FR2963107B1 - Complexe immuno-magnetique et son utilisation pour le groupage/phenotypage erythrocytaire - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un réactif pour le groupage/phénotypage érythrocytaire comprenant une suspension de particules ou billes magnétiques revêtues d'une antiglobuline saturée d'anticorps anti-antigène érythrocytaire ainsi qu'un kit ou dispositif le comprenant. La présente invention concerne également un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire mettant en oeuvre une telle suspension de particules ou billes magnétiques selon la présente invention.

Description

La présente invention concerne un réactif pour le groupage/phénotypage érythrocytaire comprenant une suspension de particules ou billes magnétiques revêtues d’une antiglobuline saturée d’anticorps anti-antigène érythrocytaire ainsi qu’un kit ou dispositif le comprenant. La présente invention concerne également un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire mettant en oeuvre une telle suspension de particules ou billes magnétiques selon la présente invention.

En pratique clinique transfusionnelle, le phénotypage érythrocytaire, qui correspond à la recherche et à l’identification des antigènes de groupe sanguin à la surface des hématies (à l’exception du système ABO où l’on recherche en outre la présence des anticorps réguliers correspondants) concerne aussi bien le receveur que le donneur. A l’échelon du receveur et du donneur, trois niveaux de phénotype érythrocytaire existent afin de mettre à disposition du receveur des concentrés érythrocytaires compatibles en fonction des situations à risque : la détermination du groupage ABO et Rhésus standard (présence ou absence de l’antigène D) ; la détermination du phénotype Rhésus Kell (présence ou absence des antigènes C, E, c, e, et K) ; et la détermination du phénotype étendu (ou élargi), c’est-à-dire présence des antigènes du système Duffy (Fya, Fyb), du système Kidd (Jka, Jkb) et du système MNSs (antigènes S et s) ; d’autres antigènes pouvant être en outre recherchés selon la nature du risque et/ou de l’anticorps irrégulier mis en évidence dans le sérum du receveur.

Les techniques habituellement utilisées pour le phénotypage consistent, en général, à rechercher à l’aide de sérums tests contenant les anticorps appropriés la présence ou l’absence de l’antigène recherché. De préférence, ces anticorps contenus dans ces sérums tests sont de nature agglutinante (IgM ou IgA) ce qui permet d’obtenir une agglutination totale ou partielle des érythrocytes à phénotyper lorsque ces derniers portent l’antigène correspondant à l’anticorps présent dans le sérum test. Néanmoins, il est possible d’utiliser des anticorps tests non agglutinants (de type IgG), l’agglutination étant provoquée au moyen d’une anti-immunoglobuline humaine et visible notamment après une étape de centrifugation et remise en suspension du culot obtenu (technique dite de Coombs indirect).

Ce test est appelé coombs indirect, car la première étape consiste à incuber les globules rouges avec les IgG tests à 37°C. A la suite de l’incubation, une étape de lavage par centrifugation est réalisée pour éliminer l’excès d’anticorps non fixé et permettre une fixation optimale de T antiglobuline humaine (AGH). La fixation de l’AGH (anti-globuline humaine) aux anticorps tests permet une agglutination des globules rouges par formation d’un complexe macromoléculaire. Cette agglutination sera favorisée après une étape de centrifugation et de remise en suspension du culot obtenu.

Parmi les variantes des techniques utilisées pour le phénotypage ou pour la recherche d’anticorps irrégulier (RAI), on peut également citer celles qui ont été développées de manière générale pour la recherche dans un échantillon d’un analyte capable de se fixer sur une cellule en utilisant des particules magnétiques, ceci notamment afin de supprimer la centrifugation, opération nécessaire notamment dans les techniques basées sur l’agglutination comme la technique à l’anti-globuline (Coombs indirect par agglutination ou par immuno-adhérence sur phase solide) pour la RAI ou encore pour le phénotypage, ou encore, comme pour la RAI, lorsqu’il est nécessaire de laver les globules rouges sensibilisés afin d’éliminer les anticorps non spécifiques capables de reconnaître l’anti-immunoglobuline utilisée à l’étape suivante.

En effet, l’étape de centrifugation est toujours difficile à mettre en œuvre dans les procédés que l’on souhaite entièrement automatiser, notamment due au coût et à l’encombrement des centrifugeuses, leur manipulation, etc..

Les particules magnétiques sont depuis longtemps utilisées pour la détection de complexes de type ligand-récepteur ou anticorps-antigène, on peut citer par exemple les procédés tels que ceux décrits dans les documents brevets suivants : - le document WO 92/17781 qui décrit une méthode de détermination de la présence d’un ligand dans un échantillon dans laquelle on incube des particules de latex magnétiques, pouvant être de couleurs différentes, revêtues d’une substance, telle un anticorps, capable de se fixer avec ce ligand, puis on applique un champ magnétique au milieu d’incubation et enfin on observe la présence ou l’absence d’agglutination ; ou encore - le document EP 0 426 170 qui décrit une méthode de détermination de la présence d’un ligand dans un échantillon, méthode dans laquelle on incube des particules de gélatine magnétiques sensibilisées avec des antigènes ou des anticorps capables de se fixer avec ce ligand, puis on applique un champ magnétique au milieu d’incubation et enfin on observe la présence ou l’absence d’agglutination, ladite méthode étant caractérisée en ce qu’on observe l’état de glissement de ces particules après inclinaison du container, notamment une cupule de microplaque à fond en V.

De telles particules magnétiques ont déjà été utilisées en immunohématologie pour le phénotypage et/ou la RAI. Parmi les documents décrivant de telles applications, on peut citer notamment : - le document W02005121805 qui décrit un procédé de groupage/phénotypage et de recherche d’agglutinines irrégulières utilisant une solution aqueuse de ferrofluide ; - le document EP 0 351 857 qui décrit un procédé de dosage immunologique utilisant des marqueurs magnétisés tels que des anticorps ou des antigènes fixés sur des billes de latex magnétiques ; - le document EP 0 528 708 qui décrit un procédé de détection par immunoadhérence d’une substance biologique susceptible d’être présente dans un échantillon mettant en œuvre des billes de latex magnétiques ; et - le document brevet EP 0 230 768 qui décrit un procédé de co-agrégation de particules magnétiques capable de se lier à une substance contenue dans un échantillon au moyen de composés polycationiques ou polyanioniques en présence d’un champ magnétique.

Si ces dernières techniques mettant en œuvre des billes magnétiques ou un ferrofluide modifié permettent de s’affranchir des étapes de centrifugation, elles nécessitent l’utilisation de phases solides préalablement revêtues de globules tests ou à phénotyper, peu stables ou devant être préparées par l’utilisateur final. D’autre part, voir notamment le document EP 0 230 768, l’utilisation de certaines compositions magnétiques provoque la co-agrégation non spécifique des globules rouges après application du champ magnétique ce qui abolit définitivement la possibilité d’une lecture d’une agglutination spécifique des globules rouges en présence de l’anticorps anti-antigène érythrocytaire, technique de référence dans le domaine de la transfusion sanguine.

Ainsi, il reste de pouvoir disposer d’un procédé rapide et simple, pouvant être mis en œuvre sur un support pratique et disponible tel qu’une microplaque, procédé dans lequel l’étape de centrifugation est remplacée par l’application d’un champ magnétique, pouvant être entièrement automatisé et permettant de réaliser le groupage/phénotypage de globules rouges par lecture d’agglutination spécifique au moyen d’anticorps tests de type IgG (non agglutinants mais d’une plus grande disponibilité et diversité en terme de spécificité), ceci sans interférer significativement sur l’image finale obtenue, ce procédé pouvant être également applicable pour l’épreuve de Simonin (contre-épreuve) dans le cadre du phénotypage ABO. Un tel procédé serait effectivement plus avantageux si la composition magnétique utilisée ne provoque pas d’agrégation non spécifique des globules rouges et pour le phénotypage évite la nécessité d’utiliser des sérums tests agglutinants, plus rares et donc plus chers.

Ceci est justement l’objet de la présente invention.

Les inventeurs ont mis en évidence que des érythrocytes mis en contact avec une suspension diluée et aqueuse de particules magnétiques (microparticules ou billes magnétiques) revêtues d’antiglobuline comme l’antiglobuline humaine (AGH), cette dernière étant préalablement saturée avec un anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire, étaient capables de s'agglutiner spécifiquement après avoir été soumis à un champ magnétique, ce quelle que soit la nature agglutinante (IgG ou IgM) des anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire utilisés.

De plus, ce réactif permet d’effectuer un tel groupage ou phénotypage sans centrifugation et par conséquent d’automatiser complètement ce procédé.

Enfin, les inventeurs ont mis en évidence qu’un tel réactif prêt à l’emploi était stable et pouvait être stocké avant utilisation.

Les inventeurs ont mis en évidence également et de manière inattendue que la présence de ces billes ou particules magnétiques contenues dans cette suspension ainsi diluée, n’interférait pas de manière significative sur cette agglutination spécifique, cette dernière pouvant être mise en évidence aisément à l’oeil ou par tout système de lecture automatisé adéquate capable de détecter la présence ou l’absence d’agglutinats érythrocytaires.

Enfin, un tel réactif permet d’utiliser pour le phénotypage des anticorps antiantigène de groupe/phénotype érythrocytaire de type IgG et aboutir à une lecture par agglutination spécifique.

Le terme de groupage est utilisé pour le système de groupe sanguin dit ABO, le terme phénotypage pour les autres systèmes de groupes sanguins.

La présente invention permet de réaliser un groupage/phénotypage érythrocytaire à partir d’IgG tests sans réaliser d’étapes de lavages, pour éliminer l’excès d’IgG spécifiques après l’incubation à 37°C, ni d’étapes de centrifugation pour favoriser l’agglutination du complexe ainsi formé en présence des érythrocytes. L’invention est relative à un procédé permettant le groupage et le phénotypage sanguin grâce à un réactif prêt à l’emploi utilisé dans un kit.

Ce procédé utilise des particules magnétiques recouvertes d’une antiglobuline humaine, elle-même préalablement saturée en IgG spécifiques de l’antigène à mettre en évidence sur le globule rouge (voir figure 1). Ainsi il est possible de réaliser un coombs indirect, sans lavage et sans centrifugation, puisque d’une part l’IgG spécifique est déjà fixée à l’antiglobuline et ne nécessite aucun lavage, et d’autre part après fixation des globules rouges à ce complexe immuno-magnétique, l’application d’un champ magnétique va entraîner les globules rouges au fond du puits et favoriser leur agglutination. Une agitation après la phase d’aimantation permet de resuspendre le culot et de visualiser l’agglutinat.

Ce procédé peut permettre le groupage et phénotypage de tous les antigènes présents à la surface des globules rouges, dès lors qu’il existe un anticorps disponible.

Par ailleurs, il est tout à fait possible de réaliser ce type de test en utilisant des IgM et ainsi renforcer leur pourvoir agglutinant. Il s’agit alors de fixer sur la bille magnétique une antiglobuline anti-IgM humaine et de la saturer avec une IgM spécifique de l’antigène à mettre en évidence.

Il est aussi possible de mélanger dans un même réactif prêt à l’emploi, deux types de billes, chacune couplée à une antiglobuline et à un anticorps spécifique et de pouvoir par ce mélange améliorer la détection d’un antigène variant ou faible. Notamment dans le cas de la recherche de D faible, où il est souvent utilisé des mélanges de clones anti-D pour permettre une reconnaissance optimale de tous les antigènes D faibles et variants.

Il devient alors facile de réaliser des agglutinations spécifiques et de phénotyper totalement les globules rouges d’un individu, en utilisant tout type d’anticorps et quel que soit son isotype.

Ce complexe macromoléculaire, immuno-magnétique, devient ainsi capable d’agglutiner des globules rouges présentant l’antigène à détecter, après application d’un champ magnétique. L’étape de centrifugation normalement utilisée est alors remplacée par une étape d’aimantation pour favoriser l’agglutination.

Ainsi, la présente invention a pour objet une suspension de particules magnétiques ou billes magnétiques, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont révêtues à leur surface d’un complexe antiglobuline, de préférence antiglobuline humaine (AGH)/anticorps et dans lequel complexe, ledit anticorps est dirigé spécifiquement contre un antigène de groupe/phénotype érythrocytaire (dénommé anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire).

Il est bien entendu ici que si l’antiglobuline (AG) est une AG anti-espèce d’une espèce donnée, alors ledit anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire aura comme origine la même espèce contre laquelle est dirigée ladite AG.

Par exemple, et de préférence, quand l’AG est une AGH, alors ledit anticorps du complexe est un anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire d’origine humaine. Néanmoins, l’AG pourra être de type AG murine et ledit anticorps est un anticorps d’origine murine, il en est de même pour le rat ou pour tout autre mammifère.

Sous un aspect particulier, cette AGH peut- être remplacée par de la protéine A ou de la protéine G, ou toute protéine ou polypeptide capable de fixer spécifiquement un anticorps par son fragment Fc, de préférence de nature bi-fonctionnelle (deux anticorps pouvant se fixer par un tel polypeptide bi fonctionnelle).

Dans la présente invention, on entend désigner par « particule magnétique » ou « bille magnétique » le même objet, à savoir une bille magnétique sphérique dont le diamètre est compris entre au moins 0,5 pm et au plus 10 pm (ceci par opposition au ferrofluide qui ne fait pas partie de la portée englobée par cette définition).

Parmi les fournisseurs, dont les particules magnétiques peuvent être utilisées dans le cadre de cette invention, on peut citer en particulier la société Ademtech (33600 Pessac, France) qui propose des billes magnétiques d’environ 100 à 500 nm de diamètre pouvant être fonctionnalisées par une fonction acide ou amine ainsi que les protocoles et réactifs permettent d’effectuer le greffage souhaité avec ces fonctions. Ces particules magnétiques sont constituées de plus à plus de 50 % d'un noyau de composé ferromagnétique (type oxyde de fer), ce noyau étant enrobé de polystyrène. On peut également citer la société Bioclone Inc. (San Diego, CA, USA) qui propose tout un catalogue de billes magnétiques fonctionnalisées pouvant être utilisées. On peut citer encore la société Dynal (Invitrogen, USA) avec sa gamme très variée de Dynabeads™ proposant notamment des microbilles magnétiques activées à la streptavidine, au Tosyl ou activées par une fonction carboxylique. On peut également citer la société Merck -Chimie SAS (Fontenay Sous Bois, France) qui avec sa gamme de microparticules magnétiques ESTAPOR™ propose différentes tailles de particules (de 200 nm à l,5pm) à base de polystyrène ou de divinylbenzène pouvant comprendre jusqu’à plus de 50 % de ferrite et pouvant être fonctionnalisées ou non, par exemple avec une fonction carboxylique, amine ou Tosyl. Ces particules sont préparées par un procédé mettant en œuvre une polymérisation de styrène en présence du composé ferromagnétique. On peut encore citer la société JSR Micro (Japon), qui propose des particules magnétiques de différentes tailles de 1 pm à 3 pm activées à la streptavidine ou comportant des fonctions carboxyliques ou Tosyl. Les billes magnétiques de chez JSR sont composées d’une particule centrale recouverte de substance magnétique, laquelle sera recouverte par un monomère permettant d’encapsuler la substance magnétique. Parmi les billes proposées on préférera des billes hydrophobes de taille 1 pm avec un contenu en fer d’environ 48 % et un taux de fonctions carboxyliques d’environ 15 nmol par mg de billes. Ces billes ont la caractéristique de pouvoir permettre un couplage par adsorption physique ou par couplage chimique.

Les billes magnétiques pouvant être utilisées dans cette invention sont superparamagnétiques, la taille des particules magnétiques pouvant atteindre 200 nm à 1,5 pm, plutôt de type hydrophobe et fonctionnalisées par des groupements carboxyliques ou Tosyl.

Le taux moyen de fer des billes magnétiques est d’environ 45 % pour des billes carboxyliques et d’environ 30 % pour des billes Tosyl.

De préférence, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que ladite AGH est choisie parmi les AGH de type anti-IgG ou de type anti-IgM.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que ledit anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est de type IgG lorsque l’AGH est de type anti-IgG et ledit anticorps antiantigène de groupe/phénotype érythrocytaire est de type IgM lorsque l’AGH est de type anti-IgM.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que ladite AG est saturée en anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire.

Dans la présente description, on entend désigner par un anticorps anti-antigène spécifique de groupe sanguin, des anticorps polyclonaux, monoclonaux ou encore recombinants de spécificité connue capable de reconnaître et se fixer sur l’érythrocyte portant l’antigène contre lequel il est dirigé.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que ledit anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est choisi parmi les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, de préférence monoclonaux, anti-A, anti-B, anti-D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e, anti-K, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb anti-S et anti-s ou dirigés spécifiquement contre tout autre antigène de groupe/phénotype érythrocytaire dont on cherche à déterminer la présence à la surface d’un érythrocyte.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques choisies parmi des particules super-paramagnétiques.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques choisies parmi des particules magnétiques de diamètre compris entre 0,75 pm et 5 pm, de préférence entre 1 pm et 3 pm et entre 1 pm et 2 pm.

Les techniques immunodiagnostiques, de capture ou de tri cellulaire mettant en œuvre des particules magnétiques ont fait l’objet de nombreuses publications et sont bien connues de l’homme de l’art.

Parmi ces techniques, on peut citer celles faisant appel à une fonctionnalisation de la particule magnétique permettant d’obtenir une fonction réactive en surface capable de réagir dans des conditions et avec des réactifs appropriés avec l’antigène, l’anticorps ou de manière générale avec toute protéine ou ses dérivés (comme les glycoprotéines ou leurs fragments) que l’on souhaite greffer de manière covalente sur la particule, notamment une fonction acide, amine, alcool, tosyl, époxy ou aldhéhyde pour ne citer que les plus courants. Même si elle est moins préférée, on peut également citer celles faisant appel à une adsorption passive de l’antigène que l’on souhaite fixer sur la particule, notamment par un traitement adéquate permettant d’obtenir des billes chargées positivement ou négativement en fonction des antigènes et des conditions dans lesquelles on souhaite réaliser cette absorption passive.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques préalablement fonctionnalisées avec un groupement choisi parmi les groupements carboxyliques, aminés, alcools ou tosyls.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques préalablement fonctionnalisées avec un groupement choisi parmi les groupements carboxyliques, aminés, alcools ou tosyls et dont le taux de fonctionnalisation est compris entre 20 peq/gramme de bille et 350 peq/gramme de bille, de préférence entre 20 peq/gramme de bille et 80 peq/gramme de bille.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques présentant un taux moyen de fer compris entre 30 % et 50 %, de préférence entre 30 % et 40 %.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que la concentration en AGH revêtues sur lesdites particules magnétiques est comprise entre 10 pg/mg de particules et 70 pg/mg de particules, de préférence entre 20 pg/mg ± 5 pg/mg de particules pour l’AGH de type anti-IgM et 50 pg/mg ±10 pg/mg de particules pour l’AGH de type anti-IgG.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont suspendues dans une solution aqueuse comprenant un surfactant, de préférence à une concentration en particules entre 0,1 % et 2,5 % (p/v), de préférence entre 0,2 % et 1,5 % (p/v), de préférence encore comprise 0,25 % et 1,0 % (p/v), de préférence encore à 0,5 % ± 0,25 % (p/v), 0,3 % étant également préférée.

Suspension de particules magnétiques, caractérisée en ce que ledit surfactant est choisi parmi les surfactants ou détergents non ioniques, de préférence choisi parmi les détergents non ioniques hydrophiles comme le Tween® 20, 40 ou 80, les poloxamères comme le synperonic PE/F68® ou le F127.

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que ledit surfactant est à une concentration comprise entre 0,1% et 2,5 % (m/v), de préférence entre 0,25 % et 1 %, de préférence à 0,5 % ± 0,15 % (m/v), de préférence encore à 0,75 % ± 0,25 % (m/v).

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont en suspension dans une solution aqueuse tamponnée comprenant de la sérum albumine bovine (BSA) à une concentration comprise entre 0,05 % et 0, 75 %, de préférence entre 0,1 % et 0,5 % (p/v) de préférence 0, 5 % (p/v), de préférence dans un tampon physiologique comme le tampon phosphate salin à 0,3 M, pH 7,4.

En effet, de manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence qu’une telle molarité de tampon (environ deux fois la molarité du PBS standard), permettait d’obtenir des résultats significativement meilleurs, notamment en terme de possibilité de stockage de ces suspensions de particules magnétiques revêtues d’AG et, le cas échéant d’anticorps (suspension prête à l’emploi comme réactif de groupage/phénotypage).

De préférence encore, cette suspension de particules magnétiques selon l’invention est caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont en suspension à 0,1 % ± 0,25 % (p/v) dans un tampon physiologique phosphate salin à 0,3 M, pH 7,4 (PBS) comprenant de la sérum albumine bovine (BSA) à une concentration de 0,1 % (p/v).

Dans certaines applications, notamment lorsqu’il s’agira d’améliorer la sensibilité ou la vitesse de réaction (sans toutefois augmenter la non spécificité du test), on pourra utiliser un tampon dit de basse force ionique (BFI), appelée encore tampon LISS (« LISS » pour « Low Ionie Strength Solution »).

Par tampon ou solution physiologique, l’homme de l’art comprendra qu’il s’agit là de tampon habituellement utilisé dans le domaine de la biologie cellulaire, notamment en immunohématologie afin d’éviter la lyse des globules rouges. De tels tampons ou solutions seront par exemple des tampons à pH physiologique, compris entre 6,8 et 7,5, avec une molarité ajustée de telle sorte qu’elle s’apparente à la molarité d’une solution de type NaCl à 9 pour mille (proche de 0,15 M de NaCl). On peut notamment citer mais sans s’y limiter le tampon phosphate type PBS à pH 7 - 7,4 bien connu de l’homme de l’art.

La composition des tampons BFI ou LISS ne sera pas ici développée, ces tampons étant bien connus en immunohématologie pour favoriser les réactions d’agglutination. Ces tampons sont notamment disponibles auprès des fournisseurs de réactifs pour Γimmunohématologie (on pourra citer pour exemple, mais sans s’y limiter le tampon LISS de composition suivante : 16 g/1 de glycine, 0,03 M de NaCl et 0,015 M phosphate à pH 6,7).

Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un kit ou nécessaire pour le groupage/phénotypage érythrocytaire comprenant une suspension de particules magnétiques selon l’invention dont ledit anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est dirigé spécifiquement contre un antigène donné.

De préférence, ledit kit pour le groupage/phénotypage érythrocytaire comprend au moins deux suspensions distinctes de particules magnétiques selon l’invention dont chacun desdits anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est dirigé spécifiquement contre un antigène donné différent l’un de l’autre.

De préférence, ledit kit pour le groupage/phénotypage érythrocytaire comprend un mélange d’au moins deux suspensions de particules magnétiques selon l’invention dont chacun desdits anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est dirigé spécifiquement contre un antigène donné différent l’un de l’autre, de préférence dirigé chacun contre un antigène choisi parmi les antigènes du groupe D faible, D partiel et/ou parmi les variants de l’antigène D.

Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire à partir d’un échantillon biologique contenant des érythrocytes dont on cherche à déterminer le groupe et/ou le phénotype, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) une étape dans laquelle la suspension d’érythrocytes à grouper/phénotyper est mise en contact dans un container avec une suspension de particules magnétiques selon l’invention ou, avec un mélange d’au moins deux de cesdites suspensions de particules magnétiques de spécificité anticorps distincte (en particulier pour certains phénotypes comprenant des variants ou antigène dit faible comme l’antigène D) ; b) une étape d’incubation, avec, le cas échéant, un mélange préalable de la suspension de particules et des érythrocytes (ce mélange pouvant être réalisé par agitation du container) ; c) l’application d’un champ magnétique audit container au moyen d’un aimant situé à l’extérieur et sous ledit container de manière à entraîner lesdites particules magnétiques avec, le cas échéant, les érythrocytes fixés auxdites particules magnétiques ; d) la remise en suspension du culot obtenu à l’étape c) par agitation ; e) la lecture à l’œil et/ou par tout autre système de lecture approprié de la présence ou non d’agglutinats dans le container, la présence d’agglutinat étant indicatif de la présence de l’antigène contre lequel est spécifiquement dirigé l’anticorps antiantigène de groupe/phénotype érythrocytaire présent sur la particule magnétique.

Bien entendu, dans ce procédé pour la détermination par réaction d’agglutination d’érythrocytes de la présence d’un antigène de groupe sanguin selon l’invention, on préfère également en ce que l’étape c) d’application d’un champ magnétique audit container est réalisée au moyen d’un aimant situé à l’extérieur sous le container de telle manière que les particules magnétiques soient entraînées au fond dudit container selon un axe vertical.

Dans un mode de réalisation préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce que l’étape d) peut être suivie si nécessaire d’une nouvelle étape d’agitation dans le but de recollecter des petits agglutinais pouvant s’être formés pour des réactions de faible intensité et de former ainsi des agglutinats de plus grande taille.

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce que ladite suspension d’érythrocytes à grouper/phénotype à l’étape a) est une suspension comprise entre 0,20 % et 0,1 % (v/v) dans une solution aqueuse, de préférence entre 0,3 % et 0,75 % (v/v), de préférence à 0,5 %.

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce que ladite solution aqueuse est un tampon de basse force ionique.

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce que l’étape b) d’incubation est effectuée pendant un temps compris entre 10 et 35 min., de préférence entre 15 et 30 min., de préférence pendant 20 min., de préférence à une température comprise entre 20°C et 40°C, de préférence entre 30°C et 37°C, de préférence à 37°C.

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce que l’étape c) ledit aimant est un aimant permanent de magnitude comprise entre 10 000 et 14 000 gauss, de préférence 12 000 gauss, et en ce que le champ magnétique est appliqué pendant 2,5 min. à 10 min., de préférence pendant 4 min. à 6 min. audit container, de préférence à température ambiante.

Dans le procédé selon l’invention l’application du champ magnétique sera de préférence obtenue par un aimant, de type permanent, situé à l’extérieur et en-dessous du ou des containers à réaction.

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce que l’étape d) d’agitation est effectuée pendant un temps compris entre 30 sec. et 2 min. 30 sec., de préférence pendant 1 min. à 2 min..

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce qu’à l’étape a), ladite suspension d’érythrocytes issus d’érythrocytes contenus dans l’échantillon est issue d’un culot d’érythrocytes obtenu après sédimentation d’un échantillon de sang total d’un individu.

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce qu’à l’étape a), ledit container est une cupule de microplaque, de préférence une cupule à fond hémisphérique (« fond rond »).

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce qu’à l’étape b), l’agitation est effectuée à l’aide d’un agitateur pour microplaque à une vitesse comprise entre 500 et 1200 trs/min, de préférence entre 500 et 900 trs/min et de préférence encore entre 900 et 950 trs/min, de préférence entre 700 et 750 trs/min.

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce qu’à l’étape d), l’agitation est effectuée en 2 étapes à l’aide d’un agitateur pour microplaque, une première d’agitation pendant 10 à 15 sec à une vitesse comprise entre 900 et 1200 trs/min, de préférence à une vitesse de 900 trs/min, et une deuxième agitation pendant un temps compris entre 1 min. 10 sec. et 1 min. 45 sec., de préférence 1 min. 30 sec. à une vitesse de 700 trs/min.

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce qu’à la fin de l’étape d), on effectue une nouvelle agitation pendant un temps compris entre 10 sec. et 1 min., de préférence à une vitesse comprise entre 300 et 500 trs/min., de préférence 45 sec. à une vitesse de 450 trs/min.

Dans un mode de réalisation également préféré, l’invention a pour objet un procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la présente invention caractérisé en ce qu’à l’étape a) on met en contact dans ladite cupule de 35 μΐ à 45 μΐ de la suspension d’érythrocytes à 0,5 %, de préférence 40 μΐ avec 10 μΐ de ladite suspension de particules à 0,3 % (p/v).

Sous un autre aspect, la présente invention comprend un dispositif ou appareillage pour le groupage/phénotypage érythrocytaire caractérisé en ce qu’il comprend une suspension de particules magnétiques selon la présente invention.

De préférence, ledit dispositif ou kit pour la détermination par réaction d’agglutination d’érythrocytes de la présence d’un antigène du groupe sanguin à la surface d’un érythrocyte d’un échantillon est caractérisé en ce qu’il comprend : a) un container contenant une suspension de particules magnétiques telle que définie dans la présente invention ; b) au moins un aimant ou un ensemble d’aimants pouvant être disposé à l’extérieur dudit ou desdits containers et sous ledit ou lesdits containers ; c) un système d’agitation dudit ou desdits containers ; et, le cas échéant, d) un lecteur capable d’évaluer la présence d’agglutinats érythrocytaires dans chacun des containers. L’invention porte également sur un dispositif selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit container à réaction est une cupule de microplaque, de préférence à fond hémisphérique ou à fond en V.

De préférence encore, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que ladite solution aqueuse de particules magnétiques est préalablement diluée dans un tampon ou une solution physiologique.

Pour le procédé selon l’invention pour la détermination par réaction d’agglutination d’érythrocytes de la présence d’un antigène de groupe sanguin ou d’un anticorps anti-antigène de groupe sanguin, on préfère également en ce que le container à réaction est une cupule de microplaque, de préférence une cupule à fond hémisphérique (« fond rond ») ou à fond en V.

Les exemples qui suivent avec les figures sont destinés à illustrer l’invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des Figures :

Figure 1 : Représentation schématique d’un complexe macromoléculaire immuno-magnétique agglutinant

Du centre vers l’extérieur : Particule (ou bille) magnétique, Antiglobuline humaine anti -IgG (ou anti-IgM) (AGH) et (en périphérie anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire).

Figures 2A-2B : Réaction/résultat obtenue pour un échantillon positif (Figure 2A) et négatif (Figure 2B).

Figure 3 : Réactions/Résultats obtenus avec Echantillons positifs (D faible de type 1, 2 et 3).

Figure 4 : Réactions obtenues avec Echantillons positifs (D partiel de type VI et d’autres types de D partiel).

Figure 5 : Réactions/Résultats obtenus avec Echantillons négatifs, et positifs (D positif et D partiel de type VI).

Figure 6 : Couplage des billes magnétiques à Γ antiglobuline Humaine anti-IgG ou anti-IgM.

Figure 7 : Couplage secondaire de l’antiglobuline avec les anticorps antiérythrocytaires de type IgG à partir de concentrés d’anticorps monoclonaux non purifiés.

Figure 8 : Principe de phénotypage des érythrocytes par agglutination grâce au complexe macro moléculaire immuno-magnétique de type IgG.

Figure 9 : Couplage secondaire de l’antiglobuline avec les anticorps antiérythrocytaires de type IgM à partir de concentrés d’anticorps monoclonaux non purifiés.

Figure 10 : Principe de phénotypage des érythrocytes par agglutination grâce au complexe macro moléculaire immuno-magnétique de type IgM. EXEMPLE 1 : Formation du complexe macromoléculaire immuno-magnétique

La réalisation du complexe macromoléculaire immuno-magnétique (voir figure 1), se fait en 2 étapes. A) 1ère étape ou couplage primaire :

La première étape ou couplage primaire, consiste à fixer une antiglobuline humaine anti-IgG ou anti-IgM à des billes magnétiques contenant des groupements fonctionnels.

Ces groupements fonctionnels peuvent être de différentes natures tels que des fonctions amines (-ΝΉ2) ou des fonctions alcooliques (-OH), des fonctions carboxyliques (-COOH) ou bien encore des fonctions Tosyl, toutes ces fonctions sont bien connues de l’homme de l’art.

Les liaisons ainsi établies entre l’anticorps et la bille magnétique peuvent être de natures électrostatiques, hydrophobes ou covalentes. La fixation covalente de l’anticorps sur les billes magnétiques est réalisée par l’intermédiaire de groupements fonctionnels à la surface des billes.

Les billes magnétiques utilisées sont super-paramagnétiques de 1 à 3 pm de type hydrophobe, fonctionnalisées par des groupements de type carboxyliques ou Tosyl, en fonction de l’anticorps à coupler. Parmi les billes pouvant être utilisées, on peut citer des billes magnétiques provenant de plusieurs fournisseurs, telles que les billes magnétiques de chez ESTAPOR ou bien celles de chez Dynal ou encore les billes magnétiques provenant de chez JSR Micro. On préférera les billes magnétiques provenant de chez ESTAPOR d’une taille de 1 à l,2pm de type hydrophobe ou bien les billes de l,5pm de chez JSR Micro.

Les fonctions chimiques capables de fixer les anti-globulines humaines de type IgG ou IgM, peuvent être de type Tosyl ou carboxyliques ou bien de type NH2, ou encore de type alcoolique. Avec une préférence pour des fonctions Tosyl pour l’antiglobuline humaine anti-IgG et des fonctions carboxyliques pour l’antiglobuline humaine anti-IgM.

Le taux moyen de fer des billes magnétiques est d’environ 45 % pour des billes carboxyliques et d’environ 30 % pour des billes Tosyl.

Le taux de fonctionnalisation en groupements fonctionnels est variable : pour des billes de type Tosyl le nombre de fonction varie de 40 à 80 peq/gramme de billes avec une préférence pour un nombre de fonctions Tosyl de 75 peq/g, alors que pour des billes avec des groupements carboxyliques, le nombre de fonctions peut varier de 20 peq/ gramme de billes à 350 peq/g, avec une préférence pour une quantité de fonction carboxyliques de 20 peq/'g de billes.

Les anti-globulines humaines, anti -IgG ou bien anti-IgM, couplées aux billes magnétiques fonctionnalisées sont toutes les deux d’isotype IgGl.

Pour le couplage des anti-globulines anti-IgG, on préférera des billes Tosyl de 1 à 1,2 pm de chez ESTAPOR obtenues sous la référence R01-24 et comportant une quantité de fonctions Tosyl de 75peq/gramme de billes ou bien les billes Tosyl de 1,5 pm de chez JSR obtenues sous la référence : MS150/Tosyl.

Pour le couplage des anti-globulines anti-IgM, on préférera les billes carboxyliques de 1 pm de chez ESTAPOR obtenues sous la référence : EM1-100/40 comportant une quantité de fonctions carboxyliques de 20 peq par gramme de billes.

La concentration des anti-globulines humaines couplées aux billes magnétiques peut varier de 20 pg/mg de billes à 50 pg/mg de billes, en fonction des anti-globulines. L’antiglobuline humaine anti-IgG est utiliser à une concentration de 50 pg/mg de billes, alors que l’antiglobuline humaine de type anti-IgM est couplée à une concentration de 20 pg par mg de billes. B) 2ème étape ou couplage secondaire :

La deuxième étape de la formation du complexe immuno-magnétique ou couplage secondaire, consiste à coupler des anticorps spécifiques des antigènes érythrocytaires sur l’antiglobuline humaine, à partir d’un concentré de surnageant de culture d’hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux. Ce couplage est réalisé en incubant les billes couplées à l’antiglobuline avec le concentré d’anticorps monoclonaux. Ce procédé permet une immuno-purification du concentré dans lequel se trouvent différentes protéines présentes lors de la culture de l’hybridome sécrétant l’anticorps spécifique. A la suite de ce couplage secondaire, l’AGH est totalement saturée par l’anticorps spécifique de type IgG ou IgM, selon l’AGH couplée, et constitue alors un réactif prêt à l’emploi, macromoléculaire et immuno-magnétique qui peut être utilisé pour le groupage et le phénotypage des antigènes érythrocytaires, en fonction des anticorps spécifiques utilisés (anti-A, anti-B, anti-D, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb, etc.).

Différents concentrés de culture d’hybridomes, contenant des anticorps monoclonaux spécifiques des globules rouges, peuvent être couplés aux anti-globulines humaines. Il est aussi possible de réaliser des complexes immuno-magnétiques d’autres espèces en couplant une anti-globuline anti-espèce capable de reconnaître le deuxième anticorps spécifique d’un antigène érythrocytaire issu d’une autre espèce (par exemple produit chez la souris). Ainsi, par exemple, l’antiglobuline sera une antiglobuline anti-IgG ou anti-IgM de souris et l’anticorps anti-antigène de groupe/phénotype sanguin une IgG ou IgM produit par la souris.

La concentration du couplage secondaire est fonction de la quantité d’anticorps présents dans le concentré de culture et du type d’anticorps.

Cette concentration peut varier de 120 pg de protéines totales par mg de billes à 3000 pg de protéines totales par mg de billes.

La solution finale, ou tampon de stockage, contenant les billes couplées à l’AGH et à l’anticorps spécifique d’intérêt, est constituée d’un tampon PBS contenant de la BSA à 0,1 % (m/v) ainsi qu’un détergent non ionique, de type synperonic PE/F68. Le synperonic PE/F68 est un surfactant non ionique hydrophile appelé aussi poloxamère synperonic F68 et obtenu chez Sigma Aldrich sous la référence : 81 112. Ce polymère tri blocs est composé d’une partie centrale hydrophobe constituée de blocs de polyoxypropylène, entourée de 2 blocs hydrophiles de polyoxyéthylène. L’utilisation de détergent est nécessaire lorsqu’on utilise des nanoparticules, afin d’éviter l’agrégation spontanée de celles ci qui peut avoir lieu dans des conditions physico-chimiques particulières de pH, de force ionique et de température. Il a été démontré notamment que la modification de surface des particules par adsorption de macromolécules amphiphiles non ioniques telles que les poloxamères aident à la non agrégation des particules en solution.

Notamment lorsque des particules sont mises en solution dans un tampon de force ionique élevée, tel que le PBS, les nanoparticules ont tendance à perdre leur stabilité colloïdale et à s’agréger. L’ajout d’un surfactant permet alors de garder cette stabilité colloïdale et d’éviter une agrégation des particules dans un tampon de force ionique élevée.

Il existe plusieurs types de surfactants non ioniques tels que le Tween 20, 60, et 80 ou bien encore le synperonic PE/F68 ou F127. Dans cette invention nous préférons l’utilisation du synperonic PE/F68.

Pour avoir une action efficace sur la stabilité colloïdale des billes couplées aux différents anticorps, la concentration du synpéronic doit être supérieure à 0,1 % et inférieure à 2,5 %, seuil de viabilité des cellules en présence de cette concentration de surfactant. Avec une préférence pour une concentration de 1 % (m/v).

La concentration finale des billes couplées avec les anticorps d’intérêts est fonction de l’anticorps utilisé et peut varier de 0,1 % (m/v) à 0,5% dans le tampon de stockage décrit ci-dessus, soit PBS 0,1 % BSA +1 % de synperonic PE/68. EXEMPLE II : Détermination de groupage ou de phénotypage sanguin

La mise en œuvre pour la détermination en évidence de l’antigène d’intérêt sur les globules rouges d’un individu, se fait à partir d’un prélèvement sanguin sur anticoagulant de type EDTA ou citrate.

Une suspension globulaire entre 0,3 % et 1 %, de préférence 0,5 % est réalisée, dans un tube à hémolyse ou dans le puits d’une microplaque à fond rond, en diluant 10 μΐ de culot globulaire dans 2 ml d’un tampon de basse force ionique, en particulier un tampon LISS.

Dans un puits de microplaque à fond rond, 10 μΐ de la solution de billes couplées aux anticorps (AGH + anticorps spécifique de l’antigène à détecter) sont déposés sur lesquels sont ajoutés 40 μί de la suspension globulaire à 0,5 %. Les constituants sont homogénéisés en plaçant la microplaque sur un agitateur de microplaque automatique. La vitesse d’agitation peut varier de 900 rpm à 1200 rpm pendant 10 secondes, avec une préférence pour 1000 rpm (« rpm » pour tour par minute).

La microplaque est ensuite incubée entre 15 et 30 minutes avec une préférence pour 20 minutes à 37°C, pour permettre aux anticorps de se fixer aux antigènes présents sur les globules rouges. A la fin de l’incubation, la microplaque est placée sur une plaque d’aimants contenant 96 aimants piles s’ajustant parfaitement sous chaque puits de la microplaque. Sous l’effet du champ magnétique les billes entraînent les hématies au fond du puits et favorisent leur agglutination dans le cas où les anticorps se sont fixés aux globules rouges.

La durée de cette aimantation peut varier de 2 à 10 minutes avec une préférence pour 4 minutes d’aimantation à température ambiante.

Puis la microplaque est placée sur un agitateur pour permettre la remise en suspension des globules rouges non agglutinés, donc négatifs pour l’antigène recherché. La séquence des agitations permettant à la fois une bonne resuspension des globules rouges non agglutinés mais aussi la visualisation des agglutinais de globules rouges est la suivante : elle est composée d’une première agitation assez forte qui permet de décoller les culots du fond du puits après l’aimantation, cette agitation peut varier de 900 à 1200 rpm pendant 10 secondes avec une préférence pour 900 ipm. La seconde agitation permet de remettre en suspension les hématies négatives pour l’antigène recherché, donc non agglutinées, la vitesse de cette agitation peut varier de 650 rpm à 900 rpm avec une préférence pour 700 rpm pendant 1 minute 30 secondes. A la fin de cette agitation, les hématies non agglutinées sont dispersées et forment une suspension homogène, alors que les hématies exprimant fortement l’antigène recherché forment un agglutinai intègre. En revanche pour des antigènes plus faiblement exprimés les agglutinais formés sont plus petits et plus dispersés à la fin de l’agitation, ce qui nécessite une agitation dite de « recollecte » qui va permettre de rassembler tous les petits agglutinais dispersés et former ainsi un agglutinai complet et net au fond du puits. Cette agitation de « recollecte » est réalisée à faible vitesse, c’est-à-dire entre 300 et 500 ipm avec une préférence pour une vitesse de 450 rpm pendant au moins 10 secondes mais pas plus de 1 minute, avec une préférence pour 45 secondes. Cette agitation de « recollecte » n’ayant aucune influence sur les hématies négatives, ou sur les forts agglutinais. La microplaque peut ensuite être lue à l’œil ou par un lecteur automatique équipée d’une caméra.

EXEMPLE HI : Réalisation d’un complexe macromoléculaire immuno-magnétique de type IgG anti-D

Pour la réalisation de ce complexe, différents anti-D spécifiques de certains variants de l’antigène D peuvent être utilisés.

Anti-D reconnaissants des variants particuliers des antigènes D utilisés dans ce test :

Anti-D de type IgG, clone HM16 (Diagast)

Anti-D de type IgG, clone P3X35 (Diagast)

Anti-D de type IgG, clone P3X290 (Diagast)

Anti-D detype IgG, clone ESDI (Alba Biosciences)

Anti-D de type IgM, clone P3X61 (Diagast)

Anti-D de type IgM, clone P3X21223B10 (Diagast)

Chacun des anti-D utilisés est connu pour reconnaître certains types de variants de l’antigène D. Le tableau 1 ci-dessous décrit les variants de l’antigène D reconnus par chacun des anti-D utilisés.

P Λ Φ

S

H

A) Couplage primaire de l’antiglobuline humaine anti-IgG aux billes Tosyl a. Préparation des tampons

Tampon Sodium Phosphate 0,1 M à pH 7,4

Peser 2,62 g de NaH2PO4 x H20 Peser 14,42 g de Na2H PO4 x 2H20

Dissoudre dans de l’eau distillée puis ajuster le volume à 1 litre Tampon Sulfate d’Ammonium (NH4)2SO4, 3M

Peser 39,64 g de (NH^SCL

Dissoudre dans 100 ml de tampon Sodium Phosphate Ajuster le pH avec NaOH ou HCl

Tampon PBS pH 7,4 + 0,5% de BSA (m/v) (Tampon de saturation) (« PBS » pour tampon phosphate salin)

Ajouter 1,53 g de NaCl à 80 ml de tampon Sodium Phosphate 0,02M, pH 7,4 Peser 0,5g de BSA (« BSA » pour albumine bovine sérique)

Bien homogénéiser

Ajuster le volume à 100 ml de tampon Sodium Phosphate 0,02M, pH 7,4 Tampon PBS pH 7,4 + 0,1 % de BSA (m/v)

Ajouter 1,53 g de NaCl à 80 ml de tampon Sodium Phosphate 0,02M, pH 7,4 Peser 0,1g de BSA Bien homogénéiser

Ajuster le volume à 100 ml de tampon Sodium Phosphate 0,0IM, pH 7,4 b. Réactifs et matériels - Billes : Billes magnétiques TOSYL (référence : R01-24) à 10 % (lrag billes = 10μ1) - Anticorps AGH : AGH anti IgG humaine purifiée ; concentration initiale : 1,8 mg/ml

- Tampons : PBS pH 7,4 ; tampon sodium phosphate (PBS) 0,3 M à pH 7,4 ; Tampon sulfate d’ammonium (NH4)2SO4, 3M ; PBS pH 7,4 + 0,5 % BSA ; PBS pH 7,4 + 0,1 % BSA - Matériel : Tubes eppendorf ; Pipettes réglables et cônes adaptés ; Roue d’agitation ; Aimant ; Tubes à essai en verre c. Protocole de couplage primaire

Le protocole suivant est réalisé en quadruplât afin d’effectuer le couplage secondaire avec les quatre IgG anti-D : HM16, P3x35, P3x290, ESDI. Pour se faire 4 foisl5 mg de billes (soit 4 χ 150μ1) sont couplés avec l’AGH selon le rapport suivant : 50 μg d’AGH pour 1 mg de bille.

Couplage :

Prélèvement de 150 μί de billes Tosyl à 10 %, soit 15 mg de billes Lavage des billes sur aimant : Dépôt dans un tube eppendorf® de 150 μί de billes,

Prélèvement du surnageant quand les billes sont décantées.

Ajout de 1000 μί de tampon Sodium Phosphate

Remise en suspension des billes dans le tampon Sodium Phosphate

Mise en place du tube eppendorf® sur l’aimant

Prélèvement du surnageant

Reprise des billes avec 416 μί d’anticorps (soit 750gg)

Homogénéisation par vortex

Ajout de 200μ1 de tampon (NH4)2SO4, 3M

Vortex

Mise en place des tubes eppendorf® sur la roue pendant 24 heures à température ambiante.

Lavage et saturation des billes couplées :

Mise en place des tubes sur aimant et décantation des billes Prélèvement du surnageant

Resuspension des billes dans 1 ml de tampon de saturation (PBS + 0,5 % de BSA pH 7,4)

Mise en place des tubes sur aimant et décantation des billes Prélèvement du surnageant

Resuspension des billes dans 1 ml de tampon de saturation (PBS + 0,5 % de BSA pH 7,4)

Incubation des billes sur roue pendant 2 heures à température ambiante Placer les tubes sur aimant et laisser décanter

Prélever le surnageant et le remplacer par 1 ml de tampon PBS + 0,1 % de BSA Resuspendre les billes complètement par vortex pendant 5-10 sec.

Replacer le tube sur aimant et laisser décanter

Prélever le surnageant

Resuspendre dans 1,5 ml de tampon PBS + 0,1 % de BSA concentration finale des billes 1 %.

B) Couplage secondaire de l’anticorps spécifique (anti-D) à l’antiglobuline humaine anti IgG a. Préparation des tampons

Tampon PBS pH 7,4 + 0,1 % de BSA (m/v) + 0,5 % Synperonic PE/F68® (m/v) (Synperonic PE/F68® est le nom commercial donné à un copolymère d’oxyde d’éthylène et d’oxyde de propylène, appartenant au groupe ICI)

Ajouter 1,53g de NaCl à 80 ml de tampon Sodium-Phosphate 0,02M, pH 7,4 Peser 0,1 g de BSA et 0,5 g de Synperonic PE/F68 Les ajouter au tampon phosphate préparé ci-dessus Bien homogénéiser

Ajuster le volume à 100 ml de tampon Sodium-Phosphate 0,02M pH 7,4 Tampon PBS pH 7,4 + 0,1 % de BSA (m/v) + 1 % Synperonic PE/F68® (m/v)

Ajouter 1,53g de NaCl à 80 ml de tampon Sodium-Phosphate 0,02M, pH 7,4 Peser 0,1 g de BSA et 1 g de Synperonic PE/F68 Les ajouter au tampon phosphate préparé ci-dessus Bien homogénéiser

Ajuster le volume à 100 ml de tampon Sodium-Phosphate 0,02M pH 7,4. b. Réactifs et matériels - Billes : Billes magnétiques couplées à l’AGH anti-IgG à 1 % (lmg billes pour 100 μΐ) - Anticorps : HM16 Anti-D monoclonal de type IgG, concentré de culture ; P3x35 Anti-D monoclonal de type IgG, concentré de culture ; P3x290 Anti-D monoclonal de type IgG, concentré de culture. ESDI Anti-D monoclonal de type IgG, concentré de culture - Tampons : PBS + BSA 0,1 % ; PBS + 0,1 % BSA + 0,5 % Synperonic® F68 - Matériel : Pipettes réglables et cônes adaptés ; Tubes à essai en verre ; Tubes eppendorf ®; Aimant. c. Préparation des anticorps anti-D de type IgG à coupler

Les concentrés d’anticorps anti-D non purifiés sont chacun couplés à 15 mg de billes Tosyl couplées à l’AGH selon le rapport 120 pg d’anticorps par mg de bille. HM16 : anti-D monoclonal de type IgG, issu du concentré de culture. Anticorps non purifié

Concentration initiale : 11,5 g/L de protéines totales

Quantité à ajouter : 1800 pg soit un volume de 155 pl P3X35 : anti-D monoclonal de type IgG, issu du concentré de culture. Anticorps non purifié

Concentration initiale : 10,5 g/L de protéines totales

Quantité à ajouter : 1800 pg soit un volume de 170 pl P3X290 : anti-D monoclonal de type IgG, issu du concentré de culture. Anticorps non purifié

Concentration initiale : 14 g/L de protéines totales

Quantité à ajouter : 1800 pg soit un volume de 130 pl ESDI : anti-D monoclonal de type IgG, issu du concentré de culture.

Concentration initiale : 16,7 g/L de protéines totales

Quantité à ajouter : 1800 pg soit un volume de 108 pl d. Protocole 1,5 ml de billes couplées à l’AGH (soit 15 mg de billes par couplage secondaire) sont incubées directement avec les concentrés d’anticorps anti-D aux volumes décrits ci-dessus.

Mise en place des tubes eppendorf® sur la roue pendant 2 heures à température ambiante. A la fin du couplage secondaire, les tubes eppendorf® sont placés sur aimant, les billes sont décantées et le surnageant est retiré.

Les billes sont ensuite lavées 1 fois avec 1 ml de tampon PBS 0,1 % BSA puis 2 fois avec le tampon PBS 0,1 % BSA + 0,5 % Synperonic F68.

Les billes sont remises en suspension avec 1,5 ml de tampon PBS, 0,1 % BSA + 1 % Synperonic PE/F68, stockage à 4°C. C) Dilution du réactif immuno-magnétique dans son tampon final

Après couplage chaque complexe immuno-magnétique est dilué à 0,3 % dans un tampon PBS 0,1 % BSA +1 % de Synpéronie PE/F68.

EXEMPLE IV : Réalisation d’un complexe macromoléculaire immuno-magnétique de type IgM A) Couplage primaire de l’antiglobuline humaine anti IgM aux billes Carboxyliques (COOH) a. Réactifs et matériels

Tableau 2 b. Protocole

Le protocole suivant est réalisé en dupliquât afin d’effectuer le couplage secondaire avec les deux IgM : P3x61et P3x21223B10. Pour se faire 2 fois 15 mg de billes (soit 2 x 150 μί) sont couplées avec l’AGH anti IgM selon le rapport suivant : 20 pg d’AGH pour 1 mg de bille.

Couplage :

Prélèvement de 150 μί de billes magnétiques carboxyliques à 10 %, soit 15 mg de billes

Lavage des billes sur aimant : Dépôt dans un eppendorf ®de 150μ1 de billes Placer le tube sur aimant

Prélèvement du surnageant quand les billes sont décantées.

Ajout de 1000 μί de tampon Na2HPO4/ NaH2PO4 10 mM pH 6

Remise en suspension des billes par vortex Répéter le lavage avec le tampon Na2HPO4/ NaLLPCL 10 mM pH 6 Transférer les billes dans un tube en verre de 5 ml Aspirer la totalité du surnageant

Ajout de 2,5 ml de la solution de couplage (EDC+NHS dans tampon

Na2HPO4/NaH2PO4 10 mM pH 6)

Resuspendre les billes par vortex

Placer le tube sous agitation 15 min à température ambiante. A la fin de l’incubation, placer le tube sur aimant Laisser décanter les billes

Prélever le surnageant

Resuspendre les billes avec 1 ml de tampon HCl 2 mM Placer le tube sur aimant Laisser décanter les billes Aspirer le surnageant

Resuspendre les billes dans 890 μΐ de tampon Na2HPO4/NaH2PO4 20 mM pH 7,5

Ajout immédiat de l’AGH anti-IgM à coupler : soit 300 pg d’AGH pour 15 mg de billes, soit 272 μΐ d’AGH

Vortex

Placer le tube sous agitation 2h à température ambiante

Laver les billes deux fois avec le tampon NaHPO4/NaH2PO4 20 mM pH 7,5

Resuspendre les billes dans 1,5 ml de tampon Na2HPO4/NaH2PO4 20 mM pH 7,5

Lavage et saturation des billes couplées :

Mise en place des tubes sur aimant et décantation des billes Prélèvement du surnageant

Resuspension des billes dans 1 ml de tampon de saturation PBS + 0,5 % BSA pH 7,4

Mise en place des tubes sur aimant et décantation des billes Prélèvement du surnageant

Resuspension des billes dans 1 ml de tampon de saturation PBS + 0,5 % BSA pH 7,4

Incubation des billes sur roue pendant 2 heures à RT Placer les tubes sur aimant et laisser décanter

Prélever le surnageant et le remplacer par 1 ml de tampon PBS + 0,1 % BSA Resuspendre les billes complètement par vortex pendant 10 sec Replacer le tube sur aimant et laisser décanter

Prélever le surnageant

Resuspendre dans 1,5 ml de tampon PBS + 0,1 % BSA concentration finale des billes 1 %

B/ Couplage secondaire de l’anticorps spécifique (anti-D) à T antiglobuline humaine anti IgM a. Réactifs et matériels

Tableau 3

b. Préparation des anticorps à coupler

Les concentrés d’anticorps anti-D non purifiés sont chacun couplés à 15 mg de billes magnétiques carboxyliques couplées à l’AGH anti-IgM selon le rapport : 320 pg d’AC/mg de bille pour l’anticorps P3x61 Quantité à ajouter : 4800 pg soit un volume de 457 pl 2000 pg d’AC/mg de billes pour l’anticorps P3x21223B10

Quantité à ajouter : 30 000 pg soit un volume de 1,2 ml c. Protocole 1,5 ml de billes magnétiques couplées à l’AGH anti-IgM (soit 15 mg de billes par couplage secondaire) sont incubées directement avec les concentrés d’anticorps anti-D aux volumes décrits ci-dessus.

Mise en place des tubes eppendorf® sur la roue pendant 2 heures à température ambiante. A la fin du couplage secondaire, les tubes eppendorf sont placés sur aimant, les billes sont décantées et le surnageant est retiré.

Les billes sont ensuite lavées 1 fois avec 1 ml de tampon PBS 0,1 % BSA puis 2 fois avec le tampon PBS 0,1 % BSA + 1 % Synpéronie® PE/F68.

Les billes sont remises en suspension avec 1,5 ml de tampon PBS 0,1 % BSA + 1 % Synpéronie PE/F68, pour stockage à 4°C. C) Dilution du réactif immuno-magnétique dans son tampon final :

Après couplage chaque complexe immuno-magnétique est dilué à la concentration précise, 0,3 % pour l’anti-D P3X61 et 0,1 % pour l’anti-D P3X21223B10 dans un tampon PBS 0,1 % BSA + 1 % de synpéronie PE/L68. EXEMPLE V : Utilisation des différents complexes immuno-magnétiques dans un test de phénotypage sanguin Réalisation du test de détection des isoformes de l’antigène RhD faiblement exprimées et/ou tronquées, a. Réactifs et matériels

Tableau 4

b. Préparation des suspensions globulaires à 0,5 %

Prélever 5μ1 de culot globulaire à partir d’un tube de sang total collecté sur anticoagulant

Diluer le culot globulaire dans un tube contenant 1 ml de Liss

Homogénéiser la suspension par agitation c. Test

Pour chaque échantillon et chaque type de bille

Préparation

Agiter les flacons contenant les billes couplées avant de les utiliser

Dans le puits d’une microplaque 96 puits à fond rond, déposer 10 μΐ de billes couplées à un anti-D

Ajouter 40μΐ de suspension globulaire à 0,5 %

Agiter la plaque pendant 10 sec à 900 rpm pour homogénéiser les billes et la suspension globulaire

Incuber la plaque pendant 20 min à 37°C Déposer la microplaque sur une plaque contenant 96 aimants piles, en contact direct avec chaque puits de la microplaque réactionnelle, pendant 4 min et à température ambiante

Placer la microplaque sur un agitateur et agiter pendant 10 secondes à 900 rpm puis 1 min 30 sec à 700 rpm et enfin pendant 45 secondes à 450 rpm

Visualiser la microplaque pour déterminer les réactions positives et négatives, ou placer la microplaque sur un lecteur automatique.

Les réactions positives se caractérisent par la présence d’un agglutinât au fond du puits, alors que les réactions négatives donneront une suspension globulaire homogène. EXEMPLE VI : Phénotypage Rhésus D affaiblis ou variants

Des donneurs de l’EFS (Etablissements Français du Sang) présentant un phénotype Rhésus D affaiblis ou variant, confirmés par génotypage, ont été testés avec différents complexes immuno-magnétiques spécifiques de l’antigène D.

Plusieurs globules rouges issus de donneurs connus pour présenter des variants de l’antigène D ou une expression affaiblie de l’antigène D ont été phénotypés avec les différents complexes immuno-magnétiques anti-D.

De même des patients ne présentant pas d’antigène D, RhD négatif, ont été testés avec ces mêmes complexes immuno-magnétiques pour vérifier la spécificité du test, a. Globules rouges présentant un antigène D affaiblis (D faible) 3 donneurs D faible de type 1 (Dfl) 7 donneurs D faible de type 2 (Df2) 2 donneurs D faible de type 3 (Df3) (Voir Figure 3)

Chaque complexe anti-D reconnaît les différents antigènes D faibles, l’intensité des réactions est dépendante de chaque clone. Ainsi on peut observer que le complexe couplé avec l’anti-D P3X290, donne des réactions légèrement moins fortes pour les antigènes D faible de type 2 qu’avec les antigènes D faible de type 1 et 3. Néanmoins, on observe que tous les anti-D de type IgG, couplées dans le complexe immuno-magnétique sont capables d’agglutiner les globules rouges exprimant faiblement l’antigène D. Les réactions obtenues sont de fortes intensités même avec des antigènes connus pour être très faiblement exprimés comme les antigènes D faible de type 2 (D£2). b. Globules rouges exprimant un antigène D partiel 4 donneurs exprimant un antigène D partiel de type VI (DVI) 1 donneur exprimant un antigène D partiel de type HMI (DHMI) 1 donneur exprimant un antigène D partiel de type DFR (DFR) 1 donneur exprimant un antigène D partiel de type DOL (DOL) 1 donneur exprimant un antigène D partiel de type DNB (DNB) (Voir figure 4)

Chaque complexe anti-D reconnaît différemment les variants de l’antigène D. Cette reconnaissance est fonction de la spécificité épitopique de chaque clone (voir carte épitopique des différents clones utilisés).

Ainsi les complexes immuno-magnétiques couplé avec les anti-D HM16 et P3X61 ne reconnaissent pas l’antigène D partiel de type DVI. Néanmoins, on observe que tous les anti-D de type IgG, couplées dans le complexe immuno-magnétique sont capables d’agglutiner les globules rouges exprimant des variants de l’antigène D. Les intensités de réactions sont fonctions du clone utilisé et de sa capacité de reconnaissance du variant, et sont en accord avec les réactions attendues.

Carte épitopique des clones anti-D utilisés (Voir Tableau 5) m s î3 ω 3 ce

H

c. Spécificité du test

Des donneurs négatifs prélevés sur anticoagulant EDTA, ont été testés avec les mêmes complexes immuno-magnétiques, pour vérifier la spécificité du test.

Les réactions attendues négatives sont bien obtenues négatives, alors que les témoins positifs (échantillons D positif et D partiel de type VI), présentent des réactions fortement positives (voir Figure 5).

Claims (10)

1. REVENDICATIONS 1) Suspension de particules magnétiques, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont revêtues à leur surface d’un complexe antîglobuline (AG)/anticorps et dans lequel complexe, ledit anticorps est dirigé spécifiquement contre un antigène de groupe,-'phénotype érythrocytaire (dénommé anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire) et caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont suspendues dans une solution aqueuse comprenant un surfactant.
2. 2) Suspension de particules magnétiques selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite AG est anti-globuline humaine (AGH) et ledit anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire un anticorps d’origine humaine.
3. 3) Suspension de particules magnétiques selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite AG est une anti-globuline de type anti-IgG ou de type anti-IgM.
4. 4) Suspension de particules magnétiques selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est de type IgG lorsque PAG est de type anti-IgG et ledit anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est de type IgM lorsque PAG est de type anti-IgM.
5. 5) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite AG est saturée en anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire.
6. 6) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendication 1 à 5, caractérisée en ce que ledit anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est choisi parmi les anticorps polyclonaux ou monoelonaux, de préférence monoclonaux, anti-A, anti-B, anti-D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e, anti-K, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb anti-S et anti-s ou dirigés spécifiquement contre tout autre antigène de groupe/phénotype érythrocytaire dont on cherche à déterminer la présence à la surface d’un érythocyte.
7. 7) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques choisies parmi des particules super-paramagnétiques.
8. 8) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques choisies parmi des particules magnétiques de diamètre compris entre 0,75 pm et 5 pm, de préférence entre 1 pm et 3 pm et entre 1 pm et 2 pm.
9. 9) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques préalablement fonctionnalisées avec un groupement choisi parmi les groupements carboxyliques, aminés, alcooliques ou tosyls. 10) Suspension de particules magnétiques selon la revendication 9, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques préalablement fonctionnalisées avec un groupement choisi parmi les groupements carboxyliques, aminés, alcooliques ou tosyls et dont le taux de fonetionnalisation est compris entre 20 peq/gramme de bille et 350 peq/gramme de bille, de préférence entre 20 peq/gramme de bille et 80 peq/gramme de bille. 11) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont des particules magnétiques présentant un taux moyen de fer compris entre 30 % et 40 %. 12) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la concentration en AGH revêtues sur lesdites particules magnétiques est comprise entre 10 pg/mg de particules et 70 pg/mg de particules, de préférence entre 20 pg/mg ± 5 pg/mg de particules pour l’AGH de type anti-IgM et 50 pg/mg ±10 pg/mg de particules pour l’AGH de type anti-IgG. 13) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont suspendues dans une solution aqueuse comprenant un surfactantà une concentration en particules comprise entre 0,1 % et 2,5 % (p/v), de préférence entre 0,25 % et 1,5 % (p/v), de préférence encore entre 0,5 % ± 0,25 % (p/v), 0,3 % étant également préférée. 14) Suspension de particules magnétiques selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit surfactant est choisi parmi les surfactants ou détergents non-ioniques, de préférence choisi parmi les détergents non-ioniques hydrophiles comme le Tween® 20, 40 ou 80, les poloxamères comme le synperonic® PE/F68 ou le F127, de préférence à une concentration comprise entre 0,1% et 2,5 % (m/v), de préférence à 0,75 % ± 0,25 % (m/v). 15) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont en suspension dans une solution aqueuse tamponnée comprenant de la sérum albumine bovine (BSA) à une concentration comprise entre 0,05 % et 0, 75 %, de préférence entre 0,1 % et 0,5 % (p/v), de préférence 0, 5 % (p/v). 16) Suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont en suspension dans un tampon physiologique, de préférence le tampon phosphate salin à 0,3 M, pH 7,4. 17) Suspension de particules magnétiques selon Tune des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que lesdites particules magnétiques sont en suspension à 0,1 % ± 0,25 % (p/v) dans un tampon physiologique phosphate salin à 0,3 M, pH 7,4 (PBS) comprenant de la sérum albumine bovine (BSA) à une concentration de 0,1 % (p/v) et du synpéronie PE/F68 à une concentration de 1 %. 18) Kit pour le groupage/phénotypage érythrocytaire comprenant une suspension de particules magnétiques selon Tune des revendications 1 à 17 dont ledit anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est dirigé spécifiquement contre un antigène donné. 19) Kit pour le groupage/phénotypage érythrocytaire comprenant au moins deux suspensions distinctes de particules magnétiques selon Tune des revendications 1 à 17 dont chacun desdits anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est dirigé spécifiquement contre un antigène donné différent l’un de l’autre. 20) Kit pour le groupage/phénotypage érythrocytaire comprenant un mélange d’au moins deux suspensions de particules magnétiques selon Tune des revendications 1 à 17 dont chacun desdits anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire est dirigé spécifiquement contre un antigène donné différent l’un de l’autre, de préférence dirigé chacun contre un antigène choisi parmi les antigènes du groupe D faible, D partiel et/ou parmi les variants de l’antigène D. 21) Dispositif ou appareillage pour le groupage/phénotypage érythrocytaire caractérisé en ce qu’il comprend une suspension de particules magnétiques selon Tune des revendications 1 à 17. 22) Procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire à partir d’un échantillon biologique contenant des érythrocytes dont on cherche à déterminer le groupe et/ou le phénotype, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) une étape dans laquelle la suspension d’érythrocytes à grouper/phénotyper est mise en contact dans un container avec une suspension de particules magnétiques selon l’une des revendications 1 à 17, ou avec un mélange d’au moins deux de cesdites suspensions de particules magnétiques ; b) une étape d’incubation, le cas échéant, sous agitation; c) l’application d’un champ magnétique audit container au moyen d’un aimant situé à l’extérieur et sous ledit container de manière à entraîner lesdites particules magnétiques avec, le cas échéant, les érythrocytes fixés auxdites particules magnétiques ; d) la remise en suspension du culot obtenu à l’étape c) par agitation ; e) la lecture à l’œil et/ou par tout autre système de lecture approprié de la présence ou non d’agglutinats dans le container, la présence d’agglutinat étant indicatif de la présence de l’antigène contre lequel est spécifiquement dirigé l’anticorps anti-antigène de groupe/phénotype érythrocytaire présent sur la particule magnétique. 23) Procédé de groupage/phénotypage érythrocytaire selon la revendication 22, caractérisé en ce que l’étape d) peut être suivie si nécessaire d’une nouvelle étape d’agitation dans le but de recollecter des petits agglutinais pouvant s’être formés pour des réactions de faible intensité et de former ainsi des agglutinais de plus grande taille. 24) Procédé selon l’une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que ladite suspension d’érythrocytes à grouper/phénotype à l’étape a) est une suspension comprise entre 0,20 % et 0,75 % (v/v) dans une solution aqueuse, de préférence entre 0,3 % et 0,5 % (v/v). 25) Procédé selon l’une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que ladite solution aqueuse est un tampon de basse force ionique, 26) Procédé selon l’une des revendications 22 à 25, caractérisé en ce que l’étape b) d’incubation est effectuée pendant un temps compris entre 10 et 35 min., de préférence entre 15 et 30 min., de préférence pendant 20 min., de préférence à une température comprise entre 20°C et 40°C, de préférence entre 30°C et 37°C, de préférence à 37°C. 27) Procédé l’une des revendications 22 à 26, caractérisé en ce que à l’étape c), ledit aimant est un aimant permanent de magnitude comprise entre 10 000 et 14 000 gauss, de préférence 12 000 gauss, et ce que le champ magnétique est appliqué pendant 2,5 min. à 10 min., de préférence pendant 4 min. à 6 min. audit container, de préférence à température ambiante. 28) Procédé selon Tune des revendications 22 à 26, caractérisé en ce que l’étape d) d’agitation est effectuée pendant un temps compris entre 30 sec. et 2 min. 30 sec., de préférence pendant 1 min. à 2 min., 29) Procédé selon l’une des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que à T étape a), ladite suspension d’érythrocytes issus d’érythrocytes contenus dans l’échantillon est issue d’un culot d’érythrocytes obtenu après sédimentation d’un échantillon de sang total d’un individu. 30) Procédé selon Tune des revendications 22 à 28, caractérisé en ce que à T étape a), ledit container est une cupule de microplaque, de préférence une cupule à fond hémisphérique (« fond rond »). 31) Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que à l’étape b), l’agitation est effectuée à l’aide d’un agitateur pour microplaque à une vitesse comprise entre 500 et 900 trs/min, de préférence entre 700 et 750 trs/min. 32) Procédé selon la revendication 30 ou 31, caractérisé en ce que à l’étape d), l’agitation est effectuée en 2 étapes à l’aide d’un agitateur pour microplaque, une première d’agitation pendant 10 à 15 sec à une vitesse comprise entre 900 et 1200 trs/min., de préférence à une vitesse de 900 trs/min., et une deuxième agitation pendant un temps compris entre 1 min.
10. 10 sec. et 1 min. 45 sec., de préférence 1 min. 30 sec. à une vitesse de 700 trs/min. 33) Procédé selon Tune des revendications 22 à 28, caractérisé en ce que à la fin de l’étape d), on effectue une nouvelle agitation pendant un temps compris entre 10 sec. et 45 sec., de préférence à une vitesse comprise entre 300 et 500 trs/min, de préférence 15 sec, à une vitesse de 450 trs/min. 34) Procédé selon Tune des revendications 30 à 33, caractérisé en ce que à l’étape a) on met en contact dans ladite cupule de 35 μΐ à 45 μ! de la suspension d’érythrocytes à 0,5 %, de préférence 40 μΐ avec 10 μΐ de ladite suspension de particules à 0,3 % (p/v). 35) Dispositif ou Kit pour la détermination par réaction d’agglutination d’érythrocytes de la présence d’un antigène du groupe sanguin à la surface d’un érythrocyte d’un échantillon caractérisé en ce qu’il comprend : a) un container contenant une suspension de particules magnétiques telle que définie dans les revendications 1 à 17 ; b) au moins un aimant ou un ensemble d’aimants pouvant être disposé à l’extérieur dudit ou desdits containers et sous ledit ou Iesdits containers ; c) un système d’agitation dudit ou desdits containers ; et, le cas échéant, d) un lecteur capable d’évaluer la présence d’agglutinais érythrocytaires dans chacun des containers. 36) Dispositif selon la revendication 35, caractérisé en ce que ledit container à réaction est une cupule de microplaque, de préférence à fond hémisphérique ou à fond en V.