FR2855613A1 - Procede de detection et de quantification multiplex d'analytes dans un echantillon a l'aide de microspheres - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet un procédé de détection et/ou de quantification multiplex d'analytes dans un échantillon à l'aide de microsphères fonctionnalisées, ces microsphères étant magnétisées après l'étape de mise en présence de l'échantillon avec ces microsphères. Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la quantification multiplex de plusieurs analytes par cytométrie de flux. L'invention a également pour objet un kit pour la détection et/ou la quantification de plusieurs analytes pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention qui comprend une suspension de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, une solution de ferrofluides et une solution d'au moins un conjugué.

Description

<Desc/Clms Page number 1>

La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification multiplex d'analytes dans un échantillon à l'aide de microsphères fonctionnalisées, ces microsphères étant magnétisées après l'étape de mise en présence de l'échantillon avec ces microsphères. Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la quantification multiplex de plusieurs analytes par cytométrie de flux. L'invention a également pour objet un kit pour la détection et/ou la quantification de plusieurs analytes pour la mise en #uvre du procédé selon l'invention qui comprend une suspension de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, une solution de ferrofluides et une solution d'au moins un conjugué.

Le développement et la diversification du diagnostic in vitro demandent de plus en plus la mise en place de moyens pour la détection et l'identification rapides de composés et microorganismes divers. Ce besoin concerne à la fois le domaine de la santé humaine ou animale, par exemple pour la recherche et le dosage d'antigènes ou agents pathogènes particuliers, le domaine de l'agro-alimentaire, tel par exemple le contrôle de la qualité et le dépistage de contaminants éventuels dans des produits destinés à l'alimentation, ou le domaine de l'environnement lorsqu'il s'agit par exemple de prévention de tout risque biologique, ou de détection d'impuretés, pesticides ou agents polluants divers.

L'utilisation de tests immunologiques sur microbilles associés à des systèmes d'analyse de type cytométrie de flux, constitue l'une des voies technologiques les mieux adaptées à ces besoins et de nombreuses approches basées sur ce principe ont été proposées dans l'état de l'art.

Par exemple, les demandes de brevet internationales publiées sous les numéros WO 98/51435, WO 94/09368, WO 90/15666 et la demande de brevet européenne publiée sous le numéro EP 180384 décrivent des particules magnétiques ou fluorescentes de type particulier, utilisables dans des méthodes de diagnostic.

D'autres documents de l'art antérieur proposent différents protocoles pour l'identification et/ou le dosage d'analytes multiples sur microbilles. Ainsi à titre d'exemple,

<Desc/Clms Page number 2>

la demande internationale publiée sous le numéro WO 90/05305 concerne un procédé et son kit correspondant pour détecter et/ou doser plusieurs analytes dans un échantillon par une méthode d'agglutination utilisant plusieurs sous-populations de billes fluorescentes.

La fluorescence des agrégats formés peut être mesurée par cytométrie de flux, analyse d'image ou système à balayage laser.

Le brevet américain délivré sous le numéro US 4,665,020 concerne un procédé de dosage d'un antigène par cytométrie de flux utilisant deux populations de sphères de diamètre différent, les plus grosses étant recouvertes d'un anticorps spécifique de l'antigène, et les plus petites étant fluorescentes. Le dosage est réalisé selon le principe d'une méthode sandwich ou de compétition en fonction du ligand fixé sur les sphères fluorescentes (anticorps ou antigène).

La demande internationale publiée sous le numéro WO 97/14028 concerne une méthode d'analyse par cytométrie de flux pour la détection de plusieurs analytes d'intérêt, dans laquelle on utilise une pluralité de sous-populations de billes dont au moins l'un des paramètres de classification pour l'analyse en cytométrie de flux diffère d'une souspopulation à l'autre. Chaque sous-population est couplée à un composé réagissant spécifiquement avec l'un des analytes à doser. La sous-population de billes, et donc la nature du composé ayant réagi avec l'analyte correspondant, est identifiée par cytométrie, à partir de l'analyse de l'ensemble des paramètres de classification de chaque souspopulation.

La demande internationale publiée sous le numéro WO 98/20351 concerne une méthode pour déterminer la présence d'un ou plusieurs analytes dans un échantillon, dans laquelle on utilise des populations "test" de microparticules, chacune des populations portant un ligand spécifique d'un analyte, et des microparticules de référence ne réagissant avec aucun des analytes recherchés. Le dosage est réalisé en comptant le nombre de microparticules libres dans chaque population "test" et en le comparant à celui des microparticules de référence. Le comptage est réalisé selon différentes méthodes, dont préférentiellement la cytométrie.

La demande internationale publiée sous le numéro WO 96/31777 vise une méthode de détection de microorganismes dans un échantillon utilisant au moins un type de particule détectable portant un ligand spécifique des microorganismes recherchés. Les

<Desc/Clms Page number 3>

microorganismes fixés aux particules sont ensuite révélés à l'aide d'un second ligand portant un marqueur fluorescent.

Le brevet américain délivré sous le numéro US 6,280,618 concerne une méthode pour détecter individuellement une pluralité d'analytes dans laquelle on utilise un mélange de populations de microparticules magnétiques pouvant être différenciées les unes des autres et portant chacune un ligand différent. Les microparticules de chaque groupe sont séparées du milieu et mises ensuite en suspension dans un second milieu liquide dans lequel elles sont analysées par cytométrie de flux.

La demande internationale publiée sous le numéro WO 93/02260 concerne une méthode de cytométrie de flux pour détecter simultanément plusieurs analytes dans un même échantillon, et le réactif pour sa mise en #uvre. Ce réactif est constitué par un mélange de plusieurs sous-populations de microsphères, chaque sous-population portant à la surface un ligand particulier capable de former une paire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés. La détection des analytes fixés aux microsphères est réalisée après addition d'un agent portant un fluorochrome, capable de se fixer sur les paires de liaisons formées.

Ces procédés de détection simultanée de plusieurs analytes dans un même échantillon peuvent également comporter une ou plusieurs étapes de séparation magnétique.

En effet, une telle étape de séparation magnétique permet de faciliter les dosages dans certains milieux complexes où les antigènes d'intérêt doivent être isolés de façon spécifique (une analyse cytométrique pouvant s'avérer non réalisable en présence de certaines microparticules). C'est le cas par exemple pour des analyses en agro-alimentaire, papeterie et traitement des eaux usées où sont recherchées des molécules/ particules présentes dans des broyats liquéfiés divers (pulpes, mous, produits laitiers voire fromagers, jus de fruits, broyats de légumes, jus de fermentation etc....), préparations qui ne peuvent être filtrées au risque de perdre l'analyte à doser.

C'est le cas aussi pour des analyses en sciences de l'environnement et santé humaine où le contenu particulaire d'un grand volume d'air est concentré dans un liquide grâce à un bio-collecteur. Dans ce cas aussi il est impératif d'éliminer toutes les particules, poussières, micro-fibres, pollens etc... en suspension dans l'air, dont la taille i) soit couvre celle des billes de capture (1 à 30 m) et rend difficile voire impossible leur identification

<Desc/Clms Page number 4>

par les seuls paramètres de diffusion lumineuse, ii) soit rend incompatible l'analyse par bouchage du cytomètre (risque élevé à partir de 100 m) et qui sont retrouvées concentrées dans le liquide après biocollection.

De plus, on doit aussi se débarrasser des particules huileuses (graisseuses) qui sont incompatibles avec le bon fonctionnement de la fluidique d'un cytomètre.

En outre, l'utilisation d'une séparation magnétique permet également de concentrer rapidement les agents à doser et évite de devoir utiliser des étapes de centrifugation pour laver les billes de capture.

Une telle association entre une étape de capture spécifique sur des microbilles et une étape de séparation magnétique a déjà été décrite dans l'état de l'art, notamment dans le brevet délivré sous le numéro US 6,280,618.

Toutefois, l'utilisation de microsphères magnétiques dans un procédé d'identification et de dosage d'analytes contenus dans un échantillon, peut présenter différentes contraintes industrielles, et gêner la manipulation et l'homogénéité de prélèvement des suspensions. En effet, des microsphères magnétiques de tailles différentes (et souvent de contenus différents en matériel aimantable) peuvent avoir des comportements différents au cours de la séparation magnétique, c'est-à-dire des temps d'aimantation plus ou moins longs. Il en résulte des rendements de séparation variables selon les familles de microbilles en présence, d'où une hétérogénéité des résultats ou un allongement des phases de séparation magnétique. Pour pallier ce problème, il est nécessaire de disposer de microsphères magnétiques dont le contenu en matériel aimantable est adapté en fonction de la taille. Ceci crée bien évidemment des contraintes industrielles en terme de fabrication ou d'approvisionnement.

De plus, les microsphères magnétiques sont denses, ce qui pose des problèmes pratiques de sédimentation au stockage, remise en suspension et sédimentation rapide à l'analyse. En effet, la densité des billes magnétiques est couramment supérieure à 1,15 et, selon le taux de magnétite, oscille entre 1,15 et 1,50, amenant à des vitesses de sédimentation très rapides, en particulier pour des particules de grand diamètre (> 2 m) (cf. demande de brevet européen publiée sous le numéro EP 1248110).

Ainsi, il existe aujourd'hui un besoin de développer un nouveau procédé spécifique d'identification et de dosage de plusieurs analytes contenus dans un échantillon liquide et qui comprend une ou plusieurs étapes de séparation magnétique, ledit procédé

<Desc/Clms Page number 5>

étant capable de contourner de tels inconvénients liés à l'utilisation de microsphères magnétiques.

Ceci est justement l'objet de la présente invention.

L'invention a ainsi pour objet un procédé de détection et/ou de quantification multiplex d'analytes susceptibles d'êtres contenus dans un échantillon à l'aide de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdits analytes pouvant être le cas échéant préalablement marqués par un marqueur, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en présence dudit échantillon avec une suspension de populations de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdites microsphères portant à leur surface : pour toutes les populations de microsphères, un composé A formant un premier membre d'une paire de liaison, ledit composé A étant également caractérisé en ce qu'il ne peut pas se lier avec lesdits analytes, et pour chacune des populations de microsphères, un composé B, différent pour chaque population, capable de former une paire de liaison spécifique avec l'un desdits analytes de l'échantillon, b) l'addition au milieu réactionnel obtenu à l'étape a) d'un ferrofluide, lequel ferrofluide contient des particules magnétiques qui portent à leur surface un second membre de liaison capable de former une paire de liaison spécifique avec le composé A, c) au moins une étape de lavage par séparation magnétique des microsphères magnétisées à l'étape b), d) le cas échéant lorsque lesdits analytes ne sont pas préalablement marqués, la mise en présence de la suspension des microsphères magnétisées obtenues à l'étape c) avec une solution d'au moins un conjugué, ledit conjugué comprenant un composé C capable de reconnaître et de se lier spécifiquement avec l'un desdits analytes et un marqueur, cette étape d) étant suivie de préférence d'au moins une étape de lavage des microsphères par séparation magnétique, et, e) la détection et/ou la quantification dudit marqueur à la surface des microsphères.

<Desc/Clms Page number 6>

On entend désigner par procédé de détection et/ou de quantification multiplex dans la présente description un procédé de détection et/ou de quantification de plusieurs analytes d'intérêt en un seul test.

On entend désigner par échantillon dans le procédé selon la présente invention tout échantillon pouvant contenir plusieurs analytes que l'on souhaite détecter et/ou quantifier dans ledit échantillon.

Parmi les échantillons susceptibles de contenir lesdits analytes selon la présente invention, on peut citer notamment les échantillons biologiques (notamment sang total, plasma ou sérum, liquide céphalorachidien, muqueuses, etc...) ou chimiques issus de tous types de prélèvements, notamment dans les domaines de la santé humaine ou animale, de l'agro-alimentaire ou de l'environnement, ou encore issus de l'industrie chimique, lesquels prélèvements sont effectués afin de détecter et/ou quantifier plusieurs analytes d'intérêt susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon prélevé.

Par analyte, on entend désigner dans la présente description tout composé d'intérêt susceptible de pouvoir être détecté et/ou quantifié selon la présente invention.

De préférence, lesdits analytes sont de type protéique et dérivés, ou sont des acides nucléiques.

Les termes protéine, polypeptide ou peptide sont utilisés indifféremment dans la présente description pour désigner une séquence d'acides aminés ou, pour leurs dérivés, contenant une séquence d'acides aminés.

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN. Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel, et sont naturels ou artificiels.

Selon un mode de réalisation particulier, de tels analytes sont des composés organiques, chimiques ou biochimiques, pouvant être présents soit en solution dans un liquide, soit présents à la surface d'une cellule ou d'une particule en suspension dans l'échantillon.

<Desc/Clms Page number 7>

Comme exemple de cellule ou de particule pouvant porter à sa surface ledit analyte on peut citer, mais sans s'y limiter, les cellules eucaryotes telles qu'une cellule de mammifère ou une levure, les cellules procaryotes telles que par exemple une bactérie, et les particules telles que par exemple une particule virale, une spore ou un grain de pollen, ou tout micro-organisme, notamment un champignon.

Un premier mode de réalisation de l'invention concerne l'identification et/ou le dosage multiplex dans un échantillon d'agents biologiques tels que des antigènes liés à des supports, comme les antigènes de surface de microorganismes, les récepteurs et autres structures membranaires, ou des analytes à l'état libre dans l'échantillon, tels que des protéines, enzymes, métabolites, et autres produits de sécrétion.

Comme exemple d'analytes d'intérêt, on peut citer notamment, mais sans s'y limiter, les protéines et leurs dérivés tels que les glycoprotéines ou les lipoprotéines, les acide nucléiques, les hydrates de carbone, les composés de nature lipidique et tous les composés naturels ou pouvant être obtenus par synthèse chimique. On peut également citer comme exemples d'analytes les composés présentant une particularité fonctionnelle tels que les cytokines, les récepteurs cellulaires, les anticorps, les antigènes, les toxines, les allergènes, les drogues, les pesticides ou herbicides, ou tout polluant, analytes que l'on souhaite détecter et/ou quantifier dans un échantillon, qu'ils soient présents en solution ou le cas échéant portés à la surface d'une cellule ou d'une particule.

De manière particulièrement préférée, lesdits composés sont des toxines protéiques, ou bien ladite cellule ou particule est un microorganisme, tel qu'une bactérie ou un virus.

Lorsque les analytes sont présents à la surface d'une cellule ou d'une particule, la détection et/ou la quantification desdits analytes permet la détection et/ou la quantification desdites cellules ou particules si lesdits analytes choisis sont spécifiques de ces dites cellules ou particules.

Comme autre exemple d'analytes d'intérêt pouvant être contenus dans un échantillon on peut citer les composés présents dans l'atmosphère, de façon naturelle ou accidentelle, qui peuvent être collectés dans un liquide, tel que par exemple au moyen d'un biocollecteur, qui prélève les particules présentes dans l'atmosphère et les impacte dans un liquide, généralement un tampon tel que du PBS, ou une huile.

<Desc/Clms Page number 8>

Un exemple typique de bio-collecteur est décrit dans la documentation commerciale du BioSampler# de SKC Inc., PA, ainsi que dans les brevets US 5902385 et US 5904752 et dans des publications techniques telles que : et al. : and analysis of airborne microorganisms, in Manual of environmental Microbiology, ASM Press, Wash. DC, 1997, pp. 629-640, Improved aerosol collection by combined impaction and centrifugal motion. Willeke K et al. , Aerosol Sci. Tech., 28:439-456 (1998) US 6468330 Irving et al.

On entend par analytes préalablement marqués par un marqueur dans le procédé selon l'invention tout analyte que l'on cherche à détecter et/ou quantifier dans un échantillon et qui se présente sous forme marquée avant la mise en #uvre dudit procédé.

Comme exemple d'analytes préalablement marqués on peut citer, mais sans s'y limiter, les acides nucléiques, ou produits PCR (amplicons), qui résultent d'une amplification enzymatique, telle que la PCR (réaction en chaîne à la polmyérase), qui peuvent être obtenus sous une forme marquée, notamment à l'aide de marqueurs fluorescents, ces techniques de marquage d'acides nucléiques étant bien connues de l'homme de l'art.

On entend désigner par microsphères non magnétiques fonctionnalisées dans le procédé selon la présente invention des microsphères non magnétiques portant à leur surface un composé A et un composé B.

Les composés A et B peuvent être fixés sur les microsphères non magnétiques selon des méthodes connues de l'homme de l'art, telles que le couplage par liaison covalente, par affinité, par adsorption passive ou forcée. De telles méthodes sont également utilisées pour la fixation du composé à la surface des particules magnétiques du ferrofluide.

De tels procédés de fonctionnalisation de divers supports ont été largement décrits dans la littérature, par exemple dans les brevets américains délivrés sous les numéros US 4,181,636 - US 4,264,766 - US 4,419,444 - US 4,775,619, etc. et dans Legastelois S et al., Latex et diagnostic. 1996, ou Le Technoscope . Biofutur, 161 1-11; Duke Scientific Corp. Catalog, Palo-Alto, CA. Technical Note-013A Reagent Microspheres-Surface properties and Conjugation Methods .

Dans le cas d'un couplage par liaison covalente, les microsphères utilisées sont porteuses de groupements chimiques capables de réagir avec un autre groupement chimique porté par le composé A ou B pour former une liaison covalente.

<Desc/Clms Page number 9>

Comme exemple de groupements chimiques pouvant être présents à la surface des microsphères on peut citer, mais sans s'y limiter, les groupements carboxyle, amino, aldéhyde et époxy. Dans le cas particulier où les analytes que l'on cherche à caractériser sont des espèces chimiques réactives, un des groupements chimiques portés par les microsphères non magnétiques peut être capable de réagir spécifiquement avec les espèces chimiques réactives desdits analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier, ledit groupement chimique assurant ainsi également le rôle du composé B.

Pour la fonctionnalisation des microsphères, on peut également utiliser l'interaction par affinité, qui est généralement mise en #uvre par deux partenaires d'un couple de liaison à haute affinité tels que notamment, mais sans s'y limiter, les couples (poly) carbohydrate/lectine, biotine ou composés biotinilés/avidine ou streptavidine, récepteur/ligand spécifique, antigène ou haptène/anticorps, etc...

La fonctionnalisation des microsphères peut également être réalisée soit directement, soit en utilisant des bras espaceurs encore désignés sous les termes "linker" ou "spacer".

La fonctionnalisation par adsorption passive ou forcée est connue de l'homme de l'art, et a déjà été décrite dans les brevets américains précédemment cités. Pour la fonctionnalisation par adsorption passive on pourra utiliser par exemple la BSA-biotine (Bovin Serum Albumin) (Sigma, Lyon, FR - Réf. A-8549).

Les microsphères non magnétiques fonctionnalisées dans la présente description peuvent être constituées par n'importe quel type de matériau dans la mesure où celui-ci ne contient aucun constituant magnétique. On choisira de préférence un matériau inerte aux analytes de l'échantillon et aux autres réactifs d'analyse, insoluble dans l'échantillon et dans tous les autres milieux réactionnels utilisés dans le procédé selon l'invention et qui peut être fonctionnalisé. Il peut s'agir par exemple d'un polymère, ou d'un copolymère, ou encore de latex, de verre ou de silice.

Dans la mesure où ces microsphères ne sont pas magnétiques, il n'existe aucune contrainte particulière quant au choix du matériau dans lequel elles peuvent être fabriquées. Ainsi, on peut utiliser n'importe quel type de microsphère dans une gamme très large de latex non magnétique. On peut également utiliser des microsphères dans d'autres matériaux, plus ou moins appropriés en fonction des analytes à détecter et/ou à quantifier, qui sont commercialisées dans diverses tailles sous forme non magnétique.

<Desc/Clms Page number 10>

Ainsi, le procédé selon l'invention peut par exemple utiliser des microbilles de verre ou de silice, matériaux respectivement utilisés de préférence pour une capture de plaquettes sanguines et d'acides nucléiques (voir notamment la demande internationale publiée sous le numéro WO 94/19600 qui décrit l'utilisation de microbilles de verre pour capturer (et dans ce cas précis éliminer) des plaquettes agrégées activées).

On peut citer comme exemples de polymères ou de copolymères, mais sans s'y limiter, le divinylbenzène, le polystyrène, le polyvinylpyridine, les copolymères de styrène-butadiène, les copolymères d'acrylonitrile-butadiène, les polyesters, les copolymères d'acétate-acrylate ester de vinyl, les copolymères de chlorure-acrylate ester de vinyl, les polyéthers, les polyoléfines, les oxydes de polyalkylène, les polyamides, les polyuréthanes, les polysaccharides, les celluloses, et les polyisoprènes. La réticulation est utile pour de nombreux polymères afin de donner une intégrité et une rigidité structurales auxdites microsphères.

Ainsi, selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que les microsphères sont dans un matériau choisi au sein du groupe constitué par le latex, un polymère, un copolymère, le verre ou la silice.

Les microsphères non magnétiques en polymère ou copolymère, en latex, en verre ou en silice sont bien connues de l'homme de l'art et sont disponibles dans le commerce, comme par exemple les gammes de microsphères fournies par les sociétés Spherotech (Libertyville, US), Polysciences (Warrington, US), Merck Eurolab SA (Fontenay-sousBois, FR) pour la gamme Estapor, Duke Scientific (Palo Alto, US), Seradyn (Indianapolis, US), Dynal Biotech pour Dyno Particles (Oslo, NO), etc. D'autres gammes de microsphères pourront être fournies par Bang's Labs (Fishers, US) et Polymer Laboratories Ltd (Church Stretton, UK).

De même, des procédures d'adsorption/ désorption d'acides nucléiques sur billes de silice sont décrites dans TechNote #302, Bang's Labs (Fishers, US) pour la capture d'acides nucléiques.

Par ailleurs, grâce à l'étendue du choix du matériau des microsphères utilisables dans le procédé selon la présente invention, il est possible d'utiliser des microsphères qui sédimentent moins, par exemple des billes de latex non magnétiques, et qui sont donc plus faciles à utiliser, en particulier dans les automates.

<Desc/Clms Page number 11>

Par composé A, on entend désigner dans la présente description, pour toutes les populations de microsphères, tout composé présent à la surface desdites microsphères non magnétiques fonctionnalisées telles que décrites précédemment, lequel composé est capable de se lier de manière spécifique avec un autre composé fixé à la surface des particules magnétiques d'un ferrofluide, ledit composé A formant le premier membre de la paire de liaison spécifique, et l'autre composé formant le second membre, ledit composé A étant également caractérisé en ce qu'il ne peut pas se lier avec les analytes
On entend désigner par ferrofluide dans la présente description une suspension colloïdale stable de particules magnétiques dans un porteur liquide. Les particules magnétiques, qui ont une taille moyenne environ de 100 # (10 nm), sont enduites d'un agent de dispersion stabilisant (agent tensio-actif) qui empêche l'agglomération des particules même lorsqu'un gradient de champ magnétique fort est appliqué au ferrofluide.

En l'absence d'un champ magnétique, les moments magnétiques des particules sont aléatoirement distribués et le fluide n'a aucune magnétisation nette.

Les particules magnétiques du ferrofluide sont recouvertes en surface par ledit composé formant le second membre de la paire de liaison spécifique avec le composé A à la surface des microparticules. Ainsi, ces particules magnétiques sont capables de venir se fixer à la surface des microsphères grâce à ladite paire de liaison formée, lesdites microsphères étant de cette manière magnétisées.

Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que ladite paire de liaison formée entre le composé A et le second membre fixé à la surface des ferrofluides, est de préférence choisie au sein du groupe constitué par les paires de liaison spécifique de type biotine/avidine ou biotine/streptavidine, enzyme/cofacteur, lectine/carbohydrate et anticorps/haptène.

Comme exemple de ferrofluide, on peut citer notamment, mais sans s'y limiter le FF-SA (ferrofluides-streptavidine) de Molecular Probes Europe (Leiden, NL) (Réf.C-21476,lot#71Al-l).

La quantité de matériel aimantable (particules magnétiques du ferrofluide) à mettre sur chaque population de microsphères peut donc être facilement gérée en modifiant la quantité des points d'accroche (formation des paires de liaisons) par population de microbilles.

<Desc/Clms Page number 12>

De plus, la sédimentation des ferrofluides est aussi très limitée, ce qui facilite la manipulation et l'homogénéité de prélèvement des suspensions.

L'aimantation des microparticules est réalisée selon un protocole classique à l'aide d'un aimant (Ex. DYNAL MPC).

Par composé B, on entend désigner dans la présente description, pour chacune des populations de microsphères, tout composé présent à la surface des microsphères de l'une des populations, lesquelles microsphères non magnétiques fonctionnalisées sont telles que décrites précédemment, lequel composé est capable de former une liaison spécifique avec l'un des analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier qui sont susceptibles d'être contenus dans l'échantillon.

Comme exemple de composé B on peut citer, mais sans toutefois s'y limiter, les protéines ou leurs fragments et structures dérivées, les récepteurs, les anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou leurs fragments, les anticorps monovalents, les acides nucléiques mono ou double brin et tout fragment ou construction dérivée, ainsi que des associations de plusieurs de ces composants. On peut citer comme exemples de liaison spécifique entre le composé B et un analyte le couplage antigène-anticorps ou ligandrécepteur membranaire, ou une hybridation entre acide nucléiques, la séquence nucléotidique du composé B greffé à la surface des microsphères étant alors complémentaire de celle de l'analyte.

De préférence, le composé B est une protéine ou l'un de ses fragments, capable de reconnaître l'un desdits analytes, telle que par exemple un anticorps polyclonal ou monoclonal ou l'un de ses fragments, dirigé spécifiquement contre l'analyte que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier, ou inversement, le composé B peut être un antigène ou haptène capable de reconnaître un anticorps que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier, ou encore un ligand spécifique d'un récepteur, un enzyme spécifique d'un cofacteur, ou un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier .

Dans le cas où le composé B ou C est un anticorps, on pourra se référer, pour la préparation d'anticorps polyclonaux, monoclonaux, ou leurs fragments, ou encore recombinants, aux techniques bien connues de l'homme de l'art, techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel Antibodies (Harlow et al., Antibodies : Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications pp. 726,1988) ou à la technique de

<Desc/Clms Page number 13>

préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et al. (Kôhler et Milstein. Nature, 256 : 495-497,1975). Des anticorps spécifiques peuvent être obtenus par exemple à partir de sérum ou de cellule d'un animal immunisé spécifiquement contre des antigènes.

Par fragment d'anticorps capable de reconnaître spécifiquement des antigènes, on entend désigner en particulier les fragments d'anticorps comprenant tout fragment dudit anticorps capable de se fixer spécifiquement sur l'épitope dudit antigène sur lequel se fixe l'anticorps dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps simple chaîne (scFv) ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F (ab')2, possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps dont ils sont issus. Ces fragments d'anticorps peuvent être obtenus à partir des anticorps polyclonaux ou monoclonaux par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière ces anticorps, ou leurs fragments, pourront également être obtenus par recombinaison génétique (anticorps recombinants).

Ainsi, selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que ledit composé B est choisi au sein du groupe constitué par les protéines et les acides nucléiques.

Selon un mode particulier de réalisation, le composé B présent à la surface des microsphères de chacune des populations est un anticorps et les analytes à détecter et/ou à quantifier sont des antigènes.

L'étape d) du procédé selon la présente invention est mise en #uvre uniquement dans le cas où lesdits analytes que l'on cherche à identifier et/ou à quantifier n'ont pas été préalablement marqués comme il a été décrit précédemment. Dans ce cas, ladite étape d) est nécessaire pour la réalisation de l'étape postérieure e) de détection et/ou de quantification. Elle fait intervenir une solution comprenant au moins un conjugué capable de se lier spécifiquement à l'un desdits analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier dans l'échantillon.

Ledit conjugué du procédé selon la présente invention comprend un composé C capable de reconnaître et de se lier spécifiquement avec l'un desdits analytes, et un marqueur qui lui est associé.

De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le composé C dudit conjugué utilisé à l'étape d) est un composé choisi au sein du groupe

<Desc/Clms Page number 14>

constitué par les protéines et les acides nucléiques, lorsque lesdits analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier dans l'échantillon sont respectivement des protéines ou des acides nucléiques.

Lorsque l'étape d) du procédé selon l'invention est mise en #uvre, celle-ci est suivie de préférence d'au moins une étape de lavage par séparation magnétique, laquelle étape est nécessaire pour séparer les microsphères magnétisées marquées de celles portant à leur surface uniquement lesdits analytes.

L'étape e) du procédé selon la présente invention peut être réalisée selon toute méthode automatisée électronique ou optique de détection et de comptage de particules.

La cytométrie de flux est particulièrement adaptée pour ce type d'analyse.

Cette méthode, largement utilisée aujourd'hui, permet de réaliser des mesures d'intensité lumineuse d'une très grande sensibilité sur des microsphères en suspension dans un milieu réactionnel. Ces mesures sont faites individuellement sur chaque microsphère, à haute cadence (plusieurs centaines à plusieurs milliers de microsphères analysées/ interrogées par seconde), ce qui permet en quelques dizaines de secondes de réaliser ces mesures sur un grand nombre de microsphères. Plusieurs paramètres de lumière sont mesurables simultanément sur chacune des microsphères : i) des paramètres de diffusion/ diffraction de lumière laser pour en caractériser/évaluer la taille et la structure (granularité, compacité) d'une part et ii) d'autre part plusieurs paramètres de fluorescence, différentiables par leurs longueurs d'onde et généralement associés à la présence de fluorochromes, ou marqueurs fluorescents, présents intrinsèquement dans la microsphère, ou associés à la fixation spécifique de conjugués.

En pratique, la cytométrie en flux (CMF) consiste à faire défiler une à une devant un rayon laser focalisé les microsphères en suspension dans un liquide, et de mesurer, sur chaque microsphère, individuellement, d'une part la diffusion/ diffraction de lumière laser et d'autre part les signaux de fluorescence associés. Toutes ces informations sont présentées à l'utilisateur sous forme de distributions de fréquences (histogrammes) dans lesquelles ce dernier repère aisément des sous-populations homogènes sur un ou plusieurs des paramètres considérés (par exemple la taille ou une fluorescence). Un (ou plusieurs) paramètre (s) de fluorescence peu (ven)t en plus des paramètres de taille/structure, au regroupement des individus appartenant à un même type de microsphères (dosage

<Desc/Clms Page number 15>

multiplex). Un (ou plusieurs) autre (s) de fluorescence peu(ven)t servir de révélateur, dont l'intensité est directement proportionnelle à la quantité d'analytes présent sur le type de microsphère considéré .

Un exemple de cytométrie de flux qui peut être utilisée à l'étape e) est la technique FACS (flluorescence-activated cell sorter), qui consiste en un système électronique pour séparer les microsphères selon leur taille et l'intensité de la fluorescence qu'elles émettent après divers marquages. L'appareil prépare des microgouttes de la suspension de microsphères qui sont diluées de façon à ne contenir qu'une seule microsphère. La microgoutte passe devant un faisceau lumineux à rayon laser et les microsphères sont analysées (histogramme) et séparées sur la base de leur fluorescence et/ou de leur taille.

Parmi les marqueurs pouvant être utilisés pour le marquage du composé C ou pour le marquage desdits analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier dans l'échantillon, on préfère les marqueurs fluorescents tels que notamment, mais sans s'y limiter, la fluorescéine et ses dérivés, tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), ou encore l'allophycocyanine (APC), la phycoérythrine-cyanine 5 (PC5) et la phycoérythrine (PE), la R-phycoérythrine (R-PE), ou encore la rhodamine et ses dérivés, la coumarine et ses dérivés, la luciférase et ses dérivés, la chromomycine, la mithramycine, la GFP (GFP pour Green Fluorescent Protein ), la eGFP (eGFP pour Enhanced Green Fluorescent Protein ), la RFP (RFP pour Red Fluorescent Protein ), la BFP (BFP pour Blue Fluorescent Protein ), la eBFP (eBFP pour Enhanced Blue Fluorescent Protein ), la YFP (YFP pour Yellow Fluorescent Protein ), la eYFP (eYFP pour Enhanced Yellow Fluorescent Protein ) le dansyl, l'umbelliférone, le bromure d'éthydium, l'acridine orange, le thiazole orange, le iodure de propidium (PI) etc.

Ainsi, de manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le ou les marqueurs utilisés sont fluorescents.

De manière plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la détection et/ou la quantification dudit marqueur à l'étape e) du procédé est réalisée par cytométrie de flux.

Les techniques permettant de coupler ces marqueurs sont bien connues de l'homme du métier et ne seront pas développées dans la présente description. Néanmoins, pour certains analytes, on peut trouver dans le commerce des conjugués comprenant de

<Desc/Clms Page number 16>

tels marqueurs fluorescents dirigés contre l'analyte que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier.

Dans un tel procédé de détection et/ou de quantification multiplex de plusieurs analytes, on préfère utiliser une gamme de marqueurs pouvant être détectés et/ou quantifiés simultanément de manière spécifique, de préférence des marqueurs fluorescents. De manière particulièrement préférée, on utilisera la cytométrie de flux pour la détection et/ou la quantification directe et simultanée de ladite gamme de marqueurs fluorescents
Ainsi, la suspension de populations de microsphères pourra comprendre une première population ni dont les microsphères la composant auront chacune le composé B1 fixé à leur surface, une deuxième population n2 dont les microsphères la composant auront chacune le composé B2 fixé à leur surface, une troisième population n3 dont les microsphères la composant auront chacune le composé B3 fixé à leur surface, et ainsi de suite. Ainsi, l'analyte, sera reconnu par le composé B1, l'analyte2 sera reconnu par le composé B2, l'analyte3 sera reconnu par le composé B3, et ainsi de suite.

Selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que deux au moins desdites populations possèdent en outre au moins une caractéristique physique intrinsèque permettant de les différencier entre elles.

L'homme du métier peut disposer de populations de microsphères présentant des caractéristiques physiques intrinsèques permettant de les différencier les unes des autres, permettant ainsi d'augmenter le nombre d'analytes différents à détecter et/ou à quantifier dans un échantillon, lesdites caractéristiques physiques intrinsèques pouvant être différentiables par leur taille et/ou leurs propriétés optiques (fluorescence spécifique pour chaque population).

Ainsi, de manière préférée, la caractéristique physique intrinsèque des microsphères du procédé selon la présente invention permettant de différencier les au moins deux populations de microsphères est la taille et/ou une propriété optique desdites microsphères.

De manière plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les microsphères ont une taille comprise entre 0,3 et 100 m.

De manière encore plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les microsphères ont une taille comprise entre 1 et 20 m.

<Desc/Clms Page number 17>

Ces gammes de taille correspondent le mieux au domaine d'analyse de taille des cytomètres en flux courants. Dans ces gammes de diamètres et à condition de ne pas poser de contraintes supplémentaires trop rigides (magnétisme, fluorescence), il est facile de trouver des billes distinguables les unes des autres par leur seul paramètre de taille, mesuré par le paramètre nommé forward light scatter (FS ou FLS), pour former plusieurs groupes distincts (ex. 1, 3, 5 ; 8 ; 10 et 15 m). Certains de ces diamètres sont aussi disponibles en version fluorescente, voire avec plusieurs niveaux d'intensité différentiables.

Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la propriété optique est la longueur d'onde d'émission et/ou l'intensité de la fluorescence desdites microsphères.

Ainsi, il est possible de différencier les n populations de microsphères de ladite suspension entre elles.

Ainsi par exemple, les gammes QuantumPlexTM fournies par Bang's Labs (Fishers, US) et CytoPlexTM fournies par Duke Scientific (Palo Alto, US) permettent d'accéder, pour une taille donnée, à des sous-familles de billes différentiables par leur niveaux d'intensité en fluorescence rouge, jusqu'à 10 niveaux pour des billes de 4 m (CytoPlex) ou 2 x 5 niveaux pour des billes de 4. 4 et 5.5 m (QuantumPlex). En supposant disponibles les billes ad hoc dans les diamètres sus-cités et avec chacune 5 niveaux d'intensité de fluorescence rouge, la détection multiplex possible selon l'invention s'élève à 6 x 5 = 30 analytes.

Avantageusement, le procédé selon l'invention permet la détection et/ou la quantification rapide d'au moins 6 analytes différents.

La spécificité requise pour les populations de conjugués utilisés est fonction de la complexité de l'étape e) de détection et/ou de quantification, du type et du nombre d'analytes recherchés. Il est ainsi possible de n'utiliser qu'une seule population de conjugué comprenant un seul type de marqueur, ledit conjugué ayant alors une fonction de révélateur ubiquitaire. Dans ce cas, la spécificité est apportée uniquement par la sélectivité de chaque bille de capture. Inversement, il est également possible d'utiliser autant de populations de conjugués différentes que d'analytes à doser. En fonction du test à réaliser, l'homme du métier pourra bien entendu choisir les alternatives convenables entre ces deux variantes extrêmes.

<Desc/Clms Page number 18>

Selon un mode de réalisation avantageux le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que lesdits analytes sont des acides nucléiques et en ce qu'à l'étape a), le composé B est un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec l'un desdits analytes
De manière préférée, lesdits analytes sont des produits PCR.

De manière plus préférée, lesdits produits PCR sont obtenus marqués.

De tels produits PCR, le cas échéant marqués, ont été décrits précédemment. Les microsphères non magnétiques fonctionnalisées utilisées dans ce mode de réalisation portent à leur surface un composé B de type oligonucléotide, lequel composé B est complémentaire de l'un des produits d'amplification recherchés. Lorsque les produits sont préalablement marqués, l'étape d) de mise en présence des microsphères magnétisées avec des conjugués n'est pas nécessaire. Le marquage à la surface des microsphères est fourni par le marqueur porté par les produits PCR que les microsphères ont capturé.

De manière encore plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le composé C dudit conjugué utilisé à l'étape d) est un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec l'un desdits analytes.

Un tel type de conjugué pourra être utilisé par exemple pour détecter et/ou quantifier plusieurs analytes tels que notamment du matériel génomique non préalablement amplifié, ou des dérivés non préalablement amplifiés, tels que des fragments générés par clivage enzymatique à l'aide d'enzymes de restriction de ce matériel génomique.

L'étape d'amplification du signal peut être alors assurée par l'étape de ligation entre le composé B des microsphères et le composé C des conjugués.

Ainsi, l'invention a également pour objet l'utilisation du procédé selon l'invention pour la détection et/ou la quantification multiplex de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms).

Dans ce cas, la méthode de l'invention est de préférence utilisée en association avec la technique OLA pour Oligonucléotide Ligation Assay (test de ligation d'oligonucléotides) basée sur l'action d'une ligase qui ne relie deux oligonuléotides adjacents d'une façon covalente qu'à la condition qu'ils soient parfaitement complémentaires du brin d'ADN matrice (Landegren et al Proc. Natl. Acad. Sci. US 1990;87:8923-8927; brevetUS4988617). Comme indiqué précédemment, le brin d'ADN matrice peut être soit un amplicon (fragment amplifié par PCR/Polymerase Chain Reaction ou autre réaction d'amplification enzymatique), soit du matériel génomique non

<Desc/Clms Page number 19>

préalablement amplifié ou ses dérivés non préalablement amplifiés par exemple des fragments générés par clivage enzymatique à l'aide d'enzymes de restriction de ce matériel génomique.

Ainsi, de manière préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce la détection et/ou la quantification multiplex de SNPs est réalisée par la méthode OLA.

Dans cette variante, le conjugué au sens de la définition générale ci-dessus est une sonde de révélation (composé C) portant un marqueur fluorescent. L'étape de ligation constitue une étape supplémentaire entre l'étape d) et l'étape e) dudit procédé.

Le protocole décrit ci-après et schématisé sur la figure 1 illustre le principe général de l'invention. Ce mode de réalisation porte sur la détection de trois antigènes différents.

Bien entendu, sur cette base, de nombreuses variantes pourront être envisagées par l'homme de l'art, selon la nature et le nombre d'analytes différents à détecter et/ou à quantifier, la sensibilité du test, la vitesse de réalisation, le matériel utilisé, etc. Ces variantes peuvent par exemple concerner le nombre et/ou la taille et/ou les propriétés optiques des microsphères fonctionnalisées, le nombre de ligands spécifiques de l'analyte recherché fixé à leur surface (composés B), l'étape d'aimantation qui peut être répétée plusieurs fois en alternance avec des lavages successifs, la nature du marqueur lié au conjugué qui peut être le même pour tous les conjugués du mélange ou être différent selon la spécificité des conjugués, etc.

Des populations de microsphères fonctionnalisées sont mises en présence de l'échantillon que l'on veut tester. Par mesure de simplification et de clarté, on considère dans ce descriptif que l'on dispose de trois populations de microsphères de latex (trois analytes à détecter et/ou à quantifier) de tailles différentes. Chacune des populations porte à sa surface un composé B qui est un anticorps de capture spécifique de l'un des trois analytes recherchés. Dans cette illustration, on considère également que les composés A sont des molécules de biotine qui sont greffées à la surface des microsphères pour permettre la fixation des particules magnétiques du ferrofluide par l'intermédiaire d'une liaison biotinestreptavidine. Lorsque les microsphères sont mélangées à l'échantillon, chacun des analytes recherchés va se lier à la population portant l'anticorps spécifique. Les particules magnétiques du ferrofluide couplés à de la streptavidine sont alors ajoutés au milieu et vont se fixer à la surface des microsphères. Les microsphères rendues ainsi magnétisables peuvent être séparées des autres produits interférents du milieu par une ou plusieurs étapes

<Desc/Clms Page number 20>

d'aimantation en alternance avec une ou plusieurs étapes de lavage avec un tampon approprié.

Les populations de microsphères sont ensuite mises en présence d'un mélange de trois types de conjugués, chaque type de conjugué étant représenté dans ce schéma par un composé C qui est un anticorps spécifique portant un marqueur fluorescent.

Après une phase d'incubation des microsphères avec la solution de conjugués suffisante pour permettre la fixation desdits conjugués sur leur analyte spécifique, lui-même retenu à la surface des microsphères, les microsphères associées au fluorochrome, peuvent être analysées. Dans le cas présent, celles-ci sont analysées en cytométrie de flux en fonction de leur taille.

Les conjugués sont généralement utilisés en excès de façon à s'assurer un marquage optimal des analytes fixés sur les microsphères. De ce fait, avant de procéder à l'analyse des microsphères, il est préférable d'isoler celles-ci du milieu contenant des conjugués en excès restés en suspension. Cette séparation est avantageusement réalisée à nouveau par une ou plusieurs série (s) et de lavage(s).

Comme cela a déjà été indiqué, une variante avantageuse du procédé selon l'invention vise la détection et/ou la quantification de n acides nucléiques. Dans sa réalisation la plus simple, cette variante se déroule selon le protocole ci-après, schématisé dans la figure 2.

Dans ce cas, l'analyse porte sur trois produits de PCR fluorescents à l'aide de billes de tailles différentes. Chacune des populations de microsphères fonctionnalisées est recouverte par un composé B qui est un oligonucléotide complémentaire de l'un des produits de PCR (sonde de capture) et non plus par un anticorps spécifique. Les étapes de mélange et d'aimantation des microsphères sont identiques à celles décrites dans le mode de réalisation précédent. Après les étapes d'aimantation et de lavage, les microsphères ayant capturé des produits fluorescents à leur surface sont analysées en cytométrie de flux.

La présente invention a également pour objet un kit pour la détection et/ou la quantification multiplex d'analytes susceptibles d'être contenus dans un échantillon,

<Desc/Clms Page number 21>

caractérisé en ce qu'il comprend une suspension de populations de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdites microsphères portant à leur surface : a) un réactif 1 comprenant une: - un composé A formant un premier membre d'une paire de liaison ; - un composé B capable de former une liaison spécifique avec l'un desdits analytes de l'échantillon, et b) un réactif 2 comprenant un ferrofluide qui contient des particules magnétiques portant à leur surface un second membre de liaison capable de former une paire de liaison spécifique avec ledit composé A ; et c) un réactif 3 comprenant une solution d'au moins un conjugué, ledit conjugué comprenant un composé C capable de réagir spécifiquement avec lesdits analytes et un marqueur capable d'être détecté.

De manière encore préférée, le kit selon l'invention comprend en outre : - un réactif 4 comprenant lesdits analytes susceptibles d'être contenus dans un échantillon.

De manière encore plus préférée, le kit selon l'invention comprend en outre : - un réactif 5 composé d'un tampon de dilution ; et - un réactif 6 composé d'un tampon de lavage.

Enfin, selon un autre mode de réalisation encore plus préféré, le kit selon l'invention comprend en outre : - un réactif 7 comprenant un tampon de neutralisation de l'agrégation des différentes microsphères.

Lesdits tampons sont par exemple des tampons à base de PBS, tels que par exemple le PBS/Tween 20.

Le réactif 7 sera plus particulièrement utilisé dans le cas ou le composé A à la surface des microsphères est un composé de type biotine. Ledit tampon de neutralisation permet d'éviter une agrégation des différentes microsphères recouvertes de composé A lors de l'aimantation. Dans ce cas où il s'agit de microsphères biotinylées, le tampon de neutralisation est par exemple constitué d'une solution aqueuse de biotine.

<Desc/Clms Page number 22>

Comme cela a déjà été indiqué, et ainsi qu'il en ressortira à la lecture des exemples ci-après, la méthode de l'invention permet de réaliser en des temps relativement rapides l'identification simultanée de plusieurs agents dans un échantillon.

Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinées à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : du principe du procédé de détection et/ou de quantification (dosage multiplex) selon l'invention appliqué à la détection et/ou la quantification de trois antigènes à l'aide de billes de tailles différentes.

Figure 2 : du principe du procédé selon l'invention appliqué au dosage multiplex de trois produits de PCR fluorescents à l'aide de billes de tailles différentes.

Figure 3 : du principe du procédé de dosage multiplex selon l'invention appliqué à la génétique moléculaire pour la recherche de SNPs.

Figure 4 : illustrant le même principe que le précédent, dans lequel un degré de spécificité supplémentaire est obtenu au niveau du greffage de la sonde de révélation.

Figure 5 : Analyse en CMF d'un mélange de billes de 3 - 8-10 et 15 m en fonction de la taille.

Figure 6 : Analyse en CMF d'un mélange de billes de 3 - 4,4 - 8-10 et 15 m en fonction de la taille et d'une fluorescence.

Figure 7 : en CMF d'un mélange de billes de 4,4 - 8-10 et 15 m initialement non magnétiques.

Figure 8 : de la distribution en FS LOG des différentes populations de billes- biotine lors de la fixation des FF-SA.

Figure 9 : Dosage de B. globigii sur microsphère 15 m anti- B. globigii.

Figure 10: Dosage d'Ovalbumine sur microsphère 4,4 m QuantumPlex #3 antiovalbumine.

<Desc/Clms Page number 23>

EXEMPLES Exemple 1 : de familles de microsphères ( S) en fonction de la taille par CMF
Les microsphères listées ci-dessous ont été mélangées dans des proportions similaires et le mélange analysé sur un cytomètre en flux de type EPICS XL (Coulter) (Figure 5).

@ L'analyse par cytométrie en flux d'un mélange de 6 populations de billes de tailles 2 - 3,1 - 6 -7,6 - 10,2 et 15,1 m a montré que les singlets des différentes populations de billes étaient différentiables en analyse double scatter. Les paramètres sont mesurés après amplification logarithmique (FS log/SS log) (FS pour Forward light Scatter ; SS pour Side light Scatter).

Liste des 6 populations de microsphères utilisées :

<tb>
<tb> Diamètre
<tb> Référence <SEP> Fournisseur <SEP> Polymère
<tb> ( m)
<tb> Dynospheres <SEP> Calibration <SEP> Dyno <SEP> Particles
<tb> Kit <SEP> (Dynal <SEP> Biotech) <SEP> 15,1 <SEP> Polystyrène <SEP> (PS)
<tb> Dynospheres <SEP> Calibration <SEP> Dyno <SEP> Particles
<tb> 10,2 <SEP> PS
<tb> Kit <SEP> (Dynal <SEP> Biotech)
<tb> PS <SEP> 98% <SEP> /
<tb> Uniform <SEP> Latex <SEP> Particles <SEP> Seradyn <SEP> 7,6 <SEP> Divinylbenzène
<tb> (DVB) <SEP> 2%
<tb> Sphero <SEP> Polystyrène
<tb> Spherotech, <SEP> Inc. <SEP> 6 <SEP> PS
<tb> Particles
<tb> Microspheres <SEP> Estapor <SEP> Estapor
<tb> 3,1 <SEP> PS
<tb> White <SEP> 3 <SEP> m <SEP> (Merck <SEP> Eurolab)
<tb>

<Desc/Clms Page number 24>

<tb>
<tb> Dynospheres <SEP> Calibration <SEP> Dyno <SEP> Particles
<tb> 2 <SEP> PS
<tb> Kit <SEP> (Dynal <SEP> Biotech)
<tb>
. L'analyse par cytométrie en flux d'un mélange de 4 populations de billes de tailles approximatives 3,8, 10 et 15 m a montré que les singlets des différentes populations de billes étaient aisément différentiables en FS log/SS log et que les multiplets éventuels ne représentaient pas une gêne.

Liste des 4 populations de microsphères utilisées :

<tb>
<tb> Diamètre <SEP> CV
<tb> Référence <SEP> N <SEP> de <SEP> lot <SEP> Fournisseur <SEP> Polymère
<tb> ( m) <SEP> (%)
<tb> PL-Microspheres <SEP> Polymer <SEP> Polystyrène
<tb> SP-1444 <SEP> 14,57 <SEP> 2,92
<tb> Plain <SEP> White <SEP> 15 <SEP> m <SEP> Laboratories <SEP> (PS)
<tb> Dyno <SEP> Particles <SEP> PS <SEP> 94,5%
<tb> Dynospheres <SEP> Q-561 <SEP> Q-561 <SEP> 10,1 <SEP> 1,00
<tb> (Dynal <SEP> Biotech)/DVB <SEP> 5,5 <SEP> %
<tb> PL-Microspheres <SEP> Polymer
<tb> SP-1436 <SEP> 7,97 <SEP> 2,29 <SEP> PS
<tb> Plain <SEP> White <SEP> 8 <SEP> m <SEP> Laboratories
<tb> Microspheres
<tb> Estapor
<tb> estapor <SEP> White <SEP> 3 <SEP> m <SEP> 285 <SEP> 3,1 <SEP> ND <SEP> PS
<tb> (Merck <SEP> Eurolab)
<tb> R <SEP> 94-52
<tb>
Exemple 2 : Différenciation de multiples (6) familles de microsphères par CMF en fonction combinée de la taille et d'une fluorescence
Des microsphères de 4,4 m porteuses d'une fluorescence rouge (mesurée sur le détecteur FL4 ont été ajoutées au mélange de l'exemple 1. La combinaison, au mélange précédemment décrit, de microsphères de 4,4 m permet la reconnaissance de 2 familles supplémentaires ; la différence de scatter axial (log FS) entre les microsphères de 3 m et celles de 4,4 m reste trop faible pour une discrimination facile (cf. Fig 5 A et B).

L'apport de la FL4 en paramètre associé permet une discrimination complète des microsphères de 4,4 m vis-à-vis de toutes les autres (3 m en particulier) et pour les 2 groupes de microsphères 4,4 m entre eux (Figure 6).

<Desc/Clms Page number 25>

Exemple 3 : Fonctionnalisation de microsphères 8,10 et 15 m par adsorption passive Purification des IgG:
Des sérums polyclonaux de lapins immunisés contre les bactéries modèles B. globigii, B. pseudomallei ou Y pestis ou contre les antigènes solubles modèles ovalbumine (OVA) et chaîne A de la ricine (Ricine) ont été générés. Les Immunoglobulines G (IgG) de lapin ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur protéine G.

En bref, 50 mL de sérum dilué ont été déposés sur une colonne contenant 5 mL de protéine G Sepharose 4 fast flow (Pharmacia) préalablement équilibrée en tampon Na2HP04 pH=7. Les IgG accrochées ont ensuite été éluées en tampon Glycine/HCl 0,1 M pH=2,7 puis immédiatement neutralisées par du tampon Tris/HCl pH=9.

Les éluats ont été dialysés contre du tampon PBS 150 mM pH=7,2 à 4 C puis concentrés par osmose inverse. Les concentrations en IgG ont été estimées par lecture d'absorbance à 280 nm (#0,1%à 280 nm = 1,41).

Préparation des billes 8, 10 et 15 m:
1 mL de billes de latex à 10% de solide (soit 100 mg de latex) de diamètres 8 m (Polymer Laboratories), 10 m (Dynal Particles) ou 15 m (Polymer Laboratories), ont été centrifugés 10 mn à 500 g. Après élimination de 600 L de surnageant, 2 mL de tampon PBS/Triton X-100 0,25%/NaN3 0,09% (PBS/Triton) ont été ajoutés. Les billes ont été incubées 10 mn à température ambiante, lavées par 2,4 mL de tampon PBS puis remises en suspension dans un volume final de 6 mL de ce même tampon et placées à 4 C pendant 30 mn.

Préparation des anticorps (Ac) :
Les Ac ont été dilués en tampon PBS à une concentration de 200 g/mL dans un volume de 1 mL et placés à 4 C pendant 30 mn. Deux tubes contenant 1 mL de PBS 150 mM / BSA 0,1 %/ NaN3 0,09 % (PBS/BSA) ont également été prévus afin d'obtenir des billes non chargées.

La BSA-biotine (Sigma, Réf. A-8549) a été diluée en tampon PBS à 500 ug/mL dans un volume de 1 mL et placée à 4 C pendant 30 mn.

Charge des billes :

<Desc/Clms Page number 26>

1 mL de billes (8,10 ou 15 m) a été ajouté aux différentes solutions d'anticorps maintenues sous forte agitation (vortex). Les différents mélanges ont alors été placés 12 heures à 4 C sous agitation rotative. Après cette incubation, les mélanges ont été centrifugés 10 mn à 500 g. Après élimination du surnageant, les billes chargées ont été biotinylées par une incubation de 3 heures à 4 C dans 2 mL de BSA-biotine à 500 g/mL.

Après élimination du surnageant, les billes chargées ont été saturées par une incubation de 2 heures dans 2 mL de tampon PBS/BSA 2 %. Deux lavages en tampon PBS ont été réalisés avant de reprendre les billes par 1 mL de PBS/BA. Les suspensions obtenues ont été numérées et leurs concentrations ajustées à 2,5.104/ L.

Exemple 4 : Fonctionnalisation de microsphères 4,4 m par couplage covalent
Les Ac anti-OVA et anti-Ricine ont été couplés de manière covalente après activation des billes-COOH (protocole adapté de la procédure Bang's Labs, Réf.

TechNote #205 : "Covalent Coupling"). Le carbo-diimide utilisé pour l'activation des billes est le l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide-HCl (EDC, Pierce Brebières, FR - , Réf. 1853160).

Préparation des Ac :
Les IgG anti OVA (respectivement anti Ricine) ont été diluées en tampon PBS à une concentration de 200 ug/mL dans un volume de 1 mL.

Activation des billes :
1 mL de billes de latex Bang's Labs QuantumPlex #5 et #3, diamètre 4,4 m, ont été centrifugées 10 mn à 1900 g. Après élimination du surnageant, 2 mL de tampon MES 0,1 M pH=5,5 ont été ajoutés. Après répétition de cette opération, 500 L de tampon MES 0,1 M/EDC 10 mg/mL pH=5,5 ont été ajoutés. Les mélanges ainsi obtenus ont été mis sous agitation rotative pendant 15 mn, lavés deux fois par 2 mL de tampon PBS puis repris dans un volume de 1 mL de ce même tampon.

Couplage des Ac aux billes :
1 mL de billes QuantumPlex #5 a été ajouté à la solution d'IgG anti Ricine maintenue sous forte agitation (vortex). La même opération a été réalisée en mélangeant les billes QuantumPlex #3 à la solution d'IgG anti OVA précédemment préparée. Les différents mélanges ont alors été placés 4h à température ambiante sous agitation rotative.

Biotinylation des billes :

<Desc/Clms Page number 27>

Les mélanges ont été centrifugés 10 mn à 1900 g. Après élimination du surnageant, les billes chargées ont été biotinylées par une incubation d'une nuit à 4 C dans 2 mL de PBS/BSA-biotine 0,05 %/Glycine 30 mM.

La charge des billes à la biotine a été vérifiée par la suite en CMF après marquage par de la Streptavidine-PE (Sigma, Réf. S-3402).

Saturation des billes :
Suite à cette incubation, les billes ont été centrifugées 10 mn à 1900 g. Après élimination du surnageant, les billes chargées ont été saturées par une incubation de 30 mn dans 2 mL de tampon PBS/BSA 2 %. Un lavage en tampon PBS a été réalisé avant de reprendre les billes par 1 mL de PBS/BA. Les suspensions obtenues ont été numérées et leurs concentrations ajustées à 2,5.104 billes/ L.

Exemple 5 : magnétique et reconnaissance différentielle de microsphères 4,4 m, 8, 10 et 15 m initialement non magnétiques.

1. But . Démontrer la possibilité d'isoler par aimantation des billes de latex, non magnétiques initialement, mais qui le deviennent lors de la fixation des particules magnétiques d'un ferrofluide par l'intermédiaire d'une liaison streptavidine/biotine.

. Montrer que cette fixation n'entraîne pas de recouvrement des différentes catégories de billes en FS LOG/SS LOG.

. Montrer que les rendements de récupération des billes sont suffisamment importants pour permettre une analyse cytométrique.

2. Matériel - Mélange de billes fonctionnalisées (5000 billes/uL de chaque spécificité) composé de :
Billes 4,4 m QuantumPlex # 3/ Ac anti-OVA/ BSA-biotine (lot # 682).

Billes 4,4 m QuantumPlex # 5/ Ac anti-Ricine/ BSA-biotine (lot # 681).

Billes 8 m Polymer Laboratories / Ac anti Y. pestis / BSA-biotine (lot #
041).

Billes 10 m Dyno /Ac anti B. pseudomallei / BSA-biotine (lot # 042).

<Desc/Clms Page number 28>

Billes 15 m Polymer Laboratories/ Ac anti B. globigii / BSA-biotine (lot # 043).

- Ferrofluides-streptavidine (FF-SA) Molecular Probes (Réf. C-21476) à 0,5 mg Fe/mL (lot#71Al-l).

- d-biotine à 200 g/mL en eau distillée.

- Tampon PBS/Tween 0,1%.

- Tampon PBS/BA.

- Tube IMS 1 mL.

- Aimant Dynal.

- Billes 5,1 m Duke XPR green (lot # 1938).

3. Protocole
En tube IMS de 1 mL, introduire 790 L de PBS/Tween 0,1 % (tube IMS) ou 490 L de PBS/BSA 0,1%/NaN3 0,09% (PBS/BA) (tube référence).

Ajouter 10 L de mélange de billes fonctionnalisées (soit 50 000 billes de chaque catégorie).

Vortexer.

Ajouter 30 L de FF-SA.

Vortexer.

Mettre 5' sous agitation rotative.

Ajouter 100 L de biotine à 200 g/mL.

Incuber 1 min.

Pour le tube
Vortexer.

IMS uniquement Aimanter le tube pendant 2 min30. umquement Eliminer le tampon.

Ajouter 800 L de PBS/BA.

Aimanter le tube pendant 2min30.

Eliminer le tampon.

Ajouter 500 L de PBS/BA.

<Desc/Clms Page number 29>

Ajouter 15 L de billes Duke XPR diluées au 1/50 en PBS/Tween 0,1 % (billes de référence permettant de standardiser le nombre d'évènements comptés lors de l'analyse cytométrique).

Analyser les deux tubes sur cytomètre Coulter EPICS XL comme indiqué cidessous :
Créer un histogramme FS LOG/SS LOG. Sur cet histogramme, créer 4 régions d'analyse (A, B, C et D) (Figure 7A).

Placer les régions B, C et D sur les billes de 8,10 et 15 m respectivement.

Placer la région A sur la population composée des billes de comptage (5,1 m.

Duke XPR) et des billes de capture de 4,4 m.

Créer un histogramme FS LOG/FL4 LOG conditionné sur la fenêtre A (Figure 7b).

Créer 3 régions d'analyse (E, F et G).

Placer les régions E et F sur les populations de billes 4,4 m QuantumPlex #3 et #5 respectivement. Placer la région G sur la population de billes de comptage (Duke XPR).

Créer un histogramme mono-paramétrique conditionné sur la région G. Placer un stop automatique d'analyse à 10 000 évènements sur cet histogramme.

Relever le nombre d'évènements comptés dans les régions B, C, D, E et F.

Calculer les rendements de récupération de chaque catégorie de billes en divisant le nombre d'évènements comptés sur le tube IMS par celui compté sur le tube référence.

4. Résultats
4. 1. Evolution de la distribution en FS LOG des différentes populations de billes-biotine lors de la fixation des FF-SA (Figure 8).

La fixation des FF-SA sur les billes/BSA-biotine entraîne une légère diminution du FS. Cette évolution n'entraîne pas de recouvrement des différentes populations de billes.

4. 2. Rendements de récupération

<Desc/Clms Page number 30>

Les rendements de récupération (% de billes récupérées) obtenus lors de 3 essais différents, dans les conditions exposées au paragraphe 3, sont exposés dans le tableau cidessous.

<tb>
<tb>

Catégorie <SEP> de <SEP> billes/BSA-biotine
<tb> 4,4 <SEP> m <SEP> 4,4 <SEP> m <SEP> 8 <SEP> m <SEP> 10 <SEP> m <SEP> 15 <SEP> m
<tb> QP#3 <SEP> QP#5 <SEP> 'm <SEP> . <SEP> m
<tb> Moyenne <SEP> 52,3 <SEP> 50,5 <SEP> 69,3 <SEP> 93,3 <SEP> 90,8
<tb> Ecart-type <SEP> 8,5 <SEP> 8,2 <SEP> 9,4 <SEP> 7,2 <SEP> 6,0
<tb> CV <SEP> (%) <SEP> 16,2 <SEP> 16,1 <SEP> 13,6 <SEP> 7,7 <SEP> 6,6
<tb>
Des rendements de récupération compris entre 50 et 95 % ont été obtenus.

5. Conclusion # La faisabilité de l'isolement par aimantation de billes de latex biotinylées rendues magnétiques par la fixation de FF-SA est acquise (rendements de récupération suffisants).

. Cette séparation magnétique est compatible avec la mise en #uvre d'un dosage multiplex (pas de recouvrement des différentes catégories de microsphères).

# Cet exemple illustre parfaitement la flexibilité du système .

L'utilisation disjointe de microsphères de multiplexage et de nanosphères de séparation élargit le champ de disponibilité des microsphères de qualités requises (taille, auto-fluorescence, densité, matériau, chimie de surface...). En effet les latex non magnétiques sont très facilement accessibles dans toutes les gammes des caractéristiques pré-citées, alors que la gamme de microsphères magnétiques est très réduite (< 1% des références catalogues). Le choix peut imposer par exemple des fournisseurs différents pour créer une série de familles de multiplexage significative ou des réalisations spéciales (et donc coûteuses).

Au contraire, avec le système proposé, on peut utiliser n'importe quelle microsphère de multiplexage, dans la gamme très large des latex non magnétiques.

Exemple 6 : de modèle de kit selon l'invention

<Desc/Clms Page number 31>

Réactif 1 - Microsphères fonctionnalisées : de microsphères biotinylées et coatées par des Ac spécifiques des Ag à doser. Concentration en billes : 2500 microsphères de chaque spécificité/ L (Tableau suivant).

<tb>
<tb>

Diamètre <SEP> Fluorescence
<tb> Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Ac <SEP> de <SEP> capture
<tb> ( m) <SEP> à <SEP> 675 <SEP> nm <SEP>
<tb> Polymer <SEP> PL-Microspheres <SEP> Plain <SEP> AcP <SEP> anti-B.
<tb>

Laboratories <SEP> White <SEP> 15 <SEP> m <SEP> globigii
<tb> Dynal <SEP> AcP <SEP> anti <SEP> B.
<tb>

10- <SEP> Dynospheres
<tb> Particles <SEP> pseudomallei
<tb> Polymer <SEP> PL-Microspheres <SEP> Plain
<tb> 8- <SEP> AcP <SEP> anti- <SEP> Y. <SEP> pestis
<tb> Laboratories <SEP> White <SEP> 8 <SEP> m
<tb> 4,4 <SEP> +++ <SEP> QuantumPlex <SEP> #5 <SEP> AcP <SEP> anti <SEP> Ricine
<tb> 4,4 <SEP> ++ <SEP> Bang's <SEP> Lab. <SEP> QuantumPlex <SEP> #4 <SEP> AcM1 <SEP> anti-SEB
<tb> 4,4 <SEP> + <SEP> QuantumPlex <SEP> #3 <SEP> AcP <SEP> anti-Ova <SEP>
<tb>
Réactif 2 - Ferrofluides-Streptavidine : captivate ferrofluid conjugate (Molecular Probes, Réf. C-21476).

Réactif 3 - Réactif de révélation : mélange de conjugués fluorescents spécifiques des Ag à doser (Tableau suivant).

<tb>
<tb>

Concentration <SEP> d'utilisation
<tb> Ac <SEP> de <SEP> révélation <SEP> Fluorochrome <SEP> conjugué <SEP> ( g/mL)
<tb> AcP <SEP> anti-B. <SEP> globigii <SEP> R-Phycoérythrine <SEP> (R-PE) <SEP> 25
<tb> AcP <SEP> anti <SEP> B. <SEP> pseudomallei <SEP> Isothiocyanate <SEP> de <SEP> 50
<tb> fluorescéine <SEP> (FITC)
<tb> AcP <SEP> anti-Y. <SEP> pestis <SEP> R-PE <SEP> 50
<tb> AcP <SEP> anti <SEP> Ricine <SEP> FITC <SEP> 50
<tb> AcM2 <SEP> anti-SEB <SEP> FITC <SEP> 50
<tb> AcP <SEP> anti-Ova <SEP> FITC <SEP> 50
<tb>

<Desc/Clms Page number 32>

Réactif 4 - Standards : mélange concentré (concentration à définir) des 6 Ag à doser.

Une série de dilutions de ce réactif est à préparer extemporanément (dilution en Réactif 1). Traitée dans les mêmes conditions que l'échantillon à analyser, cette gamme (nombre de points à déterminer) permet la quantification des Ag présents dans l'échantillon.

Réactif 5 - Tampon de dilution : tampon PBS/Tween20 0,1% pH=7,2.

Réactif 6 - Tampon de lavage : A déterminer (PBS/BSA 0,1%/NaN3 0,09% ou PBS/Tween 20 0,1% ou autre).

Réactif 7 - Tampon de neutralisation : solution de d-biotine à 200 ug/mL en eau distillée.

La d-biotine empêche l'agrégation des différentes microsphères biotinylées lors de l'aimantation (agrégation microsphères/biotine - SA/FF/SA - biotine/microsphères évitée en neutralisant SA/FF/SA par de la biotine pour donner biotine-SA/FF/SA-biotine qui ne peut pas réaliser de pontage entre les différentes microsphères-biotine).

Matériel nécessaire non fourni : Aimant Dynal MPC Exemple 7 : Modèle de protocole opératoire du dosage multiplex de 3 bactéries et 3 protéines
1. Préparer une gamme d'étalonnage en mélangeant les réactifs 4 et 5 comme indiqué ci-dessous

<tb>
<tb> Tube <SEP> TO <SEP> T1 <SEP> T2 <SEP> T3 <SEP> ... <SEP> Tn
<tb> Réactif <SEP> 4 <SEP> (\il)
<tb> Réactif <SEP> 5 <SEP> ( L)
<tb> Ag <SEP> bactérien
<tb> (bactéries/mL)
<tb> Concentration <SEP> ~~~~~~~~~ <SEP> ~~~~ <SEP> ~~~~ <SEP> ~~~~ <SEP> ~~~~ <SEP> ~~~~ <SEP> ~~~~
<tb> Ag <SEP> protéique
<tb> (ng/mL)
<tb>

<Desc/Clms Page number 33>

2. En tubes de 1 mL, introduire 800 L d'échantillon à analyser ou 800 L de standard (tube TO à Tn).

3. Ajouter 20 L de réactif 1.

4. Vortexer les tubes.

5. Placer les tubes 8 minutes sous agitation rotative (possibilité de réduire ce temps à 5 minutes à l'étude).

6. Ajouter 30 L de réactif 2.

7. Vortexer les tubes.

8. Placer les tubes 5 minutes sous agitation rotative.

9. Introduire 100 L de réactif 7.

10. Vortexer les tubes.

11. Incuber 1 minute à température ambiante (cette incubation d'1minute n'est pas forcément nécessaire)
12. Placer les tubes sur l'aimant pendant 2 minutes 30 secondes (possibilité de réduire ce temps à 2 minutes à l'étude).

13. Eliminer le milieu.

14. Ajouter 200 L de réactif 3.

15. Vortexer les tubes.

16. Incuber 10 minutes à température ambiante.

17. Ajouter 600 L de réactif 6.

18. Placer les tubes sur l'aimant pendant 2 minutes 30 secondes (possibilité de réduire ce temps à 2 minutes à l'étude).

19. Eliminer le milieu.

* 20. Ajouter 500 L de réactif 6.

21. Analyser en CMF.

Exemple 8: Détection et dosage d'une bactérie sur microsphères 15 m après isolement magnétique.

<Desc/Clms Page number 34>

But : Détecter et déterminer la concentration en B. globigii sur billes 15 m biotinylées et chargées par des AcP anti B. globigii.

Matériel et protocole : Ceux-ci correspondent aux exemples 6 et 7.

Echantillons analysés : dilutions de spores de B. globigii en réactif 1.

Concentrations en Ag de 160 000 - 80 000 - 40 000 - 20 000 -10 000 et 5 000 spores/mL.

Résultats :

<tb>
<tb> MFI <SEP> FL2 <SEP>
<tb> MFI <SEP> FL2 <SEP>
<tb> Spores/mL <SEP> (a. <SEP> u.) <SEP> corrigée
<tb> (a. <SEP> u.)
<tb> (a. <SEP> u.)
<tb> 160000 <SEP> 17,300 <SEP> 17,001
<tb> 80000 <SEP> 7,760 <SEP> 7,461
<tb> 40000 <SEP> 3,930 <SEP> 3,631
<tb> 20000 <SEP> 2,110 <SEP> 1,811
<tb> 10000 <SEP> 0,923 <SEP> 0,624 <SEP>
<tb> 5000 <SEP> 0,463 <SEP> 0,164
<tb> 0 <SEP> 0,299 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Voir Figure 9.

Exemple 9 : multiplex d'ovalbumine sur microsphères 4,4 m fluorescentes après isolement magnétique.

But : Détecter et déterminer la concentration en ovalbumine sur billes 4,4 m fluorescentes biotinylées et chargés par des AcP anti Ovalbumine.

Matériel et Protocole : le matériel et le protocole employés sont décrits dans les exemples 6 et 7.

Echantillons analysés : dilutions d'Ovalbumine en réactif 1. Concentration en Ovalbumine de 1,6 - 0,8 - 0,4 - 0,2 - 0,1 et 0,05 ng/mL.

Résultats :

<tb>
<tb> Ovalbumine <SEP> MFI <SEP> FL1 <SEP> MFI <SEP> FL1
<tb> (ng/mL) <SEP> (a.u.) <SEP> corrigée <SEP> (a. <SEP> u.)
<tb>

<Desc/Clms Page number 35>

<tb>
<tb> 1,60 <SEP> 4,940 <SEP> 4,76
<tb> 0,80 <SEP> 2,670 <SEP> 2,49
<tb> 0,40 <SEP> 1,400 <SEP> 1,22
<tb> 0,20 <SEP> 0,893 <SEP> 0,72
<tb> 0,10 <SEP> 0,483 <SEP> 0,31 <SEP>
<tb> 0,05 <SEP> 0,269 <SEP> 0,09
<tb> 0 <SEP> 0,177 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Exemple 10 : multiplex par cytométrie en flux appliquée à la génétique moléculaire pour la recherche de SNPs Test type OLA
1) Une sonde oligonucléotidique de capture, d'une taille comprise généralement entre 5 et 100 bases, spécifique pour un gène, est fixée par les méthodes chimiques sur une microphère de latex biotinylée (Iannone MA et al 2000; Cytometry 39:131-140).

L'étape de biotinylation de la microphère de latex peut aussi être réalisée après le couplage de la sonde de capture sur la microsphère. Dans un tube unique, les billes de latex sont incubées en présence des ferrofluides streptavidine (FF-SA), des sondes de révélation (Al et A2 dans l'exemple de la Figure 3) et des amplicons ou de l'ADN génomique extrait d'un échantillon biologique non amplifié préalablement par PCR ou des fragments dérivés de cet ADN non amplifiés préalablement par PCR. Les sondes A1 et A2 peuvent être soit des sondes fluorescentes différentes (par exemple Cy3 et Cy5) ou des haptènes distincts permettant une réaction immunologique ultérieure (par exemple avec deux anticorps marqués par des fluorochromes dissemblables [FITC vs PE]). Le multiplexage est obtenu par déclinaison du système de billes de latex qui peuvent être soit de tailles variables ou/et douées de caractéristiques de fluorescence distinctes.

2) Avec le même principe que celui énoncé dansl), un test peut être développé en ajoutant un degré de spécificité supplémentaire au niveau du greffage de la sonde de capture sur la microsphère de latex. Ce greffage peut être réalisé par l'intermédiaire d'un couple antigène-anticorps spécifique, d'un couple haptène-anticorps spécifique ou d'une sonde oligonucléotidique riche en G+C (Guanine, Cytosine). Dans ce troisième cas, une séquence oligonucléotidique riche en G+C fixée de manière covalente à la microsphère s'hybride avec une séquence complémentaire ajoutée en 5' de la sonde de capture (Figure

<Desc/Clms Page number 36>

4). De plus dans le cas de l'hybridation nucléotidique, le Tm (Melting Température) de la séquence nucléotidique d'ancrage sera idéalement supérieur à 60 C et/ou composé d'un polymère d'au moins 15 résidus de guanine ou de cytosine ou d'un mélange des deux bases nucléotidiques. Dans ces conditions, les hybridations et déshybridations (réalisées généralement entre 15 C et 40 C) du matériel génomique ou des amplicons capturés sont possibles sans pour autant déshybrider la sonde capture de la microsphère.

Claims (24)

1. Revendications 1. Procédé de détection et/ou de quantification multiplex d'analytes susceptibles d'êtres contenus dans un échantillon à l'aide de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdits analytes pouvant être le cas échéant préalablement marqués par un marqueur, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en présence dudit échantillon avec une suspension de populations de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdites microsphères portant à leur surface : pour toutes les populations de microsphères, un composé A formant un premier membre d'une paire de liaison, ledit composé A étant également caractérisé en ce qu'il ne peut pas se lier avec lesdits analytes, et pour chacune des populations de microsphères, un composé B, différent pour chaque population, capable de former une paire de liaison spécifique avec l'un desdits analytes de l'échantillon, b) l'addition au milieu réactionnel obtenu à l'étape a) d'un ferrofluide, lequel ferrofluide contient des particules magnétiques qui portent à leur surface un second membre de liaison capable de former une paire de liaison spécifique avec le composé A, c) au moins une étape de lavage par séparation magnétique des microsphères magnétisées à l'étape b), d) le cas échéant lorsque lesdits analytes ne sont pas préalablement marqués, la mise en présence de la suspension des microsphères magnétisées obtenues à l'étape c) avec une solution d'au moins un conjugué, ledit conjugué comprenant un composé C capable de reconnaître et de se lier spécifiquement avec l'un desdits analytes et un marqueur, cette étape d) étant suivie de préférence d'au moins une étape de lavage des microsphères par séparation magnétique, et, e) la détection et/ou la quantification dudit marqueur à la surface des microsphères.

   <Desc/Clms Page number 38>
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que deux au moins desdites populations de microsphères possèdent en outre au moins une caractéristique physique intrinsèque permettant de les différencier entre elles.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite paire de liaison formée entre le composé A et le second membre fixé à la surface des ferrofluides, est de préférence choisie au sein du groupe constitué par les paires de liaison spécifique de type biotine/avidine ou biotine/streptavidine, enzyme/cofacteur, lectine/carbohydrate et anticorps/haptène.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les microsphères sont dans un matériau choisi au sein du groupe constitué par le latex, un polymère, un copolymère, le verre ou la silice.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le ou les marqueurs utilisés sont fluorescents.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la détection et/ou la quantification dudit marqueur à l'étape e) du procédé est réalisée par cytométrie de flux.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite caractéristique physique intrinsèque permettant de différencier les au moins 2 populations de microsphères est la taille et/ou une propriété optique desdites microsphères.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les microsphères ont une taille comprise entre 0,3 et 100 m de diamètre.
9. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la propriété optique est la longueur d'onde d'émission et/ou l'intensité de la fluorescence desdites microsphères.
10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lesdits analytes sont de type protéique et dérivés, ou sont des acides nucléiques.
11. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que lesdits analytes sont des composés pouvant être présents soit en solution dans un liquide, soit présents à la surface d'une cellule ou d'une particule en suspension dans l'échantillon.
12. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que lesdits composés sont des toxines protéiques, ou en ce que ladite cellule ou particule est un microorganisme, tel qu'une bactérie ou un virus.

    <Desc/Clms Page number 39>
13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit composé B est choisi au sein du groupe constitué par les protéines et les acides nucléiques.
14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ledit composé C dudit conjugué utilisé à l'étape d) est choisi au sein du groupe constitué par les protéines et les acides nucléiques.
15. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que lesdits analytes sont des acides nucléiques et en ce qu'à l'étape a), le composé B est un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec l'un desdits analytes.
16. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que lesdits analytes sont des produits PCR.
17. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que lesdits produits PCR sont obtenus marqués.
18. 18. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ledit composé C dudit conjugué est un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec l'un desdits analytes.
19. 19. Utilisation du procédé selon la revendication 18 pour la détection et/ou la quantification multiplex de SNPs.
20. 20. Utilisation du procédé selon la revendication 19, caractérisée en ce que la détection et/ou la quantification multiplex de SNPs est réalisée par la méthode OLA.
21. 21. Kit pour la détection et/ou la quantification multiplex d'analytes susceptibles d'être contenus dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un réactif 1 comprenant une suspension de populations de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdites microsphères portant à leur surface: - un composé A formant un premier membre d'une paire de liaison ; - un composé B capable de former une liaison spécifique avec l'un desdits analytes de l'échantillon, et b) un réactif 2 comprenant un ferrofluide qui contient des particules magnétiques portant à leur surface un second membre de liaison capable de former une paire de liaison spécifique avec ledit composé A ;

    <Desc/Clms Page number 40>

    c) un réactif 3 comprenant une solution d'au moins un conjugué, ledit conjugué comprenant un composé C capable de réagir spécifiquement avec lesdits analytes et un marqueur capable d'être détecté.
22. 22. Kit selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : - un réactif 4 comprenant lesdits analytes susceptibles d'être contenus dans un échantillon.
23. 23. Kit selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : - un réactif 5 composé d'un tampon de dilution ; et - un réactif 6 composé d'un tampon de lavage.
24. 24. Kit selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : - un réactif 7 comprenant un tampon de neutralisation de l'agrégation des différentes microsphères.