FR2917174A1 - Analyse multiple d'echantillons sanguins - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de détection d'une pluralité de molécules antigéniques portées par les érythrocytes et/ou d'une pluralité d'anticorps anti-érythrocytaires d'un individu, comprenant la mise en contact d'un échantillon avec des billes distinguables, sur lesquelles sont fixés a) des anticorps spécifiques desdits antigènes ou b) des érythrocytes, des fragments membranaires d'érythrocytes, ou des antigènes de groupe sanguin.

Description

L'invention concerne l'analyse du groupe et du phénotype érythrocytaire,

ainsi que la recherche d'anticorps irréguliers anti-érythrocytes, la détermination de la compatibilité entre un donneur et un receveur et la mise en évidence d'érythrocytes revêtus d'anticorps ou de fractions sériques activées du complément.

La transfusion sanguine consiste de nos jours à administrer par voie intraveineuse des préparations de concentrés de globules rouges (concentrés globulaires) obtenues à partir de sang de donneurs. Lors d'une transfusion sanguine, le risque premier est lié à la possibilité de réunir dans l'organisme du receveur (la personne transfusée) un anticorps et son antigène érythrocytaire. On trouve en effet à la surface des érythrocytes, appelés encore globules rouges ou hématies, des antigènes membranaires, notamment des antigènes de groupe (ou système) sanguin, capables d'être reconnus par le système immunitaire et de déclencher une réponse immune avec hémolyse des globules rouges. Les conséquences d'une telle réaction immunologique peuvent aller d'une transfusion inefficace sans signe clinique, à une réaction clinique légère (angoisse, frisson), grave (choc, hémoglobinurie, insuffisance rénale), ou dramatique (choc, hémolyse intravasculaire disséminée) conduisant au décès. Les globules rouges du donneur sont dits compatibles avec le sang du receveur si le receveur ne présente pas d'anticorps circulants dirigés contre un antigène érythrocytaire du donneur. Parmi l'ensemble des variants antigéniques d'un antigène membranaire érythrocytaire constituant les groupes sanguins, plus de vingt systèmes antigéniques érythrocytaires chez l'homme ont été à ce jour identifiés : le système ABO avec les antigènes A, B et H, le système Rhésus (RH) avec notamment les antigènes D (l'absence de l'antigène D étant noté d), C, E, c et e, le système Kell (KEL) avec notamment les deux antigènes K et k, le système Duffy (FY) avec notamment les antigènes Fya et Fyb, le système Kidd (JK) avec notamment les antigènes Jka et Jkb ou encore d'autres systèmes moins fréquemment recherchés en pratique tels que les systèmes MNS, Lewis (LE), etc.. Les individus présentant une même association d'antigènes érythrocytaires appartiennent à un même groupe sanguin érythrocytaire. En dehors de situations pathologiques, telles que dans le cas de maladies auto-immunes, le 30 sérum d'un individu peut contenir deux types d'anticorps dirigés contre des antigènes érythrocytaires: - (i) Les anticorps dits réguliers et dirigés contre les antigènes du système ABO (par exemple anticorps anti-A chez l'individu de groupe B). - (ii) Les anticorps dits irréguliers (ou immuns) dont la présence dans le sérum ou plasma est facultative et qui sont dirigés plus particulièrement contre des antigènes des systèmes non ABO. Les anticorps dits réguliers sont des immunoglobulines d'isotype M et/ou A qui sont capables d'agglutiner les globules rouges in vitro. Ce phénomène est mis à profit pour déterminer le groupe ABO d'un individu par les épreuves de Beth-Vincent et Simonin, l'épreuve de Beth-Vincent permettant de déterminer les antigènes portés par ses globules rouges (phénotype antigénique) et l'épreuve de Simonin permettant de réaliser l'étude complémentaire, c'est à dire de déterminer les anticorps anti-A et/ou anti-B circulants présents dans le sérum de l'individu. Dans l'épreuve de Beth-Vincent, les globules rouges de l'individu sont mis en présence de sérums tests, ou anticorps tests, possédant chacun une spécificité anticorps précise, dirigée contre un antigène du système ABO. Il s'agit donc d'un test d'agglutination des globules rouges avec des sérums tests.

Dans l'épreuve de Simonin, appelée encore contre-épreuve, le sérum ou le plasma de l'individu, contenant ses anticorps circulants, est mis en présence de globules rouges tests, ou érythrocytes tests, appartenant chacun à un groupe antigénique précis du système ABO. Il s'agit donc d'un test d'agglutination du sérum avec des globules rouges tests. Les anticorps dits irréguliers (ou immuns) sont le plus souvent d'isotype G, apparaissant à l'occasion d'une stimulation antigénique par des globules rouges étrangers, par exemple suite à une immunisation contre un ou plusieurs antigènes lors d'une transfusion sanguine ou encore lors d'une grossesse par réaction immunitaire maternelle dirigée contre les antigènes érythrocytaires foetaux n'appartenant pas au groupe sanguin maternel, notamment lors de l'accouchement.

La recherche de ces anticorps dits irréguliers est appelée Recherche d'Agglutinines Irrégulières (RAI). Ce test est utilisé pour détecter la présence ou non dans le sang d'un individu d'anticorps dirigés contre divers antigènes érythrocytaires. Pour cela, on cherche à mettre en évidence la fixation de ces anticorps (IgG et/ou IgM) sur des globules rouges tests dont les antigènes sont connus. On procède en parallèle avec de nombreux types de globules rouges, la comparaison des résultats permettant de déduire la ou les spécificités des anticorps présents. Le risque lié à une réaction immunologique est d'autant plus important que cette réaction implique les antigènes les plus immunogènes comme ceux du système Rhésus (le gradient de dangerosité pour ce système étant le suivant : D>E>c>e>C), puis selon un ordre d'immunogénicité décroissante l'antigène K du système Kell, les antigènes Fy a et Fy b du système Duffy, les antigènes Jk a et Jk b du système Kidd, etc... En pratique, on ne peut tenir compte de tous ces antigènes pour réaliser une transfusion faute de quoi on ne disposerait jamais du bon groupe sanguin au bon moment, d'autant moins que certaines associations antigéniques sont très rares. La transfusion standard ne tient donc compte le plus souvent que du groupe dans le système ABO et du système Rhésus D (Rh+ ou Rh-). Toutefois, dans les situations à risques d'apparition d'une agglutinine irrégulière, on tient compte d'un certain nombre d'autres systèmes, notamment les Rhésus C, c, E et e et le Kell, voire encore d'autres systèmes. Il s'agira alors pour ces situations à risques de respecter la compatibilité du groupe sanguin du donneur avec celui du sang du receveur en tenant compte de la présence ou du risque d'apparition de ces agglutinines irrégulières. Ainsi, chez un patient receveur porteur d'anticorps irréguliers anti-érythrocytaires ou dans une situation à risques comme notamment chez les patients polytransfusés ne possédant pas d'anticorps irréguliers anti-érythrocytaires et chez la femme enceinte, il est indispensable de sélectionner les unités de concentrés érythrocytaires qui vont être transfusées de telle sorte que les globules rouges du donneur devront être dépourvus des antigènes contre lesquels les anticorps du receveur sont dirigés ou susceptibles d'apparaître. En pratique transfusionnelle, actuellement, les professionnels peuvent adopter deux attitudes : - soit ils recherchent systématiquement la présence d'anticorps irréguliers dans le sérum ou le plasma du patient, et si de tels anticorps sont présents, ils choisissent des concentrés érythrocytaires dépourvus des structures antigéniques mises en cause ( il s'agit du cas rencontré le plus fréquemment en France), - soit ils pratiquent une épreuve de compatibilité directe avec les hématies du donneur en 25 présence du sérum ou plasma du receveur dans laquelle aucune réaction d'agglutination et/ou de lyse ne doit être observée. En pratique clinique transfusionnelle, le phénotypage érythrocytaire, qui correspond à la recherche et à l'identification des antigènes de groupe sanguin à la surface des hématies (à l'exception du système particulier ABO où l'on recherche en outre la présence des 30 anticorps réguliers correspondants), concerne aussi bien le receveur que le donneur. A l'échelon du receveur et du donneur, trois niveaux de phénotype érythrocytaire existent afin de mettre à disposition du receveur des concentrés érythrocytaires compatibles en fonction des situations à risque: - la détermination du phénotype groupage ABO (ou groupage ABO) et Rhésus standard (présence ou absence de l'antigène D); - la détermination du phénotype Rhésus Kell (présence ou absence des antigènes C, E, c, e et K) ; et - la détermination du phénotype étendu (ou élargi), à savoir la détermination de la présence ou absence des antigènes du système Duffy, Fy a et Fy b, du système Kidd, Jk a et Jk b, du système MNS et du système Lewis, d'autres antigènes pouvant être en outre recherchés selon la nature du risque et/ou de l'anticorps irrégulier mis en évidence dans le sérum du receveur.

Les techniques habituellement utilisées pour le phénotypage consistent en général à rechercher, à l'aide de sérums tests contenant les anticorps appropriés, la présence ou l'absence de l'antigène recherché. De préférence, ces anticorps contenus dans ces sérums tests sont de nature agglutinante (IgM ou IgA), ce qui permet d'obtenir une agglutination totale ou partielle des érythrocytes à phénotyper lorsque ces derniers portent l'antigène correspondant à l'anticorps présent dans le sérum test. Néanmoins, il est possible d'utiliser des anticorps tests non agglutinants (de type IgG), en mettant en évidence leur présence par agglutination au moyen d'une anti-immunoglobuline (technique dite de Coombs indirect). Pour la recherche et l'identification dans l'échantillon de sérum ou de plasma du patient à tester d'anticorps anti-antigène de groupe sanguin, réguliers pour le groupage ABO ou irréguliers dans le cadre de la RAI, on met en général en présence du sérum ou du plasma du patient avec des érythrocytes-tests (appelés encore hématies-, ou globules rouges-tests, d'antigénicité connue dans un certain nombre de systèmes de groupes sanguins (ABO, Rhésus, Kell, Duffy, Kidd, MNS, ...). Pour la RAI, pour laquelle les anticorps susceptibles d'être présents sont plutôt de type non agglutinants, les techniques utilisées sont de type Coombs indirect par agglutination au moyen d'une anti-immunoglobuline ou par immunoadhérence sur une phase solide et révélation par des hématies revêtues d'une antiimmunoglobuline telles que décrites dans le brevet EP 0367468. Dans le cas de la RAI, on utilise dans une première étape un panel de globules rouges dit de dépistage (deux ou trois globules rouges de groupes différents choisis de façon à comporter la totalité des antigènes d'importance transfusionnelle permettant de détecter (mais pas d'identifier) la présence ou l'absence d'anticorps irréguliers. Lorsque le dépistage est positif, on réalise alors l'identification de la spécificité du ou des anticorps irréguliers présents au moyen d'au moins un panel de globules rouges dit d'identification comportant en général 10 à 15 voire 20 globules rouges différents phénotypés dans la grande majorité des systèmes de groupes sanguins connus. Dans le cas de l'épreuve de compatibilité, on utilise également la technique de Coombs indirecte. Ainsi, on met en présence les hématies du donneur provenant d'échantillons prélevés dans les poches susceptibles d'être transfusées, le sérum du receveur et une antiglobuline. Une telle analyse conduit seulement à la détermination de la présence ou de l'absence d'anticorps mais ne permet pas d'en déterminer la spécificité. Il existe un grand nombre de variantes des techniques utilisées pour le phénotypage ou la RAI dans le domaine de la transfusion sanguine, ces techniques pouvant être manuelles, sur plaque d'opaline, en tube ou en cupule de microplaque, en colonne de gel, ou complètement automatisées à l'aide de robot distributeur d'échantillon et de réactif, agitateur, incubateur, centrifugeuse et lecteur automatique dont les programmes sont adaptés aux techniques mises en oeuvre.

Les techniques actuelles présentent néanmoins un certain nombre de limites. Actuellement, lorsque l'on fait la détermination d'un groupe sanguin, le résultat final correspond au cumul de plusieurs résultats discrets, qui ne sont pas réalisés avec la même prise d'échantillon. L'utilisation de plusieurs prises d'échantillons du même patient influe sur la fiabilité du test. En outre elle requiert la prise d'un volume important de sang, ce qui peut être problématique chez certains patients (par exemple chez les nourrissons et chez les patients fortement anémiés).

Pour la détermination du groupe ABO notamment, l'analyse est le résultat de la combinaison et de l'interprétation de deux types d'analyses : les analyses sériques avec du plasma ou du sérum et les analyses cellulaires à partir du culot globulaire. Dans le cas de la recherche d'anticorps irréguliers, le dépistage est généralement réalisé en première intention, puis en cas de positivité, l'échantillon est trié pour identifier la spécificité de l'anticorps. Ces deux étapes retarde le moment du rendu du résultat et peuvent dégrader les échantillons. De plus, le volume d'échantillon s'avère souvent insuffisant pour poursuivre l'étude (c'est en particulier le cas avec des mélanges d'anticorps) obligeant à re-prélever le patient. La multiplicité de ces étapes nécessite la mise en place de procédures strictes de suivi pour éviter les erreurs.

Par ailleurs, tous les tests de groupage et phénotypage basés sur le principe d'agglutination sont impossibles pour certains systèmes (Duffy par exemple), où seuls des anticorps humains d'isotype G sont disponibles, ceux-ci étant incapables d'agglutiner directement les hématies porteuses de l'antigène spécifique. Dans ce cas, il est fait recours à un réactif complémentaire (AGH) reconnaissant ces immunoglobulines humaines et permettant le pontage entre les anticorps fixés aux hématies à tester. Cependant ce type de réactif ne peut être utilisé dans le cas de patients possédant des hématies sensibilisées in vivo par des anticorps (anémie auto-immune, nouveau-né...), au risque de provoquer une réaction d'agglutination non spécifique (agglutination même en l'absence de l'antigène considéré à la surface de l'hématie). Il est donc impossible de délivrer le phénotype de cette catégorie de patients et cela provoque un véritable problème de santé publique. En effet, dans ce cas le médecin transfuseur a l'obligation de transfuser des hématies dont le maximum de marqueurs antigéniques sont négatifs, de telles hématies n'étant pas toujours disponibles dans les unités thérapeutiques.

En outre, avec les technologies actuellement disponibles, le temps nécessaire pour rendre un résultat exploitable qui résulte souvent de la combinaison des résultats de plusieurs tests est au minimum de l'ordre de deux fois trente minutes alors que les situations nécessitant des transfusions sont généralement des situations d'urgence pour lesquelles il serait souhaitable de pouvoir déterminer dans un délai le plus court possible la compatibilité entre le donneur et le receveur.

Résumé de l'invention La présente invention résout ces problèmes, en fournissant un procédé rapide et simple, pouvant être entièrement automatisé et permettant de réaliser le groupage, le phénotypage de globules rouges, la recherche d'anticorps irréguliers anti-érythrocytes, la détermination de la compatibilité entre un donneur et un receveur, et la mise en évidence d'hématies revêtues soit d'anticorps soit de fractions sériques du complément, le procédé étant de préférence réalisé en format multiplexe avec un seul échantillon. L'invention fournit ainsi un procédé in vitro d'identification des molécules antigéniques portées par les érythrocytes ainsi que des anticorps anti-érythrocytaires susceptibles d'être présents chez un individu, de préférence en format multiplexe, comprenant la mise en contact d'un échantillon, avec des billes distinguables, sur lesquelles sont fixés a) des anticorps spécifiques desdits antigènes ou b) des érythrocytes, des fragments membranaires d'érythrocytes ou des antigènes de groupe sanguin, dans des conditions permettant aux anticorps de se lier à leurs antigènes, le cas échéant avec activation de la fraction sérique du complément, sans agglutination, notamment des érythrocytes ou des billes distinguables. Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé in vitro d'identification de molécules antigéniques portées par les érythrocytes et/ou des anticorps anti-érythrocytaires d'un individu, comprenant a) l'identification d'une pluralité de molécules antigéniques portées par des érythrocytes dans un échantillon biologique, par (i) la mise en contact, dans un unique récipient d'essai, ou dans plusieurs récipients d'essai séparés, dudit échantillon contenant des érythrocytes, avec des groupes de billes distinguables, chaque groupe de billes distinguables portant un anticorps déterminé, spécifique d'une molécule antigénique portée par des érythrocytes, différant d'un groupe de billes à l'autre, dans des conditions permettant aux érythrocytes de se lier aux anticorps, sans agglutination, lesdits érythrocytes étant marqués préalablement ou postérieurement à leur mise en contact avec lesdits groupes de billes, (ii) l'élimination des érythrocytes qui ne sont pas liés auxdits anticorps, et ; (iii) l'identification du groupe de billes ayant lié les érythrocytes marqués, ce qui permet l'identification des antigènes portés par les érythrocytes détectés; et/ou b) l'identification d'une pluralité d'anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon biologique, par (i) la mise en contact dans un unique récipient d'essai, ou dans plusieurs récipients d'essai séparés, dudit échantillon avec des groupes de billes distinguables, chaque groupe de billes distinguables portant (1) des érythrocytes, (2) des fragments membranaires d'érythrocytes ou (3) des antigènes de groupe sanguin, de phénotype connu différant d'un groupe de billes à l'autre, dans des conditions permettant aux anticorps ou aux fractions sériques activées du complément présents dans l'échantillon, de se lier aux érythrocytes, aux fragments membranaires d'érythrocytes ou aux antigènes de groupe sanguin, sans agglutination ; (ii) l'élimination des anticorps ou fractions sériques activées du complément qui ne se sont pas liés auxdits érythrocytes ou auxdits fragments membranaires d'érythrocytes ou auxdits antigènes de groupe sanguin, (iii) le marquage des anticorps liés et/ou des fractions sériques activées du complément liées, et (iv) l'identification du groupe de billes ayant lié les anticorps ou les fractions sériques activées du complément marqués, ce qui permet l'identification des anticorps anti-5 érythrocytaires présents. De préférence, le mode (a) et/ou le mode (b) sont réalisés en format multiplexe, dans un unique récipient. La dernière étape a-(iii) ou b-(iv) comprend alors l'analyse du mélange pour identifier quel groupe de billes a lié les érythrocytes marqués, ou a lié les anticorps ou les fractions sériques activées du complément, respectivement. 10 L'invention a également pour objet un ensemble de réactifs destinés à mettre en oeuvre le procédé de détection ci-dessus, comprenant des groupes de billes, porteuses chacun d'au moins un paramètre physique détectable particulier, et appartenant à au moins deux groupes différents, l'un des groupes étant porteur d'un anticorps de capture spécifique d'une molécule antigénique portée par des érythrocytes, et l'autre groupe étant porteur (1) d'érythrocytes, (2) 15 d'un fragment membranaire d'érythrocytes ou (3) d'un antigène de capture, qui est un antigène de groupe sanguin.

Description détaillée de l'invention Définitions : 20 Dans la présente description, les termes érythrocyte , globule rouge et hématie sont employés indifféremment pour désigner la même cellule sanguine. Le terme multiplexe signifie que plusieurs réactions de type antigène-anticorps différentes sont analysées de manière simultanée pour un unique échantillon dans un unique récipient et à l'aide d'un seul système de lecture du signal. 25 Le terme simplex signifie que les réactions de type antigène-anticorps sont analysées dans plusieurs récipients séparés. De préférence les analyses sont néanmoins réalisées de manière simultanée et de préférence à l'aide d'un seul système de lecture du signal. L'expression molécule antigénique portée par des érythrocytes désigne non seulement tout antigène érythrocytaire retrouvés physiologiquement à la surface des érythrocytes, 30 notamment un antigène d'un groupe sanguin, mais également des antigènes présents à la surface des érythrocytes résultant de réactions immunologiques dues à des antigènes érythrocytaires. Dans ce cas, le terme molécule antigénique portée par les érythrocytes comprend des anticorps ou des éléments activés de la fraction sérique du complément portés par des érythrocytes sensibilisés in vivo.

De manière générale, les molécules antigéniques portées par les érythrocytes sont donc choisies dans le groupe constitué par des antigènes membranaires érythrocytaires constituant les groupes sanguins, des fractions sériques activées du complément portées par les érythrocytes, et des anticorps présents à la surface des érythrocytes sensibilisés.

L'expression anticorps anti- érythrocytaire désigne tout anticorps se liant spécifiquement à un antigène porté par des érythrocytes. Par individu , on entend tout animal présentant une pluralité de groupes sanguins. Comme animal présentant une pluralité de groupes sanguins, on peut citer par exemple le chien chez qui huit groupes sanguins différents ont été identifiés à ce jour, et le chat qui en présente trois.

Bien entendu, le terme d'individu concerne également l'être humain y compris au stade foetal. Par échantillon biologique , on entend toute fraction d'un liquide corporel ou d'une biopsie tissulaire, susceptible de contenir des érythrocytes ou des anticorps antiérythrocytaires, que cela soit de façon physiologique ou pathologique. Comme échantillon biologique, on peut donc citer un échantillon de sang, et en particulier un échantillon de sang total, de culot globulaire, de concentré globulaire thérapeutique (ou une poche de sang), mais également de la salive, de la sueur, des larmes, du lait ou de l'urine lorsque celle-ci comporte du sang. Pour la recherche des anticorps, on peut aussi utiliser un échantillon de plasma ou de sérum. Pour la détermination des antigènes portés par les érythrocytes, l'échantillon biologique peut consister en un culot globulaire. L'échantillon utilisé dans le mode (a) peut être identique ou différent de l'échantillon utilisé dans le mode (b). Quand l'échantillon est identique, les modes (a) et (b) peuvent être réalisés dans le même récipient, simultanément. L'échantillon biologique peut n'avoir subi aucun pré-traitement. Le terme anticorps se réfère à tout anticorps entier ou fragment fonctionnel d'un anticorps comprenant ou consistant en au moins un site de combinaison antigénique, permettant audit anticorps de se lier à au moins un déterminant antigénique d'un composé antigénique. A titre d'exemple de fragments d'anticorps on peut citer les fragments Fab, Fab', F(ab')2 ainsi que les chaînes scFv (Single chain variable fragment), dsFv (Double-stranded variable fragment), etc... Ces fragments fonctionnels peuvent notamment être obtenus par génie génétique.

Par antigène de capture , on entend un fragment antigénique fixé sur une phase solide, qui est capable d'être reconnu par des anticorps et de permettre une liaison affine avec ces derniers. L'antigène de groupe sanguin fixé sur les billes est un antigène de groupe sanguin, qui peut être un antigène de synthèse, produit par voie chimique ou par recombinaison génétique. Il peut aussi s'agir d'un antigène purifié à partir d'un échantillon biologique.

Par anticorps de capture , on entend un anticorps ou une partie d'anticorps, fixé sur une phase solide, qui est capable de retenir au moins un déterminant antigénique d'un composé antigénique présent dans un échantillon biologique, par liaison affine. Les anticorps utilisés comme outils de détection peuvent être des anticorps polyclonaux ou 5 monoclonaux. La production d'anticorps monoclonaux ou d'anticorps polyclonaux utiles dans le cadre de l'invention relève de techniques conventionnelles. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de fusion lymphocytaire et culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein (Nature, 256, p. 495-497(1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également 10 connues (Harlow et al. editors, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés en immunisant un mammifère (par exemple une souris, un rat, un lapin, voire un être humain, etc...) et en utilisant la technique de fusion lymphocytaire conduisant à des hybridomes (Kôhler et Milstein, 1975, supra). 15 Des techniques alternatives à cette technique usuelle existent. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique cloné à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ( phage display ), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux (par exemple, fUSE5 pour E.coli, Scott et al. (Science, 20 249, pp. 386-390 (1990)). Ces derniers constituent des banques et présentent des fragments scFv à leur surface. Des protocoles de construction de ces banques d'anticorps sont décrits dans Marks et al. (1991) (J. Mol. Biol., 222, pp. 581- 597, (1991)). Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre un antigène, de préférence de nature peptidique, selon les modes opératoires usuels. 25 D'une manière générale, on peut utiliser, par exemple, comme immunogène, un polypeptide, en particulier recombiné, ou un oligopeptide. Selon un protocole classique, des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg de l'immunogène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al. [PNAS USA, 79, pp. 917-921 (1982)].

30 Les billes : Les billes sont généralement constituées de polymères inertes vis à vis des constituants des échantillons biologiques ; elles sont solides et insolubles dans les échantillons. Les polymères utilisés peuvent être des polyesters, polyéthers, polyoléfines, polyamides, polysaccharides, polyuréthanes ou celluloses. Des agents liants peuvent être également utilisés pour apporter une intégrité et une structure aux particules. Des groupes fonctionnels peuvent être incorporés avec ces polymères pour permettre la fixation ou le couplage de macromolécules d'intérêts biologiques (protéines, lipides, glucides, acides nucléiques). Ces groupes fonctionnels, connus de l'homme du métier, peuvent être des fonctions animes (-NH2) ou anmmonium (-NH3+ ou -NR3+), des fonctions alcooliques (-OH), des fonctions carboxyliques (-COOH) ou isocyanate (-NCO). Les monomères les plus couramment utilisés pour introduire des fonctions COOH dans les polyoléfines sont l'acide acrylique ou l'acide méthacrylique.

La fixation de réactifs sur la surface des billes peut se faire par attractions électrostatiques, interactions d'affinité, interactions hydrophobes ou couplage covalent. Le couplage covalent est préféré. Les billes utilisées dans l'invention sont des particules de forme approximativement sphérique, de tailles pouvant être comprises entre 0,5 et 40 m, de préférence entre 4 et 9 et 15 plus particulièrement entre 5 et 8 m. Les billes utilisées ici sont distinguables en ce qu'elles présentent des marqueurs différentiels permettant de les distinguer lesunes des autres par un détecteur approprié. Chaque groupe de billes possède donc des propriétés physicochimiques différentes (taille, densité, granulométrie, rugosité, absorbance, fluorescence, composants paramagnétiques) 20 permettant de les différencier les unes des autres à l'aide de détecteurs ou d'outils adaptés, par exemple un cytomètre en flux. Comme paramètre différentiel permettant de distinguer les particules entre elles, on peut utiliser en particulier la taille des particules en choisissant des plages de taille non chevauchantes. 25 Dans un autre mode de réalisation préféré, les particules distinguables émettent des signaux de fluorescence. Les billes qui incorporent différents marqueurs fluorescents peuvent en effet être distinguées par leur spectre de fluorescence. Pour cela, les billes peuvent être imprégnées d'un ou plusieurs colorants (par exemple, fluorescent, luminescent, etc), le cas échéant à différentes concentrations, ou d'un marqueur de type radio-isotope, enzymatique, etc. 30 (Venkatasubbarao S. Microarrays-Status and prospects Trends in Biotechnology Dec 2004, 22(12) :630-637 ; Morgan et al, Cytometric bead array : a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology , Clin. Immunol. (2004) 100:252-266). La dispersion, l'émission de lumière ou leur combinaison peuvent aussi être utilisées pour permettre la distinction des particules entre elles.

Dans un mode de réalisation préféré, les billes distinguables émettent des signaux luminescents ou fluorescents. Les billes utilisées peuvent être superparamagnétiques ou non. Comme billes superparamagnétiques pouvant être utilisées selon l'invention, on peut citer notamment celles décrites dans US 6,872,578. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les billes utilisées sont fluorescentes et super paramagnétiques. Ces propriétés physicochimiques peuvent permettre, lors de la réaction avec l'échantillon biologique, la séparation des fractions capturées par ces microparticules de celles non liées. Cette séparation pouvant se faire entre autre par centrifugation, filtration ou aimantation. La séparation par aimantation est préférée et pour cela des billes contenant des composants paramagnétiques, ferromagnétiques, ferrimagnétiques et métamagnétiques peuvent être utilisées. Les composants paramagnétiques sont préférés comme par exemple le fer, le cobalt, le nickel ou des oxydes métalliques tel que le Mn2O3, Cr2O ou le Fe3O4. La quantité de composants magnétiques peut être comprise (en poids) entre 2% et 50 % et préférentiellement entre 3% et 25%.

Les anticorps peuvent être fixés aux billes (selon a) par toute technique appropriée. Ils peuvent être fixés par covalence directe, ou de manière non-covalente, notamment par adsorption passive ou par affinité. La fixation covalente directe peut être réalisée par le biais d'une activation des groupements carboxyliques présents à la surface des billes, impliquant une liaison par hydroxysuccinimide ou carbodiimide par exemple. Dans un mode de réalisation particulier, on fixe d'abord sur les billes des anticorps anti-immunoglobulines, par covalence, puis on met en contact les billes avec les anticorps à fixer.

Les érythrocytes, les fragments membranaires d'érythrocytes ou les antigènes de groupe sanguin peuvent être fixés aux billes par liaison non covalente via une poly-L-lysine, ou par tout type de ligand tel que des polycations de type colorant. Les érythrocytes, les fragments membranaires d'érythrocytes ou les antigènes synthétiques peuvent également être fixés aux billes par liaison covalente notamment à l'aide de périodate de sodium. On a constaté de façon surprenante que la fixation des hématies ou des fragments de 30 membranes, quelle soit covalente ou non, n'altère pas la propriété des billes d'être distinguables suivant un procédé de cytométrie en flux. Par ailleurs, il est possible de fixer de la même manière, à la surface de ces billes, des antigènes synthétiques homologues de certains antigènes de groupe sanguins et présents à la surface des érythrocytes. La fixation de ces antigènes n'altère pas non plus la propriété des billes à être distinguables. De tels antigènes synthétiques peuvent être par exemple des polyoses.

Les billes sont soumises à une mesure par un détecteur tel qu'un cytomètre en flux, comme décrit par exemple dans la demande de brevet de Luminex WO97/14028. Ainsi, des sous-groupes de billes porteuses d'un réactant (anticorps ou érythrocyte ou membrane d'érythrocyte) sont exposées à un échantillon biologique, chaque sous-groupe ayant un ou plusieurs paramètres de classification qui permettent de distinguer les billes d'un sous-groupe de celles d'un autre sous-groupe. Les billes ainsi exposées à l'échantillon passent ensuite dans une zone d'examen (par exemple un cytomètre en flux), où sont recueillies les données relatives aux paramètres de classification (par exemple les intensités d'émission de fluorescence), et de préférence aussi les données relatives à la présence ou à l'absence d'un complexe formé entre le réactant et l'analyte d'intérêt (à savoir entre la bille et la molécule antigénique portée par l'érythrocyte selon (a) ou l'anticorps selon (b) dans le procédé de l'invention).

Les marquages : Les érythrocytes marqués de manière détectable (dans le mode (a)) peuvent être marqués par toute technique connue de l'homme du métier. Ils peuvent être par exemple marqués par un composé fluorescent, par exemple un fluorophore qui s'insère dans les membranes de ces cellules. Ils peuvent également être marqués à l'aide d'un ligand lui même fonctionnalisé par un marqueur fluorescent, ce ligand étant capable de reconnaître des structures à la surface des érythrocytes. Ces ligands peuvent être par exemple des anticorps ou des lectines animales ou végétales. Ces types de marquage sont réalisés préalablement ou non au test.

Dans le mode b), ce sont les anticorps qui sont marqués, ou bien ce sont les fractions sériques activées du complément. Toute technique de marquage est possible. On peut également mélanger les types de marquage. Selon un mode de réalisation particulier, les anticorps sont mis en contact avec un anticorps anti-immunoglobuline humaine porteur d'un marqueur fluorescent ou radioactif.

Selon un autre mode de réalisation particulier, éventuellement cumulatif, les fractions sériques activées sont mises en contact avec un anticorps reconnaissant spécifiquement les fractions sériques activées du complément, ledit anticorps étant par exemple porteur d'un marqueur fluorescent ou radioactif. De tels anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux et sont bien connus de l'homme du métier.

L'élimination des réactifs non liés : Avant de procéder à l'étape d'analyse, il convient d'éliminer les réactifs qui ne se sont pas liés lors de la mise en contact et l'incubation des réactifs. Il est souhaitable d'éliminer le plus de réactifs non liés possible afin de réduire le bruit de fond et donc d'obtenir une bonne spécificité du test mais des conditions trop drastiques pourraient en réduire la sensibilité. Une présence résiduelle de réactifs non liés est donc généralement tolérable. Les conditions permettant l'obtention d'un compromis acceptable entre la sensibilité et la spécificité du procédé peuvent être facilement déterminées par l'homme du métier à l'aide d'expériences de routine. L'élimination des réactifs non liés peut être effectuée par toute technique connue de l'homme du métier, comme le lavage à l'aide d'étapes de centrifugation répétées ou l'utilisation du caractère super paramagnétique des billes et utilisation d'aimant.

Modes de réalisation préférés : Comme défini précédemment, le procédé selon l'invention permet soit l'identification des antigènes selon (a), soit l'identification des anticorps, soit encore l'identification des fractions sériques du complément activées et fixées. Il permet également la mise en oeuvre de la combinaison de plusieurs types d'identifications. Ainsi, l'identification des antigènes selon (a) et l'identification des anticorps selon (b) peuvent être réalisées simultanément ou séparément. L'identification des anticorps selon (b) peut être réalisée en révélant à la fois les anticorps et les fractions sériques activées du complément. Le récipient peut être n'importe quel container solide, par exemple un tube à essai, une cupule de microplaque ou tout récipient permettant les réactions dans un système automatisé. Il n'est 25 pas nécessaire de centrifuger les récipients.

Le mélange des réactants et de danalyte d'intérêt est réalisé dans des conditions (notamment de pH, de température, force ionique,...), permettant la liaison spécifique des antigènes portés par les érythrocytes aux anticorps, sans agglutination . L'absence substantielle d'agglutination 30 rend possible l'utilisation notamment d'un cytomètre en flux. Afin d'éviter toute réaction d'agglutination, il est avantageux de jouer sur la quantité et la taille des billes, ainsi que sur la concentration de l'échantillon. Les réactions d'agglutination répondent à des lois mathématiques qui ont été notamment décrites Hart H.E, Bulletin of mathematical biology, vol 42, 17-36, par Chak K. C., Bulletin of mathematical biology, vol 42, 37-56 et par DeLisi C., Journal of theorical Biology, 1974, vol 45, pages 555-575. Ces lois font intervenir plusieurs paramètres tels que notamment la taille des réactifs ainsi que leur rapport en nombre. L'homme du métier choisira donc les conditions réactionnelles en application de ces lois mathématiques en fonction des réactifs qu'il utilise de sorte qu'aucune agglutination substantielle ne se produise. Par exemple lorsque l'on met en oeuvre, des érythrocytes et des billes de taille similaire à celles des érythrocytes, c'est-à-dire de l'ordre de 71um, l'homme du métier choisira un rapport du nombre d'érythrocytes au nombre de billes allant de 30 à 150. De manière avantageuse, il est préféré de prévoir une étape d'hémolyse, de préférence après la fixation, et avant l'identification, des antigènes (selon a) ou des anticorps (selon b).

L'hémolyse peut être réalisée de diverses manières. Par exemple, on peut incuber le mélange dans un milieu de basse osmolarité. Par milieu de basse osmolarité , on entend généralement un milieu présentant une osmolarité inférieure ou égale à 100 mosmol/L. Comme milieu de basse osmolarité approprié, on peut citer les solutions de chlorure d'ammonium ayant une concentration de 40 mM ou moins , l'eau distillée. On peut encore réaliser l'hémolyse par sonication. Sans vouloir être liés à une théorie particulière, les inventeurs émettent l'hypothèse que l'étape d'hémolyse rapprocherait la bille de l'élément à analyser ce qui permettrait durant la phase d'analyse, de mieux affecter le signal de luminescence lié à la réaction analyte/réactant (mode a ou b) à la bille distinguable.

Applications : Le procédé permet de réaliser un phénotypage et/ou le groupage des érythrocytes, dans un format multiplexe. Les antigènes identifiés par le mode de réalisation (a) du procédé selon l'invention peuvent être tout antigène du groupe sanguin, à savoir du système ABO avec les antigènes A, B, A et B exprimés simultanément ou H, du système Rhésus avec les antigènes D, E, e, et C ou c, du système Kell avec l'antigène K ou k, du système Duffy (Fya, Fyb), du système Kidd (Jka, Jkb) ou encore d'autres systèmes moins fréquemment recherchés en pratique existant aussi tels que MNS, Lewis, etc.

Le mode de réalisation (a) du procédé de l'invention offre également la possibilité d'identifier le phénotype à partir d'un échantillon biologique qui provient d'un patient possédant des érythrocytes sensibilisés in vivo par des anticorps ou bien par des fractions sériques du complément. Ces patients sont dits à test de Coombs direct positif . Il s'agit notamment des nouveaux-nés ou de patients atteints d'anémie hémolytique par exemple. Le fait que les hématies de ces patients soient recouvertes par des immunoglobulines de type G interdit l'utilisation de réactifs faisant intervenir comme réactif secondaire des anti-globulines humaines. Le test de Coombs indirect ne peut donc être utilisé dans un tel cas. Cette particularité limite fortement la capacité des biologistes pour établir le phénotype complet de ce type de patient. En effet, de nombreux réactifs de phénotypage n'existent que sous forme d'une solution d'anticorps humains spécifiques de nature IgG et nécessitent l'emploi d'un réactif secondaire anti-globuline humaine. Dans certains cas, il est donc impossible de réaliser l'analyse, donc impossible de transfuser le patient, ce qui peut bien entendu affecter la qualité de l'acte thérapeutique. Or le procédé selon l'invention ne requiert pas la mise en oeuvre de réactifs secondaires anti-globuline et permet donc l'identification des antigènes érythrocytaires d'érythrocytes sensibilisés in vivo.

Les anticorps ou fractions sériques activées du complément présents à la surface des érythrocytes sensibilisés in vivo sont eux-même susceptibles de constituer des antigènes portés par des érythrocytes identifiables avec le mode de réalisation (a) du procédé selon l'invention. De manière avantageuse, le procédé de l'invention permet également de déterminer l'isotype des immunoglobulines présentes à la surface des érythrocytes. Certains isotypes étant plus dangereux que d'autres, il est intéressant de pouvoir préciser la nature des anticorps retrouvés, permettant ainsi au clinicien d'orienter son geste thérapeutique. De même, suivant le mode de réalisation b, en utilisant des marqueurs des anticorps spécifiques des isotypes des immunoglobulines, l'isotype de l'anticorps irrégulier peut être déterminé.

Le mode de réalisation (a) du procédé selon l'invention permet de plus la mise en évidence de populations multiples d'hématies, c'est-à- dire d'hématies de phénotypes différents (double-population), rencontrées parfois chez des patients polytransfusés lorsqu'ils ont subi de multiples transfusions de sang non parfaitement compatibles avec leur groupe sanguin.

Le procédé de l'invention permet encore le suivi de reprise de greffe de moelle osseuse en 30 mettant en évidence de très faibles quantités d'hématies synthétisées de nouveau par le patient/greffon.

Le procédé de l'invention permet également, le cas échéant, en remplacement du test de Kleihauer, d'identifier les hématies foetales présentes dans un échantillon de sang de la mère.

En outre, le procédé permet, par exemple grâce à l'analyse des signaux de fluorescence, de déterminer de manière quantitative la proportion d'antigènes à la surface des érythrocytes de l'échantillon.

Le procédé de l'invention offre par ailleurs la possibilité d'identifier une pluralité d'anticorps anti-érythrocytaires (selon b). De manière générale, le procédé permet d'identifier toute spécificité anti-groupe ABO pour la contre-épreuve de Simonin, ou toutes autres spécificités dans le cadre de la recherche d'anticorps irréguliers. De manière générale, ces anticorps sont aptes à se lier de façon stable à leurs antigènes, c'est-à-dire non seulement à se lier à leurs antigènes mais à y rester fixés notamment dans les conditions de mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Ces anticorps peuvent être identifiés grâce au mode de réalisation (b) du procédé selon l'invention.

Par ailleurs, il est bien connu maintenant que certains anticorps anti-érythrocytaires particuliers, de par leur isotype, leur réactivité variable en fonction de la température, ne sont pas capables de rester fixés à leurs antigènes correspondants. En revanche, ces anticorps sont aptes à activer l'ensemble des protéines constitutives du système du complément et notamment, les fractions sériques C 1 q, C3 et C4. Le résultat de cette activation conduit à la formation de protéines modifiées telles que les protéines C3b, C3dg et C3d, qui pour ces deux dernières restent ancrées dans la membrane de l'érythrocyte, alors que l'anticorps initiateur est éliminé de la surface de l'hématie. Ce processus complexe est cependant directement lié à la réaction initiale et spécifique de la fixation primaire de l'anticorps à l'antigène érythrocytaire. Le mode de réalisation (b) du procédé selon l'invention qui identifie les fractions sériques activées, permet l'identification de l'anticorps initial.

De manière avantageuse, le procédé de l'invention permet également de déterminer l'isotype des immunoglobulines présentes dans le sérum de patients, par exemple de la femme enceinte. Ceci a un intérêt majeur pour le suivi des anémies foetales. En effet, il est maintenant démontré que la gravité de la maladie hémolytique du nouveau-né dépend de l'isotype des anticorps présents chez la mère et dirigés contre les déterminants antigéniques érythrocytaires de l'enfant (Lambin et al, Transfusion, 2002, vol 42, pp1537-1546). Certains isotypes étant plus dangereux que d'autres, il est intéressant de pouvoir préciser la nature des anticorps retrouvés, permettant ainsi au clinicien d'orienter son geste thérapeutique.

De plus de façon particulièrement avantageuse, le procédé selon l'invention permet la détermination complète du groupe sanguin d'un individu dans le système ABO avec à la fois la détermination des antigènes érythrocytaires portés par les hématies et des anticorps anti-érythrocytaires présents dans le sang de l'individu à partir d'une seule prise d'échantillon en mettant en oeuvre simultanément et dans le même récipient les modes de réalisation (a) et (b) du procédé de l'invention.

En outre, selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, celui-ci est mis en oeuvre pour vérifier la compatibilité pré-transfusionnelle ( cross match ). Il s'agit alors de vérifier la compatibilité de l'ensemble des antigènes du groupe sanguin (pas seulement ABO). Dans ce cas, (i) on met en contact de façon simultanée, de préférence dans un unique récipient d'essai, un échantillon du sérum ou du plasma du patient, avec des groupes de billes distinguables portant les érythrocytes devant être transfusés, dans des conditions permettant aux éventuels anticorps présents de se lier aux érythrocytes, (ii) on élimine les anticorps qui ne se sont pas liés auxdits érythrocytes, (iii) on marque les anticorps qui se sont liés, en particulier en utilisant une anti-globuline marquée par exemple par un marqueur fluorescent , puis (iv) on analyse le mélange, de préférence par cytométrie en flux, pour déterminer si un groupe de billes a lié des anticorps, une liaison d'un groupe de billes signifiant que les érythrocytes devant être transfusés ne sont pas parfaitement compatibles pour le patient.

Une telle application est rendue possible grâce à la grande fiabilité du procédé de l'invention.

De manière avantageuse, le procédé permet d'obtenir des résultats complets, fiables, et ce en quelques minutes seulement. Plus précisément, il est possible de rendre un résultat complet en moins de une heure, voire en moins de trente minutes.

Par ailleurs, le procédé de l'invention présente une très bonne sensibilité, au moins similaire à celles des techniques actuellement commercialisées telle que la filtration en colonne de gel. Le procédé de l'invention rend en outre possible une réduction importante du volume de prise d'essai de l'échantillon. Aujourd'hui les réactions sont faites généralement avec une prise d'essai de 25 L pour chaque test, soit 575 L dans le cas d'une RAI avec 20 globules30 différents et 3 globules de dépistage. Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, seuls 50 à 100 L sont par exemple suffisants.

Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.

LEGENDE DES FIGURES : La Figure 1 est un schéma qui illustre une immobilisation directe des anticorps sur une bille de type Luminex . La Figure 2 est un schéma qui illustre une immobilisation des anticorps sur des billes, par 10 affinité, sur une bille de de type Luminex . La Figure 3 est un schéma qui illustre le marquage d'hématies de différents phénotypes par un composé fluorescent intra-membranaire. La Figure 4 est un schéma qui illustre une procédure d'immobilisation des hématies sur des billes de type Luminex par l'intermédiaire de poly-L-lysine. 15 Les Figures 5A à 5D montrent un phénotypage multiplexé d'hématies. La Figure 6 est un schéma qui illustre l'identification et le phénotypage multiplexé simultané d'hématies d'un patient à Coombs direct positif . La Figure 7 est un schéma qui illustre la détection multiplexe de l'anticorps anti-D. La Figure 8 est un graphe qui montre la calibration multiplexe de l'anticorps anti-D. 20 La Figure 9 est un graphe qui montre la calibration simplexe de l'anticorps anti-D dans le sérum de référence du Centre de Référence pour les Groupes Sanguins (CNRGS). La Figure 10 est un schéma qui illustre la détection multiplexe des anticorps anti-D et anti-Fya.

25 EXEMPLES :

Exemple 1 : Phénotvpa2e et Groupage. Le but de cette analyse est d'identifier à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques, les antigènes des groupes sanguins présents à la surface des hématies de donneurs ou de patients 30 (groupe ABO, RH, Duffy, Kidd, Lewis ...). Pour démontrer la possibilité de réaliser le phénotypage / groupage d'hématies avec la technologie de l'invention, des billes fluorescentes sont utilisées pour immobiliser les anticorps anti-globules rouges. Les anticorps de spécificités antigèniques différentes peuvent ainsi être liés à différentes régions de billes de couleurs différentes.

Les hématies sont quant à elles marquées par un composé fluorescent compatible avec les longueurs d'onde du laser reporteur de l'appareil commercialisé sous la dénomination Bioplex 200 par la société Bio-Rad. Après marquage, les hématies sont incubées avec les billes sensibilisées. Il est ainsi possible de détecter les hématies fixées sur les billes et ainsi déterminer leurs spécificités antigéniques.

1.1 - Matériel et réactifs. (Rajouter les Product Number des billes Luminex- Frédéric) - Billes : Les billes utilisées sont fabriquées par Luminex (Luminex Corp., Austin Texas, Etats Unis). 10 Il s'agit de billes superparamagnétiques de 8 m de diamètre composées de polystyrène et d'acide méthacrylique (fonction COOH). Dans cet exemple, on utilise des billes fluorescentes super paramagnétiques de différentes régions 19 , 21 , 32 , 34 (Internal Standard Beads (ISB) ), 71 et 98 (Blank Beads (BB)). Les billes (ISB) de région 34 sont fonctionnalisées avec un dérivé de rhodamine et sont 15 employées comme contrôle interne de fluorescence. Ces billes doivent conduire à des valeurs de fluorescence comprises entre 5000 et 15000 RFI. Les billes BB région 98 sont saturées avec de l'albumine bovine. Ces billes ne peuvent pas fixer d'antigènes ni d'anticorps et sont donc utilisées pour vérifier l'absence de fixation non spécifique. Ces billes doivent conduire à des valeurs de fluorescence inférieures à 1000 RFI. 20 - Anticorps monoclonal IgG anti-immunoglobuline humaine, clone 125A15 (Bio-Rad). - Anticorps polyclonal anti-IgM (mu) humaine (Bio-Rad). - Anticorps monocolonaux IgG anti-D (clone H2D5D2F5), IgG anti-Fya (clone 5T72A13F5A93) et IgM anti-S (clone MS94) (Bio-Rad, Millipore). - Kit de marquage cellulaire PKH26 (Sigma). 25 - Milieux de dilution commercialisés sous les dénominations de ScanLiss code 86442 et de Stabiliss code 86550 par la société Bio-Rad. - Cartes gel commercialisées sous la dénomination de ScanGel Coombs code 86432 pour la recherche d'anticorps irréguliers (Bio-Rad) . - Cartes gel commercialisées sous les dénominations de ScanGel RhK code 86428 30 et ScanGel Neutral code 86430 (Bio-Rad). - Hématies phénotypées commercialisées sous les dénominations de ScanPanel code 86593 et ScanCell code 86595 pour la recherche d'anticorps irréguliers par technique en cartes gel (Bio-Rad). - Culots globulaires concentrés phénotypés conservés en milieu SAG-MAN (EFS Nord de France). - Hématies Coombs directs positifs et/ou négatifs provenant de prélèvements de patients. - Tampon ou liquide de gaine (phosphate de sodium 10 mM, NaCl 150 mM, Proclin 0,1 % (v/v)) -Albumine sérique de bovin (BSA) (Millipore). - Tampon PBS pH 7,4 (Phosphate de sodium 7 mM, KC1 2,7 mM, NaCl 136 mM). 1.2 ù Protocole. 1. 2.1. Sensibilisation des billes par des anticorps de groupe sanguin.

L'immobilisation des anticorps à la surface des billes peut être réalisée selon deux principes différents. Dans le premier cas, les anticorps sont immobilisés par covalence directement sur les billes (Figure 1). La deuxième approche consiste à réaliser l'immobilisation des anticorps anti-globules rouges par affinité de manière non covalente. Dans ce cas, la fixation est réalisée par l'intermédiaire d'un anticorps anti-immunoglobuline fixé par covalence sur la bille dans une première étape (Figure 2). Cette approche a été retenue dans les exemples présentés.

Les billes de régions 19, 21 et 32 ont été utilisées pour l'immobilisation covalente de l'antiimmunoglobuline humaine. Les billes fluorescentes de région 71 ont été utilisées pour l'immobilisation covalente de l'anti-IgM humaine. Les groupements carboxyliques présents à la surface des billes ont été activés suivant une technique faisant intervenir un hydroxysuccinimide et un carbodiimide. Les protéines ont ainsi pu être immobilisées via leurs groupements amines. Les billes ainsi préparées sont conservées à + 4 C à la concentration de 3 mg/mL en PBS, pH 7,4, contenant 10 % (p/v) de BSA, 0,5 % (v/v) de Tween 20 et 0,09 % (p/v) d'azide de sodium.

Les billes portant l'anti-immunoglobuline humaine immobilisé peuvent être sensibilisées avec les anticorps de groupe sanguin IgG anti- D ou IgG anti-Fya. L'anti-immunoglobuline permet en effet la fixation des IgG par leur fragment Fc. Les anticorps de groupe sanguin sont donc immobilisés de façon non covalente sur les billes en utilisant ce principe. Chaque région de bille est sensibilisée par un anticorps de spécificité différente. L'anti-immunoglobuline choisie présente une affinité élevée pour les immunoglobulines humaines, permettant ainsi à cette fixation d'être stable dans le temps. L'anti-D et l'anti-Fya non purifiés sont utilisés aux concentrations respectives finales de 30 et 10 g/mL avec des billes fonctionnalisées en anti-Fc à 80 g/mg.

La sensibilisation avec les anticorps de groupe sanguin est réalisée en PBS, pH 7,4 sous agitation à 37 C pendant une heure. Après sensibilisation, les billes sont rincées plusieurs fois puis stockées à + 4 C en PBS, pH 7,4. Les billes portant l'anti-mu immobilisé peuvent être sensibilisées avec l'IgM anti-S. L'anti- mu permet en effet la fixation des IgM. L'affinité de ce sérum polyclonal anti-mu est suffisante pour assurer une fixation stable dans le temps. L'anti-S non purifié est immobilisé sur des billes fonctionnalisées en anti-mu à 40 g/mg. La sensibilisation est réalisée en PBS, pH 7,4 sous agitation à 37 C pendant une heure. Après sensibilisation, les billes sont rincées plusieurs fois puis stockées à + 4 C en PBS, pH 7,4.

Avant incubation avec les hématies (test proprement dit), les billes sensibilisées avec les anticorps de groupe sanguin sont mélangées avec des billes contrôle région 34 (ISB) et des billes contrôle région 98 (BB).

1.2.2. Marquage des hématies.

Le marquage des hématies par un composé fluorescent peut être réalisé enutilisant différents principes. Dans les exemples présentés, les hématies sont marquées à l'aide de la PKH26 qui est un fluorophore s'insérant dans la membrane des hématies. Des globules rouges de phénotypes variés peuvent ainsi être marqués selon un protocole identique (Figure 3). La PKH26 est une sonde fluorescente commercialisée par la société Sigma. Cette sonde présente une excitation maximale à 551 nm et une émission maximale à 567 nm. Le kit inclut le marqueur fluorescent qui possède une longue chaîne aliphatique permettant son incorporation dans la couche lipidique des membranes cellulaires , ainsi qu'un diluant aqueux iso-osmotique ne contenant aucun sel, tampon ou solvant organique. Ce diluant permet de maintenir la viabilité des cellules, la solubilité du marqueur et l'efficacité du marquage à des niveaux élevés. Le marquage des hématies par la PKH26 est réalisé en utilisant le protocole préconisé par le fabricant. Les hématies ainsi marquées sont diluées dans le tampon Stabiliss et conservées à l'obscurité à + 4 C.

La qualité, la viabilité et la stabilité des hématies marquées sont contrôlées au cours du temps en réalisant des essais de phénotypage suivant une technique en gel. L'intégrité antigénique des hématies marquées est comparée avec celle des hématies non marquées. La qualité et la stabilité du marquage fluorescent sont quant à elles étudiées en réalisant des mesures de fluorescence à l'aide de l'appareil Bioplex 200 de Bio-Rad.

1.2.3. Incubation billes-anticorps de groupe sanguin et hématies. Afin de démontrer la faisabilité et vérifier la spécificité du groupage suivant la technologie selon l'invention, les inventeurs ont effectué les réactions de manière unitaire. Dans ce cas, les billes fonctionnalisées avec les anticorps de groupe sanguin sont incubées individuellement avec des hématies de phénotypes variés. Dans le cas des réactions multiplexées, des échantillons de sang différents sont mis en contact individuellement avec des billes de région différentes et sensibilisées par des anticorps de spécificités différentes. Ce type d'expérience a permis de vérifier la possibilité de détecter plusieurs spécificités antigéniques de groupe sanguin dans la même prise d'échantillon.

Les billes sensibilisées sont mélangées avec les hématies afin d'obtenir un ratio hématies/billes d'environ 50 à 150. L'incubation du mélange est réalisée pendant 15 minutes sous agitation à 37 C.

Après incubation, les complexes billes-hématies sont lavés plusieurs fois avec de l'eau distillée.

1.2.4. Mesures par cytométrie en flux en utilisant l'automate Bioplex 200 de la société Bio-Rad.

Après le dernier lavage et préalablement aux mesures, les complexes sont dilués avec 185 gL de milieu liquide de gaine . Pour chaque essai, 25 gL de suspension sont injectés automatiquement dans l'appareil. Les mesures sont réalisées par acquisition de 250 billes par région. Pour chaque série de groupage / phénotypage, des témoins systématiques sont réalisés afin de vérifier la spécificité des réactions étudiées.

1.3. Exemples Phénotypage / Groupage - Simplex / Multiplex. L'objectif de cette série d'essais est de démontrer la faisabilité du phénotypage / groupage d'hématies en mode unitaire et/ou multiplexé. Les antigènes D, Fya et S sont retenus comme modèles. Des billes sensibilisées par un anticorps anti-immunoglobuline humaine ou antichaîne mu sont utilisées pour immobiliser les anticorps anti-D, anti-Fya et anti-S.

1.3.1. Phénotypage unitaire d'hématies RH D positives.

Les billes sensibilisées avec l'anticorps anti-D ont été incubées avec des hématies RH D positives et RH D négatives marquées par la PKH26 en utilisant un ratio nombre hématies / nombre de billes de 150 . Deux hématies RH D positives et deux hématies RH D négatives ont été employées. Chaque échantillon a été injecté en double dans l'appareil.

Les hématies RH D positives conduisent à des signaux fortement positifs de l'ordre de 21 000 à 25 000 RFI alors que les hématies RH D négatives présentent des signaux négatifs compris entre 40 et 400 RFI. Les billes de contrôle ISB 34 donnant des signaux de l'ordre de 6500 RFI et les billes de contrôle BB 98 de moins 1000 RFI, valident les résultats. Les différents témoins négatifs réalisés présentent des signaux compris entre 15 et 400 RFI, confirmant la spécificité des réactions. Les hématies RH D positives et RH D négatives ne se fixent en effet pas sur les billes en l'absence d'anticorps anti-D.

Ces résultats démontrent la possibilité de distinguer de façon très nette les hématies RH D 20 positives et RH D négatives et donc d'identifier l'antigène D à la surface des globules rouges.

Le phénotypage unitaire d'hématies Fya et S a pu être réalisé suivant le même principe en utilisant des anticorps spécifiques d'isotype G ou M.

25 1.3.2. Phénotypage multiplex d'hématies D, Fya et S. Le principe du phénotypage multiplexé est résumé dans les Figures 5A à 5D. Dans ce cas, des billes de région 19 sensibilisées avec un anticorps anti-D ont été mélangées avec des billes de région 21 sensibilisées avec un anticorps anti-Fya ainsi qu'avec des billes de région 71 sensibilisées avec un anticorps anti-S. 30 Ce mélange de billes a été incubé avec des hématies présentant des phénotypes D, Fya et S différents : D+Fya+S+ / D+Fya-S- / D-Fya+S- / D-Fya-S- / D-Fya-S+ / D-Fya+S+ / D+Fya-S+ / D+Fya+S-. Un ratio nombre d'hématies / nombre de billes de 50 a été utilisé.

Des signaux positifs compris entre 13 000 et 29 000 RFI sont obtenus lorsque les billes sensibilisées par un anticorps donné fixent une hématie présentant la spécificité antigénique correspondante. Une parfaite corrélation est observée entre les signaux fluorescents mesurés et le phénotype des hématies utilisées pour réaliser le test. Lorsqu'une bille sensibilisée avec un anticorps est mise en contact avec une hématie ne portant pas l'antigène correspondant, un signal inférieur à 1000 RFI est obtenu. Par ailleurs, les témoins réalisés avec des billes non sensibilisées en anticorps conduisent à des signaux négatifs quelle que soit l'hématie utilisée.

Ces résultats démontrent que les signaux mesurés sont spécifiques : la fixation bille-hématie ne se produit que lorsqu'un couple antigène-anticorps est mis en jeu.

Les résultats obtenus avec les billes de contrôles ISB 34 (11000 RFI) et BB 98 (inférieurs à 1000 RFI) valident les analyses.

Les coefficients de variation infra-essais sont compris entre 1 et 10 %, ce qui démontre une reproductibilité intra-essais satisfaisante.

Ces résultats démontrent la faisabilité du phénotypage multiplexé d'hématies à trois paramètres suivant la technologie selon l'invention. 1.3.3. Phénotypage multiplexé d'hématies Coombs direct positives (CD +). L'utilisation de l'approche multiplexée avec des microbilles rend l'identification du caractère CD+ et le phénotypage des hématies possible de façon simultanée selon un principe décrit dans la Figure 6.

Des billes de région 32 sensibilisées avec l'anticorps anti-Fc sont mélangées avec des billes de région 19, 21 et 71 respectivement sensibilisées avec un anticorps anti-D, anti-Fya et anti-S. Les hématies CD+, sensibilisées in vivo par un anticorps, peuvent se fixer sur l'antiimmunoglobuline humaine porté par les billes de région 32, ce qui permet l'identification de la caractéristique CD+. Par ailleurs, ces hématies peuvent également se fixer sur les billes de région 19, 21 et 71 portant les anticorps spécifiques des antigènes D, Fya et S en fonction des spécificités présentes sur la membrane des globules rouges. Cette approche a été démontrée en utilisant un ratio nombre d'hématies / nombre de billes de l'ordre de 40.

Les billes de contrôle ISB 34 et BB 98 conduisent aux signaux attendus à savoir respectivement de l'ordre de 13000 RFI et inférieurs à 1000 RFI et valident les résultats. Les deux hématies CD+ conduisent à des signaux positifs supérieurs à 30000 RFI avec les billes de région 32 sensibilisées avec l'anticorps anti-immunoglobuline humaine. Les deux hématies CD négatives conduisent quant à elles à des signaux négatifs inférieurs à 500 RFI avec cette même région de bille. Ces résultats démontrent la possibilité d'identifier les hématies CD+ grâce à leur fixation spécifique à l'aide d'une anti-globuline préalablement couplée à une bille de région déterminée. De plus, les résultats démontrent également que le phénotypage multiplexé des antigènes érythrocytaires des hématies CD+ est réalisable simultanément à l'identification du caractère CD+. En effet, les hématies CD+ sont phénotypées D+Fya-S- pour l'une et D+Fya+S+ pour l'autre. Le phénotype S de ces deux échantillons a été vérifié suivant une technique classique en utilisant des anticorps anti-S de nature IgM. Les résultats obtenus sont parfaitement corrélés 15 avec ceux obtenus suivant la nouvelle technique. En revanche, en ce qui concerne le phénotype anti-Fya, cette même analyse n'a pu être réalisée. Il n'existe pas en effet de réactif de nature IgM permettant de phénotyper les hématies. Cependant, une différence est observée pour le phénotype Fya suivant l'hématie CD+ 20 analysée ce qui valide les résultats, et permet d'exclure un phénomène de fixation non spécifique. Les coefficients de variation sont pour la plupart des échantillons compris entre 1 et 5 %, ce qui montre une reproductibilité intra-essais satisfaisante.

25 Exemple 2 : Recherche d'anticorps irréguliers ù méthodologie unitaire et multiplexée.

La recherche d'anticorps irréguliers (RAI) est généralement réalisée suivant les méthodes les plus sensibles (filtration au travers d'un gel commercialisée par la société Bio-Rad sous la 30 gamme ScanGel , par la société Diamed sous la dénomination Diamed ID , ou suivant une méthodologie d'immuno-adhérence en format microplaque commercialisée par la société Immucor, gamme Capture ). Dans les deux premiers cas, elle met en oeuvre des hématies dont le phénotype est connu et qui sont incubées avec l'échantillon de sérum ou de plasma à examiner. Les anticorps spécifiques, éventuellement présents, se fixent à la surface des hématies. Leur révélation est ensuite effectuée par utilisation d'un réactif contenant une anticorps anti-immunoglobuline humaine. Dans le cas d'une réaction positive, il se forme un agglutinat d'hématies. Si la réaction est négative les hématies sont libres et aucun agrégat n'est formé. En utilisant des panels d'hématies présentant ou non différents antigènes, il est alors possible de déterminer la spécificité des anticorps présents dans l'échantillon.

L'objectif de cette série d'essais est d'utiliser des billes sur lesquelles des hématies phénotypées sont immobilisées via la Poly-LLysine (PLL) pour réaliser la détection d'anticorps de groupe sanguin de type IgG suivant la technologie selon l'invention utilisant un cytomètre en flux. Un anticorps conjugué anti-Fc marqué à la phycoérythrine (PE) est utilisé pour la détection des anticorps irréguliers fixés.

2. 1 - Matériel et réactifs. - Billes fluorescentes super paramagnétiques de régions 17 , 21 , 32 , et 36. Les billes sont conservées à + 4 C en tampon PBS pH 7,4. Billes fluorescentes de contrôle région 34 (Internal Standard Beads (ISB) et région 98 (Blank Beads (BB) . Poly-L-Lysine (PLL) de poids moléculaire 70 000 ù 130 000. - Anticorps monoclonal IgG anti-immunoglobuline humaine, clone 125A15 (Bio-Rad) couplé à la phycoérythrine (PE) avec un ratio de 2 équivalents anticorps par équivalent de PE. - Anticorps monoclonaux IgG anti-D (clone H2D5D2F5) et anti-Fya (clone 5T72A13F5A93) (Bio-Rad). - Etalon National anti-RH1 (Centre de Référence pour les Groupes Sanguins, France) - Hématies phénotypées commercialisées sous les dénominations de ScanCell et ScanPanel pour la recherche d'anticorps irréguliers (Bio-Rad) . - Tampon ou liquide de gaine (phosphate de sodium 10 mM, NaCl 150 mM, Proclin 0,1 % (v/v))). - Albumine sérique de bovin (BSA) (Millipore). - Tampon PBS pH 7,4 (Phosphate de sodium 7 mM, KC1 2,7 mM, NaCl 136 mM).

2.2- Protocole. 2.2.1. Sensibilisation des billes par la PLL.

Les billes neutres de région 17, 21, 32 et 36 sont incubées avec la PLL 25 g/mL en PBS pH 7,4 pendant 18 heures à température ambiante et sous agitation. A l'issue de cette étape, les billes sont lavées en PBS pH 7,4 puis utilisées pour immobiliser les hématies. 2.2.2. Immobilisation des hématies sur les billes. Les réactifs billes-hématies sont préparés en mélangeant les billes recouvertes de PLL et les hématies dans un ratio nombre d'hématies/nombre de billes égal à 100. L'incubation est réalisée en PBS pH 7,4 sous agitation pendant 5 minutes à température ambiante. Chaque région de bille est utilisée pour immobiliser un seul type d'hématie de phénotype connu et différent. A l'issue de cette étape, les réactifs bille-PLL-hématie sont lavés avec du PBS pH 7,4 puis avec de 1' eau distillée. Les réactifs billes-hématies ainsi préparés sont conservés dans du PBS pH 7,4 à + 4 C. Le principe d'immobilisation des hématies sur les billes grâce à la PLL est résumé à la Figure 4.

La fixation des hématies par l'intermédiaire de la PLL est suffisamment solide pour ne pas permettre leur décrochage au cours des tests et analyses. Avant incubation avec les anticorps recherchés, les réactifs bille-PLL-hématie sont mélangés aux billes de contrôle de région 34 (ISB) et de région 98 (BB). 2.2.3. Réaction des réactifs bille-PLL-hématie avec les anticorps. Dans le cas des réactions unitaires, les réactifs bille-hématie sont utilisés individuellement et incubés avec des anticorps différents afin de vérifier la spécificité des réactions. Pour réaliser les réactions multiplexées, les billes sensibilisées par différentes hématies de phénotypes connus sont mélangées puis incubées avec le ou les anticorps à détecter.

Les anticorps à mesurer sont dilués soit en tampon riche en protéine (NaCl 0,15 M, BSA 60 g/L) soit en tampon PBS pH 7,4 avant incubation avec les réactifs bille-PLL-hématies. Dans tous les cas, 125 L de réactifs bille-PLL-hématie sont mélangés avec 125 L d'anticorps puis incubés pendant 60 minutes sous agitation à 37 C. Après incubation, les complexes sont lavés plusieurs fois. 2.2.4. Révélation des complexes par l'anti-Fc marqué à la PE. Pour détecter les complexes bille-PLL-hématie-anticorps, un anticorps spécifique du fragment Fc des immunoglobulines humaines marqué à la PE est utilisé. Cet anticorps conjugué est employé à la concentration de 60 g/mL en PBS pH 7,4, et est incubé avec les complexes pendant 15 minutes à 37 C sous agitation. Les complexes sont ensuite lavés avec de l'eau distillée. 2.2.5. Mesures. Après le dernier lavage et préalablement aux mesures, les complexes sont repris avec 185 L du liquide de gaine. Pour chaque essai, 25 L de suspension sont injectés dans l'appareil. Les mesures sont réalisées par acquisition de 250 billes par région. Pour chaque série, des témoins systématiques sont réalisés afin de vérifier la spécificité des 10 réactions étudiées. Pour chaque anticorps testé, un témoin négatif est réalisé en utilisant des hématies phénotypées ne portant pas la spécificité antigénique correspondante.

2.3- Exemples RAI - Simplex / Multiplex.

15 2.3.1. Détection multiplexée de l'anticorps monoclonal anti-D dans un milieu riche en protéine. L'anticorps a été détecté en utilisant un mélange de billes de régions différentes sensibilisées par des hématies de phénotypes connus. Des billes de région 17 recouvertes de PLL ont été utilisées pour l'immobilisation d'une 20 hématie phénotypée D, CC, ee . Une hématie de phénotype D, cc, EE a été immobilisée sur des billes de région 32 et une hématie de phénotype d, cc, ee a été immobilisée sur des billes de région 36. Les billes de région 36 recouvertes avec les hématies D négatif ont été utilisées comme contrôles négatifs afin de vérifier la spécificité de la réaction. 25 Les billes sensibilisées ont été mélangées puis incubées avec l'anticorps monoclonal anti-D préparé à différentes concentrations en tampon NaCl 0,15M, BSA 60 g/L. La détection a été réalisée avec le conjugué anti-Fc marqué à la PE. Le principe de cette approche est résumé dans la Figure 7.

30 Les résultats sont présentés dans la Figure 8. On observe que la réponse vis-à-vis des hématies ne possédant pas l'antigène D (bille 36) présente des valeurs inférieures ou égales à 1000 RFI qui correspondent à des réponses négatives. En revanche, avec les billes supportant des hématies présentant les antigènes D (billes 32 et 17), les valeurs obtenues sont largement supérieures (de l'ordre de 2000 à plus de 7000 RFI). De plus, les signaux positifs sont corrélés à la concentration d'anticorps anti-D mis en jeu, la limite de détection suivant ce format étant située autour de 5 ng/mL. Pour une même concentration d'anticorps anti-D, on peut noter des variations de positivité suivant le phénotype de l'hématie fixée à la surface des billes. Ce phénomène est connu en immuno-hématologie et est lié à la différence d'expression antigénique de l'antigène D. Ces résultats démontrent la spécificité de la détection réalisée avec le format multiplex considéré. Par ailleurs, les billes de contrôle de région 34 et 98 fournissent les niveaux de signaux 10 attendus, à savoir respectivement de l'ordre de 11 000 RFI et inférieurs à 1000 RFI.

2.3.2. Détection unitaire de l'anticorps polyclonal anti-D de référence dans un sérum de référence. Un étalon national de référence anti-D CNRGS a été utilisé pour réaliser la détection unitaire 15 de l'anticorps anti-D dans un milieu riche en protéine se rapprochant d'un plasma. Une hématie de phénotype D, cc, EE a été immobilisée sur des billes de région 32. Un contrôle négatif a été réalisé séparément en utilisant une hématie de phénotype d, cc, ee immobilisée sur des billes de région 21. L'étalon a été dilué dans un tampon NaCl 0,15 M contenant 60 g/L de BSA. 20 Les résultats, présentés à la Figure 9, montrent que l'anticorps de référence peut être détecté à une concentration de moins de 1 ng/mL en présence des hématies de phénotype RH D. La gamme dynamique s'étend linéairement jusqu'à au moins 100 ng/mL, les résultats obtenus en présence de bille portant une hématie RH D négative étant inférieurs à 650 RFI. Les valeurs des billes de contrôles (ISB et BB) permettent de valider les résultats observés. 25 2.3.3. Détection multiplexée de plusieurs anticorps monoclonaux de groupes sanguins. Dans ce cas, les billes de région 17 ont été sensibilisées par des hématies de phénotype D,CC, ee , Fya-b+, les billes de région 32 ont été sensibilisées par des hématies de phénotype dd, cc, ee , Fya+b- et les billes de région 21 ont été sensibilisées par des hématies de phénotype D, 30 cc, EE , Fya-b+. Les 3 types de billes ont été mélangés puis incubés avec les anticorps monoclonaux anti-D et anti-Fya employés séparément ou en mélange. Toutes les étapes ont été réalisées en PBS pH 7,4. Le principe de cette approche est présenté dans la Figure 10.

Les billes de contrôle interne de région 34 et 98 conduisent aux niveaux de signaux attendus, à savoir respectivement de l'ordre de 11000 RFI et inférieurs à 1000 RFI. Une parfaite corrélation est observée entre le phénotype des hématies employées au cours de la sensibilisation des billes et les anticorps présents dans les mélanges réactionnels. Ainsi, des signaux positifs de l'ordre de 6000 à 25000 RFI sont observés lorsque les anticorps anti-D et anti-Fya sont incubés en présence des hématies portant les antigènes correspondant. L'incubation des anticorps avec des hématies ne portant pas les antigènes correspondant conduit à des signaux négatifs inférieurs à 1000 RFI. Les réactions sont spécifiques.

Ces résultats démontrent la validité de l'approche considérée pour réaliser la détection multiplexée de plusieurs anticorps présents dans un même échantillon.

Claims (16)

Revendications

1. Procédé in vitro d'identification de molécules antigéniques portées par les érythrocytes et/ou des anticorps anti-érythrocytaires d'un individu, comprenant a) l'identification d'une pluralité de molécules antigéniques portées par des érythrocytes dans un échantillon biologique, par (iv) la mise en contact, dans un unique récipient d'essai, ou dans plusieurs récipients d'essai séparés, dudit échantillon contenant des érythrocytes, avec des groupes de billes distinguables, chaque groupe de billes distinguables portant un anticorps déterminé, spécifique d'une molécule antigénique portée par des érythrocytes, différant d'un groupe de billes à l'autre, dans des conditions permettant aux érythrocytes de se lier aux anticorps, sans agglutination, lesdits érythrocytes étant marqués préalablement ou postérieurement à leur mise en contact avec lesdits groupes de billes, (v) l'élimination des érythrocytes qui ne sont pas liés auxdits anticorps, et ; (vi) l'identification du groupe de billes ayant lié les érythrocytes marqués, ce qui permet l'identification des antigènes portés par les érythrocytes détectés; et/ou b) l'identification d'une pluralité d'anticorps anti-érythrocytaires dans un échantillon 20 biologique, par (v) la mise en contact dans un unique récipient d'essai, ou dans plusieurs récipients d'essai séparés, dudit échantillon avec des groupes de billes distinguables, chaque groupe de billes distinguables portant (1) des érythrocytes, (2) des fragments membranaires d'érythrocytes ou (3) des antigènes de groupe sanguin, de 25 phénotype connu différant d'un groupe de billes à l'autre, dans des conditions permettant aux anticorps ou aux fractions sériques activées du complément présents dans l'échantillon, de se lier aux érythrocytes, aux fragments membranaires d'érythrocytes ou aux antigènes de groupe sanguin, sans agglutination ; 30 (vi) l'élimination des anticorps ou fractions sériques activées du complément qui ne se sont pas liés auxdits érythrocytes ou auxdits fragments membranaires d'érythrocytes ou auxdits antigènes de groupe sanguin, (vii) le marquage des anticorps liés et/ou des fractions sériques activées du complément liées, et(viii) l'identification du groupe de billes ayant lié les anticorps ou les fractions sériques activées du complément marqués, ce qui permet l'identification des anticorps antiérythrocytaires présents.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les molécules antigéniques portées par les érythrocytes sont choisies dans le groupe constitué par des antigènes membranaires érythrocytaires constituant les groupes sanguins, des fractions sériques activées du complément portées par les érythrocytes, et des anticorps présents à la surface des érythrocytes sensibilisés.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'identification des antigènes selon (a) et l'identification des anticorps selon (b) sont réalisées simultanément et dans le même récipient.

4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'analyse du mélange est 15 réalisée par un cytomètre en flux.

5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, qui comprend en outre une étape d'hémolyse. 20

6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les billes distinguables sont des billes superparamagnétiques.

7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les billes distinguables émettent des signaux luminescents ou fluorescents.

8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les érythrocytes marqués de manière détectable (selon a) sont marqués par un composé fluorescent.

9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les anticorps (selon b) sont 30 marqués par mise en contact avec un anticorps anti-globuline humaine porteur d'un marqueur fluorescent ou radioactif. 25

10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les fractions sériques du complément activées (selon b) sont marquées par mise en contact avec un anticorps antifractions sériques du complément porteur d'un marqueur fluorescent ou radioactif

11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comprenant l'identification d'une pluralité d'anticorps anti-érythrocytaires (selon b), dans lequel les anticorps sont des anticorps irréguliers.

12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon biologique 10 est choisi dans le groupe constitué par du sang total , du plasma, du sérum, un culot globulaire, et un concentré globulaire.

13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon biologique provient d'un individu possédant des érythrocytes soit sensibilisés in vivo par des anticorps, 15 soit revêtus par la fraction sérique du complément.

14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel on détermine l'isotype des immunoglobulines présentes à la surface des érythrocytes et/ou dans un liquide biologique provenant dudit individu .

15. Procédé pour vérifier la compatibilité pré-transfusionnelle d'érythrocytes devant être transfusés à un patient, comprenant (i) la mise en contact simultanée dans un unique récipient d'essai, d'un échantillon de sérum ou de plasma du patient, avec des groupes de billes 25 distinguables portant les érythrocytes devant être transfusés, dans des conditions permettant aux éventuels anticorps présents de se lier aux érythrocytes, (ii) l'élimination des anticorps qui ne se sont pas liés auxdits érythrocytes, (iii) le marquage des anticorps qui se sont liés, et 30 (iv) l'analyse du mélange pour déterminer si un groupe de billes a lié des anticorps, une liaison d'un groupe de billes signifiant que les érythrocytes devant être transfusés ne sont pas parfaitement compatibles pour le patient. 20

16. Ensemble de réactifs destinés à mettre en oeuvre le procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, comprenant des groupes de billes, porteuses chacun d'au moins un paramètre physique détectable particulier, et appartenant à au moins deux groupes différents, l'un des groupes étant porteur d'un anticorps de capture spécifique d'une molécule antigénique portée par des érythrocytes, et l'autre groupe étant porteur (1) d'érythrocytes, (2) d'un fragment membranaire d'érythrocytes ou (3) d'un antigène de capture, qui est un antigène de groupe sanguin. 15