パリンドローム対称性の無さからなる群から前記パラメ
    ーターが選択される、核酸； 親水性および疎水性のモノマーユニットを包含する合成
    ポリマー； 等電点、側鎖の双極子モーメント、および荷電原子間の
    直線距離からなる群から前記パラメーターが選択され
    る、正および／あるいは負に荷電した基で誘導体化され
    た炭水化物；および フォトファチジルジグリセライド； からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記試験する工程が、 前記被分析物が標識混合物と競合して前記パネル中の各
    アナログと結合する能力を評価することで行われ、該混
    合物が該パネル中の全のアナログと結合可能である；あ
    るいは 特異的に結合する物質が吸着される条件下で、前記被分
    析物を含有する試料を、固相支持体に結合したアナログ
    を各テスト部分が含有する複数のテスト部分を通過さ
    せ、未結合部分を回収し、吸着した全ての物質を溶出
    し、そして、該被分析物が固相支持体に結合した該アナ
    ログに特異的結合を示したかどうかを決定するために、
    未結合あるいは溶出した物質中に該被分析物が存在する
    かしないかを検出して、行う、 請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記パネルが、 前記パラメーターの値の全範囲内にわたる該パラメータ
    ーの所定値に従って個々のアナログを合成することで調
    製される；あるいは 前記アナログのランダムな混合物を合成し、そして、該
    アナログを一連の、リガンドが他の物質に結合する能力
    を決定する少なくとも二つの前記パラメーターの、系統
    的に変化し最大に多様化された値を有するリガンドに対
    する結合能力で選別することで、調製される、 請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】非ペプチドポリマー性（＜7.5kD）パラト
    ープアナログのパネルであって、該個々のアナログが、
    パラメーターの各々が該アナログの他の物質に結合する
    能力を決定する、および／あるいは、該パラメーターの
    組合せが該アナログの他の物質に結合する能力を決定す
    る、少なくとも二つのパラメーターの系統的に変化し最
    大に多様化された値を有する、パネル。
  7. 【請求項７】前記パラメーターが、疎水性指数、等電
    点、疎水性モーメント、側鎖の双極子モーメント、芳香
    族性指数、荷電原子間の直線距離、および波形因子から
    なる群から選択される、請求項６に記載のパネル。
  8. 【請求項８】前記アナログが、核酸である；あるいは 前記アナログが、親水性および疎水性のモノマーユニッ
    トを包含する合成ポリマーである；あるいは 前記アナログが、正および／あるいは負に荷電した基で
    誘導体化された炭水化物である、 請求項６に記載のパネル。
  9. 【請求項９】前記系統的に変化する値が、前記パネルに
    わたって前記二つのパラメーターの値の変化を設計する
    ことにより得られる；あるいは 前記系統的に変化する値が、アナログの別のパネルに対
    して前記パネルをスクリーニングすることにより得ら
    れ、該アナログの別のパネルが、パラメーターの各々が
    該アナログが他の物質に結合する能力を決定する、およ
    び／あるいは、パラメーターの組合せが該アナログが他
    の物質に結合する能力を決定するような、少なくとも二
    つのパラメーターにおいて、系統的な変化および最大の
    多様化を有する、 請求項６に記載のパネル。
  10. 【請求項１０】ポリマーのパネルの構造であって、 該パネルが、各パラメーターがポリマーが他の物質に結
    合する能力を決定する、および／あるいは、パラメータ
    ーの組合せがポリマーが他の物質に結合する能力を決定
    する少なくとも二つのパラメーターの、系統的に変化し
    最大に多様化された値を有する個々のポリマーを含み、 ここで個々の候補ポリマーの該パネルが、異なったポリ
    マーを各テスト部分が有する一組のテスト部分を含み、 該構造が、 ミニクロマトグラフィーカラムであるか、または、底が
    メンブレンマイクロタイタープレートに含まれる、複数
    のテスト部分；あるいは 該パネルのメンバーの少なくとも一部を、所定のパター
    ンで分布して有する固相支持体を含む、クロマトグラフ
    ィー用の支持体グラジエント、 を含む、構造。
  11. 【請求項１１】単一の被分析物を特徴付ける方法であっ
    て： 該被分析物を、複数の異なる程度で該単一の被分析物と
    反応する被ペプチドポリマー性（＜7.5kD）パラトープ
    アナログの各パネルと接触させる工程； 該被分析物の、各該パラトープアナログに対する反応の
    程度を検出する工程であって、ここで、該パラトープア
    ナログは、複数の異なる程度で反応し、そして少なくと
    も二つのパラメーターに関して最大限に多様化してお
    り、各該パラメーターが、該被分析物を有する他の物質
    に該アナログが結合する能力を決定する、および／ある
    いは、該パラメーターの組合せが、該被分析物を有する
    他の物質に該アナログが結合する能力を決定する、工
    程； 該被分析物の該各パラトープアナログに対する反応程度
    を記録する工程；および 該記録された反応程度を、該被分析物の特徴的なプロフ
    ィールを提供するためにまとめる工程、 を包含する、方法。
  12. 【請求項１２】前記検出工程が、標識されていない被分
    析物を、前記パネルにおいて各パラトープアナログとお
    よそ同程度に反応する標識されたミモトープの混合物
    と、各該パラトープアナログに関して競合的に反応さ
    せ、そして該パネルにおいて該標識された混合物の各該
    パラトープアナログに対する結合の減少を測定すること
    による工程である、請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】候補物質を同定する方法であって、該物
    質は、標的物質との反応に有効であり、ここで該標的物
    質が、該標的物質が反応する既知のリガンドを有し： 該候補物質を、非ペプチドポリマー性（＜7.5kD）パラ
    トープアナログの各パネルと接触させる工程であって、
    ここで、該パラトープアナログは、複数の異なる程度で
    反応し、そして少なくとも二つのパラメーターに関して
    最大限に多様化しており、各該パラメーターが、該候補
    物質を有する他の物質に該アナログが結合する能力を決
    定する、および／あるいは、ここで該パラメーターの組
    合せが、該候補物質を有する他の物質に該アナログが結
    合する能力を決定する、工程； 該候補物質の各該パラトープアナログに対する反応程度
    を検出する工程； 該候補物質の各該パラトープアナログに対する反応程度
    を記録する工程； 該記録された反応程度を、該候補物質の特徴的なプロフ
    ィールを提供するためにまとめる工程；および 該プロフィールを、該複数のパラトープアナログに関し
    て該リガンドの類似的に得られたプロフィールに対して
    比較する工程； を包含し、ここで、該候補物質のプロフィールと該リガ
    ンドのプロフィールとの類似性が、該候補物質の該標的
    物質と反応する能力を示す、 方法。
  14. 【請求項１４】前記検出工程が、標識されていない候補
    物質を、各パラトープアナログとおよそ同程度に反応す
    る標識されたミモトープの多様な混合物と、各該パラト
    ープアナログに関して競合的に反応させ、そして他の標
    識された混合物の各該パラトープアナログに対する結合
    の減少を測定することにより得られる工程である、請求
    項13に記載の方法。
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