DE3750354T2

DE3750354T2 - Monoklonale Antikörper und Verfahren zum Nachweis von Dioxinen und Dibenzofuranen.

Info

Publication number: DE3750354T2
Application number: DE3750354T
Authority: DE
Inventors: Larry H Stanker; Martin Vanderlaan; Bruce E Watkins
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1986-06-24
Filing date: 1987-06-22
Publication date: 1994-12-08
Anticipated expiration: 2007-06-23
Also published as: EP0251635A3; EP0251635B1; CA1305929C; EP0251635A2; JPS6314691A; US4798807A; ATE109825T1; DE3750354D1

Description

Diese Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die für taxische Dioxine und Dibenzofurane spezifisch sind, Hybridome, die zur Sekretion solcher Antikörper fähig sind, und die Verwendung der Antikörper bei der Detektion und quantitativen Analyse der Toxine.
Die US-Regierung besitzt aufgrund des Vertrags Nr. W-7405-ENG-48 zwischen dem US-Department of Energy und der Universität von Californien über die Arbeit des Lawrence Livermore National Laboratory Rechte an dieser Erfindung.
Polychlorierte Dibenzodioxine (PCDD) und Dibenzofurane (PCDF) sind persistente, toxische Verunreinigungen, die sowohl für die menschliche Gesundheit als auch für die Biosphäre im allgemeinen eine Bedrohung darstellen. Diese Verbindungen sind Kontaminationen von Herbiziden, wie Agent Orange, und werden als Nebenprodukte auch bei einer Vielzahl von industriellen chemischen Prozessen erzeugt wie auch während der Verbrennung oder der Veraschung von anderen polychlorierten organischen Verbindungen, wie Plastik und polychlorierten Biphenylen (PCB). In Anbetracht der häufigen Verwendung oder dem Auftreten solcher Prozesse sind Dioxine und Dibenzofurane in der Umwelt weit verbreitet. Da nun die Gefährlichkeit dieser Materialien vollständig erkannt wurde, wurde es zu einer wichtigen Aufgabe, die Herkunft zu ermitteln. Ein wichtiger nicht trivialer erster Schritt ist es, die Verschmutzungsorte zu identifizieren, was einen einfachen, ökonomischen und schnellen Test zur Detektion des Vorkommens dieser Verbindungen in Proben erfordert, die aus Böden, menschlichen oder tierischen Geweben, wie auch aus Nahrungsmitteln, entnommen wurden.
Ein wichtiger Aspekt eines erwünschten Testverfahrens betrifft die Spezifität. Es existiert eine große Anzahl an Isomeren sowohl an PCDD's und PCDF's, wie auch an PCB's, die in der Toxizität von äußerst toxisch bis hin zu geringeren Toxizitäten variieren, die aber auch chemisch zu anderen, relativ harmlosen Verbindungen ähnlich sind. Ein zweiter Aspekt des Problems ist, daß das Isomer dieser Verbindungen mit der größten Toxizität in der Umwelt, das heißt 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin, in sehr kleinen Mengen gefährlich ist und zur Konzentrierung fähig ist, wenn es die Nahrungskette durchläuft. Daher muß ein wünschenswerter Test zur Detektion des Vorkommens dieser gefährlichen Verbindungen in sehr kleinen Konzentrationen fähig sein. Die chemische Analyse der Bodenproben auf Kontamination wird auch durch einige andere Faktoren behindert: (1) Dioxine binden fest an den Boden und zeigen eine zu vernachlässigende Löslichkeit in Wasser, und (2) die Vielfalt der Isomere und der verwandten chemischen Kontaminationen machen den quantitativen Test durch herkömmliche Gaschromatographie- und Massenspektrometrieverfahren teuer und zeitaufwendig. Die Kosten und die Durchsatzzeit schließen eine detaillierte Probenahme eines zu bestimmenden Bereichs aus, um das Ausmaß der Kontamination zu bestimmen und erfordern hochentwickelte Zentrallaboratorien, die für die Feldversuche dieser Gesundheitsgefährdung ungeeignet sind.
Die potentiellen Vorteile der Immunassayverfahren über die herkömmlichen analytischen Verfahren wurden kürzlich erkannt, insbesondere, daß der Immunassay ein Verfahren bereitstellt, das genauso empfindlich ist, wie die Gaschromatographie und/oder Massenspektrometrie, während er schneller und billiger ist.
Ein erster Versuch zur Lösung des Problems der Detektion von Dioxinen in der Umwelt wird in einem Artikel von P.W. Albro et al., "Radioimmunoassay of Chlorinated Dibenzo-p-dioxines", Methods in Enzymology 84 : 619-639, 1982 und in der US-Patentanmeldung Nr. 4 238 472 Albro et al, Radioimmunoassay for chlorinated Dibenzo-p-dioxins, vom 9. Dezember 1980 diskutiert. Der von Albro et al beschriebene Test ist ein auf polyklonale Antiseren basierender Radioimmunassay, die durch Immunisierung von Kaninchen mit 1-Amino-3,7,8-trichlordibenzo-p-dioxin hergestellt wurden. Der Test von Albro et al fand keine verbreitete Anwendung, da er mehrere Limitierungen aufweist. Er erfordert die häufige Synthese von ¹²&sup5;I-TDDD, er erfordert drei Tage bis zum Abschluß und er ist für 2,3,7,8-TCDD nicht ausreichend spezifisch, da nicht-spezifische Kaninchenantiseren verwendet.
Ein weiterer Versuch wird von Stephen J. Kennel in einem Artikel in Toxicslogy & Applied Pharmacolcgy 82, 256-263, 1986 berichtet, der mit "Monoclonal Antibodies to Chlorinated Dibenzo-p-dioxins" überschrieben ist. Dieser Test auf Dioxine basiert auf monoklonalen Antikörpern, die von BALB/c Mäusen durch Immunisierung mit einem Thyreoglobulinkonjugat von Dioxin, nämlich Thyreoglobulin-2-adipamid-3,7,8-trichlordibenzo-p-dioxin, gebildet werden. Die Hybridome wurden durch Zellfusion von Immunmilzzellen und SP2/0, P3 oder NSI genannten Myelomzellen hergestellt. Der von Kennel entwickelte Test leidet jedoch unter dem Nachteil der unzureichenden Selektivität, da die Antikörper nicht mit 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin in Lösung reagieren können, das nicht mit einem Protein konjugiert ist, dem Isomer mit der größten Toxizität der Dioxinisomere und auch nicht mit anderen Dioxinisomeren, während sie mit Verbindungen reagieren, die kein Identifizierungsziel darstellen. Andere Probleme sind, daß der Test ein Radioimmunassayverfahren mit den dadurch bedingten Nachteilen verwenden.
Die EP-A 242 589, die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hybridomen, die zur Sekretion von monoklonalen Antikörpern fähig sind, welche gegenüber einer Vielzahl von toxischen Haptenen spezifisch sind, wobei das Verfahren die Immunisierung mit dem unkonjugierten Hapten umfaßt. Die Haptene, auf die es sich bezieht, beinhalten Tetrachlordibenzodioxin.
Das Vorangegangene zeigt deutlich, daß ein kontinuierlicher Bedarf für einen wirksamen, praktischen Test zur Detektion von toxischen Dioxinen besteht.
Demnach versucht diese Erfindung zur Verwendung in einem Immunassayverfahren für Dioxine geeignete monoklonale Antikörper bereitzustellen, die die notwendige Selektivität und Empfindlichkeit aufweisen, um beweiskräftig das Vorkommen von Dioxinen in Konzentrationen von einigen Teilen pro Milliarde (Nanogramm pro Probe) anzuzeigen, wobei dieses Verfahren schnell ausgeführt werden kann und zur Ausführung im Feld durch eine mobile Einheit geeignet ist und beweiskräftig die polychlorierten Dioxine und Dibenzofurane mit der größten Toxizität erkennt und/oder deren Empfindlichkeit erhöht werden kann, um die Detektion von Toxinen in der Größenordnung von einem Teil pro einer Billion zu erreichen.
Die vorliegende Erfindung liefert daher Hybridome oder Nachkommen hiervon, die monoklonale Antikörper mit spezifischen Affinitäten für toxische Isomere der polyhalogenierten Dibenzo-p-dioxine und Dibenzofurane einschließlich 1,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin sekretieren, und die nicht oder nur am Rande mit Hexachlordibenzofuran, Octachlordibenzofuran, Octachlordibenzo-p-dioxin und polychlorierten Biphenylen reagieren, und monoklonale Antikörper, die solche spezifische Affinitäten aufweisen.
In einer bestimmten Ausführungsform haben die Antikörper eine spezifische Affinität für toxische Isomere, einschließlich:
2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin
1,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin
1,2,3,7-Tetrachlordibenzo-p-dioxin
1,2,3,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin
1,2,3,7,8-Pentachlordibenzo-p-dioxin
2,3,7,8-Tetrabromdibenzo-p-dioxin und
2,3,7,8-Tetrachlordibenzofuran.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Hybridome durch Selektion gemäß spezifischer Bindungsaffinitäten für dieses toxische Dioxinisomer von Milzlymphozyten aus Mäusen abgeleitet, die mit toxischen Dioxinisomeranaloga immunisiert wurden,
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion von toxischen Isomeren von Dioxin oder Dibenzofuran, das die folgenden Schritte umfaßt:
a) Zusammenbringen der Isomere mit monoklonalen Antikörpern, die aus den Hybridomen der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, und
b) Messen der Menge der gebundenen Antikörper.
Die Erfindung betrifft ferner noch ein Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern, das die Züchtung der erfindungsgemäßen Hybridome und das Ernten der monoklonalen Antikörper aus dem Züchtungsprodukt umfaßt. Die vorliegende Erfindung kann als enzymgebundenes-Immunosorbent-Assay ELISA Verfahren verwendet werden, wobei Proben untersucht werden, um das Vorkommen der polychlorierten Dioxine und insbesondere von 2,3,7,8-Tetrahlordibenzo-p-dioxin (TCDD) zu bestimmen, wobei einzigartige monoklonale Antikörper verwendet werden, die aus einzigartigen Hybridomzellinien erhalten werden, die hierin später als DD-1, DD-3, DD-4, DD-5 und DD-6 bezeichnet werden. Die Herstellung der hiervon stammenden Zellinien und Antikörper wird später ausführlicher beschrieben. Diese Antikörper sind durch eine hohe Affinität und Selektivität gegenüber TCDD gekennzeichnet. Ihre Verwendung mit dem vorgeschlagenen ELISA Testprotokoll erlaubt die Bestimmung des Vorkommens von Dioxinen in Testproben in Mengen von einigen Teilen pro Milliarde und weniger. Die Tests können innerhalb von Stunden anstatt Tagen abgeschlossen werden. Die Verwendung von radioaktiv markierten Verbindungen wird vermieden. Mit den vorliegenden Antikörpern können Tests auf TCDD in wäßrigen Medien durch Ultrabeschallung ausgeführt werden. In einer bevorzugten Form kann die Empfindlichkeit des vorliegenden Testverfahrens durch die Zugabe von Detergentienkonzentrationen in der Größenordnung von 0,05 Volumenprozent gesteigert werden, was es ermöglicht, TCDD in Mengen bis auf die Größenordnung von einem Teil pro Billion zu detektieren.

Herstellung der Hybridome und Antikörper

Die vorliegenden Hybridome DD-1, DD-3, DD-4, DD-5 und DD-6 wurden durch Fusion von SP2/0 Mausmyelomzellen mit Milzlymphozyten hergestellt, die aus immunisierten BALB/c und Biozzi Mäusen erhalten wurden. Um Tiere zur immunologischen Antwort auf kleine organische Moleküle zu bringen, müssen die Haptene oder Analoga hiervon) an Trägerproteine gekoppelt werden. Der erste Schritt bei der Herstellung von Antikörpern ist daher die Synthese eines Analogons mit einer funktionellen Gruppe, das an ein Protein gebunden werden kann. Das für diese Immunisierung ausgewählte TCDD Analogon war 1-Amino-3,7,8-trichlordibenzo-p-dioxin (A-TriCDD). Diese Verbindung wurde gemäß eines Verfahrens synthetisiert, das von Chae et al (1977) in "Synthesis of 1-Amino-3,7,8-trichlordibenzo-p-dioxin and 1- Amino-2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin as Haptenic Compound", Agr. Food Chem., 25, 1207-1209 veröffentlicht wurde. Das A-TriCDD kann dann mit Trägerproteinen, wie Thyreoglobulin, Kaninchenserumalbumin (RSA), "keyhole limpet hemocyane" (KLH) und anderen konjugiert werden. In unseren Experimenten verwendeten wir Rinderserumalbumin (BSA). Wir injizierten in BALB/c und Biozzi Mäuse, wie dies in der folgenden Tabelle gezeigt ist: Tabelle I Anti-Dioxin Klone Stamm Klon Nr. Isotyp Biozzi kappa
Das befolgte Immunisierungsprotokoll beinhaltete typischerweise 10 ug Injektionen in Adjuvans pro Monat pro Maus für einen Zeitraum von 10 Monaten mit einer letzten Injektion einige Tage vor der Entnahme der Milz der Tiere. Nach Beendigung des Injektionsprotokolls werden die Milzzellen entfernt und in Kultur durch Fusion fit Myelomzellen zum Wachstum induziert. Im vorliegenden Fall wurden die Milzlymphozyten mit der SP2/0 Mausmyelomzellinie fusioniert. Diese fusionierten Zellen oder Hybridome wachsen in Kultur und sekretieren monoklonale Antikörper. Obwohl jeder Zellklon nur einen Antikörpertyp sekretiert, werden aus jeder gegebenen Fusion von Milzzellen typischerweise 10 000 Hybridome erhalten. Das Screeningverfahren ist daher eine Angelegenheit von entscheidender Bedeutung.
In diesem Fall wurden die Hybridome dann auf ihre Fähigkeit gescreent, A-TriCDD-BSA und A-TriCDD-RSA von BSA und RSA zu unterscheiden. Auf der Grundlage dieses anfänglichen Screenings wurden etwa 25 stabile Antikörper-bildende Kolonien isoliert, subkloniert und eingefroren. Die verbleibenden Klone wurden erneut auf ihre Fähigkeiten gescreent, freies TCDD in Suspension zu erkennen. Experimentell wurde in der Größenordnung von 10-100 Nanogramm TCDD in Hexan getrocknet, 0,5 ml Kochsalzlösung mit BSA (1 mg/ml) wurde zugegeben und für 2 Stunden ultrabeschallt. Die Experimente mit ¹&sup4;C-TCDD zeigten, daß etwa die Hälfte des TCDD in der wäßrigen Phase suspendiert wurde, was einer Konzentration von etwa 100 ppb entsprach. Identische Verfahren wurden für andere Dioxinisomere befolgt. Eine Verdünnungsreihe in Mikrotiterplattenvertiefungen wurde dann mit dem suspendierten TCDD hergestellt der Antikörper zugegeben und der Kompetitions-ELISA vollendet. Die Kompetitions-ELISA-Testverfahren sind im Detail in der folgenden Literaturstelle beschrieben: Butt, W.R. (1984) "Practical Immunoassay: The State of the Art", Marcel Dekker, Inc., N.Y., N.Y.
Eine großer Teil des Erfolgs, den wir bei der Charakterisierung der Bindungsspezifitäten unserer monoklonalen Antikörper hatten, kommt von der Entwicklung eines verläßlichen Kompetitions-ELISA-Protokolls. Unser bevorzugter Test geht von Stammlösungen der verschiedenen in Tabelle I aufgeführten Verbindungen mit 10 ppm in Hexan aus. 10 ul der Hexanlösung werden in ein kleines Gläschen aliquotiert, unter einem Stickstoffgasstrom eingedampft, und 500 ul einer 1 mg/ml Lösung BSA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 BSA werden zugegeben. Das Gläschen wird verschlossen und für 2 Stunden in ein Ultraschallsäuberungswasserbad gegeben. Zwei Stunden Ultrabeschallung ergeben einen reproduzierbareren Test als eine Stunde. Während der Ultrabeschallung scheint das Hexan vollständig zu verdampfen und man erhält eine wäßrige Lösung, die das Dioxin enthält. Mit A-TriCDD-RSA beschichtete Mikrotiterplatten werden mit einer dreiprozentigen Lösung Ovalbumin blockiert dann wird eine zweifache Verdünnungsreihe des ultrabeschallten Dioxin-BSA hergestellt, die den Bereich von 100 ppb- 0,1 ppb abdeckt. In jede Vertiefung der Platte werden 100 ul der ultrabeschallten Dioxin-BSA Lösung mit einem gleichen Volumen Antikörper gemischt. Der Antikörper teilt sich zwischen dem an das BSA adsorbierte Dioxin und dem A-Tri-CDD- RSA auf der Platte auf.
Die Fig. 1 zeigt die Ergebnisse eines Kompetitions-ELISA mittels des monoklonalen Antikörpers DD-1, der für unser detailliertes Verfahren auch mit anderen Antikörpern in der Vertiefung repräsentativ ist. A-TriCCD-RSA wurde an die Oberfläche der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Die verschiedenen aufgeführten Kompetitoren wurden in Kochsalzlösung suspendiert, die Rinderserumalbumin (BSA) enthält. Diese Lösungen wurden durch Ultrabeschallung von 10 ul Dioxinlösung in Hexan mit 500 ul Kochsalzlösung-BSA hergestellt. Dann wurde eine Verdünnungsreihe dieser Dioxin-BSA-Lösungen angefertigt, die den Bereich von 100-0,2 ppb abdeckt, und in die Mikrotiterplattenvertiefungen gegeben. Dann gab man ein gleiches Volumen des monoklonalen Antikörpers DD-1 zu und ließ ihn 1 Stunde reagieren. Der Antikörper bindet entweder an das A-TriCDD-RSA an der Platte oder an das Dioxin in Lösung. Nach einer Stunde wurde die lösliche Phase entfernt, die Platte gewaschen und für eine Stunde mit Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-Maus-Immunglobulinen erneut inkubiert. Dann wurde ein zweiter Waschschritt ausgeführt und das Substrat (ABTS) wird zur Peroxidase gegeben. Das Enzym-Antikörper-Konjugat und das Substrat fungieren als "Entwickler" und erlauben die Sichtbarmachung des an das A-TriCDD-RSA auf der Platte gebundenen DD-1. Die Ergebnisse werden dann als Bruchteil der Reaktion in Vertiefungen ohne Kompetitor ausgedrückt. In diesem Beispiel reagiert DD-1 nicht mit Octachlordibenzodioxin. Bei etwa 20 ppb von 2,3,7,8-TCDD beträgt die relative ELISA- Reaktion die Hälfte der Kontrolle, was bedeutet, daß die Hälfte des DD-1 Antikörpers an das Dioxin in der löslichen Phase gebunden hat und die Hälfte an das A-TriCDD-RSA auf der Platte gebunden hat. Für 1,2,3,7(8)-TCDD tritt eine 50%ige Hemmung bei etwa 4 ppb auf, was zeigt, daß DD-1 1,2,3,7(8)-TCDD gegenüber 2,3,7,8-TCDD bevorzugt.
Basierend auf diesem Test wurden fünf Hybridome (als DD-1, DD-3, DD-4, DD-5 und DD-6 bezeichnet) für die weitere Untersuchung ausgewählt. Die Tabelle II zeigt die Spezifität dieser Antikörper unter Verwendung dieses Tests für eine Vielzahl an Dioxinen, Dibenzofuran, PCBs und andere chlorierte Kohlenwasserstoffe. Tabelle II Kompetitoren Monoklonale Antikörper Octachlor-DD Pentachlorphenol Aldrin Chlordan Endrin Heptachlor Toxaphen Endosulfan Kepon
Der obige Graph und die Tabelle II zeigen repräsentative Kompetitionsdaten unter Verwendung von einigen chlorierten Verbindungen als Kompetitoren. Aus solchen Daten kann man die Konzentration bestimmen, die zur Hemmung der Antikörperbindung um 50 (150) erforderlich ist. Die Tabelle II führt die I&sub5;&sub0; für alle mit den Antikörpern getesteten Verbindungen auf. Bei der Angabe solcher Werte stellen Faktoren von zwei etwa die Signifikanzgrenze dar. Alle sechs Antikörper weisen die höchste Affinität für die Tetrachlordibenzodioxine mit der höchsten Affinität für das gemischte 1,3,7,8-Isomer auf. Sie haben eine etwas geringere Affinität für das 2,3,7,8-TCDD und das 2,3,7,8-TCDBF. DD-4 zeigt etwas Reaktivität mit dem 1,2,3,6,7,8-hexa-CDD. Bis zur höchsten getesteten Konzentration (100 ppb) reagieren alle Antikörper entweder nicht oder nur am Rand mit Hexachlor-DBF, Octachlor-DBF, Octachlor-DD und PCB's. Die Bindungsspezifitäten dieser Antikörper sind äußerst erwünscht, da sie die Dioxin- und Dibenzofuranisomere mit der größten Toxizität bevorzugen.
Nach unserer Erfahrung bilden verschiedene Mäuse Klone mit verschiedener Bindungsspezifität und Bindungsaffinität. Jede Maus erscheint fast einzigartig in der Art, auf die sie auf ein Immunogen reagiert. Mehrere Klone von der gleichen Maus sind oft sehr ähnlich. Daher waren wir an der Entwicklung eines Satzes an monoklonalen Antikörpern von verschiedenen Mäusen interessiert. Wir wählten fünf Hybridome aus verschiedenen Mäusen mittels derselben Protokollgrundlage aus. Alle erkennen 2,3,7,8-TCDD. Diese Tests sind äußerst reproduzierbar, wobei bei Wiederholungstests mit TCDD der I&sub5;&sub0; Wert um weniger als 20% variierte.

Probenanalyse

Die Testverfahren zur Bestimmung des Vorkommens von Dioxinen und Dibenzofuranen sind im Prinzip erneut ein Kompetitions-ELISA Test, der die in der obigen Beschreibung beschriebenen Antikörper verwendet. Die Proben können Bodenproben, Gewebeproben oder Nahrungsmittelproben sein. Diese Proben werden zuerst vorbehandelt, um die Dioxine oder Dibenzofurane zu extrahieren und sie in ein zur Verwendung im Immunassayschema geeignetes Medium quantitativ zu überführen.
Beispielsweise werden Bodenproben gemäß dem folgenden Protokoll behandelt. Zuerst werden die Dioxine oder Dibenzofurane in Hexan gemäß dem Standard- EPA-Verfahren 613 extrahiert. An dieser Stelle durchläuft der Extrakt einen oder mehrere Reinigungsschritte, um störende Substanzen zu entfernen, wie dies später ausführlicher beschrieben wird. Danach wird die Probe fast bis zur Trockne konzentriert. An dieser Stelle wird der Probenrest in einer Kochsalzlösung resuspendiert. Es wurde festgestellt, daß reproduzierbare und verläßliche Ergebnisse durch Ultrabeschallung der Kochsalzlösung für etwa 2 Stunden erhalten werden, was zu befriedigenden Bestimmungen führt, die zur Identifizierung des Vorkommens von Toxinen im Bereich von einem Teil pro einer Milliarde fähig sind.
Die Empfindlichkeit kann durch die Zugabe von kontrollierten Mengen Detergent drastisch verbessert werden. Unsere bevorzugten Detergentien sind CutscumR und Tween-20. Wir haben festgestellt, daß es durch die Reduzierung der Konzentration dieser Detergentien auf etwa 0,05 Volumenprozent möglich ist, die Empfindlichkeit des Tests bemerkenswert zu verbessern, um Dioxine oder Dibenzofurane in Konzentrationen zu detektieren, die so gering sind wie einige Teile pro Billion.
Der Rest des Verfahrens wird durch Füllen der Probe in die Mikrotiterplatte, Zugabe des Antikörpers, Fortfahren mit dem Kompetitions-ELISA- Test, Sammeln und Analysieren der Daten mit dem Mikrocomputer ausgeführt. Das Verfahren wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel I

10 g nasser Boden werden in eine bernsteinfarbene 500 ml Flasche eingewogen und vollständig mit 20 Gramm Natriumsulfat gemischt. 20 ml Methanol und 150 ml Hexan werden zugegeben und das Gemisch wird für mindestens 3 Stunden geschüttelt. Die Hexanschicht wird vom Gemisch dekantiert, filtriert und das Volumen auf 1 ml In einem Rotationsverdampfer reduziert. Der Rest wird auf eine kurze Einwegchromatographiesäule Kieselgel oder Aluminiumoxid, 1 Gramm) aufgetragen und entweder jeweils mit Hexan oder 20 Methylenchlorid/Hexan eluiert. Das Lösungsmittel wird dann durch einen trockenen Stickstoffgasstrom entfernt und der Rest ist für die Verwendung im Immunassayschema geeignet.
Der Zweck der Chromatographiesäule ist es, das unwesentliche Material im Boden zu entfernen, das mit dem Test wechselwirken kann. Böden können eine große Menge an hexanlöslichem, organischen Material enthalten, in dem sich das Dioxin bevorzugt gegenüber dem im Immunassay verwendeten Lösungsmittel verteilt, was das Dioxin für die Antikörper unzugänglich macht. Ohne der Chromatographie wird der Immunassay mit einigen Bodentypen nicht funktionieren. Die zwei obigen Bedingungen funktionieren beide gut und andere sollten genauso gut funktionieren. Dieses Verfahren arbeitet mit Gewebs- und Nahrungsmittelproben gleichgut.

Beispiel II

Der Bodenextrakt oder die Testverbindung in Hexanlösung wird getrocknet und 5 ul einer 5%igen (V/V) Lösung Detergent in Methanol (beispielsweise CutscumR) wird zugegeben. Das Methanol wird dann durch einen Stickstoffstrom verdampft. 500 ul phosphatgepufferte Kochsalzlösung [0,01 M Phosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,2] (PBS-7) wird dann zugegeben und das Reaktionsgläschen wird fest verschlossen. Das Gläschen wird dann in einen Bransonic 220 Ultraschallreiniger gegeben und für 30 Minuten ultrabeschallt. Dieses Material wird dann auf den Dioxingehalt in einem Kompetitions-ELISA titriert.
Die vorangehende Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde zum Zweck der Erläuterung und Beschreibung bereitgestellt. Sie ist weder erschöpfend gedacht, noch soll sie die Erfindung auf die präzise beschriebene Form beschränken, und offensichtlich sind viele Modifikationen und Variationen bezüglich der obigen Beschreibung möglich. Die Ausführungsform wurde ausgewählt und beschrieben, um am besten die Prinzipien der Erfindung und deren praktische Anwendung zu erklären, um es hierdurch anderen Fachleuten zu ermöglichen, die Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen und mit verschiedenen Modifikationen am besten zu verwenden, wie sie bei der bestimmten beabsichtigten Verwendung geeignet erscheinen. Es ist beabsichtigt, daß der Schutzumfang der Erfindung durch die hieran angefügten Patentansprüche definiert wird.

Claims

1. Hybridome oder Nachkommen davon, die monoklonale Antikörper ausscheiden mit spezifischen Affinitäten zu toxischen Isomeren von polyhalogenierten Dibenzo-p-dioxinen und Dibenzofuranen, einschließlich 1,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin, und die nicht oder nur am Rande mit Hexachlordibenzofuran, Octachlordibenzofuran, Octachlordibenzo-p-dioxin und polychlorierten Biphenylen reagieren.

2. Hybridome nach Anspruch 1, die Antikörper ausscheiden, die nicht oder nur am Rande mit 1,2,3,6,7,8-Hexachlordibenzo-p- dioxin reagieren.

3. Hybridome nach Anspruch 1 oder 2, die Antikörper ausscheiden, die spezifisch sind gegenüber weiteren toxischen Tetrachlordibenzo-p-dioxin-isomeren.

4. Hybridome nach einem der vorangehenden Ansprüche, die weiter dadurch definiert sind, daß die toxischen Isomere umfassen:

2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin,

1,2,3,7-Tetrachlordibenzo-p-dioxin,

1,2,3,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin,

1,2,3,7,8-Pentachlordibenzo-p-dioxin,

2,3,7,8-Tetrabromdibenzo-p-dioxin und

2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-furan.

5. Hybridome nach einem der vorangehenden Ansprüche, die abgeleitet sind von Spleenozyten von Mäusen, die mit toxischen Dioxinisomer-analogen immunisiert sind, durch Auswahl entspechend den Bindungsaffinitäten, die für das toxische Dioxinisomer spezifisch sind.

6. Monoklonale Antikörper mit spezifischen Affinitäten gegenüber toxischen Isomeren von polyhalogeniereten Dibenzo-p-dioxinen und Dibenzofuranen einschließlich 1,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin, und die nicht oder nur am Rande reagieren mit Hexachlordibenzofuran, Octachlordibenzofuran, octachlordibenzo- p-dioxin und polychlorierten Biphenylen.

7. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 6, die nicht oder nur am Rande reagieren mit 1,2,3,6,7,8-Hexachlordibenzo-p-dioxin.

8. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 6 oder 7, die spezifisch sind gegenüber weiteren toxischen Tetrachlordibenzo-p- dioxin-isomeren.

9. Monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 6 bis 8, die ferner dadurch definiert sind, daß die toxischen Isomere umfassen:

2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin,

1,2,3,7-Tetrachlordibenzo-p-dioxin,

1,2,3,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin,

1,2,3,7,8-Pentachlordibenzo-p-dioxin,

2,3,7,8-Tetrabromdibenzo-p-dioxin und

2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-furan.

10. Monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 6 bis 9, die weiter dadurch definiert sind, daß sie gekennzeichnet sind durch Affinitäten, wie sie etwa in Tabelle 11 angegeben sind.

11. Verfahren zum Nachweis von toxischen Isomeren von Dioxin oder Dibenzofuran, umfassend die Stufen:

a) Zusammenbringen der Isomere mit monoklonalen Antikörpern, die erhalten worden sind von Hybridomen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, und

b) Messung der Menge der gebundenen Antikörper.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Isomere von einer Probe extrahiert und in Salzlösung, umfassend ein Detergens, durch Beschallen wieder suspendiert worden sind.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die gebundenen Antikörper gemessen werden mit Hilfe von Konkurrenz-ELISA-Testverfahren.

14. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 6 bis 10, umfassend das Züchten von Hybridomen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, und Ernten der monoklonalen Antikörper aus dem Züchtungsprodukt.