CN1308236A - 通过免疫测定法检测化学物质 - Google Patents
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Abstract
一个检测一种肉眼不可见的与一种产品相联的标志化合物之存在的方法。包括提供一个在一种水性介质中的标志化合物样品,然后通过对该化合物特异的免疫测定法鉴定此标志物。此法可用一种包括这种免疫测定法在内的检测盒方便的进行。
Description
本发明关系到用免疫测定法检测化学标志化合物的一种方法以及能在此领域实施这种检测的一种分析试剂盒。此发明特别,虽非绝对,适用于液态产品中的标志化合物的检测,尤其是以油为基础的(油性的)产品中,例如润滑油中,标志化合物的检测。
在世界上很多地区所经历的,并与许多不同产品相关的一个主要问题是产品的伪造问题。
全世界商人们把所出售的材料赋以看上去别具一格的外观,以便顾客能够把他们的材料与其他材料区别开来。结果,他们的顾客晓得将材料的看上去别具一格的外观与一定的质量标准联系在一起,而且假如他们对这些标准满意的话,将会首选那些具有看上去别具一格外观的材料。
一旦顾客已经获得对具有特殊的,看来别具一格的外观的材料的偏爱,商人就变得易受伪造产品的损害。
一种伪造产品由这样的材料构成,它具有看来独具一格的外观,令人速感地好似具有提供给真正产品的那种材料的外观。顾客看到伪造材料的看来独具一格的外观就买了这种材料,还以为他们所买的是一种真正产品。
已知有许多方法提供材料以具有看来独具一格的外观。一般来说,看来独具一格的外观或者直接提供给该材料,或者提供给与该材料相关的一种物品,例如一个标签、包装物或容器。这看来独具一格的外观可以是,例如,一种有特色的外形或外貌,一个有特色的标志,或者两者兼有。一种特别受人偏爱的看上去别具一格的外观是商标。
一种伪造产品的材料可以是相同于或不同于真正产品的材料。伪造产品的材料时常是相同的,但质量较次。
产品伪造可按很多种方法进行。一种方法是,产品伪造者给其伪造材料以看上去与真正产品一致的独具一格的外观。另一种方法是,产品伪造者掺假或取代真正产品的材料,而不影响真正产品的材料所一直具有的看上去独具一格的外观。
这种问题的一个实例就是润滑油或其他以油为基础的产品的掺假,把伪造者的油加到真正的产品中。这种掺假不仅在经济上损害了油制造者,而且随之可能发生的性能的降低可以对顾客造成损害,结果伤害了真正产品的信誉。
克服这个问题的一个方法以前曾经提出过,即向产品中参入染料。这样一种策略是很容易模仿的。然而,假如掺入一种不易通过可见的方式而被察觉的标志物,则可能被掺假的产品的样品,假如有的话,在人们确定掺假程度之前,需送回到一个基础实验室进行物理学分析,例如用色谱技术。如此所引起的耽误,例如,对于某些不易获得实验室支持设施的地区的批发商是很不方便的,降低了对伪造者的技术威胁效力。
很清楚,需要一种能用于这一领域检测产品伪造企图的方法。
欧洲专利申请公开号EP-A-0260829透露出可用于鉴定材料中的氯化苯酚,特别是五氯苯酚,并测定原材料中这种化合物浓度的单克隆抗体及多克隆抗体。在其说明书的序言中让人注意到五氯苯酚是作为一种杀虫剂或防磨剂加到材料中的。然而EP-A-0260829并未透露产品中氯代苯酚的鉴定,也就是说用一种看来独具一格的外观提供给材料。再者,EP-A-0260829未透露氯代苯酚作为标志化合物的用途。尤其是,EP-A-0260829未透露氯代苯酚与一个真正产品联合在一起具有区分伪造产品的目的。
在第六届杀虫剂化学的国际会议上,1986年8月10-15日于渥太华,加拿大,M.J.Wraith等以版报发表的题为”拟除虫菊酯杀虫剂免疫分析方法之发展”一文中,透露出m-苯氧基苯甲酸及二氯乙烯基环丙烷羧酸的蛋白质结合物,以及用这些蛋白质结合物所制备的多克隆抗体。也透露了在红茶、水及土壤中的cypermethrin代谢物,m-苯氧基甲酸及二氯乙烯基丙烷羧酸的分析。然而,既未透露m-苯甲基苯甲酸或二氯乙烯基丙烷羧酸作为标志化合物的使用,亦未透露在具有看上去独具一格的外观的任何材料中任一化合物通过免疫分析来检测。
根据这一发明,我们提供一个检测一种肉眼不可察的,实质上水溶性的标志化合物存在的方法,这种标志化合物与一种产品相联,它包括提供一种在水性介质中的所说标志化合物的样品,并通过一种对标志化合物特异的免疫分析来鉴定样品中的标志化合物。
这一标志化合物可以多种多样的方式与产品相联,这一点将受赞赏。因此这一标志化合物可存在于全部或部分产品之中或之上,或存在于与产品相关的标鉴、包装物或容器之中或之上。这一标志化合物通常是与产品混合的,但也可以独立于产品而存在,例如,标志可以存在于产品的包装或标鉴中。
产品可以是固体的或液体的。
固体产品的实例包括药用片剂、胶囊及粉剂;农药的固体配方,例如,杀虫剂、除草剂、杀真菌剂及肥料;织物,例如布匹;录制的东西,如留声机唱片,录音带,软塑料磁盘及密盘;电器,例如电视机、计算机及录象机;机动车构件及照象机。
液体产品的实例包括以油为基础的产品,例如,润滑油、汽油、柴油以及液化石油产品;染料;香料;化妆品;饮料,例如葡萄酒、威士忌、雪利葡萄酒、杜松子酒及伏特加酒;液体药物配方,例如糖浆、乳剂及悬液;液体农药配方;及工业溶剂。这种产品最好是液体的,最好是一种以油为基础的产品,例如润滑油。
标志化合物应该是肉眼不可见和基本水溶性的。标志化合物亦应能用免疫分析检测,并应是与其所标记的产品相容的。这一点将受到赞赏。它若无毒则更好。一个掌握免疫分析技术之技巧的人在鉴定适用于标志化合物的化合物上不会有困难。
通常适于做标志化合物的化合物是由碳和氢原子并还可有一个或更多氧或氮杂原子构成的有机化物及其盐。一个或更多的其他杂原子亦可选择性的存在,例如,诸如氯、溴、碘原子的囟族原子,磷原子或硫原子。较好的化合物是羧酸、羧酸酯、酮、醇、酚、胺、苯胺、腈及酯,及其盐。尤其更好的化合物是芳香羧酸,例如苯甲酸;苯酚;多羟醇及苯酚酯;氨基酸;肽;蛋白质;脂类;糖类;例如糖及多糖;核苷酸;及多核苷酸,例如脱氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。
当产品是一种以油为基础的产品如润滑油时,用做为标志化合物的化合物最好在从-2.5到+5.0,较好从-1.5到4.5,最好从0到4的范围内有一个logP(LogP于此意指某一化合物在25℃于辛醇与水之间的分配系数的对数)。因此,例如m-苯氧基苯甲酸的logP为3.9。
选择性的针对一个化合物的特别的旋光性形式产生抗体是可能的。由于很难通过常规的分析技术来区分化合物的旋光性,尤其是当仅可获得痕量的化合物进行分析时更是如此,因而选用旋光性标志化合物可能是特别优越的。
适合于用作标志化合物的化合物已被发现是m-苯氧基苯甲酸,但将受到赞赏的是,适用于这一目的的化合物是很广泛的,只要它与被标志的产品相容并对其无毒。因而油相容、水相容及固体相容性化合物作为标志化合物的使用是依赖于受标志的产品而设计的。
当产品是一种液体时,标志化合物为无色并溶于液体产品较好,这样它的存在仅能通过以后的分析才能检测出来。它亦无味则更好。
更好的是只用痕量的标志物即可。一般地说,一个标志化合物以1 ppb(1 part per billion每+亿份之一)至25ppm(part permillion每百万份之一)的浓度范围与产品相掺合。浓度在100ppb至15ppm范围较好,在1ppm至10ppm更好。因而,例如,标志化合物的浓度可以高至约10ppm,并且取决于标志化合物,甚至几个ppb对于检测即足够了。
能够检测浓度在25ppm或以下的标志化合物是本发明所提供方法之特别优越之处。因而仅需少量的标志化合物。
依据其他方面,本发明提供了一个含有标志化合物的以油为基础的产物,此标志化合物为含量从1ppb至25ppm,肉眼不可检测,基本水溶性,在从-2.5至5.0范围内具有一个logP。
如果标志化合物参入到一种水性介质的产品中,免疫分析可以直接用样品本身进行;假如必要可在滤除固体之后进行。否则必须将标志化合物引入水溶液中。
一般来说,提供一个在水溶液中的标志化合物样品,将包括一个或更多的步骤。这些步骤是从下列处理选择的:从产品中用溶剂提取标志化合物;用水性溶剂稀释产品;过滤;蒸发;及标志化合物的固相提取,例如,用离子交换树脂或层析,如用硅胶,纯化标志化合物。在一种明显油性产品的情况下,溶剂提取似乎是必要的。
在分析之前为从产品中提取标志化合物,溶剂的选择基本上依赖于产品及标志物的性质。根据产品及标志物的性质,溶剂一般包括下列成分之一或更多:水;烃,例如苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷及辛烷;亚砜,例如二甲亚砜;卤化羟,例如氯代苯,氯代甲烯,氯仿及四氯化碳;醚,例如乙醚,二恶烷及四氢呋喃;酰胺,例如二甲基甲酰胺及二甲基乙酰胺;腈,例如乙腈;醇,例如甲醇、乙醇、丙醇;酯,例如乙酸乙酯;及酮,例如丙酮。溶剂由水和/或一种可与有机溶剂混溶的水组成更好。当检测用m-苯氧基苯甲酸标志的润滑油时,适当的提取溶剂是油的稀释剂混合物,例如己烷,一种可混溶于水的有机溶剂如乙腈,及水。提取溶剂亦可任选缓冲盐例如Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)来组成。用较好的溶剂系统可把标志物提取到适合于直接进行以后的免疫分析的水相之中。
免疫测定法是用一种预先制备的针对所选的标志化合物的抗体进行的。这样一种抗体是通过已知的技术产生的,这种技术能使人获得对特殊化合物特异的单克隆或多克隆抗体。用单克隆抗体更好。
抗体是在动物体内由称为B淋巴细胞的生成抗体的细胞在动物暴露给外源性化合物(抗原)的反应中产生的蛋白质。这些抗体可特异地结合到刺激它生成的特殊化合物上。
产生抗体的细胞当动物用一种免疫原性化合物免疫时出现在动物的脾内。并非所有化合物都是免疫原性的。分子量在2000以下的化合物一般不是免疫原性的。然而,对这种化合物(称为半抗原)特异的抗体,可以通过把半抗原化学结合到一个较大的免疫原性的载体,例如糖或蛋白质上,并用所产生的免疫原性结合物免疫动物而获得。
将半抗原附着到免疫原性的载体,可用一种双功能分子通过两步化学反应而达到。这样在半抗原和载体间提供一个一定空间间隔的臂,从而可以改善免疫反应。为将化合物化学连接到载体或双功能分子,它本身应含有一个功能基。较好的功能基是氨基、羟基及羧基。
当一只动物已经用一种免疫原性物质免疫时,各种各样的抗体生成细胞受到刺激。由这样一种反应所产生的抗体称为多克隆抗体。
针对一种特殊化合物产生的多克隆抗体对这种化合物的结合并非全部具有相同的特异性。然而,得到全部以相同的特异性及亲和性结合到一种化合物的抗体是可能的。这些抗体称为单克隆抗体。
为了获得这样的单克隆抗体,首先从一个被免疫的动物的脾脏提取出产生抗体的细胞。然后将这些细胞与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。融合可以通过例如用聚乙二醇处理来达到。杂交瘤象抗体生成细胞的前体一样,是能产生抗体的,但却是不死的;它们可在体外连续生长。已知有很多种适于与抗体生成细胞融合的骨髓瘤细胞,并对于受过技术训练的人是容易获得的。一种容易获得的适用的骨髓瘤细胞的实例是PX3-63-AG8-653。这种细胞例如可从AmericanType Culture Collection(美国典型培养物保藏中心,美国马里兰州的洛克维尔市Rockville,获得,其编号为ATCCCRL1580。
抗体生成细胞与骨髓瘤细胞一旦融合,所产生的杂交瘤细胞要与未融合的细胞分离开,并通过重复进行有限稀释而克隆。然后对克隆的杂交瘤细胞进行检测,确定哪一个克隆产生所希望的抗体。这种检测可以通过例如竞争性酶联免疫吸附分析(ELISA)而达到。对于一种化合物的特异性及亲和性可以这样来估价,即把游离的化合物加到ELISA测试体系中,来估计游离的化合物抑制单克隆抗体结合已固相化的化合物的能力。
一种特定的杂交瘤一旦被选择出来,便可用已知的技术不费力的大量的产生单克隆抗体。如果需要的话,这些抗体可用一种酶来标记;例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
为一种化合物生产单克隆及多克隆抗体的技术对于受过技术训练的人来说是已知的。描述这些技术的参考实例包括:酶学方法第70和73卷,分别由Van Vunakis,H及Langone,J.L.主编的免疫化学技术A.B两部分,由Academic Press出版社出版,1980(A部分),1981(B部分),以及Kohler,G.R.Milstein,C.自然杂志(Natune)265卷,495页(1975)。
本发明的另一方面包括对m-苯氧基苯甲酸的新的单克隆抗体。
根据本发明这一方法可包括样品中标志化合物的定性及定量鉴定。此方法较好的包括标志化合物的定量鉴定。可用本法确定掺假的程度。
通过与抗体接触来分析标志化合物,用竞争性酶联免疫分析(ELISA)较好,虽然其他的免疫分析方法亦可采用,包括酶介导的免疫测定法及夹心(sandwich)免疫测量分析法,精确测定分析结果可借助于比色的方法或别的检测方法例如,化学发光或荧光。
这样一种检测方法很适合于野外操作,因为不需要复杂的实验室设备。这很受赞赏。因此本发明进一步提供了一个为检测一种肉眼看不见、基本上水溶性的,与一种产品相联的标志化合物的分析盒。包括提供在水性介质中的所谓的标志样品的部分,免疫分析部分,包括对标志化合物特异的抗体,为监测免疫分析的检测部分以及将免疫分析的结果与预期从真正产品所获得的结果相比较的部分。
为提供一个在水性介质中的所谓的标志的样品的部分,可包括下列内容:为把标志带入水性溶液所需要的溶剂和/或为去除不要的固体的过滤部分和/或固相提取柱(例如含离子交换树脂的柱或层析介质如硅胶)。
免疫分析部分可包括单克隆或多克隆抗体,以适当的数量提供。也可包括一种半抗原,它可被结合到一种固定相。
为监测免疫分析之结果的检测部分可以是,例如,产生和/或测量一个颜色反应的部分。因而一个检测部分可以包括一个酶和这个酶的一个作用物。这个酶可以被连接到半抗原,抗半抗原抗体,或直接针对半抗原抗体的第二抗体。酶的例子,包括辣根过氧化物酶及碱性磷酸酶。作用物的例子包括O-苯二胺二氢氯化物;AmerliteSignal试剂(可从Amersham Intennational PLC获得);及p-硝基酚磷酸酯。一种外检测装置可采用例如一台分光光度计、荧光光度计的发光测量仪。这将受到赞赏。以这种方式,不但标志化合物的存在,而且连其存在量都可被测定,因而给出产品掺假程度的指示。
将免疫分析的结果与预期从真正产品所得结果加以比较的部分可以包括描述一个真正产品的预期结果的说明(包括,例如,一个带颜色的图表,校正表或校正曲线),或者它包括一个与被标志的真正产品相同的标志物样品(与未知样品并行分析的)。
此分析盒最好能表现出此真正产品的材料所具有的看上去别具一格的外观。例如分析盒可带有真正产品的材料所具有的商标。
能够以分析盒的形式提供测定方法,可确保在此领域的人,例如远离产品来源的产品批发商,可以迅速核定产品的可靠性而不必依赖于实验室设施。
本发明现在通过下面的实施例将被进一步描述。
实施例1
打算作为标志化合物的化合物与蛋白质结合物的制备
首先通过化学合成从m-苯氧基苯甲酸(一种半抗原,以后称作PBA)制备一种适当的反应衍生物,然后将此衍生物与蛋白质结合。这样制备出一系列m-苯氧基苯甲酸的蛋白质结合物。这些衍生物同一种14C放射标记来制备,以便监测以后所产生的蛋白质结合物,并检验试剂的去除及计算有半抗原的蛋白质的加载重。
ⅰ)PBA衍生物的制备
R为-(CH2)3COOH
还有两种衍生物的制备系通过中间产物苯酰氯与b)甘氨酸及c)甘氨酰甘氨酸在氢氧化钠存在的情况下进行反应,然后被酸水解产生b)(其R为-CH2COOH)的结果式Ⅰ的衍生物及c)(其R为-CH2CONHCH2COOH)的结果式Ⅰ的另一衍生物。
结果式Ⅰ的衍生物a)亦可通过苯甲基4-氨基丁酸与3-(3′-二甲基氨基丙基)-1-乙基碳二亚胺在水性四氢呋喃中反应产生一种R为-(CH2)3COOCH2Ph的结果式Ⅰ化合物,然后用披钯木炭催化剂在四氢呋喃中氢解产生衍生物a)。
这些衍生物通过以下方法转变为其钠盐(易溶于水)。即按化学计算量加入溶于水中的碳酸氢钠或碳酸钠,再加四氢呋喃直至得到均一的溶液,然后减压蒸干。
ⅱ)蛋白质结合物的制备
如上在ⅰ)项所述方法制备的衍生物,以其钠盐形式,分别溶于水中,调至pH8并冷却至0℃。将3-(3′-二甲基氨基丙基)-1-乙基碳二亚胺溶液,亦冷至0℃,加到衍生物钠盐中,放置2分钟至异脲羧化物完全形成。
然后将每一种衍生物接合到溶解于蒸馏水、去离子水并经过滤的下述蛋白质之一:
牛血清清蛋白(分子量约68,000)
鸡7球蛋白(分子量125,000-750,000)
钥孔血兰蛋白(分子量3,000,000-7,000,000)
加载的操作方法系通过在一分钟内将溶液加入到搅拌中的蛋白质中,混合物在5℃保持几小时以完成接合。必要时将pH调至8。加载的蛋白质用盐水磷酸缓冲液pH7.3透析5至7天,每天更换透析液并通过14C放射活性的测量确定加载量。
实施例2
单克隆抗体的产生
PBA与牛血清清蛋白的结合物,每摩尔蛋白质含15摩尔PBA,用来产生抗体。PBA-牛血清清蛋白是用例1ⅰ)衍生物a)按例1(ⅱ)的步骤制备的。
六只小鼠(Balb/c,雌性)用1∶1的完全佛氏佐剂比PBA结合物(0.1ml,50μg)乳液通过皮下注射进行免疫。每只动物以三周的间隔再注射三次,但用不完全佐剂。另六只动物以相似的一套方法受到较高剂量结合物(200μg)的免疫。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测这12只动物血清样品对PBA的特异性结合。
从产生血清抗体浓度最高的动物切除脾脏,脾细胞用于与PX3-63-AG8-653骨髓瘤细胞(来自于American Type CultuneCollection,Rockville,Maryland,USA,编号ATCCCRL1580)进行融合。杂交瘤细胞分配到十块96孔微量滴定板上。随细胞生长经ELISA检测组织培养上清液中的抗体生成。通过加入游离的PBA到检测体系来确定抗体与ELISA法中固相PBA靶位相结合受抑制的情况以估价特异性。将几个阳性孔中的细胞扩增以积累细胞数量,然后通过有限稀释技术进行克隆。随着细胞的进一步生长,如上法检测其上清液,将几个阳性孔中的细胞扩增,再次克隆。使被鉴定为阳性并进行过第二次克隆的细胞大量生长来产生含足量单克隆抗体的上清液以发展初步的分析测定。
为产生足量的氮克隆抗体以满足中期需要,选择5个克隆细胞的杂交瘤来产生富含抗体的腹水液。每种杂交瘤腹腔内接种10只异十八烷激发的雌性Balb/c小鼠,每只接种107杂交瘤细胞。收集合并腹水液,置深冻中贮存。
抗体亦可通过使杂交瘤细胞于体外在搅动的组织培养器皿中生长来产生。
杂交瘤的克隆细胞之一已作为样品贮存在欧洲动物细胞培养物收集中心(ECACC),应用微生物学及研究的PHLS中心,Porton Down,Salisbury SP4 OJG,英国从1989年1月10日生效,登记号89011001。
实施例3
带标志的润滑油的检测法
一种含10ppm m-苯氧基苯甲酸的带标志的润滑油(可按壳牌商标Rimula X名义获得)被制备出来。制成一系列含不同百分比的标志油及不掺假的(纯)油的样品,每个样品2ml。
通过以下方法从每种油样品中提取PBA以进行分析。从油中提取PBA
1.欲进行可靠性核定的油样置于带塞的容器中。随后将五倍体积的己烷及1倍体积的溶于0.05M Tris/HCl pH7.5中的20%乙腈加到油中并封闭之,然后将混合物摇动1分钟并使所产生的悬液分层。为此仅需约30秒。
2.用一次性塑料吸管从分层的混合物的下层取1等份样品加到一个3ml的NH2 Bond Elut柱(可从Joues Chromatography购得的一种离子交换树脂柱)上,加压使提取物样品通过柱,然后用4份1ml的蒸馏水洗柱。
3.然后用2ml0.05%(V/V)Tween20盐水溶液洗柱。此溶液可洗脱任何结合的PBA。然后每个回收的PBA溶液通过下述方法进行竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)。免疫测定法(通过颜色反应方法检测)
1.用按例1所述制得的PBA-鸡7球蛋白结合物以固定的含量包被塑料孔/管。为达到这种包被,每一份100μl,浓度为10μg/ml的结合物置于孔/管中。然后在仔细控制的温度下保温固定的时间,通过吸附可达到有重复性的包被水平。包被后将孔洗过并可贮存于4℃。
2.将待分析的含PBA的溶液置于含有限定水平的特异性单克隆抗体的预先包被好的孔中。单克隆抗体系按例2所述制备的。抗体样品在1∶1000稀释度下使用。此分析法的基础是溶液中的PBA与作为结合物固定在孔表面的PBA竞争与抗体结合。在固定的期间之后去除孔中的溶液并洗孔。洗后留在孔中的抗体即是结合到固相化PBA上的抗体,残留抗体的水平从而与预先存在于溶液中的游离PBA水平成反比。
3.第二抗体-酶结合物溶液加到孔中。所用的第二抗体-酶结合物为IgG(连接到兔抗鼠免疫球蛋白G的碱性磷酸酶,可由ICN生物试剂公司购得),以1∶1000稀释度,每孔100μl。此结合物可结合到留在孔中并已结合到固相化合物上的任何第一抗体。第二抗体-酶结合物以过量加入,未结合的物质再经洗涤去除。洗过之后,保留在孔中的第二抗体-酶结合物的水平与以上在第二步结合的第一抗体的水平直接成比例。
4.将含有第二抗体-酶结合物中酶的作用物之溶液加到孔中,所存在的酶的水平通过测定有色产物的形成而确定。作用物为p-硝基苯磷酸二钠盐(可从Sigma化学试剂公司以Sigma 104磷酸酶作用物购得),其浓度为1mg/1ml,溶于10%二乙醇胺缓冲液pH9.8中。黄色产物的形成可在405nm用一种垂直光束可见光分光光度计(MR610微盘读数-Dynatech公司)测量之。
比色分析含不同百分率标志油的油样,所得的两套结果如表1。这些结果以样品中标志油的百分率表示。
表1
实施例4:一种检测盒的装配及其在标志润滑油检测中的应用
样品号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
校正的 | 75 | 25 | 100 | 0 | 50 | 0 | 33 | 100 | 10 | 50 |
观察的A系 | 47 | 14 | 100 | 0 | 50 | 0 | 29 | 100 | 0 | 42 |
观察的B系 | 76 | 33 | 93 | 0 | 55 | 0 | 22 | 118 | 31 | 55 |
一种适用于检出三种可能伪造的润滑油样品的检测盒被集装起来。此盒包括:
1)5个由PBA-鸡γ球蛋白结合物包被的塑料管(按下述方法制作);
2)5个离子交换树脂粒(3ml NH2 Bond Elut柱,从琼斯柱层析公司(Johns Chrnmatography)购得);
3)5个10ml体积的提取溶剂,包括8ml己烷及2ml的40%乙腈在0.05M Tris/HCl,pH7.5中;
4)1个含10ppm的m-苯氧基苯甲酸的一个样品(代表一个带标志的真正产品的样品);
5)1个不含m-苯氧基苯甲酸的润滑油样品;
6)5个2ml体积的PBA特异性单克隆抗体在磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS,可以片剂形式从Oxoid公司得到)中稀释10倍,PBS中含0.05%重量/体积的吐温20(聚氧乙烯-山梨糖醇酐单月桂酸酯,可从Sigma化学试剂公司获得,产品目录编号P1379);
7)1体积的抗体-酶结合物(由辣根过氧化物酶结合的针对鼠免疫球蛋白的兔免疫球蛋白,可从DAKO有限公司得到,产品目录编号P161);
8)化学发光作用物(Amerlite Signal Reagent,可从Amersham International PLG得到,产品目录编号LAN4400);
9)洗液,含0.05%(体积/体积)Twecn20溶于生理盐水中(ST);
10)柱流洗液,由蒸馏水构成;及
11)1页说明书。用PBA-鸡γ球蛋白结合物包被的塑料管的制备
塑料管用一定量的PBA-鸡γ球蛋白结合物包被,PBA-γ球蛋白结合物按例1所述制备。为达到如是包被,在管中放置每测量份500μl结合物,其浓度为20μg/ml。然后室温下保温3小时,通过吸附可达到有重复性的包被。在包被之后,用生理盐水/Tween溶液(ST)如例3所述洗管。干燥并最好贮存在4℃,备用。检测盒检测带标志润滑油的应用
1)为了实现这一检测,第一步为制备化学发光作用物,制备方法按制造商的说明书进行。
2)属于检测盒的二个样品及三个未知的润滑油样品,用5个体积的提取溶剂及5个离子交换柱,按例3的方法提取。然后用每份2ml的柱流洗液二份洗柱。
3)然后用一份2ml的洗液洗脱每个柱,收集在含2ml体积的PBA-特异性单克隆抗体的小玻璃瓶中。
4)然后混合瓶内的内容物,从5个混合物的每一个之中取出至少500μl转移至5个用PBA-鸡γ球蛋白结合物包被的塑料管中。5分钟后吸去管中的溶液并用洗液洗管一次。
5)向每管中加入500μl抗体-酶结合物溶液。保温5分钟后吸去管中内容物,用洗液洗管5次。
6)然后向管中加入化学发光作用物1ml并在2分钟后测量发出光,测量用一种便携式,电池供电的,管式发光计(可从Dynotech Laboratories Ltd获得)按操作说明进行。仪器的读数为0-999的3位数字。
7)此法之重复性通过2个操作者在四个星期对35介检测系列进行了估价。对这一实验系列的内检测变化系数(CV)为9.1%发现假如正确进行检测,阳性对照(较低的读数)与阴性对照(较高的读数)之比为0.612±0.056(即±1个标准差(SD)。对于一个“未知”油数值为0.725或更大表明“可能是伪造”样品。
实施例5:带标志汽油的检测法
13ml的含铅的及除铅的汽油用三个水平(10.5及2.5ppm)的PBA作标志。用Tris缓冲液(2ml,0.05M,pH7.5)提取之。按例3所述检测提取物,并用以无标志物的汽油提取物制作的标准校正曲线定PBA的量。制备含有放射性标记的PBA的相应样品以便确定提取的效率,并对观察值及预计值进行比较。结果如表2所示。
表2
在无标志物的汽油提取物中水性检测样品对校正曲线的观察值与预料值之比较
样 品 | 空白 | 10ppm提取物 | 烯释的10ppm提取物 | 5ppm提取物 | 烯释的5ppm提取物 | 25ppm提取物 | |||
1∶2 | 1∶4 | 1∶8 | 1∶2 | 1∶4 | |||||
含铅的汽油 | |||||||||
预料的(放射化学)观察的 | 00.9 | 46*47 | 2322.5 | 11.511.0 | 5.76.4 | 2329 | 11.413.5 | 5.75.3 | 11.413.5 |
无铅的汽油 | |||||||||
预料的(放射化学)观察的 | 00.9 | 3341 | 16.218.5 | 8.17.0 | 4.13.8 | 15.514.5 | 7.76.2 | 3.93.4 | 7.57.6 |
*所有数值以ppm引用。
这些结果证明从13ml的汽油提取PBA到2ml Tris缓冲液所达到的浓液效果,并令人信服的证明用PBA作标志的汽油可通过免疫检测法与未带标志的汽油区分开。实施例6带标志药品的检测法
制备含20ppm固体PBA的退热净(对乙酰氨基酚-一种温和的镇疼及解热剂)及甲氧基甲基萘乙酸(一种非类固醇抗炎剂)的标志样品。每份(1克)加至置于20ml玻璃瓶中的10mlPBS/Tween(在例4中已述及)中。同样为这两种材料制作无标志物的检测空白。将瓶翻滚过夜以将PBA提取到PBS/Tween中。然后通过离心分离不溶物,每份样品,含250μl上清液,加至250μlPBA特异性的抗体中并用类似于例4所述的检测盒进行分析。
从表3所示的结果证明,有标志的药品可很清楚的区别于无标志的药品。
表3
药物 | 无标志的* | 标志的* | 比率(%) |
退热净 | 400394377378281266386398517480469平均比率=74 | 288275283278206203303267357378379标准差(S.D.)=4.2 | 7270757473767867697980变化系数(C.V.)=5.7% |
表3(续)
药物 | 无标志的* | 标志的* | 比率(%) |
甲氧基甲基萘乙酸 | 517503355313279269269245平均率=71 | 350337260226185220204153标准差(S.D)=5.7 | 6867737266817664变化系数(C.V)=8.0% |
*所指示的表值是从例4所述的管形发光计读出的。
实施例7:
带标志的香料的检测法
科隆香水′Eau de Cologne '的样品被制成含20ppm的的PBA.2ml的带有标志材料及2ml无标志的材料被置于小玻璃试管中在弱气流下减压蒸发至开始发干。2mlPBS/Tween(如例4所述)被加至油样残渣中,通过顶点混匀器将管内容物剧烈混匀。不溶的,比水重的油随后通过离心分离,各份上清液样品如例6所述进行分析。从表4所示结果证明有标志的香料明显区别于无标志者。
表4香 料 未标志的 有标志的 比率(%)Eau de Cologne 866 104 12(科隆香水) 851 243 29
655 107 16
722 133 18
710 126 18
782 196 25
平均比率=20 S.D=6.2 C.V=31.6%
(标准差) (变化系数)所示数值如例4所述由管状发光计读出。
作为另一种途径可将有标志及无标志的Eau de Cologne用PBA/Tween稀释10倍,如例6所示直接加以检测。结果列于表5并指明这种变更的方法亦在无标志的及有标志的香料间形成明显的区别。
表5
香 料 无标志的 有标志的 比率(%)Eau de Cologne 736 499 68(科隆香水) 760 522 69
494 324 66
382 267 70
401 233 58
385 257 68
352 210 60
484 307 63
640 426 67
平均比率=65.4 S.D=4.2 CV=6.4%
实施例8:带标志饮料的检测法
制备含20ppm PBA的混合威士忌样品。带有标志的威士忌及相应的无标志的威士忌用PBS/Tween稀释4倍,每份250μl的样品用例6所述方法进行分析。表6所示结果说明,有标志的威士忌清楚的区别于无标志的威士忌。
表6
饮料 | 无标志的* | 有标志的* | 比率(%) |
威士忌 | 375396381449435427431421387440412386353474452446平均比率=28.4 | 1191581801101041099511611786122122107115106111标准差=6.9 | 31394725242622283019303230242325变化系数=24% |
*指示的数值如例4所述从管状发光计获得,在此样品中值得
注意的是所产生的信号约需20分钟来形成。
Claims (1)
1.一种标记的产品,包括:
(a)与其混合物的市售石油产品;
(b)一种通常不与该石油产品相连的半抗原标记物。
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