DE68922123T2

DE68922123T2 - Nachweis von Chemikalien mittels Immuntestverfahren.

Info

Publication number: DE68922123T2
Application number: DE68922123T
Authority: DE
Inventors: David William Britton; Michael John Wraith
Original assignee: Biocode Inc
Current assignee: Authentix Inc
Priority date: 1988-02-02
Filing date: 1989-01-25
Publication date: 1995-11-30
Anticipated expiration: 2009-01-26
Also published as: IN174248B; CA1340594C; BR8900409A; AR241825A1; FI890460A; ATE121192T1; AU2894689A; EP0327163A2; NO890403L; PT89572A; EP0327163B1; CN1071454C; HUT66852A; JPH01227059A; CN1037969A; OA09230A; EP0327163A3; IE68407B1; ES2073426T3; KR0150193B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von chemischen Marker-Verbindungen mittels Immunoassay und ein Assay-Set, das die Durchführung eines derartigen Nachweises an Ort und Stelle ermöglicht. Die Erfindung richtet sich insbesondere, wenn auch nicht ausschließlich, auf den Nachweis von Marker- Verbindungen in flüssigen Produkten, insbesondere Produkten auf Ölbasis wie z.B. Schmierölen.
Ein in vielen Teilen der Welt und in Verbindung mit vielen verschiedenen Produkten auftretendes Hauptproblem ist jenes der Produktfälschung.
In aller Welt versehen Händler die von ihnen verkauften Materialien mit einem charakteristischen, visuellen Merkmal, damit Kunden ihre Materialien von jenen anderer unterscheiden können. In der Folge lernen ihre Kunden das charakteristische, visuelle Merkmal des Materials mit gewissen Qualitätsstandards in Verbindung zu bringen, und falls sie mit diesen Standards zufrieden sind, geben sie beim Kauf Materialien, die dieses charakteristische, visuelle Merkmal aufweisen, gegenüber anderen den Vorzug.
Sobald Kunden einmal eine Präferenz für ein bestimmtes, charakteristisches, visuelles Merkmal aufweisende Materialien entwickelt haben, sind die Händler Produktfälschung ausgesetzt.
Ein nachgeahmtes Produkt besteht aus einem Material, das ein zu jenem des Originalprodukts verwechselbar ähnliches, charakteristisches, visuelles Merkmal aufweist. Kunden, die das charakteristische, visuelle Merkmal der Nachahmung sehen, kaufen dieses Material in der Erwartung, daß sie ein echtes bzw. Original-Produkt erstehen.
Es sind viele Wege bekannt, Materialien mit einem charakteristischen, visuellen Merkmal zu versehen. Im allgemeinen weist entweder das Material selbst oder ein Gegenstand, der mit dem Material verbunden ist, wie z.B. ein Aufkleber, eine Hülle oder ein Behälter, das charakteristische, visuelle Merkmal auf. Das charakteristische, visuelle Merkmal kann beispielsweise eine charakteristische Form oder Gestaltung, eine charakteristische Markierung oder eine Kombination beider sein. Ein besonders bevorzugtes, charakteristisches, visuelles Merkmal ist ein Warenzeichen.
Das Material einer Nachahmung kann dasselbe oder ein anderes Material als das eines Originalprodukts sein. Häufig ist das Material der Nachahmung dasselbe, jedoch von minderer Qualität.
Es gibt viele Arten der Produktfälschung. Bei einer versieht der Nachahmer sein nachgeahmtes Material mit einem charakteristischen, visuellen Merkmal, das eine Kopie jenes des Originalprodukts ist. In anderer Weise verfälscht oder ersetzt der Produktfälscher das Material eines Originalprodukts, ohne das charakteristische, visuelle Merkmal, mit dem das Material des Originalprodukts versehen wurde, zu beeinträchtigen.
Ein Beispiel für ein derartiges Problem liegt in der Verfälschung von Schmierölen oder anderen Produkten auf Ölbasis durch Zugabe des Öls eines Nachahmers zu einem Originalprodukt. Eine derartige Verfälschung fügt dem Ölhersteller nicht nur finanziellen Schaden zu, sondern es kann auch die gegebenenfalls auftretende, nachfolgende Leistungsminderung eine Schädigung des Kundens bedeuten und in der Folge dem guten Ruf des Originalprodukts schaden.
Ein Verfahren zur Lösung dieses Problems wurde bereits vorgeschlagen, das den Einbau von Farbstoff in das Produkt umfaßt. Eine derartige Vorgangsweise ist leicht zu kopieren. Falls jedoch ein Marker eingebaut wird, der auf visuellem Weg nicht leicht nachzuweisen ist, müssen gegebenenfalls Proben des Produkts, das unter Umständen verfälscht wurde, zur physikalischen Analyse, beispielsweise nach chromatografischen Verfahren, zu einem Basislabor zurückgesandt werden, bevor man das Ausmaß der Verfälschung, falls vorhanden, bestimmen kann. Die resultierende Verzögerung ist beispielsweise für einen Händler in einer Gegend, wo es kaum die Möglichkeiten eines rückendeckenden Labors gibt, unangenehm und senkt die Wirksamkeit der Methode zur Abschreckung von Nachahmern.
Es besteht offensichtlich Bedarf an einem Verfahren, das auf dem Gebiet des Nachweises von versuchten Produktfälschungen eingesetzt werden kann.
EP-A-0.260.829 offenbart monoklonale und polyklonale Antikörper, die zur Identifikation von chlorierten Phenolen, insbesondere Pentachlorphenol, in Materialien und zur Bestimmung der Konzentration der Chemikalie in diesen Materialien verwendet werden können. Es wird in der Einleitung der Beschreibung angemerkt, daß Pentachlorphenol Materialien als Pestizid oder Konservierungsmittel zugesetzt wird. EP- A-0.260.829 offenbart jedoch nicht die Identifikation von chlorierten Phenolen in Produkten, d.h. Materialien, die mit einem charakteristischen, visuellen Merkmal versehen sind. Weiters offenbart EP-A-O.260.829 nicht die Verwendung von chlorierten Phenolen als Markerverbindungen. Insbesondere offenbart EP-AO.260.829 nicht die Verbindung eines chlorierten Phenols mit einem Originalprodukt, um dieses von einem Nachahmungsprodukt zu unterscheiden.
Bei einer Bildpräsentation von M.J. Wraith et al. beim 6. Internationalen Kongress der Pestizidchemie, am 10. - 15. August 1986 in Ottawa, Kanada, mit dem Titel: "Entwicklung von Immunoassay-Verfahren für Pyrethoid-Insektizide" wurden Proteinkonjugate von m-Phenoxybenzoesäure und Dichlorvinylcyclopropancarbonsäure und unter Verwendung dieser Proteinkonjugate hergestellte polyklonale Antikörper vorgestellt. Ebenso wurde die Analyse von Cypermethrin-Metaboliten, m- Phenoxybenzoesäure und Dichlorvinylcyclopropancarbonsäure in Schwarztee, Wasser und Erdreich beschrieben. Es wurde jedoch weder die Verwendung von entweder m- Phenoxybenzoesäure oder Dichlorvinylcyclopropancarbonsäure als Markerverbindung noch der Nachweis mittels Immunoassay einer der beiden Verbindungen in irgendeinem mit einem charakteristischen, visuellen Merkmal versehenen Material beschrieben.
Gemäß vorliegender Erfindung stellen die Autoren ein Verfahren zum Bestimmen der Echtheit eines Produkts bereit, umfassend:
Assoziieren einer Markerverbindung mit dem Produkt, um dadurch ein "echtes" Produkt herzustellen, wobei die mit dem Produkt assoziierte Markerverbindung visuell nicht bestimmbar ist; anschließend
Bereitstellen einer Probe aus einem Testprodukt, dessen Echtheit bestimmt werden soll, die, gelöst in wäßrigem Medium, jegliche der mit dem Testprodukt assoziierten Markerverbindungen enthält;
Identifizieren jeder der Markerverbindungen in der Probe durch einen für den Marker spezifischen Immunoassay; und
Vergleichen des Ergebnisses des Immunoassays, der mit der Probe aus dem Testprodukt durchgeführt wurde, mit jenem, das erhalten wird, wenn derselbe Immunoassay mit einer Probe aus dem "echten" Produkt in wäßrigem Medium durchgeführt wird.
Es ist anzumerken, daß die Markerverbindung mit dem Produkt auf vielerlei Arten assoziiert sein kann. So kann die Markerverbindung in oder auf dem gesamten Produkt oder einem Teil davon, oder zur Gänze oder teilweise in oder auf einem oder einer mit dem Produkt assoziierten Aufkleber, Hülle oder Behälter vorhanden sein. Die Markerverbindung wird üblicherweise mit dem Produkt vermischt, kann jedoch alternativ dazu getrennt vom Produkt vorhanden sein, beispielsweise in der Verpackung oder dem Etikett des Produkts.
Das Produkt kann fest oder flüssig sein. Beispiele für feste Produkte umfassen pharmazeutische Tabletten, Kapseln und Pulver; feste Formulierungen von landwirtschaftlichen Chemikalien, wie z.B. Insektiziden, Herbiziden, Fungiziden und Düngern; Textilien, wie z.B. Bekleidung; Aufnahmeträger, wie z.B. Schallplatten, Tonbänder, Disketten und Cds; Elektrogeräte, wie z.B. Fernsehapparate, Computer und Radios; Kraftfahrzeugteile und Kameras.
Beispiele für flüssige Produkte sind u.a. Produkte auf Ölbasis, wie z.B. Schmieröle, Benzin, Diesel und flüssige Erdölprodukte; Farben; Parfums; Kosmetika; Getränke, wie z.B. Wein, Whisky, Sherry, Gin und Wodka; flüssige pharmazeutische Formulierungen, wie z.B. Sirupe, Emulsionen und Suspensionen; flüssige landwirtschaftliche Chemikalien und industrielle Lösungsmittel. Das Produkt ist vorzugsweise flüssig, vorzugsweise ein Produkt auf Ölbasis, wie z.B. ein Schmieröl.
Die Markerverbindung sollte visuell nicht nachweisbar und im wesentlichen wasserlöslich sein. Natürlich sollte die Markerverbindung auch mittels Immunoassay nachweisbar und mit dem Produkt, das sie markiert, verträglich sein. Vorzugsweise ist sie ungiftig. Ein Fachmann auf dem Gebiet der Immunoassay-Technik könnte problemlos Verbindungen identifizieren, die sich zur Verwendung als Markerverbindungen eignen.
Üblicherweise sind Verbindungen, die sich zur Verwendung als Markerverbindungen eignen, organische Verbindungen aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen und einem oder mehreren Heteroatomen, ausgewählt aus Sauerstoff und Stickstoff, und Salze davon. Gegebenenfalls können auch ein oder mehrere andere Heteroatome enthalten sein, wie z.B. Chlor-, Brom- oder Iodatome, Phosphoratome oder Schwefelatome. Bevorzugte organische Verbindungen sind Carbonsäuren, Carbonsäureester, Ketone, Alkohole, Phenole, Amine, Aniline, Nitrile und Ether, sowie Salze davon. Besonders bevorzugte Verbindungen sind aromatische Carbonsäuren, wie z.B. Benzoesäuren; Phenole; Ether von mehrwertigen Alkoholen und Phenolen; Aminosäuren; Peptide; Proteine; Lipide; Kohlenhydrate, wie z.B. Zucker und Polysaccharide; Nukleinsäuren; und Polynukleinsäuren, wie z.B. Desoxyribonukleinsäuren und Ribonukleinsäuren.
Wenn das Produkt ein Produkt auf Ölbasis ist, wie z.B. ein Schmieröl, weist die als Markerverbindung verwendete Verbindung vorzugsweise einen logP im Bereich von -2,5 bis +5,0, vorzugsweise -1,5 bis 4,5, noch bevorzugter 0 bis 4,0, auf. (LogP bezeichnet hierin den Logarithmus des Verteilungskoeffizienten einer Verbindung zwischen Octanol und Wasser bei 25ºC.) So hat m-Phenoxybenzoesäure beispielsweise einen logP von 3,9.
Es ist möglich, Antikörper zu produzieren, die für eine bestimmte optisch aktive Form einer Verbindung selektiv sind. Da es nach herkömmlichen Verfahren schwierig ist, zwischen optisch aktiven Formen von Verbindungen zu unterscheiden, insbesondere wenn nur Spuren der Verbindung für die Analyse zur Verfügung stehen, kann die Verwendung von optisch aktiven Markerverbindungen besonders vorteilhaft sein.
m-Phenoxybenzoesäure erwies sich als eine zum Einsatz als Markerverbindung geeignete Verbindung, es ist jedoch klar, daß sich eine breite Vielfalt an Verbindungen für diese Zwecke eignet, solange diese mit dem zu markierenden Produkt verträglich und unschädlich sind. So wird, je nach dem zu markierenden Produkt, die Verwendung von ölverträglichen, wasserverträglichen und feststoffverträglichen Verbindungen ins Auge gefaßt.
Wenn das Produkt eine Flüssigkeit ist, ist die Markerverbindung vorzugsweise farblos und im flüssigen Produkt löslich, sodaß ihre Gegenwart nur mittels nachfolgenden Assays nachweisbar ist. Vorzugsweise ist sie auch geruchlos.
Vorzugsweise werden nur Spurenmengen des Markers eingesetzt. Typischerweise wird ein Marker in ein Produkt in einer Konzentration im Bereich von 1 ppb bis 25 ppm eingearbeitet. Vorzugsweise liegt die Konzentration im Bereich von 100 ppb bis 15 ppm, noch bevorzugter 1 ppm bis 10 ppm. So kann die Konzentration an Markerverbindung beispielsweise bis hinauf zu etwa 10 ppm betragen; je nach Markerverbindung können aber selbst einige wenige ppb zum Nachweis ausreichen.
Die Möglichkeit, Konzentrationen der Markerverbindungen von 25 ppm oder darunter nachweisen zu können, ist ein besonderer Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. So brauchen nur geringe Mengen an Markerverbindung eingesetzt zu werden.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Produkt auf Ölbasis bereit, das u.a. 1ppb bis 25 ppm einer visuell nicht nachweisbaren, im wesentlichen wasserlöslichen Markerverbindung mit einem logP im Bereich von -2,5 bis 5,0 bereit.
Falls die Markerverbindung zusammen mit dem Produkt in wäßrigem Medium enthalten ist, kann der Immunoassay direkt an einer Probe davon durchgeführt werden, falls notwendig, nach Filtration, um Feststoffe zu entfernen. Ansonsten muß die Markerverbindung in eine wäßrige Lösung umgewandelt werden.
Im allgemeinen umfaßt die Bereitstellung einer Probe von Markerverbindung in wäßriger Lösung einen oder mehrere Schritte, ausgewählt aus Solventextraktion der Markerverbindung aus dem Produkt; Verdünnung des Produkts mit einem wäßrigen Lösungsmittel; Filtration; Verdampfung; und Festphasen-Extraktion der Markerverbindung, wie z.B. Reinigung der Markerverbindung unter Verwendung von Ionenaustausch-Harz oder -Chromatografie, z.B. unter Verwendung von Kieselgel. Im Fall eines markierten Produkts auf Ölbasis scheint Solventextraktion notwendig zu sein.
Das zur Extraktion der Markerverbindung aus dem Produkt vor dem Assay ausgewählte Lösungsmittel hängt natürlich von der Beschaffenheit des Produkts und des Markers ab. Je nach der Beschaffenheit des Produkts und des Markers umfaßt das Lösungsmittel im allgemeinen einen oder mehrere von: Wasser; Kohlenwasserstoffen, wie z.B. Benzol, Toluol, Xylol, Hexan, Heptan und Octan; Sulfoxide wie z.B.
Dimethylsulfoxid; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie z.B. Chlorbenzol, Methylenchlorid, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff; Ether, wie z. B. Diethylether, Dioxanund Tetrahydrofuran; Amide, wie z.B. Dimethylformamid und Dimethylacetamid; Nitrile, wie z.B. Acetonitril; Alkohole, wie z.B. Methanol, Ethanol und Propanol; Ester, wie z.B. Ethylacetat; und Ketone, wie z.B. Aceton. Vorzugsweise umfaßt das Lösungsmittel Wasser und/oder ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel. Beim Testen von mit m-Phenoxybenzoesäure markierten Schmierölen ist ein geeignetes Lösungsmittel zur Extraktion ein Gemisch aus einem Verdünner für das Öl, wie z.B. Hexan, einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Acetonitril, und Wasser. Gegebenenfalls kann das Lösungsmittel zur Extraktion auch Puffersalze, wie z. B. Tris-Puffer [Tris(hydroxymethyl)aminomethan], enthalten. Das eingesetzte Lösungsmittelsystem liefert die extrahierte Markerverbindung in einer wäßrigen Phase, die sich direkt für den anschließenden Immunoassay eignet.
Der Immunoassay wird unter Verwendung eines zuvor hergestellten Antikörpers gegen die gewählte Markerverbindung durchgeführt. Ein derartiger Antikörper wird nach bekannten Verfahren erzeugt, die es ermöglichen, für eine bestimmte Verbindung spezifische, monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erhalten. Vorzugsweise werden monoklonale Antikörper eingesetzt.
Antikörper sind Proteine, die in Tieren als Reaktion auf das Ausgesetztsein des Tieres gegenüber fremden Verbindungen (Antigenen) von antikörper-produzierenden Zellen erzeugt werden, die als B-Lymphozyten bekannt sind. Diese Antikörper binden sich spezifisch an die jeweilige Verbindung, die deren Produktion angeregt hat.
Antikörper-produzierende Zellen entstehen in der Milz eines Tieres, nachdem dieses mit einer immunogenen Verbindung immunisiert wurde. Nicht alle Verbindungen sind immunogen. Im allgemeinen sind Verbindung mit einem Molekulargewicht von unter 2000 nicht immunogen. Es können jedoch Antikörper erhalten werden, die für derartige Verbindungen (bekannt als Haptene) spezifisch sind, indem das Hapten chemisch an einen größeren immunogenen Träger, wie z.B. ein Kohlenhydrat oder ein Protein, gebunden und ein Tier mit dem resultierenden immunogenen Konjugat immunisiert wird.
Das Anbringen von Hapten an einen immunogenen Träger kann unter Verwendung eines bifunktionellen Moleküls in einer chemischen Zweistufen-Reaktion erreicht werden. Das sorgt für einen Spacer-Arm zwischen Hapten und Träger, was die Immunreaktion verbessern kann. Um die Verbindung chemisch an den Träger oder das bifunktionelle Molekül zu binden, sollte sie selbst eine fuktionelle Gruppe enthalten. Bevorzugte funktionelle Gruppen sind Amino-, Hydroxyl- und Carboxylgruppen.
Bei Immunisierung eines Tieres mit einer immunogenen Substanz wird eine breite Vielzahl an verschiedenen antikörper-produzierenden Zellen angeregt. Die durch eine derartige Reaktion produzierten Antikörper sind als polyklonale Antikörper bekannt.
Gegen eine bestimmte Verbindung gebildete polyklonale Antikörper binden sich nicht alle mit derselben Spezifität an diese Verbindung. Es ist aber möglich, Antikörper zu erhalten, die sich alle mit derselben Spezifität und Affinität an eine Verbindung binden. Diese Antikörper sind als monoklonale Antikörper bekannt.
Um derartige monoklonale Antikörper zu erhalten, werden zuerst antikörperproduzierende Zellen aus der Milz eines immunisierten Tieres extrahiert. Diese Zellen werden anschließend mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridome zu erzeugen. Die Fusion kann beispielsweise durch Behandlung mit Polyethylenglykol erreicht werden. Die Hybridome sind wie die antikörper-produzierenden Vorläufer-Zellen in der Lage, Antikörper zu produzieren, sind jedoch unsterblich; sie sind zu kontinuierlicher Vermehrung in vitro befähigt. Für den Fachmann ist eine Reihe von zur Fusion mit antikörper-produzierenden Zellen geeigneten Myelomzel len bekannt und leicht erhältlich. Ein Beispiel für eine geeignete, leicht erhältliche Myelomzelle ist PX3-63- AGB-653. Diese Zelle ist beispielsweise von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter der Nummer ATCC CRL 1580 erhältlich.
Nach der Fusion der antikörper-produzierenden Zellen und der Myelomzellen werden die resultierenden Hybridomzellen von den nicht-fusionierten Zellen abgetrennt und mittels wiederholter Grenzverdünnung kloniert. Anschließend werden klonierte Hybridome getestet, um zu bestimmen, welche die gewünschten Antikörper produzieren. Diese Tests können beispielsweise durch kompetitiven enzymgebundenen Immunosorptionsassay ("enzyme linked immunosorbent assay", ELISA) erfolgen. Die Spezifität und Affinität für eine Verbindung sind z.B. durch Hinzufügen von freier Verbindung zum ELISA-Testsystem, um die Fähigkeit der freien Verbindung zur Hemmung der Bindung des monoklonalen Antikörpers an die an eine feste Phase gebundene Verbindung zu bestimmen, zugänglich.
Nach Auswahl eines bestimmten Hybridoms können monoklonale Antikörper nach bekannten Verfahren leicht in großen Mengen produziert werden. Falls gewünscht, können diese Antikörper mit einem Enzym markiert werden; wie z.B. mit Meerrettichperoxidase oder alkalischer Phosphatase.
Die Verfahren zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern für eine Verbindung sind Fachleuten wohlbekannt. Beispiele für Lietraturstellen, worin derartige Verfahren beschrieben werden, sind Methods of Enzymology, Bd. 70 und 73, Immunochemical Techniques, Teil A bzw. B, Hrsg.: H. Van Vunakis und J.L. Langone, veröffentlicht von Academic Press, 1980 (Teil A) und 1981 (Teil B), und G. Kohler und C. Milstein, Nature 265, 495 (1975).
Gemäß einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung neue monoklonale Antikörper gegen m-Phenoxybenzoesäure.
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann die qualitative oder quantitative Identifikation der Markerverbindung in der Probe umfassen. Das Verfahren umfaßt vorzugsweise die quantitative Identifikation der Markerverbindung. Auf diese Weise kann der Grad an Verfälschung bestimmt werden.
Der Assay auf Markerverbindung durch Kontakt mit dem Antikörper erfolgt vorzugsweise mittels kompetitiver ELISA, obwohl auch andere Immunoassay-Verfahren angewandt werden können, einschließlich von enzym-vermittelten Immunoassays und immunometrischen Sandwich-Assays. Die tatsächliche Bestimmung des Assayergebnisses kann auf kolorimetrische Weise oder durch alternative Nachweismittel, wie z.B. Chemolumineszenz oder Fluoreszenz, erfolgen.
Es ist anzumerken, daß ein derartiges Bestimmungsverfahren sich sehr gut zur Außenarbeit eignet, da keine komplexe Laborausrüstung erforderlich ist. Daher kann zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ein Assay-Set zum Nachweis der Gegenwart einer visuell nicht nachweisbaren, im wesentlichen wasserlöslichen Markerverbindung bereitgestellt werden, die mit einem Produkt assoziiert ist, wobei das Set Mittel zur Bereitstellung einer Probe des Markers in wäßrigem Medium, Nachweismittel zur Überwachung des Immunoassays und Mittel zum Vergleich des Ergebnisses des Immunoassays mit dem von einem Originalprodukt erwarteten Ergebnis umfaßt.
Ein Mittel zur Bereitstellung einer Probe des Markers in wäßrigem Medium kann jedes beliebige Lösungsmittel, um den Marker in wäßrige Lösung zu bringen, und/oder ein Filtrationsmittel zur Entfernung unerwünschter Feststoffe und/oder Festphasen- Extraktionssäulen umfassen (beispielsweise Säulen, die ein Ionenaustauschharz oder ein Chromatografiermedium, wie z.B. Kieselgel, enthalten).
Ein Immunoassay-Mittel kann in geeigneter Menge vorliegende mono- oder polyklonale Antikörper umfassen. Es kann ebenso ein Hapten umfassen, das an eine feste Phase gebunden sein kann.
Ein Nachweismittel zur Überwachung des Ergebnisses des Immunoassays kann beispielsweise ein Mittel zur Erzeugung und/oder Messung einer Farbreaktion sein. So kann ein Nachweismittel ein Enzym und ein Substrat dafür umfassen. Das Enzym kann am Hapten, am Anti-Hapten-Antikörper oder an einem zweiten, gegen den Anti-Hapten-Antikörper gerichteten Antikörper angebracht sein. Beispiele für Enzyme sind u.a. Meerrettichperoxidase und alkalische Phosphatase. Beispiele für Substrate umfassen o-Phenylendiamin-dihydrochlorid; Amerlite Signal Reagent (erhältlich von Amersham International PLC); und p-Nitrophenolphosphat. Natürlich kann auch eine externe Meßvorrichtung, wie z. B. ein Spektralphotometer, Luminometer oder Fluorometer verwendet werden. Auf diese Weise kann nicht nur die Gegenwart der Markerverbindung nachgewiesen sondern auch die vorhandene Menge bestimmt werden, was einen Hinweis auf das Ausmaß der Verfälschung des Produkts gibt.
Ein Mittel zum Vergleichen des Ergebnisses des Immunoassays mit jenem, das von einem Originalprodukt erwartet wird, kann Anleitungen umfassen, die das von einem Originalprodukt erwartete Ergebnis beschreiben (beispielsweise eine Farbtafel, eine Eichtabelle oder eine Eichkurve), oder es kann eine Probe markierten Materials umfassen, das mit dem markierten Originalprodukt identisch ist (und gemeinsam mit der unbekannten Probe analysiert werden soll).
Das Set ist vorzugsweise mit einer Darstellung des charakteristischen visuellen Merkmals versehen, das auch das Material des Originalprodukts trägt. Beispielsweise kann das Set eine Darstellung eines Warenzeichens aufweisen, mit dem das Material des Originalprodukts versehen ist.
Die Möglichkeit, Assaymittel in Setform bereitzustellen, stellt sicher, daß ein Laie, wie z.B. ein Händler für ein Produkt, in einer vom Ursprung des Produkts entfernten Umgebung die Echtheit des Produkts überprüfen kann, ohne Laboreinrichtungen in Anspruch nehmen zu müssen.
Die Erfindung wird in der Folge unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung von Proteinkonjugaten von zur Verwendung als Markerverbindungen bestimmten Verbindungen

Es wurde eine Reihe von Proteinkonjugaten von m-Phenoxybenzoesäure (eines Haptens, hierin nachfolgend mit "PBA" bezeichnet) hergestellt, indem zunächst durch chemische Synthese ein geeignetes reaktives Derivat von PBA erzeugt wurde, gefolgt von der Konjugation des Derivats mit dem Protein. Die Derivate wurden zur Überwachung des anschließenden Proteinkonjugats mit einer ¹&sup4;C-Radiomarkierung hergestellt, um die Entfernung von Reagentien zu überprüfen und die Beladung des Proteins mit dem Hapten zu berechnen.

i) Herstellung von PBA-Derivaten

m-Phenoxybenzoesäure wurde in Benzol mit Thionylchlorid umgesetzt, um das entsprechende Benzoylchlorid zu ergeben, das anschließend in Gegenwart von NaOH mit 4-Aminobuttersäure umgesetzt wurde, gefolgt von saurer Hydrolyse, um ein Derivat a) der Formel I zu liefern
worin R = -(CH&sub2;)&sub3;COOH ist.
Zwei weitere Derivate wurden durch Umsetzung des Benzoylchlorid- Zwischenprodukts in Gegenwart von NaOH mit b) Glycin und c) Glycylglycin, gefolgt von saurer Hydrolyse, hergestellt, um b) ein Derivat der Formel I zu ergeben, worin R = -CH&sub2;COOH ist, und c) ein Derivat der Formel I zu ergeben, worin R = -CH&sub2;CONHCH&sub2;COOH ist.
Die Herstellung von Derivat a) der Formel I erfolgte auch durch Umsetzung von Benzyl-4-aminobutyrat mit 3-(3 -Dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimid in wäßrigem Tetrahydrofuran zu einer Verbindung der Formel I, worin R = -(CH&sub2;)&sub3;COOCH&sub2;Ph ist, gefolgt von Hydrogenolyse mit Palladium auf Aktivkohle als Katalysator in Tetrahydrofuran, um Derivat a) zu ergeben.
Die Derivate wurden durch Zugabe stöchiometrischer Mengen an Natriumbicarbonat oder -carbonat in Wasser und Zugabe von Tetrahydrofuran, bis eine homogene Lösung erhalten wurde, gefolgt von Eindampfen bis zur Trockene in ihre Natriumsalze übergeführt (die sich leicht in Wasser lösten).

ii) Herstellung von Proteinkoniugaten

Die wie zuvor unter i) beschrieben hergestellten Derivate in Form ihrer Natriumsalze wurden jeweils in Wasser gelöst, auf pH 8 gebracht und auf 0ºC abgekühlt. Eine ebenfalls auf 0ºC gekühlte Lösung von 3-(3 '-Dimethylaminopropyl)-1- ethylcarbodiimid wurde dem Natriumsalz des jeweiligen Derivats zugesetzt und das Gemisch zur vollständigen Bildung des Isoharnstoffcarboxylats 2 min stehengelassen.
Jedes der Derivate wurde anschließend an eines der folgenden Proteine, gelöst in destilliertem, entionisiertem Wasser, gebunden und filtriert:
Rinderserumal bum in (MG etwa 68.000)
Hühner-γ-Globulin (MG 125.000 - 750.000)
Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin (MG 3.000.000 - 7.000.000)
Die Beladung erfolgte durch Zusatz der Lösung zum Protein innerhalb 1 min unter Rühren und Halten des Gemischs bei 5ºC über mehrere Stunden zur vollständigen Bindung. Der pH wurde bei Bedarf auf pH 8 eingestellt. Das beladene Protein wurde 5 - 7 d lang unter täglichem Austausch des Dialysats gegen Salzlösung- Phosphatpuffer (ph 7,3) dialysiert und die Beladung mittels ¹&sup4;C- Radioaktivitätsmessungen bestimmt.

Beispiel 2

Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Ein Konjugat von PBA und Rinderserumalbumin mit 15 Mol PBA pro Mol Protein wurde zur Erzeugung der Antikörper verwendet. Das PBA-Rinderserumalbumin wurde unter Einsatz von Derivat a) aus Beispiel 1 i) im Verfahren aus Beispiel 1 ii) hergestellt.
Es wurden 6 Mäuse (Balb/c, weiblich) subkutan mit einer 1 : 1 Emulsion von vollständigem Freund-Adjuvans und PBA-Konjugat (0,1 ml, 50 ug) immunisiert. Jedes Tier erhielt 3 weitere Injektionen in 3-wöchigen Intervallen, jedoch mit unvollständigem Adjuvans. Nach dem gleichen Schema erhielten weitere 6 Tiere eine höhere Dosis von Konjugat (200 ug). Serumproben der 12 Tiere wurden mittels ELISA auf spezifische Bindung an PBA getestet.
Jenem Tier, das die höchste Serumkonzentration von Antikörpern produzierte, wurde die Milz entfernt und die Splenozyten für eine Fusion mit PX3-63-AGB-653- Myelomzellen verwendet (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter der Nummer ATCC CRL 1580). Die Hybridomzellen wurden auf 10 96-Napf-Mikrotiterplatten verteilt. Nach der Zellvermehrung wurden die Gewebekultur-Überstände mittels ELLSA auf Antikörper-Produktion getestet. Die Spezifität wurde durch Zugabe von freiem PBA zum Testsystem bestimmt, um die Hemmung der Bindung der Antikörper an die Festphasen-PBA-Zielverbindung im ELlSA- Verfahren zu bestimmen. Zellen aus mehreren positiven Näpfen wurden vermehrt, um einen Zellvorrat anzulegen, und anschließend nach dem Grenzverdünnungs-Verfahren kloniert. Nach weiterem Zellwachstum wurden die resultierenden Überstände wie zuvor getestet und der Inhalt mehrerer positiven Näpfe kultiviert und erneut kloniert. Die Zellen in den Näpfen, die sich nach dem zweiten Klonieren als positiv erwiesen, wurden vermehrt, um Überstände zu erzeugen, die ausreichende Mengen an Antikörpern zur vorbereitenden Assay-Entwicklung enthielten.
Um ausreichende Mengen monoklonaler Antikörper für mittelmäßige hohe Anforderungen zu erzeugen, wurden 5 klonale Zellhybridome zur Produktion von antikörper-reichem Bauchwasser ausgewählt. Jeder von 10 mit Pristan geprimten weiblichen Balb/c-Mäusen pro Hybridom wurde intraperitoneal mit bis zu 10&sup7; Hybridomzellen eingeimpft. Das Bauchwasser wurde entfernt, gepoolt und tiefgefroren aufbewahrt.
Antikörper wurden auch durch in vitro-Vermehrung von Hybridomzellen in gerührten Gewebekultur-Gefäßen erzeugt.
Eine Probe eines der klonalen Zellhybridome wurde mit Wirksamkeit vom 10. Jänner 1989 unter der Zugriffsnummer 89011001 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS-Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom, hinterlegt.

Beispiel 3

Assay eines markierten Schmieröls

Ein Schmieröl (unter dem Handelsnamen "Rimula X" von Shell erhältlich) wurde mit 10 ppm m-Phenoxybenzoesäure markiert. Es wurde eine Reihe von 2 ml-Proben hergestellt, die variierende Prozentsätze von markiertem und unverfälschtem Öl enthielten.
Für den Assay wurde nach folgendem Verfahren PBA aus jeder Ölprobe extrah iert.

Extraktion von PBA aus Öl

1. Die Ölprobe, an der die Echtheitsprobe durchzuführen war, wurde in ein dicht verschließbares Gefäß eingebracht. Anschließend wurden 5 Volumsteile Hexan und 1 Volumsteil 20%-iges Acetonitril in 0,05 M Tris/HCl (pH 7,5) dem Öl zugesetzt und das Gefäß dicht verschlossen. Das Gemisch wurde danach 1 min lang geschüttelt und die resultierende Suspension absetzen gelassen. Dies dauerte etwa 30 s lang.
2. Aus der unteren Phase des getrennten Gemischs wurde unter Verwendung einer Einweg-Kunststoffpipette ein Aliquot entfernt und auf eine 3 ml NH2 Bond Elut Säule (eine Ionenaustauschharz-Säule von Jones Chromatography) aufgebracht. Die Extraktprobe wurde durch Anwendung von Druck durch die Säule geführt und die Säule anschließend mit 4 x 1 ml Aliquoten dest. Wasser gewaschen.
3. Anschließend wurde die Säule mit 2 ml einer Lösung von 0,05 Vol.-% Tween 20 in Salzlösung eluiert. Diese Lösung entfernte jegliches gebundenes PBA. Jede abgenommene PBA-Lösung wurde danach nach dem folgenden Verfahren einem kompetitiven ELISA unterzogen.

Immunoassay-Verfahren (mit kolorimetrischer Bestimmung)

1. Ein Kunststoff-Napf/Röhrchen wurde mit einer festgelegten Menge eines wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben hergestellten PBA-Hühner-γ-Globulin-Konjugats beschichtet. Dazu wurde ein abgemessenes Aliquot von 100 ul Konjugat mit einer Konzentration von 10 ug/ml in den Napf/das Röhrchen eingefüllt. Dieses wurde anschließend bei einer genau geregelten Temperatur eine festgesetzte Zeit lang inkubiert, wodurch durch Adsorption eine reproduzierbare Menge an Beschichtung erhalten wurde. Nach der Beschichtungsdauer wurden die Näpfe gewaschen und konnten bei 4ºC gelagert werden.
2. Die zu testende PBA-hältige Lösung wurde in Gegenwart einer begrenzten Menge an wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellten, spezifischen monoklonalen Antikörpern in einen zuvor beschichteten Napf eingebracht. Die Antikörper-Probe wurde in einer Verdünnung von 1 : 1000 eingesetzt. Die Grundlage dieses Assays ist die Konkurrenz zwischen dem PBA in Lösung und dem als Konjugat an der Napfoberfläche immobilisierten PBA um die Antikörperbindung. Nach einer festgelegten Zeitspanne wurde die Lösung aus dem Napf entfernt und dieser gewaschen. Die nach dem Waschen im Napf verbleibenden Antikörper sind jene, die sich an das immobilisierte PBA gebunden hatten; somit ist die Menge an verbleibenden Antikörpern umgekehrt proportional zur Menge an PBA, die zuvor frei in Lösung vorhenden war.
3. Zu dem Napf wurde eine Lösung eines zweiten Antikörper-Enzym-Konjugats zugegeben. Das verwendete, zweite Antikörper-Enzym-Konjugat waren 100 ul pro Napf IgG (alkalische Phosphatase, gebunden an Hasen-Anti-Mäuse-Immunoglobulin G; erhältlich von ICN Biologicals) in einer Verdünnung von 1 : 1000. Dieses Konjugat bindet sich an jegliche primäre Antikörper, die gebunden an das immobilisierte Konjugat im Napf verblieben waren. Das zweite Antikörper-Enzym-Konjugat wurde im Überschuß zugesetzt und ungebundenes Material wiederum durch Waschen entfernt. Nach dem Waschen ist die Menge an im Napf verbleibendem, zweitem Antikörper- Enzym-Konjugat direkt proportional zur Menge an wie zuvor in Schritt 2 beschrieben gebundenen, primären Antikörpern.
4. Eine Lösung, die ein Substrat für das Enzym des zweiten Antikörper-Enzym- Konjugats enthielt, wurde in den Napf eingebracht und die Menge an vorhandenem Enzym durch Messung des Ausmaßes der Bildung von gefärbtem Produkt bestimmt. Das Substrat war p-Nitrophenylphosphat-dinatriumsalz (erhältlich von Sigma Chemical Co. als Sigma 104 Phosphatase-Substrat) in einer Konzentration von 1 mg/ml in 10%-igem Diethanolamin-Puffer (pH 9,8). Das Ausmaß der Bildung von gelb gefärbtem Produkt wurde unter Verwendung eines Vertikalstrahl-Absorptionsspektralphotometers für sichtbares Licht (MR610 Mikroplattenablesevorrichtung von Dynatech) bei 405 nm gemessen.
In nachstehender Tabelle 1 sind zwei Ergebnisreihen des kolorimetrischen Assays der variierende Prozentsätze von markiertem Öl enthaltenden Ölproben angeführt. Die Ergebnisse sind als Prozentsätze von markiertem Öl in der Probe angegeben. Tabelle 1 Probe Nr. Berechnet gefunden, Meßreihe A Meßreihe B

Beispiel 4

Zusammenbau eines Assaysets und dessen Verwendung in einem Assay auf ein markiertes Schmieröl

Es wurde ein zum Testen von bis zu drei möglicherweise verfälschten Schmierölproben geeignetes Assayset zusammengesetzt. Das Set enthielt:
(1) 5 Kunststoffröhrchen, beschichtet mit einem PBA-Hühner-γ-Globulin-Konjugat (wie unten beschrieben hergestellt);
(2) 5 Ionenaustauschharz-Säulen (3 ml NH2 Bond Elut Säulen, erhältlich von Jones Chromatography);
(3) 5 x 10 ml Lösungsmittel zur Extraktion, bestehend aus 8 ml Hexan und 2 ml 40%-igem Acetonitril in 0,05 M Tris/HCl (pH 7,5);
(4) 1 Schmierölprobe mit 10 ppm m-Phenoxybenzoesäure (die eine Probe eines markierten Originalprodukts darstellt);
(5) 1 Schmieröl probe ohne m-Phenoxybenzoesäure;
(6) 5 x 2 ml PBA-spezifischer monoklonaler Antikörper, in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, erhältlich von Oxoid in Tablettenform), die 0,05% (w/v) Tween 20 (Polyoxyethylen-Sorbitanmonolaurat, erhältlich von Sigma Chemical Co., Katalog-Nr. P1379) enthielt, auf das 10fache verdünnt;
(7) 1 Volumsteil Antikörper-Enzym-Konjugat (umfassend an Meerrettichperoxidase konjugierte Hasen-Immunoglobuline gegen Mäuse-Immunoglobuline, erhältlich von DAKO Limited, Katalog-Nr. P161);
(8) Chemolumineszenz-Substrat (Amerlite Signal Reagent, erhältlich von Amersham International PLC, Katalog-Nr. LAN 4400);
(9) Waschlösung, bestehend aus 0,05 Vol.-% Tween 20 in Salzlösung (ST);
(10) Säulenwaschlösung, bestehend aus dest. Wasser; und
(11) 1 Gebrauchsanweisung.

Herstellung von mit einem PBA-Hühner-γ-Globulin-Konjugat beschichteten Kunststoffröhrchen

Es wurden Kunststoffröhrchen mit einer festgesetzten Menge eines wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten PBA-Hühner-γ-Globulin-Konjugats beschichtet. Dazu wurde ein abgemessenes Aliquot von 500 ul Konjugat in einer Konzentration von 20 ug/ml in das Röhrchen gefüllt. Dieses wurde anszhließend 3 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch mittels Adsorption eine reproduzierbare Menge an Beschichtung erzielt wurde. Nach der Beschichtung wurden die Röhrchen mit der in Beispiel 3 beschriebenen Salzlösung/Tween-Lösung (ST) gewaschen, getrocknet und bis zur Verwendung trocken, vorzugsweise bei 4ºC, gelagert.

Verwendung des Assaysets zum Testen von markierten Schmierölen

1. Bei der Durchführung des Assays ist der erste Schritt die Herstellung des Chemol um ineszenz-Substrats gemäß den Angaben des Herstellers.
2. Die beiden zum Set gehörigen Schmierölproben und drei "unbekannte" Schmierölproben werden unter Verwendung der 5 Volumsteile Lösungsmittel zur Extraktion und der 5 Ionenaustauscher-Säulen nach dem Verfahren aus Beispiel 3 extrahiert. Anschließend werden die Säulen mit 2 ml Aliquoten Säulenwaschlösung gewaschen.
3. Jeder der Säulen wird danach mit einem 2 ml Aliquot Waschlösung in kleine Glasfläschchen eluiert, die die 2 ml PBA-spezifischen monoklonalen Antikörper enthalten.
4. Der Fläschcheninhalt wird anschließend vermischt und zumindest 500 ul jedes der 5 Gemische wird in die 5 mit PBA-Hühner-γ-Globulin-Konjugat beschichteten Kunststoffröhrchen übergeführt. Nach 5 min werden die Lösungen aus den Röhrchen weggekippt und die Röhrchen einmal mit Waschlösung gewaschen.
5. 500 ul einer Lösung des Antikörper-Enzym-Konjugats wird zu jedem der Röhrchen zugegeben. Nach 5-minütiger Inkubation wird der Inhalt der Röhrchen weggekippt und die Röhrchen fünfmal mit Waschlösung gewaschen.
6. Anschließend wird 1 ml des Chemolumineszenz-Substrats in die Röhrchen gefüllt und nach 2 min der Lichtaustritt gemäß den Angaben des Herstellers zur Verwendung eines tragbaren, batteriebetriebenen Röhrenluminometers (erhältlich von Dynatech Laboratories Ltd.) gemessen. Die Ablesung des Instruments ist eine dreistellige Zahl im Bereich von 0 - 999.
7. Die Reproduzierbarkeit des Verfahrens wurde mittels einer Reihe von 35 Assays ermittelt, die über einen Zeitraum von 4 Wochen von zwei Benutzern durchgeführt wurde. Der Variationskoeffizient zwischen den Assays ("coefficient of variation", cv) betrug für diese Versuchsreihe 9,1%. Es zeigte sich, daß bei korrekter Durchführung des Assays das Verhältnis zwischen dem positiven Vergleich (niedrigere Ablesung) zum negativen Vergleich (höhere Ablesung) 0,612 ± 0,056 betrug [d.h. ± 1 Standardabweichung ("Standard Deviation", SD)]. Für ein "unbekanntes" Öl wies ein Wert von 0,725 oder darüber auf eine "mögliche Verfälschung" hin.

Beispiel 5

Assay für markiertes Benzin

Es wurden 13 ml Proben von verbleitem und unverbleitem Benzin mit 3 verschiedenen Mengen an PBA (10, 5 und 2,5 ppm) markiert. Sie wurden mit Tris-Puffer (2 ml, 0,05 M, pH 7,5) extrahiert. Die Extrakte wurden wie in Beispiel 3 beschrieben getestet und PBA unter Verwendung einer Eichkurve von Standards, die in einem nichtmarkierten Benzin-Extrakt hergestellt worden waren, quantitativ bestimmt. Es wurden entsprechende Proben hergestellt, die radioaktiv markiertes PBA enthielten, wodurch die Bestimmung der Extraktionswirkungsgrade und ein Vergleich zwischen beobachteten und erwarteten Werten ermöglicht wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Vergleich zwischen beobachteten und erwarteten Werten für wäßrige Proben, getestet gegen eine Eichkurve in nicht markiertem Benzin-Extrakt Probe verdünnter Extrakt 5ppm verdünnt Blindwert Extrakt verbleites Benzin erwartet (Radiochemie) beobachtet Unverbleites Benzin Alle Werte in ppm. Diese Ergebnisse zeigen den Konzentrationseffekt, der bei der Extraction von PBA aus 13 ml Benzin in 2 ml Tris-Puffer erzielt wird, und zeigen in überzeugender Weise, daß mit PBA markiertes Benzin mittels Immunoassay von nicht-markiertem Benzin zu unterscheiden.

Beispiel 6

Assay für markierte Pharmazeutika

Proben von Paracetamol (Acetaminophen - ein leichter Schmerzstiller und Antipyretikum) und Naproxen (ein nicht-steroider Entzündungshemmer) wurden mit 20 ppm festem PBA markiert. Jeweils 1 g wurde zu 10 ml PBS/Tween (beschrieben in Beispiel 4) in einem 20 ml Glasfläschchen zugesetzt. In ähnlicher Weise wurden nichtmarkierte Assay-Blindproben für beide Materialien hergestellt. Die Fläschchen wurden über Nacht geschwenkt, um das PBA in das PBS/Tween zu extrahieren. Nach der Abtrennung von nicht-gelöstem Material durch Zentrifugation wurden Probenaliquote (250 ul) des überstehenden Lösungen zu 250 ul PBA-spezifischem Antikörper zugegeben und unter Verwendung eines ähnlichen Assaysets wie in Beispiel 4 analysiert.
Aus den in Tabelle 3 angeführten Ergebnissen ging hervor, daß die markierten Pharmazeutika von den nicht-markierten deutlich zu unterscheiden waren. Tabelle 3 Wirkstoff nicht-markiert* markiert* Verhältnis (%) Paracetamol mittleres Verhältnis Naproxen *Die angegebenen Werte wurden von dem in Beispiel 4 beschriebenen Röhrenluminometer abgelesen.

Beispiel 7

Assay für markiertes Parfum

Eine Probe "Eau de Cologne" wurde mit 20 ppm PBA markiert. 2 ml dieses markierten Materials und 2 ml des unmarkierten Materials wurden in ein kleines Glasteströhrchen eingebracht und in einem moderaten Luftstrom bis zur beginnenden Trockene eingedampft. 2 ml PBS/Tween (beschrieben in Beispiel 4) wurden zum öligen Rückstand zugegeben und der Röhrcheninhalt durch heftiges, verwirbelndes Mischen vermischt. Das unlösliche Öl, das schwerer als Wasser war, wurde anschließend durch Zentrifugation abgetrennt und Probenaliquote der überstehenden Lösung wie in Beispiel 6 beschrieben analysiert. Aus den in Tabelle 4 angeführten Ergebnissen ging hervor, daß das markierte Parfum vom nicht-markierten klar zu unterscheiden war. Tabelle 4 Parfum nicht-markiert* markiert* Verhältnis (%) Eau de Cologne mittleres Verhältnis *Die angegebenen Werte wurden von dem in Beispiel 4 beschriebenen Röhrenluminometer abgelesen.
In einem alternativen Versuch wurden markiertes und nicht-markiertes Eau de Cologne mit PBS/Tween auf das 10fache verdünnt und direkt wie in Beispiel 6 angeführt getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben und zeigen, daß auch dieses alternative Verfahren eine klare Unterscheidung zwischen markiertem und nichtmarkiertem Parfum zuläßt. Tabelle 5 Parfum nicht-markiert* markiert* Verhältnis (%) Eau de Cologne mittleres Verhältnis

Beispiel 8

Assay für markierte Getränke

Eine Probe von verschnittenem Whisky wurde mit 20 ppm PBA markiert. Der markierte Whisky und eine entsprechende Probe des nicht-markierten Whiskys wurden mit PBS/Tween auf das 4fache verdünnt und Probenaliquote (250 ul) nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren getestet. Die in Tabelle & angegebenen Ergebnisse zeigen, daß der markierte Whisky klar vom nicht-markierten Whisky zu unterscheiden ist. Tabelle 6 Getränk nicht-markiet* markiert* Verhältnis (%) Whisky mittleres Verhältnis *Die angegebenen Werte wurden von dem in Beispiel 4 beschriebenen Röhrenluminometer abgelesen. Es wurde in diesem Beispiel beobachtet, daß das erzeugte Signal etwa 20 min bis zur Entwicklung benötigte.
Anmerkung: Die folgenden im Text verwendeten Ausdrücke sind eingetragene Warenzeichen: Amerlite; NH2 Bond Elut; Tween.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen der Echtheit eines Produkts, umfassend:

Assoziieren einer Markerverbindung mit dem Produkt, um dadurch ein "echtes" Produkt herzustellen, wobei die mit dem Produkt assoziierte Markerverbindung visuell nicht bestimmbar ist; anschließend

Bereitstellen einer Probe aus einem Testprodukt, dessen Echtheit bestimmt werden soll, die, gelöst in wäßrigem Medium, jegliche der mit dem Testprodukt assoziierten Markerverbindungen enthält;

Identifizieren jeder der Markerverbindungen in der Probe durch- einen für den Marker spezifischen Immunoassay; und

Vergleichen des Ergebnisses des Immunoassays, der mit der Probe aus dem Testprodukt durchgeführt wurde, mit jenem, das erhalten wird, wenn derselbe Immunoassay mit einer Probe aus dem "echten" Produkt in wäßrigem Medium durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Markerverbindung in der Probe aus dem Testprodukt quantitativ bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Markerverbindung mit dem Produkt vermischt wird.

4. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Produkt ein Produkt auf Ölbasis, ein Parfum, ein Anstrichmittel oder ein Getränk ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Produkt ein Produkt auf Ölbasis ist und die Markerverbindung einen logP im Bereich von -2,5 bis +5 besitzt, wobei P der Verteilungskoeffizient der Markerverbindung zwischen Octanol und Wasser bei 25ºC ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Produkt ein flüssiges Produkt auf Ölbasis ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Produkt ein Schmieröl ist.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Markerverbindung ausgewählt wird aus: aromatischen Carbonsäuren; Phenolen; Ethern von mehrwertigen Alkoholen und Phenolen; Aminosäuren; Proteinen; Lipiden; Kohlehydraten und Nukleinsäuren.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Markerverbindung m- Phenoxybenzoesäure ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Immunoassay monoklonale Antikörper verwendet, die für m-Phenoxybenzoesäure spezifisch sind.

11 Verfahren nach Anspruch 9, worin der Immunoassay Antikörper verwendet, die für ein Proteinkonjugat von m-Phenoxybenzoesäure spezifisch sind.

12. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Markerverbindung unter Verwendung eines Lösungsmittels, umfassend Wasser und/oder ein wassermischbares organisches Lösungsmittel, aus dem Produkt extrahiert wird.

13. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Identifizierung des Markers durch einen kompetitiven enzymgebundenen Immunosorbens-Assay erfolgt.