DE68928704T2

DE68928704T2 - Gruppe von getrennten peptiden

Info

Publication number: DE68928704T2
Application number: DE68928704T
Authority: DE
Inventors: Lawrence M. San Francisco Ca 94122 Kauvar
Original assignee: Telik Inc; Terrapin Technologies Inc
Current assignee: Telik Inc
Priority date: 1988-03-24
Filing date: 1989-03-23
Publication date: 1998-12-10
Anticipated expiration: 2009-03-24
Also published as: CA1339768C; KR900700170A; HUT63587A; EP0438402B1; JP2690164B2; WO1989009088A1; AU628812B2; EP0438402A1; EP0438402A4; ATE167301T1; NZ228482A; JPH03505120A; DE68928704D1; AU3353789A; HU892121D0

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft eine Serie von individuellen Peptiden mit 4 bis 20 Aminosäuren und ein Verfahren zum Absuchen der Peptide der Serie auf ihre Fähigkeit, selektiv einen Analyten zu binden. Die Erfindung betrifft ferner chromatographische und analytische Verfahren, bei denen Affinitätsliganden für spezifische Analyte beteiligt sind. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von Peptidparalogen als Affinitätsliganden in chromatographischen Techniken zum Nachweis und zur Reinigung einer Vielzahl von Analyten, insbesondere toxischen Verunreinigungen niedriger Immunigenität. Die Paralogen können auch in Immuntestverfahren verwendet werden.

Stand der Technik

Zwei Hauptentwicklungen in der Praxis der chromatographischen Trennungen waren im Verlauf ungefähr der letzten zehn Jahre von besonderer Bedeutung, um die Isolierung von Naturprodukten, die Trennung von Komponenten aus Gemischen und die Analyse von komplexen Zusammensetzungen zu erleichtern. Diese sind die Erhöhung der Vielfalt der verfügbaren Liganden für die Affinitätschromatographie, wobei die Trennung oder Analyse von der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem trägergebundenen Liganden und einem gewünschten Analyt abhängt, und das Aufkommen der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), die eine rasche und effiziente Trennung mehrerer Komponenten erlaubt. Diese Entwicklungen überlappen nur in einem begrenzten Ausmaß, da bei der HPLC im allgemeinen Bedingungen verwendet werden, die für viele Liganden, die als spezifische Affinitätspartner verwendet werden, ungünstig sind. Der häufigste Affinitätspartner zur Verwendung in diesen Techniken bezüglich eines Spektrums möglicher Analyte, waren spezifische Immunglobuline oder immunreaktive Fragmente davon. Im allgemeinen ist dieser Typ von Ligand bezüglich der bei der HPLC verwendeten Bedingungen instabil. Bei der HPLC werden oft nichtwäßrige Lösungsmittel verwendet, die viele Affinitätsliganden denaturieren, und die verwendeten hohen Drücke zerstören ebenfalls viele dieser Substanzen.
Bei der Affinitätschromatographie kann eine Vielzahl von festen Trägern und Affinitätsliganden verwendet werden, wie in einem frühen Übersichtsartikel von May, S.W. in Separation and Purification, 3. Aufl. (1978), Edmond S. Perry, et al., Hrsg., Bd. 12 in Techniques of Chemistry (J. Wiley) zusammengefaßt ist. Dieser Übersichtsartikel beschreibt geeignete Träger für die Affinitätschromatographie unter besonderer Betonung von Polysaccharidträgern zusätzlich zu Polyacrylamidgelen, gemischten Gelen und verschiedenen Gläsern und Siliciumdioxidderivaten. Von diesen erlangten nur Siliciumdioxidderivate eine breite Akzeptanz zur Verwendung bei der HPLC. Jedoch war das Ausmaß der Derivatisierung des Trägers zur Modifizierung seiner Bindungseigenschaften auf die Veränderung der Hydrophobizität durch Konjugation verschiedener Kohlenwasserstoffliganden oder anderer einfacher Moleküle beschränkt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine einfache Kreuzung zwischen der HPLC und den Affinitätsverfahren, indem Liganden bereitgestellt werden, die die benötigte Affinität besitzen, die für ein ausgewähltes Mitglied einer Anordnung möglicher Analyte spezifisch ist, und die Fähigkeit besitzen, den Bedingungen der HPLC zu widerstehen.
Andere Forscher versuchten diese Kreuzung auf verschiedene Arten. Peterson, E.A. et al., Meth. Enz. (1984), 104: 113-133 beschreiben eine "Verdrängungs"- Chromatographie, bei der eine Kompetition um die Adsorptionsstellen zwischen den adsorbierten Komponenten anstelle einer Kompetition mit dem Eluenten stattfindet. Chromatographische Träger, bei denen Kohlenhydrate, wie Cyclodextrine, mit verschiedenen spezifischen Affinitäten für die zu trennenden Substanzen verwendet werden, wurden ebenfalls beschrieben (Armstrong, D.W. et al., J. Chrom. Sci. (1984), 22: 411- 415).
Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Liganden sind Peptide mit 4 bis 20 Aminosäuren und werden hier als "Paraloge" bezeichnet. Ein Paralog ahmt den Teil eines Immunglobulins nach, der spezifisch an die antigene Determinante oder das Epitop des Antigens bindet, gegen das der Antikörper erzeugt wurde. Das zu diesem Epitop komplementäre Segment wird im allgemeinen als Paratop bezeichnet, und da die Peptidsequenz in dem Paralog nicht die gleiche sein muß, wie sie in den erzeugten Antikörpern vorkommt, wird der Ausdruck Paralog (oder paratopes Analog) verwendet. Die Synthese und die Identifizierung von Paralogen wurde zuvor in einem sehr begrenzten Ausmaß durchgeführt. Atassi, M.Z., et al., J. Biol. Chem. (1977), 252: 8784-8787 beschrieben die spezifische Entwicklung eines Peptids, das den antigenen Stellen von Lysozym komplementär ist. Das Wissen um die dreidimensionalen Umriße von Lysozym erlaubte die Synthese eines Peptids mit Ausmaßen und Elektronendichtemustern, die der abgeleiteten Determinante analog sind. Das Paralog wurde durch Herstellen einer Peptidsequenz, die absichtlich bezüglich der Abmessungen und Elektronenverteilung dem die Determinante nachahmenden Peptid komplementär ist, erhalten. Die Pseudo-"Paratop"-Peptide hemmten die Reaktion von Lysozym mit Antiseren und banden spezifisch Lysozym unter Ausschluß von Myoglobin oder Antikörper. Spätere Arbeiten aus der gleichen Gruppe führten zur Synthese eines Peptids, das die Acetylcholinbindungsstelle eines spezifischen Rezeptors und einer Bindungsstelle im Trypsin widergibt (McCormick, D.J., et al., Biochem. J. (1984), 224: 995-1000; Atassi, M.Z., Biochem. J. (1985), 226: 477-485). Die paralogen (oder analoge Rezeptor- oder Enzymbindungsstelle nachahmenden) Peptide beruhten auf bekannten Parametern, die mit entweder der antigenen Determinante oder mit der Determinantenbindungseinheit verbunden sind.
Jüngste Arbeiten zeigten, daß die idiotypische Oberfläche von Antikörpern kartiert werden kann, und Peptide, die Teile dieser Oberfläche nachahmen, hergestellt werden können. Wie erwartet, stimmen die Idiotope und die Paratope nicht genau überein. Seiden, M.V., Am. Assoc. Immunol. (1986), 136: 582-587; Roux, K.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987), 84: 4984-4988.
Jüngst wurden Verfahren zur Nachahmung von Epitopen als spezifisch bindende komplementäre Komponenten ohne das Wissen über die Eigenschaften der spezifischen Wechselwirkung beschrieben. Die wichtigste Arbeit ist die von Geysen, H.M. von den Commonwealth Serum Laboratories in Australien. Geysen entwickelte ein empirisches Verfahren zur Herstellung einer Serie von multiplen Kandidatensequenzen, deren Fähigkeit, spezifisch an einen Antikörper zu binden, empirisch getestet werden kann. Bei dem Geysen-Verfahren wird jedes der Kandidatenpeptide getrennt an einem individuellen Polyethylenträgerstäbchen in relativ kleiner Menge synthetisiert. Diese Trägerstäbchen werden zweckdienlicherweise so angeordnet, daß sie einzeln in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eintauchen. Typischerweise können 96 getrennte Peptide gleichzeitig synthetisiert werden (die Anzahl entspricht der Anordnung im Handel erhältlicher Platten). Die 96 Peptide können auch gleichzeitig auf die Bindung an Antikörper oder Rezeptoren unter Verwendung von Standardradioimmuntest- oder ELISA-Techniken getestet werden. (Vergleiche beispielsweise Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984), 81:3998-4002, WO-A-86 00991 und WO-A-86 06487).
Eine Vielzahl von Kandidatenpeptiden kann auch gleichzeitig in getrennten Behältern unter Verwendung des T-Bag-Verfahrens von Houghten, R., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) (1985), 82:5131-5135 synthetisiert werden.
Die vorstehenden Elemente aus dem Stand der Technik können produktiv als Quelle zur Konstruktion der Liganden, die für die chromatographischen Substrate und für die Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung benötigt werden, verwendet werden.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Serie von getrennten individuellen Peptiden mit 4 bis 20 Aminosäuren, wobei die individuellen Peptide so ausgerichtet sind, daß sie:
a) einen stetig ansteigenden Wert des hydrophoben Index und eine periodische Veränderung des hydrophoben Moments innerhalb der Serie aufweisen; oder
b) einen stetig ansteigenden Wert des hydrophoben Index und eine systematische Veränderung des Ladungsmusters innerhalb der Serie aufweisen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Peptids, das eine spezifische Affinität für einen Analyten aufweist, nach Anspruch 3, und ein Verfahren zur Charakterisierung eines einzelnen Analyten nach Anspruch 6.
Die Erfindung stellt eine nützliche Form einer analytischen und präparativen Chromatographie auf festen Trägern bereit, die eine Kombination der Vorteile der Affinitätschromatographie und der HPLC erlaubt. Durch Konstruieren geeigneter Substrate für chromatographische Trennungen und Reinigungen auf Affinitätsbasis können die Verfahren unter effizienten Bedingungen durchgeführt werden, die eine fertige Analyse der Komponenten oder ihre Reinigung oder ihre Entfernung aus Gemischen erlauben. Diese Techniken sind zur Entfernung toxischer Abfälle aus Effluenten, zur Bestimmung der Menge von Toxinen in Sammelbehältnissen, zur Analyse des Gehalts von Materialien in niedrigen Konzentrationen in Anwesenheit einer hohen Konzentration nichtspezifischer Verunreinigungen und in präparativen Verfahren, die HPLC einschließen, besonders nützlich.
So betrifft gemäß einem Gesichtspunkt die Erfindung Substrate, die einen bestimmten Analyten adsorbieren können, wobei das Substrat einen festen Träger umfaßt, an den ein Ligand, bestehend im wesentlichen aus einem 4 bis 20 Aminosäuren langen Paralog mit spezifischer Affinität für den bestimmten Analyten, konjugiert ist. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung Säulen oder andere chromatographische Konfigurationen, die dieses Substrat enthalten, und Verfahren zur Reinigung und Analyse von Analyten unter Verwendung dieser Mittel.
Gemäß einem noch weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung der gewünschten Affinitätssubstrate, die Paralogliganden enthalten. Sie betrifft auch alternative Verwendungen für die Paralogen einschließlich des Ersatzes von Antikörpern oder Fragmenten davon in Immuntestverfahren durch sie. Die Paralogen können auch anstelle von Antikörpern zum Absuchen von Mimotopserien nach Mitglieder, die ein spezielles Hapten im Verfahren einer pseudoidiotypischen Netzwerk(PIN)-Chromatographie ersetzen können, verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Figur 1 zeigt die generischen Ergebnisse eines typischen ELISA-Bindungstests, bei dem eine Serie von Paralogen mit einem einzelnen markierten Analyt umgesetzt wird.
Die Figur 2 zeigt die generischen Ergebnisse eines typischen ELISA-Bindungstests, bei dem eine Serie von Paralogen mit einem Gemisch markierter Peptide umgesetzt wird.
Die Figur 3 zeigt die generischen Ergebnisse des entsprechenden Tests der gleichen Paralogserie mit dem markierten Gemisch in Anwesenheit eines nichtmarkierten Analyten.
Die Figur 4 zeigt die Serie von 90 Kandidatenpentapeptid-Paralogen, die nach Beispiel 1 synthetisiert wurden.
Die Figur 5 zeigt die Variation des Hydrophobizitäts-Index und des hydrophoben Moments in einer Serie nach Figur 4.

Arten zur Ausführung der Erfindung

Der hier verwendete Ausdruck "Paralog" bezeichnet ein Peptid mit 4 bis 20, bevorzugt 5 bis 15, und mehr bevorzugt 6 bis 8 Aminosäuren, das eine spezifische Affinität für einen definierten Analyt oder ein definiertes Hapten hat. Das Paralog ahmt die räumliche Konformation und das Elektronenverteilungsmuster der Paratopregion eines Antikörpers, der als Antwort auf die Verabreichung des Analyten erzeugt werden könnte, nach. Während das Paralog auf diese Weise entwickelt werden kann, ist es natürlich nicht notwendig, daß die Verabreichung des Analyten in der Tat in jedem Fall (oder in einigen Fällen) Immunglobuline mit einem Paratop genau mit der Konformation und dem Muster des Paralogs erzeugt. Es reicht aus, daß das Paralog analoge spezifische Affinitätseigenschaften bezüglich des Analyten zeigen kann.
Der Ausdruck "spezifische Affinität" bezeichnet die Fähigkeit des Paralogs, den Analyt spezifisch zu binden, i.e. die Stärke der Wechselwirkung zwischen dem Analyt und dem Paralog ist effektiv größer als die Stärke der Wechselwirkung zwischen anderen Materialien, die mit dem Analyt und dem Paralog vorhanden sein könnten, so daß die Bindung an das Paralog verwendet werden kann, um zwischen Analyt und "Verunreinigung" zu unterscheiden. Typische Werte für die spezifische Affinität liegen im Bereich von mindestens 10³ l/mol bis 10&sup4; l/mol und bevorzugt 10&sup8; oder 10¹&sup0; l/mol. Der benötigte Wert hängt von der Umgebung ab, in der der Analyt vorkommt, und von der relativen Bindungsstärke der Verunreinigungen sowie von ihrer Konzentration. In einigen Zusammenhängen reicht eine niedrigere Affinität aus, während, wenn das Paralog auch stark an die Verunreinigungen bindet, insbesondere an diejenigen, die in hoher Konzentration vorhanden sind, eine höhere Affinität benötigt werden kann, um die Bindung an den Analyt von der an die Verunreinigungen zu unterscheiden. Kurz ausgedrückt, es ist die relative Affinität für den Analyt, verglichen mit der für die Verunreinigungen, die wesentlich ist. Jedoch sollte sich die spezifische Affinität aus der Eigenschaft Ladung/räumliche Anordnung des Paralogs, komplementär zu dem Analyt, und nicht so sehr aus einer allgemeinen Eigenschaft, wie dem pI-Wert oder dem hydrophoben Index, ergeben.
Verfahren zur Messung der Affinität der Wechselwirkung zwischen Antigenen und hochaffinen Antikörpern sind Standard; diejenige der Wechselwirkung mit niedrigaffinen Antikörpern kann, wie beispielsweise in Takeo, K., et al., J. Immunol. (1978), 121: 2305-2310 beschrieben, gemessen werden. Takeo et al. beschreiben die Messung von Bindungskonstanten bestimmter Oligosaccharide an spezifische Myelomproteine, wobei eine Polacrylamidgelelektrophorese verwendet wird und die Natur und der Gehalt der Oligosaccharide in dem Gel bei Bestimmung der Wanderung der Proteine variiert werden. Das Verfahren gilt als nützlich zum Erhalt von Bindungskonstanten im Bereich von 10² - 10&sup6; Liter/Mol. Varga, J.M., et al., J. Immunol. (1974), 112:1565-1570 beschreiben die Bestimmung von Bindungskonstanten unter Verwendung von Nylon- Polystyrol-Whiskerscheiben, die über Glutaraldehyd an Immunglobuline gekoppelt sind, um die Bindung von radioaktiven Liganden zu testen. So gibt es eine Reihe von Protokollen, zusätzlich zu den gegenwärtig verwendeten Standarverdünnungs- Immuntestverfahren in Vertiefungen von Mikrotiterplatten, um die Bindung zu bewerten und die Bindungskonstanten quantitativ zu bestimmen.

Herstellung von Paralogen

Die Erfindung ist auf eine große Vielfalt von Analyten anwendbar, die immunogen sein können oder nicht. Zusätzlich zu den Analyt, die selbst Peptide sind und die daher eine direkte Entwicklung von Paralogen nach dem "Komplementaritäts"-verfahren bezüglich sequentiell überlappender Anteile der primären Aminosäuresequenz erlauben können (eine Kombination aus Synthese/Analyseverfahren von Geysen mit dem Komplementaritäts-Konstruktionsverfahren nach Atassi) können die Analyte jeden beliebigen Ursprung haben, einschließlich Arzneimittel, wie Penicillin, Tetracyclin, Steroide, Naproxen, Theophyllin, Vitamine, wie die Vitamine K, D und A, verschiedene Toxine, wie PCBs, Dioxin und Tetrabromethylen, und beliebige verschiedene chemische Substanzen mit einer definierten Molekülkonformation oder -form unter spezifizierten Bedingungen umfassen. Ein spezifisches Peptidparalog kann für praktisch je den Analyt oder eine definierte Region davon entwickelt werden.
Die Art der Entwicklung des Paralogs für Analyte, unabhängig davon, ob sie Peptide sind oder nicht, kann durch ein Absuchverfahren unter Kandidatenparalogpeptiden erhalten werden (dieses Verfahren kann natürlich für Analyte, die selbst Peptide sind, verwendet werden, aber die vorstehend genannte Alternative ist ebenfalls verfügbar). In diesem Verfahren wird eine Serie von Kandidatenparalogen mit einer willkürlichen Anzahl von Aminosäuren, typischerweise 4 bis 20, zum Absuchen hergestellt. Es ist hilfreich, wenn die Serie so entwickelt werden kann, daß sie einen weiten Bereich von Alternativen für das Elektronenwolkenmuster umfaßt, so daß eine Annäherung des gewünschten Paralogs zuerst erhalten werden kann und dann Kandidatenmoleküle in diesem Bereich zur Feinabstimmung getestet werden können.
Wenn beispielsweise Paralogen, die 6 Aminosäuren in ihrer Primärsequenz enthalten, verwendet werden, gibt es 64 Millionen mögliche 6-mere unter Verwendung von nur den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren. Natürlich muß die Synthese von Peptiden nicht auf diese natürlich vorkommenden Untereinheiten beschränkt sein, und die D-Formen der codierten Aminosäuren sowie verschiedene nichtcodierte Aminosäuren, wie β-Alanin, Aminobuttersäure, Citrullin und dergleichen, können ebenfalls verwendet werden. In der Tat können diese bevorzugt sein, da von ihnen erwartet wird, daß sie stabiler sind als die "natürlichen" Aminosäuren, die Metabolite für Mikroorganismen sind.
Wenn nur eine zweckdienliche Anzahl von solchen 6-meren synthetisiert werden soll, sollten die Parameter, die die Elektronenwolkenmuster bestimmen, in einem weiten Bereich der Kandidatenmoleküle variiert werden. Die hergestellten Kandidatenpeptide sollten so gewählt werden, daß der Hydrophobizitätsindex innerhalb der Serie ständig zunimmt. Eine Diskussion der Hydrophobizitätsindices in Bezug auf die Struktur findet sich in Janin, J., Nature (1979), 277: 491-492. Zusätzlich können die amphipathischen Eigenschaften der Proteine durch Einstellen der periodischen Hydrophobizität der Reste variiert werden (Eisenberg, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1984), 81: 140-144; Eisenberg, D., et al., Nature (1982), 299: 371-374). Die amphipathische Eigenschaft liegt in der Sekundär- oder Tertiärkonformation des Peptids, was zu Anteilen oder Oberflächen des Moleküls führt, die wasserlöslich sind, und anderen, die hydrophob sind. Zusätzlich kann das Ladungsmuster infolge der Anwesenheit von positiv oder negativ geladenen Aminosäureresten ebenfalls systematisch in der Kandidatenserie variiert werden.
Eine erste Kandidatenserie kann zweckdienlicherweise aus etwa 90 Peptiden der Einfachheit halber bestehen. Dies ist eine vollständige Widerspiegelung der Anordnung von im Handel erhältlichen Mikrotiterplatten und Proteinsynthesestäbchen (Cambridge Research Biochemicals) und ist eine zweckdienliche Anzahl, ausreichend individuelle Tests bereitzustellen, die die Eigenschaften des gewünschten Paralogs abstecken. Die Synthese wird unter Verwendung herkömmlicher, üblicherweise kommerziell erhältlicher Methoden durchgeführt, und die Serie von einzelnen Kandidatenparalogen ist dann zum Absuchen bereit.

Absuchverfahren

Das Absuchverfahren kann wiederholt verwendet werden, weil auf Bindung beruhende Tests, die zum Nachweis der spezifischen Affinität verwendet werden, im allgemeinen reversibel sind, so daß die Testzusammensetzungen anschließend von der Paratopserie entfernt werden können, die an die festen Träger gebunden bleibt. Es ist nicht notwendig, solche Tests in wiedergewinnbarer Form oder in Bindung an feste Träger durchzuführen, aber eine derartige Ausführung ist in hohem Maße zweckmäßig.
Die Wiederverwendbarkeit ist besonders im Zusammenhang mit einer der beabsichtigten Verwendungen des Paralogs als Affinitätsligand bei der Chromatographie zweckdienlich, da die relativen Bindungsstärken in einer Reihe vorgeschlagener Elutionslösungsmittelsysteme systematisch getestet werden können. Beispielsweise kann die Bindungsstärke in einer Reihe von Lösungen, die Methanol in zunehmenden Konzentrationen enthalten oder Lösungen mit zunehmenden Salzkonzentrationen enthalten und die Elutionsgradienten simulieren, verwendet werden. Bei dieser Art von Test kann das vergleichende Verhalten einer Anzahl von Paralogen unter einer Vielzahl von Elutionsbedingungen empirisch getestet werden. Dies kann sehr nützlich dahingehend sein, daß der für das Paralog X erhaltene Bindungskonstantengradient gegenüber dem für das Paralog Y unter den gewünschten Elutionsbedingungen erhaltenen bevorzugt sein kann, obwohl es den Anschein haben könnte, daß das Paralog Y eine bevorzugte spezifische Affinitätshöhe beim Testen unter der Bedingung von nur einem Lösungsmittel oder nur einer Temperatur aufweist. Die Wiederverwendbarkeit der Testreihe erlaubt so die Auswahl des besten Paralogs unter einem Muster von Bedingungen, das seine Verwendung in dem chromatographischen Verfahren nachahmt. Vor dem Test kann die Paralogserie gegebenenfalls durch Bindung an Molekülstäbchen konformationsgesteuert werden. Die vollständige Serie kann mit dem gleichen Molekülstäbchen behandelt werden, oder es können unter Verwendung getrennter Vertiefungen einzelne Molekülstäbchen innerhalb der Serie ausprobiert werden. In einem solchen Protokoll kann es in einigen Fällen nützlich sein, Mehrfachstäbchen mit dem gleichen zu testenden Paralog mit verschiedenen konformationsgesteuerten Molekülstäbchen-Spacer-Verbindungen bereitzustellen.
Jedoch wird die Serie zum Test formuliert, die Serie wird dann auf die spezifische Affinität ihrer Mitglieder für den gewünschten Analyt getestet. Auf einer theoretischen Basis könnte dies direkt durch Markieren des Analyten und Nachweis der relativen Menge des an die einzelnen Paralogmitglieder der Serie gebundenen Markers durchgeführt werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens wird ein Muster, das dem in Figur 1 gezeigten ähnlich ist, erhalten. Wie in Figur 1 gezeigt, ist die Menge des an jedes Mitglied der Serie gebundenen Markers (die y-Koordinate) über die Mitglieder der Reihe (die x-Koordinate) gezeigt. Variierende Mengen an Markierung werden in Abhängigkeit von der Affinität jedes Paralogs für den Analyt erhalten.
Eine Alternative zu diesem direkten Verfahren ist manchmal praktischer. Bei dieser Alternative wird die spezifische Affinität mittels Kompetition des nichtmarkierten Analyten mit einem Gemisch markierter Peptide getestet. Das Peptidgemisch muß eine ausreichende Anzahl an Mitgliedern enthalten, so daß eine mehr oder weniger äquivalente Bindung an alle Paralogen durch das markierte Gemisch per se in Abwesenheit des Analyten erhalten wird.
Kurz ausgedrückt, das Gemisch der benötigten Anzahl von Peptiden (grob im Bereich von 500-1000, obwohl in einigen Fällen kleinere Mitgliederzahlen ausreichen können) wird auf geeignete Weise markiert, beispielsweise unter Verwendung des Acyliodierungsverfahrens mit dem Iodisotop 125, wie von Bolton, A.E., et al., Biochem. J. (1973), 529-539 beschrieben und im Handel von ICN Radiochemicals erhältlich. Andere Markierungsverfahren können ebenfalls verwendet werden. Das Gemisch kann direkt durch Synthese der einzelnen Mitglieder und ihr Zusammenmischen hergestellt werden oder kann einfacher durch Hydrolyse von großen Proteinen in willkürliche kleine Peptide erhalten werden. Bei einer Variante wird beispielsweise ein Trypsin- Teilhydrolysat (Cleveland, D.W., et al., J. Biol. Chem. (1977), 252: 1102-1106) eines Hefelysats verwendet. Dies ergibt eine große Anzahl von Peptiden, die als ein Gemisch markiert werden können oder die unter Verwendung von beispielsweise SDS- Gelelektrophorese getrennt werden können und dann auf einen Testträger, wie Immunodyne (Burnette, W.N., Anal. Biochem. (1981) 112: 195-203) überführt werden können, wenn ihre Bindung individuell beurteilt werden soll.
Es kann bei der Verwendung des markierten Peptidgemisches notwendig sein, zu bestätigen, daß eine ausreichende Bindung bezüglich aller Kandidatenparalogen in der Serie eintritt. Die Bedingungen zur Bewirkung dieser äquivalenten Bindung in der Serie sollte ebenfalls empirisch festgestellt werden. In einer perfekten Situation bindet das Peptidgemisch gleichförmig an alle Mitglieder der Serie. Jedoch werden häufiger nur ähnliche Ausmaße an Bindung gefunden. Dies ergibt eine perfekt funktionierende Basis für die Kompetition mit dem Analyt. Die Interpretation der Ergebnisse, wenn Kompetition zusätzlich eingeführt wird, kann durch Normalisieren der Bindungswerte auf den gleichen Wert vor der Bewertung der Kompetition erzielt werden.
Wenn bestätigt wird, daß das markierte Peptidgemisch ungefähr äquivalent an alle Kandidatenparalogen in Abwesenheit des Analyten bindet oder eine ähnliche Bindung normalisiert wurde, wird das Absuchen in Gegenwart des Analyten wiederholt. Diejenigen Kandidaten, die eine spezifische Affinität für den Analyt besitzen, zeigen eine Abnahme der Konjugation an das markierte Peptidgemisch, wobei die Abnahme der spezifischen Affinität des Kandidaten für den Analyt proportional ist. Ein typisches Kompetitionsmuster ist in Figur 3 gezeigt. Die Bedeutung der Koordinaten ist die gleiche, wie in den anderen Figuren. Die Paralogen mit der größten Affinität für den Analyt zeigen jedoch die niedrigsten Markierungshöhen, da dies eine erfolgreiche Kompetition des Analyten mit dem markierten Proteingemisch um das Paralog anzeigt. Durch Bewertung der Fähigkeit des Analyten zur Kompetition werden die Paralogen, die die größte Abnahme in der Aufnahme des Markers zeigen als diejenigen, ausgewählt, die die Parameter besitzen, die für die Bindung des Analyten am günstigsten sind.
Das Absuchverfahren kann mit zusätzlichen Serien mit Eigenschaften, die zwischen denjenigen von Mitgliedern liegen, die die größte spezifische Affinität oder das am meisten erwünschte Elutionsmusterverhalten in der ursprünglichen Serie zeigen, wiederholt werden, um die Molekülform und das Ladungsverteilungsmuster des endgültig gewählten Paralogs fein abzustimmen. Das Absuchen kann beliebig oft mit einer willkürlichen Anzahl von Serien bis zu dem benötigten Grad an spezifischer Affinität oder chromatographischem Verhalten wiederholt werden. Das Elektronenwolkenmuster der Paralogreihe kann so systematisch manipuliert werden, um die Affinität des Paralogs für den Analyt zu optimieren; wenn das Paralog als Affinitätsligand in einem chromatographischen Verfahren verwendet wird, kann eine Affinität, die so groß ist, daß die Elution schwierig ist, nicht erwünscht sein, und das korrekte Muster sollte gewählt werden. Die Wirkung der Konformationssteuerung kann auch, wie vorstehend beschrieben, untersucht werden.

Verwendung der ausgewählten Paralogen

Zur Verwendung in der Chromatographie wird, wenn ein Paralog mit ausreichenden Eigenschaften für einen gewünschten Analyt gewählt ist, es an ein einen festen Träger unter Verwendung herkömmlicher, auf dem Fachgebiet bekannter Mittel konjugiert.
Typische feste Träger umfassen Polysaccharidträger, Acrylamidgele, Siliciumdioxidträger, Aluminiumoxid und dergleichen im Bereich der typischen im Handel erhältlichen Chromatographieträger. Ein besonders favorisierter Trägertyp ist ein Fluorkohlenstoffpolymer, wie Polyvinylidendifluorid (PVDF), beispielsweise das, das von Millipore oder Immobilon vertrieben wird. Eine breite Vielzahl von Konjugationstechniken ist auch verfügbar einschließlich derer, die gegebenenfalls einen Linkerarm zwischen dem festen Träger und dem Paralogliganden einführen. Die Verwendung eines Linkerarms einer Länge, die etwa 3 bis 9 Kohlenstoffatomen entspricht, ist in einigen Fällen vorteilhaft, um die größere Zugänglichkeit des Analyten an den Liganden zu ergeben.
Das so erhaltene Substrat, das den festen Träger in Konjugation an das Paralog, das für die Bindung an den gewünschten Analyten spezifisch ist, umfaßt, kann dann so, wie es für chromatographische Substrate üblich ist, verwendet werden. Es kann in Säulen gepackt werden oder in Filterbetten plaziert werden, um den Analyt zu adsorbieren, wenn die Zusammensetzung, die den Analyt enthält, mit dem Substrat in Kontakt gebracht wird. Da das Paralog ein relativ stabiler Ligand ist, können Präparationen und mit dem erfindungsgemäßen Substrat gepackte Säulen in eine Vorrichtung für die HPLC eingeschlossen werden.
Die Vorteile der Anpassung der Affinitätchromatographie an die HPLC können nicht leicht überschätzt werden, insbesondere, wenn das Chromatographieverfahren in einem präparativen Maßstab durchgeführt wird. Die Auflösung in präparativen Verfahren muß auf der Basis der Eigenschaften der Säule statt auf roher Kraft beruhender Verfahren durch Erhöhung der Größe der Säule oder durch Einstellung der Stärke des abwärts laufenden Eluenten erzielt werden, so daß die Elution eine längere Zeitspanne benötigt. Jede Einstellung, die die Komplexität oder Menge des Elutions-Lösungsmittels erhöht, ist ein ernsthafter Nachteil beim präparativen Maßstab. Beispielsweise sind teure Lösungsmittel und komplexe Mischprotokolle vernünftig, wenn insgesamt 10-100 ml benötigt werden, wie bei analytischen Verfahren. Sie werden teuer und problematisch, wenn Hunderte von Gallonen (1 Gallone = 4,55.10&supmin;³ m³) benötigt werden, wie es oft bei präparativen Protokollen der Fall ist. Das Lösungsmittel muß nicht nur wiedergewonnen werden, um die Kosten zu senken, ein teures Verfahren als solches, sondern es muß auch von dem hergestellten Produkt entfernt werden.
Da zusätzlich das durch präparative Chromatographie gereinigte Material im allgemeinen nochmals durch die Säule geschickt werden muß, um eine adäquate Auflösung zu erhalten, besitzen komplexe Elutionsprotokolle den weiteren Nachteil, daß sie eine erneute Äquilibrierung der Säule in der Phase benötigen, in der das Material nochmals durch die Säule geschickt wird.
Aus den vorstehenden Gründen lassen sich im allgemeinen analytische Verfahren nur dann im Maßstab vergrößern, wenn die Basis für die Trennung für den Adsorbenten selektiv ist, d.h. auf einem Affinitätschromatographieverfahren beruht.
In einem besonders bevorzugten Protokoll kann eine Säule mit einer Serie von Paralogen mit variierender im allgemeinen zunehmender Affinität für den Zielanalyten konstruiert werden. Die Aufeinanderfolge der Bindungsaffinitäten, wenn der Analyt durch die Säule wandert, ist bezüglich einer Verbesserung der Auflösung wirksam. In einer typischen Ausführungsform beginnt die Säule mit einem Paralogliganden, der eine sehr niedrige Affinität für das Zielmolekül besitzt. Die folgenden Paralogen besitzen eine wachsende Affinität.
Folglich können mit Substrat mit Paralogliganden gepackte Säulen entweder als analytische oder präparative Mittel verwendet werden, und die Verwendung von paralogderivatisierten Substratsäulen ergibt eine zweckdienliche und effiziente Alternative zu herkömmlicheren Chromatographieverfahren. Wenn der Analyt ein Arzneimittel ist, kann das paralogderivatisierte Substrat als spezifisches Reagens zur Adsorption des Arzneistoffs aus Körperflüssigkeiten verwendet werden, und der Arzneistoff kann dann zur Analyse erneut eluiert werden. Wenn der Analyt ein Toxin, das in Abfallprodukten vorkommt, ist, kann das Substrat zum Nachweis und auch zur Entfernung des Toxins aus dem Gemisch verwendet werden. Wenn der Analyt ein gewünschtes Produkt, das in niedriger Ausbeute anfällt, ist, kann das Substrat zur chargenweisen Isolierung des Produkts oder zur Isolierung unter Verwendung von Standardchromatographietechniken verwendet werden.
Es können auch diejenigen Paralogen vorteilhaft genutzt werden, die die Eigenschaft einer spezifischen Affinität für Toxine besitzen, indem sie in vitro und in vivo als Einfangmoleküle verwendet werden. Beispielsweise könnten in einer Ausführungsform an ein Paralog konjugierte Latexkügelchen in den Dünndarm oder den Blutstrom als Antidot gegen Vergiftung abgegeben werden. In einer anderen Ausführungsform könnten solche Konfigurationen als Abgabesysteme für Arzneimittel, die spezifisch, aber mit moderater Affinität an das Paralog binden, verwendet werden.
Während das ausgewählte Paralog bei Konjugation an einen festen Träger, insbesondere in der Chromatographie, nützlich ist, ist die Nützlichkeit des Paralogs nicht auf seine Feststoff-gebundene Form beschränkt. Das Paralog von geeigneter Zusammensetzung und mit geeigneten Eigenschaften kann auch verwendet werden, um den entsprechenden Antikörper oder das Fragment davon in Standardimmuntests zu ersetzen. Zur derartigen Verwendung kann das Paralog gegebenenfalls markiert werden, was von dem Protokoll abhängt. Beispielsweise werden in einem typischen Sandwichtest Vertiefungen von Mikrotiterplatten, die mit dem Paralog beschichtet sind, verwendet, um Proben auf das Antigen zu testen, wobei das an das Paralog gebundene Antigen dann markiert wird, wobei die markierte Form des Antikörpers, der für ein anderes Epitop spezifisch ist, verwendet wird oder wobei die markierte Form eines alternativen Paralogs verwendet wird. Alternativ kann das markierte Paralog verwendet werden, um mit jedem Antikörper für einen Analyt in einer Probe um das an das feste Substrat gebundene Antigen zu konkurrieren. Wie auf dem Fachgebiet gut verstanden ist, ist die Vielfalt spezifischer Protokolle für Festphasen- und Agglutinations-Immuntests groß und wird von Fachleuten auf dem Gebiet gut verstanden.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Synthese einer Paralogserie

Eine Serie von 90 Pentapeptiden wurde auf der Basis abnehmender Hydrophobizität und periodischer Variation des hydrophoben Moments entwickelt. Die Figur 4 zeigt die Liste der synthetisierten Pentapeptide mit den Nrn. 1 bis 88; die Figur 5 zeigt den hydrophoben Index und die hydrophoben Momente in dieser Serie.
Die Serie wurde unter Verwendung des Verfahrens nach Geysen, H.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) (a.a.O.) synthetisiert. Die verbleibenden acht Polyethylenstifte wurden zur Kontrolle der Synthese zur Analyse mittels Aminosäureanalyse verwendet.
Der Satz der Polyethylenstifte, die die Paralogserie enthalten, wird dann auf gleichförmige Reaktion mit einem Gemisch von Proteinen getestet. Das Gemisch wird durch Hydrolyse von Hefelysat unter Verwendung von Trypsin erhalten, und das so erhaltene Gemisch wird unter Verwendung von Bolton-Hunter-Reagens unter Verwendung von 125-I, wie vorstehend beschrieben, markiert.
Das markierte Hydrolysat wird verwendet, um alle 90 Mitglieder der Serie zu behandeln, und die Menge des gebundenen Markers wird nachgewiesen. Das Ausmaß der Bindung wird durch Inkontaktbringen behandelter Stifte mit einem Röntgenfilm und Detektion der Dichte der Flecken auf dem Film oder durch individuelles Zählen jedes gebundenen Peptids durch Entfernung der Stifte, die die gebundenen Peptide enthalten, und direkte Auszählung mit einem Gamma-Counter zur Bestimmung der Menge der Radioaktivität auf jedem Stift entsprechend den aufgebrachten Paralogen quantitativ bestimmt.
Es wird gefunden, daß das Proteingemisch ausreichend ähnlich an die Mitglieder der Serie bindet, und die Bindungswerte werden auf 100% normalisiert.
Die Serie wird dann durch Wiederholen des Absuchens unter Zugabe einer definierten Menge des Analyten zu dem Gemisch in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte erneut getestet. Eine kleine Anzahl von peptidkonjugierten Stiften zeigt eine stark verminderte Markierung. Diese gewählten Peptide stellen das Ergebnis eines anfänglichen Absuchens nach Molekülen mit geeigneten Elektronenwolkenmustern dar. Gegebenenfalls kann eine weitere Feinanpassung von Kandidatenpeptiden durch Konformationssteuerung, Testen unter variablen Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, erhalten werden, und zusätzlich können Serien mit geringfügigen Variationen der Eigenschaften der besten Kandidaten analog der in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Wenn eine vernünftige Anzahl von erfolgreichen Kandidatenparalogen erhalten wurde, werden diese erfolgreichen Kandidatenparalogen unter Verwendung von routinemäßigen Festphasenmethoden in ausreichender Menge synthetisiert, um ihre Sequenz zu bestätigen. Wenn das Paralog in der Chromatographie verwendet werden soll, kann es an einen festen Träger, wie Affi-prep-10 (Bio-Rad), gebunden werden und in eine Chromatographiesäule verpackt werden. Alternativ kann der Chromatographieträger dadurch erhalten werden, daß man das Peptid auf dem Syntheseträger, wie einem Siliciumdioxidträger, Ultra Affinity-ET (Beckman), auf dem es synthetisiert wurde, beläßt.
Um zu bestätigen, daß das Paralog die gewünschte spezifische Affinität besitzt, kann eine ähnliche Säule unter Verwendung einer gefalteten ("scrambled") Form der Aminosäurensequenz des Paralogs als Ligand hergestellt werden. Der Analyt bindet an die paraloghaltige Säule, aber nicht an die, die das gefaltete Peptid enthält. Die Dokumente von Atassi (a.a.O.) bestätigen, daß eine solche Faltung die Bindung zerstört.

Claims

1. Serie von getrennten individuellen Peptiden mit vier bis 20 Aminosäuren, wobei die individuellen Peptide so ausgerichtet sind, daß sie

(a) einen stetig ansteigenden Wert des hydrophoben Index und eine periodische Veränderung des hydrophoben Moments innerhalb der Serie aufweisen; oder

(b) einen stetig ansteigenden Wert des hydrophoben Index und eine systematische Veränderung des Ladungsmusters innerhalb der Serie aufweisen.

2. Serie nach Anspruch 1, wobei der hydrophobe Index stetig erhöht und das hydrophobe Moment periodisch innerhalb der Serie verändert ist.

3. Verfahren zur Identifizierung eines Peptids, das eine spezifische Affinität für einen Analyt aufweist, wobei das Verfahren das Absuchen von Peptiden einer Serie nach Anspruch 1 oder 2 auf ihre Fähigkeit, den Analyt selektiv zu binden, umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Absuchen durchgeführt wird, indem die Fähigkeit des Analyten beurteilt wird, mit einem markierten Peptidgemisch um die Bindung an jedes Peptid der Serie zu kompetieren, wobei das Gemisch in der Lage ist, ungefähr gleichermaßen an alle Peptide der Serie zu binden, und wobei eine Verringerung der Bindung des Gemischs an ein Peptid der Serie in Gegenwart des Analyten eine selektive Bindung des Analyten an dieses Peptid anzeigt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, das zusätzlich das Absuchen des Analyten gegen eine zusätzliche Serie individueller Peptide umfaßt, die den Teil der ursprünglichen Reihe darstellen, der die größte spezifische Affinität für den Analyten zeigt.

6. Verfahren zur Charakterisierung eines einzelnen Analyten, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

Inkontaktbringen des Analyten mit jedem Peptid einer Serie nach Anspruch 1 oder 2;

Bestimmung des Grads der Affinität des Analyten für jedes der Peptide; und

Aufzeichnen des Grads der Affinität des Analyten für jedes der Peptide.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Bestimmung die kompetitive Umsetzung von unmarkiertem Analyt mit einem Gemisch von markierten Peptiden im Hinblick auf jedes der Peptide der Serie bedeutet, wobei das Gemisch, insgesamt gesehen, ungefähr gleichermaßen reaktiv mit jedem Peptid der Serie ist; und

Messung der Verringerung der Bindung des markierten Gemischs in Gegenwart des Analyten verglichen mit der Bindung bei dessen Abwesenheit, wobei das Ausmaß der Verringerung den Grad der Affinität des Analyten für das Peptid der Serie anzeigt.