JP2010529445A - 赤血球によって保有される抗原および抗赤血球抗体の検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、赤血球によって保有される複数の抗原性分子および／または複数の抗赤血球抗体を検出するための方法であって、赤血球によって保有される抗原性分子は、血液型抗原分子以外の、赤血球によってのみならず少なくとも１つの他の細胞集団によっても保有される抗原性分子からなり、方法は、試料を、ａ）抗原に特異的な抗体、またはｂ）赤血球もしくは赤血球膜フラグメントがその上に結合している区別可能なビーズと接触させることを含む、方法に関する。

Description

本発明は、赤血球および他の細胞集団の両方によって保有される抗原性分子を同定するために、赤血球上の抗原性分子の存在を利用する。

今日では、輸血は、血液ドナーから得られた赤血球濃縮物（血液細胞濃縮物）の調製物を静脈内投与することにある。輸血が存在する場合、主な危険性は、抗体およびその赤血球抗原がレシピエント（輸血される個体）の身体中で再結合されることの可能性に関連付けられる。事実、赤血球（erythrocyte）（赤血球（red blood cell）とも呼ばれる）の表面に、免疫系によって認識され、そして赤血球溶血を伴う免疫応答を引き起こすことができる膜抗原、特に血液型（または式）抗原が存在する。そのような免疫学的反応の結果は、臨床徴候を伴わない不十分な輸血から、軽微な臨床反応（不安、悪寒）、重篤な臨床反応（ショック、ヘモグロビン尿、腎不全）、または結果として死を生じる劇的な臨床反応（ショック、播種性血管内溶血）までの範囲でありうる。

ドナーの赤血球は、レシピエントが、ドナーの赤血球抗原に対するいかなる循環抗体も有しない場合に、レシピエントの血液と適合性であるといわれる。

血液型抗原に加えて、赤血球上のＨＬＡ抗原決定基の存在が、フランス人集団中の個体の１５％において検出されている（de Villartay et al., Tissue Antigens, 1985, 26(l):12-9）。赤血球上のＨＬＡ抗原決定基のこの量は他の細胞型に比較して低いが、それにもかかわらず、輸血の危険性の点から重大である（Everett et al., Transplantation, 1987, vol. 44, no. 1, pp. 123-129）。

次いで、本発明者らは、最初に輸血の危険性に焦点を合わせ、血液型抗原分子に加えて、任意の抗原性分子を、赤血球上のその偶発的存在を利用することによって容易に検出できることを実現化した。

発明の概要
本発明は、生物学的試料中の、個体の赤血球によって保有される複数の抗原性分子を同定するための、および／または赤血球によって保有される抗原性分子に対する複数の抗体を同定するためのインビトロ方法であって、赤血球によって保有される抗原性分子は、血液型分子以外の、赤血球、および少なくとも１つの他の細胞集団の両方によって保有される抗原性分子からなり、
方法は、
ａ）
（ｉ）赤血球を含む試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、赤血球が抗体に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる、赤血球によって保有される抗原性分子に特異的な、所定の抗体を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること（ここで、赤血球はそれがビーズの群と接触させられる前または後に標識される）、
（ｉｉ）抗体に結合していない赤血球を除去すること、および
（ｉｉｉ）標識された赤血球に結合しているビーズの群を同定し、それにより、検出される赤血球によって保有される抗原の同定を可能にすること、
によって、個体の赤血球によって保有される複数の抗原性分子を同定すること；および／または
ｂ）
（ｉｖ）試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、試料中に存在する抗体または活性化血清補体画分が赤血球または赤血球膜フラグメントに結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる、既知の表現型の、（１）赤血球または（２）赤血球膜フラグメントを各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること、
（ｖ）赤血球または赤血球膜フラグメントに結合していない抗体または活性化血清補体画分を除去すること、
（ｖｉ）結合している抗体および／または結合している活性化血清補体画分を標識すること、および
（ｖｉｉ）標識された抗体または標識された活性化血清補体画分に結合しているビーズの群を同定し、それにより、存在する、赤血球によって保有される抗原性分子に対する抗体の同定を可能にすること、
によって、生物学的試料中の赤血球によって保有される抗原性分子に対する複数の抗体を同定すること、
を含む、方法を提供する。

本発明はまた、この方法を実行するための一組の試薬であって、各々が、検出されることができる少なくとも１つの特定の物理的パラメーターを保有し、そして、群の１つは赤血球によって保有される抗原性分子に特異的な捕獲抗体を保有し、そして他の群は（１）赤血球または（２）赤血球膜フラグメントを保有する、少なくとも２つの異なる群に属する、区別可能なビーズの群を含む、一組の試薬を提供する。

発明の詳細な説明
定義：
本明細書において、「赤血球（erythrocyte）」または「赤血球（red blood cell）」という用語は同じ血液細胞を示すために区別なく使用される。

「多重（multiplex）」という用語は、同時に単一の試料について単一の容器中でそして単一のシグナル読み取りシステムを使用して、いくつかの異なる抗原−抗体型反応が分析されることを意味する。

「単純（simplex）」という用語は、いくつかの分離した容器中で、抗原−抗体型反応が分析されることを意味する。好ましくは、分析は、それにもかかわらず、同時に、そして好ましくは単一のシグナル読み取りシステムを使用して行われる。

「赤血球によって保有される抗原性分子」という表現は、赤血球および少なくとも１つの他の細胞集団の両方によって保有される抗原性分子からなる、赤血球によって保有される任意の抗原性分子を示す。ここで血液型分子は除外される。「血液型抗原」という用語は、Ａ抗原、Ｂ抗原、同時に発現されるＡおよびＢ抗原もしくはＨ抗原を用いるＡＢＯ式、Ｄ、Ｅ、ｅおよびＣもしくはｃ抗原を用いるＲｈｅｓｕｓ式、Ｋもしくはｋ抗原を用いるＫｅｌｌ式、Ｄｕｆｆｙ式（Ｆｙａ、Ｆｙｂ）、Ｋｉｄｄ式（Ｊｋａ、Ｊｋｂ）、または実際にはそれほど一般的には研究されていないが、それもまた存在する他の方式（例えばＭＮＳ、Ｌｅｗｉｓなど）の任意の抗原を意味することが意図される。

目的の抗原性分子を保有する細胞集団は血液細胞（リンパ球）であってもよく、血小板が含まれる。

赤血球および他の細胞集団によって保有される目的の抗原性分子の例は、ＨＬＡ系の分子、特にＨＬＡ Ｂ−２７、ＣＤ５５および／またはＣＤ２９を含む（Terpos et al., Medical Science Monit. 2008, 14 276-280）。目的の抗原性分子の他の例は、赤血球老化マーカー、例えばホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む。

生理学的にまたは赤血球の表面ではなく、そして他の細胞型または集団の表面で見出される赤血球抗原が含まれる。赤血球抗原に起因する免疫学的反応から生じる赤血球の表面に存在する抗原も含まれる。この場合、「赤血球によって保有される抗原性分子」という表現は、インビボで感受性化された赤血球によって保有される抗体または血清補体画分の要素を含む。生理学的に見出されない抗原性分子は、例えば、個体によって吸収される化学産物もしくは医薬、またはその分解産物を含む。

赤血球上に吸着しているが他の細胞集団起源である抗原性分子も含まれる。

「赤血球によって保有される」という用語は、処理によるかまたは赤血球の生理学的プロセスによって（例えば赤血球の老化の間に）抗原性分子が接近可能になる、膜発現、吸着または細胞間発現を指す。

「赤血球によって保有される抗原性分子に対する抗体」または「抗赤血球抗体」という表現は、赤血球、および少なくとも１つの他の細胞集団によって保有される抗原に特異的に結合する任意の抗体を示す。「結合している抗体および／または結合している血清補体画分の標識」という用語は、赤血球膜に可逆的に結合しているかまたは直接的に包埋されている抗体または（場合により活性化された）血清補体画分の標識を意味すると理解される。

「個体」という用語は、赤血球によって保有される複数の抗原性分子を有する任意の動物を意味することが意図される。動物として、例えば、イヌ（今日までに８個の異なる血液型が同定されている）、およびネコ（３個を有する）に言及しうる。もちろん、「個体」という用語は、ヒト（胎児期を含む）にも関する。

「生物学的試料」という用語は、生理学的であろうと病理学的であろうと、赤血球または抗赤血球抗体を含みうる体液または組織バイオプシーの任意の画分を意味することが意図される。生物学的試料として、それゆえ、血液試料、特に全血試料または血液細胞ペレット試料（もしくは血液バッグ）、または任意の他の血液調製物に言及しうるが、それが血液を含むときには、唾液、汗、涙、乳汁または尿にも言及しうる。抗体スクリーニングのために血漿または血清試料を使用することも可能である。抗原性分子を検出するために様式（ａ）において使用される試料は、抗体を検出するために使用される試料と同一であってもよくまたは異なっていてもよい。試料が同一であるときに、様式（ａ）および（ｂ）を同じ容器中で同時に行うことができる。生物学的試料は前処理を経ていなくてもよい。

「抗体」という用語は、抗原性化合物の少なくとも１つの抗原決定基に抗体が結合することを可能にする、少なくとも１つの抗原結合部位を含むかまたはそれからなる任意の抗体全体または抗体の機能性フラグメントを指す。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントに、そしてまたｓｃＦｖ鎖（単鎖可変フラグメント）、ｄｓＦｖ鎖（二重鎖可変フラグメント）などに言及しうる。これらの機能性フラグメントを、特に遺伝子工学によって得てもよい。

「捕獲抗体」という用語は、親和性結合によって、生物学的試料中に存在する抗原性化合物の少なくとも１つの抗原決定基を保持することができる、固相に結合された抗体または抗体の部分を意味することが意図される。

検出ツールとして使用される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でありうる。本発明に関して使用することができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生は、従来技術の部類に入る。

モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein（Nature, 256, p. 495-497(1975)）によって記載される従来のリンパ球融合およびハイブリドーマ培養方法に従って得てもよい。モノクローナル抗体を調製するための他の方法も公知である（Harlow et al. editors, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。モノクローナル抗体を、哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギまたはヒトさえ等）を免疫し、そしてリンパ球融合物産生ハイブリドーマの技術を使用することによって調製してもよい（Kohler and Milstein, 1975、上記）。

この習慣的技術に対する代替技術が存在する。例えば、モノクローナル抗体を、ハイブリドーマからクローン化された核酸の発現によって産生することができる。抗体を、典型的には繊維状ファージであるベクター（例えばＥ．ｃｏｌｉ用のｆＵＳＥ５、Scott et al.（Science, 249, pp. 386-390 (1990)））中に抗体ｃＤＮＡを導入することによって、ファージディスプレイ技術によって産生することもできる。後者は、ライブラリーを構成し、そしてその表面にｓｃＦｖフラグメントを有する。この抗体ライブラリーを構築するためのプロトコルは、Marks et al.（J. MoI. Biol., 222, pp. 581- 597, (1991)）に記載されている。

ポリクローナル抗体を、通常の手順に従って、抗原（好ましくはペプチド性質の）に対して免疫された動物の血清から得ることができる。

一般に、ポリペプチド（特に組換えポリペプチド）またはオリゴペプチドを、例えば免疫原として、使用することができる。従来のプロトコルによれば、Benoit et al.［PNAS USA, 79, pp. 917-921 (1982)］によって記載される手順に従って、ペプチド免疫原１ｍｇの等価物でウサギを免疫する。

ビーズ：
ビーズは、一般に、生物学的試料の構成要素に関して不活性であるポリマーからなり；それは固体であり、そして試料に不溶性である。使用されるポリマーは、ポリエステル、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリサッカリド、ポリウレタンまたはセルロースでありうる。粒子に完全性および構造を与えるために結合剤を使用してもよい。

生物学的な目的の高分子（タンパク質、脂質、炭水化物、核酸）の結合またはカップリングを可能にするように、これらのポリマーに官能基を組み入れてもよい。当業者に公知であるこれらの官能基は、アミン（−ＮＨ２）またはアンモニウム（−ＮＨ_３ ^＋または−ＮＲ_３ ^＋）官能基、アルコール官能基（−ＯＨ）、カルボキシル官能基（−ＣＯＯＨ）またはイソシアネート官能基（−ＮＣＯ）でありうる。ＣＯＯＨ官能基をポリオレフィン中に導入するために最も一般的に使用されているモノマーはアクリル酸またはメタクリル酸である。

ビーズの表面への試薬の結合を、静電誘引、親和性相互作用、疎水性相互作用または共有結合によって行うことができる。共有結合が好ましい。

本発明において使用されるビーズは、形状がほぼ球状であり、０．５〜４０μｍ、好ましくは４〜９、より特定すると５〜８μｍでありうるサイズの粒子である。

ここで使用されるビーズは、適切な検出器によってそれらを互いに区別することを可能にする差示的なマーカーをそれらが有するという点で、「区別可能」である。それゆえ、各々のビーズの群は、適切な検出器またはツール（例えばフローサイトメーター）によってそれらを互いに識別することを可能にする、異なる物理化学的特性（サイズ、密度、粒子サイズ、粗さ、吸光度、蛍光、常磁性成分）を有する。

粒子を互いに区別するための差示的なパラメーターとして、特に、非重複サイズ範囲を選択することによって、粒子のサイズを利用しうる。別の好ましい実施態様において、区別可能な粒子は蛍光シグナルを発する。種々の蛍光標識を組み入れるビーズを、事実、その蛍光スペクトルによって区別することができる。このために、ビーズに１つ以上の色素（例えば蛍光、発光など）（適切であれば種々の濃度の）、または放射性同位元素型、酵素型などの標識を浸透させることができる（Venkatasubbarao S. << Microarrays-Status and prospects >> Trends in Biotechnology Dec 2004, 22(12):630-637 ; Morgan et al, << Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology >>, Clin. Immunol. (2004) 100:252-266）。光の散乱もしくは発光、またはその組み合わせを、粒子間の区別のために使用することもできる。

好ましい実施態様において、区別可能なビーズは発光または蛍光シグナルを発する。

使用されるビーズは、超常磁性、磁性または磁化可能でありうる。本発明に従って使用することができるビーズとして、特にＵＳ６，８７２，５７８に記載のものに言及しうる。特に好ましい実施態様によれば、使用されるビーズは、蛍光性でありそして超常磁性である。これらの物理化学的特性は、生物学的試料との反応の間に、これらの微粒子によって捕獲された画分を結合していないものから分離することを可能にしうる。この分離を、とりわけ、遠心分離、ろ過または磁化によって行うことができる。磁化による分離が好ましく、そしてこのために、常磁性、強磁性、フェリ磁性およびメタ磁性成分を含むビーズを使用しうる。常磁性成分が好ましい（例えば、鉄、コバルト、ニッケルまたは金属酸化物、例えばＭｎ_２Ｏ_３、Ｃｒ_２ＯもしくはＦｅ_３Ｏ_４）。磁性成分の量は２％〜５０％（重量）、好ましくは３％〜２５％でありうる。

抗体を、任意の適切な技術によってビーズに結合させうる。それらは、直接的共有結合によって、または非共有結合で、特に受動的吸着もしくは親和性によって結合されうる。直接的共有結合を、例えば、ヒドロキシスクシンイミドまたはカルボジイミドを介する結合を含む、ビーズの表面に存在するカルボキシル基の活性化によって行いうる。特定の実施態様において、抗免疫グロブリン抗体をまずビーズに結合させ（共有結合によって）、次いでビーズを結合させようとする抗体と接触させる。

赤血球または赤血球膜フラグメントを、ポリ−Ｌ−リジンを介する非共有結合によってか、または色素型のポリカチオンのような任意の型のリガンドによって、ビーズに結合させることができる。赤血球または赤血球膜フラグメントを、共有結合によって、特に過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、ビーズに結合させることもできる。

驚くべきことに、赤血球または膜フラグメントの結合が、共有結合であろうと非共有結合であろうと、フローサイトメトリープロセスに従って区別可能であるというビーズの有する特性を損なわないことが示された。

ビーズは、例えばＬｕｍｉｎｅｘの特許出願ＷＯ９７／１４０２８に記載されるような、フローサイトメーターのような検出器による測定に供される。従って、反応物（抗体または赤血球または赤血球膜）を保有するビーズのサブグループが生物学的試料に曝露され、各々のサブグループは、１つのサブグループのビーズを別のサブグループのものから区別することを可能にする１つ以上の分類パラメーターを有している。次いで、このようにして試料に曝露されたビーズは、検査ゾーン（例えばフローサイトメーター）を通過し、ここで分類パラメーターに関連するデータ（例えば蛍光発光強度）が収集され、そして好ましくは反応物と目的の分析物との間（すなわち、ビーズと、本発明の方法における（ａ）による赤血球によって保有される抗原性分子または（ｂ）による抗体との間）に形成された複合体の有無に関連するデータも収集される。

標識：
検出可能に標識された赤血球を、当業者に公知の任意の技術によって標識することができる。例えば、それを、蛍光化合物、例えば細胞の膜中に挿入されるフルオロフォアで標識してもよい。それを、それ自体が蛍光標識で官能性付与されている、赤血球の表面の構造を認識することができるリガンドを使用して標識してもよい。これらのリガンドは、例えば、抗体または動物または植物レクチンでありうる。これらの型の標識を、試験の前に行ってもよく、または行わなくてもよい。

抗体同定の場合、標識されるのは抗体であるか、あるいは、（場合により活性化された）血清補体画分である。任意の標識技術が可能である。標識の型を混合することもできる。

特定の実施態様によれば、抗体は、蛍光、発光または放射性標識を保有する抗ヒト免疫グロブリン抗体と接触させられる。

別の特定の、場合により累積的な、実施態様によれば、活性化血清画分を、活性化血清補体画分を特異的に認識する、例えば、蛍光、発光または放射性標識を保有する抗体と接触させる。そのような抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、そして当業者に周知である。

非結合試薬の除去：
分析工程を行う前に、接触および試薬のインキュベーションの間に結合していない試薬を除去すべきである。バックグラウンドノイズを低下させ、それゆえ試験の良好な特異性を得るために、できるだけ多くのの非結合試薬を除去することが望ましいが、徹底的過ぎる条件は前記試験の感度を低下させうる。それゆえ、非結合試薬の残存する存在は一般に容認できる。方法の感度と特異性との間の許容されうる妥協を得るための条件は、日常的な実験により当業者によって容易に決定されうる。

非結合試薬の除去を、反復した遠心分離工程、またはビーズの超常磁性性質の使用および磁石の使用による洗浄のような、当業者に公知の任意の技術によって行うことができる。

好ましい実施態様：
上記で規定するように、本発明による方法は、抗原を同定することを可能にし、または結合している抗体または血清補体画分を同定することも可能にする。それはまた、いくつかの型の同定の組み合わせを使用することを可能にする。従って、抗原の同定および抗体の同定を、同時にまたは別々に行うことができる。抗体の同定を、抗体および血清補体画分の両方を明らかにすることによって行うことができる。

容器は任意の固体容器、例えば試験管、マクロプレートウェル、または自動化システムにおける反応を可能にする任意の容器でありうる。容器を遠心分離する必要はない。

反応物の混合および目的の分析物の混合を、凝集なしに、赤血球によって保有される抗原の抗体への特異的結合を可能にする条件（特にｐＨ、温度、イオン強度などの）下で行う。凝集の実質的な非存在は、特にフローサイトメーターを使用することを可能にする。いかなる凝集反応をも回避するために、ビーズの量およびサイズを、そしてまた試料の濃度を調整することが有利である。凝集反応は、特にH.E. Hart, Bulletin of mathematical biology, vol 42, 17-36、K.C. Chak, Bulletin of mathematical biology, vol 42, 37-56およびC. DeLisi, Journal of Theoretical Biology, 1974, vol 45, pages 555-575によって記載されている数学的法則を満たす。これらの法則は、特に、試薬のサイズそしてまたその数での比率のようないくつかのパラメーターを含む。それゆえ、当業者は、実質的な凝集が生じないように、使用する試薬に応じてこれらの数学的法則を適用することによって、反応条件を選択する。例えば、赤血球および赤血球のサイズと類似するサイズ（すなわち７μｍのオーダー）のビーズを使用する場合、当業者は３０〜１５０の範囲のビーズ数に対する赤血球数の比率を選択する。

有利には、溶血のようなヘモグロビンの化学的または酵素的分解の工程を、好ましくは結合の後、抗原または抗体の同定の前に提供することが好ましい。

溶血を種々の方法で行うことができる。例えば、混合物を低浸透圧モル濃度の媒質中でインキュベートすることができる。「低浸透圧モル濃度の媒質」という用語は、一般に、１００ｍｏｓｍｏｌ／Ｌ以下の浸透圧モル濃度を有する媒質を意味することが意図される。低浸透圧モル濃度の適切な媒質として、４０ｍＭ以下の濃度を有する塩化アンモニウム溶液、または蒸留水に言及しうる。溶血を超音波処理によって行ってもよい。

適用：
方法は、多重フォーマットで、赤血球によって保有される抗原性分子の同定を行うことを可能にする。

さらに、方法は、例えば蛍光シグナルの分析を通して、試料中の赤血球の表面の抗原の割合を定量的に決定することを可能にする。

本発明の方法は抗体の定量化も可能にする。従って、得られる結果は数値的形態にあり得、そして電子データ処理システムによる促進された解釈のために利用可能でありうる。

有利には、方法は、完全な信頼できる結果を数分のみのうちに得ることを可能にする。より詳細には、１時間未満のうちに、または３０分未満のうちにさえ完全な結果を与えることが可能である。

本発明の方法はまた、取る試験試料の容積をかなり低下させることを可能にする。今日、反応は、一般に、各々の試験について２５μｌの試験試料を用いて行われる。本発明の方法を行うためには、例えば５０〜１００μｌのみで十分である。

以下の図面および実施例は本発明をその範囲を限定することなしに例証する。

Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ上の抗体の直接的固定化を示すスキームである。 Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ上の、親和性による、ビーズ上の抗体の固定化を示すスキームである。 蛍光膜内化合物での種々の表現型の赤血球の標識を示すスキームである。 ポリ−Ｌ−リジンによりＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ上に赤血球を固定化するための手順を示すスキームである。 赤血球の多重化表現型決定（multiplexed phenotyping）を示す。 赤血球の多重化表現型決定を示す。 赤血球の多重化表現型決定を示す。 赤血球の多重化表現型決定を示す。 「直接クームス陽性」患者由来の赤血球の同時同定および多重化表現型決定を示すスキームである。

実施例：
実施例１：抗原同定
この分析の目的は、ドナーまたは患者由来の赤血球の表面に存在する抗原を、特異的モノクローナル抗体によって、同定することである。

蛍光ビーズを使用して、抗赤血球抗体を固定化する。このようにして、異なる抗原特異性の抗体を、異なる色を有するビーズの種々の領域に結合させることができる。

赤血球については、それを、企業Bio-Radによって「Ｂｉｏｐｌｅｘ ２００」の名称の下に販売されている装置のレポーターレーザーの波長に適合する蛍光化合物で標識する。

標識後、赤血球を、感受性化したビーズとともにインキュベートする。このようにして、ビーズに結合した赤血球を検出し、従ってその抗原特異性を決定することが可能である。

１．１ − 材料および試薬
ビーズ：
使用するビーズはＬｕｍｉｎｅｘ（Luminex Corp., Austin Texas, United States）によって製造されている。それは、ポリスチレンおよびメタクリル酸（ＣＯＯＨ官能基）から構成される、直径８μｍの超常磁性ビーズである。
この実施例において、種々のビーズ領域１９、２１、３２、３４（内部標準ビーズ（ＩＳＢ））、７１および９８（ブランクビーズ（ＢＢ））を有する蛍光超常磁性ビーズを使用する。
ビーズ領域３４を有するビーズ（ＩＳＢ）にローダミン誘導体で官能性付与し、そしてそれを内部蛍光対照として使用する。このビーズは５０００〜１５０００ＲＦＩの蛍光値を生じるはずである。
領域９８ ＢＢビーズをウシアルブミンを用いて飽和させる。このビーズは、抗原も抗体も結合せず、それゆえ非特異的結合の非存在を確認するために使用される。このビーズは１０００ＲＦＩ未満の蛍光値を生じるはずである。
− 抗ヒト免疫グロブリンモノクローナルＩｇＧ抗体、クローン１２５Ａ１５（Bio-Rad）。
− 抗ヒトＩｇＭ（μ）ポリクローナル抗体（Bio-Rad）。
− 抗Ｄ ＩｇＧ（クローンＨ２Ｄ５Ｄ２Ｆ５）、抗Ｆｙａ ＩｇＧ（クローン５Ｔ７２Ａ１３Ｆ５Ａ９３）および抗Ｓ ＩｇＭ（クローンＭＳ９４）モノクローナル抗体（Bio-Rad, Millipore）。
− ＰＫＨ２６細胞標識キット（Sigma）。
− 企業Bio-Radによって「ＳｃａｎＬｉｓｓ」コード８６４４２および「Ｓｔａｂｉｌｉｓｓ」コード８６５５０の名称の下に販売されている希釈媒質。
− 非定型抗体スクリーニング用に「ＳｃａｎＧｅｌ Ｃｏｏｍｂｓ」コード８６４３２の名称の下に販売されているゲルカード（Bio-Rad）。
− 「ＳｃａｎＧｅｌＲｈＫ」コード８６４２８および「ＳｃａｎＧｅｌ Ｎｅｕｔｒａｌ」コード８６４３０の名称の下に販売されているゲルカード（Bio-Rad）。
− ゲルカード技術による非定型抗体スクリーニング用に「ＳｃａｎＰａｎｅｌ」コード８６５９３および「ＳｃａｎＣｅｌｌ」コード８６５９５の名称の下に販売されている表現型決定された赤血球（Bio-Rad）。
− ＳＡＧ−ＭＡＮ培地中に保存された濃縮され表現型決定された血液細胞ペレット（EFS Nord de France）。
− 患者試料起源の直接クームス陽性および／または陰性赤血球。
− コーティング液または緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）プロクリン。
− ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Millipore）。
− ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４（７ｍＭリン酸ナトリウム、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３６ｍＭ ＮａＣｌ）。

１．２ − プロトコル
１．２．１．血液型抗体でのビーズの感受性化
ビーズの表面での抗体の固定化を２つの異なる原理に従って行うことができる。第１の場合、抗体をビーズ上に直接的に共有結合によって固定化する（図１）。第２のアプローチは、親和性によって、非共有結合的に抗赤血球抗体の固定化を行うことにある。この場合、結合は、第１工程においてビーズに共有結合により結合された抗免疫グロブリン抗体により行われる（図２）。このアプローチを、示す実施例において選択した。

ビーズ領域１９、２１および３２を有するビーズを、抗ヒト免疫グロブリンの共有結合固定化のために使用した。ビーズ領域７１を有する蛍光ビーズを、抗ヒトＩｇＭの共有結合固定化のために使用した。ビーズの表面に存在するカルボキシル基を、ヒドロキシスクシンイミドおよびカルボジイミドを含む技術に従って活性化した。このようにして、タンパク質をそのアミン基を介して固定化することができた。

このようにして調製したビーズを、＋４℃で、１０％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０および０．０９％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４中３ｍｇ／ｍｌの濃度で貯蔵する。

固定化抗ヒト免疫グロブリンを保有するビーズを、抗Ｄ ＩｇＧまたは抗Ｆｙａ ＩｇＧ血液型抗体で感受性化することができる。抗免疫グロブリンは、事実、ＩｇＧがそのＦｃフラグメントを介して結合することを可能にする。それゆえ、血液型抗体を、この原理を使用してビーズ上に非共有結合的に固定化する。各々のビーズ領域を、異なる特異性の抗体で感受性化する。選択される抗免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンに対する高親和性を有し、従ってこの結合を長時間安定にする。

非精製抗Ｄおよび抗Ｆｙａを、それぞれ最終濃度３０および１０μｇ／ｍｌで、８０μｇ／ｍｇの抗Ｆｃで官能性付与されたビーズとともに使用する。

血液型抗体での感受性化を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中攪拌しながら３７℃で１時間行う。

感受性化後、ビーズを数回すすぎ、次いで＋４℃でＰＢＳ、ｐＨ７．４中で貯蔵する。

固定化抗μを保有するビーズを抗Ｓ ＩｇＭで感受性化することができる。抗μは、事実、ＩｇＭの結合を可能にする。この抗μポリクローナル血清の親和性は、長時間安定な結合を確実にするために十分である。非精製抗Ｓを４０μｇ／ｍｇの抗μで官能性付与されたビーズ上に固定化する。感受性化を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中攪拌しながら３７℃で１時間行う。感受性化後、ビーズを数回すすぎ、次いで＋４℃でＰＢＳ、ｐＨ７．４中で貯蔵する。

赤血球とのインキュベーション（試験自体）の前に、血液型抗体で感受性化したビーズを、対照領域３４ビーズ（ＩＳＢ）および対照領域９８ビーズ（ＢＢ）と混合する。

１．２．２．赤血球の標識
蛍光化合物での赤血球の標識を、種々の原理を使用して行うことができる。示す実施例において、赤血球をＰＫＨ２６（これは赤血球膜中に挿入されるフルオロフォアである）を使用して標識する。このようにして、種々の表現型の赤血球を、同一のプロトコルに従って標識することができる（図３）。

ＰＫＨ２６は企業Sigmaによって販売されている蛍光プローブである。このプローブは、５５１ｎｍに最大励起を、そして５６７ｎｍに最大発光を有する。

キットは、蛍光標識（これは長い脂肪族鎖を有し、それが細胞膜の脂質層中に組み込まれることを可能にする）を含み、そして塩、緩衝液または有機溶媒を含まない等張水性希釈剤も含む。この希釈剤は、細胞生存率、標識溶解性および標識効率を高レベルに維持することを可能にする。ＰＫＨ２６での赤血球の標識を、製造業者によって推奨されるプロトコルを使用して行う。このようにして標識した赤血球を、Ｓｔａｂｉｌｉｓｓ緩衝液中で希釈し、そして暗所で＋４℃で貯蔵する。

標識赤血球の品質、生存率および安定性を、ゲル技術に従って表現型決定アッセイを行うことによって経時的に確認する。標識赤血球の抗原性完全性を、非標識赤血球のものと比較する。蛍光標識の品質および安定性は、それらに関する限り、Bio-Radからの「Ｂｉｏｐｌｅｘ ２００」装置を使用して蛍光測定を行うことによって研究される。

１．２．３．抗体−ビーズおよび赤血球のインキュベーション
本発明による技術に従う型決定（grouping）の実行可能性を実証し、そしてその特異性を確認するために、本発明者らは単体（unitary）様式で反応を行った。この場合、目的の抗体で官能性付与されたビーズを、種々の表現型の赤血球とともに個別にインキュベートする。

多重化反応の場合、異なる血液試料を異なるビーズ領域を有するビーズと個別に接触させ、そして異なる特異性の抗体で感受性化する。この型の実験は、同じ試験試料中でいくつかの抗原特異性を検出することの可能性を確認することを可能にした。

感受性化したビーズを、赤血球と、約５０〜１５０の赤血球／ビーズ比率が得られるように混合する。混合物を、１５分間攪拌しながら３７℃でインキュベートする。

インキュベーション後、ビーズ−赤血球複合体を数回蒸留水で洗浄する。

１．２．４．企業Bio-Radからの「Ｂｉｏｐｌｅｘ ２００」自動化デバイスを使用したフローサイトメトリーによる測定
最終洗浄の後、測定の前に、複合体を１８５μｌの「コーティング液」媒質で希釈する。各々の試験について、２５μｌの懸濁液を自動的に装置中に注入する。領域当たり２５０ビーズの捕獲によって測定を行う。

各々の型決定／表現型決定シリーズについて、研究する反応の特異性を確認するために、系統的な対照を行う。

１．３．単純／多重表現型決定／型決定実施例
この一連の試験の目的は、単体および／または多重化様式での赤血球の表現型決定／型決定の実行可能性を実証することである。Ｄ、ＦｙａおよびＳ抗原をモデルとして選択する。抗ヒト免疫グロブリンまたは抗μ鎖抗体で感受性化したビーズを使用して、抗Ｄ、抗Ｆｙａおよび抗Ｓ抗体を固定化する。

１．３．１．ＲＨ Ｄ陽性赤血球の単体表現型決定
抗Ｄ抗体で感受性化したビーズを、ＰＫＨ２６で標識したＲｈ Ｄ陽性およびＲｈ Ｄ陰性赤血球とともに、１５０の赤血球数／ビーズ数比率を使用してインキュベートした。

２つのＲＨ Ｄ陽性赤血球および２つのＲＨ Ｄ陰性赤血球を使用した。各々の試料を装置中に二連で注入した。

ＲＨ Ｄ陽性赤血球は２１０００〜２５０００ＲＦＩのオーダーの強く陽性のシグナルを生じ、一方、ＲＨ Ｄ陰性赤血球は４０〜４００ＲＦＩの陰性シグナルを示す。

６５００ＲＦＩのオーダーのシグナルを与えるＩＳＢ３４対照ビーズおよび１０００ＲＦＩ未満を与えるＢＢ９８対照ビーズにより結果を検証する。行う種々の陰性対照は、１５〜４００ＲＦＩのシグナルを示し、反応の特異性を確認する。ＲＨ Ｄ陽性およびＲＨ Ｄ陰性赤血球は、事実、抗Ｄ抗体の非存在下でビーズに結合しない。

これらの結果は、ＲＨ Ｄ陽性およびＲＨ Ｄ陰性赤血球を非常に明らかに区別すること、それゆえ赤血球の表面のＤ抗原を同定することの可能性を実証する。

ＦｙａおよびＳ赤血球の単体表現型決定を、同じ原理に従って、アイソタイプＧ特異的またはアイソタイプＭ型特異的抗体を使用して行うことができる。

１．３．２．Ｄ、ＦｙａおよびＳ赤血球の多重表現型決定
多重化表現型決定の原理を図５Ａ〜５Ｄにまとめる。

この場合、抗Ｄ抗体で感受性化した領域１９ビーズを、抗Ｆｙａ抗体で感受性化した領域２１ビーズと、そしてまた抗Ｓ抗体で感受性化した領域７１ビーズと混合した。

このビーズの混合物を、異なるＤ、ＦｙａおよびＳ表現型を有する赤血球とともにインキュベートした：Ｄ＋Ｆｙａ＋Ｓ＋／Ｄ＋Ｆｙａ−Ｓ−／Ｄ−Ｆｙａ＋Ｓ−／Ｄ−Ｆｙａ−Ｓ−／Ｄ−Ｆｙａ−Ｓ＋／Ｄ−Ｆｙａ＋Ｓ＋／Ｄ＋Ｆｙａ−Ｓ＋／Ｄ＋Ｆｙａ＋Ｓ−。５０の赤血球数／ビーズ数比率を使用した。

所定の抗体で感受性化したビーズが対応する抗原特異性を有する赤血球に結合したときに、１３０００〜２９０００ＲＦＩの陽性シグナルが得られる。

完全な相関が、測定される蛍光シグナルと、試験を行うために使用される赤血球の表現型との間に観察される。

抗体で感受性化したビーズを、対応する抗原を保有しない赤血球と接触させたときに、１０００ＲＦＩ未満のシグナルが得られる。

さらに、抗体感受性化していないビーズを用いて行う対照は、使用する赤血球にかかわらず、陰性シグナルを生じる。

これらの結果は、測定されるシグナルが特異的であること：抗原−抗体対が関与するときにのみビーズ−赤血球結合が起こることを実証する。

対照ビーズＩＳＢ３４（１１０００ＲＦＩ）およびＢＢ９８（１０００ＲＦＩ未満）を用いて得られた結果は、分析を検証する。

試験間変動係数は１％〜１０％であり、これは満足な試験間再現性を実証する。

これらの結果は、本発明による技術に従う赤血球の３パラメーター多重化表現型決定の実行可能性を実証する。

１．３．３．直接クームス陽性（ＣＤ＋）赤血球の多重化表現型決定
マイクロビーズを用いる多重化アプローチの使用は、図６に記載の原理に従って同時にＣＤ＋性質を同定し、そして赤血球を表現型決定することを可能にする。

抗Ｆｃ抗体で感受性化した領域３２ビーズを、それぞれ抗Ｄ、抗Ｆｙａおよび抗Ｓ抗体で感受性化した領域１９、２１および７１ビーズと混合する。抗体でインビボで感受性化したＣＤ＋赤血球は、領域３２ビーズによって保有される抗ヒト免疫グロブリンに結合することができ、それによりＣＤ＋特徴を同定することを可能にする。さらに、これらの赤血球はまた、赤血球膜上に存在する特異性に従って、Ｄ、ＦｙａおよびＳ抗原に特異的な抗体を保有する領域１９、２１および７１ビーズに結合することができる。

このアプローチを、４０のオーダーの赤血球数／ビーズ数比率を使用して実証した。

ＩＳＢ３４およびＢＢ９８対照ビーズは、予想される、すなわちそれぞれ１３０００ＲＦＩおよび１０００ＲＦＩ未満のオーダーのシグナルを生じ、そして結果を検証する。

２つのＣＤ＋赤血球は、抗ヒト免疫グロブリン抗体で感受性化した領域３２ビーズを用いて３００００ＲＦＩより高い陽性シグナルを生じる。２つのＣＤ陰性赤血球は、それらに関する限り、この同じビーズ領域を用いて５００ＲＦＩ未満の陰性シグナルを生じる。これらの結果は、所定のビーズ領域のビーズに予め結合された抗グロブリンを使用してその特異的結合によりＣＤ＋赤血球を同定することの可能性を実証する。

さらに、結果はまた、ＣＤ＋赤血球の赤血球抗原の多重化表現型決定を、ＣＤ＋性質の同定と同時に行うことができることを実証する。事実、ＣＤ＋赤血球の一方はＤ＋Ｆｙａ−Ｓ−と、そして他方はＤ＋Ｆｙａ＋Ｓ＋と表現型決定される。

これら２つの試料のＳ表現型を、従来技術に従って、ＩｇＭ型の抗Ｓ抗体を使用して確認した。得られた結果は、新たな技術に従って得られたものと完全に相関する。

他方、抗Ｆｙａ表現型に関しては、この同じ分析を行うことができなかった。事実、赤血球を表現型決定するためのＩｇＭ型の試薬は存在しない。

しかし、分析したＣＤ＋赤血球に従ってＦｙａ表現型について差異が観察され、これは結果を検証し、そして非特異的結合の現象を排除することを可能にする。

変動係数は大部分の試料について１％〜５％であり、これは満足な試験間再現性を示す。

実施例２：赤血球老化のマーカーであるホスファチジルセリンの検出
赤血球老化のマーカーの実証は、輸血における赤血球集団の研究において（Cardo L J et al Transfus Apher Sci, 2008 Apr; 38(2): 141-7）、またサラセミアのような特定の血液病態に関与する現象の研究において（Basu S et al Br J Haematol, 2008 Apr; 141(1): 92-9）価値がある。

赤血球老化は、特に、赤血球の表面でのホスファチジルセリン（ＰＳ）と呼ばれる構造の出現によって反映される。

本発明の試験を、赤血球の表面でこの分子を検出するために容易に実行することができる。

このために、蛍光ビーズを使用して、試験しようとする赤血球を、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を介して固定化する。

次いで、このビーズをインキュベーション相で抗ホスファチジルセリン抗体と接触させる。

洗浄工程の後、抗ホスファチジルセリンの赤血球への結合を、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識された抗Ｆｃ（ＩｇＧ）二次抗体とのビーズ−赤血球複合体のインキュベーションによって検出する。

非結合抗Ｆｃ（ＩｇＧ）−ＰＥを除去することを意図した最終洗浄工程を行う。

次いで、ビーズ−赤血球複合体を、ＢｉｏＰｌｅｘ ２００装置を使用して読み取る。

血液バッグから得られる様々な時期の赤血球を標準範囲として使用する。

Claims (14)

1. 生物学的試料中の、個体の赤血球によって保有される複数の抗原性分子を同定するための、および／または赤血球によって保有される抗原性分子に対する複数の抗体を同定するためのインビトロ方法であって、
   赤血球によって保有される抗原性分子は、血液型分子以外の、赤血球、および少なくとも１つの他の細胞集団の両方によって保有される抗原性分子からなり、
   方法は、
   ａ）
   （ｉ）赤血球を含む試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、赤血球が抗体に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる、赤血球によって保有される抗原性分子に特異的な、所定の抗体を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること（ここで、赤血球はそれがビーズの群と接触させられる前または後に標識される）、
   （ｉｉ）抗体に結合していない赤血球を除去すること、および
   （ｉｉｉ）標識された赤血球に結合しているビーズの群を同定し、それにより、検出される赤血球によって保有される抗原の同定を可能にすること、
   によって、個体の赤血球によって保有される複数の抗原性分子を同定すること；および／または
   ｂ）
   （ｉｖ）試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、試料中に存在する抗体または活性化血清補体画分が赤血球または赤血球膜フラグメントに結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる、既知の表現型の、（１）赤血球または（２）赤血球膜フラグメントを各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること、
   （ｖ）赤血球または赤血球膜フラグメントに結合していない抗体または活性化血清補体画分を除去すること、
   （ｖｉ）結合している抗体および／または結合している活性化血清補体画分を標識すること、および
   （ｖｉｉ）標識された抗体または標識された活性化血清補体画分に結合しているビーズの群を同定し、それにより、存在する、赤血球によって保有される抗原性分子に対する抗体の同定を可能にすること、
   によって、生物学的試料中の赤血球によって保有される抗原性分子に対する複数の抗体を同定すること、
   を含む、方法。
2. （ａ）による抗原の同定および（ｂ）による抗体の同定が同時にそして同じ容器中で行われる、請求項１記載の方法。
3. 混合物の分析がフローサイトメトリーによって行われる、請求項１または２記載の方法。
4. 溶血のような、ヘモグロビンの化学的または酵素的分解の工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 区別可能なビーズが超常磁性または磁性または磁化可能ビーズである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 区別可能なビーズが発光または蛍光シグナルを発する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 検出可能に標識された赤血球が蛍光化合物で標識される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 抗体（ｂによる）が、蛍光、発光または放射性標識を保有する抗ヒトグロブリン抗体と接触させることによって標識される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 活性化血清補体画分が、蛍光、発光または放射性標識を保有する抗血清補体画分抗体と接触させることによって標識される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 生物学的試料が、全血、血漿、血清、血液細胞ペレットまたは任意の他の血液調製物からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
11. 生物学的試料が、抗体によってインビボで感受性化されたか、または血清補体画分でコートされたかのいずれかの赤血球を有する個体起源である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 同定された抗体の定量をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
13. 抗原性分子が、ＨＬＡ系の分子、個体によって吸収された化学産物もしくは医薬、またはその分解産物である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
14. 請求項１〜１３のいずれか１項記載の検出方法を実行するための一組の試薬であって、各々が、検出されることができる少なくとも１つの特定の物理的パラメーターを保有し、そして、群の１つは赤血球によって保有される抗原性分子に特異的な捕獲抗体を保有し、そして他の群は（１）赤血球または（２）赤血球膜フラグメントを保有する、少なくとも２つの異なる群に属する、区別可能なビーズの群を含む、一組の試薬。

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