NL8601468A - Complexen van thyroxine bindende proteinen met lichaamsvreemde stoffen; kit en werkwijze voor biologische monitoring en bepaling van de toxiciteit van lichaamsvreemde stoffen. - Google Patents

Description

Nw 8218

Titel: Complexen van thyroxine bindende proteïnen met lichaams-vreemde stoffen? kit en werkwijze voor biologische monitoring en bepaling van de toxiciteit van lichaams-vreemde stoffen.

Polychloorbifenyl verbindingen (PCBs) en verwante verbindingen blijken bij mensen en dieren soms effecten te hebben die lijken op die van een hypovitaminose A. Er bestaat experimenteel bewijs dat het vitamine A metabolisme 5 door deze stoffen wordt beïnvloed. Proeven aan ratten, die oraal PCBs of tetrachloro-dibenzo-para-dioxine (TCDD) kregen toegediend, lieten een aanzienlijke verlaging van het totale vitamine A gehalte in de lever zien. Een enkele orale dosis van polybromobifenyl verbindingen (PBBs) resulteerde 10 bij ratten in een verlaging van zowel het vitamine A gehalte in het serum als in de lever. In Rhesus en Marmoset apen, waaraan oraal PCBs waren toegediend, werden verlaagde vitamine A gehaltes in de lever aangetroffen.

Door Brouwer en Van den Berg, Toxicol. Appl. Pharmacol.

15 73 (1984), 204-209 en door Brouwer et al, Toxicol. Appl. Pharmacol. 78 (1985), 180-189 is beschreven dat een enkele of meerdere intraperitoneale injecties van 3,4,3',4*-tetrachlorobifenyl (TCB) in muizen en ratten resulteerde in de verlaging van de vitamine A gehaltes van het serum 20 en de lever. Een verlaging van het serum vitamine A (retinol) gehalte werd waargenomen in Ah-responsive (C57BL/Rij, BALB/c) als in Ah-nonresponsive (DBA/2) stammen van muizen die aan TCB waren blootgesteld, terwijl de vitamine A gehaltes in de lever alleen verlaagd bleken in C57BL/Rij muizen.

25 Bovendien bleken de effecten van TCB op retinol gehaltes in het serum groter te zijn in DBA/2 dan in C57BL/Rij muizen. Deze gegevens duiden erop dat de vitamine A verlaging in het serum als gevolg van blootstelling aan TCB niet via de Ah-receptor plaatsvindt en dat een ander mechanisme 30 voor dit effect verantwoordelijk is.

Uit kinetische onderzoeken was gebleken dat een verlaging van het retinol gehalte in het serum een zeer vroegtijdig

λ Λ j ’A O •j *f i *ï J O

-2- i ï (binnen 6 tot 12 uur na blootstelling) en gevoelig (ED50 van 1 tot 2 mg/kg) effect van TCB in knaagdieren is. Verder bleek de ophoping van TCB in het serum goed te correleren met de kinetiek van de serum retinol verlaging, op grond 5 waarvan een mogelijke verstoring van het plasma transport van vitamine A door TCB werd aangenomen. De afgifte van vitamine A aan zijn doelweefsels (epitheelweefsel) wordt physiologisch gereguleerd door het plasma transport systeem d'at een complex van twee eiwitten omvat, nl. het retinol 10 bindend proteïne (RBP) en het thyroxine bindend prealbumine (PA), of volgens recente nomenclatuur transthyretine (TTR).

Om meer inzicht te verwerven in het mechanisme van de serum vitamine A verlaging onder invloed van lichaamsvreem-de stoffen zoals polychloorbifenyl verbindingen werd het 15 effect van een TCB behandeling op het plasma transportsysteem van vitamine A onderzocht met polyacrylamide gelelectroforese (PAGE) onder toepassing van radioactief gelabelde liganden.

Een deel van het onderzoek werd uitgevoerd aan ratten met eenvitamine A tekort, dat met radioactief gelabeld retinol 20 werd aangevuld. Met behulp van dit systeem konden voldoende hoeveelheden ^H-retinol label, gebonden aan plasma proteïnen, worden gerealiseerd voor PAGE analyse. De twee dragers van radioactief gelabeld retinol in serum werden geïdentificeerd als het retinol bindend proteïne (RBP) en het complex 25 van RBP met transthyretine (TTR). Deze identificatie is gebaseerd op een radioimmunochemische analyse (Fig. 3) en een bepaling van de molecuulmassa door gradiënt PAGE onder natieve condities (Fig. 4).

Behandeling van de ratten met TCB leidde tot een uitge-30 sproken verlaging van de hoeveelheid ^H-retinol radioactiviteit, gebonden aan beide bindende proteïnen (Fig. 2B en 4B) . Deze gegevens wijzen op een sterke verstoring van het plasma transportsysteem van vitamine A door TCB. Verder werd vastgesteld dat de plasmaconcentratie van RBP, zoals 35 geanalyseerd door middel van een radioimmunoanalyse, in §601403 * Λ -3- hoge mate verlaagd is in ratten en muizen die aan TCB zijn blootgesteld, terwijl de TTR gehaltes een normale waarde hebben. Bovendien bleek noch de synthese noch het vrijkomen van RBP uit de lever in de bloedsomloop door TCB te worden 5 beïnvloed. Deze bevindingen vormen een sterke aanwijzing dat de verstoring van het plasma transportsysteem van vitamine A door TCB plaatsvindt op het niveau van de vorming van het drager proteïne complex.

Teneinde vast te stellen op welke wijze TCB de vorming 10 van het RBP-TTR complex verstoorde, werden dieren behandeld met radioactief gelabeld TCB. Analyse van de plasma proteïnen met behulp van PAGE openbaarde de aanwezigheid van vier radioactiviteitspieken in de gel. De grootste hoeveelheid van het TCB label werd gevonden in een gebied op de gel 15 waar chylomicrons en andere lipoproteïnen zijn gelegen.

Bij recente onderzoeken is gevonden dat 2,4,5,2^4^5^ hexachlorobifenyl zowel in vivo als in vitro in hoofdzaak gebonden is aan verschillende klassen van lipoproteïnen.

Aangezien in het bijzonder lipoproteïnen primair betrokken 20 zijn bij het transport van lipiden en andere hydrofobe moleculen zoals vitamine A, zou de binding van PCBs kunnen leiden tot een verstoring van de lipide transportfunctie van deze proteïnen. Feitelijk werd ook waargenomen dat de hoeveelheid retinol label, gebonden aan de chylomicron/lipo-25 proteïne fractie op een PAGE gel, aanzienlijk verlaagd was in serum van ratten die met TCB waren behandeld. Chylomicrons leveren onder normale omstandigheden vitamine A aan de lever, zodat dit effect een gedeeltelijke verklaring kan vormen voor de verlaagde opslag in de lever van vitamine 30 A, die is vastgesteld in dieren die aan deze verbindingen zijn blootgesteld.

Op de plaatsen van het RBP-TTR complex (Rf 0,04-0,08) en van het RBP (0,32-0,36) werd geen aan TCB gebonden radioactiviteit gevonden. Er lijkt derhalve geen direkte interactie 35 te bestaan tussen TCB met RBP of met het RBP-TTR complex.

- f* * J - v ; v ; * -4-

Een aanzienlijke hoeveelheid van ^h-tCB (25%) bleek echter gebonden te zijn aan een proteïne dat zowel op immunochemische wijze als op basis van de molecuulmassa (52-57 kD) geïdentificeerd werd als vrij TTR (niet gebonden aan RBP). Dit 5 was een nogal verrassende vondst omdat algemeen werd aangenomen dat xenobiotica niet aan TTR maar aan albumine en lipo-proteïnen worden gebonden; zie Vallner, J. Pharm. Sci.

66 (1977), 447-465. Door Matthews et al, Fundam. Appl.

Toxicol. 4 (1984), 420-428 is vermeld dat 2,4,5,2',5'-10 pentachlorobifenyl zich in vivo hoofdzakelijk aan lipoproteïnen bindt, terwijl ongeveer 30% van het radioactieve PCB isomeer gebonden was aan proteïnen in het albumine gebied van een gel filtratie experiment. Deze verdelingsverhouding tussen lipoproteïnen en de albumine fractie werd ook waargenomen 15 bij in vitro experimenten aan 4-mono; 4,4'-di-; 3,4,3',4'-tetra-; 3,5,3 ',5'-tetra-; 2,4,5,2’,41,5'-hexa- en 2,4,6,2',-46 -hexachlorobifenyl. Omdat gelfiltratie een inadequate methode is om albumine te scheiden van TTR, kan op grond van dit onderzoek niet worden uitgesloten, noch worden 20 geconcludeerd dat een binding aan TTR is opgetreden.

Analyse van de aan TTR gebonden radioactief gelabelde verbinding door HPLC openbaarde de aanwezigheid van een metaboliet van TCB en niet van het TCB zelf. Met behulp van massaspectrometrie is de metaboliet van TCB, die door 25 TTR van rat en Marmoset aap wordt gebonden, geïdentificeerd als 5-hydroxy 3,4,3',4'tetrachloorbifenyl (TCBOH). Deze metaboliet wordt in vivo snel gevormd, binnen 4 tot 8 uur na intraperitoniale injectie, terwijl bijna 90% van de radioactiviteit na 48 uur in de vorm van deze metaboliet 30 in het bloed aanwezig is. Meer dan 70% van het 3h-tCB label kon uit totaal plasmaproteïnen en uit TTR in PAGE fracties worden geëxtraheerd, door gebruik te maken van een mengsel van methanol en diisopropylether met een volumeverhouding methanol : diisopropylether van ongeveer 1:2. Deze gegevens 35 wijzen erop dat het ^h-TCB label voor het grootste gedeelte

..r .¾ A ^ A Λ A

S *ί -5- niet covalent gebonden is. Het is echter niet onmogelijk dat een ondergeschikte hoeveelheid van het ^h-TCB label wel covalent is gebonden. Door PAGE onder denaturerende condities, bijvoorbeeld SDS-PAGE, kan in deze vraag klaarheid 5 worden gebracht.

Ook zijn experimenten uitgevoerd die meer inzicht zouden kunnen geven over de invloed van TCB op het schildklier (thyroide) hormoon metabolisme. Daarbij bleek een enkelvoudige intraperitoniale dosis van 15 mg TCB/kg in ratten (Sprague 10 Dawley WAG/Rij) een dramatische verlaging van de totale thyroxine (T4) concentraties in serum tot ongeveer 5% van de controleniveaus op te roepen binnen 24 uur na de injectie.

De totale T4 niveaus bleven gedurende ongeveer 10 dagen in serum.van de2e ratten beneden het normale niveau. Bovendien 15 werd een vergroot aantal vrije thyroxine bindingsplaatsen (T3-harsopname) gevonden in serum van de aan TCB blootgestelde ratten, hetgeen een verstoring van de binding van thyroxine aan zijn plasma drager proteïnen door TCB doet vermoeden.Serum van ratten, die waren ingespoten met 125-thyroxine, vertoonde 20 na PAGE electroforese twee pieken van radioactiviteit.

De hoofdcomponent werd geïndentificeerd als TTR en de nevencomponent bleek albumïne te zijn. Wanneer de ratten waren voorbehandeld met TCB (15 mg/kg)d en vervolgens met 125I-T4 werden ingespoten, bevatte de TTR piek slechts 5 % van de radioactiviteit 25 terwijl de radioactiviteit op de albumine piek niet was veranderd. Deze resultaten tonen aan dat TTR het voornaamste dragereiwit voor thyroxine bij de rat is en dat TCB specifiek de binding van T4 aan dit eiwit verhindert. Ook in muizen (DBA/2), blootgesteld aan TCB, werd een uitgesproken verlaging 30 (70%) in het totaal serum T4 gehalte waargenomen na een enkele toediening van TCB.

Een ander TCB isomeer, nl. het isomeer 2,4,3',4'-tetrachlorobifenyl, dat een niet-toxisch isomeer van PCBs is, gaf geen significante wijziging van de totale T4 serum 35 gehaltes in de DBA/2 muizestam, hetgeen een aanwijzing vormt dat een verlaging van de schildklier hormoon concentraties in serum een specifiek effect van toxische PCBs is.

56 014 SB

-6-

Het effect van PCB in het thyroid metabolisme is ook onderzocht in een primatensoort, nl. de Marmoset aap (Callithrix Jacchus). De serum schildklier hormoon gehaltes bleken ook in Marmoset apen snel af te nemen wanneer deze waren 5 blootgesteld aan hetzij een enkelvoudige intraperitoneale dosis van 5 mg TCB/kg hetzij aan meerdere orale doses van 0,1, 1, en 3 mg TCB/kg, twee keer per week. In vergelijking met de controles was de T3-harsopname in Marmoset apen, die aan TCB waren blootgesteld, duidelijk verhoogd. De 10. verlaging van de serum T4 concentraties bleek goed overeen te stemmen met het verlies aan lichaamsgewicht van de apen, dat een vroegtijdige en karakteristieke indicator voor toxiciteit van PCBs en verwante chemische stoffen is. Een post mortum onderzoek van de Marmoset apen openbaarde naast andere lesies, histopatologische veranderingen in de schildklier, zoals een vergrote schildklier als gevolg van een schildklier folliculaire cel hyperplasie. De hoeveelheden thyreotropine (thyroide stimulerend hormoon TSH) bleken drie tot vier keer zo hoog te zijn. In deze apensoort lijkt TCB derhalve 20 een primaire hypothyroidie te veroorzaken.

Proefnemingen, waarbij geïsoleerd radioactief TCBOH (de metaboliet van TCB) werd geïncubeerd met serum van ratten en Marmoset apen, gevolgd door scheiding van de plasma eiwitten door middel van electroforese of HPLC, 25 wezen op een associatie met in hoofdzaak TTR en in zeer geringe mate met albumine en thyroxine (T4) bindend globuline (TBG). Dezelfde procedure met radioactief gemerkt T4 geeft een vrijwel identieke associatie te zien.

Binding van de TCBOH en T4 met humaan serum gebeurt 50 daarentegen aan TBG en albumine als bij de rat en niet of nauwelijks aan TTR.

Tenslotte werd door in vitro experimenten aangetoond dat de binding van T4 aan TTR in rattenserum sterk geremd wordt wanneer tegelijkertijd TCBOH wordt toegevoegd.

55 Al deze resultaten tezamen wijzen er zeer sterk op dat TCBOH en T4 affiniteit hebben voor dezelfde bindings-plaatsen op transporteiwitten van het bloed.

Op basis van de resultaten van de uitgevoerde onderzoeken 8501463 * -7- kan een model worden opgesteld voor het mechanisme van de invloed van PCBs en verwante verbindingen op vitamine A en T4 transport (Fig. 9), waarmee enkele karakteristieke toxische lesies kunnen worden verklaard die optreden in 5 diersoorten die aan deze verbindingen zijn blootgesteld.

TCB wordt in vivo snel omgezet in een polaire metaboliet, met een fenolische hydroxylgroep, waarschijnlijk onder invloed van enzymen van een oxydase systeem met gemengde functie. Deze metaboliet bindt met een betrekkelijk hoge 10 affiniteit aan transthyretine (TTR). De vorming en biologische levensduur van het metaboliet en de chemische struktuur van de lichaamsvreemde uitgangsverbinding kunnen belangrijke parameters zijn voor de binding aan TTR en derhalve voor de inductie van hypovitaminose A en hypothyroidie in verscheidene 15 soorten. Toxische PCB isomeren zoals 3,4,3 *,4*-tetra- en 3,4,5,3',4*,5'-hexachlorobifenyl veroorzaakten aanzienlijke verlagingen van de serum vitamine A gehaltes in muizen, terwijl niet-toxische PCB isomeren zoals 2,4,3*,4'-tetra-en 2,4,5,21,4',5’-hexachlorobifenyl geen wijziging van 20 de serum vitamine A gehaltes gaven. Door anderen is reeds beschreven dat 3,4,3',4'-TCB in veel sterkere mate aan bloedcomponenten is gebonden dan het 2,4,2*,4’-TCB. Het zal derhalve duidelijk zijn dat de aanwezigheid van een transthyretine bindend metaboliet van PCBs in serum van 25 blootgestelde dieren een waardevolle en gemakkelijk meetbare parameter is voor de toxiciteit van PCBs en verwante verbindingen.

Door de binding van een TCB metaboliet zou een conformatie wijziging van TTR kunnen optreden of zouden de bindingsplaatsen voor RBP op TTR kunnen worden geblokkeerd, hetgeen uiteindelijk 30 leidt tot een verlaagd serumgehalte van het RBP-TTR proteïne complex. Op basis van de huidige gegevens kan geen onderscheid worden gemaakt tussen een geremde binding of een versterkte dissociatie van het RBP-TTR complex door TCB. Er zijn echter reeds aanwijzingen gevonden voor de aanwezigheid van TTR 35 gebonden radioactiviteit in een lever cytosol fractie 48 uur na blootstelling van de in dit onderzoek gebruikte ratten, hetgeen suggereert dat de interactie van TCB met TTR reeds plaatsvindt voordat de binding van RBP aan TTR optreedt. De inhibitie van de vorming van het RBP-TTR complex 8601468 ï * -8- kan op zijn beurt leiden tot een uitscheiding via de urine van holoRBP, omdat niet-gebonden holoRBP voldoende klein is om door het glomerulaire basaalmembraan te passeren (holoRBP is RBP met daaraan gebonden retinol). Daardoor 5 kunnen de gehaltes van retinol en RBP in het plasma snel dalen, met als gevolg dat de toevoer van vitamine A aan perifere weefsels wordt onderdrukt. In knaagdieren is bewijs gevonden voor een snelle verlaging van de retinol en RBP gehaltes in plasma en voor de uitscheiding via de urine 10 van RBP. Evenzo zijn de verwachte effecten op de perifere weefsels aangetoond. In ratten werden verlagingen van de vitamine A gehaltes gevonden van 80% in de lever, 70% in de longen, 50% in de nieren en 357» in de huid. Uiteindelijk kunnen sommige weefsels een vitamine A tekort vertonen 15 voor een normale groei, ontwikkeling van epitheelweefsel en reproduktie. In verband met de in de literatuur voorgestelde anti-carcinogene eigenschappen van vitamine A zou zich ook een grotere gevoeligheid van perifere weefsels voor de werking van carcinogenen kunnen ontwikkelen.

20 Naast zijn rol in het transport van retinol naar de doelweefsels, heeft transthyretine ook een funktie als drager van schildklier hormonen zodat de binding van het TCB-metaboliet aan TTR ook de binding en het transport van thyroxine zou kunnen verstoren. Het thyroxine molecuul 25 vertoont feitelijk structurele gelijkenis met TCB. Proefnemingen wezen uit dat de totale thyroxine gehaltes in sera van de onderzochte dieren met 90% waren verlaagd. Enkele eerdere onderzoeken naar de invloed van PCBs en verwante verbindingen op het schildklier hormoon metabolisme hebben 30 reeds uitgewezen dat ratten waaraan PCBs waren toegediend een verlaagd serum proteine gebonden jodium gehalte vertonen; dat een verminderde binding van schildklier hormonen aan serum proteïnen optreedt, zoals blijkt uit een versterkte harsopname van uit serum; dat na 35 orale toediening van TCDD aan ratten verlaagde serum thyroxine gehaltes optreden; en dat PCBs en PBBs in ratten en muizen de serum thyroxine en triiodothyronine gehaltes verlagen.

-Λ Λ Λ 1 /»( ΐ* ύ V 5 * ** -9-

Gewijzigde verhoudingen van gebonden versus vrije thyroide hormonen kunnen tot veranderingen leiden in de basale metabolische snelheid van energie-omzetting, die op hun beurt het lipide metabolisme zouden kunnen versnellen. Dit zou kunnen verklaren 5 waarom in gevallen van PCB en TCDD toxiciteit vaak een verlies van lichaamsvet wordt waargenomen.

Aan TTR is ook een thymus hormoonachtige activiteit toegeschreven. Verstoring van deze activiteit door TCB en verwante verbindingen zou immunologische veranderingen 10 kunnen veroorzaken in de functie van de thymus. Thymus atrofie en onderdrukking van T-cel activiteit zijn karakteristieke toxicologische tekenen die in knaagdieren worden waargenomen na blootstelling aan PCBs en verwante verbindingen.

Een ander intrigerend aspect van TTR is de vermoedelijke 15 DNA bindingsplaats, zoals voorgesteld door Blake et al,

Nature 286 (1977), 115-120. De TCB metaboliet zou een directe invloed kunnen uitoefenen .in de gen regulering in doelweefsels.

Op dit moment is echter nog onbekend of TTR alleen of gebonden aan de TCB metaboliet in staat is om cellen binnen te gaan 20 en interactie met DNA te vertonen.

Het bovenstaand beschreven model is niet alleen van toepassing op TCB, maar ook op een aantal andere gehalogeneerde aromatische verbindingen zoals TCDD, PBBs en andere PCB isomeren, die bepaalde toxiciteitseigenschappen gemeen 25 hebben, en die soortgelijke effecten veroorzaken op de vitamine A gehaltes, de thyroxine gehaltes en de thymus functies. Behalve deze chemische stoffen leiden ook stoffen zoals DDT, endosulfan en polycyclische aromaten zoals benzo- (a)pyreen, methylcholanthreen en 1,2-dibenzanthraceen tot 30 verlaagde vitamine A gehaltes, waarbij vermoedelijk eveneens een verstoring optreedt via een binding aan transthyretine. Tenslotte kan nog de aan TCDD (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-para-dioxine) verwante verbinding 2,3,7,8-tetrachlorodibenzofuran (TCDF) worden genoemd.

£ o 3 14 o 3

5 V

-10-

Samenvattend is derhalve gevonden dat er een direkte interaktie bestaat tussen bepaalde lichaamsvreemde stoffen of metabolieten daarvan en thyroxine bindende proteïnen zoals het thyroxine bindende prealbumine (PA; of transthyretine 5 (TTR)) en het thyroxine bindend globuline (TBG) welke interactie leidt tot een inhibitie van de vorming van het plasma transport proteïne complex dat zowel retinol als thyroxine vervoert. Blootstelling van dieren zoals ratten en muizen aan TCB en verwante toxische stoffen blijkt aanleiding 10 te geven tot een sterke verlaging van de gehaltes aan retinol en RBP in het serum, en bij mensen, apen, ratten en muizen verlaagde T4 gehaltes in het serum.

Deze bevindingen kunnen worden benut voor een biologische monitoring van PCBs, PBBs en andere lichaamsvreemde stoffen 15 in humane en dierlijke sera met behulp van procedures, waarbij bijvoorbeeld gebruik wordt gemaakt van thyroxine bindende proteïnen dan wel van anti lichamen, gericht tegen complexen van thyroxine bindende proteïnen met die lichaamsvreemde stoffen of metabolieten daarvan. Een andere mogelijke toepassing 20 betreft in vitro procedures om de mogelijke toxiciteit van chemische stoffen vast te stellen door te onderzoeken of de chemische stoffen complexen vormen met thyroxine bindende proteïnen bij mensen en dieren, waarbij eventueel gebruik kan worden gemaakt van antilichamen tegen dergelijke 25 complexen.

De uitvinding betreft op de eerste plaats complexen van een thyroxine bindend proteïne, zoals het thyroxine bindend prealbumine (PA) en het thyroxine bindend globuline (TBG), met lichaamsvreemde stoffen zoals polychlorobifenyl 30 verbindingen (PCBs), polybromobifenyl verbindingen (PBBs) en polychloro-dibenzo-para-dioxinen (PCDDs), of metabolieten daarvan.

Verder betreft de uitvinding polyklonale en monoklonale antilichamen met specificiteit voor dergelijke complexen.

35 De uitvinding betreft ook een kit voor biologische monitoring van lichaamsvreemde stoffen in humane en dierlijke lichaams- $3|» 1 i O 5* ψ * -11- vloeistoffen, zoals serum, plasma, urine, liquor, en melk, of voor bepaling van de mogelijke toxiciteit van lichaams-vreemde stoffen, omvattende: (a) een gezuiverd thyroxine bindend proteïne, en een radio-5 actief gelabelde lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan; of (b) een gezuiverd thyroxine bindend proteïne, en radioactief gelabeld thyroxine; of (c) een radioactief gelabelde lichaamsvreemde stof of 10 metaboliet daarvan, en anti lichamen tegen de lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan; of (d) een complex van een thyroxine bindend proteïne met een radioactief gelabelde lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan, en anti lichamen tegen het complex; of 15 (e) een complex van een thyroxine bindend proteïne met een lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan, en antilichamen tegen het complex, en een enzym-gelabeld anti-antiserum.

Tenslotte betreft de uitvinding ook een werkwijze voor het bepalen van toxische stoffen in humane en dierlijke 20 lichaamsvloeistoffen, zoals serum, plasma, urine, liquor en melk, door een monster van de lichaamsvloeistof, of een extract daarvan, (a) aan een competitieve radioreceptor (CRR) analyse te onderwerpen waarbij met gezuiverd thyroxine bindend proteïne en een radioactief gelabelde lichaamsvreemde 25 stof of metaboliet daarvan wordt geïncubeerd; of (b) aan een CRR analyse te onderwerpen waarbij met' gezuiverd thyroxine bindend proteïne en radioactief gelabeld thyroxine wordt geïncubeerd; of (c) aan een competitieve radioimmuunanalyse (CRIA) te 30 onderwerpen waarbij met een radioactief gelabelde lichaamsvreemde stof of een metaboliet daarvan en antilichamen daartegen wordt geïncubeerd; of (d) aan een CRIA te onderwerpen waarbij met een complex van een thyroxine bindend proteïne met een radioactief 35 gelabelde lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan, en

S30 1 4 β S

t -12- antilichamen tegen het complex wordt geïncubeerd; of (e) aan een competitieve enzym-gelabelde immunosorbens analyse (comp. ELISA) te onderwerpen, waarbij een complex van een thyroxine bindend proteïne met een lichaamsvreemde 5 stof of metaboliet daarvan, alsmede anti lichamen tegen het complex en een enzym-gelabeld anti-antiserum worden toegepast.

In deze werkwijze heeft het de voorkeur dat als lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan .5-hydroxy-10 3,4,3',4'-tetrachlorobifenyl wordt toegepast.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm wordt een extract van een lichaamsvloeistof toegepast, welk extract verkregen is door de lichaamsvloeistof te extraheren met een mengsel van diisopropylether en methanol met een volume verhouding 15 diisopropylether/ethanol van ongeveer 2/1 en het na droogdampen van de diisopropyletherfase verkregen residu op te lossen in methanol.

Onderstaand worden een aantal methoden beschreven voor het bepalen van toxische stoffen in lichaamsvloeistoffen 20 van mens en dier (biologische monitoring), welke berust op de specifieke interactie van deze stoffen (of metabolieten daarvan) met prealbumine of thyroxine bindend globuline.

A., COMPETITIEVE RADIORECEPTOR (CRR) TOETS MET TCB METABOLIET 25··

Een monster (1 ml) van de te onderzoeken lichaamsvloeistof (serum, plasma, urine, liquor, melk) wordt geextraheerd met 1 ml van .een mengsel van diisopropylether (DIPE) en me-thanol (2:1,v/v). De DIPE fase wordt drooggedampt 30 met een N2 stroom bij 40°C. Het residu wordt opgelost in • 0,1 ml methanol. Een monster van deze oplossing (0,01 ml) 3 wordt in een buisje gedaan. Een oplossing van H gelabelde 5-hydroxy-3,4,3',4'-tetrachloorbifenyl ( >1 TCBOH, 10 pmol in ethanol) wordt hieraan 35 toegevoegd. Controle oplossingen worden gemaakt f* ,-·' -Λ A f Λ ί .

'<* 'H- i V· * -i -13- met buffer in plaats van serum extract. Een hoeveelheid gezuiverde prealbumine (PA) of thyroxine bindende globuline (TBG) in buffer (5 pmol in 0,01 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl pH 7 ,5) waarbij 50% van de toegevoegde radioactieve label 5 wordt gebonden, wordt vervolgens toegevoegd. De buisjes worden afgesloten en gedurende 2-16 uur weggezet bij kamertemperatuur. De hoeveelheid vrije label wordt verwijderd door 1. toevoeging van eenzelfde volume koolpoeder suspensie 10 (0/5 7o Norit A, 0,05 % dextranT 70, 0,1 % gelatine in buffer).

De buisjes worden 90 min geschud en vervolgens gecentrifugeerd; of 2. de inhoud van het buisje op een microcentrifugekolom met Sephadex G 25 te brengen, waarna de kolom 1 min gecentri- 15 fugeerd wordt.

Monsters van de bovenstaande vloeistof 1) of van de doorgelopen vloeistof 2) worden overgebracht in een telflesje, gemengd met scintillatorvloeistof en de radioactiviteit wordt gemeten in een vloeistofscintillatieteller.

20 Om de nlet-specifieke binding te corrigeren wordt een controle uitgevoerd waarbij bovendien nog eens 10 ng ongelabelde TCB0H wordt toegevoegd. De maximale (100 %) bindingscapaciteit wordt eveneens bepaald in een incubatiemengsel zonder serum extract maar met een verhoogde [^h}tCB0H (100 pmol) concen-25 tratie.

B. CRR TOETS MET THYROXINE

Een monster van de te onderzoeken vloeistof wordt 30 voorbereid als onder A is beschreven. Een hoeveelheid monster (0,01 ml) wordt in een buisje gepipetteerd. Hieraan wordt bovendien toegevoegd een oplossing die thyroxine gelabelde met 125j bevat (10 pmol in 10 ul ethanol/water 70:30 v/v). Vervolgens wordt prealbumine of TBG toegevoegd die, zonder 35 toevoeging van een serum extract, 50 % van de gelabelde thyroxine zal binden (5 pmol), zoals boven is beschreven.

36 G1468 t < -14-

Het buisje wordt 30 min. weggezet bij kamertemperatuur. Niet-gebonden label wordt verwijderd zoals aangegeven is onder Al of A2. De radioactiviteit van monsters wordt gemeten in een gammateller.

5 C. COMPETITIEVE RADI0IMUUNTOETS (CRIA) 1. Een monster wordt voorbereid als onder A is beschreven. Een hoeveelheid extract (0,01 ml) wordt in een buisje gepipet- Ï0 teerd tesamen met 3H-TCB0H (10 pmol) en een hoeveelheid anti lichaam (0CTCB0H) in een verdunning, die 50 % van de radioactiviteit bindt zonder extract.

1.1. Aan de oplossing wordt Nonidet toegevoegd (0,1 %) in een totaal volume van 100 ul. Na 2 uur incubatie bij 15 kamertemperatuur wordt 100 ul verzadigde ammoniumsulfaat oplossing (pH=7,0) toegevoegd. Tien minuten later wordt het buisje gecentrifugeerd. De radioactiviteit in 150 ul van de bovenstaande vloeistof wordt gemeten met scintillatie-vloeistof in een vloeistofscintillatieteller; of 20 1.2. Na een incubatie van 2 uur wordt niet gebonden label verwijderd zoals onder A2 is beschreven.

2. Een monster lichaamsvloeistof (0,1 ml) wordt in een buisje gepipetteerd en daaraan wordt toegevoegd 10 pmol complex van TBG of PA en j^H^TCBOH (in 0,01 M Tris-HCl, 25 0,1 M NaCl pH 7,5). Antilichaam (d TBG/TCBOH of <* PA/TCBOH) verdunning wordt toegevoegd en vervolgens wordt het buisje 2 uur weggezet bij kamertemperatuur. Aan het buisje wordt 0,1 ml van een geschikte verdunning van een antilichaam tegen TBG/TCBOH of PA/TCBOH toegevoegd. Na 18-24 uur wordt 30 het buisje gecentrifugeerd en de radioactiviteit in 150 ul van de bovenstaande vloeistof wordt gemeten in een vloei-stofscintillatieteller na toevoeging van een scintil-latoroplossing.

35 D. COMPETITIEVE ELISA TOETS

De bepaling wordt uitgevoerd in een microtiterplaat 8601458 -15- met 96 gaten. De gaten worden gevuld met 50 ul oplossing die 1-2 ug PA-TCBOH of TBG-TCBOH complex bevat per ml buffer (140 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 3 mM NaN3>. De plaat wordt, zonder deksel, gedurende een nacht op een temperatuur 5 van 40°C gehouden. De gaten worden dan 5 x met wasbuffer (10 mM Na fosfaat pH 7.4, 140 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 en 0,1 % (w/v) gelatine) gespoeld. De gaten worden gevuld met 200 ul oplossing van 0,05 % IgG in PBS-Tween (0,05 7o) en gedurende 1,5 uur op 37°C verwarmd. De gaten worden 10 weer 5 x met wasbuffer gespoeld. 50 ul serum of serumextract (A) in PBS wordt in de gaten gepipetteerd gevolgd door 50 ul van een geschikte verdunning van polyklonaal of mono-klonaal antiserum tegen PA-TCBOH of TBG-TCBOH in PBS. De plaat wordt 1,5 uur bij 37°C langzaam geschud. De gaten 15 worden weer 5 x gewassen met wasbuffer. In de gaten wordt 0,1 ml geit anti-konijne IgG, gekoppeld aan alkalische fosfatase (in wasbuffer met 5 % feutale ka1verserum), gebracht. De plaat wordt 1,5 uur bij 37°C verwarmd. De gaten worden dan 5 x met wasbuffer gespoeld en vervolgens 2 x met 0,1 20 M diethanolamine pH 9,8. Het substraat (0,1 ml/gat, 10 mM diethanolamine pH 9,8, 1 mM MgCl2, 0,2 mM 4-methylumum-belliferylfosfaat) wordt toegevoegd en weggezet gedurende een nacht bij kamertemperatuur en in het donker. Monsters van 90 ul worden verdund met 1,9 ml stopbuffer (10 mM EDTA, 25: 100 mM diethanolamine pH 9,8) en gemeten in een fluorimeter bij een excitatiegolflengte van 366 nm en een emissie van 443 nm. Uit de remming van de binding van het antilichaam wordt de onbekende concentratie toxische stof berekend. Alternatieve methodes die beschreven zijn voor enzymatisch 30 geconjugeerde IgG en gebruik maken van peroxidase, B-galactosi-dase, glucose oxidase of catalase om de immuuncomplexen te detecteren, kunnen eveneens worden toegepast.

Onderstaand zal worden aangegeven op welke wijze men de vereiste stoffen kan verkrijgen.

86 0 1 -1 sa * Η -16- I. Bereiding van Μ- 5-Hydroxy-3,4,3',4',-tetrachloor-bifenyl (^hJtCBOH)

De synthese van [3h] -3,4,3*,4',-tetrachloorbifenyl 5 ( [3H]tCB) wordt uitgevoerd zoals door Brouwer en Van den

Berg is beschreven, uitgaande van 50 mg 3,3 '-L3H]-d ichloor-benzidine (spec. act. 300 mCi per 50 mg). Het ruwe TCB product wordt gezuiverd zoals is beschreven. Een rat wordt ingespoten (i.p.) met 15 mg/kg [^hJ-TCB. Na een periode van 48 uur wordt bloed afgenomen en serum bereid. Serum wordt geextraheerd zoals onder A is beschreven. De gelabelde verbinding wordt gezuiverd met HPLC. De identiteit van de [3h] gelabelde verbinding wordt met behulp van hoge resolutie massaspectrometrie en NMR technieken vastgesteld 15 0p -5-hydroxy-3,4,3’,41-tetrachloorbifenyl.

II. Bereiding van prealbumine (PA) uit serum

Monsters van 100-500 ul plasma of serum van een rat 20 of andere geschikte diersoort worden gemengd met een gelijke hoeveelheid Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5) plus NaCl (0,2 M) en vervolgens geïnjecteerd op een HPLC systeem voorzien van een gelpermeatiekolom (GPC). De prealbuminefractie, die gescheiden van en volgend op de albuminepiek komt, 25 wordt opgevangen met behulp van een fractieverzamelaar, gedialyseerd en geconcentreerd tot een volume van 50 ul.

Het voorgezuiverde PA concentraat wordt op een preparatieve polyacrylamide gel gebracht en geelectroforeerd. De prealbumine piek (Rf-0,80) wordt uitgesneden en de gel wordt geelueerd 30 in 5 ml aqua dest (24 uur bij 4°C). Het eluaat wordt gevriesdroogd.

III. Bereiding van polyklonale antilichamen tegen complexen van PA en TBG met TCB-OH

35 Een tot tien ug complex van PA (zie II) of TBG met 8801488 ? * -17- TCBOH (PA-TCBOH en TBG-TCBOH) wordt geadsorbeerd aan aluminium-hydroxide en, tesamen met Freunds adjuvants, intracutaan ingespoten bij konijnen. De injecties worden elke 4-6 weken gedaan. Het ontstaan van antilichamen tegen het complex 5 wordt gecontroleerd door regelmatig bloed van de dieren te nemen en in het daaruit verkregen serum een analyse te doen met behulp van immunodiffusie- en immunoelektroforetische technieken. Bij een voldoend hoge titer wordt serum van de dieren bereid en de IgG fracties worden geïsoleerd door 10 een chromatografiestap over een affiniteitskolom met Staphylococcen proteïne A (Schneider et al, J. Biol. Chem. 257 (1982), 81.

IV. Bereiding van monoklonale antilichamen.

15 BALB/c muizen worden geïmmuniseerd zoals onder III is aangegeven. Wanneer een voldoende hoge titer bereikt wordt, dan wordt de milt verwijderd en worden fusies uitgevoerd zoals is beschreven (Kohier en Milstein, Nature (1975) 20 en Eur. J. Immunol. 6 (1976), 511). Positieve klonen worden uitgeselecteerd waarbij antilichamen tegen het complex worden geproduceerd zoals gemeten wordt volgens de onder III beschreven methode.

De positieve klonen worden verder opgekweekt. Weefselkweekmedium 25 of ascitesvloeistof van de positieve klonen wordt verzameld en de IgG fractie daaruit wordt verkregen zoals onder III is beschreven.

Figuurbeschrijving 30

Figuur 1 toont de kinetiek van de verlaging van de serum retinol concentraties in ratten na blootstelling aan 3,4,3',4'-tetrachlorobifenyl.

Uitgezet is de radioactiviteit in het serum van ratten, 35 behandeld met maisolie (O) of met 15 mg TCB/kg (·) tegen de tijd. In het ingevoegde beeld worden de gegevens uitgedrukt als een relatief effect, dat wil zeggen worden de waarden 8601468 -18- uitgedrukt als een fractie van de controle die willekeurig is gesteld op een waarde van 1,0. De tijdsschaal langs de x-as geeft de tijd aan na de behandeling met TCB.

Figuur 2 toont de resultaten van een polyacrylamide gelelectroforese van -^H-retinol bindende proteïnen in ratte-5 serum.

Hoeveelheden ratteserum van 25 /il, verzameld 48 uur na behandeling met maïsolie (A) of 15 mg TGB/kg (B) werden door een polyacrylamide gel gevoerd (7 °L T; 2,6 aL C) . Na electroforese werd de gel tot kleine stukjes van 2 mm gesneden. 10 Hët ^H-retinol label werd uit deze gelstukjes geëxtraheerd met een mengsel van methanol en diisopropylether (1:2) en met LSC geteld.

Figuur 3 toont radioummunochemische lokalisatie van RBP (A) en TTR (B) op een polyacrylamide gel.

15 Hoeveelheden van normaal ratteserum van 50 /A werden op een polyacrylamide gel gebracht (7 % T; 2,6 % C). Na electroforese werd de gel tot kleine stukjes van 2 mm gesneden,’ die in één ml gedestilleerd water (24 uur op 4°C) werden geplaatst om de proteïnen van de gelstukjes te elueren.

20 De eluaten werden verzameld en geanalyseerd op RBP en TTR door middel van de RIA methode (Muto et al, J. Biol. Chem.

247, (1972), 2542-2550). Het minimum detectieniveau voor RBP en TTR bedroeg 20 ng/fractie. Fracties bij Rf 0,04-0,08 en 0,32-0,60 bevatten ook TTR, maar als gevolg van de geringe 25 hoeveelheden (150-250 ng/fractie) vergeleken met de belangrijkste piek bij Rf 0,80 zijn deze hoeveelheden in Fig.

3B niet visueel waarneembaar.

Figuur 4 toont een identificatie van serum ^H-retinol bindende proteïnen op een gradiënt PAGE.

30 Serum monsters, verzameld 48 uur na behandeling van ratten met (A) maisolie (5 ml/kg) of (B) TCB (15 mg/kg).

De radioactiviteitspiek die waargenomen werd bij een migratie van 62 mm, correspondeert met de radioactiviteitspiek 1 die met PAGE (Fig. 2) is waargenomen. De migratie van refe-35 rentieproteïnen onder deze condities, gerelateerd aan hun molecuulgewicht, wordt in het ingevoegde beeld getoond.

83 014 58 9 » -19-

De zwarte stip geeft de plaats aan van het met ^H-retinol gebonden proteïne, dat wil zeggen het RBP-TBPA complex.

TG: thyroglobuline (669000); FT: ferritine (440000); CAT: catalase (232000); LDH: lactaat dehydrogenase (140000); 5 BSA: runderserumalbumine (67000).

Figuur 5 toont de kinetiek van 3,4,3 r,41 — Ph]} tetrachloro-bifenyl ophoping in het serum van ratten.

Ratten werden behandeld op dezelfde wijze als beschreven is voor Fig. 1, behalve dat niet-radioactief gelabeld retinol 10 gebruikt werd om het vitamine A gehalte van de dieren te herstellen. Na 6 dagen op het retinol-houdende dieet werden de ratten behandeld met een intraperitoniale injectie van radioactief gelabeld 3h-tcB (2,5 mCi) in een dosis van 15 mg/kg. Op verscheidene tijdstippen na de injectie werden 15 bloedmonsters uit de ratten verzameld door bloed af te nemen uit de staart onder anaesthesie met ether. De hoeveelheid radioactiviteit in serum hoeveelheden van 50 yul werd gemeten met LSC.

Figuur 6 toont de localisatie van ^H-TCB radioactiviteit 20 op PAGE, gebonden aan plasma proteïnen van de rat.

Een hoeveelheid serum van 25 jul, verzameld 48 uur na behandeling van de ratten met ^jj-TCB werd chromatografisch gescheiden op PAGE zoals beschreven is voor Fig. 2. Een gezuiverd preparaat van prealbumine werd parallel behandeld, 25 waarbij zijn positie op de gel, gemeten door dat deel van de gel te kleuren, correspondeerde met een Rf waarde van 0,82. Metingen van de radioactiviteit in gesneden stukken van de gel werden uitgevoerd op de voor Fig. 2 beschreven wijze. De eerste piek (A) in de figuur lag bij een negatieve 30 Rf waarde, dat wil zeggen in de stacking gel.

Figuur 7 toont een identificatie van ^H-TCB gebonden plasma proteïnen van piek C op gradiënt PAGE.

Een serum monster van 20 ul, verzameld 48 uur na behandeling van ratten met ^H-TCB werd door een gradiënt 35 van polyacrylamide van 4-30 7, gevoerd. In deze bepaalde 86 0 1 4 '3 6 -20- gel zullen proteïnen met een molecuulmassa boven 2000 kD niet in de gel komen, terwijl proteïnen met een molecuulmassa beneden 40 kD van de gel af zullen lopen. Bijgevolg zijn op de gradiënt gel slechts twee radioactiviteitspieken 5 aanwezig, namelijk de pieken B en C op PAGE (Fig. 5), In het ingevoegde beeld wordt de positie van de referentie proteïnen, in relatie tot hun molecuulmassa, gegeven. De zwarte stip duidt de positie van radioactiviteitspiek C op de gradiënt gel aan. Deze proef werd uitgevoerd op de 10 voor Fig. 3 beschreven wijze.

Figuur 8 toont een HPLC analyse van het ^h-tCB label gebonden aan transthyretine.

Een gelextract van een fractie bij een migratie van 72 mm op een gradient PAGE, dat wil zeggen de laatste piek 15 in Fig. 7, gebonden aan transthyretine, werd met HPLC geanalyseerd. De radioactiviteit in HPLC eluaat fracties werd gemeten met LSC. De positie van een zuivere standaard van TCB op het HPLC profiel is in de figuur aangegeven.

Figuur 9 toont een model voor het toxiciteitsmechanisme 20 van PCBs en verwante verbindingen.

Dunne lijnen stellen de normale fysiologische route van vitamine A en thyroide hormoon transport door het serum voor. De dikke lijnen en pijlen vertegenwoordigen de abnormale situatie of de verstoring van het serum transport van retinol 25 door TCB en zijn effecten op vitamine A of de gehaltes aan bindend proteïne. De onderbroken dikke lijnen en pijlen geven mogelijke wijzen van verstoring of voorspelde effecten aan.JRJBPa: apo of ligande (retinol)-vrij RBP; RBPh: holo of ligande-gebonden RBP; TTR: transthyretine; T4: thyroxine; 30 MFO: gemengde functie oxidases; TCB: 3,4,3',4’-tetrachloro-bifenyl; TCB-X:metaboliet van TCB.

De uitvinding zal nader worden toegelicht aan de hand van het hiernavolgende experimentele gedeelte.

A § P 1 .4 b v ^ "J s * -21-

MSTHODEN

Dieren en behandelingen.

5 Sprague Dawley/Rij (Ulm, West-Duitsland) vrouwtjesratten werden in dit onderzoek gebruikt. De dieren werden gefokt onder specifieke pathogeenvrije (SPF) condities (na 20 generaties werd de afkorting Rij gebruikt) en werden gebruikt bij een leeftijd van 3 weken. Ze werden ondergebracht in 10 een ruimte die op een negatieve luchtdruk werd gehouden (3 tot 5 mm beneden atmosferische druk). Er werd een licht-cyclus van 12 uur aangehouden, waarbij de relatieve vochtigheid 55% bedroeg en de kamertemperatuur op 23°C werd gehouden. Ze kregen een vitamine A deficient, gezuiverd dieet (Hope 15 Farms, Woerden, Nederland) gedurende 12-16 weken. Ze kregen voedsel en aangezuurd water met een pH van 3 (om Pseudomonas infecties te verhinderen die zouden kunnen optreden in de verzwakte toestand van de dieren) ad libitum.

Aan het einde van de periode van 12-16 weken waren 20 de retinol gehaltes van het serum afgenomen tot 10 % van de controle waarden, zoals geanalyseerd werd met HPLC. De ratten werden aangevuld met radioactief gelabeld ^H-retinol (Amersham, [ll,12(π)-^η}retinol 149 mCi per milligram retinol) door ze te voederen op een dieet dat 500 /uCi (8000 IU) 25 retinol/kg dieet bevatte. Na 5 dagen waren verzadigingsge-haltes ^H-retinol tellingen in het bloed bereikt, zoals vastgesteld werd door vloeistofscintillatie telling (LSC) van bloedmonsters. Op dag 6 werden de ratten hetzij behandeld met een intraperitoniale dosis van 15 mg/kg TCB (99 % zuiver, 30 dibenzodioxine en furanvrij, verkregen als analytische standaard van Chrompack, Middelburg, Nederland), hetzij met 1 ml/kg maïsolie. Op verschillende momenten na de behandeling met TCB, werd bloed van de dieren verzameld. De hoeveelheid ^H-retinol label werd geanalyseerd door LSC 35 in 50 hoeveelheden serum. Men voegde 50 ^ul methanol en 100 8601468 -22- /j1 diisopropylether toe om retinol van de plasma proteïnen te extraheren. De identiteit van de radioactiviteit werd gecontroleerd door HPLC analyse en bleek aan natief retinol te zijn gekoppeld.

5

Polyacrylamide gelelectroforese (PAGE) PAGE werd uitgevoerd onder natieve condities, gebruik makend van het discontinue systeem van Davis, Ann. Ny. Acad. •lOSci. 121, 1964, 404-427. Men bereidde een scheidingsgel (7 7e acrylamide) in een verticaal slab-gel systeem (LKB), met daarop een laag van een stacking gel (3 % acrylamide). Monsters van 25 ul serum werden gedurende 5 uur bij een constante stroom van 40 mA aan chromatografie onderworpen.

15 Na electróforese werden de gels gedurende 15 minuten bij -20°C gehouden en in stukjes van 2 mm gesneden. De radioactief gelabelde retinoiden werden uit de gel porties geëxtraheerd door toevoeging van een mengsel van 100 yul methanol en 200 yul diisopropylether. Radioactiviteit werd geanalyseerd 20 door LSC metingen.

PAGE in gradiënt gels

Electroforese werd uitgevoerd in een GE-4 electroforese 25 eenheid (Pharmacia), gevuld met een gradiënt gel PAA 4/30 (Pharmacia). Serum monsters van 20 yul werden gedurende 16 uur (4°C) in de gel geleid in een buffer van Tris (0,09 M); boraat (0,08 M); pH 8,35 bij een constante spanning van 125 V. Referentie proteïne monsters van 20 yul (50-100 30/ug/ml) werden parallel doorgevoerd. Na electroforese werden delen van de gel die de referentie proteïnen bevatten, verwijderd om te worden gekleurd (60 minuten in een 0,04 % Coomassie Brilliant Blue G250 in 3,5 7,-ige perchloorzuur oplossing, gevolgd door ontkleuring met 7 % azijnzuur geduren-35de 24 uur). De rest van de gel werd gedurende 15 minuten bij -20°C gehouden en in stukjes van 1 mm gesneden. Extractie 8601453 -23- en LSC metingen van ^H-retinol werden uitgevoerd zoals beschreven voor Fig. 2.

Synthese van radioactief gelabeld ^H-TCB 5

Radioactief gelabeld ^H-TCB werd in essentie bereid volgens de procedure van Nakatsu et al, J. Chromatogr.

239, 1982, 97-106, waarbij radioactief gelabeld 3,3’- [?h[-dichlorobenzidine (NEN, 300 mCi per 50 mg van de verbinding) 10 als voorloper werd gebruikt. Deze bereidingsmethode vermijdt de vorming van gechloreerde dioxinen en -furanen als bijpro-dukten. Zuivering van het ruwe preparaat werd uitgevoerd op een C18-silica preparatieve kolom (lengte 20 cm), inwendige diameter 1 cm, deeltjesgrootte 0,25-0,42 mm), door elutie 15 met 50 ml mengsels van methanol en water in verhoudingen van 70/30; 80/20; en 90/10. Eluaat fracties werden verzameld en met HPLC geanalyseerd. Identificatie van het gezuiverde produkt was gebaseerd op cochromatografie met een zuivere TCB standaard op HPLC met verschillende samenstellingen 20 van de mobiele fase. De eluaat fracties die TCB bevatten, werden verzameld, gedroogd onder een stikstofstroom en opnieuw opgelost in aceton (100 7a). Het verkregen eindprodukt had een zuiverheid van meer dan 95 % en een specifieke activiteit van 6-8 mCi/mg.

25

Extractie en analyse van radioactief gelabeld retinol en TCB in serum en in gel eluaat fracties door HPLC

Extractie en analyse door HPLC van retinol werden 30 in essentie uitgevoerd volgens de methode van Brouwer en Van de Berg, Toxicol. Appl. Pharmacol. 73, 1984, 204-209.

Deze extractie en -analysemethoden bleken ook voor TCB gunstig te zijn. Kortgezegd werden de extractie van zowel retinol als van TCB uitgevoerd door toevoeging van 1 volume-35 deel methanol en twee volumedelen diisopropylether aan 850146Ë -24- serum of aan eluaten van gel fracties. Na mengen (Vortex) werd gedurende 24 uur bij -20°C geëxtraheerd. De organische fase werd verzameld, drooggedampt onder een stroom stikstof (0,5 1/min) en opnieuw opgelost in een kleine hoeveelheid 5 (50 /j1) diisopropylether. Van deze uiteindelijke extracten werden porties van 10-25 yul geanalyseerd met HPLC, gebruikmakend van een radiaal gepakte C18 analytische kolom (Waters Ass., 5 yum, lengte 100 mm; inwendige diameter 8 mm), voorzien van een RCSS C18 Guard Pak voorkolom. De analytische kolom 10 en de voorkolom werden onder een radiale druk gehouden met een radiale compressie module (Waters Ass.). Elutie van ^h-TCB en ^H-retinol radioactiviteit werd uitgevoerd met een isocratisch mengsel van methanol en water (90:10).

De stroomsnelheid bedroeg 2,0 ml/min. met een maximale 15 drukopbouw van 10,3 MPa. Het HPLC eluaat werd verzameld in fracties van 1 ml met behulp van een Helirac fractie collectie systeem (LKB). De eluaat fracties werden gemengd met 2 ml scintillatie vloeistof (Instagel, Packard) en geteld met LSC.

20

Radioimmunochemische analyse van serum RBP en TTR in PAGE gel fracties

Hoeveelheden serum van 25 yul werden aan PAGE (7 °L 25 T, 2,6 C) onderworpen. Na electroforese werd de gel in kleine stukjes van 2 mm gesneden, welke stukjes gedurende 24 uur bij 4°C in 1 ml gedestilleerd water werden gebracht (om elutie van proteïnen uit de gelstukjes mogelijk te maken). De proteïne eluaten werden op RBP en TTR geanalyseerd 30 door een radioimmunochemische (RIA) methode, beschreven door Muto et al, J. Biol. Chem. 247, 1972, 2542-2550.

RESULTATEN

35 Interferentie van TCB met het plasma transport systeem voor vitamine A

S 6 0 1 4 6 8 -25- .

Het effect van TCB op het plasma transport systeem voor vitamine A werd geanalyseerd met PAGE, gebruikmakend van ^H-retinol om de positie van de drager proteïnen op de gel te localiseren. Öm een significante hoeveelheid 5 aan plasma proteïnen gebonden ^H-retinol label te verkrijgen, werden ratten gebruikt met een vitamine A tekort, die aangevuld waren met een ^H-retinol bevattend dieet totdat verzadi-gingsniveaus waren bereikt. In ratten die aan TCB waren blootgesteld, bleek de hoeveelheid %-retinol label in 10 het plasma snel af te nemen, waarbij zijn laagste niveaus na 24 uur waren bereikt (Fig. 1). Daarna bleken de retinol concentraties geleidelijk te stijgen tot de controlewaarden die binnen 7 tot 10 dagen bereikt waren.

Om retinol drager proteïnen in het serum te identificeren, 15 werd een electroforese onder natieve condities in een 7 % polyacrylamide gel (PAGE) uitgevoerd. In het systeem worden verscheidene serum proteïnen goed gescheiden, terwijl de identiteit van veel proteïnen bekend is. Retinol bindende proteïnen werden geïdentificeerd door a) LSC metingen van 20 de radioactiviteit in gesneden plakjes van de gels, en b) door radioimmunochemische analyse van RBP en TTR in proteïne eluaten van gel fracties. Fig. 2A toont het profiel van de ^H-retinol radioactiviteit, gebonden aan serum proteïnen. Er werden twee radioactiviteitspieken waargenomen, die 25 op de gel gelegen waren bij Rf-waarden van resp. 0,04-0,08 en 0,32-0,36. Met deze Rf-waarden corresponderende gel fracties bevatten RBP, zoals bepaald werd door radioimmuno-analyse, waaruit blijkt dat de twee radioactiviteitspieken in Fig. 2A de twee retinol bindende entiteiten in plasma 30 voorstellen. TTR was bij de Rf-waarden van 0,04-0,08 en 0,32-0,36 aanwezig in geringe gehaltes (150-250 ng/fractie).

De geringe hoeveelheden TTR op deze posities van de gel, vergeleken met de hoeveelheid TTR bij een Rf-waarde van 0,80-0,88, waar dit eiwit voornamelijk werd aangetroffen, 35 verhinderen een visuele identificatie van deze ondergeschikte §601453 -26- pieken in Fig. 3B. Op basis van immunochemische gegevens kon niet worden uitgemaakt welke van de beide pieken in de Figuren 2A en 3A RBP of het RBP-TTR complex voorstellen.

Het is echter bekend dat gezuiverd RBP in het o(-gebied 5 van plasma proteïnen is gelocaliseerd na PAGE onder identieke chromatografische condities. Deze ligging correspondeert goed met de positie van de tweede piek in de figuren 2A en 3A, zodat piek 2 RBP voorstelt terwijl de eerste piek met het RBP-TTR complex correspondeert.

10 Voor de zekerheid werd piek 1 nader gekarakteriseerd door electroforese in een 4-30 % gradiënt van polyacrylamide, waarin de scheiding plaatsvindt op basis van de molecuulmassa. Fig. 4A toont dat de radioactiviteit van piek 1 op de gradiënt gel in een enkele piek resulteert. Omdat de hier gebruikte 15 gradiënt gel een molecuulmassa begrenzing van 40 kilodalton had, is RBP met een molecuulmassa van 21 kD van de gel afgelopen. De schijnbare microheterogeniteit van de radioactiviteit in de piek is vermoedelijk te wijten aan het snijden van de gel in kleine fracties. De positie van de radioactivi-20 teit van piek 1 correspondeert met een proteïne met een molecuulmassa van 85-90 kD, zoals in het ingevoegde beeld in Fig. 1 wordt getoond. Dit stemt goed overeen met de eerder vermelde molecuulmassa voor het RBP-TTR complex van 80-90 kD zoals geschat op basis van gel filtratie resul-25 taten. Daaruit werd geconcludeerd dat piek 1 het RBP-TTR complex voorstelt.

Het effect van TCB op het transport van retinol door zijn dragers wordt in de Figuren 2B en 4B (RBP-TTR complex) getoond. Beide radioactiviteitspieken in de gel zijn 48 30 uur na behandeling met TCB in hoge mate verkleind. Zoals getoond in Fig. 4B, verloor het RBP-TTR drager complex nagenoeg 90 7« van zijn oorspronkelijke radioactiviteit binnen 48 uur na de behandeling met TCB. De kinetiek van het effect van TCB op de binding van retinol aan zijn proteïnen 35 correleert goed met de effecten op de plasma retinol concentraties .

860 1 4 S 8 -27-

Binding van ^H-TCB aan plasma proteïnen

De mogelijke binding van TCB aan plasma proteïne componenten werd onderzocht met ^-gelabeld TCB in eenzelfde 5 experiment als beschreven is voor de identificatie van retinol bindende proteïnen, behalve dat niet-radioactief retinol gebruikt werd om de ratten met vitamine A tekort aan te vullen. De ratten werden intraperitoniaal geïnjecteerd met 2,5 mCi (15 mg/kg) ^H-TCB. De hoeveelheid radioactiviteit 10 in het bloed werd op verschillende momenten na de behandeling geanalyseerd. Fig. 5 toont de kinetiek van de ophoping van het ^h-TCB label in het serum, met een maximum na 48 uur na de behandeling. Analyse van de radioactief gelabelde componenten met HPLC liet zien dat 8 uur na de injectie 15 meer dan 90 % van ^H-TCB aanwezig was in de vorm van twee metabolieten, waarvan de grootste bij een retentie-tijd van 2,0 min. en de kleinste bij een retentie-tijd van 3,5 min.

De binding van ^H-TCB aan plasma proteïnen werd geanaly-20 seerd met PAGE onder natieve condities. Het in Fig. 6 weergegeven profiel van de ^H-TCB gebonden radioactiviteit toont 4 radioactiviteitspieken, waarvan de twee hoofdpieken (A en C) gelegen zijn bij Rf-waarden van -0,05 en 0,82 en de twee kleinere pieken (B en D) gelegen zijn bij waarden 25 van 0,68 en 1,00. Piek A, die meer dan 60 % van de 48 uur na behandeling met TCB in serum aangetroffen radioactiviteit voorstelt, bevindt zich in de stacking gel waar ook chylomicrons en andere lipoproteïnen worden aangetroffen. Piek B, die ongeveer 4 % van de radioactiviteit bevat, migreert 30 samen met serumalbumine, terwijl piek D (8 %) niet-gebonden radioactiviteit zou kunnen voorstellen. Piek C echter bevat 25 7o van de totale radioactiviteit in serum na 48 uur na de behandeling en zijn positie correspondeert met de positie van een gezuiverd TTR monster (Rf 0,82), dat parallel werd 35 doorgevoerd.

Door a) radioimmunochemische identificatie van TTR

8201 4 o S

-28- in PAGE fracties en door b) bepaling van de molecuulmassa van piek C, gebruikmakend van gradiënt PAGE onder natieve condities werd verder bewijs verkregen voor het feit dat het aan piek C radioactiviteit gebonden proteïne TTR voorstelt.

5 Zoals in Fig. 3B wordt getoond,'werd TTR in grote hoeveelheden gedetecteerd in gel fracties bij Rf van 0,80-0,88, hetgeen goed correspondeert met de positie van de piek C radioactiviteit in Fig. 6. In Fig. 7 wordt het radioactiviteitsprofiel van piek C op de 4-30 % gradiënt gel getoond. Een onderge-10 schikte hoeveelheid radioactiviteit werd bij een migratie van 65 mm gevonden, en correspondeert met de piek B radioactiviteit van Fig. 6. Piek C werd gevonden bij een migratie van 72 mm, hetgeen correspondeert met een molecuulmassa van 52-57 kD, zoals in het in Fig. 7 ingevoegde deel wordt 15 getoond. Deze geschatte molecuulmassa van het aan de radioac-tiviteitspiek C gebonden proteïne stemt goed overeen met de eerder vermelde molecuulmassa voor TTR van 55 kD. Gebaseerd op deze gegevens kon worden aangenomen dat het aan de radioac-tiviteitspiek C gebonden proteïne TTR voorstelt. De kinetiek 20 van de aan TTR gebonden TCB radioactiviteit vertoonde een omgekeerde correlatie met de door TCB veroorzaakte verlaging van de serum retinol gehaltes.

Om te identificeren of natief TCB of een van zijn metabolieten aan TTR was gebonden, werden eluaten van plakjes 25 van de gradiënt gel met HPLC geanalyseerd. Zoals in Fig.

8 wordt getoond, werd de radioactiviteit aangetroffen in fractie 4, die correspondeert met een Rt-waarde van 2,0 min., waaruit blijkt dat een metaboliet van TCB aan TTR was gebonden. Door massaspectrometrie werd vastgesteld 30 dat deze metaboliet een 5-hydroxy derivaat van het 3,4,3’,41-tetrachloorbifenyl was.

8801*64

Claims (6)

1. Complexen van een thyroxine bindend proteïne, zoals het thyroxine bindend prealbumine (PA) en het thyroxine bindend globuline (TBG), met lichaamsvreemde stoffen, zoals polychlorobifenylverbindingen (PCBs), polybromobifenylverbin- 5 dingen (PBBs) en polychloro-dibenzo-para-dioxinen (PCDDs), of metabolieten daarvan.

2. Polyklonale en monoklonale antilichamen met specificiteit voor complexen volgens conclusie 1.

3. Kit voor biologische monitoring van lichaamsvreemde 10 stoffen in humane en dierlijke lichaamsvloeistoffen, zoals serum, plasma, urine, liquor, en melk, of voor bepaling van de mogelijke toxiciteit van lichaamsvreemde stoffen, omvattende (a) een gezuiverd thyroxine bindend proteïne, en een radio-15 actief gelabelde lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan; of b) een gezuiverd thyroxine bindend proteïne, en radioactief gelabeld thyroxine; of c) een radioactief gelabelde lichaamsvreemde stof of 20 metaboliet daarvan, en antilichamen tegen de lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan; of d) een complex van een thyroxine bindend proteïne met een radioactief gelabelde lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan, en antilichamen tegen het complex; of 25 e) een complex van een thyroxine bindend proteïne met een lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan, en antilichamen tegen het complex, en een enzym-gelabeld anti-antiserum.

4. Werkwijze voor het bepalen van toxische stoffen in humane en dierlijke lichaamsvloeistoffen, zoals serum, 3Q plasma, urine, liquor en melk, door een monster van de lichaamsvloeistof, of een extract daarvan, a) aan een competitieve radioreceptor (CRR) analyse te onderwerpen waarbij 3801*58 -30- met gezuiverd thyroxine bindend proteïne en een radioactief gelabelde lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan wordt ge'incubeerd; of b) aan een CRR analyse te onderwerpen waarbij met gezuiverd 5 thyroxine bindend proteïne en radioactief gelabeld thyroxine wordt geïncubeerd; of c) aan een competitieve radioimmuunanalyse (CRIA) te onderwerpen waarbij met een radioactief gelabelde lichaamsvreemde stof of een metaboliet daarvan en antilichamen 10 daartegen wordt geïncubeerd; of d) aan een CRIA te onderwerpen waarbij met een complex van een thyroxine bindend proteïne met een radioactief gelabelde lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan, en antilichamen tegen het complex wordt geïncubeerd; of 15 e) aan een competitieve enzym-gelabelde immunosorbens analyse (comp. ELISA) te onderwerpen, waarbij een complex van een thyroxine bindend proteïne met een lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan, alsmede antilichamen tegen het complex en een enzym-gelabeld anti-antiserum worden 20 toegepast.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij als lichaamsvreemde stof of metaboliet daarvan 5-hydroxy- 3,4,31,4-'-tetrachlorobifenyl wordt toegepast.

6,. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, waarbij een extract 25, van een lichaamsvloeistof wordt toegepast, dat verkregen is door de lichaamsvloeistof te extraheren met een mengsel van diisopropylether en methanol met een volumeverhouding diisopropylether/methanol van ongeveer 2/1 en het na droog-dampen van de diisopropylether fase verkregen residu op 30 te lossen in methanol. 85 λ 4 a 3 Q tl y « *4 0 0 i i .1