HUT63587A - Paralogic affinity-chromatography - Google Patents
Paralogic affinity-chromatography Download PDFInfo
- Publication number
- HUT63587A HUT63587A HU892121A HU212189A HUT63587A HU T63587 A HUT63587 A HU T63587A HU 892121 A HU892121 A HU 892121A HU 212189 A HU212189 A HU 212189A HU T63587 A HUT63587 A HU T63587A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- paralog
- analyte
- affinity
- peptide
- substrate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
- B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
- B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
- B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
- B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3268—Macromolecular compounds
- B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
- B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
A találmány olyan kromatográfiás és analitikai eljárásokkal foglalkozik, amelyek az analizálandó anyagokra fajlagos affinítás-ligandumokkal kapcsolatosak. Részletesebben, ez a találmány peptid paralógok, mint affinitás-ligandumok alkalmazásával foglalkozik a kromatográfiás technikákban sokféle analizálandó anyagok, elsősorban kis immunogenicitású toxikus szennyezések kimutatásához és tisztításához. A paralógokat alkalmazhatjuk immunossay műveletekben is.
A kromatográfiás elkülönítések gyakorlatában két nagyobb fejlődési irányzat lett drámai fontosságú az utóbbi évtizedben, amelyek megkönnyítik a természetes termékek izolálását, keverékek komponenseinek elkülönítését és komplex kompozíciók elemzését. Ezek: 1./ az affinitáskromatográfiához rendelkezésre álló sokféle ligandum elterjedése, ahol az elkülönítés vagy elemzés egy támasztóanyaghoz rögzített ligandum és egy elemezni kívánt anyag közti fajlagos kölcsönhatástól függ; és 2./ a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) megjelenése, amely lehetővé teszi sokféle komponens gyors és hatékony elkülönítését. Ezek a fejlődések csak kis mértékben fedik át egymást, mivel a HPLC általában olyan körülményeket alkalmaz, amelyek a legtöbb fajlagos affinitás-partnerként alkalmazott ligandum számára kedvezőtlen. Az ezekben a technikákban alkalmazott legáltalánosabb affinitás-partnerek a lehetséges meghatározandó anyagok széles spektrumában a fajlagos immunglobulinok vagy ezek immunreatív fragmentumai. Az ilyen típusú ligandumok azonban általában instabilak a HPLC-ben alkalmazott körülmények között. A HPLC gyakran
- 3 alkalmaz nem-vizes oldószereket, amelyek denaturálnak sok affinitás-ligandumot és az alkalmazott nagy nyomás gyakran roncsoló hatású sok ilyen vegyöletre.
Az affinitáson alapuló kromatográfiában sokféle szilárd támasztó anyagot alkalmazhatunk; erről összefoglaló munkát jelentetett meg May S. W. £a ’Techniques of Chemistry* sorozat 12. kötetében: “Separation and Purification’, 3.kiadás ; szerkesztő: Perry Edmond S. és munkatársai; kiadó: □. Wiley (1978)]. Ez az összefoglaló munka leírja az affinitáskromatográfiához alkalmas támasztóanyagokat, a poliakrilamid géleken, kevert géleken, és különböző üveg- és kovasav származékokon kívül hangsúlyozva a poliszaharóz támasztóanyagokat is. Ezek közül csak a kovasav-származékok nyertek széleskörű felhasználást a HPLC-ben. A támasztóanyag kötési jellemzőket módosító származék-képzésének terjedelme azonben csak a hidrofobícitás változtatására korlátozott a különböző szénhidrogén-ligandumok vagy más egyszerű molekulák konjugációja révén.
A jelen találmány egy kényelmes keresztezést tesz lehetővé a HPLC és az affinitásos megközelítés között olyan ligandumok szolgáltatáséval, amelyek rendelkeznek a lehetséges analizálandó anyagok sorának kiválasztott tagjaira fajlagos affinitással, ugyanakkor képesek elviselni a HPLC körülményeit.
Mások is megkísérelték már ezt a keresztezést különböző utakon. Peterson E.A. és munkatársai ^Meth. Enz. 104, 113-133 (1984)] leír jak a k iszorításos kromatográfiát, ahol az adszorpciós helyekért való versengést az eluáló szerért való versengés
- 4 helyettesíti. Beszámoltak olyan kromatográfiás támasztó anyagokról is, amelyek szénhidrátokat, pl. ciklodextrineket alkalmaznak ; ezek az elkülönítendő anyagokkal szemben különböző fajlagos aktivitásokkal bírnak [Armstrong D.W. és munkatársai :
3. Chrom. Sci. 22, 411-415 (1984)].
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott ligandumok ff
4-20 aminosavból álló peptidek, amelyeket itt paralóg-oknak nevezünk. Egy paralóg utánozza valamely immunglobulinnak azt a részét, amely fajlagosan kötődik az antigén determinánshoz, vagy az antigén olyan epitopja, amelyhez az antitest kialakult. Az ezzel az epitoppal komplementer szegmenst általában paratopnak nevezik; és mivel a paralógban levő peptid-szekvenciának nem szükséges azonosnak lennie a kialakult antitestben előforduló szekvenciával, a paralóg (vagy paratóp analóg) kifejezést alkalmazzuk.
A paralógok szintézisét és azonosítását korábban csak nagyon korlátozott mértékben végezték el. Atassi M.Z. és munkatársai [□. Bioi. Chem. 252, 8784-8787 (1977)] leírták egy olyan peptid speciális tervezését, amely komplementer a lizozim antigén helyeivel. A lizozim háromdimenziós kontúrjainak ismerete lehetővé teszi a kikövetkeztetett determinánssal analóg dimenziójú és elektronsűrűségű összetétellel bíró peptid szintézisét. A paralógot úgy kapják meg, hogy dimenziójában és elektroneloszlásában a determinást utánzó peptiddel megtervezetten komplementer peptid szekvenciát készítenek. A pszeudo-’paratop peptidek gátolják a lizozim reakcióját antiszérumokkal és fajlagosan kötik a lizozimot a mioglobin vagy antitest kivételével. Ugyanennek a kutatócsoportnak egy későbbi munkája olyan peptid szintézisét eredményezte, amely egy fajlagos receptor acetil-kolin kötőhelyét és egy tripszinben levő kötőhelyet képvisel [^McCormick D.O. és munkatársai: Biochem. □. 224, 995-1000 (1984) i Atassi M.Z. : Biochem □. 226, 477-485 (1985)]. A paralóg (vagy analóg receptor- vagy enzim-kötő hely utánzó) peptidek ismert paramétereken alapulnak, amelyek vagy az antigén determinnánssal, vagy a determináns kötő részével kapcsolatosak.
Egy nem régi munkában kimutatták, hogy az antitest idiotipusos felületét térképezni lehet és el lehet készíteni az ilyen felület részeit utánzó peptideket. Amint várható, az idiotopok és a paratopok nem pontosan vágnak egybe [seiden M.V.*. Am. Assoc. Immunoi. 136, 582-587 (1986); Roux K.H. és munkatársai: Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84, 4984-4988 (1987)].
Nemrégiben eljárásokat alakítottak ki epitopok,mint fajlagosan kötődő komplementer komponensek utánzására, a fajlagos kölcsönhatás jellemzőinek ismerete nélkül. A legutóbbi ilyen munka Geysen H.M. munkája (Commonwealth Serum Laboratories, Ausztrália). Geysen empirikus eljárást ötlött ki több szekvencia-jelölt sorozatának elkészítésében, amelyeknek az antitesthez való fajlagos kötődési képességét empirikusan lehet vizsgálni. A Geysen-féle megközelítésben a peptid-jelölteket külön-külön szintetizálják egyedi polietilén támasztó rúdon viszonylag kis mennyiségben. A támasztórudakat kényelmesen úgy rendezik el, hogy egyenként merüljenek egy mikrotitráló tálca üregeibe. Tipikusan 96 eltérő peptidet lehet egyidejűleg szintetizálni (ez a szám a kereskedelmi forgalomban kapható tálcák elrendezésének felel meg).
A 96 peptidet egyidejűleg ki lehet mérni antitestekhez vagy receptorokhoz való kötődésre standard radioimmunassay-t vagy ELISA technikát alkalmazva [lásd pl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998-4002 (1984) ; W086/00991 és W086/06487 közzétételi számú PCT szabadalmi bejelentések?.
e./
Sokféle peptid-jelöltet lhet egyidejűleg szintetizálni külön tartályokban, Houghten R. T-zsák eljárását alkalmazva £Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 5131-5135 (1985)J .
A paralógok teljesítményét bizonyos esetekben lehet javítani háromdimenziós konformációjuk szabályozásával, molekuláris nyél alkalmazása révén, amint ez a 2550-0003 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben le van írva ; ennek bejelentője azonos a jelen bejelentés bejelentőjével, és ez a bejelentés referenciaként épül be a jelen bejelentésbe.
A szakterület eddig elért eredményeit hatékonyan lehet alkalmazni forrásként a kromatográfiás szubsztrátumokhoz szükséges ligandumok megalkotásához és a jelen találmány eljárásainak véghezviteléhez.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmányt.
A találmány hasznos formáját nyújtja a szilárd támasztóanyagon végzett analitikai és preparatív kromatográfiának, amely lehetővé teszi az affinitás-kromatográfia és a HPLC előnyeinek kombinálását. Az affinitáson alapuló kromatográfiás elkülönítéshez és tisztításhoz való megfelelő szubsztrátumok megalkotásával • · ·
- 7 a műveleteket olyan hatásos körülmények között végezhetjük, amelyek lehetővé teszik a komponensek teljes elemzését, vagy tisztításukat, vagy keverékekből való eltávolításukat. Ezek a technikák különösen hasznosak toxikus hulladékok eltávolításához elmenő folyadékokból, toxinok mennyiségének meghatározásához tartályokban, kis koncentrációban jelen levő anyagok szintjének elemzéséhez nagy koncentrációjú, nem fajlagos szennyezések jelenlétében, és HPLC-t is magában foglaló preparatív műveletekhez.
így egyik szempontja szerint a találmány olyan szubsztrátumokra irányul, amelyek meghatározandó anyagok adszorbeálására képesek, aholis ez a szubsztrátum tartalmaz egy szilárd támasztó anyagot, amelyhez egy lényegében 4-20 aminosavból álló paralógot tartalmazó ligandum van konjugálva, amely ligandumnak fajlagos affinitása van a meghatározandó anyaghoz. Egy másik szempontja szerint a találmány a szubsztrátumot tartalmazó oszlopokra, vagy más kromatográfiás elrendezésekre vonatkozik, valamint eljárásokra a meghatározandó anyagok tisztítására és elemzésére ezekkel az eszközökkel.
Egy további szempontja szerint a találmány olyan eljárásokra irányul, amelyek segítségével a paralóg ligandumokat tartalmazó, kívánt affinitású szubsztrátumok készíthetők; a találmány a paralógok másféle alkalmazásaira is irányul, beleértve antitestek vagy fragmentumaik helyettesítését immunassay eljárásokban. A paralógokat alkalmazhatjuk antitestek helyett mimotop sorozatok átvizsgálására a pszeudo-idiotípusos hálózat (pseudoidiotypic netwörk, PIN) kromatográfia eljárásában valamely
- 8 adott haptén helyettesítésére képes tagokra, amint ezt a 108,130 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírták; e bejelentés bejelentője azonos a jelen bejelentés bejelentőjével, és ez a bejelentés referenciaként épöl be a jelen bejelentésbe.
Az alábbiakban röviden ismertejök a bejelentés ábráit.
Az 1. ábra egy tipikus ELISA kötési vizsgálat általános eredményeit mutatja be, ahol paralógok sorozatát egyedi, jelzett, meghatározandó anyaggal reagáltatjuk.
A 2. ábra egy tipikus ELISA kötési vizsgálat általános eredményeit mutatja be, ahol paralógok sorozatát jelzett peptidek keverékével reagáltatjuk.
A 3. ábra az azonos paralóg sorozat jelzett keverékkel végzett megfelelő vizsgálatának általános eredményeit mutatja be nem jelzett vizsgálandó anyag jelenlétében.
A 4. ábra 90, 1.példa szerint szintetizált pentapeptid paralóg-jelölt sorozatát mutatja be.
A 5. ábra a hidrofóbikus index és a hidrofóbikus momentum változásait mutaja be a 4.ábra sorozatán keresztül.
Az alábbiakban a találmány kiviteli módjait ismertetjük.
Ahogyan itt használjuk, a paralóg* kifejezés olyan peptidekre utal, amelyek 4-20, előnyösen 5-15, még előnyösebben 6-8 aminosavból állnak, és amelyeknek fajlagos aktivitása van egy meghatározandó anyaghoz vagy hapténhez. A paralóg utánozza egy antitest paratop területének térbeli konformációját és elektroneloszlási mintáját; itt olyan antitestről beszélünk, amely a meghatározandó anyag beadására adott válaszként alakulhat ki. Bár a paralógról ilyen módon fogalmat alkothatunk, természetesen nem szükséges, hogy a meghatározandó anyag beadása valóban minden esetben (vagy bármely esetben) olyan paratóppal ellátott immunglobulint alakítson ki, amely pontosan a paralóg konformációjának éa mintájának felel meg. Elegendő, hogy ha a paralóg képes analóg fajlagos affinitás! tulajdonságokat kifejezni a meghatározandó anyagot illetően.
A fajlagos affinitás a paralógnak arra a képességére utal, hogy a meghatározandó anyagot fajlagosan köti - vagyis a meghatározandó anyag és a paralóg közti kölcsönhatás erőssége jelentősen nagyobb, mint a más anyagokkal, amelyek a meghatározandó anyaggal és a paralóggal együtt jelen vannak, így a paralóghoz való kötődést fel lehet használni a meghatározandó anyag és a szennyeződés megkülönböztetésére. A fajlagos aktivitás tipikus értékei minimunként a 10 1/mól és 10 l/mól közti nagyságrendben, előnyösen a 10 - 10 l/mól nagyságrendben vannak.
A szükséges érték függ attól a környezettől, amelyben a meghatározandó anyag található, és függ a szennyező anyagok relatív kötési erősségétől és koncentrációjától. Bizonyos szituációkban egy kisebb affinitás is egészen megfelelő, míg ha a paralóg erősen kötődik a szennyeződésekhez, különösen azokhoz, amelyek nagy koncentrációban vannak jelen, nagyobb affinitás szükséges arra a célra, hogy a meghatározandó anyag kötődését megkülönböztethessük a szennyező anyagok kötődésétől. Röviden összefoglalva: a meghatározandó anyag relatív affinitása a kritikus a szennyező
anyagok affinitásához viszonyítva. A fajlagos affinitás azonban inkább a paralóg, mint a meghatározandó anyag komplementere, töltés- és térbeli elrendeződési jellemzőiből adódik, mint az általánosított tulajdonságok, pl. pl vagy hidrofóbikus index jellemzőiből.
Standard eljárások ismeretesek az antigének és nagy affinitású antitestek közti kölcsönhatás affinitásának mérésére; a kis affinitású antitestekkel való kölcsönhatás affinitását pedig úgy mérhetjük, ahogyan pl. Takeo K. és munkatársai leírták Immunoi. 121, 2305-2310 (1978)3· Takeo és munkatársai leírják bizonyos oligoszacharidok speciális mielóma fehérjékhez való kötési állandóinak mérését poliakrilamid gélelektroforézist alkalmazva, és a gélben az oligoszacharidok természetét és menynyiségét változtatva, amikor a fehérjék mobilitását határozzák fi meg. Az eljárásról elmondható, hogy alkalmas 10 - 10 liter/mól tartományba eső kötési állandók meghatározására,Varga O.M. és munkatársai Immunoi. 112, 1565-1570 (1974)3 leírják a kötési állandók meghatározását az immunglobulinokhoz glutáraldehiddel kötött nej Ion-polisztirol kerek lemezeket alkalmazva, hogy meghatározzák a radioaktív ligandumok kötődését. így tehát egy sor munkamenet áll rendelkezésre a jelenleg általában alkalmazott, mikrotitráló lemezek üregeiben végzett standard hígításos immunassay vizsgálaton kívül, hogy értékeljük a kötődést és a menynyiségi kötődési állandókat.
Paralóqok előállítása
A találmány sokféle meghatározandó anyaghoz alkalmas, a« ·· • · ·
- 11 melyek lehetnek akár immunogének, akár nem. Azokon a meghatározandó anyagokon kívül, amelyek maguk is peptidek, és amelyek ennél fogva lehetővé teszik paralógok közvetlen tervezését a komplementer megközelítéssel a primer aminosavszekvencia szekvenciálisán átfedő területeire tekintettel (Geysen szintézis/analízis eljárásának és Atassi kompleme>teritási tervezési megközelítésének kombinációja), a meghatározandó anyagok bár milyen eredetűek lehetnek, ideértve gyógyszereket, mint pl.
penicillin, tetraciklin, szteroidok, naproxen, teofillin,' viatz taminok, pl. K, D és A vitamin, különböző toxinokat, mint pl.
PCB, dioxin és tetra-bróm-etilén, és bármilyen jellegű kémiai anyagot, amelynek meghatározott körülmények között meghatározott molekuláris konfigurációja vagy alakja van. Fajlagos peptid paralógokat lehet tervezni jóformán bármely meghatározandó anyagra vagy annak valamely meghatározott területére.
A meghatározandó anyaghoz, legyen akár peptid, akár nem peptid, való paralóg tervezésének módját egy átvizsgálás! eljárással lehet megközelíteni a paralóg peptid-jelöltek között. (Ez a megközelítés természetesen alkalmazható olyan meghatározandó anyagokra is, amelyek maguk is peptidek, de ehhez a kezdetben említett változat is rendelkezésre áll). Ebben meg közelítésben tetszés szerinti számú, de tipikusan 4-20 amino savból álló paralóg-jelöltek sorozatát állítjuk elő az átvizsgáláshoz. Segítséget jelent, ha a sorozatot úgy tervezzük, hogy elektronfelhő-minta változatok széles tartományát fedje be, úgy, hogy először a kívánt paralóg megközelítését kapjuk meg, és az * ♦ · « « « ' ··:
·· · · 4 4··
- 12 ezután következő jelölteket ebből a tartományból vizsgáljuk át a végső beszabályozáshoz .
így pl. ha primer szekvenciájukban 6 aminosavat tartalmazó paralógokat alkalmazunk, 64 millió 6-mer lehetséges csak a 20 természetben előforduló aminosavat alkalmazva. Természetesen a peptidek szintézisének nem kell csupán ezekre a természetben előforduló alegységekre korlátozódnia: a kódolt aminosavak D-formái, valamint különböző nem kódolt aminosavak, mint pl. bétaalanin, amino-vajsav, citrullin és hasonlók szintén alkalmazhatók. Sőt, ezek lehetnek előnyösek is, mivel várhatóan stabilabbak, mint a természetes aminosavak, amelyek a mikroorganizmusok számára metabolitok.
Ha csupán megfelelő számú szintetizálandó 6-mer-ről van szó, azok a paraméterek, amelyek az elektronfelhő-mintát meghatározzák, ez esetben is széles tartományban váltózóak a jelöltek között. így pl. az elkészített peptid-jelölteket úgy lehet kiválasztani, hogy a hidrofóbikus index állandóan növekedjék a sorozat mentén. A hidrofóbikus indexek és a szerkezet kapcsolatáról értekezés található az alábbi közleményban: Janin : Natúré, 277, 491-492 (1979). Ezen kívül a fehérjék amfipatikus tulajdonságai változtathatók olyan módon, hogy a gyökök periódikus hidrofobicitását állítjuk be [ Eisenberg D. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 140-144 (1984) ,· Eisenberg D. és munkatársai: Natúré 299, 371-374 (1982)J. Az amfipatikus tulajdonság a peptid szekunder és tercier konformációjában lakozik, a molekula olyan részeit vagy oldalait eredményezve, amelyek víz- 13 oldhatók, vagy olyanokat, amelyek hidrofóbok. Ezen kívül a pozitítan vagy negatívan töltött aminosav gyökök jelenléte következtében szisztémátikusn változhat a töltési minta is a jelöltek sorozatában.
Egy kiindulási jelölt sorozat kényelmi szempontból alkalmasan mintegy 90 peptidből áll. Ez teljességgel a kereskedelmi forgalomban levő mikrotitráló lemezekhez és fehérje-szintetizá16 rudakhoz (Cambridge Research Biochemicals) való tervezést tükrözi, és ez kellemes szám, hogy elegendő egyedi vizsgálatot végezhessünk a kívánt paralóg jellemzőinek felderítésére. A szintézist hagyományos, általában kereskedelmi forgalomban levő eszközöket alkalmazó eljárásokkal hajtjuk végre, és az egység paralóg- jelöltek sorozata ezután kész az átvizsgáláshoz.
Átvizsgálási munkamenetek
Az átvizsgálási munkamenetet ismételten lehet alkalmazni, mivel a fajlagos affinitás kimutatására alkalmazott kötésre alapozott vizsgálatok általában reverzibilisek olyan módon, hogy a vizsgálati kompozíciót a vizsgálatot követően el lehet távolítani a paratóp sorozatról, amely a szilárd támasztóanyagon kötve marad. Nem feltétlenül szükséges az ilyen vizsgálatokat visszanyerhető formában vagy szilárd támasztóanyaghoz kötve elvégezni, de nagyon kényelmes így elvégezni.
Az újból felhasználhatóság különösen kényelmes a paralóg egyik szándékolt alkalmazásával, vagyis a kromatográfiában affinitás- ligandumként való felhasználásával kapcsolatban, mivel a relatív kötési erősségeket egy sor javasolt eluciós oldószer-
-rendszerben lehet szisztematikusan vizsgálni. így pl. a kötés erősségét egy-egy oldószer-sorozatban lehet vizsgálni, pl. olyan sorozatban, amely növekvő metanol-koncentrációt tartalmaz, vagy olyan sorozatban, amel növekvő sókoncentrációt tartalmaz, eluciós gradienst modellezve. Az ilyen típusú vizsgálatokban sok paralóg Összehasonlító viselkedése vizsgálható meg empirikusan sokféle eluciós körülmény között. Ez jelentős segítséget nyújthat, amennyiben pl. az X paralóghoz kapott kötési állandó gradiens előnyösebb lehet bizonyos kívánt eluciós körülmények között az Y paralóghoz kapott gradiensnél még akkor is, ha az Y paralógról úgy tőnik, hogy előnyösebb fajlagos affinitási szinttel bír, amikor csak egyetlen oldószerrel vagy egyetlen hőmérsékletnél vizsgáljuk. A vizsgálati sorozat újra felhsználhatósága így lehetővé teszi a legjobb paralóg kiválasztását a körülmények olyan sorozatában, amely a kromatográfiás eljárásban való felhasználást legjobban modellezi.
A vizsgálat előtt a paralóg sorozatot meg lehet (de nem feltétlenül szükséges) vizsgálni konformációra molekuláris nyéllel való kapcsolással, amint ezt a korábban idézett 2550-0003 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés leírja. A teljes sorozatot kezelhetjük ugyanazzal a molekuláris nyéllel, vagy elkülönített üregeket alkalmazva egyedi molekuláris nyeleket értékelhetünk a sorozat mentén. Egy ilyen munkamenetben bizonyos esetekben hasznos lehet többszörös tűről gondoskodni azonos vizsgálandó paralóggal és különböző konformáció-szabályozó molekuláris nyél távtartó tagokkal.
- 15 Miután a sorozatot a vizsgálathoz előkészítettük, átvizsgáljuk tagjainak fajlagos affinitását a kívánt vizsgálandó anyaghoz. Elméletileg ezt meg lehet tenni közvetlenül is a vizsgálandó anyag jelzésével és a sorozat egyes paralóg tagjaihoz kötött jelzés relatív mennyiségeinek meghatározásával. Ezt a megközelítést alkalmazva az 1. ábrában bemutatott mintához hasonló mintát kaphatjuk. Amint az 1. ábrában bemutatjuk, a sorozat egyes tagjaihoz kötött jelzés mennyiségét (az y koordináta) a sorozat tagjai mentén (az x koordináta) mutatjuk be. Különböző mennyiségű jelzéseket kapunk, az egyes paralógok affinitásától függően a meghatározandó anyaghoz.
A közvetlen eljárás alternatívája néha praktikusabb. Ebben az alternatívában a fajlagos affinitást a nem jelzett vizsgálananyag dó/jelzett peptidek keverékével való versengésének segítségével határozzuk meg. A peptid-keveréknek megfelelő számú tagot kell tartalmaznia úgy, hogy többé-kevésbé ekvivalens kötést kapjunk az összes paralóghoz a jelzett keverékkel önmagával a meghatározandó anyag távollétében. Egy nem jelzett anyag egy sorozat tagjaihoz való kötődésének kimutatására szolgáló ezen általános megközelítést részletesebben is leírja a 108,130 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amelyet 1987. október 13-án nyújtottak be a jelen bejelentés bejelentői; ez referenciaként épül be a jelen bejelentésbe.
Röviden ismertetve: kellő számú peptid (durván 500-1000 körüli nagyságrendben, bár bizonyos esetekben kisebb szám is elegendő) keverékét megfelelő módon jelezzük, pl. az acil jódozásos
*· ··’ ···.
eljárást alkalmazva 125. jódizotóppal, amint ezt Bolton A.E. és munkatársai leírták ^Biochem. □ . 529-539 (1973)]; ez a jódizotóp az ICN RádiochemicaIs kereskedelmi forgalomban levő terméke. Alkalmazhatók más jelzési eljárások is. A keveréket elkészíthetjük közvetlenül az egyes tagok szintézisével, majd ezek összekeverésével, vagy - és ez a kényelmesebb megoldás - megkaphatjuk nagy fehérjék hidrolízisével véletlenszerű kis peptidekké. Az egyik megközelítés például egy élesztő lizátum részleges tripszin/hidrolizátúrnát alkalmazza ^Cleveland D.IV. és munkatársai:
3. Bioi. Chem. 252, 1102-1106 (1977)]. Ez nagy számú peptidet szolgáltat, amelyeket keverékképpen lehet jelezni, vagy amelyet el lehet különíteni pl. SDS gélelektroforézist alkalmazva, és átvinni egy vizsgálati támasztóanyagra, pl. Immunodyne-re £ Burnette W.N.: Anal.Biochem. 112, 195-203 (1981)], ha kötésüket egyenként kell felbecsülni.
A jelzett peptidkeverék hasznosításában szükséges lehet azt igazolni, hogy kielégítő kötés történik a panelben levő összes paralóg-jelölt tekintetében. Azokat a körülményeket, amelyek ezt az ekvivalensjkötést hatékonnyá teszik a sorozat mentén, szintén meg kell állapítani tapasztalati úton. Egy tökéletes szituációban a peptidkeverék egységesen kötődik a sorozat minden tagjához, amint ezt a 2A. ábrában bemutatjuk. Gyakrabban azonban a kötésnek csak hasonló szintjei találhatók, mint a 2B. ábrában. Ez tökéletesen működő alapot nyújt az analizálandó anyaggal való versengéshez. Az eredmények interpretálását, amikor versengés is kialakul, le lehet egyszerűsíteni a kötési értékek normali- 17 zálásával ugyanarra az értékre, amely a versengés értékelése előtt volt.
Amikor igazolódott, hogy a jelzett peptidkeverék durván ekvivalens módon kötődik az összes paralóg-jelölthöz az analizálandó anyag távollétében, vagy hasonló kötés van normalizálva, az átvizsgálást megismételjük az analizálandó anyag jelenlétében, Azok a jelöltek, amelyek fajlagos aktivitással bírnak az analizálandó anyaghoz, csökkenést mutatnak a jelzett peptidkeverékhez való konjugálásban; a csökkenés arányos a jelölt fajlagos affinitásával az analizálandó anyaghoz.A 3.ábra tipikus versengési mintát mutat be. A koordináták jelentése ugyanaz, mint a többi ábrákban. Az analizálandó anyaghoz nagyobb aktivitású paralógok azonban a jelzés legkisebb szintjeit mutatják, ami azt jelzi, hogy sikeresen verseng az analizálandó anyag a jelzett fehérjekeverékkél a paralógért. Az analizálandó anyag azon képességének megállapításával, hogy versengeni tud, azokat a paralógokat, amelyek a legnagyobb csökkenést mutatják a jelzés felvételében, választjuk ki, mivel ezek rendelkeznek azokkal a paraméterekkel, amelyek a legkedvezőbbek az analizálandó anyag megkötéséhez.
Az átvizsgálási folyamatot meg lehet ismételni további sorozatokkal, amelyek tulajdonságai azok között a tagok között vannak, amelyek a legnagyobb fajlagos affinitást vagy a legkívánatosabb elúciós minta viselkedést mutatják az eredeti sorozatban, abból a célból, hogy finoman beállítsuk a végűlis kiválasztott paralóg molekuláris alakot és a töltéseloszlási min18 táját. Az átvizsgálást megismételhetjük tetszőleges számban és tetszőleges számú sorozattal olyan mértékig, amelyet a fajlagos affinitás vagy a kromatográfiás viselkedés megkíván. A paralóg sorozat elektronfelhő-mintáját így szintetikusan manipulálhatjuk abból a célból, hogy a paralóg affinitását a meghatározandó anyaghoz optimatizáljuk; ha a paralógot affinitási ligandumként alkalmazzuk egy kromatográfiás munkamenetben, egy affinitás, amely olyan nagy, hogy az elúció nehézkes, lehet, hogy nem kívánatos, és a korrekt mintát kell kiválasztani. A konformációs kontroll hatását is lehet tanulmányozni, amint fentebb leírtuk.
A kiválasztott paralógok alkalmazása
A kromatográfiában való felhasználásnál, amikor olyan paralógot választunk ki, amely a kívánt analizálandó anyaghoz megfelelő jellemzőkkel bír, ez a paralóg szilárd támasztóanyaghoz van rögzítve a szakterületen ismert hagyományos módszereket alkalmazva. A tipikus szilárd támasztóanyagok közt találjuk a kovasav alapú támasztóanyagokat, timföldet, poliszacharid alapú támasztóanyagokat, akrilamid géleket, és sok más hasonló, kereskedelmi forgalomban kapható taámasztóanyagot. A támasztóanyagoknak egy különösen kedvelt típusa a fluor-szénhidrogének, pl. a polivinilidén-difluorid (PVDF), pl. az, amelyet a Millipore vagy az Immobilon forgalmaz. A konjugációs technikák széles választéka áll rendelkezésre, beleértve azokat is, amelyek szükség esetén egy kapcsoló kart vezetnek be a szilárd támasztóanyag és a paralóg ligandum közé. Bizonyos esetekben az olyan kapcsolókar alkalmazása előnyös, amelynek hossza mintegy 3-9 szénnel ekvivalens, mert ez nagyobb hozzáférhetőséget biztosít az analizálandó anyagnak a 1igandumhoz.
Az így létrejött szubsztrátumot, amelyben a szilárd támasztóanyag egy, a kívánt analizálandó anyaghoz való kötésre fajlagos paralóghoz van rögzítve, ezután a kromatográfiás szubsztrátumoknál hagyományos módon használhatjuk. Ez be lehet csomagolva oszlopba vagy be lehet helyezve szűrőágyba, hogy adszorbeálja az analizálandó anyagot, amikor az analizálandó anyagot tartalmazó kompozíciót a szubsztrátummal érintkezésbe hozzuk. Amikor a paralóg viszonylag stabil ligandum, a találmány szerinti szubsztrátummal töltött készítmények és oszlopok HPLC-re tervezett berendezésbe is behelyezhetők.
Az affinitáson alapuló kromatográfia HPLC-be való adaptálásának előnyeit nem is lehet kellőképpen túlbecsülni, különösen akkor, ha a kromatográfiás munkamenetet preparatív méretben akarjuk végrehajtani. A jobb felhasználást a preparatív munkamenetben inkább az oszlop jellemzőinek alapján célszerű elérni, mint az oszlop méretnövelésének durva erőltetésével vagy az eluálószer erősségének lecsökkentésével, amely igen hosszú eluciós időt igényel. Bármely olyan beállítás, amely növeli az eluálószer komplex voltát vagy mennyiségét, súlyos hátrányt jelent preparatív méretekben. így pl. a drága oldószerek és a komplex keverési munkamenet csak akkor lehet indokolt, amikor összesen legfeljebb 10-100 ml szükséges, mint pl. az analitikai eljárásokban; ezek ezonban drágává és problematikussá válnak, amikor • · ·
- 20 több száz vagy ezer liter oldószer szükséges, amely gyakran előfordulhst preparatív munkamenetek esetében. Nem csupán azért kell eltávolítani (illetve visszanyerni) ilyen esetekben az oldószert, hogy a költségeket csökkentsük (bár maga az oldószervisszanyerés is költséges), hanem azért is, hogy az előállítandó termék oldószermen.tes legyen.
Ezen túl, mivel a preparatív kromatográfiával tisztítandó anyagot gyakran szükséges újra átvezetni az oszlopon, hogy elérjük a hatékony elválasztást, a komplex eluálási munkamenetnek további hátránya az, hogy az oszlop újra kiegyensúlyozását igényli az újra-feltöltési fázisban.
A fenti okokból az analitikai eljárások általában csak úgy válhatnak méret-növeltté, ha az elkülönítés alapja az adszorbens növelt szelektivitása, vagyis az eljárás affinitás-kromatográfiás megközelítésen alapszik.
Egy különösen előnyös munkamenetben olyan oszlopot lehet kialakítani, amely paralógok sorozatával bír, amelyeknek különböző, általában növekvő, affinitása van az analizálandó cél-anyaghoz. A kötési affinitások ilyen egymásutánisága, ahogyan az analizállandó anyag végighalad az oszlopon, hatékony a feloldóképesség javításában. Egy tipikus kiviteli módban az oszlop egy olyan paralóg ligandummal kezdődik, amely a cél-anyaghoz nagyon kis affinitással bír; az ez után következő paralógok növekvő affinitással bírnak.
Következésképpen a paralóg ligandumokkal bíró szubsztrátumokkal töltött oszlopokat alkalmazhatjuk akár analitikai, akár • · ·
- 21 preparatív eszközként, és a paralóg-származékos szubsztrátummal ellátott oszlopok alkalmazása kényelmes és hatékony alternatívája lehet a hagyományos kromatográfiás megközelítéseknek. Ha az analizálandó anyag gyógyszer, a paralóg-származékos szubsztrátumot fajlagos reagensként lehet alkalmazni, amely adszorbeálja a gyógyszert a testfolyadékból, majd ezt a gyógyszert elemzéshez le lehet eluálni. Ha az analizálandó anyag valamely melléktermékben vagy eltávozó anyagban levő toxin, ezt a szubsztrátumot lehet használni kimutatáshoz, de lehet alkalmazni a toxin eltávolítására is a keverékből. Ha az analizálandó anyag maga a kívánt termék, amely kis kitermeléssel készült, a szubsztrátumot arra lehet felhasználni, hogy a terméket egy tételben vagy standard kromatográfiás technikákat alkalmazva izoláljuk.
Előnyösek lehetnek azok a paralógok is, amelyeknek az a tulajdonságuk, hogy toxinokhoz van fajlagos affinitásuk; ezek; mind in vivő, mind in vitro ’ utcaseprődként alkalmazhatók, így pl. az egyik kiviteli módban paralóghoz konjugált latex gyöngyöket adhatunk a belekbe vagy a véráramba, mint antidótumokat mérgezés ellen. Egy másik kiviteli módban olyan felállást alkalmazhatunk, amelyben gyógyszer-szállító rendszert nyújtunk, amely ugyan fajlagosan kötődik a paralóghoz, de csak mérsékelt affinitással.
Miközben bizonyos kiválasztott paralógok úgy nyernek hasznosítást, hogy szilárd támasztóanyaghoz vannak rögzítve, elsősorban a kromatográfiában, a paralógok hasznosítása nem korlátozódik szilárdan kötött formájára. A megfelelő összetételű és
- 22 jellegű paralógokat alkalmazhatjuk megfelelő antitestek vagy antitest-fragmentumok helyettesítéséte is standard immunassayban. Az ilyen célú felhasználásban a paralóg lehet jelzett is, de lehet jelzetlen is, a munkamenettől függően. így pl. egy tipikus szendvics-vizsgálatban paralógokkal bevont mikrotitráűregeket alkalmazunk az antigén mintáinak elemzéséhez, ahol a paralóghoz kötött antigént azután jelezzük, egy eltérő epitopra fajlagos antitest jelzett formáját alkalmazva, vagy egy váltakozó paralóg jelzett formájával. Egy másik módszer szerint jelzett paralógokat alkalmazhatunk, hogy versengjenek egy mintában levő bármely analizálandó antitesttel a szilárd szubsztrátumhoz kötött antigénért. A szakterület ismerete alapján érthető, hogy igen sokféle speciális munkamenet ismeretes a szilárd fázison alapuló és az agglutináción alapuló területeken; ez világos azok számára, akik a szakterületen járatosak.
Az alábbi példa segít a találmány jobb megértésében, de nem az oltalmi kör korlátozására szolgál.
PÉLDA
Paralóg sorozat szintézise peptidből álló sorozatot tervezünk csökkenő hidrofobicitás és a hidrofóbikus momentum periódikus váltakozása alapján. A 4.ábra az 1-88. számon szintetizált pentapeptidek listáját mutatja be, míg az 5. ábra a hidrofóbikus indexet és a hidrofóbikus momentumot mutatja be a sorozat mentén.
A sorozatot Geysen H.M. és munkatársai eljárását l · · · • · · · ····
- 23 Natl. Acad. Sci. USA (1984), fentebb idézett munkaj alkalmazva szintetizáljuk. A további megmaradó 8 polietilén tűt alkalmazzuk a szintézis aminosavelemzéssel analizálandó kontrolljához.
A paralóg paneleket tartalmazó polietilén tűk készletét azután egységes reakcióra átvizsgáljuk fehérjék keverékével. A keveréket élesztő lizátum tripszines hidrolízisével kapjuk meg, és az így létrejött keveréket Bolton-Hunter reagens alkalmazásával jelöljük, 125-I-t használva, amint korábban leírtuk.
A jelzett hidrolizátumot a sorozat mind a 90 tagjának kezelésére alkalmazzuk, és a jelzett kötés mennyiségét kimutatjuk. A kötés mennyiségét mennyiségileg úgy határozzuk meg, hogy a kezelt rudacskákat röntgenfilmmel hozzuk érintkezésbe, és a filmen kimutatjuk a foltok sűrűségét, vagy az egyes kötött peptideket egyenként számoljuk meg a kötött peptideket tartalmazó rudacskák eltávolításával és gamma-számolóval végzett közvetlen számolásával, hogy felbecsüljük a radióaktivitás mennyiségét a támasztóanyaghoz kapcsolt paralógoknak megfelelő egyes rudacskákon.
A fehérjekeverékről úgy találjuk, hogy értelemszerűen a sorozat tagjaihoz hasonlóan kötődik; a kötési értékeket 100 % ra normalizáljuk.
A sorozatot azután újra átvizsgáljuk, a vizsgálati eljárást olyan módon ismételve meg, hogy a mikrotitráló lemezekben levő keverékhez az analizálandó anyag meghatározott mennyiségét adjuk hozzá. Kis számú peptiddel konjugált tű mutat je• * · • « ·
- 24 lentősen csökkentett jelzést. Ezek a kiválasztott peptidek jelentik a kezdeti átvizsgálás eredményét megfelelő elektronfelhő mintájú molekulákra. Ha szükséges, a peptid-jelöltek további finomítását is elérhetjük egy konformációs kontroll révén, különböző feltételek között vizsgálva, amint fentebb leírtuk, továbbá előállíthatunk a legjobb jelöltek tulajdonságaitól csak csekély változásokat mutató sorozatokat is hasonló módon, ahogyan ebben a példában fentebb leírtuk.
Amikor megfelelő számú sikeres paralóg-jelöltet kaptunk, ezeket a sikeres paralóg-jelölteket rutin eljárásokkal, szilárd fázisú eljárással szintetizáljuk olyan mennyiségben, hogy szekvenciájukat igazolni tudjuk. Ha a paralógot kromatográfiában kívánjuk alkalmazni, ezt valamilyen szilárd támasztóanyaghoz rögzíthetjük, mint pl. Affi-prep-10 (Bio-Rad)z és betölthetjük kromatográfiás oszlopba. Egy másik eljárás szerint a kromatográfiás támasztóanyagot úgy is megszerezhetjük, hogy a peptidet azon a szintézis-támasztóanyagon, pl. a kovasav alapú Ultra Affinity-ET támasztóanyagon (Beckman) hagyjuk rajta, amelyen szintetizáltuk.
Abból a célból, hogy igazoljuk: a paralóg rendelkezik a kívánt fajlagos affinitással, hasonló oszlopot készítünk, ligandumként a paralóg aminosav-szekvenciájának összekevert formáját alkalmazva. Az analizálandó anyag kötődik a paralógot tartalmazó oszlophoz, de nem kötődik az összekevert szekvenciájú peptidet tartalmazóhoz. Az Atassi-féle irodalmi hely, amelyet korábban idéztünk, igazolja, hogy az ilyen összekeverés megszünteti a kötődést.
Claims (17)
1. Szubsztrátum paralóg affinitáskromatográfia végrehajtására azzal jellemezve, hogy az alábbi alkotórészekből áll: szilárd támasztóanyag egy adott analizálandó anyaghoz fajlagos affinitással bíró paralóghoz - kívánt esetben kapcsoló kacson keresztül - kötve, ahol a nevezett paralóg lényegében 4-20 aminosavból álló peptid.
2. Az 1. igénypont szerinti szubsztrátum azzal jellemezve, hogy a nevezett paralóg 5-15 aminosavból álló peptid.
3. Az 1. igénypont szerinti szubsztrátum azzal jellemezve, hogy a nevezett szilárd támasztóanyag poliszacharid-, poliakrilamid-, polisztirol-, polietilén-, fluorozott szénhidrogén-, vagy kovasav-alapú részecskékből áll.
4. Az 1. igénypont szerinti szubsztrátum azzal jellemezve, hogy a nevezett paralóg valamely nem-peptid analizálandó anyaghoz bír fajlagos affinitással.
5. Kromatográfiás oszlop azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tápközeg valamely 1. igénypont szerinti szubsztrátum.
6. Eljárás paralóg affinitás-kromatográfiához alkalmas oszlop előállítására azzal jellemezve, hogy valamely szilárd támasztóanyaghoz olyan paralógot kötünk, amely lényegében 4-20 aminosavat tartalmazó peptid, és amelynek egy adott analizálandó anyaghoz fajlagos affinitása van.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy magában foglalja az említett paralóg azonosításának lépését is, amely abból áll, hogy paralóg-jelöltek sorozatát átvizsgáljuk fajlagos aktivitásra az adott analizálandó anyaghoz.
8. A 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy analizálandó anyagként valamely nem-peptid analizálandó anyaghoz fajlagos affinitású paralógot kötünk.
9. Eljárás valamely analizálandó anyag tisztítására azzal jellemezve, hogy
- a szóban forgó analizálandó anyagot tartalmazó kompozíciót érintkezésbe hozzuk az 1. igénypont szerinti szubsztrátummal olyan módon, hogy az analizálandó anyag szelektíven abszorbeálódva elkülönüljön a kompozíció többi komponenseitől; és
- az említett analizálandó anyagot a szubsztrátumról eluálj uk.
10. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az eluálási lépésben az analizálandó anyag szelektíven eluálódik a kompozíció további komponenseihez viszonyítva.
11. Eljárás valamely analizálandó anyag jelenlétének vagy mennyiségének meghatározására valamely kompozícióban azzal jellemezve, hogy az említett kompozíciót érintkezésbe hozzuk olyan szubsztrátummal, amely az analizálandó anyaghoz fajlagos affinitással bíró paralógot tartalmaz, amely paralóg lényegében 4-20 aminosavból áll és valamely szilárd támasztóanyaghoz van kötve; és az analizálandó anyag szubsztrátumhoz való adszorpcióját kimutatjuk vagy mennyiségileg meghatározzuk.
• » · * · 9 ··· ··« · • · · ·· »· Μ'«
12. Eljárás valamely analizálandó anyag jelenlétének vagy mennyiségének meghatározására valamely kompozícióban azzal jellemezve, hogy az említett kompozíciót egy standard immunassay munkamenetben olyan paralóggal kezeljük, amely az analizálandó anyagra fajlagos antitestet helyettesítő, lényegében 4-20 aminosavból álló szekvenciával bíró peptid.
13. Eljárás valamely meghatározandó anyaghoz fajlagos affinitással bíró paralóg azonosítására azzal jellemezve, hogy
- 4-20 aminosavból álló egyedi peptidek sorozatát készítjük el, ahol a nevezett peptidek szisztematikusan változó hidrofóbicitással, amfipatikus jellemzőkkel és töltési mintákkal bírnak; és
- az említett sorozatot átvizsgáljuk az analizálandó anyaghoz való kötődésre.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy 5-15 aminosavból álló egyedi peptidek sorozatát készítjük el.
15. A 13. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett átvizsgálási lépést úgy hajtjuk végre, hogy az analizálandó anyagnak felbecsüljük azt a képességét, hogyan képes versengeni a sorozatban az egyes paralógok kötéséért peptidek olyan jelzett keverékével, amely az egyes paralóg-jelöltek mindegyikével képes kötődni.
16. A 15. igénypont szerint eljárás azzal jellemezve, hogy a peptidek jelzett keverékeként jódozó acetilezéssel jelzett peptidkeveréket alkalmazunk.
* ' ‘ >
2Θ
17. Eljárás toxin eltávolítására környezetéből azzal jellemezve, hogy a nevezett környezetet érintkezésbe hozzuk egy olyan szilárd támasztóanyaggal, amely a toxinhoz fajlagos affinitással bíró paralóghoz - kívánt esetben kapcsoló kacson keresztül - van kötve, ahol a nevezett paralóg lényegében 4-20 aminosavból álló peptid.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17262688A | 1988-03-24 | 1988-03-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU892121D0 HU892121D0 (en) | 1991-03-28 |
| HUT63587A true HUT63587A (en) | 1993-09-28 |
Family
ID=22628508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU892121A HUT63587A (en) | 1988-03-24 | 1989-03-23 | Paralogic affinity-chromatography |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0438402B1 (hu) |
| JP (1) | JP2690164B2 (hu) |
| KR (1) | KR900700170A (hu) |
| AT (1) | ATE167301T1 (hu) |
| AU (1) | AU628812B2 (hu) |
| CA (1) | CA1339768C (hu) |
| DE (1) | DE68928704T2 (hu) |
| HU (1) | HUT63587A (hu) |
| NZ (1) | NZ228482A (hu) |
| WO (1) | WO1989009088A1 (hu) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8928501D0 (en) * | 1989-12-18 | 1990-02-21 | Unilever Plc | Reagents |
| US5650489A (en) * | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
| AU675446B2 (en) * | 1992-07-27 | 1997-02-06 | Terrapin Technologies, Inc. | Sorbent families |
| NZ516848A (en) | 1997-06-20 | 2004-03-26 | Ciphergen Biosystems Inc | Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine |
| EP1387390B1 (en) * | 1997-06-20 | 2009-02-18 | Bio - Rad Laboratories, Inc. | Retentate chromatography and protein chip arrays with applications in biology and medicine |
| WO2001033230A2 (en) * | 1999-11-02 | 2001-05-10 | Chiron Corporation | Biological sample component purification and differential display |
| US6783929B1 (en) | 1999-11-02 | 2004-08-31 | Chiron Corporation | Biological sample component purification and differential display |
| US7148058B2 (en) | 2000-06-05 | 2006-12-12 | Chiron Corporation | Protein microarrays on mirrored surfaces for performing proteomic analyses |
| US7153682B2 (en) | 2000-06-05 | 2006-12-26 | Chiron Corporation | Microarrays on mirrored substrates for performing proteomic analyses |
| IT1318595B1 (it) * | 2000-06-23 | 2003-08-27 | Ausimont Spa | Microsfere di copolimeri termoprocessabili del tetrafluoroetilene. |
| MY150687A (en) | 2006-07-21 | 2014-02-28 | Femalon S P R L | Assay and kit for predicting implantation success in assisted fertilisation |
| WO2011000805A1 (en) | 2009-06-29 | 2011-01-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Biomarkers of oocyte competency and method of use |
| CN109187779A (zh) * | 2018-08-29 | 2019-01-11 | 四川百特芳华医药科技有限公司 | 一种甾体化合物的分析方法 |
| WO2024049540A1 (en) * | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Advanced Materials Technology, Inc. | Hydrophobic interaction chromatography (hic) composition and method of producing the hic composition |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4525465A (en) * | 1983-10-07 | 1985-06-25 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Water-insoluble biospecific absorbent containing argininal derivative |
| US4636463A (en) * | 1984-04-05 | 1987-01-13 | Scripps Clinic And Research Foundation | Antibodies to human interleukin-2 induced by synthetic polypeptides |
| US4544485A (en) * | 1984-08-31 | 1985-10-01 | Purdue Research Foundation | Chromatographic method and means |
-
1989
- 1989-03-23 DE DE68928704T patent/DE68928704T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-23 HU HU892121A patent/HUT63587A/hu unknown
- 1989-03-23 AU AU33537/89A patent/AU628812B2/en not_active Ceased
- 1989-03-23 EP EP89904386A patent/EP0438402B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-23 CA CA000594691A patent/CA1339768C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-23 AT AT89904386T patent/ATE167301T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-23 JP JP1503913A patent/JP2690164B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-23 WO PCT/US1989/001194 patent/WO1989009088A1/en active IP Right Grant
- 1989-03-23 KR KR1019890702178A patent/KR900700170A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-03-23 NZ NZ228482A patent/NZ228482A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0438402A4 (en) | 1991-12-04 |
| HU892121D0 (en) | 1991-03-28 |
| AU3353789A (en) | 1989-10-16 |
| EP0438402A1 (en) | 1991-07-31 |
| KR900700170A (ko) | 1990-08-11 |
| DE68928704T2 (de) | 1998-12-10 |
| ATE167301T1 (de) | 1998-06-15 |
| JPH03505120A (ja) | 1991-11-07 |
| NZ228482A (en) | 1991-03-26 |
| EP0438402B1 (en) | 1998-06-10 |
| WO1989009088A1 (en) | 1989-10-05 |
| CA1339768C (en) | 1998-03-24 |
| AU628812B2 (en) | 1992-09-24 |
| JP2690164B2 (ja) | 1997-12-10 |
| DE68928704D1 (de) | 1998-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4963263A (en) | Method of identity analyte-binding peptides | |
| AU654940B2 (en) | Method to identify analyte-binding ligands | |
| US5340474A (en) | Panels of analyte-binding ligands | |
| US5567317A (en) | Method to identify analyte-binding ligands | |
| KR101149969B1 (ko) | 항체 정제 | |
| HUT63587A (en) | Paralogic affinity-chromatography | |
| Ostryanina et al. | Multifunctional fractionation of polyclonal antibodies by immunoaffinity high-performance monolithic disk chromatography | |
| Platonova et al. | Quantitative fast fractionation of a pool of polyclonal antibodies by immunoaffinity membrane chromatography | |
| Hage et al. | Affinity chromatography: a historical perspective | |
| Jadaun et al. | HPLC for Peptides and Proteins: Principles, Methods and Applications. | |
| US20070048795A1 (en) | Immunoaffinity separation and analysis compositions and methods | |
| WO2011010304A2 (en) | Method for preparing molecularly imprinted polymers and uses thereof | |
| JPH1025299A (ja) | 整列ペプチド、及びそれを用いたタンパク質の結合・相互作用部位検出方法 | |
| Wang et al. | A hexamer peptide ligand that binds selectively to staphylococcal enterotoxin B: isolation from a solid phase combinatorial library | |
| Liu et al. | Rational design of affinity peptide ligand by flexible docking simulation | |
| Skoczylas et al. | Dipeptide-bonded stationary phases for hydrophilic interaction liquid chromatography | |
| Smejkal et al. | Separation methods in proteomics | |
| Xu et al. | Protein–protein interactions on weak-cation-exchange sorbent surfaces during chromatographic separations | |
| JPS58144749A (ja) | 第２抗体で被覆したイムノアツセイ用プラスチツク支持材およびその製造方法 | |
| JPS63184065A (ja) | ペプチドシ−クエネ−タ−用連続フロ−反応器 | |
| Oscarsson et al. | Thiophilic adsorbents for RIA and ELISA procedures | |
| Harlow et al. | Purification of antibodies on an antigen column | |
| Benedek et al. | “Paralogs”, sorbent families for protein separations | |
| WO2008058325A1 (en) | Immunoaffinity compositions for immunodepletion of proteins | |
| Krull et al. | Capillary electrophoresis in combinatorial library analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC9 | Refusal of application |