JP2690164B2 - パラログ親和性クロマトグラフィー - Google Patents
パラログ親和性クロマトグラフィーInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は，特定の分析物のための親和性リガンドを含
むクロマトグラフィー法および分析方法に関する。特
に，免疫性の低い特定の毒性汚染物質における，様々な
分析物の検出および精製を行うクロマトグラフィー技術
において，親和性リガンドとしてのペプチドパラログの
使用に関する。このパラログはまた，免疫アッセイ手法
においても使用され得る。
むクロマトグラフィー法および分析方法に関する。特
に，免疫性の低い特定の毒性汚染物質における，様々な
分析物の検出および精製を行うクロマトグラフィー技術
において，親和性リガンドとしてのペプチドパラログの
使用に関する。このパラログはまた，免疫アッセイ手法
においても使用され得る。
技術背景 クロマトグラフィー分離の実施における２つの主要な
発展は，過去10年に渡って，即ち天然生成物の単離を容
易にし，混合物の成分の分離，および複雑な組成物の分
析において非常に重要であった。これらは，親和性クロ
マトグラフィーのための入手可能な様々なリガンドの増
殖であり（ここでは，分離または分析は，支持リガンド
と所望の分析物との特異的相互作用に依存する），およ
び複数の成分の迅速で効果的な分離を可能にする高性能
な液体クロマトグラフィー（HPLC）の出現である。これ
らの発展は,HPLCが一般に，特定の親和性パートナーと
して使用される多数のリガンドに不利な条件で使用する
ので，限定された程度にのみ重複する。可能な分析物の
スペクトルに関するこれらの技術において使用される最
も一般的な親和性パートナーは，特性の免疫グロブリン
またはその免疫反応性の断片であった。一般に，このタ
イプのリガンドは,HPLCにおいて使用される条件に関し
て不安定である。HPLCは頻繁に，多くの親和性リガンド
を変性する非水溶媒を使用し，使用される高圧力はま
た，多数のこれらの物質に対して破壊性を有する。
発展は，過去10年に渡って，即ち天然生成物の単離を容
易にし，混合物の成分の分離，および複雑な組成物の分
析において非常に重要であった。これらは，親和性クロ
マトグラフィーのための入手可能な様々なリガンドの増
殖であり（ここでは，分離または分析は，支持リガンド
と所望の分析物との特異的相互作用に依存する），およ
び複数の成分の迅速で効果的な分離を可能にする高性能
な液体クロマトグラフィー（HPLC）の出現である。これ
らの発展は,HPLCが一般に，特定の親和性パートナーと
して使用される多数のリガンドに不利な条件で使用する
ので，限定された程度にのみ重複する。可能な分析物の
スペクトルに関するこれらの技術において使用される最
も一般的な親和性パートナーは，特性の免疫グロブリン
またはその免疫反応性の断片であった。一般に，このタ
イプのリガンドは,HPLCにおいて使用される条件に関し
て不安定である。HPLCは頻繁に，多くの親和性リガンド
を変性する非水溶媒を使用し，使用される高圧力はま
た，多数のこれらの物質に対して破壊性を有する。
親和性に基づくクロマトグラフィーにおいて，様々な
親和性リガンドの固体支持体が,May,S.W.in Separation
and Purification 3rd Ed.（1978）Edmond S.Perry,
ら，編集,vol.12 in Techniques of Chemistry（J.Wile
y）による初期文献において要約されるように使用され
得る。この文献では，ポリアクリルアミドゲル，混合ゲ
ル，および様々なガラスおよびシリカ誘導体に加えて，
多糖類支持体を強調する親和性クロマトグラフィーに適
切な支持体に関して記述されている。これらの中で，シ
リカ誘導体のみが,HPLCおいて広範囲に使用されてい
る。しかし，その結合特性を改変するための支持体の誘
導程度は，様々な炭化水素リガンドまたは他の単純な分
子の接合による疎水性の改変に限定されている。
親和性リガンドの固体支持体が,May,S.W.in Separation
and Purification 3rd Ed.（1978）Edmond S.Perry,
ら，編集,vol.12 in Techniques of Chemistry（J.Wile
y）による初期文献において要約されるように使用され
得る。この文献では，ポリアクリルアミドゲル，混合ゲ
ル，および様々なガラスおよびシリカ誘導体に加えて，
多糖類支持体を強調する親和性クロマトグラフィーに適
切な支持体に関して記述されている。これらの中で，シ
リカ誘導体のみが,HPLCおいて広範囲に使用されてい
る。しかし，その結合特性を改変するための支持体の誘
導程度は，様々な炭化水素リガンドまたは他の単純な分
子の接合による疎水性の改変に限定されている。
本発明は,HPLCの条件に耐えられる能力を有し，可能
な分析物系列の選択された種類に特異的で必要とされる
親和性を有するリガンドを提供することによってHPLCお
よび親和性アプローチの間の適切な越境（crossover）
を可能にする。
な分析物系列の選択された種類に特異的で必要とされる
親和性を有するリガンドを提供することによってHPLCお
よび親和性アプローチの間の適切な越境（crossover）
を可能にする。
その他にも，様々な方法によってこの越境が試みられ
ている。Peterson,E.A.らMeth Enz（1984）104:113−13
3は，吸着成分間の吸着部位の競合が，溶離液との競合
にとってかわる「置換」クロマトグラフィーについて記
述している。分離される物質に対して異なる特異的な親
和性を有するシクロデキストリンのような含水炭素を使
用するクロマトグラフィー支持体についても記載されて
いる（Armstrogn,D.W.らJChrom Sci（1984）22:411−41
5）。
ている。Peterson,E.A.らMeth Enz（1984）104:113−13
3は，吸着成分間の吸着部位の競合が，溶離液との競合
にとってかわる「置換」クロマトグラフィーについて記
述している。分離される物質に対して異なる特異的な親
和性を有するシクロデキストリンのような含水炭素を使
用するクロマトグラフィー支持体についても記載されて
いる（Armstrogn,D.W.らJChrom Sci（1984）22:411−41
5）。
本発明の方法で使用されるリガンドは，本願で「パラ
ログ」と呼ばれる４から20のアミノ酸のペプチドであ
る。パラログは，特異的に抗原の抗原決定基または抗体
が育成（raise）されるエピトープと結合する免疫グロ
ブリンの部位を擬態する。このエピトープに相補的な断
片は，通常パラトープと呼ばれており，パラログにおけ
るペプチド配列は育成された抗体に発生するものと同一
である必要がないので，用語パラログ（またはパラトー
プアナログ）が使用される。
ログ」と呼ばれる４から20のアミノ酸のペプチドであ
る。パラログは，特異的に抗原の抗原決定基または抗体
が育成（raise）されるエピトープと結合する免疫グロ
ブリンの部位を擬態する。このエピトープに相補的な断
片は，通常パラトープと呼ばれており，パラログにおけ
るペプチド配列は育成された抗体に発生するものと同一
である必要がないので，用語パラログ（またはパラトー
プアナログ）が使用される。
パラログの合成および同定は，非常に限定された程度
まですでに行われている。Atassi,M.Z.,らJ Biol Chem
（1977）252:8784−8787は，リゾチームの抗原部位に相
補的なペプチドの特異的な型について記述した。リゾチ
ームの三次元形状を知ることによって，推定される決定
基に類似する寸法および電子密度パターンのペプチドの
合成が可能になった。このパラログは，決定基擬態ペプ
チドに対して寸法および電子分布が相補的なペプチド配
列を意図的に調製することによって得られた。擬「パラ
トープ」ペプチドは，リゾチームの抗血清との反応を防
止し，リゾチームを特異的にミオグロビンまたは抗体を
排除したものに結合させる。同じグループによる後の研
究によって，特異的受容体のアセチルコリン結合部位を
代表するペプチドおよびトリプシンにおける結合部位の
合成に成功した（McCormick,D.J.,らBiochem J（1984）
224:995−1000;Atassi,M.Z.Biochem J（1985）226:477
−485）。パラログ（即ち類似受容体−または酵素結合
部位−擬態）ペプチドは，抗原決定基または決定基結合
部位のいずれかと関連する既知のパラメーターに基づい
ていた。
まですでに行われている。Atassi,M.Z.,らJ Biol Chem
（1977）252:8784−8787は，リゾチームの抗原部位に相
補的なペプチドの特異的な型について記述した。リゾチ
ームの三次元形状を知ることによって，推定される決定
基に類似する寸法および電子密度パターンのペプチドの
合成が可能になった。このパラログは，決定基擬態ペプ
チドに対して寸法および電子分布が相補的なペプチド配
列を意図的に調製することによって得られた。擬「パラ
トープ」ペプチドは，リゾチームの抗血清との反応を防
止し，リゾチームを特異的にミオグロビンまたは抗体を
排除したものに結合させる。同じグループによる後の研
究によって，特異的受容体のアセチルコリン結合部位を
代表するペプチドおよびトリプシンにおける結合部位の
合成に成功した（McCormick,D.J.,らBiochem J（1984）
224:995−1000;Atassi,M.Z.Biochem J（1985）226:477
−485）。パラログ（即ち類似受容体−または酵素結合
部位−擬態）ペプチドは，抗原決定基または決定基結合
部位のいずれかと関連する既知のパラメーターに基づい
ていた。
最近の研究では，抗体の遺伝子型表面がマップされ
得，この表面のペプチド擬態部位が調製され得ることが
示されている。予想したように，イディオトープおよび
パラトープは正確に一致していない。Seiden,M.V.Am As
soc Immunol（1986）136:582−587;Roux,K.H.らProc Na
tl Acad Sci USA（1987）84:4984−498。
得，この表面のペプチド擬態部位が調製され得ることが
示されている。予想したように，イディオトープおよび
パラトープは正確に一致していない。Seiden,M.V.Am As
soc Immunol（1986）136:582−587;Roux,K.H.らProc Na
tl Acad Sci USA（1987）84:4984−498。
最近，特異的相互反応の特性を知らずに，特異的に結
合する相補的な成分としてのエピトープを擬態する方法
が開示されている。最も関連のある研究は，オーストラ
リアのGeysen,H.M.at the Commonwealth Serum Laborat
oriesである。Geysenは，その特異的に抗体に結合する
能力が実験的にテストされ得る，一団の多数の候補配列
を調製する実験的方法を考案しいる。Geysenのアプロー
チにおいて，各候補ペプチドは，個別ポリエチレン指示
ロッド上で，個別比較的少量で合成される。支持ロッド
は，ミクロタイタ（microtitre）トレイのウェルに個別
に滴下するようにうまく配列されている。典型的に,96
の分離ペプチドが同時に合成され得る（商業上入手可能
なトレイの配列に対応する数）。96のペプチドはまた，
標準放射性免疫アッセイまたはエリサ（ELISA）技術を
使用して抗体または受容体に対する結合性を同時にアッ
セイされ得る。（例，Proc Natl Acad Sci（USA）（198
4）81:3998−4002,PCT出願WO86/00991およびWO86/06487
を参照のこと）。様々な候補ペプチドはまた,Houghten,
R.,Proc Natl Acad Sci（USA）（1985）82:5131−5135
のＴ−袋方法を使用して分離容器において同時に合成し
得る。
合する相補的な成分としてのエピトープを擬態する方法
が開示されている。最も関連のある研究は，オーストラ
リアのGeysen,H.M.at the Commonwealth Serum Laborat
oriesである。Geysenは，その特異的に抗体に結合する
能力が実験的にテストされ得る，一団の多数の候補配列
を調製する実験的方法を考案しいる。Geysenのアプロー
チにおいて，各候補ペプチドは，個別ポリエチレン指示
ロッド上で，個別比較的少量で合成される。支持ロッド
は，ミクロタイタ（microtitre）トレイのウェルに個別
に滴下するようにうまく配列されている。典型的に,96
の分離ペプチドが同時に合成され得る（商業上入手可能
なトレイの配列に対応する数）。96のペプチドはまた，
標準放射性免疫アッセイまたはエリサ（ELISA）技術を
使用して抗体または受容体に対する結合性を同時にアッ
セイされ得る。（例，Proc Natl Acad Sci（USA）（198
4）81:3998−4002,PCT出願WO86/00991およびWO86/06487
を参照のこと）。様々な候補ペプチドはまた,Houghten,
R.,Proc Natl Acad Sci（USA）（1985）82:5131−5135
のＴ−袋方法を使用して分離容器において同時に合成し
得る。
パラログの性能は，同一譲受人に譲渡され，本願にお
いて引例として取り上げられた米国特許出願認可番号25
50−0003号において記述されるように「分子スティッ
ク」を使用して三次元構成を制御することによって改善
され得る場合もある。
いて引例として取り上げられた米国特許出願認可番号25
50−0003号において記述されるように「分子スティッ
ク」を使用して三次元構成を制御することによって改善
され得る場合もある。
前記の技術要素は，クロマトグラフィー基質および本
出願の方法を実行するのに必要なリガンドを導くための
源として生産的に使用され得る。
出願の方法を実行するのに必要なリガンドを導くための
源として生産的に使用され得る。
発明の開示 本発明は，親和性クロマトグラフィーおよびHPLCの利
点を合わせ持つ固体支持体上に，有用な形態の分析的お
よび分離用クロマトグラフィーを提供する。親和性に基
づくクロマトグラフィーの分離および精製に適切な基質
を構築することによって，成分の分析，精製，または混
合物からの除去を容易にする効果的な条件の下で，手法
を施行し得る。これらの技術は，特に毒性廃棄物の排出
水からの除去，リザーバー中の毒素の量のアッセイ，高
濃度の非特定汚染物質の存在下で低密度における物質の
レベルの分析，とよびHPLCに関連する分離手法において
有用である。
点を合わせ持つ固体支持体上に，有用な形態の分析的お
よび分離用クロマトグラフィーを提供する。親和性に基
づくクロマトグラフィーの分離および精製に適切な基質
を構築することによって，成分の分析，精製，または混
合物からの除去を容易にする効果的な条件の下で，手法
を施行し得る。これらの技術は，特に毒性廃棄物の排出
水からの除去，リザーバー中の毒素の量のアッセイ，高
濃度の非特定汚染物質の存在下で低密度における物質の
レベルの分析，とよびHPLCに関連する分離手法において
有用である。
このように,1つの局面において，本発明は，特定の分
析物を吸着することが可能な基質に向けられており，そ
の基質が特定の分析物に対して特異的な親和性を有する
４から20のアミノ酸パラログからなるリガンドが接合す
る固体支持体を包含する。もう１つの局面において，本
発明は，カラムまたはこの基質を有する他のクロマトグ
ラフィー構造，ならびにこれらの器具を使用する分析物
の精製および分析方法に関する。
析物を吸着することが可能な基質に向けられており，そ
の基質が特定の分析物に対して特異的な親和性を有する
４から20のアミノ酸パラログからなるリガンドが接合す
る固体支持体を包含する。もう１つの局面において，本
発明は，カラムまたはこの基質を有する他のクロマトグ
ラフィー構造，ならびにこれらの器具を使用する分析物
の精製および分析方法に関する。
さらにもう１つの局面において，本発明は，パラログ
リガンドを含む所望の親和性基質を調製する方法に向け
られており，免疫アッセイ手順における抗体またはその
断片の置換を含むパラログ代替使用にも向けられてい
る。パラログはまた，同一譲受人に譲渡され，本願にお
いて引例として組み込まれる米国通し番号108,130号で
記述される擬−遺伝子型ネットワーク（PIN）の方法で
特定のハプテンによってかわることが可能な部位のため
のミモトープパネル（mimotope panels）をスクリーニ
ングするのに，抗体の代わりに使用され得る。
リガンドを含む所望の親和性基質を調製する方法に向け
られており，免疫アッセイ手順における抗体またはその
断片の置換を含むパラログ代替使用にも向けられてい
る。パラログはまた，同一譲受人に譲渡され，本願にお
いて引例として組み込まれる米国通し番号108,130号で
記述される擬−遺伝子型ネットワーク（PIN）の方法で
特定のハプテンによってかわることが可能な部位のため
のミモトープパネル（mimotope panels）をスクリーニ
ングするのに，抗体の代わりに使用され得る。
図面の簡単な説明 第１図は，パラログのパネルが単一の標識された分析
物と反応する，通常のエリサ結合アッセイの一般的結果
を示す。
物と反応する，通常のエリサ結合アッセイの一般的結果
を示す。
第２図は，パラログのパネルが標識されたペプチドの
混合物と反応する，通常のエリサ結合アッセイの一般的
結果を示す。
混合物と反応する，通常のエリサ結合アッセイの一般的
結果を示す。
第３図は，標識されていない分析物の存在下におい
て，同様のパラログパネルと標識された混合物との対応
アッセイの一般的結果を示す。
て，同様のパラログパネルと標識された混合物との対応
アッセイの一般的結果を示す。
第４図は，実施例１によって合成された90の候補ペン
タペプチドパラログのパネルを示す。
タペプチドパラログのパネルを示す。
第５図は，第４図のパネルを横軸にとった疎水指数お
よび疎水モーメントの変化を示す。
よび疎水モーメントの変化を示す。
本発明の実施方法 本願で使用されているように，「パラログ」は，特定
の分析物またはハプテンに特異的な親和性を有する４か
ら20,好ましくは５から15,さらに好ましくは６から８の
アミノ酸をもつペプチドのことを指す。パラログは，分
析物の投与に応じて生成される抗体のパラトープ領域の
空間構造および電子分布パターンを擬態する。パラログ
はこのように概念化され得るけれども，もちろん分析物
の投与によって，事実，あらゆる場合（またはいかなる
場合）においても，パラログの構造およびパターンを正
確にもつパラトープを有する免疫グロブリンを育成する
必要はない。パラログが，分析物に対して類似する特異
的な親和性を示すことが可能なだけで充分である。
の分析物またはハプテンに特異的な親和性を有する４か
ら20,好ましくは５から15,さらに好ましくは６から８の
アミノ酸をもつペプチドのことを指す。パラログは，分
析物の投与に応じて生成される抗体のパラトープ領域の
空間構造および電子分布パターンを擬態する。パラログ
はこのように概念化され得るけれども，もちろん分析物
の投与によって，事実，あらゆる場合（またはいかなる
場合）においても，パラログの構造およびパターンを正
確にもつパラトープを有する免疫グロブリンを育成する
必要はない。パラログが，分析物に対して類似する特異
的な親和性を示すことが可能なだけで充分である。
「特異的親和性」とは，パラログが分析物に特異的に
結合する能力のことを指す−−即ち，分析物およびパラ
ログの間の相互反応の強度が，分析物と共に存在し得る
他の物質およびパラログの間の相互作用の強度に比べて
実効的に大きいため，パラログへの結合が分析物と「汚
染物質」とを区別するのに使用され得る。特異的親和性
の通常の値は，最低103l/moleから104l/moleオーダーで
あり，好ましくは,108から1010l/moleオーダーである。
必要とされる値は，分析物が発見される環境ならびに汚
染物質の相対的な結合強度およびその濃度に依存する。
場合によっては，低い親和性で充分であるが，パラログ
がまた汚染物質，特に高密度で存在する汚染物質に強く
結合する場合には，分析物の結合を汚染物質の結合より
強固にするために，より高い親和性が必要とされ得る。
要するに，重要なことは，汚染物質に対する親和性と比
較した場合の分析物に対する相対的親和性である。しか
し，特異的親和性は,pIまたは疎水指数のような一般的
特性からむしろ，分析物に相補的なパラログの電荷／空
間配列特性からの結果であるべきである。
結合する能力のことを指す−−即ち，分析物およびパラ
ログの間の相互反応の強度が，分析物と共に存在し得る
他の物質およびパラログの間の相互作用の強度に比べて
実効的に大きいため，パラログへの結合が分析物と「汚
染物質」とを区別するのに使用され得る。特異的親和性
の通常の値は，最低103l/moleから104l/moleオーダーで
あり，好ましくは,108から1010l/moleオーダーである。
必要とされる値は，分析物が発見される環境ならびに汚
染物質の相対的な結合強度およびその濃度に依存する。
場合によっては，低い親和性で充分であるが，パラログ
がまた汚染物質，特に高密度で存在する汚染物質に強く
結合する場合には，分析物の結合を汚染物質の結合より
強固にするために，より高い親和性が必要とされ得る。
要するに，重要なことは，汚染物質に対する親和性と比
較した場合の分析物に対する相対的親和性である。しか
し，特異的親和性は,pIまたは疎水指数のような一般的
特性からむしろ，分析物に相補的なパラログの電荷／空
間配列特性からの結果であるべきである。
抗原と高親和性抗体との相互反応の親和性を測定する
方法は，一般的であり，低親和性抗体との相互反応の親
和性は，例えばTakeo,K.,ら,J Immunl（1978）121:2305
−2310によって記述されるように測定され得る。Takeo
らは，ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用したり，
タンパクの移動性を決定する際のゲルにおけるオリゴ糖
の特性および含有率を変化させることによって，特定の
オリゴ糖と特異的な骨髄腫タンパクとの結合の測定につ
いて記述している。この方法は,1モル当り102から106リ
ットルの範囲の結合定数を得るのに有用であると言われ
ている。Varga,J.M.,ら,J Immunol（1974）112:1565−1
570は，放射性リガンドの結合をテストするために免疫
グロブリンにグルタルアルデヒドによって連結されたナ
イロン−ポリスチレンホイスカーを使用して結合定数を
決定する方法について記述している。このように，結合
を評価し，結合定数を測定するためにミクロタイタウェ
ルにおける近年使用される通常の希釈免疫アッセイ手法
に加えて多数のプロトコル方法がある。
方法は，一般的であり，低親和性抗体との相互反応の親
和性は，例えばTakeo,K.,ら,J Immunl（1978）121:2305
−2310によって記述されるように測定され得る。Takeo
らは，ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用したり，
タンパクの移動性を決定する際のゲルにおけるオリゴ糖
の特性および含有率を変化させることによって，特定の
オリゴ糖と特異的な骨髄腫タンパクとの結合の測定につ
いて記述している。この方法は,1モル当り102から106リ
ットルの範囲の結合定数を得るのに有用であると言われ
ている。Varga,J.M.,ら,J Immunol（1974）112:1565−1
570は，放射性リガンドの結合をテストするために免疫
グロブリンにグルタルアルデヒドによって連結されたナ
イロン−ポリスチレンホイスカーを使用して結合定数を
決定する方法について記述している。このように，結合
を評価し，結合定数を測定するためにミクロタイタウェ
ルにおける近年使用される通常の希釈免疫アッセイ手法
に加えて多数のプロトコル方法がある。
パラログの調製 本発明は，免疫性であるかないかにかかわらず，広範
囲の分析物に適用される。それ自身ペプチドであり，従
って一次アミノ酸配列の一連の重なる部位に関して「相
補的」なアプローチ（Geysenの合成／分析方法とAtassi
の相補的な形成アプローチとの組合せ）によって直接パ
ラログを形成させる分析物に加えて，ペニシリン，テト
ラサイクリン，ステロイド，ナプロクサン，テオフィリ
ン，ビタミンK,D,およびＡ等のビタミン,PCB,ジオキシ
ンおよびテトラブロモエチレン等の様々な毒物のような
薬品を含有するもの，ならびに特定の条件下で限定され
た分子構造または形を有するその他の化学物質でもよ
い。特定のペプチドパラログは，ほとんどいかなる分析
物またはその限定領域に形成され得る。
囲の分析物に適用される。それ自身ペプチドであり，従
って一次アミノ酸配列の一連の重なる部位に関して「相
補的」なアプローチ（Geysenの合成／分析方法とAtassi
の相補的な形成アプローチとの組合せ）によって直接パ
ラログを形成させる分析物に加えて，ペニシリン，テト
ラサイクリン，ステロイド，ナプロクサン，テオフィリ
ン，ビタミンK,D,およびＡ等のビタミン,PCB,ジオキシ
ンおよびテトラブロモエチレン等の様々な毒物のような
薬品を含有するもの，ならびに特定の条件下で限定され
た分子構造または形を有するその他の化学物質でもよ
い。特定のペプチドパラログは，ほとんどいかなる分析
物またはその限定領域に形成され得る。
パラログの分析物への形成は，ペプチドまたは非ペプ
チドにかかわらず，候補パラログペプチド中におけるス
クリーニング手法によってアプローチされ得る。（この
アプローチは，無論，それ自身がペプチドである分析物
に使用され得るが，上記の代替物でもよい）。このアプ
ローチにおいて，通常４から20の任意の数のアミノ酸の
候補パラログのパネルがスクリーニングのために調製さ
れる。所望のパラログの近似値がまず得られ，次いで微
同調のためにテストされる範囲にある候補が得られるよ
うに，パネルが広範囲の電子雲パターンの代替物をカバ
ーするように形成され得るならば，それは有用である。
チドにかかわらず，候補パラログペプチド中におけるス
クリーニング手法によってアプローチされ得る。（この
アプローチは，無論，それ自身がペプチドである分析物
に使用され得るが，上記の代替物でもよい）。このアプ
ローチにおいて，通常４から20の任意の数のアミノ酸の
候補パラログのパネルがスクリーニングのために調製さ
れる。所望のパラログの近似値がまず得られ，次いで微
同調のためにテストされる範囲にある候補が得られるよ
うに，パネルが広範囲の電子雲パターンの代替物をカバ
ーするように形成され得るならば，それは有用である。
例えば，もし一次配列において６つのアミノ酸を含有
するパラログを使用するならば,20の天然に発生するア
ミノ酸のみを使用する６千４百万の可能な６量体（６−
mers）が存在する。無論，ペプチドの合成は，これらの
天然に発生するサブユニットに限定される必要はなく,D
−型のコードされたアミノ酸およびベータアラニン，ア
ミノ−酪酸，シトルリン等の様々なコードされないアミ
ノ酸もまた，使用され得る。事実，これらは，微生物に
対して代謝物質である「天然」アミノ酸よりもより安定
であると予想されるため，好まれ得る。
するパラログを使用するならば,20の天然に発生するア
ミノ酸のみを使用する６千４百万の可能な６量体（６−
mers）が存在する。無論，ペプチドの合成は，これらの
天然に発生するサブユニットに限定される必要はなく,D
−型のコードされたアミノ酸およびベータアラニン，ア
ミノ−酪酸，シトルリン等の様々なコードされないアミ
ノ酸もまた，使用され得る。事実，これらは，微生物に
対して代謝物質である「天然」アミノ酸よりもより安定
であると予想されるため，好まれ得る。
もし，良好な数の，そのような６量体のみが合成され
るならば，電子雲パターンを決定するパラメータは候補
によって広範囲に変化されなければならない。例えば，
疎水指数がパネルに対して確実に増加するように，調製
された候補ペプチドが選択されなければならない。構造
に関連する疎水指数の議論は,Janin,J.Nature（1979）2
77:491−492において発見される。更に，タンパクの両
親媒特性は，残基の周期的な疎水性を調製することによ
って変化させ得る（Eisenberg,D.,らProc Natl Acad Sc
i USA（1984）81:140−144;Eisenberg,D.,らNature（19
82）299:371−374）。両親媒特性は，ペプチドの二次ま
たは三次構造においても存在するので，水溶性の分子の
部位または面およびその他の疎水性のものに存在する。
更に，陽性または陰性に荷電したアミノ酸残基の存在に
よる電荷パターンもまた，候補パネルにおいて組織的に
変化し得る。
るならば，電子雲パターンを決定するパラメータは候補
によって広範囲に変化されなければならない。例えば，
疎水指数がパネルに対して確実に増加するように，調製
された候補ペプチドが選択されなければならない。構造
に関連する疎水指数の議論は,Janin,J.Nature（1979）2
77:491−492において発見される。更に，タンパクの両
親媒特性は，残基の周期的な疎水性を調製することによ
って変化させ得る（Eisenberg,D.,らProc Natl Acad Sc
i USA（1984）81:140−144;Eisenberg,D.,らNature（19
82）299:371−374）。両親媒特性は，ペプチドの二次ま
たは三次構造においても存在するので，水溶性の分子の
部位または面およびその他の疎水性のものに存在する。
更に，陽性または陰性に荷電したアミノ酸残基の存在に
よる電荷パターンもまた，候補パネルにおいて組織的に
変化し得る。
初期候補パネルは，都合よく約90のペプチドから構成
され得る。これは，全く，商業上入手可能なミクロタイ
タープレートおよびタンパク合成ロッド（Cambridge Re
search Biochemicals）の型を反映しており，所望のパ
ラログの特性を決定するのに充分で個別のテストを提供
するのに都合のよい数である。合成は，従来の通常商業
上入手可能な方法を使用して行われ，次いで個別の候補
パラログのパネルがスクリーニングのために準備され
る。
され得る。これは，全く，商業上入手可能なミクロタイ
タープレートおよびタンパク合成ロッド（Cambridge Re
search Biochemicals）の型を反映しており，所望のパ
ラログの特性を決定するのに充分で個別のテストを提供
するのに都合のよい数である。合成は，従来の通常商業
上入手可能な方法を使用して行われ，次いで個別の候補
パラログのパネルがスクリーニングのために準備され
る。
スクリーニング手法 テスト組成物が，後で固体支持体に結合して残ったパ
ラトープパネルから取り除くことができるように，特異
的親和性は一般的に可逆的であるため，スクリーニング
手法は繰り返し使用され得る。このようなアッセイは，
回復可能な形態または固体支持体に結合した形態で行う
必要はないが，その方がはるかに都合がよい。
ラトープパネルから取り除くことができるように，特異
的親和性は一般的に可逆的であるため，スクリーニング
手法は繰り返し使用され得る。このようなアッセイは，
回復可能な形態または固体支持体に結合した形態で行う
必要はないが，その方がはるかに都合がよい。
一連の提案された溶出溶媒システムにおける相対結合
強度が体系的にテストされ得るため，再使用可能である
ことは，特にクロマトグラフィーにおける親和性リガン
ドとしてのパラログの意図された使用の１つにおいて都
合がよい。例えば，増加する濃度でメタノールを含有す
る一連の溶液または溶出勾配をシミュレートする増加す
る塩分濃度における溶液中の結合強度が使用され得る。
このタイプのテストでは，多数の溶出条件の下で多数の
パラログの比較作用が実験的にテストされ得る。ただ１
つの，溶剤または温度条件下でテストした場合に，パラ
ログＹは好ましい特異的親和性レベルを有しているよう
に思われたとしても，所望の溶出条件下ではパラログＹ
のための結合定数勾配が得られることよりも，パラログ
Ｘのための結合定数勾配が得られることの方が好まし
い。このように，テストパネルの再使用によって，クロ
マトグラフィー手順におけるその使用をシミュレートす
るパターンの条件下で最良のパラログを選択することが
可能になる。
強度が体系的にテストされ得るため，再使用可能である
ことは，特にクロマトグラフィーにおける親和性リガン
ドとしてのパラログの意図された使用の１つにおいて都
合がよい。例えば，増加する濃度でメタノールを含有す
る一連の溶液または溶出勾配をシミュレートする増加す
る塩分濃度における溶液中の結合強度が使用され得る。
このタイプのテストでは，多数の溶出条件の下で多数の
パラログの比較作用が実験的にテストされ得る。ただ１
つの，溶剤または温度条件下でテストした場合に，パラ
ログＹは好ましい特異的親和性レベルを有しているよう
に思われたとしても，所望の溶出条件下ではパラログＹ
のための結合定数勾配が得られることよりも，パラログ
Ｘのための結合定数勾配が得られることの方が好まし
い。このように，テストパネルの再使用によって，クロ
マトグラフィー手順におけるその使用をシミュレートす
るパターンの条件下で最良のパラログを選択することが
可能になる。
テストの前に，パラログパネルは，同時係属出願認可
番号2550−0003号（前出）において記述される分子ステ
ィックへの連結によって構造制御され得るかまたはされ
得ない。パネル全体は，同様の分子スティックで処理さ
れるか，または分離ウェルを使用して，個個の分子ステ
ィックがパネルに対して評価され得る。このようなプロ
トコルにおいて，テストされる同様のパラログに，異な
る構造制御分子スティックスペーサーリンクと共に複数
のピンを提供することが，場合によっては有用であり得
る。
番号2550−0003号（前出）において記述される分子ステ
ィックへの連結によって構造制御され得るかまたはされ
得ない。パネル全体は，同様の分子スティックで処理さ
れるか，または分離ウェルを使用して，個個の分子ステ
ィックがパネルに対して評価され得る。このようなプロ
トコルにおいて，テストされる同様のパラログに，異な
る構造制御分子スティックスペーサーリンクと共に複数
のピンを提供することが，場合によっては有用であり得
る。
パネルはテスト用に形成されるが，次いでパネルは，
所望の分析物に対するその構造物の特異的な親和性をテ
ストされる。これは，理論上，分析物を標識し，パネル
の個別パラログ要素に結合する標識の相対量を検出する
ことによって，直接行われる。このアプローチを使用す
ると，第１図に示されるパターンと同様のパターンが得
られる。第１図に示されるように，パネルの各構成物に
結合する標識の量（ｙ座標）は，パネルの構成物（ｘ座
標）を横軸にとって示される。分析物に対する各パラロ
グの親和性に基づいて，様々な量の標識が得られる。
所望の分析物に対するその構造物の特異的な親和性をテ
ストされる。これは，理論上，分析物を標識し，パネル
の個別パラログ要素に結合する標識の相対量を検出する
ことによって，直接行われる。このアプローチを使用す
ると，第１図に示されるパターンと同様のパターンが得
られる。第１図に示されるように，パネルの各構成物に
結合する標識の量（ｙ座標）は，パネルの構成物（ｘ座
標）を横軸にとって示される。分析物に対する各パラロ
グの親和性に基づいて，様々な量の標識が得られる。
この直接方法に代わるものがしばしばより実用的であ
る。この代替方法において，特異的親和性は，標識され
ない分析物の，標識されたペプチドの混合物に対する競
合によってアッセイされる。分析物が存在しない状態
で，標識された混合物それ自身によるパラログ全体への
等価結合が幾分か得られるように，ペプチド混合物は，
充分な数の構成物を含んでいなければならない。標識さ
れていない物質のパネルの構成物に対する結合を検出す
るためのこの一般的なアプローチについては,1987年10
月13日に提出され，同一譲受人に譲渡され本願において
引例として取り入れられている，同時係属出願米国通し
番号108,130号に詳細に記述されている。
る。この代替方法において，特異的親和性は，標識され
ない分析物の，標識されたペプチドの混合物に対する競
合によってアッセイされる。分析物が存在しない状態
で，標識された混合物それ自身によるパラログ全体への
等価結合が幾分か得られるように，ペプチド混合物は，
充分な数の構成物を含んでいなければならない。標識さ
れていない物質のパネルの構成物に対する結合を検出す
るためのこの一般的なアプローチについては,1987年10
月13日に提出され，同一譲受人に譲渡され本願において
引例として取り入れられている，同時係属出願米国通し
番号108,130号に詳細に記述されている。
要するに，必要な数のペプチドの混合物（少数でも充
分な場合があるが，約500から1000）が，例えばBolton,
A.E.,ら,Biochem J（1973）529−539に記述され,ICN Ra
diochemicalsから商業上入手可能なよう素アイソトープ
125でアシルよう素化方法を使用して，適切に標識され
る。他の標識方法もまた，使用され得る。混合物は，個
個の構成物を合成し，それらを混合することによって直
接調製され得るが，多数のタンパクを任意のペプチドに
加水分解することによってより都合よく得られる。例え
ば,1つのアプローチでは，酵母溶解産物部分トリプシン
水解物（Cleveland,D.W.,らJ Biol Chem（1977）252:11
02−1106）を使用する。これによって，混合物として標
識され，例えばSDSゲル電気泳動を使用して分離され，
もしその結合が個別に査定されるなら,Immunodyne（Bur
nette,W.N.Anal Biochem（1981）112:195−203）等のテ
スト支持体に変形され得る多数のペプチドが提供され
る。標識されたペプチド混合物を使用する際には，パネ
ル中のすべての候補パラログに関して良好な結合が発生
していることを証明する必要がある。パネル中のこの等
価結合に影響を与えるための条件もまた，実験的に確立
されなけばならない。完全な状態では，ペプチド混合物
は，第2A図に示すようにすべてのパネル構成物に均一に
結合する。しかし，第2B図に示すように，しばしば，同
様のレベルの結合のみが発見される。このことは，分析
物との競合に関して完全に有効な基礎を提供する。競合
が加えられた場合の結果の解釈は，競合を評価する前に
結合値を同一の値に標準化することによって簡略化され
得る。
分な場合があるが，約500から1000）が，例えばBolton,
A.E.,ら,Biochem J（1973）529−539に記述され,ICN Ra
diochemicalsから商業上入手可能なよう素アイソトープ
125でアシルよう素化方法を使用して，適切に標識され
る。他の標識方法もまた，使用され得る。混合物は，個
個の構成物を合成し，それらを混合することによって直
接調製され得るが，多数のタンパクを任意のペプチドに
加水分解することによってより都合よく得られる。例え
ば,1つのアプローチでは，酵母溶解産物部分トリプシン
水解物（Cleveland,D.W.,らJ Biol Chem（1977）252:11
02−1106）を使用する。これによって，混合物として標
識され，例えばSDSゲル電気泳動を使用して分離され，
もしその結合が個別に査定されるなら,Immunodyne（Bur
nette,W.N.Anal Biochem（1981）112:195−203）等のテ
スト支持体に変形され得る多数のペプチドが提供され
る。標識されたペプチド混合物を使用する際には，パネ
ル中のすべての候補パラログに関して良好な結合が発生
していることを証明する必要がある。パネル中のこの等
価結合に影響を与えるための条件もまた，実験的に確立
されなけばならない。完全な状態では，ペプチド混合物
は，第2A図に示すようにすべてのパネル構成物に均一に
結合する。しかし，第2B図に示すように，しばしば，同
様のレベルの結合のみが発見される。このことは，分析
物との競合に関して完全に有効な基礎を提供する。競合
が加えられた場合の結果の解釈は，競合を評価する前に
結合値を同一の値に標準化することによって簡略化され
得る。
標識されたペプチド混合物が，分析物の不在下ですべ
ての候補パラログにほとんど同等に結合するか，または
同様の結合が標準化されていることが確認されると，ス
クリーニングが分析物の存在下で繰り返される。分析物
に対して特異的な親和性を有する候補では，標識された
ペプチド混合物への接合が減少しており，その減少は，
分析物に対する候補の特異的な親和性に比例する。典型
的な競合のパターンが第３図に示される。座標の意味
は，他の図と同様である。分析物に対する親和性が最も
大きいパラログは，最も低いレベルの標識を示すが，こ
のことは，分析物とパラログのための標識されたタンパ
ク混合物との良好な競合を示す。分析物の競合能力を査
定することによって，標識の取り込みが最も減少したパ
ラログが，結合分析物に対して最も好ましいパラメータ
を有するものとして選択される。
ての候補パラログにほとんど同等に結合するか，または
同様の結合が標準化されていることが確認されると，ス
クリーニングが分析物の存在下で繰り返される。分析物
に対して特異的な親和性を有する候補では，標識された
ペプチド混合物への接合が減少しており，その減少は，
分析物に対する候補の特異的な親和性に比例する。典型
的な競合のパターンが第３図に示される。座標の意味
は，他の図と同様である。分析物に対する親和性が最も
大きいパラログは，最も低いレベルの標識を示すが，こ
のことは，分析物とパラログのための標識されたタンパ
ク混合物との良好な競合を示す。分析物の競合能力を査
定することによって，標識の取り込みが最も減少したパ
ラログが，結合分析物に対して最も好ましいパラメータ
を有するものとして選択される。
分子形態および，最終的に選択されたパラログの電荷
分布パターンを微調整するために，最大の特異的親和性
または本来のパネルに最も所望の溶離剤パターン作用を
示す構成物に介在する特性を有するパネルを加える毎
に，スクリーニング工程を繰り返すことが可能である。
スクリーニングは，必要とされる特異的親和性またはク
ロマトグラフィー作用の程度まで，任意の数のパネルで
任意の回数だけ繰り返すことが可能である。このよう
に，パラログパネルの電子雲パターンは，分析物に対す
るパラログの親和性を最適にするように体系的に操作さ
れ得，パラログがクロマトグラフィー手法において親和
性リガンドとして使用される場合は，溶離が困難になる
ほど親和性の大きいものは望ましくないため，正確なパ
ターンが選択されなければならない。上記のように，構
造制御の影響もまた，研究され得る。
分布パターンを微調整するために，最大の特異的親和性
または本来のパネルに最も所望の溶離剤パターン作用を
示す構成物に介在する特性を有するパネルを加える毎
に，スクリーニング工程を繰り返すことが可能である。
スクリーニングは，必要とされる特異的親和性またはク
ロマトグラフィー作用の程度まで，任意の数のパネルで
任意の回数だけ繰り返すことが可能である。このよう
に，パラログパネルの電子雲パターンは，分析物に対す
るパラログの親和性を最適にするように体系的に操作さ
れ得，パラログがクロマトグラフィー手法において親和
性リガンドとして使用される場合は，溶離が困難になる
ほど親和性の大きいものは望ましくないため，正確なパ
ターンが選択されなければならない。上記のように，構
造制御の影響もまた，研究され得る。
選択されたパラログの使用 クロマトグラフィーでの使用について，所望の分析物
に対して良好な特性を有するパラログが選択される場
合，従来の技術において既知の方法を使用することによ
って，固体支持体に接合される。典型的な固体支持体に
は，通常商業的に入手可能なクロマトグラフィー支持体
の範囲で多糖類支持体，アクリルアミドゲル，シリカ支
持体，アルミナ等が含まれる。特に好適なタイプの支持
体は，例えばMilliporeまたはImmobilonTMによって表示
されるポリビニリデン二フッ化物（PVDF）等のフッ化炭
化水素重合体である。所望の場合は，固体支持体および
パラログリガンドの間に連結アームを導入する技術も含
めて，広範囲な接合技術が得られる。３から９炭素に匹
敵する長さの連結アームの使用は，分析物のリガンドに
対するより強力な接近を提供するために，有利な場合が
ある。
に対して良好な特性を有するパラログが選択される場
合，従来の技術において既知の方法を使用することによ
って，固体支持体に接合される。典型的な固体支持体に
は，通常商業的に入手可能なクロマトグラフィー支持体
の範囲で多糖類支持体，アクリルアミドゲル，シリカ支
持体，アルミナ等が含まれる。特に好適なタイプの支持
体は，例えばMilliporeまたはImmobilonTMによって表示
されるポリビニリデン二フッ化物（PVDF）等のフッ化炭
化水素重合体である。所望の場合は，固体支持体および
パラログリガンドの間に連結アームを導入する技術も含
めて，広範囲な接合技術が得られる。３から９炭素に匹
敵する長さの連結アームの使用は，分析物のリガンドに
対するより強力な接近を提供するために，有利な場合が
ある。
生じた基質は，所望の分析物への結合に特異的なパラ
ログに接合する固体支持体を含み，従来の方法でクロマ
トグラフィー基質に使用され得る。分析物を含有する組
成物が基質と接触する場合，基質は，カラムにパックさ
れるかまたはフィルターベッド内に置かれて分析物を吸
着し得る。このパラログは，比較的安定なリガンドであ
るため調製物および本発明の基質とともにパックされた
カラムは,HPLCのために形成された装置に使用され得
る。
ログに接合する固体支持体を含み，従来の方法でクロマ
トグラフィー基質に使用され得る。分析物を含有する組
成物が基質と接触する場合，基質は，カラムにパックさ
れるかまたはフィルターベッド内に置かれて分析物を吸
着し得る。このパラログは，比較的安定なリガンドであ
るため調製物および本発明の基質とともにパックされた
カラムは,HPLCのために形成された装置に使用され得
る。
親和性に基づくクロマトグラフィーのHPLCへの適用の
利点は，特にもしクロマトグラフィー手法が分離規模で
行われる場合には，非常に評価される。分離手順におけ
る分解能は，カラムのサイズを増大させたり，溶出によ
り長い時間がかかるように溶出液の強度を下げるよう調
整する力ずくの方法よりむしろ，カラムの特性に基づい
て成し遂げられる必要がある。溶出溶媒の複雑さまたは
量を増大させるような調整は，いかなるものも分離規模
において重大な欠点である。例えば，総量で10から100m
lが分析手順に必要とされる場合は，高価な溶剤および
複雑な混合方法は妥当であるが，分離プロトコルにおい
てしばしばあるように，数百ガロンが必要とされる場合
には，それらは高価で問題となる。コスト即ち高価な工
程それ自身を減少させるために溶媒を回収する必要があ
り，また溶媒は，調製される生成物から取り除かれる必
要がある。
利点は，特にもしクロマトグラフィー手法が分離規模で
行われる場合には，非常に評価される。分離手順におけ
る分解能は，カラムのサイズを増大させたり，溶出によ
り長い時間がかかるように溶出液の強度を下げるよう調
整する力ずくの方法よりむしろ，カラムの特性に基づい
て成し遂げられる必要がある。溶出溶媒の複雑さまたは
量を増大させるような調整は，いかなるものも分離規模
において重大な欠点である。例えば，総量で10から100m
lが分析手順に必要とされる場合は，高価な溶剤および
複雑な混合方法は妥当であるが，分離プロトコルにおい
てしばしばあるように，数百ガロンが必要とされる場合
には，それらは高価で問題となる。コスト即ち高価な工
程それ自身を減少させるために溶媒を回収する必要があ
り，また溶媒は，調製される生成物から取り除かれる必
要がある。
更に，分離クロマトグラフィーによって精製された材
料は適切な分解能を得るために，通常，再びカラムを通
す必要があるので，複雑な溶離方法では，再分離段階に
おいてカラムの再平衡を必要とする更に付加的な欠点が
生じる。
料は適切な分解能を得るために，通常，再びカラムを通
す必要があるので，複雑な溶離方法では，再分離段階に
おいてカラムの再平衡を必要とする更に付加的な欠点が
生じる。
一般に，上記の理由により，分離の基礎が吸着剤の選
択力である場合−−即ち親和性クロマトグラフィーアプ
ローチに基づく場合にのみ分析的手法が測定され得る。
択力である場合−−即ち親和性クロマトグラフィーアプ
ローチに基づく場合にのみ分析的手法が測定され得る。
１つの特に好ましいプロトコルにおいて，カラムは，
標的の分析物に対する，変化する，一般的に増大する親
和性をもつ一連のパラログを有して，構築され得る。結
合親和性の連続は，分析物がカラム内を移動するため，
分析を進行させるのに効果的である。通常の実施例で
は，カラムは，標的に対して非常に低い親和性を有する
パラログリガンドから始まり，それに次ぐパラログは次
第に親和性を高めていく。
標的の分析物に対する，変化する，一般的に増大する親
和性をもつ一連のパラログを有して，構築され得る。結
合親和性の連続は，分析物がカラム内を移動するため，
分析を進行させるのに効果的である。通常の実施例で
は，カラムは，標的に対して非常に低い親和性を有する
パラログリガンドから始まり，それに次ぐパラログは次
第に親和性を高めていく。
従って，パラログリガンドを有する基質とともにパッ
クされたカラムは，分析的または予備的道具として使用
され得，パラログ誘導基質カラムは，それに代わるもの
として，従来のクロマトグラフィーアプローチにより便
利で効果的な使用を提供する。分析物が薬品である場合
は，パラログ誘導基質は，体液から薬品を吸着するため
の特異的試薬として使用され得，次いでその薬品は分析
用に再溶出され得る。分析物が廃棄生成物に存在する毒
物である場合，基質は検出用および毒物を混合物から除
去するために使用され得る。分析物が低い収率で形成さ
れた所望の生成物である場合，基質は，バッチ毎にまた
は標準のクロマトグラフィー技術を使用して，生成物を
単離するのに使用され得る。
クされたカラムは，分析的または予備的道具として使用
され得，パラログ誘導基質カラムは，それに代わるもの
として，従来のクロマトグラフィーアプローチにより便
利で効果的な使用を提供する。分析物が薬品である場合
は，パラログ誘導基質は，体液から薬品を吸着するため
の特異的試薬として使用され得，次いでその薬品は分析
用に再溶出され得る。分析物が廃棄生成物に存在する毒
物である場合，基質は検出用および毒物を混合物から除
去するために使用され得る。分析物が低い収率で形成さ
れた所望の生成物である場合，基質は，バッチ毎にまた
は標準のクロマトグラフィー技術を使用して，生成物を
単離するのに使用され得る。
毒物に対して特異的な親和特性を有するパラログをイ
ンビトロおよびインビボで殺菌剤として使用することに
よって，また利点を引き出すことが可能になる。例え
ば,1つの実施態様では，パラログに接合するラテックス
ビーズが毒物に対する解毒剤として腸や血流に運搬され
得る。もう１つの実施態様では，そのような構成は，特
異的に結合する薬品のための運搬システムとして使用さ
れ得るが，パラログに対しては適度な親和性を有してい
なければならない。
ンビトロおよびインビボで殺菌剤として使用することに
よって，また利点を引き出すことが可能になる。例え
ば,1つの実施態様では，パラログに接合するラテックス
ビーズが毒物に対する解毒剤として腸や血流に運搬され
得る。もう１つの実施態様では，そのような構成は，特
異的に結合する薬品のための運搬システムとして使用さ
れ得るが，パラログに対しては適度な親和性を有してい
なければならない。
選択されたパラログは，特にクロマトグラフィーにお
いて固体支持体に接合されると有用性を示すけれども，
パラログの有用性は，その固体結合形態に限定されな
い。適切な構造および特性を有するパラログはまた，通
常の免疫アッセイにおいて，対応する抗体またはその断
片にとって代わるものとして使用され得る。このように
使用するにあたって，パラログが標識され得るかまたは
され得ないかは，プロトコルに依存する。例えば，通常
のサンドイッチアッセイにおいて，パラログでコーティ
ングされたミクロタイタウェルが抗原のためのサンプル
をテストするのに使用され，ここでパラログに結合する
抗体が，異なるエピトープに対して特異的な標識された
形態の抗体または標識された形態の代替パラログを使用
することによって標識される。または，標識されたパラ
ログは，固体基質に結合する抗原に対するサンプル中の
分析物抗体と競合させるように使用され得る。従来の技
術から充分理解されるように，固体層に基づくおよび接
合に基づく免疫アッセイのための様々な特異的方法は，
当該技術者によって明白であり，よく理解されている。
いて固体支持体に接合されると有用性を示すけれども，
パラログの有用性は，その固体結合形態に限定されな
い。適切な構造および特性を有するパラログはまた，通
常の免疫アッセイにおいて，対応する抗体またはその断
片にとって代わるものとして使用され得る。このように
使用するにあたって，パラログが標識され得るかまたは
され得ないかは，プロトコルに依存する。例えば，通常
のサンドイッチアッセイにおいて，パラログでコーティ
ングされたミクロタイタウェルが抗原のためのサンプル
をテストするのに使用され，ここでパラログに結合する
抗体が，異なるエピトープに対して特異的な標識された
形態の抗体または標識された形態の代替パラログを使用
することによって標識される。または，標識されたパラ
ログは，固体基質に結合する抗原に対するサンプル中の
分析物抗体と競合させるように使用され得る。従来の技
術から充分理解されるように，固体層に基づくおよび接
合に基づく免疫アッセイのための様々な特異的方法は，
当該技術者によって明白であり，よく理解されている。
以下の実施例は，例証を目的としており，本発明を制
限するものではない。
限するものではない。
実施例１ パラログパネルの合成 疎水指数を次第に減少させ，両親媒特性を周期的に変
化させて,90ペンタペプチドのパネルを形成した。第４
図は,1から88までの合成されたペンタペプチドのリスト
を示す。第５図は，このパネルにおける疎水指数および
両親媒特性を示す。
化させて,90ペンタペプチドのパネルを形成した。第４
図は,1から88までの合成されたペンタペプチドのリスト
を示す。第５図は，このパネルにおける疎水指数および
両親媒特性を示す。
パネルを,Gesen,H.M.,らProc Natl Acad Sci USA（19
84）（前出）の方法を使用して合成した。残りの８つの
ポリエチレンピンをアミノ酸分析によって分析される合
成物の対照として使用した。
84）（前出）の方法を使用して合成した。残りの８つの
ポリエチレンピンをアミノ酸分析によって分析される合
成物の対照として使用した。
次いで，パラログパネルを含むポリエチレンピンのセ
ットをタンパクの混合物と均一に反応させるためテスト
する。酵母溶解産物をトリプシンを使用して加水分解す
ることによって，混合物を得，生成した混合物を上記の
ように125−Ｉを使用するBolton−Hunter試薬によって
標識する。
ットをタンパクの混合物と均一に反応させるためテスト
する。酵母溶解産物をトリプシンを使用して加水分解す
ることによって，混合物を得，生成した混合物を上記の
ように125−Ｉを使用するBolton−Hunter試薬によって
標識する。
標識した水解物を使用して90のパネル構成物すべてを
処理し，結合した標識の量を検出する。結合量を，処理
済みのペグをＸ線フィルムに接触させて配置し，フィル
ム上の斑点の密度を検出するか，結合ペプチドを含むペ
グを除去することによって各結合ペプチドを個別に数え
るか，ガンマ測定器を使用して指示されたパラログに対
応する各ペグ上の放射能の量を査定して直接数えること
によって測定される。
処理し，結合した標識の量を検出する。結合量を，処理
済みのペグをＸ線フィルムに接触させて配置し，フィル
ム上の斑点の密度を検出するか，結合ペプチドを含むペ
グを除去することによって各結合ペプチドを個別に数え
るか，ガンマ測定器を使用して指示されたパラログに対
応する各ペグ上の放射能の量を査定して直接数えること
によって測定される。
タンパク混合物は，適度に同様にパネルの構成物に結
合しているのが発見され，結合値は100％に標準化され
る。
合しているのが発見され，結合値は100％に標準化され
る。
次いで，所定量の分析物をミクロタイタウェルにおい
て混合物に加えることによって，スクリーニングを繰り
返して，パネルを再テストする。標識が非常に減少した
ペプチド接合ピンは，少量である。これらの選択された
ペプチドは，適切な電子雲パターンの分子のための初期
スクリーニングの結果を示す。所望の場合は，上記のよ
うに変化する条件の下でテストし，構造制御することに
よって，更に精細な候補ペプチドが得られ得る。更に，
最良の候補の特性がわずかに変化したパネルが本実施例
で記述されるのと同様の方法で調製され得る。
て混合物に加えることによって，スクリーニングを繰り
返して，パネルを再テストする。標識が非常に減少した
ペプチド接合ピンは，少量である。これらの選択された
ペプチドは，適切な電子雲パターンの分子のための初期
スクリーニングの結果を示す。所望の場合は，上記のよ
うに変化する条件の下でテストし，構造制御することに
よって，更に精細な候補ペプチドが得られ得る。更に，
最良の候補の特性がわずかに変化したパネルが本実施例
で記述されるのと同様の方法で調製され得る。
適当な数の良好な候補パラログが得られると，これら
の良好な候補パラログは，それらの配列を証明するため
に充分な量で通常の固体層方法を使用して合成される。
パラログをクロマトグラフィーに使用する場合，パラロ
グはAffi−prep−10（Bio−Rad）等の固体支持体に付着
されてクロマトグラフィーのカラムにパックされ得る。
あるいは，クロマトグラフィー支持体は，その上でペプ
チドが合成されたシリカベース支持体,Ultra Affinity
−ETTM（Beckman）等の合成支持体上にペプチドを残存
させることによって得られ得る。
の良好な候補パラログは，それらの配列を証明するため
に充分な量で通常の固体層方法を使用して合成される。
パラログをクロマトグラフィーに使用する場合，パラロ
グはAffi−prep−10（Bio−Rad）等の固体支持体に付着
されてクロマトグラフィーのカラムにパックされ得る。
あるいは，クロマトグラフィー支持体は，その上でペプ
チドが合成されたシリカベース支持体,Ultra Affinity
−ETTM（Beckman）等の合成支持体上にペプチドを残存
させることによって得られ得る。
パラログが，必要とされる特異的親和性を有している
ことを証明するために，リガンドとしてかきまぜた形態
（scrambled form）のパラログアミノ酸配列を使用し
て，同様のカラムを調製することが可能である。分析物
は，パラログを含有するカラムに結合するが，かきまぜ
たペプチドを含有するカラムには結合しない。Atassiの
引例（前出）は，このようなかきまぜが結合を破壊する
ことを確認している。
ことを証明するために，リガンドとしてかきまぜた形態
（scrambled form）のパラログアミノ酸配列を使用し
て，同様のカラムを調製することが可能である。分析物
は，パラログを含有するカラムに結合するが，かきまぜ
たペプチドを含有するカラムには結合しない。Atassiの
引例（前出）は，このようなかきまぜが結合を破壊する
ことを確認している。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−65159（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−501912（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 26，Ｎｏ．３，（10ｔｈ Ｆｅｂ. 1987），Ｐ．669−675
Claims (16)
- 【請求項１】分析物に対して特異的な親和性を有するペ
プチドパラログを選択する方法であって、以下の工程を
包含する方法： 個々のペプチドのパネルを提供する工程であって、該ペ
プチドが、疎水指数、両親媒特性、および電荷パターン
からなる群から選択される少なくとも２つのパラメータ
ーの体系的に変化させた値を有し、それによって該分析
物に対して異なる結合特性を提供するよう広範囲に変化
し得る電子雲パターンを有する工程；および 該分析物に選択的に結合する活性について、該個々のペ
プチドのパネルを試験する工程。 - 【請求項２】前記ペプチドが、４から20のアミノ酸配列
を有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記試験する工程が、分析物の、標識され
たペプチド混合物と競合する能力を評価することにより
行われ、該混合物がパネル中の各ペプチドに結合するた
めにパネル中のすべてのペプチドに結合し得る、請求項
１または２に記載の方法。 - 【請求項４】前記２つのパラメーターが以下からなる群
から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の方
法： 疎水指数と両親媒特性；疎水指数と電荷パターン；およ
び両親媒特性と電荷パターン。 - 【請求項５】前記分析物を、該分析物に対して最大の特
異的親和性を示すオリジナルのパネルの個々のペプチド
のメンバーに対して中間のパラメーターを有する個々の
ペプチドのさらなるパネルに対して試験する工程を包含
する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】分析物に対して異なる結合特性を提供する
よう広範囲に変化し得る電子雲パターンを有する個々の
ペプチドパラログのパネルであって、該パネルは、本質
的に、疎水指数、両親媒特性および電荷パターンからな
る群から選択される少なくとも２つのパラメーターの体
系的に変化した値を有する個々のペプチドからなるパネ
ル。 - 【請求項７】該ペプチドが４から20のアミノ酸配列を有
する、請求項６に記載のパネル。 - 【請求項８】前記２つのパラメーターが以下からなる群
から選択される、請求項６または７に記載のパネル： 疎水指数と両親媒特性；疎水指数と電荷パターン；およ
び両親媒特性と電荷パターン。 - 【請求項９】単一の分析物を特徴付ける方法であって、
以下の工程を包含する方法： 該分析物を、該分析物に対して異なる結合特性を提供す
るよう広範囲に変化し得る電子雲パターンを有するペプ
チドパラログの各ペプチドパラログと接触する工程、こ
こで、該ペプチドは、該単一の分析物との、疎水指数、
両親媒特性および電荷パターンからなる群から選択され
る少なくとも２つのパラメーターの体系的に変化させた
値を有する； 該分析物の該ペプチドの各々に対する反応性の程度を検
出する工程； 該分析物の該ペプチドの各々に対する反応性の程度を記
録する工程；および、 該記録された反応性の程度を配列し、該分析物の特徴的
プロファイルを提供する工程。 - 【請求項１０】前記検出する工程が、標識されていない
分析物を、全体として前記パネル中の各ペプチドとほぼ
等しく反応性である標識されたミモトープの混合物と、
前記ペプチドの各々に関して競合的に反応させ、そして
該パネル中の各ペプチドに対する該標識された混合物の
結合の減少を測定することにより行われる、請求項９に
記載の方法。 - 【請求項１１】パラログ親和性クロマトグラフィーを実
施するための基体であって、 該基体は、特定の分析物に対する特異的親和性を有する
パラログに、必要に応じて連結アームを通して、接合さ
れる固体支持体を含有する基体；ここで、該パラログは
請求項１に記載の方法により選択される。 - 【請求項１２】クロマトグラフィー媒体が請求項11の基
体である、クロマトグラフィーカラム。 - 【請求項１３】パラログ親和性クロマトグラフィーに適
した基体を調製する方法であって、 該方法は、前記固体支持体に、必要に応じてスペーサー
アームを介して、請求項１に記載の方法により選択され
た特定の分析物に対して特異的な親和性を有するパラロ
グを接合する工程を包含する。 - 【請求項１４】分析物を精製する方法であって、該方法
は以下の工程を包含する： 該分析物を含む組成物を、該分析物が該組成物に残存す
る成分から選択的に吸着されるように請求項11の基体と
接触させる工程；および 該分析物を該基体から溶出する工程。 - 【請求項１５】組成物中の分析物の存在または量をアッ
セイする方法であって、該方法は、該組成物を請求項11
の基体に接触させる工程；および 該分析物の該基体への吸着を検出するまたは定量する工
程を包含する。 - 【請求項１６】組成物中の分析物の存在または量をアッ
セイする方法であって、該方法は、該組成物を、通常の
免疫アッセイ方法における分析物に対して特異的な抗体
の代替物として、請求項１に記載の方法により同定され
たパラログペプチドで処理する工程を包含する。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17262688A | 1988-03-24 | 1988-03-24 | |
| US172,626 | 1988-03-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03505120A JPH03505120A (ja) | 1991-11-07 |
| JP2690164B2 true JP2690164B2 (ja) | 1997-12-10 |
Family
ID=22628508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1503913A Expired - Fee Related JP2690164B2 (ja) | 1988-03-24 | 1989-03-23 | パラログ親和性クロマトグラフィー |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0438402B1 (ja) |
| JP (1) | JP2690164B2 (ja) |
| KR (1) | KR900700170A (ja) |
| AT (1) | ATE167301T1 (ja) |
| AU (1) | AU628812B2 (ja) |
| CA (1) | CA1339768C (ja) |
| DE (1) | DE68928704T2 (ja) |
| HU (1) | HUT63587A (ja) |
| NZ (1) | NZ228482A (ja) |
| WO (1) | WO1989009088A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5650489A (en) * | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
| AU675446B2 (en) * | 1992-07-27 | 1997-02-06 | Terrapin Technologies, Inc. | Sorbent families |
| EP1387390B1 (en) * | 1997-06-20 | 2009-02-18 | Bio - Rad Laboratories, Inc. | Retentate chromatography and protein chip arrays with applications in biology and medicine |
| NZ516848A (en) | 1997-06-20 | 2004-03-26 | Ciphergen Biosystems Inc | Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine |
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| WO2001033230A2 (en) * | 1999-11-02 | 2001-05-10 | Chiron Corporation | Biological sample component purification and differential display |
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| US7153682B2 (en) | 2000-06-05 | 2006-12-26 | Chiron Corporation | Microarrays on mirrored substrates for performing proteomic analyses |
| IT1318595B1 (it) * | 2000-06-23 | 2003-08-27 | Ausimont Spa | Microsfere di copolimeri termoprocessabili del tetrafluoroetilene. |
| MY150687A (en) | 2006-07-21 | 2014-02-28 | Femalon S P R L | Assay and kit for predicting implantation success in assisted fertilisation |
| WO2011000805A1 (en) | 2009-06-29 | 2011-01-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Biomarkers of oocyte competency and method of use |
| CN109187779A (zh) * | 2018-08-29 | 2019-01-11 | 四川百特芳华医药科技有限公司 | 一种甾体化合物的分析方法 |
| WO2024049540A1 (en) * | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Advanced Materials Technology, Inc. | Hydrophobic interaction chromatography (hic) composition and method of producing the hic composition |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4525465A (en) * | 1983-10-07 | 1985-06-25 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Water-insoluble biospecific absorbent containing argininal derivative |
| US4636463A (en) * | 1984-04-05 | 1987-01-13 | Scripps Clinic And Research Foundation | Antibodies to human interleukin-2 induced by synthetic polypeptides |
| US4544485A (en) * | 1984-08-31 | 1985-10-01 | Purdue Research Foundation | Chromatographic method and means |
-
1989
- 1989-03-23 AT AT89904386T patent/ATE167301T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-23 AU AU33537/89A patent/AU628812B2/en not_active Ceased
- 1989-03-23 KR KR1019890702178A patent/KR900700170A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-03-23 CA CA000594691A patent/CA1339768C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-23 JP JP1503913A patent/JP2690164B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-23 EP EP89904386A patent/EP0438402B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-23 DE DE68928704T patent/DE68928704T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-23 WO PCT/US1989/001194 patent/WO1989009088A1/en active IP Right Grant
- 1989-03-23 NZ NZ228482A patent/NZ228482A/en unknown
- 1989-03-23 HU HU892121A patent/HUT63587A/hu unknown
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|---|
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| HU892121D0 (en) | 1991-03-28 |
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