EP3126832A1 - Contrôles pour la mise en oeuvre de procédés d'analyse multiplexe - Google Patents

Contrôles pour la mise en oeuvre de procédés d'analyse multiplexe

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Publication number
EP3126832A1
EP3126832A1 EP15716098.7A EP15716098A EP3126832A1 EP 3126832 A1 EP3126832 A1 EP 3126832A1 EP 15716098 A EP15716098 A EP 15716098A EP 3126832 A1 EP3126832 A1 EP 3126832A1
Authority
EP
European Patent Office
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sample
deposition
control
detection
ligand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP15716098.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christophe René Roger VÉDRINE
Nadine Marie Renée LAMBERT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bio Rad Europe GmbH
Original Assignee
Bio Rad Innovations SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Rad Innovations SAS filed Critical Bio Rad Innovations SAS
Publication of EP3126832A1 publication Critical patent/EP3126832A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the present invention relates to controls that can be used to secure the results of multiplex analysis methods comprising one or more steps.
  • a multiplex analysis method makes it possible to detect, simultaneously, the possible presence of several analytes within the same sample.
  • Multiplex analysis has several advantages, such as saving time by allowing multiple analytes to be analyzed at the same time, less consumption of reagents and consumables, and also less sample needed for analyte detection.
  • a classically used positive control consists of verifying the detection of a known compound used in a known quantity and which corresponds to an analyte whose possible presence is sought in a given sample.
  • this type of control makes it possible to validate only the overall implementation of the analysis method and does not make it possible to validate each step of the method.
  • WO2004 / 046685 uses controls to check the quality of reagents used in immunohistochemistry tests.
  • a control slide comprising a series of dilutions of different control compounds is used. Positive staining of the control slide at a control compound should be observed only if a specific antibody of said control compound or a reporter or substrate of said control compound is used during the immunolabeling process. This method of verifying the quality of the reagents requires the use of a large number of control compounds on the control slide.
  • the present invention is based on the demonstration by the inventors of control means making it possible to guarantee the reliability of the results obtained, by verifying that each step of a multiplex analysis method has proceeded correctly (and not by checking only one overall implementation of the process).
  • the inventors provide controls that make it possible to validate the deposition of the sample itself and more generally the different steps of the process.
  • the use of the controls according to the invention also makes it possible to identify potential faults existing during the implementation of the multiplex analysis method, and to modify, for example, the corresponding step or steps to improve the implementation of the analysis method.
  • the present invention also has the advantage of being simple to implement, requiring only a limited number of controls, by not adding additional steps to the analysis method and not requiring the use additional equipment (for example, not requiring the use of a spectrophotometer). Indeed, the steps of the analysis method are carried out in a single location (for example, the tube or well in which the sample is placed) and the controls, for example in the form of spots or beads, are treated in same time as the spots or beads used for the detection of analytes.
  • the first type of control according to the invention is the control of the deposit of a sample which makes it possible to check the deposit of the sample.
  • the check of the sample deposit also makes it possible to verify the deposition of one or more analyte detection ligands.
  • Deposit of the sample or an additive or “addition of the sample or additive” means the placing in the presence of the sample or at least one additive with compounds of interest fixed on a solid support.
  • At least one is meant in this application one or more, “several” meaning in particular two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen. , sixteen or more than sixteen.
  • a detection ligand By “deposition of a detection ligand, a reporter or a substrate” or “addition of a detection ligand, a protractor or a substrate”, it is meant to bring into the presence of a detection ligand, a reporter or a substrate with compounds of interest fixed on a solid support and any compounds attached to said compounds of interest.
  • the second type of control is the control of the deposition of an analyte detection ligand which makes it possible to verify the deposition of one or more detection ligands (for example a mixture of detection ligands) of analytes to be detected. in the sample. This control also validates the incubation and washing steps.
  • the third type of control is the control of the deposit of a protractor which makes it possible to verify that the step (s) of revelation proceeded correctly.
  • the control of the deposition of a reporter is useful in case of indirect labeling of the detection ligands.
  • controls according to the invention are particularly suitable for the implementation of micro-array multiplex analysis methods, for example on a solid support of the microplate type, or in a liquid chip, for example on a solid support of the type balls.
  • the sample to be analyzed is preferably a biological sample.
  • the biological sample may be a biological fluid, such as a blood sample, derived from blood (such as plasma or serum), urine, cerebrospinal fluid, saliva, or a tissue sample, such as tissue obtained by biopsy , a cell or a set of cells, a plant extract, or combinations thereof.
  • a biological fluid such as a blood sample, derived from blood (such as plasma or serum), urine, cerebrospinal fluid, saliva, or a tissue sample, such as tissue obtained by biopsy , a cell or a set of cells, a plant extract, or combinations thereof.
  • a blood derivative refers to any product, in particular fluid, obtained from a blood sample.
  • the sample to be analyzed may also be a culture medium and / or a culture supernatant.
  • the sample Before being analyzed, the sample may undergo one or more preliminary treatment steps, such as dilution, centrifugation, heat and / or chemical treatment, cell lysis (for example by one or more chaotropic agents, one or more reducing agents and / or by heating), extraction, PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction, addition of unlabeled detection ligand or combinations thereof.
  • the addition of an unlabeled detection ligand is particularly useful for the implementation of a neutralization test, which is in itself a test known to those skilled in the art.
  • the sample may also be a mixture of at least two samples that may be of the same kind or of a different nature.
  • mixture of samples of a different nature mention may be made of a mixture of blood and serum, a mixture of blood and plasma, a mixture of serum and plasma, or a mixture of blood, serum and plasma.
  • a preferred sample according to the invention is a sample or a mixture of blood and / or blood-derived samples.
  • An analyte to be detected in the sample may be any type of compound, natural or synthetic, that it is desired to detect and / or quantify in a sample.
  • An analyte may for example be a protein, a peptide, a glycoprotein, a carbohydrate, a lipid, a cell, an organelle, a virus or a nucleic acid.
  • the cell may be an animal cell, a plant cell, a bacterial cell, a metazoan cell, a yeast cell, a fungus cell, or a protozoan.
  • a nucleic acid denotes a polymer of nucleotides connected by phosphodiester bonds, such as a deoxyribonucleic acid (DNA), a ribonucleic acid (RNA) or an analogue thereof, such as phosphorothioates or thioesters, in single-stranded form or double strand.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • analogue thereof such as phosphorothioates or thioesters
  • An analyte or at least one of the analytes or the analytes is (are) for example selected from the group consisting of an antigen, an antibody, an antibody fragment, a hapten, a hormone, a hormone receptor, an enzyme or a nucleic acid.
  • the analyte (s) are not nucleic acids.
  • the analyte (s) is, for example, selected from the group consisting of an antigen, an antibody, an antibody fragment, a hapten, a hormone, a hormone receptor and an enzyme.
  • antigen is meant here a natural, recombinant or synthetic molecule recognized by antibodies or cells of the immune system and capable of generating an immune response when presented under conditions appropriate to the immune system of a host. It can be a molecule, in particular a polypeptide, comprising or consisting of at least one epitope that can be linear or conformational.
  • linear epitope denotes a polypeptide, in particular a peptide, comprising or consisting generally of 3 to 15, more generally 5 to 15 amino acids, and preferably at least 6, 8, 10 or 12 amino acids, capable of bind to a molecule of antibodies directed against said antigen.
  • formational epitope denotes a three-dimensional structure recognized by an antibody and determined by the juxtaposition of several amino acids in space, which may be non-contiguous in the peptide sequence of the protein (or polypeptide) against which this antibody is directed. antibodies, but which, because of the folding of the polypeptide chain, are found close to each other in space, and can thus form a motif that can be recognized by an antibody.
  • An antigen is, for example, a protein (in particular a native or recombinant protein), a peptide (for example a synthetic peptide), a glycoprotein, a carbohydrate or a lipid, said peptide possibly being associated or not with a carrier molecule, for example BSA (bovine serum albumin).
  • carrier molecule (also called “carrier molecule”) is meant especially in the present application a protein carrier molecule or carbohydrate.
  • a carrier molecule may be a natural or non-natural polypeptide (in particular a protein or a peptide) (for example a recombinant protein or a synthetic peptide), a functionalized polymer (of the dextran, polysaccharide or poly-lysine type) or a co-polymer. mixed polymer (in particular a co-polymer of different amino acids, for example a lysine-tyrosine co-polymer).
  • a carrier molecule may be an antibody (particularly a monoclonal antibody or a polyclonal antibody), for example an immunoglobulin.
  • An example of a carrier molecule is BSA.
  • the carrier molecule is not an antibody.
  • hapten is meant here a molecule of low molecular weight capable of being recognized by the immune system, but which is immunogenic only when coupled to a carrier molecule.
  • An analyte or at least one of the analytes is preferably a compound for diagnosing a condition of a subject, pathological or otherwise, or of diagnose the risks of developing a condition, pathological or not.
  • An example of a non-pathological condition is a pregnancy.
  • the subject may be a human, a non-human animal or a plant.
  • the non-human animal is preferably a mammal, such as a cat, dog, monkey, rabbit, mouse, rat.
  • man is used broadly and includes a man or woman of any age, such as an infant, a child, a teenager, an adult or an elderly person.
  • analyte or at least one analyte is an antigen
  • it is preferably an antigen for diagnosing an infection, for example an infection caused by a virus, bacteria, fungus or parasite.
  • analyte or at least one analyte is an antibody
  • it is preferably an antibody for diagnosing an infection, for example an infection caused by a virus, bacteria, fungus or parasite.
  • it may be one or more antigen (s) and / or one or more antibodies specific for:
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • HIV-1 or HIV-2 HIV-1 or HIV-2
  • HBV Hepatitis B Virus
  • HCV Hepatitis C Virus
  • HPV Hepatitis C Virus
  • ⁇ human papillomavirus ⁇ human papillomavirus
  • HTLV human T-lymphotropic virus
  • a parasite such as a parasite capable of causing Toxoplasmosis (in particular Toxoplasma gondii), Malaria (in particular a parasite of the genus Plasmodium, for example Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae or Plasmodium knowlesi) or Chagas disease (in particular Trypanosoma cruzi), in a human or a non-human animal, or
  • Toxoplasmosis in particular Toxoplasma gondii
  • Malaria in particular a parasite of the genus Plasmodium, for example Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae or Plasmodium knowlesi
  • Chagas disease in particular Trypanosoma cruzi
  • a bacterium such as a bacterium capable of causing syphilis (in particular Treponema pallidum) or Lyme disease (in particular a bacterium of the genus Borrelia), in a human or a non-human animal.
  • syphilis in particular Treponema pallidum
  • Lyme disease in particular a bacterium of the genus Borrelia
  • parasite is meant here a metazoan or protozoan parasitizing an organism and causing parasitosis.
  • a parasite within the meaning of the invention is therefore neither a virus, nor a bacterium, nor a fungus.
  • the analyte or at least one of the analytes may also be a marker of a disease, such as a marker of cardiovascular disease or a marker of diabetes, a marker of the course of a disease, such as hepatitis, a marker of the course of an infection caused by a virus, bacteria, fungus or parasite, a marker of resistance to treatment, for example antiviral treatment, antibiotic treatment or treatment against cancer.
  • a marker of a disease such as a marker of cardiovascular disease or a marker of diabetes
  • a marker of the course of a disease such as hepatitis
  • a marker of the course of an infection caused by a virus, bacteria, fungus or parasite such as hepatitis
  • a marker of the course of an infection caused by a virus, bacteria, fungus or parasite such as hepatitis
  • a marker of the course of an infection caused by a virus, bacteria, fungus or parasite such as hepatitis
  • analytes as described herein can be detected simultaneously in a sample during a multiplex analysis process. This can make it possible to diagnose, in the same sample, one or more infection (s) or disease (s), the evolution of an infection or disease, a condition (pathological or not), a risk of developing a condition (pathological or not) or a resistance marker to treatment in a subject.
  • the analytes detected during a multiplex analysis method may be of the same kind (for example, only antibodies or only antigens) or of a different nature (for example, at least one antigen and at least one antibody).
  • the analyte (s) to be detected are not labeled with a detection marker.
  • the analyte (s) to be detected are selected from an antibody and / or an antigen.
  • control compound is meant here a compound naturally present in the sample to be analyzed, preferably in a detectable concentration in all samples of the same kind.
  • the compound naturally present in the sample to be analyzed may be a compound initially present in the sample or a derivative of a compound initially present in the sample.
  • a derivative of a compound initially present in the sample can be obtained at the end of one or more steps of treatment of the sample prior to the analysis method. This or these steps are in particular as defined above, for example heat and / or chemical treatment, cell lysis, extraction, PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction, addition of an unlabeled detection ligand or combinations thereof.
  • a derivative of a compound present initially in the sample is, for example, a PCR product and / or a compound modified by a heat and / or chemical treatment, a cell lysis, the addition of a non-detection ligand. marked or their combinations.
  • a compound naturally present in the sample to be analyzed is a compound initially present in the sample.
  • the compound is therefore present before any prior step of processing the sample.
  • a naturally occurring compound in the sample to be analyzed does not include a compound present in the sample at the time of analysis but which has been added or is derived from a compound added to the sample during one or more pre-processing steps of the sample.
  • control compound is a compound naturally present in at least one of said samples, preferably in each sample of the mixture.
  • sample of the same kind means a sample of the same origin taken in substantially the same way from different subjects or from the same subject at different time intervals and, where appropriate, having undergone the same treatment step or steps.
  • a “detectable concentration” is a concentration for detecting the presence of a control compound in a test, including a sandwich-type immunoassay in which a control compound binds to a capture antibody bound to a solid support and is detected by a labeled detection antibody.
  • the concentration of a control compound varies little in samples of the same kind.
  • the concentration of a control compound varies little in samples of the same kind
  • concentration here means a concentration that varies from less than 60%, preferably less than 40%, more preferably less than 20% from one sample to another, the concentration being given in ⁇ g / mL.
  • a control compound is present in the sample in a concentration of the same order of magnitude as the concentration of the analyte (s) to be detected, when these analytes are present.
  • a control compound is present in the sample in a concentration of the same order of magnitude as the concentration of each of the analytes to be detected.
  • the concentration of a control compound is of the same order of magnitude as the concentration of an analyte to be assayed.
  • the concentration of the control compound is at most 5 decades less than or greater than that of said analyte to be assayed, when it is present in the sample, preferably at most 4 decades, more preferably at most 3 decades.
  • the concentration of a control compound is at most 100 ⁇ 9 ⁇ _, preferably at most 10 ⁇ 9 ⁇ _, more preferably at most 1 ⁇ 9 ⁇ _, for a concentration of an analyte to be assayed which would be 1 ng / ml.
  • the concentration of the control compound is of the same order of magnitude as the concentration of an analyte, when the difference between the concentration of the analyte in a sample to be analyzed which contains this analyte, and that of the control compound is at more than 5 decades, preferably at most 4 decades, more preferably at most 3 decades.
  • a control compound preferably has a conserved structure within the human or animal population considered for analysis.
  • a control compound does not exhibit polymorphism within the population of interest.
  • the control compound is preferably not a marker of a disease.
  • a control compound is preferably a detectable compound with an antibody.
  • control compound is preferably not denatured by the possible pre-treatment step (s) of the sample, so as to be detectable by an antibody.
  • the control compound can be a molecule, or a complex of at least two molecules, identical or different.
  • a control compound when the sample to be analyzed is a sample of blood or plasma, in particular human blood or human plasma, a control compound may be the transferrin soluble receptor complexed to transferrin, a hormone, by a steroid, a coagulation factor, for example a coagulation factor chosen from factor VIII, IX, X, XI, XII or XIII.
  • a control compound is not the factor
  • a control compound is not a type G immunoglobulin (IgG), in particular a human IgG, and / or is not an immunoglobulin type M (IgM), in particular a human IgM or, more generally, is not an immunoglobulin, in particular a human immunoglobulin.
  • IgG immunoglobulin
  • IgM immunoglobulin type M
  • the transferrin soluble receptor complexed to transferrin is a complex comprising two soluble transferrin receptor molecules and two transferrin molecules.
  • the transferrin soluble receptor complexed to transferrin is generally present in a concentration of 0.8 ⁇ g / mL to 4 ⁇ g / mL in test samples from a human subject, regardless of the subject's condition. .
  • control compound can vary, for example depending on the nature of the sample and / or the condition of the subject from which the sample is derived, it may be advantageous to use at least two different control compounds .
  • An additive is a compound or a set of compounds that is (are) not present in the sample, that is, that is (are) not initially present in the sample or which is (are) not derived from a compound initially present in the sample.
  • An additive may in particular be an antigen or a hapten, said antigen or said hapten possibly being coupled to a support molecule or not.
  • a compound or a compound which is not present in the sample to be analyzed is for example selected from the group consisting of digoxigenin, a plant hormone, an alkaloid , a plant steroid, a nucleic acid and a pesticide.
  • the additive is not a nucleic acid.
  • Digoxigenin is a steroid extracted from certain plants.
  • a pesticide is for example an insecticide, such as an organophosphorus or an organochlorine, a herbicide, such as a triazine or phenyl urea, or combinations thereof.
  • a preferred additive according to the invention is digoxigenin coupled to a carrier molecule, an auxin coupled to a support molecule, a triazine coupled to a support molecule, said support molecule being, for example, BSA.
  • a preferred additive according to the invention is digoxigenin coupled to BSA.
  • the additive does not interfere with the detection of analytes during the implementation of a multiplex analysis method.
  • the additive does not interfere with the analytes to be detected, the capture ligand or ligands used, the detection ligand or ligands used, the compound or compounds controls, if necessary the reporter (s), if appropriate the or substrates, and signal detection.
  • the additive does not comprise or consist of biotin or a biotin analogue and / or avidin or an avidin analogue (In particular streptavidin or neutravidin), said biotin, avidin or an analogue thereof being grafted or not onto a carrier molecule.
  • a capture ligand is a compound attached to a solid support, particularly at a spot or at the surface of a ball.
  • a capture ligand is preferably an antibody or antigen that is attached to the solid support, particularly at a spot or at the surface of a ball.
  • a capture ligand may be specific for an analyte to be detected in the sample, a control compound or an additive.
  • a capture ligand may be an antibody, an antigen, a peptide, a carbohydrate, a lipid or a nucleic acid.
  • the capture ligand is not a nucleic acid.
  • the capture ligand is selected from the group consisting of an antibody, an antigen, a peptide, a carbohydrate and a lipid.
  • a capture ligand is preferably an antibody or an antigen.
  • a capture ligand is an antibody, it is for example a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • a detection ligand is intended to reveal the presence of a compound of which it is specific.
  • a detection ligand can be an antibody, an antigen, a peptide, a carbohydrate, a lipid or a nucleic acid.
  • the detection ligand is not a nucleic acid.
  • the detection ligand is selected from the group consisting of an antibody, an antigen, a peptide, a carbohydrate and a lipid.
  • a detection ligand is preferably an antibody or an antigen.
  • a detection ligand is an antibody, it is for example a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • a detection ligand is preferably a labeled detection ligand, i.e. a ligand to which is attached a detection label (which may be for example biotin or a peroxidase), covalently or otherwise.
  • a detection ligand is not labeled, its detection can be achieved by using a labeled antibody specific for said detection ligand.
  • a detection ligand may be specific for an analyte to be detected in the sample, a control compound or an additive.
  • a detection ligand may be identical to the capture ligand or to one of the capture ligands used, with the exception of the possible presence of a detection marker, and / or to bind to the compound of which it is specific at the level of the same area as that bound by the capture ligand or one of the capture ligands. In this case, if said capture ligand and said detection ligand are antibodies, then it is a "homologous sandwich".
  • a capture ligand and the detection ligand or one of the detection ligands may be specific for distinct zones at the level of the compound of which they are specific, so as to avoid a competition of the capture ligand and the detection ligand with respect to of the compound of which they are specific, because of a steric hindrance.
  • said detection ligand and said capture ligand are antibodies, then it is a "heterologous sandwich".
  • a detection ligand and a capture ligand specific for the same compound do not bind at the same location on said compound. More preferably, said detection ligand binds to an area of said compound which is remote from the binding area with said capture ligand.
  • a detection ligand is identical to a capture ligand, except for the possible presence of a detection marker, and / or binds to the compound of which it is specific at the level of the same area as that bound by said capture ligand, when the compound of which it is specific is in the form of a complex having at least two identical binding areas.
  • a detection marker may be a direct marker or an indirect marker.
  • a direct marker is a marker whose signal can be detected directly, that is to say without requiring the prior addition of a protractor.
  • a direct marker is for example selected from the group consisting of a radioisotope, a fluorochrome and a heavy element of the periodic table, such as a lanthanide, a luminescent compound, a transition metal such as ruthenium, a chromogen and colored nanoparticles, fluorescent or luminescent.
  • a “luminescent compound” refers in particular in the present application to an electroluminescent, thermoluminescent or (preferably) chemiluminescent compound.
  • An example of a luminescent compound (more specifically a thermoluminescent compound) that can be used as a direct marker consists of silica nanoparticles comprising (for example doped or doped) doped molecules.
  • a dioxetane compound in particular the compound 1, 2-dioxetane, or a derivative of a dioxetane compound, for example a 1,2-dioxetane derivative.
  • An indirect marker is a marker whose signal detection requires the prior addition of a reporter, and optionally the addition of a marker substrate coupled to said reporter.
  • a reporter is a substrate of the indirect marker or a molecule specifically binding to the indirect marker, said molecule being itself a direct or indirect marker or itself being coupled to a direct or indirect marker.
  • An indirect marker may be for example an enzyme (in particular an enzyme producing a luminescent compound from a substrate), biotin, avidin, streptravidin, neutravidin, a hapten, an antigen or an antibody.
  • an enzyme in particular an enzyme producing a luminescent compound from a substrate
  • biotin avidin, streptravidin, neutravidin, a hapten, an antigen or an antibody.
  • a reporter of an enzyme is for example the substrate of said enzyme.
  • a reporter of a luminescent compound is for example an enzyme or a catalyst.
  • a reporter for biotin is, for example, avidin, streptavidin or neutravidin, preferably coupled to a direct label or an indirect label, such as an enzyme or a catalyst.
  • an enzyme is peroxidase, for example horseradish peroxidase
  • a preferred biotin reporter according to the invention is streptavidin coupled to a peroxidase, preferably horseradish peroxidase.
  • the detection marker or one of the detection markers used is or is substrate luminol (3-aminophthalhydrazide, also called 5-amino-2,3-dihydro-phthalazine-1, 4-dione, of formula C 8 H 7 N 3 O 2 ), isoluminol (also called 4-aminophthalhydrazide), an acridine compound, coelenterazine, dioxetane or peroxyoxalic, or a derivative thereof, and in particular a compound described in Pub. Publication / Gen C. et al (2000), Talanta 51, 415-439, Chemiluminescence as diagnostic tool. A review notes
  • the detection marker or one of the detection markers used has for substrate luminol, isoluminol or one of their derivatives.
  • a derivative of luminol or isoluminol is preferably a molecule obtained from luminol or isoluminol respectively, by any possible modification (s) (for example chemical and / or enzymatic) .
  • a derivative of luminol or isoluminol is in particular a substrate for a peroxidase enzyme, the reaction of said peroxidase enzyme with said luminol derivative or isoluminol for the production of a chemiluminescent compound.
  • a derivative of isoluminol may be, for example, aminoethylisoluminol (or AEI), aminoethylethylisoluminol (or AEEI), aminobutylisoluminol (or ABI), aminobutylethylisoluminol (or ABEI), aminopentylethylisoluminol (or APEI), aminohexylisoluminol (or AHI), aminohexylethylisoluminol (or AHEI), aminooctylmethylisoluminol (or AOMI) or aminooctylethylisoluminol (or AOEI), as described in the publication Dodeigne C. et al (2000), Talanta 51, 415-439, "Chemiluminescence as diagnostic tool. A review Wales Revelation
  • the step or steps of revealing corresponds (ent) to the detection of the signal produced by the detection marker or markers.
  • the "product signal” is in particular an "emitted signal”.
  • the step or steps of revealing depends on the type of marker used.
  • the signal produced or emitted by a direct fluorochrome type marker can be read directly in fluorescence.
  • An indirect marker of enzyme type, luminescent compound type or biotin type requires the addition of a reporter.
  • an indirect marker of biotin type requires the addition of a reporter, preferably a reporter coupled to a marker.
  • a reporter is coupled to an indirect marker, for example an enzyme
  • an indirect marker for example an enzyme
  • a reporter is coupled to peroxidase, it is necessary to add in a subsequent step a substrate of this enzyme, such as luminol.
  • a signal is detected in chemiluminescence, said signal being produced by a chemiluminescent compound produced by the reaction of a peroxidase enzyme with its substrate, for example luminol, isoluminol and / or a luminol derivative. or isoluminol.
  • a peroxidase enzyme with its substrate
  • luminol for example luminol, isoluminol and / or a luminol derivative. or isoluminol.
  • This reaction of a peroxidase enzyme with its The substrate generally also requires the presence of an oxidant and, where appropriate, an electron mediator.
  • the chemiluminescence reaction is carried out by means of a kit comprising at least two solutions.
  • the first solution comprises the peroxidase substrate, for example luminol, isoluminol and / or a derivative of luminol or isoluminol, and an electron mediator;
  • the second solution comprises an oxidant.
  • the "Immun-star western C” kit Bio-Rad, United States
  • "ELISTAR ETA C Ultra ELISA” Cyanagen, Italy
  • Supersignal West Pico Thermo Scientific, USA
  • Chemiluminescent Sensitive Plus HRP (Surmodics, USA).
  • the support or supports used for the implementation of the analysis method according to the invention are solid supports.
  • a solid support may be in any material suitable for carrying out the analysis method.
  • a solid support is for example a support based on a polymer or a mixture of polymers.
  • a suitable solid support according to the invention is, for example, a support of polystyrene, polypropylene, poly (meth) acrylate, polybutadiene or combinations thereof.
  • suitable solid support is, for example, an inorganic support, such as glass, and / or a metal support.
  • a support may be in the form of a plate, a microplate, a blade, beads, a membrane.
  • a suitable solid support is a membrane, for example a nitrocellulose membrane, PVDF (polyvinylidene fluoride), nylon or combinations thereof.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • a preferred solid support is polystyrene or polypropylene.
  • the multiplex analysis method may be carried out using a single solid support, for example a solid support comprising at least one compartment, said compartment comprising at least two spots, or on a set of solid supports for example a set of balls.
  • the controls according to the invention are transposable to use on a single solid support or on a set of solid supports.
  • the controls and the means for detecting the analytes are in the form of spots and in the second case, the controls and the means for detecting the analytes are in the form of beads.
  • the beads may be in solution or suspension or fixed on another solid support, for example a plate, a microplate, a slide, or a membrane , and in particular fixed to the bottom of one or more wells of a solid support (for example a microplate).
  • a sample deposition check is called a spot to check the deposit of a sample or ball to check the deposit of a sample;
  • a control of the deposition of one or more analyte detection ligand (s) is called a spot to control the deposition of an analyte or bead detection ligand to control the deposition of a detection ligand of an analyte an analyte;
  • a deposit check of a reporter is called a spot to control the deposit of a protractor or ball to control the deposition of a protractor.
  • the one or more solid supports are suitable for carrying out a multiplex analysis in the form of a sandwich type immunoassay.
  • a solid support according to the invention also has the advantage of being able to detect analytes independently of the matrix of the sample.
  • the detection of analytes present in the blood can be implemented by means of a solid support according to the invention from a blood sample or a blood derivative, such as plasma or serum, or a mixture of blood samples and / or blood derivatives.
  • Solid support suitable for secure multiplex analysis on spots can be implemented by means of a solid support according to the invention from a blood sample or a blood derivative, such as plasma or serum, or a mixture of blood samples and / or blood derivatives.
  • the subject of the present invention is particularly a solid support suitable for multiplex analysis of at least one sample, comprising at least one compartment, said compartment comprising at least one control spot and at least two detection spots of an analyte, characterized in that that said control spot is selected from the group consisting of a spot to control the deposition of a sample, a spot to control the deposition of an analyte detection ligand and a spot to control the deposition of a reporter .
  • a solid support comprises at least one compartment (also called zone of analysis), preferably at least two compartments.
  • a solid support comprises a single compartment.
  • Said single compartment may be a compartment comprising one or more walls.
  • said single compartment may be devoid of walls, and then assimilate to the solid support itself.
  • the bottom of the compartment can then consist of the upper face of the solid support.
  • An example of such a solid support comprising a single compartment with or without one or more walls is a blade or a membrane.
  • a solid support for example a slide or a membrane
  • a single compartment typically at least one (for example one or two) solid support is used per sample to be analyzed.
  • a solid support comprises at least two compartments, they are isolated from each other, so that they do not communicate with each other, that is to say so that the different compositions or solutions used for the analysis can not move from one compartment to another during the analysis.
  • an added solution in one compartment does not go into the other compartments.
  • the compartment or compartments comprise or consist of a bottom and one or more walls, the said wall or walls isolating the compartment or compartments from each other so that they do not communicate with each other.
  • a compartment of the solid support is used per sample to be analyzed.
  • An example of a compartment is a well.
  • a solid support is for example a microplate.
  • the microplate is typically a 96-well or 384-well microplate.
  • a compartment of the support used to analyze a sample comprises at least three spots, for example three spots, four spots or five spots, or at least six spots, preferably six spots, seven spots, eight spots, more preferably at least nine spots, for example, nine spots, ten spots, eleven spots, twelve spots, thirteen spots, fourteen spots, fifteen spots, sixteen spots or more than sixteen spots.
  • spot is meant here an area of a compartment of a solid support comprising at least one compound of interest linked to the surface of said compartment, in particular by non-covalent physicochemical interactions (in particular of the weak link type type). for example, ionic, van der Waals, hydrogen and / or hydrophobic) and / or by covalent bonds.
  • a spot may comprise, in addition to the compound (s) of interest, at least one polymer, in particular at least one polymer comprising hydrophilic groups, for example at least one hydrogel.
  • at least is meant in this application one or more, “several” meaning in particular two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, sixteen or more than sixteen.
  • a spot corresponds to a well-defined zone, generally of spherical or oval shape and of small size, for example ranging from 0.0078 mm 2 to 5.309 mm 2 , preferably from 0.196 mm 2 to 3.142 mm 2 , more preferably from 0.503. mm 2 to 2.01 1 mm 2 .
  • a spot may be discoidal, cylindrical or approximately discoidal or cylindrical, for example oval, in particular when a solid support is a microplate or a blade.
  • a spot may be square or rectangular (this may be in particular a band), for example when a solid support is a membrane, or any other form.
  • spots are obtained by techniques well known to those skilled in the art, such as those disclosed in patents US 7,470,547 B2, US 6,576,295 B2, US 5,916,524 A and US 5 743960 A.
  • a spot is obtained by depositing at least one drop of a solution containing a determined amount of said compound (s) of interest at a specific location on the surface of the compartment.
  • a spot comprises at least one polymer (for example at least one hydrogel)
  • said spot can be obtained by depositing at least one drop of a solution containing a determined quantity of said compound (s) of interest at a specific location on the surface of the compartment on which said polymer has been deposited beforehand.
  • a spot can also be obtained by in situ synthesis of said compound (s) of interest at a specific location on the surface of the compartment.
  • Said compound (s) of interest are in this case qualified probe. It may be a nucleic acid or a peptide (see for example US 5,143,854).
  • the surface of the compartment is also called "solid phase”.
  • a compound of interest is generally a capture ligand, a carrier molecule coupled to an indirect marker or an indirect marker.
  • the capture ligand, the carrier molecule coupled to an indirect marker and the indirect marker are in particular as defined above.
  • each compartment of a solid support comprises the same number of spots.
  • each compartment of a solid support may comprise the same number of spots and the same spot composition.
  • a support may comprise one or more compartments without spot, or with a number and / or a different spot composition (s).
  • Part or all of a support may for example comprise at least two distinct groups (or types) of spots or compartments, each of the distinct groups having a different number and / or spot composition (s).
  • a compartment comprises at least one control spot (for example at least one spot for monitoring the deposition of a sample), preferably at least two control spots, and at least two detection spots of an analyte.
  • a compartment generally comprises at least one spot per analyte to be detected, each analyte can for example correspond to an infection or a disease to be detected, to the evolution of an infection or disease, to a condition (pathological or not) of a subject, to a risk of developing a condition (pathological or not) or to a marker of resistance to a treatment.
  • spots of a compartment may also be intended for the analysis of the same analyte.
  • the spot for controlling the deposition of a sample or for controlling the deposition of an analyte detection ligand preferably comprises a capture ligand.
  • the capture ligand is in particular as defined above.
  • the same spot can comprise several different capture ligands (for example several antibodies and / or antigens), which are generally specific for the same infection or disease to be detected (in particular specific for the same virus, the same bacterium or of the same parasite), or specific of the same evolution of an infection or disease, the same condition (pathological or not) of a subject, the same risk of developing a condition (pathological or not) or the same resistance marker to a treatment.
  • capture ligands for example several antibodies and / or antigens
  • the subject of the present invention is particularly a solid support suitable for multiplex analysis of at least one sample, comprising at least one compartment, said compartment comprising at least one control spot and at least two detection spots of an analyte, characterized in that said spot control is a spot for controlling the deposition of a sample or a spot to control the deposition of an analyte detection ligand.
  • Said compartment may further comprise at least one spot for controlling the deposit of a protractor.
  • the spot for controlling the deposition of a sample or for controlling the deposition of an analyte detection ligand comprises a or at least one capture ligand, the capture ligand or ligands not being a nucleic acid.
  • the spot for controlling the deposition of a sample or for controlling the deposition of an analyte detection ligand preferably does not comprise nucleic acid.
  • the spot for monitoring the deposition of a sample or for monitoring the deposition of an analyte detection ligand comprises one or at least one capture ligand selected from the group consisting of an antibody, an antigen, a peptide, a carbohydrate and a lipid.
  • the subject of the present invention is particularly a solid support suitable for multiplex analysis of at least one sample, comprising at least one compartment, said compartment comprising at least two control spots and at least two detection spots of an analyte, characterized in that said control spots are selected from the group consisting of a spot to control the deposition of a sample, a spot to control the deposition of an analyte detection ligand and a spot to control the deposition of a protractor .
  • a solid support according to the invention allows a secure multiplex analysis.
  • the subject of the present invention is a solid support suitable for multiplex analysis of at least one sample, comprising at least one compartment, said compartment comprising at least two control spots and at least two detection spots.
  • an analyte characterized in that said control spots are selected from a spot to control the deposition of a sample and a spot to control the deposition of an analyte detection ligand.
  • the compartment or compartments of the solid support may for example comprise at least two spots for controlling the deposition of a sample or at least two spots for controlling the deposition of an analyte detection ligand.
  • the solid support compartment or compartments comprise at least one spot for monitoring the deposition of a sample and at least one spot for controlling the deposition of an analyte detection ligand.
  • the compartment or compartments comprise at least one spot for monitoring the deposition of a protractor.
  • the present invention also relates to a solid support suitable for multiplex analysis of at least one sample, comprising at least one compartment, said compartment comprising at least one spot for controlling the deposition of a sample, at least one spot for controlling the deposition of an analyte detection ligand, at least a spot for controlling the deposition of a reporter, and at least two detection spots of an analyte.
  • the compartment or compartments of the solid support may therefore comprise several spots for controlling the deposition of a reporter, for example two or three spots to control the deposition of a reporter, for analyzes involving at least two different indirect markers.
  • each spot to control the deposition of a reporter is specific to a marker.
  • the multiplexed analysis method of a sample is made with a set of beads.
  • the present invention thus also relates to a set of beads suitable for multiplex analysis of a sample, comprising at least one control ball and at least two analyte detection beads, characterized in that the control ball is selected from the group consisting of a ball to control the deposition of a sample, a ball to control the deposition of an analyte detection ligand and a ball to control the deposition of a protractor.
  • At least one ball X is meant, in the present application, at least one ball X or at least one type (or group) of beads X, “ball X” may mean “ball control”, “ball to control depositing a sample ",” ball to control the deposition of an analyte detection ligand “or” ball to control the deposition of a protractor ".
  • a “type of ball” within the meaning of the invention comprises or consists of several balls (for example 10, 50, 100, 200, 300 or 500 balls), which are identical to one another or to one another. less in several balls on the surface of which are fixed the same or the compounds of interest.
  • At least two balls X is meant, in the present application, respectively, at least two balls X or at least two types (or “groups”) distinct balls X
  • ball X may mean “Ball control”, “ball of detection of an analyte”, “ball to control the deposit of a sample”, “ball to control the deposit of an analyte detection ligand” or “ball to control the tabling of a rapporteur ".
  • Each ball is also covered with at least one compound of interest linked to the surface of the ball, also called “solid phase”.
  • a set of beads used to analyze a sample comprises at least three beads (or types of beads), for example three, four or five beads (or types of beads), or at least six beads (or types of beads), preferably six, seven, eight balls (or types of beads), more preferably at least nine balls (or types of balls), for example nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen or sixteen balls (or types of balls), or more than sixteen balls (or types of marbles).
  • ball By “ball”, “particle”, “microbead” or “microparticle” is meant in the present application any particle, preferably of spherical or approximately spherical shape, of size ranging from 0.3 ⁇ to 100 ⁇ in diameter , preferably from 0.5 ⁇ to 40 ⁇ . Such particles are manufactured for example by Luminex, Merck and Dynal.
  • a ball that can be used in the context of the present invention can also be a particle in the form of a cube or block or approximately in the shape of a cube or block, the length of the sides of which would be, for example, from 0.3 ⁇ to 100. ⁇ , preferably from 0.5 ⁇ to 40 ⁇ .
  • a ball according to the invention is preferably composed of one or more inert polymers with respect to the constituents of the biological samples; it is solid and insoluble in the samples to be analyzed.
  • inert polymer examples include a polyester, polyether, polyolefin, polyamide, polysaccharide, polyurethane or cellulose.
  • One or more functional groups may be incorporated with the at least one inert polymer to allow attachment or coupling of one or more compounds of interest (e.g., proteins, peptides, glycoproteins, lipids, carbohydrates, or nucleic acids).
  • compounds of interest e.g., proteins, peptides, glycoproteins, lipids, carbohydrates, or nucleic acids.
  • These functional groups can be selected from the group consisting of amine (-NH2) or ammonium (-NH3 + or -NHR) functions, where R represents an aliphatic chain, preferably a chain:
  • alcoholic functions (-OH), carboxylic functions (-COOH), isocyanate functions (-NCO), thiol functions (SH) or epoxy functions.
  • the monomers most commonly used to introduce carboxylic functions -COOH into polyolefins are acrylic acid or methacrylic acid.
  • a ball is indeed coated with one or more compounds of interest, using any suitable method well known to those skilled in the art.
  • the binding of the compound or compounds of interest on the surface of a ball can be done by electrostatic attraction, affinity interaction, hydrophobic interaction and / or covalent coupling.
  • the compound (s) of interest are attached to the surface of the ball by covalent coupling.
  • a bead comprising carboxyl-surface chemical functions
  • these chemical functions can be converted into an activated ester form by reaction with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride and the N-hrydroxysulfosuccinimide.
  • a compound of interest such as an antibody, a protein or a peptide, can then be grafted, by a free amino group present on said compound of interest, onto the activated ester groups of each bead.
  • the conversion to an activated ester form and the coupling of the compound of interest on a ball are carried out according to procedures that are well known to those skilled in the art (see, for example, US Pat. No. 7,141,362).
  • the beads or a portion of the beads of a bead set are preferably magnetic beads, such as beads from the Luminex xMAP ® technology, to allow recovery of the balls between the individual process steps, in particular the after the washing steps.
  • Each ball is marked with a code so as to be able to differentiate it from the other balls of the set of balls, for example by a fluorescence code or a barcode.
  • the marking of a ball with a code can be achieved by any appropriate method well known to those skilled in the art, for example as described in documents EP 1 802 710 and EP 1 049 807.
  • a compound of interest is generally a capture ligand, a carrier molecule coupled to an indirect marker, or an indirect marker.
  • the capture ligand, the carrier molecule coupled to an indirect marker and the indirect marker are in particular as defined above.
  • the set of beads according to the invention comprises a ball (or a type of bead) for the desired control and at least one bead (or at least one type of bead) per analyte to be detected.
  • a ball or a type of bead
  • the ball for controlling the deposition of a sample or for controlling the deposition of an analyte detection ligand preferably comprises a capture ligand.
  • the capture ligand is in particular as defined above.
  • the same bead (or each bead of a given type of bead) may be covered with several different capture ligands (for example several antibodies and / or antigens), which are generally specific for the same infection to be detected, and in particular of the same virus, the same bacterium or the same parasite.
  • capture ligands for example several antibodies and / or antigens
  • the set of beads therefore comprises at least one control ball (for example at least one ball to control the deposition of a sample), preferably at least two control beads, and at least two analyte detection beads.
  • At least one set of beads is used per sample to be analyzed.
  • the present invention particularly relates to a set of beads suitable for multiplex analysis of at least one sample, comprising at least one control ball and at least two analyte detection beads, characterized in that said control ball is a ball to control the deposition of a sample or ball to control the deposition of an analyte detection ligand.
  • Said set of beads may further comprise at least one ball for controlling the deposition of a protractor.
  • the ball for controlling the deposition of a sample or for controlling the deposition of an analyte detection ligand comprises one or at least one capture ligand, the one or more capture ligands being not a nucleic acid.
  • the ball for controlling the deposition of a sample or for controlling the deposition of an analyte detection ligand preferably does not comprise nucleic acid.
  • the ball for monitoring the deposition of a sample or for controlling the deposition of an analyte detection ligand comprises one or at least one capture ligand selected from the group consisting of an antibody, an antigen, a peptide, a carbohydrate and a lipid.
  • the present invention particularly relates to a set of beads suitable for multiplex analysis of a sample, comprising at least two control beads and at least two analyte detection beads, characterized in that said control beads are selected in the group consisting of a ball to control the deposition of a sample, a ball to control the deposition of an analyte detection ligand and a ball to control the deposition of a protractor.
  • the subject of the present invention is a set of beads suitable for multiplex analysis of a sample, comprising at least two control beads and at least two analyte detection beads, characterized in that said control beads are selected from a ball to control the deposition of a sample and a ball to control the deposition of a detection ligand an analyte.
  • the set of beads may, for example, comprise at least two beads to control the deposition of a sample or at least two beads to control the deposition of an analyte detection ligand.
  • the set of beads comprises at least one ball for monitoring the deposition of a sample and at least one ball for controlling the deposition of an analyte detection ligand.
  • the present invention also relates to a set of beads suitable for multiplex analysis of a sample, comprising at least one ball for monitoring the deposition of a sample, at least one ball for controlling the deposition of a detection ligand. an analyte, at least one bead for monitoring the deposition of a reporter and at least two analyte detection beads.
  • the set of beads may therefore comprise at least two beads to control the deposition of a reporter, for example two or three beads to control the deposition of a reporter, for analyzes involving at least two different indirect markers.
  • each ball to control the deposition of a reporter is preferably marker specific.
  • the set of balls according to the invention allows a secure multiplex analysis.
  • the control of the deposit of a sample makes it possible to check the placing in the presence of the sample with the spots of a compartment of the solid support or with a set of balls.
  • the control of the deposition of a sample comprises at least one capture ligand, in particular an antibody or an antigen, specific for a control compound naturally present in the sample to be analyzed.
  • the control compound is in particular as defined above.
  • a signal detected in the control of the deposition of a sample makes it possible to validate the step of depositing the sample.
  • the deposition of a sample consists in adding the sample to be analyzed into a compartment of the solid support according to the invention comprising at least one control spot and at least two analyte detection spots or to bring the sample in contact with the sample. least one set of balls according to the invention.
  • a control compound then binds to the capture ligand at the sample deposition control.
  • a control compound thus fixed can be detected by a specific detection ligand of the control compound.
  • a control compound detection ligand is specific for a zone of the control compound remote from the region of the control compound to which the capture ligand used specifically binds, so as to avoid competition of the capture ligand and detection ligand to the control compound due to steric hindrance.
  • the detection ligand or one of the detection ligands may be specific for one of the two molecules and the capture ligand or one of the specific capture ligands of the other molecule of the complex.
  • the detection ligand or one of the detection ligands and the capture ligand or one of the capture ligands may be specific for the same molecule, and even the same region of this molecule, when the complex comprises at least two of these identical molecules, thus allowing the simultaneous binding of the detection antibody and the capture antibody on the complex.
  • a depot control may comprise, as a capture ligand, an antibody specific for either transferrin or soluble transferrin receptor.
  • the ligand or one of the capture ligands is an antibody specific for the transferrin soluble receptor, in order to avoid interference with free transferrin that may be present in a blood sample.
  • the ligand or one of the deposition control capture ligands is specific for the soluble transferrin receptor and the detection ligand or one of the control or control compound detection ligands is either specific to the transferrin, which is specific for the soluble receptor of transferrin.
  • control of the deposition of a sample also makes it possible to verify that one or more analyte detection ligands have been brought into contact with the spots of a compartment of a solid support or with an assembly.
  • said analyte detection ligand or ligands are not added in same time as the sample to be analyzed, but for example at a later stage, simultaneously with the addition of the detection ligand (s) of the control compound.
  • the control compound detection ligand or ligands it is generally meant that the said analyte detection ligand or ligands are added in the form of a solution comprising the said analyte detection ligand (s). and the detection ligand (s) of the control compound.
  • said one or more analyte detection ligands and said one or more control compound detection ligands may be added in the same step but as separate solutions.
  • a sample to be analyzed comprises a compound that could interfere with the detection ligand of the control compound
  • sample in particular after the step of depositing the sample followed by at least one washing step.
  • all or part of the analyte detection ligands can be added at the same time as the detection ligand of the control compound.
  • the deposition control then also makes it possible to validate the placing in the presence of these analyte detection ligands with the spots of a compartment of the solid support or with the set of beads.
  • a blood sample includes both transferrin-soluble receptor complexed with transferrin and free transferrin, i.e. unrelated to the receptor.
  • the ligand or one of the detection ligands is a transferrin-specific antibody and is added at the same time as the sample, it may partially bind to free transferrin and the detection of the control compound would be distorted.
  • said detection ligand of the control compound is brought in a subsequent step, that is to say after the step of depositing the sample followed by at least one washing step.
  • the sample deposition control or controls do not include a factor XIII-specific antibody (ie neither an antibody specific for the tetrameric form, nor a specific antibody for a factor XIII subunit). ).
  • the sample deposition control or controls do not include a factor XIII-specific capture ligand (ie, neither a tetramerically specific capture ligand, nor a specific subunit capture ligand). factor XIII).
  • the sample deposition control or controls do not comprise a specific capture ligand (in particular a specific antibody) of an IgG, an IgM or more generally an immunoglobulin (in particular particularly human IgG, human IgM or human immunoglobulin). It may be advantageous to use at least two controls for the deposition of a sample, these controls detecting different control compounds and / or the same control compound but with different sensitivities, for example when the concentration of the control compound can vary, for example example depending on the nature of the sample and / or the condition of the subject from which the sample originated.
  • the control of the deposition of an analyte detection ligand makes it possible to verify the placing in the presence of one or more analyte detection ligands deposited simultaneously with the detection ligand of an additive and / or of one or more analyte detection ligands deposited simultaneously with an additive, with the spots of a compartment of a solid support or with a set of beads.
  • deposited simultaneously with the additive detection ligand is generally meant that said one or more analyte detection ligands are added in the form of a solution comprising said analyte detection ligand (s) and the one or more detection ligands of an additive.
  • said one or more analyte detection ligands and / or additive detection ligand (s) may be added at the same step but as separate solutions.
  • “Simultaneously deposited with an additive” generally means that said one or more analyte detection ligands are added in the form of a solution comprising said analyte detection ligand (s) and an additive. Alternatively said one or more analyte detection ligands and / or additive (s) may be added at the same step but as separate solutions.
  • the control of the deposition of an analyte detection ligand also makes it possible to verify the incubation and washing steps.
  • concentration of the additive placed in the presence of the spots of a compartment of the solid support or of a set of balls is known, a variation of the detected signal makes it possible to identify a deficiency of the process in the steps of the process , and in particular incubation and washing steps. This can in particular make it possible to avoid "false positives" resulting from incubation steps and / or deficient washing steps, that is to say unrealized or poorly performed steps.
  • a "false positive” is a positive result reflecting the presence of one or more analytes to be detected in a sample, while said one or more analytes were not present in the sample and thus should not have been detected.
  • the control of the deposition of an analyte detection ligand comprises at least one capture ligand specific for an additive that is not present in the sample to be analyzed and that is used during the implementation of the method multiplexed analysis.
  • An additive is in particular as defined above.
  • a signal detected at the level of the control of the deposition of an analyte detection ligand makes it possible to validate the deposition step of the analyte detection ligand (s) deposited at the same time as the detection ligand of a additive.
  • An additive placed in the presence of spots and / or a set of beads binds to the capture ligand at the level of the control of the deposition of an analyte detection ligand.
  • An additive thus fixed can be detected by a specific detection ligand of said additive.
  • a process control capture ligand may be an antibody specific for digoxigenin.
  • a ligand for detecting an additive is also an antibody specific for digoxigenin.
  • analyte detection ligand deposition controls may be advantageous to use several different analyte detection ligand deposition controls and therefore as many different additives, for example if the analyte detection ligands are added at several different stages, especially during at least three different steps.
  • control compound which binds to a capture ligand of a sample deposition control during the implementation of the analysis method of the invention is detected by a specific detection ligand of said control compound ( immunological sandwich type), and
  • an additive which binds to a capture ligand of a control of the deposition of an analyte detection ligand during the implementation of the analysis method is detected by a specific detection ligand of said additive (format immunological sandwich type).
  • sandwich-type immunological formats make it possible to achieve a high level of specificity and / or sensitivity, in comparison with other immunological formats and in particular indirect formats.
  • control of the deposition of a protractor makes it possible to verify the placing in the presence of a detection marker reporter with the spots of a compartment of a solid support or with a set of balls.
  • Control of the deposition of a reporter is of interest only in case of indirect labeling of at least one analyte detection ligand.
  • the control of the deposition of a reporter comprises an indirect marker or a carrier molecule coupled to an indirect marker.
  • the indirect marker of the control of the deposition of a reporter is identical to the indirect marker coupled to at least one analyte detection ligand.
  • a single and same indirect marker is used for labeling the detection ligand or ligands, and therefore only one control of the deposition of a reporter can be used.
  • a signal detected at the level of the control of the deposition of a reporter makes it possible to validate the step of depositing the reporter of the corresponding detection marker.
  • the reporter thus binds to the detection marker at the level of the control of the deposition of a reporter and a signal is obtained, if necessary after adding a marker substrate of said reporter, in case of control of the deposition of a positive reporter.
  • control of reporter deposition includes biotin or a carrier molecule coupled to biotin.
  • the subject of the present invention is thus a multiplex analysis method for detecting at least n analytes in at least one sample, n being an integer greater than or equal to 2, said method comprising at least steps a), c ) and e), at least steps a), c) and f) or at least the following steps a), b), c) and d):
  • I detection ligands of p analytes to be detected and, where appropriate, at least one additive, I being preferably greater than or equal to p,
  • step f optionally, in particular when said or one of said reporters of step f is coupled to a marker, in particular to an indirect marker (for example an enzyme), putting at least a second reporter of said marker coupled to the reporter of the step f) (for example a substrate, such as luminol, isoluminol or a derivative thereof) in the presence of the spots of said compartment or said set of beads,
  • a marker in particular to an indirect marker (for example an enzyme)
  • putting at least a second reporter of said marker coupled to the reporter of the step f) for example a substrate, such as luminol, isoluminol or a derivative thereof
  • I, ⁇ , I ", m, p and y being integers greater than or equal to 0 and the sum m + p + y being greater than or equal to 1.
  • a method for detecting at least n analytes may include detecting a number of different analytes that is less than n when at least two analytes to be detected are identical. For example, at least two spots of a compartment of a solid support or at least two balls (or types of beads) of a set of beads are intended for the detection of the same analyte.
  • the number "n” is generally equal to the number of detection spots of an analyte of a compartment of a solid support or the number of beads (or types of beads) for detecting an analyte of a set of beads .
  • the sum m + p + y is from 1 to n.
  • the sum m + p + y is equal to n, for example when there are an analyte detection spots in a compartment of a solid support or n balls (or types of beads) for detecting an analyte of a set of balls.
  • steps a) to e) can be performed simultaneously and / or successively (for example, some of these steps can be performed simultaneously while others are performed successively), at least for two of them in the order a) to e) or in another order, step a) always being the first step performed; when the process comprising step f) and possibly step g), these steps are always carried out subsequently to steps a) to e).
  • a solid support comprises at least one compartment, said compartment comprising at least one spot for controlling the deposition of a sample, or a set of beads comprises at least one a ball to control the deposit of a sample.
  • a solid support comprises at least one compartment, said compartment comprising at least one spot for controlling the deposition of a protractor, or a set of beads comprises at least a ball to control the deposit of a protractor.
  • step d) preferably comprises bringing the spots or the set of beads into contact with at least one ligand for detecting said additive (s)
  • a solid support comprises at least one compartment, said compartment comprising at least one spot for controlling the deposition of a detection ligand an analyte, or a set of beads comprises at least one ball for controlling the deposition of an analyte detection ligand.
  • step e At least one additive is brought into contact with the spots or the set of beads in step b ) and at least one detection ligand of said additive or additives is brought into contact with the spots or the set of beads in step d).
  • the expression "put compound X in the presence of a set of beads” means that compound X is brought into contact with at least one set of beads for analyzing a sample in any suitable container containing said set of beads.
  • a suitable container is a microtube, a microplate or a reaction vessel.
  • the or the compounds X can be put separately in the presence of the spot or spots of a compartment or the ball or beads or sets of beads for analyzing a sample, that is to say in the form of separate compositions.
  • these compounds X or some of these compounds X may be placed in the presence of the spot or spots of a compartment or the ball or beads or sets of beads for analyzing a sample in the form of one or more mixtures.
  • the different compounds are placed in the presence of the spots of each compartment or of each set of beads for a certain duration, for example from 1 second to 2 hours, preferably 1 minute to 1 hour, more preferably 5 minutes to 50 minutes, more preferably still 10 minutes to 40 minutes.
  • the temperature of an incubation may for example be 4 ° C, a temperature of 19 ° C to 24 ° C, 37 ° C or 40 ° C.
  • steps b), d), e), f) and g) are well known to those skilled in the art. They allow for example the formation of antigen-antibody complexes, marker-reporter.
  • Step a) consists in providing a solid support as defined above comprising at least one compartment or at least one set of balls as defined above.
  • Step a) means in particular that the multiplex analysis method is implemented by means of said solid support or said set of balls, that is to say by using said solid support or said set of balls.
  • the multiplex analysis method according to the invention is therefore implemented either by using a solid support with compartment (s), for example of the microplate type, or with a set of beads.
  • step a) consists in providing:
  • a solid support comprising at least x compartments or several solid supports so as to have at least x compartments with all the solid supports (for example, when a solid support has only one compartment, which can, in a particular embodiment, to assimilate to the solid support itself, to provide at least x solid supports), or at least x sets of balls.
  • the multiplex analysis method according to the invention allows for example the detection of n analytes in at least 1 sample, at least two samples, at least 5 samples, at least 10 samples, preferably at least 20 samples, by at least 40 samples, at least 60 samples or at least 80 samples.
  • n is an integer greater than or equal to 2, for example 2, 3, 4, 5, preferably greater than or equal to 6, for example 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 or greater than 18.
  • steps are not performed simultaneously, they are usually followed by one or more washing steps.
  • a washing step makes it possible to eliminate the compounds that are not bound to the spots or to the balls or to the various compounds bonded to said spots or to said balls.
  • a washing step consists of at least one cycle, preferably at least two cycles, more preferably 3 to 6 cycles, of distribution (for example a volume of 400 ⁇ ) and aspiration of a washing solution into each compartment or in the presence of each set of balls.
  • the wash solution may be 0.01 M Tris NaCl buffer, pH 7.4, supplemented with 0.1% Tween 20.
  • the compartments of the solid support (s) are preferably identical, in particular in terms of the number and composition of the spots.
  • the method can be implemented with at least one solid support comprising at least two distinct groups (or types) of compartments, each of the distinct groups having a number and / or a different spot composition (s).
  • the sets of beads may be identical, particularly in terms of the number and composition of the beads.
  • the method can be implemented with at least two distinct groups (or types) of different sets of beads, in particular each of separate groups of sets of beads having a different number and / or composition of beads. .
  • Steps b), d), e) and f) are performed in each compartment for analyzing a sample or in each container containing a set of beads for analyzing a sample.
  • a sample is added per compartment or per vessel containing a set of beads.
  • An additive used in the process according to the invention is an additive recognized by the capture ligand (s) of the deposition control of an analyte detection ligand.
  • a control compound present in the sample is a control compound recognized by the capture ligand (s) of the control of the deposition of a sample.
  • Each analyte detection ligand is specific for an analyte recognized by at least one capture ligand present in an analyte detection spot or on an analyte detection ball.
  • step b) When step b) is not performed simultaneously with one of steps c), d) or e), one or more washing steps can be performed after step b) and before said steps c), d ) and e) only when I is equal to 0.
  • Steps b), c), d) and e), when present, can be performed in any desired order: successively, or one, two or three steps simultaneously.
  • a step b) and a step d) respectively implement at least one additive and at least one detection ligand of said additive
  • said step d) is always carried out simultaneously or subsequently in said step b).
  • a step e), when it is present, is always carried out simultaneously or subsequently in step c), or before step c) provided that there is no step washing between step e) and c).
  • step c) is carried out after a step b) in which I is greater than or equal to 1 and / or after a step d) in which ⁇ is greater than or equal to 1 and / or after step e ), no washing step is performed between this or these steps and step c).
  • steps b) to e), when they are present, can be carried out simultaneously and / or successively, in the following orders: b) to e), b) c) e) d), c (b) (d) (e), (c) (b) (e) (d) or (c) (e) (b) (d).
  • Steps c), d) and / or e) can be performed simultaneously in step b).
  • steps b) and c) are performed simultaneously.
  • steps c) and d) are carried out simultaneously. It may indeed be advantageous to bring the sample simultaneously with the detection ligands of the analytes which interact better in solution with the analyte of which they are specific than when the analyte is already bound to the capture antibody of the analyte. analyte.
  • steps b), c) and d) are performed simultaneously.
  • the process may comprise one or more steps b) (and one or more steps d)), each of the steps b) being possible independently before, after or simultaneously with step c).
  • steps b) there may be at least two steps b), one being performed before or simultaneously with step c), the other being performed after or simultaneously with step c).
  • the compounds of a given step may be provided in the form of a mixture, that is to say of a solution, which comprises all the compounds of this step and optionally the compounds of one or more stages performed simultaneously.
  • the compounds of these different steps can be provided in the form of one or more mixtures, that is to say of one or more solutions, preferably in the form of a single mixture (that is, of a single solution).
  • the additives (when present), the detection ligands of each of the p analytes to be detected, the detection ligand (s) or said additives (when present), the detection ligands of each of the m analytes to be detected can be provided as a single mixture.
  • ⁇ is equal to n, i.e. at least n detection ligands of the n analytes are added in step d).
  • step e) is performed subsequent to step c). This is particularly the case where the presence of one or one of the detection ligands of a compound controls at the same time as the sample may cause interference.
  • step e) is performed subsequent to step c).
  • step e) is carried out after step c), preferably at least one step of washing the compartments is carried out after step c) and before step e).
  • step f When the method according to the invention comprises step f), this step is always carried out subsequently to steps a) to e) and it is generally preceded by at least one spot washing step of each compartment or each set of balls.
  • the method may also comprise a plurality of steps f) if at least two reporter deposition controls are used, preferably a f) reporter step.
  • this step is always carried out subsequently in a step f) and it is generally preceded by at least one spot washing step of each compartment or of each set of beads.
  • the or at least one of the reporters of step f) is preferably both a reporter of an indirect detection marker coupled to at least one analyte detection ligand and that of a detection marker present in at least one control of the deposit of a protractor.
  • the controls used for carrying out the multiplex analysis method according to the invention may mimic the different steps of the detection of the analytes.
  • the analyte capture ligands and the analyte detection ligands are antibodies
  • the additive detection ligand and, preferably, the control compound detection ligand are also antibodies.
  • the additive detection ligand and, preferably, the detection ligand of the control compound are labeled with the same label as that of the analyte detection ligands.
  • the method according to the invention generally comprises a step h) of detecting the signal corresponding to the detection markers of the control (s) (in particular of the control spot or spots or of the control ball or beads) and of the analyte (s).
  • a check is positive if a positive signal is detected at the end of the process.
  • a control is negative in the absence of a positive signal detected at the end of the process.
  • the detection of a positive signal for each control used during the implementation of the method makes it possible to validate the entire process.
  • a negative sample deposition check means that the sample has not been deposited and / or that said detection ligand of a control compound has not been deposited.
  • control of the deposit of a sample the control of the deposition of an analyte detection ligand and, where appropriate, the control of the deposit of a protractor are complementary and make it possible to ensure the smooth running of each steps of the method and make it possible to understand the origin of a possible defect encountered in the analysis method.
  • the method according to the invention may also comprise:
  • the present invention also relates to the use of at least one control of the deposition of a sample and / or at least one control of the deposition of an analyte detection ligand, to secure a multiplex analysis of 'a sample.
  • Said use may further include the use of at least one control of the deposition of a protractor.
  • the present invention particularly relates to the use of at least one control selected from the group consisting of a control of the deposition of a sample, a control of the deposition of an analyte detection ligand and a control of the deposit a reporter, to secure a multiplexed analysis of a sample.
  • a "false negative” is a negative result reflecting the absence of one or more analytes to be detected in a sample, while said one or more analytes were present in the sample and should have been detected.
  • the present invention also relates to the use of at least two controls selected from the group consisting of a control of the deposition of a sample, a control of the deposition of an analyte detection ligand and a control of the deposit a reporter, to secure a multiplexed analysis of a sample.
  • the present invention particularly relates to the use of at least one control of the deposition of a sample, at least one control of the deposition of an analyte detection ligand and at least one control of the deposition of a protractor , to secure a multiplex analysis of a sample.
  • Said use is preferably carried out on a solid support comprising at least one compartment as defined above or on a set of beads as defined above.
  • control of the deposition of a sample the control of the deposition of an analyte detection ligand, the control of the deposition of a protractor and the sample are in particular as defined above.
  • the present invention also relates to a kit (or kit) characterized in that it comprises or consists of at least one solid support according to the invention and / or at least one set of balls according to the invention and, where appropriate at least one composition or solution to be used to implement a multiplex analysis method according to the invention and / or a user guide.
  • FIG. 1 Example of a solid microplate support for secure multiplex analysis.
  • A is shown a schematic diagram of a microplate with 18 wells.
  • B is shown schematically the bottom of a well of the microplate.
  • Each well of the microplate comprises 9 spots, of which 6 spots are each intended for the detection of one or more analyte (s) for diagnosing an infection (respectively A1, A2, A3, A4, A5 and A6) and 3 control spots.
  • SDC Control of the deposit of a sample
  • PVC Control of the deposit of an analyte detection ligand
  • RVC Control of the deposit of a Rapporteur
  • C are schematically represented the three control spots comprising detection antibodies bound to the solid phase (PS).
  • Ac CC Antibody for detection of the control compound.
  • Ac Add Antibody for the detection of the additive.
  • MS + B Support molecule labeled with biotin.
  • FIG. 2 Schematic of a positive sample deposition (SDC) control in heterologous format.
  • the control of the deposition of a sample comprises the capture antibody of the control compound attached to the solid phase (PS).
  • the capture antibody is here specific for the soluble transferrin receptor (sTfR).
  • the compound controls, here the complex 2: 2 soluble transferrin receptor (sTfR): transferrin (Tf) is attached to the capture antibody at the level of the control of the deposition of a sample and to the detection antibody (Ac 2) which is specific to transferrin.
  • the detection antibody (Ac 2) is labeled with the biotin (B).
  • S-POD streptavidin coupled to peroxidase
  • the capture antibody and the detection antibody may be monoclonal or polyclonal antibodies. In any case, it is a heterologous sandwich.
  • FIG 3 Schematic of a Positive Sample Deposition (SDC) Control in Peer Format.
  • the control of the deposition of a sample comprises the capture antibody of the control compound attached to the solid phase (PS).
  • the capture antibody is here specific for the soluble transferrin receptor (sTfR).
  • the compound controls, here the complex 2: 2 soluble transferrin receptor (sTfR): transferrin (Tf) is attached to the capture antibody at the level of the control of the deposition of a sample and to the detection antibody (Ac 2) which is also specific for the soluble transferrin receptor (sTfR).
  • the detection antibody (Ac 2) is labeled with biotin (B).
  • S-POD streptavidin coupled to peroxidase
  • the capture antibody and the detection antibody are, for example, monoclonal antibodies. This is a homologous sandwich.
  • FIG 4 Schematic of a deposit control of a positive analyte (PVC) detection ligand.
  • the process control includes the capture antibody of the additive attached to the solid phase (PS).
  • the capture antibody here is specific for digoxigenin (Dig).
  • the additive comprises digoxigenin and BSA, the digoxigenin being complexed with BSA.
  • the additive is bound via digoxigenin to the capture antibody at the control of the deposition of an analyte detection ligand and the detection antibody (Ac 2).
  • the detection antibody (Ac 2) is labeled with biotin (B).
  • S-POD streptavidin coupled to peroxidase
  • Both the capture antibody and the detection antibody may be monoclonal antibodies or both polyclonal antibodies, in which case it is a homologous sandwich.
  • the capture antibody may be a monoclonal antibody and the detection antibody a polyclonal antibody, or conversely, in which case it is a heterologous sandwich.
  • FIG. 5 Diagram of a positive reporter (RVC) deposition control.
  • the control of the deposition of a reporter comprises a carrier molecule (MS) coupled to biotin (B) attached to the solid phase (PS).
  • MS carrier molecule
  • B biotin
  • PS solid phase
  • S-POD streptavidin coupled to peroxidase
  • Figure 6 Spotting grid located at the bottom of a well of a microplate and comprising the spots of 5 analytes to be assayed (A1 to A5) and the three control spots SDC, PVC and RVC.
  • Figure 7 Signal distribution of SDC control beads in simplex format of a population of 94 samples. The ordinate shows the number of samples and the abscissa of the Relative Fluorescence Intensity Units (RFI) intervals.
  • RFI Relative Fluorescence Intensity Units
  • FIG. 8 Signal distribution of PVC control beads in simplex format of a population of 38 samples. The ordinate shows the number of samples and the abscissa of the Relative Fluorescence Intensity Units (RFI) intervals.
  • RFI Relative Fluorescence Intensity Unit
  • sample Deposit Control the deposit of the sample and also step 2 (deposition of the conjugates 2, ie the detection ligands deposited in the step 2) and step 3 (deposition of the S-PE reporter: streptavidin coupled with Phycoerythrin) and
  • stage 1 deposition of conjugates 1, ie the detection ligands step 1
  • step 2 deposition of the conjugates 2, in dotted lines, as not illustrated in this example
  • step 3 deposition of the S-PE reporter
  • the BioPlex 200® analyzer (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France) is used according to the manufacturer's instructions.
  • This immunoassay automaton contains a flow cytometer and a Luminex 100 TM detector (Luminex Corp., Austin, Texas, USA) and uses heterogeneous sets of superparamagnetic particles.
  • Each homogeneous group of particles, composed of polystyrene and methacrylic acid (COOH function), with a size of 8 ⁇ in diameter, is manufactured with different percentages of fluorochromes (CL1 and CL2) producing a unique identification code assigned to each particle group and detectable by the Luminex 100 TM detector laser (Luminex Corp., Austin, TX, USA).
  • the balls of a game pass one by one through a flow cell, in the center of a liquid sheath, to be simultaneously excited and read by two separate lasers. Measurements are made at the passage of each ball.
  • the 638 nm red laser excites the identification fluorochromes (CL1 and CL2) embedded on the surface of each particle and the composite signal is interpreted to identify the analyte detected by the particle. This laser therefore serves, by identifying the particle category, to identify the current test.
  • the 532 nm green-beam laser excites the S-PE reporter (streptavidin coupled with Phycoerythrin) and the emitted fluorescence is proportional to the amount of reporter attached to the particle. This laser is therefore used to measure the reactivity of the immobilized analyte on said particle.
  • the system software converts the signal related to the presence of the detection ligand into a relative fluorescence intensity value (RFI in English or RFI).
  • RFI relative fluorescence intensity value
  • a ratio can be calculated to classify the result qualitatively into positive or negative.
  • a set of beads with six distinct groups of Luminex TM superparamagnetic particles (Luminex Corp., Austin, Texas, USA) is used.
  • This set of beads comprises a group of beads to control the deposition of a sample (SDC beads), a group of beads to control the deposition of an analyte detection ligand (PVC beads) and 4 groups of beads. detection of an analyte (analytes to be assayed: A1, A2, A3 and A4).
  • Each group of particles is coated with a specific capture ligand of a particular test.
  • Each capture ligand is coupled with a hetero-bifunctional reagent.
  • the SDC beads are coated with a transferrin-soluble, anti-transferrant mouse monoclonal antibody (Fitzgerald, USA) immobilized at 1 mg of particles.
  • the PVC beads are covered with a polyclonal anti-Digoxigenin sheep antibody (Abcam, USA) immobilized at 5 ⁇ g / mg of particles.
  • the detection beads of the analytes A1, A2, A3 and A4 are coated with one or more specific capture ligands of the analytes to be detected.
  • the detection ligand of the control compound (of the SDC control), pAb-anti-Tf-biot, is a polyclonal sheep anti-Transferrin antibody (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) coupled to biotin (Thermo Scientific, France ) using a heterobifunctional reagent per se known to those skilled in the art.
  • the additive detection (PVC control) ligand is a polyclonal sheep anti-Digoxigenin antibody (Abcam, France) coupled to biotin (Pierce, USA) at the same time. using a hetero-bifunctional reagent in itself known to those skilled in the art.
  • the BSA-DIG additive is digoxigenin (Sigma, France) grafted onto a carrier molecule, in this example the Bovine Serum Albumin (Millipore, France) using a hetero-bifunctional reagent, itself known from the skilled person.
  • the S-PE reporter is streptavidin (Roche, Germany) coupled with Phycoerythrin (Cyanotech, Hawai, USA) using a heterobifunctional reagent per se known to those skilled in the art.
  • Phosphate buffer pH 7.4, containing: 150 mM NaCl, Tween 20 TM (Sigma brand) 0.1%, Proclin 300 TM (Supelco brand) 0.5%, PEG 6000 2.75 %, 1% Bovine Serum Albumin, 1% Sheep Normal Serum, 0.095% NaN3. vi.5. Wash solution
  • the immunological reactions take place in the 96-well polypropylene microplate wells having a maximum volume of 355 ⁇ l per well.
  • the negative samples (serum or plasma) used come from the French blood establishment of Lane.
  • the test protocol in multiplex format comprises the assay of 4 different analytes, the assay of the A1 and A2 analytes being carried out in an immunological time, the assay of the analytes A3 and A4 being carried out in two immunological times.
  • Step 1
  • the mixture is incubated for 40 minutes at 37 ° C with shaking. 3.
  • the following washing steps are performed: separation of the solid and liquid phases by magnetization and 3 successive washes with at least 300 ⁇ of washing solution. At the last wash the particles are resuspended.
  • the mixture is incubated for 15 minutes at 37 ° C with stirring.
  • the particles are resuspended in each reaction well by adding 120 ⁇ l of wash solution and the microplate is agitated.
  • the suspension of particles from each well is read using the two laser beams.
  • the SDC ratio of the samples is calculated as follows:
  • the PVC ratio of the samples is calculated as follows RFI signal of the sample
  • the threshold value SDC and PVC was established according to a statistical study described in the results below.
  • the analyte detection beads A1 to A4 and their detection ligands are not used.
  • the study of 94 samples makes it possible to define the threshold value of the SDC system (see FIG.
  • the threshold value of the SDC system is calculated by subtracting 3 times the standard deviation of the signal from the sample population to the average value of the population signal.
  • Table 2 CDS signal statistics of the population of 94 samples and calculation of the threshold value
  • the mixture comprising "conjugates 2" comprises 90 ⁇ l of conjugate diluent 2 containing the pAb-anti-Tf-biot control compound detection ligand.
  • Table 3 Summary of SDC ratios obtained in a nominal process (case 1) and degraded processes (cases 2, 3 and 4)
  • the analyte detection beads A1 to A4 and the corresponding detection ligands are used.
  • the analyte detection beads A1 to A4 and the corresponding detection ligands are not used.
  • the threshold value of the PVC system is calculated by subtracting 3 times the standard deviation of the signal from the population of samples from the average value of the signal of the population (see Table 5).
  • Table 5 Statistics of the PVC signal of the population of 38 samples and calculation of the threshold value.
  • Threshold value Mean - 3 ⁇ (RFI) 143.4
  • the analyte detection beads A1 to A4 and the corresponding detection ligands are used.
  • the performance of the PVC system is similar in simplex mode and in multiplex mode (see Table 7).
  • Threshold value Mean - 3 ⁇ (RFI) 143.4 1 21, 7 Moreover, by comparing the RFI signals obtained between an MPX format without SDC and PVC versus an MPX format with SDC and PVC, it turns out that the addition of the SDC and PVC tests does not impact the performance of a multiplex comprising 4 analytes to be assayed (ie deviations in% between RFI signals of MPX format without SDC and PVC versus MPX format with SDC and PVC are within +/- 20%, which is considered statistically acceptable) .
  • step 2 deposit of the sample and also step 2 (deposit of the conjugates 2), step 3 (deposit of the protractor S -POD) and step 4 (deposit of Luminol substrate),
  • step 1 deposition of the additive and deposition of the conjugates 1
  • step 3 deposit of the S-POD reporter
  • step 4 deposit of Luminol substrate
  • step 3 S-POD reporter deposit of Luminol substrate
  • the technology used for this system is an innovative multiplex technology nanospotting on biochip (see definition below), with revelation by chemiluminescence thanks to a reporter labeled by the horseradish peroxidase enzyme and revealed by a luminol-type substrate.
  • biochip is a collection of miniaturized test sites (or “micro-array”) arranged on a solid support that allows for many tests simultaneously to obtain a higher rate high.
  • each well of a microplate (Greiner, Germany) are deposited in rows using a robot spotteur, drops of 50 nL of a solution of proteins or antibodies specific to the analyte to be assayed (A1, A2, A3, A4, A5, SDC, RVC and PVC) (cf. Figure 6).
  • the bottom of each well of these microplates has adsorption capabilities of proteins and peptides per se known to those skilled in the art.
  • the spots thus obtained are saturated with a saturation solution in itself known to those skilled in the art.
  • the addition of the revealing substrate causes a light emission.
  • the oxidation of luminol by enzymatic catalysis leads to a light emission proportional to the amount of Streptavidin-peroxidase reporter fixed by the spot.
  • the signal is acquired by a scientific camera.
  • the resulting image is then analyzed in order to determine the intensity of the luminescence produced by each geographic area of the bottom of the well corresponding to each spot (addressing of the information).
  • the system software converts the signal measured by spot into a value of Luminescence Relative Units ("URL” in French or "RLU” in English). A ratio can be calculated to classify the result qualitatively into positive or negative, as detailed below.
  • the different control spots are:
  • the SDC spot comprising a mouse monoclonal antibody anti-soluble transferrin receptor (Fitzgerald, USA) immobilized at 50 ⁇ g / mL,
  • the PVC spot comprising a mouse monoclonal antibody anti-Digoxigenin (Covalab, France) immobilized at 25 ⁇ g / mL, and
  • the RVC spot comprising a mouse monoclonal anti-KLH ("Keyhole Limpet Hemocyanin”) antibody (Genway, USA) coupled to biotin (Thermo Scientific, France) using a hetero-bifunctional reagent in itself known to those skilled in the art and immobilized at 1 ⁇ 9 ⁇ _.
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • the detection ligand of the control compound (relating to the SDC control), pAb-anti-Tf-biot, is a polyclonal sheep anti-Transferrin antibody (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) coupled to biotin (Thermo Scientific, France) using a hetero-bifunctional reagent per se known to those skilled in the art.
  • the additive detection (PVC control) ligand is a mouse monoclonal anti-digoxigenin antibody coupled to biotin (Covalab, France).
  • the additive BSA-DIG is Digoxigenin (Sigma, France) grafted onto a carrier molecule, in this example the Bovine Serum Albumin (Millipore, France).
  • the coupling is carried out using a hetero-bifunctional reagent, itself known to those skilled in the art.
  • the S-POD reporter is streptavidin (Roche, Germany) coupled to peroxidase (Roche Germany) by the method described by P. Nakane and A. Kawaoi (J Histochem Cytochem (1974) Vol 22, No. 12. pp 1084-1091), as known to those skilled in the art.
  • the ELISTAR ETA C Ultra ELISA revealing substrate (Cyanagen, Italy) consists of two solutions: XLSE024L Luminol enhancer solution (A) and XLSE024P Peroxide solution (B).
  • the negative samples (serum or plasma) used come from the French blood establishment of Lane.
  • the test protocol includes the following steps.
  • Step 1
  • conjugate diluent 1 comprising:
  • the mixture is incubated for 40 minutes at 37 ° C with shaking.
  • the mixture is incubated for 15 minutes at 37 ° C with stirring.
  • the mixture is incubated for 1 minute at 37 ° C with stirring.
  • the SDC ratio of the samples is calculated as follows
  • Ratio- RVC sample on -
  • the multiplex described in this example comprises 5 analytes to be assayed 3 analytes whose detection ligands are added in step 1 (A1, A2 and A3), 2 analytes whose detection ligands are added in step 2 (A4 and A5) and the three SDC, PVC and RVC controls.
  • Table 9 lists the scenarios that can be encountered during an isolated or cumulative invalidation of the SDC, PVC and RVC controls.
  • detection ligands of step 2 can not be validated or invalidated.
  • Table 10a Response of SDC, PVC and RVC controls (average response, standard deviation, minimum and maximum value, threshold values).
  • Table 10b Responses of the SDC, PVC and RVC checks (average response, standard deviation, minimum and maximum value, threshold values).
  • Table 11a Responses of SDC, PVC and RVC controls in RLU and ratios of a population of 22 samples.
  • Table 1 1b Responses of SDC, PVC and RVC controls in RLU and ratios (threshold +), ratios (threshold-) of a population of 22 samples.
  • the status of SDC and PVC and RVC controls interpretations is "Valid” for all 22 samples.
  • Cases 5 and 6 lead to SDC, PVC and RVC ratios of less than 1, which invalidates the measurements resulting from these degraded processes.
  • the RVC signal specifically invalidates the revealing step (S-POD deposit and Luminol deposit).
  • the invalidation of the process by a RVC ratio of less than 1 implies an absence of the systematic signal of the SDC and PVC controls (see Gray zone of Table 9). In this case, it is not possible to determine whether the sample deposits and conjugates 2 (SDC-controlled deposits) or additive deposits and conjugates 1 (PVC-controlled depositions) occurred correctly. or not.
  • Cases 1 and 4 lead to SVC (threshold) ratios lower than 1, which invalidates the measurements resulting from these degraded processes. Moreover, in case 1, the ratio (threshold +) PVC is greater than 1 which reflects an indirect impact of the absence of sample on the PVC control.
  • Table 13a Response of SDC, PVC and RVC Controls to RLU and Ratio of a Population of 22 Samples
  • Table 13b Response of SDC, PVC and RVC controls to RLU and ratio of a population of 22 samples

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Abstract

La présente invention concerne des contrôles pouvant être utilisés pour sécuriser les résultats de procédés d'analyse multiplexe. La présente invention a ainsi pour objet des supports solides comprenant un ou plusieurs contrôles et leur utilisation dans des procédés d'analyse multiplexe pour la détection de plusieurs analytes éventuellement présents dans un échantillon.

Description

Contrôles pour la mise en œuvre de procédés d'analyse multiplexe
Domaine technique
La présente invention concerne des contrôles pouvant être utilisés pour sécuriser les résultats de procédés d'analyse multiplexe comprenant une ou plusieurs étapes.
Etat de la technique
Un procédé d'analyse multiplexe permet de détecter, de manière simultanée, la présence éventuelle de plusieurs analytes au sein d'un même échantillon. L'analyse multiplexe présente plusieurs avantages, tels qu'un gain de temps en permettant d'analyser plusieurs analytes en même temps, une moindre consommation de réactifs et de consommables, et également une moindre quantité d'échantillon nécessaire pour la détection des analytes.
Il est courant d'utiliser un ou plusieurs contrôles pour valider les résultats obtenus à l'issue d'un procédé d'analyse visant à détecter la présence d'un ou plusieurs analytes. La fiabilité des résultats fournis par un procédé d'analyse est en effet un enjeu majeur, notamment lorsqu'il s'agit d'analyses destinées au diagnostic médical et/ou la qualification du don transfusionnel.
Un contrôle positif classiquement utilisé consiste à vérifier la détection d'un composé connu, utilisé dans une quantité connue et qui correspond à un analyte dont la présence éventuelle est recherchée dans un échantillon donné. Toutefois, ce type de contrôle permet de valider uniquement la mise en œuvre globale du procédé d'analyse et ne permet pas de valider chaque étape du procédé.
Par ailleurs, d'autres types de contrôle peuvent être utilisés. Par exemple, le document WO2004/046685 utilise des contrôles pour vérifier la qualité des réactifs utilisés dans des tests d'immuno-histochimie. A cet effet, une lame contrôle comprenant une série de dilutions de différents composés contrôle est utilisée. Une coloration positive de la lame contrôle au niveau d'un composé contrôle ne doit être observée que si un anticorps spécifique dudit composé contrôle ou un rapporteur ou substrat dudit composé contrôle est utilisé au cours du procédé d'immuno-marquage. Ce procédé de vérification de la qualité des réactifs nécessite l'utilisation d'un nombre important de composés contrôles sur la lame contrôle.
En fait, il n'existe pas actuellement de moyen simple permettant de contrôler l'ensemble des étapes dans le cas d'un procédé d'analyse multiplexe : en particulier, le dépôt des échantillons, le dépôt des réactifs, les différents cycles de lavage et d'incubations. Il est pourtant crucial dans le domaine de la transfusion sanguine et du diagnostic médical d'atteindre un haut niveau de sécurisation et de traçabilité.
Ainsi, il existe un réel besoin de fournir des solutions permettant de garantir la fiabilité des résultats obtenus lors de la mise en œuvre de procédés d'analyse multiplexe et qui permettent notamment de valider chaque étape du procédé.
Description détaillée
La présente invention repose sur la mise en évidence par les inventeurs de moyens de contrôle permettant de garantir la fiabilité des résultats obtenus, en vérifiant que chaque étape d'un procédé d'analyse multiplexe s'est déroulée correctement (et non en vérifiant seulement une mise en œuvre globale du procédé). Ainsi, pour la première fois, les inventeurs fournissent des contrôles qui permettent de valider le dépôt de l'échantillon lui-même et plus généralement les différentes étapes du procédé.
En combinant seulement deux ou trois contrôles selon l'invention, il est ainsi possible de valider l'étape de dépôt de l'échantillon, la ou les étape(s) de dépôt des ligands de détection spécifiques des analytes à détecter dans l'échantillon, les différentes étapes de lavage et d'incubation et, le cas échéant, l'étape de dépôt d'un rapporteur d'un marqueur de détection et/ou l'étape de dépôt d'un substrat du marqueur couplé audit rapporteur.
Dans le procédé d'analyse multiplexe selon l'invention, seulement deux ou trois contrôles sont nécessaires à la validation de chaque étape de l'ensemble du procédé multiplexe.
Outre la validation des résultats, l'utilisation des contrôles selon l'invention permet également d'identifier des failles potentielles existantes lors de la mise en œuvre du procédé d'analyse multiplexe, et de modifier par exemple la ou les étapes correspondantes pour améliorer la mise en œuvre du procédé d'analyse.
La présente invention présente également l'avantage d'être simple de mise en œuvre, en ne nécessitant qu'un nombre limité de contrôles, en n'ajoutant pas d'étapes supplémentaires au procédé d'analyse et en ne nécessitant pas l'utilisation d'un appareillage supplémentaire (par exemple, ne nécessitant pas l'utilisation d'un spectrophotomètre). En effet, les étapes du procédé d'analyse sont réalisées dans un seul emplacement (par exemple, le tube ou le puits dans lequel est placé l'échantillon) et les contrôles, par exemple sous forme de spots ou de billes, sont traités en même temps que les spots ou billes servant à la détection des analytes.
Le premier type de contrôle selon l'invention est le contrôle du dépôt d'un échantillon qui permet de vérifier le dépôt de l'échantillon. Dans certains modes de réalisation détaillés ci-après, le contrôle du dépôt de l'échantillon permet également de vérifier le dépôt d'un ou plusieurs ligands de détection d'analyte.
Par « dépôt de l'échantillon ou d'un additif » ou « ajout de l'échantillon ou d'un additif », on entend la mise en présence de l'échantillon ou d'au moins un additif avec des composés d'intérêt fixés sur un support solide.
Par « au moins un », on entend dans la présente demande un ou plusieurs, « plusieurs » signifiant en particulier deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze, seize ou plus de seize.
Par « dépôt d'un ligand de détection, d'un rapporteur ou d'un substrat » ou « ajout d'un ligand de détection, d'un rapporteur ou d'un substrat », on entend la mise en présence d'un ligand de détection, d'un rapporteur ou d'un substrat avec des composés d'intérêt fixés sur un support solide et les éventuels composés fixés sur lesdits composés d'intérêt.
Le deuxième type de contrôle est le contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte qui permet de vérifier le dépôt d'un ou de ligands de détection (par exemple un mélange de ligands de détection) spécifiques d'analytes à détecter dans l'échantillon. Ce contrôle permet également de valider les étapes d'incubation et de lavage.
Le troisième type de contrôle est le contrôle du dépôt d'un rapporteur qui permet de vérifier que la ou les étape(s) de révélation se sont déroulées correctement. Le contrôle du dépôt d'un rapporteur est utile en cas de marquage indirect des ligands de détection.
Enfin, les contrôles selon l'invention sont particulièrement appropriés pour la mise en œuvre de procédés d'analyse multiplexe en micro-réseau, par exemple sur un support solide de type microplaque, ou en puce liquide, par exemple sur un support solide de type billes.
Echantillon
L'échantillon à analyser est de préférence un échantillon biologique.
L'échantillon biologique peut être un fluide biologique, tel qu'un échantillon de sang, dérivé de sang (tel que plasma ou sérum), urine, fluide céphalorachidien, salive, ou un échantillon de tissu, tel qu'un tissu obtenu par biopsie, une cellule ou un ensemble de cellules, un extrait végétal, ou leurs combinaisons.
Un dérivé de sang désigne tout produit, en particulier fluide, obtenu à partir d'un échantillon de sang.
L'échantillon à analyser peut également être un milieu de culture et/ou un surnageant de culture. Avant d'être analysé, l'échantillon peut subir une ou plusieurs étapes préalables de traitement, tels que dilution, centrifugation, traitement thermique et/ou chimique, lyse cellulaire (par exemple par un ou plusieurs agents chaotropiques, un ou plusieurs agents réducteurs et/ou par chauffage), extraction, réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction), ajout d'un ligand de détection non marqué ou leurs combinaisons. L'ajout d'un ligand de détection non marqué est en particulier utile pour la mise en œuvre d'un test de neutralisation, qui est en soi un test connu de l'homme du métier.
L'échantillon peut également être un mélange d'au moins deux échantillons qui peuvent être de même nature ou de nature différente.
A titre d'exemple de mélange d'échantillons de nature différente, on peut citer un mélange de sang et de sérum, un mélange de sang et de plasma, un mélange de sérum et de plasma, ou encore un mélange de sang, sérum et plasma.
Un échantillon préféré selon l'invention est un échantillon ou un mélange d'échantillons de sang et/ou dérivé du sang.
Analvte
Un analyte à détecter dans l'échantillon peut être tout type de composé, naturel ou synthétique, que l'on souhaite détecter et / ou quantifier dans un échantillon.
Un analyte peut par exemple être une protéine, un peptide, une glycoprotéine, un glucide, un lipide, une cellule, une organelle, un virus ou un acide nucléique.
La cellule peut être une cellule animale, une cellule végétale, une cellule de bactérie, une cellule de métazoaire, une cellule de levure, une cellule de champignon, ou un protozoaire.
Un acide nucléique désigne un polymère de nucléotides reliés par des liaisons phosphodiester, tel qu'un acide désoxyribonucléique (ADN), un acide ribonucléique (ARN) ou un analogue de ceux-ci, tels que des phosphorothioates ou des thioesters, sous forme simple brin ou double brin.
Un analyte ou au moins un des analytes ou les analytes est (sont) par exemple choisi(s) dans le groupe consistant en un antigène, un anticorps, un fragment d'anticorps, un haptène, une hormone, un récepteur d'hormone, une enzyme ou un acide nucléique.
Dans un mode de réalisation préféré, le ou les analytes ne sont pas des acides nucléiques.
Le ou les analytes sont par exemple sélectionnés dans le groupe consistant en un antigène, un anticorps, un fragment d'anticorps, un haptène, une hormone, un récepteur d'hormone et une enzyme. Par « antigène », on désigne ici une molécule naturelle, recombinante ou synthétique reconnue par des anticorps ou des cellules du système immunitaire et capable d'engendrer une réponse immunitaire lorsqu'elle est présentée dans des conditions appropriées au système immunitaire d'un hôte. Ce peut être une molécule, en particulier un polypeptide, comprenant ou consistant en au moins un épitope qui peut être linéaire ou conformationnel. Le terme « épitope linéaire » désigne un polypeptide, en particulier un peptide, comprenant ou consistant généralement en 3 à 15, plus généralement 5 à 15 acides aminés, et de préférence au moins 6, 8, 10 ou 12 acides aminés, capable de se lier à une molécule d'anticorps dirigé contre ledit antigène. Le terme « épitope conformationnel » désigne une structure tridimensionnelle reconnue par un anticorps et déterminée par la juxtaposition de plusieurs acides aminés dans l'espace, qui peuvent être non contigus dans la séquence peptidique de la protéine (ou du polypeptide) contre laquelle est dirigé cet anticorps, mais qui, du fait du repliement de la chaîne polypeptidique, se retrouvent proches les uns des autres dans l'espace, et peuvent ainsi former un motif susceptible d'être reconnu par un anticorps.
Un antigène est par exemple une protéine (en particulier une protéine native ou recombinante), un peptide (par exemple un peptide synthétique), une glycoprotéine, un glucide ou un lipide, ledit peptide pouvant être associé ou non à une molécule support, par exemple la BSA (albumine de sérum bovin).
Par « molécule support » (appelé également « molécule porteuse »), on entend notamment dans la présente demande une molécule support protéique ou glucidique. Une molécule support peut être un polypeptide (en particulier une protéine ou un peptide) naturel ou non naturel (par exemple une protéine recombinante ou un peptide synthétique), un polymère fonctionnalisé (de type dextran, polysaccharide ou poly-lysine) ou un co-polymère mixte (en particulier un co-polymère d'acides aminés différents, par exemple un co-polymère lysine-tyrosine). Une molécule support peut être un anticorps (en particulier un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal), par exemple une immunoglobuline.
Un exemple de molécule support est la BSA.
Dans un mode de réalisation particulier, la molécule support n'est pas un anticorps.
Par « haptène », on désigne ici une molécule de faible poids moléculaire capable d'être reconnue par le système immunitaire, mais qui est immunogène uniquement lorsqu'elle est couplée à une molécule support.
Un analyte ou au moins un des analytes est, de préférence, un composé permettant de diagnostiquer une condition d'un sujet, pathologique ou non, ou de diagnostiquer les risques de développer une condition, pathologique ou non. Un exemple de condition non pathologique est une grossesse.
Le sujet peut être un homme, un animal non humain ou un végétal. L'animal non humain est de préférence un mammifère, tel qu'un chat, chien, singe, lapin, souris, rat.
Le terme « homme » est utilisé de manière large et désigne notamment un homme ou une femme de tout âge, tel qu'un nourrisson, un enfant, un adolescent, un adulte ou une personne âgée.
Lorsque l'analyte ou au moins un des analytes est un antigène, il s'agit de préférence d'un antigène permettant de diagnostiquer une infection, par exemple une infection causée par un virus, une bactérie, un champignon ou un parasite.
Lorsque l'analyte ou au moins un des analytes est un anticorps, il s'agit de préférence d'un anticorps permettant de diagnostiquer une infection, par exemple une infection causée par un virus, une bactérie, un champignon ou un parasite.
Typiquement, il peut s'agir d'un ou plusieurs antigène(s) et/ou d'un ou plusieurs anticorps spécifique(s) de :
un virus, tel que VIH ( Virus de l'Immunodéficience Humaine), en particulier VIH-1 ou VIH-2, VHB { Virus de l'Hépatite B), VHC { Virus de l'Hépatite C), VPH
{papillomavirus humain), HTLV { Virus T-lymphotropique humain), en particulier
HTLV-I ou HTLV-II,
- un parasite, tel qu'un parasite susceptible de provoquer la Toxoplasmose (en particulier Toxoplasma gondii), la Malaria (en particulier un parasite du genre Plasmodium, par exemple Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae ou Plasmodium knowlesi) ou la maladie de Chagas (en particulier Trypanosoma cruzi), chez un homme ou un animal non humain, ou
- une bactérie, telle qu'une bactérie susceptible de provoquer la Syphilis (en particulier Treponema pallidum) ou la maladie de Lyme (en particulier une bactérie du genre Borrelia), chez un homme ou un animal non humain.
Par « parasite », on désigne ici un métazoaire ou un protozoaire parasitant un organisme et entraînant une parasitose. Un parasite au sens de l'invention n'est donc ni un virus, ni une bactérie, ni un champignon.
L'analyte ou au moins un des analytes peut également être un marqueur d'une maladie, tel qu'un marqueur d'une maladie cardiovasculaire ou un marqueur du diabète, un marqueur de l'évolution d'une maladie, telle qu'une hépatite, un marqueur de l'évolution d'une infection causée par un virus, une bactérie, un champignon ou un parasite, un marqueur de résistance à un traitement, par exemple à un traitement antiviral, un traitement antibiotique ou un traitement contre un cancer.
Plusieurs (par exemple deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze ou plus de quinze) analytes tels que décrits dans la présente demande peuvent être détectés simultanément dans un échantillon au cours d'un procédé d'analyse multiplexe. Cela peut permettre de diagnostiquer, dans un même échantillon, une ou plusieurs infection(s) ou maladie(s), l'évolution d'une infection ou maladie, une condition (pathologique ou non), un risque de développer une condition (pathologique ou non) ou encore un marqueur de résistance à un traitement chez un sujet.
Les analytes détectés au cours d'un procédé d'analyse multiplexe peuvent être de même nature (par exemple uniquement des anticorps ou uniquement des antigènes) ou de nature différente (par exemple, au moins un antigène et au moins un anticorps).
De préférence, le ou les analytes à détecter ne sont pas marqués avec un marqueur de détection.
Dans un mode de réalisation préféré, le ou les analytes à détecter sont choisis parmi un anticorps et/ou un antigène.
Composé contrôle
Par « composé contrôle », on désigne ici un composé présent naturellement dans l'échantillon à analyser, de préférence en une concentration détectable dans tous les échantillons de même nature.
Le composé présent naturellement dans l'échantillon à analyser peut être un composé présent initialement dans l'échantillon ou un dérivé d'un composé présent initialement dans l'échantillon.
Un dérivé d'un composé présent initialement dans l'échantillon peut être obtenu à l'issue d'une ou plusieurs étapes de traitement de l'échantillon préalables au procédé d'analyse. Ce ou ces étapes sont notamment telles que définies ci-dessus, par exemple traitement thermique et/ou chimique, lyse cellulaire, extraction, réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction), ajout d'un ligand de détection non marqué ou leurs combinaisons.
Un dérivé d'un composé présent initialement dans l'échantillon est, par exemple, un produit de PCR et/ou un composé modifié par un traitement thermique et/ou chimique, une lyse cellulaire, l'ajout d'un ligand de détection non marqué ou leurs combinaisons.
De préférence, un composé présent naturellement dans l'échantillon à analyser est un composé présent initialement dans l'échantillon. Dans ce cas, si une ou plusieurs étapes de traitement de l'échantillon préalables au procédé d'analyse sont réalisées, le composé est donc présent avant toute étape préalable de traitement de l'échantillon.
Un composé présent naturellement dans l'échantillon à analyser n'inclut pas un composé présent dans l'échantillon au moment de l'analyse, mais qui a été ajouté ou qui est dérivé d'un composé ajouté à l'échantillon pendant une ou des étapes de traitement préalables de l'échantillon.
Lorsque l'échantillon est un mélange d'au moins deux échantillons, le composé contrôle est un composé présent naturellement dans au moins un desdits échantillons, de préférence dans chaque échantillon du mélange.
Par « échantillon de même nature », on entend un échantillon de même origine prélevé sensiblement de la même manière chez différents sujets ou chez un même sujet à différents intervalles de temps et, le cas échéant, ayant subi le ou les mêmes étapes de traitement.
Une « concentration détectable » est une concentration permettant de détecter la présence d'un composé contrôle lors d'un test, notamment un test immunologique de type sandwich dans lequel un composé contrôle se lie à un anticorps de capture fixé sur un support solide et est détecté par un anticorps de détection marqué.
De préférence, la concentration d'un composé contrôle varie peu dans des échantillons de même nature.
Par l'expression « la concentration d'un composé contrôle varie peu dans des échantillons de même nature», on entend ici une concentration qui varie de moins de 60%, de préférence de moins de 40%, plus préférentiellement de moins de 20 % d'un échantillon à l'autre, la concentration étant donnée en μg/mL.
Dans un mode de réalisation avantageux, un composé contrôle est présent dans l'échantillon dans une concentration du même ordre de grandeur que la concentration du ou des analytes à détecter, lorsque ces analytes sont présents. De préférence, un composé contrôle est présent dans l'échantillon dans une concentration du même ordre de grandeur que la concentration de chacun des analytes à détecter.
La concentration d'un composé contrôle est du même ordre de grandeur que la concentration d'un analyte à doser.
De préférence, la concentration du composé contrôle est au plus 5 décades inférieure ou supérieure à celle dudit analyte à doser, lorsqu'il est présent dans l'échantillon, de préférence au plus 4 décades, plus préférentiellement au plus 3 décades. Par exemple, la concentration d'un composé contrôle est au plus de 100 μ9ΛηΙ_, de préférence au plus 10 μ9ΛηΙ_, plus préférentiellement au plus 1 μ9ΛηΙ_, pour une concentration d'un analyte à doser qui serait de 1 ng/mL.
De préférence, la concentration du composé contrôle est du même ordre de grandeur que la concentration d'un analyte, lorsque l'écart entre la concentration de l'analyte dans un échantillon à analyser qui contient cet analyte, et celle du composé contrôle est au plus de 5 décades, de préférence au plus de 4 décades, plus préférentiellement au plus de 3 décades. Dans le cas d'un échantillon d'origine humaine ou animale, un composé contrôle a de préférence une structure conservée au sein de la population humaine ou animale considérée pour l'analyse. Dans un mode de réalisation préféré, un composé contrôle ne présente pas de polymorphisme au sein de la population considérée.
Le composé contrôle n'est, de préférence, pas un marqueur d'une maladie.
Lorsqu'au moins un analyte est détecté par un anticorps, un composé contrôle est, de préférence, un composé détectable par un anticorps.
Le composé contrôle n'est, de préférence, pas dénaturé par la ou les éventuelles étapes préalables de traitement de l'échantillon, de manière à être détectable par un anticorps.
Le composé contrôle peut être une molécule, ou un complexe d'au moins deux molécules, identiques ou différentes.
A titre d'exemple, lorsque l'échantillon à analyser est un échantillon de sang ou de plasma, en particulier de sang humain ou plasma humain, un composé contrôle peut être le récepteur soluble de la transferrine complexé à la transferrine, une hormone, par exemple un stéroïde, un facteur de coagulation, par exemple un facteur de coagulation choisi parmi le facteur VIII, IX, X, XI, XII ou XIII.
Dans un mode de réalisation particulier, un composé contrôle n'est pas le facteur
XIII.
Dans un mode de réalisation particulier, un composé contrôle n'est pas une immunoglobuline de type G (IgG), en particulier une IgG humaine, et/ou n'est pas une immunoglobuline de type M (IgM), en particulier une IgM humaine, ou plus généralement, n'est pas une immunoglobuline, en particulier une immunoglobuline humaine.
Le récepteur soluble de la transferrine complexé à la transferrine est un complexe comprenant deux molécules du récepteur soluble de la transferrine et deux molécules de transferrine. Par exemple, le récepteur soluble de la transferrine complexé à la transferrine est généralement présent dans une concentration comprise de 0,8 μg/mL à 4 μg/mL dans les échantillons à analyser provenant d'un sujet humain, indépendamment de la condition du sujet.
Lorsque la concentration d'un composé contrôle peut varier, par exemple en fonction de la nature de l'échantillon et/ou de la condition du sujet dont est issu l'échantillon, il peut être avantageux d'utiliser au moins deux composés contrôles différents. Additif
Un additif est un composé ou un ensemble de composés qui n'est (ne sont) pas présents dans l'échantillon, c'est-à-dire qui n'est (ne sont) pas présent(s) initialement dans l'échantillon ou qui n'est (ne sont) pas dérivé(s) d'un composé présent initialement dans l'échantillon.
Un additif peut être en particulier un antigène ou un haptène, ledit antigène ou ledit haptène pouvant être couplé ou non à une molécule support.
A titre d'exemple, pour un échantillon biologique humain ou animal, un composé ou un des composés qui n'est pas présent dans l'échantillon à analyser est par exemple sélectionné dans le groupe consistant en la digoxigénine, une hormone végétale, un alcaloïde, un stéroïde végétal, un acide nucléique et un pesticide.
Dans un mode de réalisation préféré, l'additif n'est pas un acide nucléique.
La digoxigénine est un stéroïde extrait de certaines plantes.
Un pesticide est par exemple un insecticide, tel qu'un organophosphoré ou un organochloré, un herbicide, tel qu'une triazine ou de la phényl-urée, ou leurs combinaisons.
Un additif préféré selon l'invention est de la digoxigénine couplée à une molécule support, une auxine couplée à une molécule support, une triazine couplée à une molécule support, ladite molécule support étant par exemple la BSA.
Un additif préféré selon l'invention est de la digoxigénine couplée à de la BSA. De plus, l'additif n'interfère pas avec la détection des analytes lors de la mise en œuvre d'un procédé d'analyse multiplexe. En particulier, l'additif n'interfère pas avec les analytes à détecter, le ou les ligands de capture utilisés, le ou les ligands de détection utilisés, le ou les composés contrôle, le cas échant le ou les rapporteurs, le cas échéant le ou les substrats, et la détection du signal.
Dans un mode de réalisation particulier, l'additif ne comprend ou ne consiste pas en la biotine ou un analogue de la biotine et/ou en l'avidine ou un analogue de l'avidine (en particulier la streptavidine ou la neutravidine), ladite biotine, avidine ou un de leurs analogues étant greffé ou non sur une molécule support.
Ligand de capture
Un ligand de capture est un composé fixé sur un support solide, en particulier au niveau d'un spot ou à la surface d'une bille.
Un ligand de capture est, de préférence, un anticorps ou un antigène qui est fixé sur le support solide, en particulier au niveau d'un spot ou à la surface d'une bille.
Un ligand de capture peut être spécifique d'un analyte à détecter dans l'échantillon, d'un composé contrôle ou d'un additif.
Un ligand de capture peut être un anticorps, un antigène, un peptide, un glucide, un lipide ou un acide nucléique.
Dans un mode de réalisation préféré, le ligand de capture n'est pas un acide nucléique.
Dans un mode réalisation préféré, le ligand de capture est sélectionné dans le groupe consistant en un anticorps, un antigène, un peptide, un glucide et un lipide.
Un ligand de capture est, de préférence, un anticorps ou un antigène.
Lorsqu'un ligand de capture est un anticorps, il s'agit par exemple d'un anticorps monoclonal ou d'un anticorps polyclonal.
Ligand de détection
Un ligand de détection est destiné à révéler la présence d'un composé dont il est spécifique.
Un ligand de détection peut être un anticorps, un antigène, un peptide, un glucide, un lipide ou un acide nucléique.
Dans un mode de réalisation préféré, le ligand de détection n'est pas un acide nucléique.
Dans un mode réalisation préféré, le ligand de détection est sélectionné dans le groupe consistant en un anticorps, un antigène, un peptide, un glucide et un lipide.
Un ligand de détection est, de préférence, un anticorps ou un antigène.
Lorsqu'un ligand de détection est un anticorps, il s'agit par exemple d'un anticorps monoclonal ou d'un anticorps polyclonal.
Un ligand de détection est, de préférence, un ligand de détection marqué, c'est-à- dire un ligand auquel est attaché un marqueur de détection (qui peut être par exemple la biotine ou une peroxydase), de manière covalente ou non. Lorsqu'un ligand de détection n'est pas marqué, sa détection peut être obtenue en utilisant un anticorps marqué spécifique dudit ligand de détection.
Un ligand de détection peut être spécifique d'un analyte à détecter dans l'échantillon, d'un composé contrôle ou d'un additif.
Un ligand de détection peut être identique au ligand de capture ou à un des ligands de capture utilisés, à l'exception de la présence éventuelle d'un marqueur de détection, et/ou se lier au composé dont il est spécifique au niveau de la même zone que celle liée par le ligand de capture ou un des ligands de capture. Dans ce cas, si ledit ligand de capture et ledit ligand de détection sont des anticorps, il s'agit alors d'un « sandwich homologue ».
Un ligand de capture et le ligand de détection ou un des ligands de détection peuvent être spécifiques de zones distinctes au niveau du composé dont ils sont spécifiques, de manière à éviter une compétition du ligand de capture et du ligand de détection vis-à-vis du composé dont ils sont spécifiques, en raison d'un encombrement stérique. Dans ce cas, si ledit ligand de détection et ledit ligand de capture sont des anticorps, il s'agit alors d'un « sandwich hétérologue ».
Dans un mode de réalisation préféré, un ligand de détection et un ligand de capture spécifiques du même composé ne se lient pas au même endroit sur ledit composé. Plus préférentiellement, ledit ligand de détection se lie à une zone dudit composé qui est éloignée de la zone de liaison avec ledit ligand de capture.
Dans un autre mode de réalisation préféré, un ligand de détection est identique à un ligand de capture, à l'exception de la présence éventuelle d'un marqueur de détection, et/ou se lie au composé dont il est spécifique au niveau de la même zone que celle liée par ledit ligand de capture, lorsque le composé dont il est spécifique est sous forme d'un complexe présentant au moins deux zones de liaison identiques.
Marqueur de détection
Un marqueur de détection peut être un marqueur direct ou un marqueur indirect. Un marqueur direct est un marqueur dont le signal peut être détecté directement, c'est-à-dire sans nécessiter l'ajout préalable d'un rapporteur.
Un marqueur direct est par exemple sélectionné dans le groupe consistant en un radio-isotope, un fluorochrome et un élément lourd de la classification périodique, tel qu'un lanthanide, un composé luminescent, un métal de transition tel que le ruthénium, un chromogène et des nanoparticules colorées, fluorescentes ou luminescentes.
Un « composé luminescent » désigne en particulier dans la présente demande un composé électroluminescent, thermoluminescent ou (de préférence) chimiluminescent. Un exemple de composé luminescent (plus précisément de composé thermoluminescent) que l'on peut utiliser comme marqueur direct consiste en des nanoparticules de silice comprenant (par exemple additionnée de ou dopée par (de l'anglais « doped »)) des molécules d'un composé dioxétane, en particulier le composé 1 ,2-dioxétane, ou d'un dérivé d'un composé dioxétane, par exemple un dérivé du 1 ,2- dioxétane.
Un marqueur indirect est un marqueur dont la détection du signal nécessite préalablement l'ajout d'un rapporteur, et le cas échéant l'ajout d'un substrat du marqueur couplé audit rapporteur.
Un rapporteur est un substrat du marqueur indirect ou une molécule se liant spécifiquement au marqueur indirect, ladite molécule étant elle-même un marqueur direct ou indirect ou étant elle-même couplée à un marqueur direct ou indirect.
Un marqueur indirect peut être par exemple une enzyme (en particulier une enzyme produisant un composé luminescent à partir d'un substrat), la biotine, l'avidine, la streptravidine, la neutravidine, un haptène, un antigène ou un anticorps.
Un rapporteur d'une enzyme est par exemple le substrat de la dite enzyme.
Un rapporteur d'un composé luminescent est par exemple une enzyme ou un catalyseur.
Un rapporteur de la biotine est par exemple l'avidine, la streptavidine ou la neutravidine, de préférence couplée à un marqueur direct ou à un marqueur indirect, tel qu'une enzyme ou un catalyseur.
Un exemple d'enzyme est la peroxydase, par exemple la peroxydase de raifort
(HRP).
Un rapporteur de la biotine préféré selon l'invention est la streptavidine couplée à une peroxydase, de préférence la peroxydase de raifort.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le marqueur de détection ou un des marqueurs de détection utilisé est ou a pour substrat le luminol (3- aminophthalhydrazide, appelé également 5-amino-2,3-dihydro-phthalazine-1 ,4-dione, de formule brute C8H7N3O2), l'isoluminol (appelé également 4-aminophthalhydrazide), un composé acridine, coelenterazine, dioxetane ou peroxyoxalic, ou un de leurs dérivés, et en particulier un composé décrit dans la publication_Docte/gne C. et al (2000), Talanta 51, 415-439, « Chemiluminescence as diagnostic tool. A review ».
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le marqueur de détection ou un des marqueurs de détection utilisés a pour substrat le luminol, l'isoluminol ou un de leurs dérivés. Un dérivé du luminol ou de l'isoluminol est, de préférence, une molécule obtenue à partir du luminol ou de l'isoluminol respectivement, par toute(s) modification(s) possible(s) (par exemple chimique et/ou enzymatique). Un dérivé du luminol ou de l'isoluminol est en particulier un substrat d'une enzyme peroxydase, la réaction de ladite enzyme peroxydase avec ledit dérivé du luminol ou isoluminol permettant la production d'un composé chimiluminescent.
Un dérivé de l'isoluminol peut être par exemple l'aminoethylisoluminol (ou AEI), l'aminoethylethylisoluminol (ou AEEI), l'aminobutylisoluminol (ou ABI), l'aminobutyléthylisoluminol (ou ABEI), l'aminopentyléthylisoluminol (ou APEI), l'aminohexylisoluminol (ou AHI), l'aminohexyléthylisoluminol (ou AHEI), l'aminooctylmethylisoluminol (ou AOMI) ou l'aminooctylethylisoluminol (ou AOEI), tels que décrits dans la publication Dodeigne C. et al (2000), Talanta 51, 415-439, « Chemiluminescence as diagnostic tool. A review ». Révélation
L'étape ou les étapes de révélation correspond(ent) à la détection du signal produit par le ou les marqueurs de détection.
Lorsque le signal détecté est un signal en fluorescence ou en luminescence, le « signal produit » est en particulier un « signal émis ».
L'étape ou les étapes de révélation dépend(ent) du type de marqueur utilisé.
Le signal produit ou émis par un marqueur direct de type fluorochrome peut être lu directement en fluorescence.
Un marqueur indirect de type enzyme, de type composé luminescent ou de type biotine nécessite l'ajout d'un rapporteur.
Comme indiqué ci-dessus, un marqueur indirect de type biotine nécessite l'ajout d'un rapporteur, de préférence d'un rapporteur couplé à un marqueur.
Si un rapporteur est couplé à un marqueur indirect, par exemple une enzyme, il est nécessaire d'ajouter dans une étape ultérieure un substrat de ce marqueur indirect, par exemple un substrat de cette enzyme.
A titre d'exemple, si un rapporteur est couplé à la peroxydase, il est nécessaire d'ajouter dans une étape ultérieure un substrat de cette enzyme, tel que le luminol.
Dans un mode de réalisation préféré, un signal est détecté en chimiluminescence, ledit signal étant produit par un composé chimiluminescent produit par la réaction d'une enzyme peroxydase avec son substrat, par exemple le luminol, l'isoluminol et/ou un dérivé du luminol ou de l'isoluminol. Cette réaction d'une enzyme peroxydase avec son substrat nécessite généralement également la présence d'un oxydant et, le cas échéant, d'un médiateur d'électrons.
Généralement, la réaction de chimiluminescence est effectuée au moyen d'un kit comprenant au moins deux solutions.
La première solution comprend le substrat de la peroxydase, par exemple le luminol, l'isoluminol et/ou un dérivé du luminol ou de l'isoluminol, et un médiateur d'électrons ; la deuxième solution comprend un oxydant. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser le kit « Immun-star western C » (Bio-Rad, Etats-Unis), « ELISTAR ETA C Ultra ELISA » (Cyanagen, Italie), « Supersignal West Pico » (Thermo Scientific, Etats-Unis), « Chemiluminescent Sensitive Plus HRP» (Surmodics, Etats-Unis).
Support solide approprié pour une analyse multiplexe sécurisée
Le ou les supports utilisés pour la mise en œuvre du procédé d'analyse selon l'invention sont des supports solides.
Un support solide peut être en toute matière appropriée pour la mise en œuvre du procédé d'analyse.
Un support solide est par exemple un support à base d'un polymère ou d'un mélange de polymères. Un support solide approprié selon l'invention est, par exemple, un support en polystyrène, polypropylène, poly(méth)acrylate, polybutadiène ou leurs combinaisons.
Un autre type de support solide approprié selon l'invention est par exemple un support inorganique, tel que le verre, et/ou un support métallique.
Un support peut être sous la forme d'une plaque, d'une microplaque, d'une lame, de billes, d'une membrane.
Un autre exemple de support solide approprié est une membrane, par exemple une membrane en nitrocellulose, PVDF (Polyfluorure de vinylidène), nylon ou leurs combinaisons.
Un support solide préféré est en polystyrène ou polypropylène. Dépendant de la technologie utilisée, le procédé d'analyse multiplexe peut être effectué au moyen d'un seul support solide, par exemple un support solide comprenant au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins deux spots, ou sur un ensemble de supports solides, par exemple un ensemble de billes.
Les contrôles selon l'invention sont transposables à une utilisation sur un seul support solide ou sur un ensemble de supports solides. Dans le premier cas, les contrôles et les moyens de détection des analytes sont sous forme de spots et dans le deuxième cas, les contrôles et les moyens de détection des analytes sont sous forme de billes.
Les billes (que l'on peut également appeler « particules », « microbilles » ou « microparticules » ) peuvent être en solution ou suspension ou fixées sur un autre support solide, par exemple une plaque, une microplaque, une lame, ou une membrane, et en particulier fixées au fond d'un ou plusieurs puits d'un support solide (par exemple d'une microplaque).
Selon le(s) support solide utilisé(s), un contrôle du dépôt de l'échantillon est appelé spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon; un contrôle du dépôt d'un ou plusieurs ligand(s) de détection d'un analyte est appelé spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte ou bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte ; et un contrôle de dépôt d'un rapporteur est appelé spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur ou bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Dans un mode de réalisation préféré, le ou les supports solides sont appropriés pour la mise en œuvre d'une analyse multiplexe sous forme d'un test immunologique de type sandwich.
Un support solide selon l'invention présente également l'avantage de pouvoir détecter des analytes indépendamment de la matrice de l'échantillon. Par exemple, la détection d'analytes présents dans le sang peut être mise en œuvre au moyen d'un support solide selon l'invention à partir d'un échantillon de sang ou d'un dérivé de sang, tel que plasma ou sérum, ou encore d'un mélange d'échantillons de sang et/ou de dérivés de sang. Support solide approprié pour une analyse multiplexe sécurisée sur spots
La présente invention a particulièrement pour objet un support solide approprié pour une analyse multiplexe d'au moins un échantillon, comprenant au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins un spot contrôle et au moins deux spots de détection d'un analyte, caractérisé en ce que ledit spot contrôle est sélectionné dans le groupe consistant en un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon, un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et un spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Un support solide comprend au moins un compartiment (appelé également zone d'analyse), de préférence au moins deux compartiments.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, un support solide comprend un unique compartiment. Ledit compartiment unique peut être un compartiment comprenant une ou plusieurs parois. Alternativement, ledit compartiment unique peut être dépourvu de parois, et s'assimiler alors au support solide lui-même. Le fond du compartiment peut alors consister en la face supérieure du support solide. Un exemple d'un tel support solide comprenant un unique compartiment comportant ou non une ou plusieurs parois est une lame ou une membrane.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention où un support solide (par exemple une lame ou une membrane) comprend un unique compartiment, typiquement, au moins un (par exemple un ou deux) support solide est utilisé par échantillon à analyser.
Lorsqu'un support solide comprend au moins deux compartiments, ils sont isolés les uns des autres, de sorte qu'ils ne communiquent pas entre eux, c'est-à-dire de sorte que les différentes compositions ou solutions utilisées pour l'analyse ne puissent pas circuler d'un compartiment à un autre pendant l'analyse. Ainsi, une solution ajoutée dans un compartiment ne va pas dans les autres compartiments. Par exemple, le ou les compartiments comprennent ou sont constitués d'un fond et d'une ou plusieurs parois, la ou lesdites parois isolant le ou les compartiments les uns des autres de sorte qu'ils ne communiquent pas entre eux.
Un compartiment du support solide est utilisé par échantillon à analyser.
Un exemple de compartiment est un puits.
Un support solide est par exemple une microplaque.
La microplaque est typiquement une microplaque de 96 puits ou de 384 puits.
Un compartiment du support utilisé pour analyser un échantillon comprend au moins trois spots, par exemple trois spots, quatre spots ou cinq spots, ou au moins six spots, de préférence six spots, sept spots, huit spots, plus préférentiellement au moins neuf spots, par exemple neuf spots, dix spots, onze spots, douze spots, treize spots, quatorze spots, quinze spots, seize spots ou plus de seize spots.
Par « spot », on entend ici une zone d'un compartiment d'un support solide comprenant au moins un composé d'intérêt lié à la surface dudit compartiment, notamment par des interactions physico-chimiques non covalentes (en particulier de type liaisons faibles, par exemple, ioniques, van der Waals, hydrogène et/ou hydrophobe) et/ou par des liaisons covalentes.
Un spot peut comprendre, outre le ou les composé(s) d'intérêt, au moins un polymère, en particulier au moins un polymère comportant des groupes hydrophiles, par exemple au moins un hydrogel. Par « au moins », on entend dans la présente demande un ou plusieurs, « plusieurs » signifiant en particulier deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, seize ou plus de seize.
Un spot correspond à une zone bien délimitée, généralement de forme sphérique ou ovale et de petite dimension, par exemple comprise de 0,0078 mm2 à 5,309 mm2, de préférence de 0,196 mm2 à 3,142 mm2, plus préférentiellement comprise de 0,503 mm2 à 2,01 1 mm2.
Un spot peut être de forme discoïdale, cylindrique ou approximativement discoïdale ou cylindrique, par exemple ovale, en particulier lorsqu'un support solide est une microplaque ou une lame.
Alternativement, un spot peut être de forme carrée ou rectangulaire (ce peut être en particulier une bande), par exemple lorsqu'un support solide est une membrane, ou de tout autre forme.
Les spots sont obtenus par des techniques bien connues de l'homme du métier, telles que celles divulguées dans les brevets US 7 470 547 B2, US 6 576 295 B2, US 5 916 524 A et US 5 743960 A.
Par exemple, un spot est obtenu par le dépôt d'au moins une goutte d'une solution contenant une quantité déterminée dudit ou desdits composé(s) d'intérêt à un endroit précis à la surface du compartiment.
Lorsqu'un spot comprend au moins un polymère (par exemple au moins un hydrogel), ledit spot peut être obtenu par le dépôt d'au moins une goutte d'une solution contenant une quantité déterminée dudit ou desdits composé(s) d'intérêt à un endroit précis à la surface du compartiment sur laquelle ledit polymère a été déposé au préalable.
Un spot peut également être obtenu par synthèse in situ dudit ou desdits composé(s) d'intérêt à un endroit précis à la surface du compartiment. Ledit ou lesdits composés d'intérêt sont dans ce cas qualifiés de sonde. Il peut s'agir d'un acide nucléique ou d'un peptide (voir par exemple le document US 5 143 854). La surface du compartiment est également appelée « phase solide ».
Un composé d'intérêt est généralement un ligand de capture, une molécule support couplée à un marqueur indirect ou un marqueur indirect. Le ligand de capture, la molécule support couplée à un marqueur indirect et le marqueur indirect sont notamment tels que définis ci-dessus. Dans un mode de réalisation avantageux, chaque compartiment d'un support solide comprend le même nombre de spots. De plus, chaque compartiment d'un support solide peut comprendre le même nombre de spots et la même composition en spots.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, un support peut comprendre un ou plusieurs compartiments sans spot, ou encore avec un nombre et/ou une composition de spots différent(s). Une partie ou la totalité d'un support peut par exemple comprendre au moins deux groupes distincts (ou types) de spots ou de compartiments, chacun des groupes distincts ayant un nombre et/ou une composition de spots différent(s).
Un compartiment comprend au moins un spot contrôle (par exemple au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon), de préférence au moins deux spots contrôle, et au moins deux spots de détection d'un analyte.
Un compartiment comprend généralement au moins un spot par analyte à détecter, chaque analyte pouvant par exemple correspondre à une infection ou une maladie à détecter, à l'évolution d'une infection ou maladie, à une condition (pathologique ou non) d'un sujet, à un risque de développer une condition (pathologique ou non) ou encore à un marqueur de résistance à un traitement. Plusieurs spots d'un compartiment peuvent également être destinés à l'analyse d'un même analyte.
Le spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte comprend, de préférence, un ligand de capture. Le ligand de capture est notamment tel que défini ci-dessus.
Un même spot peut comprendre plusieurs ligands de capture différents (par exemple plusieurs anticorps et/ou antigènes), qui sont généralement spécifiques d'une même infection ou maladie à détecter (en particulier spécifiques d'un même virus, d'une même bactérie ou d'un même parasite), ou spécifiques d'une même évolution d'une infection ou maladie, d'une même condition (pathologique ou non) d'un sujet, d'un même risque de développer une condition (pathologique ou non) ou d'un même marqueur de résistance à un traitement.
La présente invention a particulièrement pour objet un support solide approprié pour une analyse multiplexe d'au moins un échantillon, comprenant au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins un spot contrôle et au moins deux spots de détection d'un analyte, caractérisé en ce que ledit spot contrôle est un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte. Ledit compartiment peut en outre comprendre au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Dans un mode de réalisation préféré, le spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte comprend un ou au moins un ligand de capture, le ou lesdits ligands de capture n'étant pas un acide nucléique.
Plus généralement, le spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte ne comprend, de préférence, pas d'acide nucléique.
Dans un mode de réalisation préféré, le spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte comprend un ou au moins un ligand de capture sélectionné dans le groupe consistant en un anticorps, un antigène, un peptide, un glucide et un lipide.
La présente invention a particulièrement pour objet un support solide approprié pour une analyse multiplexe d'au moins un échantillon, comprenant au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins deux spots contrôle et au moins deux spots de détection d'un analyte, caractérisé en ce que lesdits spots contrôle sont sélectionnés dans le groupe consistant en un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon, un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et un spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Un support solide selon l'invention permet une analyse multiplexe sécurisée.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention a pour objet un support solide approprié pour une analyse multiplexe d'au moins un échantillon, comprenant au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins deux spots contrôle et au moins deux spots de détection d'un analyte, caractérisé en ce que lesdits spots contrôle sont sélectionnés parmi un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon et un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
Le ou les compartiments du support solide peuvent par exemple comprendre au moins deux spots pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou au moins deux spots pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
Dans un mode de réalisation préféré, le ou les compartiments du support solide comprennent au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon et au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
Comme expliqué ci-dessus, en cas de marquage indirect d'au moins un ligand de détection, il est utile que le ou les compartiments comprennent au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
La présente invention a également pour objet un support solide approprié pour une analyse multiplexe d'au moins un échantillon, comprenant au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon, au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte, au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur, et au moins deux spots de détection d'un analyte.
Le ou les compartiments du support solide peuvent donc comprendre plusieurs spots pour contrôler le dépôt d'un rapporteur, par exemple deux ou trois spots pour contrôler le dépôt d'un rapporteur, pour des analyses impliquant au moins deux marqueurs indirects différents. Dans un tel cas, chaque spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur est spécifique d'un marqueur.
Ensemble de billes approprié pour une analyse multiplexe sécurisée
Lorsqu'un support solide est une bille, le procédé d'analyse multiplexe d'un échantillon est réalisé avec un ensemble de billes.
La présente invention a ainsi également pour objet un ensemble de billes approprié pour une analyse multiplexe d'un échantillon, comprenant au moins une bille contrôle et au moins deux billes de détection d'un analyte, caractérisé en ce que la bille contrôle est sélectionnée dans le groupe consistant en une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon, une bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et une bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Par « au moins une bille X », on entend, dans la présente demande, au moins une bille X ou au moins un type (ou groupe) de billes X, « bille X » pouvant signifier « bille contrôle », « bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon », « bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte » ou « bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur ».
Un « type de billes » (ou « groupe de billes ») au sens de l'invention comprend ou consiste en plusieurs billes (par exemple 10, 50, 100, 200, 300 ou 500 billes), qui sont identiques entre elles ou du moins en plusieurs billes à la surface desquelles sont fixés le ou les mêmes composés d'intérêt.
De façon similaire, par « au moins deux billes X », on entend, dans la présente demande, respectivement, au moins deux billes X ou au moins deux types (ou « groupes ») distincts de billes X, « bille X » pouvant signifier « bille contrôle », « bille de détection d'un analyte », « bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon », «bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte » ou «bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur ».
Chaque bille est également recouverte d'au moins un composé d'intérêt lié à la surface de la bille, appelée également « phase solide ».
Un ensemble de billes utilisé pour analyser un échantillon comprend au moins trois billes (ou types de billes), par exemple trois, quatre ou cinq billes (ou types de billes), ou au moins six billes (ou types de billes), de préférence six, sept, huit billes (ou types de billes), plus préférentiellement au moins neuf billes (ou types de billes), par exemple neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze billes ou seize billes (ou types de billes), ou plus de seize billes (ou types de billes).
Par « bille », « particule », « microbille » ou « microparticule », on entend dans la présente demande toute particule, de préférence de forme sphérique ou approximativement sphérique, de taille pouvant être comprises de 0,3 μηι à 100 μηι de diamètre, de préférence de 0,5 μηι à 40 μηι. De telles particules sont fabriquées par exemple par les sociétés Luminex, Merck et Dynal. Une bille pouvant être utilisée dans le cadre de la présente invention peut également être une particule en forme de cube ou de pavé ou approximativement en forme de cube ou de pavé, dont la longueur des cotés serait par exemple comprise de 0,3 μηι à 100 μηι, de préférence de 0,5 μηι à 40 μηι.
Une bille selon l'invention est de préférence constituée d'un ou plusieurs polymères inertes vis à vis des constituants des échantillons biologiques; elle est solide et insoluble dans les échantillons à analyser. Des exemples de polymère inerte pouvant être utilisés sont un polyester, polyéther, polyoléfine, polyamide, polysaccharide, polyuréthane ou cellulose.
Un ou plusieurs groupes fonctionnels peuvent être incorporés avec le ou lesdits polymères inertes pour permettre la fixation ou le couplage d'un ou de plusieurs composés d'intérêt (par exemple protéines, peptides, glycoprotéines, lipides, glucides ou acides nucléiques). Ces groupes fonctionnels, connus de l'homme du métier, peuvent être sélectionnés dans le groupe consistant en des fonctions aminés (-NH2) ou ammonium (-NH3+ ou -NHR, R représentant une chaîne aliphatique, de préférence une chaîne :
- alkyle de 1 à z atomes de carbone, linéaire ou ramifiée (substituée ou non), z étant de préférence un nombre entier compris de 1 à 20, - alcényle de 2 à z atomes de carbone linéaire ou ramifiée, z étant de préférence un nombre entier compris de 1 à 20, ou
- un radical aryl),
des fonctions alcooliques (-OH), des fonctions carboxyliques (-COOH), des fonctions isocyanates (-NCO), des fonctions thiol (SH) ou des fonctions epoxy. Les monomères les plus couramment utilisés pour introduire des fonctions carboxyliques -COOH dans les polyoléfines sont l'acide acrylique ou l'acide méthacrylique.
Une bille est en effet recouverte avec un ou plusieurs composés d'intérêt, en utilisant toute méthode appropriée bien connue de l'homme du métier. La fixation du ou des composés d'intérêt sur la surface d'une bille peut se faire par attraction électrostatique, interaction d'affinité, interaction hydrophobe et/ou couplage covalent. Dans un mode de réalisation préféré, le ou les composés d'intérêt sont fixés à la surface de la bille par couplage covalent.
Les méthodes de fixation d'un ou de plusieurs composés à la surface d'une bille sont bien connues de l'homme du métier (cf. par exemple LUMINEX xMAP® Antibody Coupling KitUser Manual, l'article de Joseph Dasso et al. (Journal of Immunological Methods 263 (2002) 23- 33) ou le document W01997/014028).
Par exemple, dans le cas d'une bille comprenant des fonctions chimiques carboxyles à sa surface, ces fonctions chimiques peuvent être converties en une forme ester activée par une réaction avec le 1 -ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride et le N-hrydroxysulfosuccinimide. Un composé d'intérêt, tel qu'un anticorps, une protéine ou un peptide, peut alors être greffé, par un groupe aminé libre présent sur ledit composé d'intérêt, sur les groupements ester activés de chaque bille. La conversion en une forme ester activé et le couplage du composé d'intérêt sur une bille sont réalisés selon des procédures bien connues de l'homme du métier (cf. par exemple US 7 141 362).
Les billes ou une partie des billes d'un ensemble de billes sont de préférence des billes magnétiques, telles que des billes de la technologie Luminex xMAP®, afin de permettre la récupération des billes entre les différentes étapes du procédé, et notamment à l'issue des étapes de lavage.
Chaque bille est marquée par un code de manière à pouvoir la différencier des autres billes de l'ensemble de billes, par exemple par un code en fluorescence ou un code-barres.
Le marquage d'une bille avec un code, par exemple en fluorescence ou un code- barres, peut être réalisé par toute méthode appropriée bien connue de l'homme du métier, par exemple comme décrit dans les documents EP 1 802 710 et EP 1 049 807.
Comme pour un support solide comprenant au moins un compartiment, un composé d'intérêt est généralement un ligand de capture, une molécule support couplée à un marqueur indirect, ou un marqueur indirect. Le ligand de capture, la molécule support couplée à un marqueur indirect et le marqueur indirect sont notamment tels que définis ci-dessus.
L'ensemble de billes selon l'invention comprend une bille (ou un type de billes) par contrôle souhaité et au moins une bille (ou au moins un type de billes) par analyte à détecter. Plusieurs billes (ou un types de billes) peuvent également être destinées à la détection d'un même analyte. La bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte comprend, de préférence, un ligand de capture. Le ligand de capture est notamment tel que défini ci-dessus.
Une même bille (ou chaque bille d'un type de billes donné) peut être recouverte de plusieurs ligands de capture différents (par exemple plusieurs anticorps et/ou antigènes), qui sont généralement spécifiques d'une même infection à détecter, et en particuliers spécifiques d'un même virus, d'une même bactérie ou d'un même parasite.
L'ensemble de billes comprend donc au moins une bille contrôle (par exemple au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon), de préférence au moins deux billes contrôle, et au moins deux billes de détection d'un analyte.
Au moins un ensemble de billes est utilisé par échantillon à analyser.
La présente invention a particulièrement pour objet un ensemble de billes approprié pour une analyse multiplexe d'au moins un échantillon, comprenant au moins une bille contrôle et au moins deux billes de détection d'un analyte, caractérisé en ce que ladite bille contrôle est une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou une bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte. Ledit ensemble de billes peut en outre comprendre au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Dans un mode de réalisation préféré, la bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte comprend un ou au moins un ligand de capture, le ou lesdits ligands de capture n'étant pas un acide nucléique.
Plus généralement, la bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte ne comprend, de préférence, pas d'acide nucléique.
Dans un mode de réalisation préféré, la bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte comprend un ou au moins un ligand de capture sélectionné dans le groupe consistant en un anticorps, un antigène, un peptide, un glucide et un lipide.
La présente invention a particulièrement pour objet un ensemble de billes approprié pour une analyse multiplexe d'un échantillon, comprenant au moins deux billes contrôle et au moins deux billes de détection d'un analyte, caractérisé en ce que lesdites billes contrôle sont sélectionnées dans le groupe consistant en une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon, une bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et une bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention a pour objet un ensemble de billes approprié pour une analyse multiplexe d'un échantillon, comprenant au moins deux billes contrôle et au moins deux billes de détection d'un analyte, caractérisé en ce que lesdites billes contrôle sont choisies parmi une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon et une bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
L'ensemble de billes peut, par exemple, comprendre au moins deux billes pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou au moins deux billes pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
Dans un mode de réalisation préféré, l'ensemble de billes comprend au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon et au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
Comme expliqué ci-dessus, en cas de marquage indirect d'au moins un ligand de détection d'un analyte, il est avantageux d'utiliser au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
La présente invention a également pour objet un ensemble de billes approprié pour une analyse multiplexe d'un échantillon, comprenant au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon, au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte, au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur et au moins deux billes de détection d'un analyte.
L'ensemble de billes peut donc comprendre au moins deux billes pour contrôler le dépôt d'un rapporteur, par exemple deux ou trois billes pour contrôler le dépôt d'un rapporteur, pour des analyses impliquant au moins deux marqueurs indirects différents. Dans un tel cas, chaque bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur est de préférence spécifique d'un marqueur.
L'ensemble de billes selon l'invention permet une analyse multiplexe sécurisée.
Contrôle du dépôt d'un échantillon
Le contrôle du dépôt d'un échantillon permet de vérifier la mise en présence de l'échantillon avec les spots d'un compartiment du support solide ou avec un ensemble de billes.
Le contrôle du dépôt d'un échantillon comprend au moins un ligand de capture, en particulier un anticorps ou un antigène, spécifique d'un composé contrôle naturellement présent dans l'échantillon à l'analyser. Le composé contrôle est notamment tel que défini ci-dessus.
Ainsi, un signal détecté au niveau du contrôle du dépôt d'un échantillon permet de valider l'étape de dépôt de l'échantillon. Le dépôt d'un échantillon consiste à ajouter l'échantillon à analyser dans un compartiment du support solide selon l'invention comprenant au moins un spot contrôle et au moins deux spots de détection d'analytes ou à mettre en présence l'échantillon avec au moins un ensemble de billes selon l'invention.
Un composé contrôle se fixe alors au ligand de capture au niveau du contrôle de dépôt de l'échantillon. Un composé contrôle ainsi fixé peut être détecté par un ligand de détection spécifique du composé contrôle.
De préférence, un ligand de détection d'un composé contrôle est spécifique d'une zone du composé contrôle éloignée de la zone du composé contrôle à laquelle se lie spécifiquement le ligand de capture utilisé, de manière à éviter une compétition du ligand de capture et du ligand de détection vis-à-vis du composé contrôle, en raison d'un encombrement stérique.
Lorsqu'un composé contrôle est un complexe d'au moins deux molécules, le ligand de détection ou un des ligands de détection peut être spécifique d'une des deux molécules et le ligand de capture ou un des ligands de capture spécifique de l'autre molécule du complexe.
Alternativement, lorsqu'un composé contrôle est un complexe d'au moins deux molécules, le ligand de détection ou un des ligands de détection et le ligand de capture ou un des ligands de capture peuvent être spécifiques de la même molécule, et même de la même zone de cette molécule, lorsque le complexe comprend au moins deux de ces molécules identiques, permettant ainsi la fixation simultanée de l'anticorps de détection et de l'anticorps de capture sur le complexe.
Par exemple, lorsqu'un composé contrôle est le récepteur soluble de la transferrine complexé à la transferrine, un contrôle de dépôt peut comprendre, en tant que ligand de capture, un anticorps spécifique soit de la transferrine, soit du récepteur soluble de la transferrine. De préférence, le ligand ou un des ligands de capture est un anticorps spécifique du récepteur soluble de la transferrine, afin d'éviter des interférences avec la transferrine libre pouvant se trouver dans un échantillon de sang.
Dans un mode de réalisation préféré, le ligand ou un des ligands de capture du contrôle de dépôt est spécifique du récepteur soluble de la transferrine et le ligand de détection ou un des ligands de détection du ou d'un composé contrôle est soit spécifique de la transferrine, soit spécifique du récepteur soluble de la transferrine.
Dans certains modes de réalisation, un contrôle du dépôt d'un échantillon permet également de vérifier qu'un ou plusieurs ligands de détection d'analytes ont été mis en présence avec les spots d'un compartiment d'un support solide ou avec un ensemble de billes, lorsque ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes ne sont pas ajoutés en même temps que l'échantillon à analyser, mais par exemple à une étape ultérieure, simultanément à l'ajout du ou des ligands de détection du composé contrôle. Par « simultanément à l'ajout du ou des ligands de détection du composé contrôle», on entend généralement que ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes sont ajoutés sous la forme d'une solution comprenant ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes et le ou les ligands de détection du composé contrôle.
Alternativement ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes et ledit ou lesdits ligands de détection du composé contrôle peuvent être ajoutés à la même étape mais sous la forme de solutions distinctes.
En effet, lorsqu'un échantillon à analyser comprend un composé qui pourrait interférer avec le ligand de détection du composé contrôle, il peut être nécessaire d'ajouter le ligand de détection du composé contrôle dans une étape ultérieure à l'étape de dépôt de l'échantillon, en particulier après l'étape de dépôt de l'échantillon suivie d'au moins une étape de lavage. Dans ce cas, tout ou partie des ligands de détection des analytes peuvent être ajoutés en même temps que le ligand de détection du composé contrôle. Le contrôle de dépôt permet alors également de valider la mise en présence de ces ligands de détection des analytes avec les spots d'un compartiment du support solide ou avec l'ensemble de billes.
Par exemple, un échantillon de sang comprend à la fois le récepteur soluble de la transferrine complexé à la transferrine et de la transferrine libre, c'est-à-dire non liée au récepteur. Ainsi, si le ligand ou un des ligands de détection est un anticorps spécifique de la transferrine et qu'il est ajouté en même temps que l'échantillon, il risquerait de se lier en partie à la transferrine libre et la détection du composé contrôle serait faussée. Dans un tel cas, ledit ligand de détection du composé contrôle est apporté dans une étape ultérieure, c'est-à-dire après l'étape de dépôt de l'échantillon suivie d'au moins une étape de lavage.
Dans un mode de réalisation particulier, le ou les contrôles du dépôt d'un échantillon ne comprennent pas un anticorps spécifique du facteur XIII (i.e. ni un anticorps spécifique de la forme tétramérique, ni un anticorps spécifique d'une sous-unité du facteur XIII). De préférence, le ou les contrôles du dépôt d'un échantillon ne comprennent pas un ligand de capture spécifique du facteur XIII (i.e. ni un ligand de capture spécifique de la forme tétramérique, ni un ligand de capture spécifique d'une sous-unité du facteur XIII).
Dans un mode de réalisation particulier, le ou les contrôles du dépôt d'un échantillon ne comprennent pas un ligand de capture spécifique (en particulier un anticorps spécifique) d'une IgG, d'une IgM ou plus généralement d'une immunoglobuline (en particulier une IgG humaine, une IgM humaine ou une immunoglobuline humaine). Il peut être avantageux d'utiliser au moins deux contrôles du dépôt d'un échantillon, ces contrôles détectant des composés contrôles différents et/ou un même composé contrôle mais avec des sensibilités différentes, par exemple lorsque la concentration du composé contrôle peut varier, par exemple en fonction de la nature de l'échantillon et/ou de la condition du sujet dont est issu l'échantillon.
Contrôle du dépôt d'un liqand de détection d'un analyte
Le contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte permet de vérifier la mise en présence d'un ou des ligands de détection d'analytes déposés simultanément au ligand de détection d'un additif et/ou d'un ou des ligands de détection d'analytes déposés simultanément à un additif, avec les spots d'un compartiment d'un support solide ou avec un ensemble de billes.
Par « déposés simultanément au ligand de détection d'un additif », on entend généralement que ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes sont ajoutés sous la forme d'une solution comprenant ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes et le ou les ligands de détection d'un additif. Alternativement ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes et/ou le ou les ligands de détection d'un additif peuvent être ajoutés à la même étape mais sous la forme de solutions distinctes.
Par « déposés simultanément à un additif », on entend généralement que ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes sont ajoutés sous la forme d'une solution comprenant ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes et un additif. Alternativement ledit ou lesdits ligands de détection d'analytes et/ou un ou des additifs peuvent être ajoutés à la même étape mais sous la forme de solutions distinctes.
Le contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte permet également de vérifier les étapes d'incubation et de lavage. En effet, la concentration de l'additif mis en présence des spots d'un compartiment du support solide ou d'un ensemble de billes étant connue, une variation du signal détecté permet d'identifier une déficience du procédé au niveau des étapes du procédé, et notamment des étapes d'incubation et de lavage. Cela peut notamment permettre d'éviter des « faux positifs » résultant d'étapes d'incubation et/ou d'étapes de lavage déficientes, c'est-à-dire non réalisées ou mal réalisées.
Un « faux positif » est un résultat positif traduisant la présence d'un ou de plusieurs analytes à détecter dans un échantillon, alors que ledit ou lesdits analytes n'étaient pas présents dans l'échantillon et n'auraient donc pas dû être détectés. Le contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte comprend au moins un ligand de capture spécifique d'un additif qui n'est pas présent dans l'échantillon à analyser et qui est utilisé lors de la mise en œuvre du procédé d'analyse multiplexe. Un additif est notamment tel que défini ci-dessus.
Ainsi, un signal détecté au niveau du contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte permet de valider l'étape de dépôt du ou des ligands de détection d'analytes déposés en même temps que le ligand de détection d'un additif.
Un additif mis en présence des spots et/ou d'un ensemble de billes se fixe au ligand de capture au niveau du contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte. Un additif ainsi fixé peut être détecté par un ligand de détection spécifique dudit additif.
Par exemple, lorsqu'un additif comprend de la digoxigénine, un ligand de capture du contrôle de procédé peut être un anticorps spécifique de la digoxigénine. De préférence, un ligand de détection d'un l'additif est également un anticorps spécifique de la digoxigénine.
Il peut être avantageux d'utiliser plusieurs contrôles du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte différents et donc autant d'additifs différents, par exemple si les ligands de détection des analytes sont ajoutés à plusieurs étapes différentes, en particulier au cours d'au moins trois étapes différentes.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention,
- un composé contrôle qui se fixe à un ligand de capture d'un contrôle de dépôt d'un échantillon lors de la mise en œuvre du procédé d'analyse de l'invention est détecté par un ligand de détection spécifique dudit composé contrôle (format immunologique de type sandwich), et
- un additif qui se fixe à un ligand de capture d'un contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte lors de la mise en œuvre du procédé d'analyse est détecté par un ligand de détection spécifique dudit additif (format immunologique de type sandwich).
Ces formats immunologiques de type sandwich permettent d'atteindre un haut niveau de spécificité et/ou de sensibilité, par comparaison à d'autres formats immunologique et en particulier des formats indirects.
Contrôle du dépôt d'un rapporteur
Le contrôle du dépôt d'un rapporteur permet de vérifier la mise en présence d'un rapporteur de marqueur de détection avec les spots d'un compartiment d'un support solide ou avec un ensemble de billes. Le contrôle du dépôt d'un rapporteur n'a un intérêt qu'en cas de marquage indirect d'au moins un ligand de détection d'un analyte.
Le contrôle du dépôt d'un rapporteur comprend un marqueur indirect ou une molécule support couplée à un marqueur indirect.
Le marqueur indirect du contrôle du dépôt d'un rapporteur est identique au marqueur indirect couplé à au moins un ligand de détection d'un analyte.
Si au moins deux marqueurs indirects différents sont utilisés pour détecter au moins deux ligands de détection d'analytes, il est préférable d'utiliser un contrôle du dépôt d'un rapporteur pour chaque marqueur.
Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, un seul et même marqueur indirect est utilisé pour le marquage du ou des ligands de détection, et donc un seul contrôle du dépôt d'un rapporteur peut être utilisé.
Ainsi, un signal détecté au niveau du contrôle du dépôt d'un rapporteur permet de valider l'étape de dépôt du rapporteur du marqueur de détection correspondant.
Le rapporteur se fixe ainsi au marqueur de détection au niveau du contrôle du dépôt d'un rapporteur et un signal est obtenu, si nécessaire après ajout d'un substrat du marqueur dudit rapporteur, en cas de contrôle du dépôt d'un rapporteur positif.
Par exemple, lorsque le marqueur indirect est la biotine, le contrôle du dépôt d'un rapporteur comprend de la biotine ou une molécule support couplée à de la biotine.
Procédé d'analyse multiplexe sécurisée
La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'analyse multiplexe pour la détection d'au moins n analytes dans au moins un échantillon, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, ledit procédé comprenant au moins les étapes a), c) et e), au moins les étapes a), c) et f) ou au moins les étapes a), b), c) et d) suivantes :
a) fournir au moins un support solide comprenant au moins un compartiment tel que défini ci-dessus ou au moins un ensemble de billes tel que défini ci- dessus,
b) mettre en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes : I ligands de détection de p analytes à détecter et, le cas échéant, au moins un additif, I étant de préférence supérieur ou égal à p,
c) mettre un échantillon à analyser en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes,
d) mettre en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes : Γ ligands de détection de m analytes à détecter et, le cas échéant, au moins un ligand de détection dudit ou desdits additifs, Γ étant de préférence supérieur ou égal à m,
e) mettre en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes : au moins un ligand de détection d'un composé contrôle et I" ligands de détection de y analytes à détecter, I" étant de préférence supérieur ou égal à y, et
f) éventuellement mettre au moins un rapporteur en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes,
g) éventuellement, en particulier lorsque ledit ou un desdits rapporteurs de l'étape f est couplé à un marqueur, en particulier à un marqueur indirect (par exemple une enzyme), mettre au moins un deuxième rapporteur dudit marqueur couplé au rapporteur de l'étape f) (par exemple un substrat, tel que le luminol, l'isoluminol ou un de leurs dérivés) en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes,
I, Γ, I", m, p et y étant des nombres entiers supérieurs ou égaux à 0 et la somme m+p+y étant supérieure ou égale à 1 .
Un procédé pour la détection d'au moins n analytes peut consister à détecter un nombre d'analytes différents qui est inférieur à n, lorsqu'au moins deux analytes à détecter sont identiques. Par exemple, au moins deux spots d'un compartiment d'un support solide ou au moins deux billes (ou types de billes) d'un ensemble de billes sont destinés à la détection d'un même analyte.
Le nombre « n » est généralement égal au nombre de spots de détection d'un analyte d'un compartiment d'un support solide ou au nombre de billes (ou types de billes) de détection d'un analyte d'un ensemble de bille.
De préférence, la somme m+p+y est comprise de 1 à n.
Lorsque plusieurs analytes à détecter sont identiques, il est possible d'utiliser un même ligand de détection pour au moins deux ou la totalité des analytes identiques. La somme m+p+y peut alors être supérieure ou égale à 1 et strictement inférieur à n.
Dans un autre mode de réalisation, la somme m+p+y est égale à n, par exemple lorsqu'il y a n spots de détection d'un analyte dans un compartiment d'un support solide ou n billes (ou types de billes) de détection d'un analyte d'un ensemble de bille.
Comme détaillé ci-après, les étapes a) à e) peuvent être réalisées simultanément et/ou successivement (par exemple, certaines de ces étapes peuvent être réalisées simultanément alors que d'autres sont réalisées successivement), au moins pour deux d'entre elles dans l'ordre a) à e) ou dans un autre ordre, l'étape a) étant toujours la première étape réalisée ; lorsque le procédé comprenant l'étape f) et éventuellement l'étape g), ces étapes sont toujours réalisées ultérieurement aux étapes a) à e).
Lorsque le procédé comprend au moins les étapes a), c) et e), un support solide comprend au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon, ou un ensemble de billes comprend au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon.
Lorsque le procédé comprend au moins les étapes a), c) et f), un support solide comprend au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur, ou un ensemble de billes comprend au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Lorsque l'étape b) comprend la mise en présence des spots ou de l'ensemble de billes avec au moins un additif, l'étape d) comprend, de préférence, la mise en présence des spots ou de l'ensemble de billes avec au moins un ligand de détection dudit ou desdits additifs
Lorsque le procédé comprend au moins les étapes a), b), c) et d), au moins un additif étant mis en présence des spots ou de l'ensemble de billes à l'étape b) et au moins un ligand de détection dudit ou desdits additifs étant mis en présence des spots ou de l'ensemble de billes à l'étape d), un support solide comprend au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte, ou un ensemble de billes comprend au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
Lorsque le procédé comprend les étapes a), b), c) et d), mais ne comprend pas l'étape e), au moins un additif est mis en présence des spots ou de l'ensemble de billes à l'étape b) et au moins un ligand de détection dudit ou desdits additifs est mis en présence des spots ou de l'ensemble de billes à l'étape d).
L'expression « mettre un composé X en présence des spots d'un compartiment » signifie que le composé X est ajouté dans un compartiment comprenant lesdits spots, ledit compartiment étant destiné à analyser un échantillon.
L'expression « mettre un composé X en présence d'un ensemble de billes » signifie que le composé X est mis en présence d'au moins un ensemble de billes destiné à analyser un échantillon dans tout récipient approprié contenant ledit ensemble de billes. Un exemple de récipient approprié est un microtube, une microplaque ou une cuve réactionnelle.
Lorsqu'au moins deux des étapes b) à f) sont réalisées simultanément, le, les ou des composés X peuvent être mis séparément en présence du ou des spots d'un compartiment ou de la ou des billes ou du ou des ensembles de billes destinés à analyser un échantillon, c'est-à-dire sous la forme de compositions distinctes. Alternativement, ces composés X ou certains de ces composés X peuvent être mis en présence du ou des spots d'un compartiment ou de la ou des billes ou du ou des ensembles de billes destinés à analyser un échantillon sous la forme d'un ou plusieurs mélanges.
Les différents composés sont mis en présence des spots de chaque compartiment ou de chaque ensemble de billes pendant une certaine durée, par exemple de 1 seconde à 2 heures, de préférence 1 minute à 1 heure, plus préférentiellement 5 minutes à 50 minutes, plus préférentiellement encore de 10 minutes à 40 minutes.
L'homme du métier sait déterminer la température appropriée pour chaque étape d'incubation. La température d'une incubation peut par exemple être de 4°C, une température comprise de 19°C à 24°C, 37°C ou 40°C.
Les différents constituants utilisés au cours des étapes b), d), e), f) et g) sont bien connus de l'homme du métier. Ils permettent par exemple la formation de complexes antigènes-anticorps, marqueur-rapporteur.
L'étape a) consiste à fournir un support solide tel que défini ci-dessus comprenant au moins un compartiment ou au moins un ensemble de bille tel que défini ci-dessus.
L'étape a) signifie notamment que le procédé d'analyse multiplexe est mis en œuvre au moyen dudit support solide ou dudit ensemble de billes, c'est-à-dire en utilisant ledit support solide ou ledit ensemble de billes.
Le procédé d'analyse multiplexe selon l'invention est donc mis en œuvre soit en utilisant un support solide avec compartiment(s), par exemple de type microplaque, soit avec un ensemble de billes.
Pour x échantillons à analyser, l'étape a) consiste à fournir :
un support solide comprenant au moins x compartiments ou encore plusieurs supports solide de manière à avoir au moins x compartiments avec l'ensemble des supports solides (par exemple, lorsqu'un support solide ne comporte qu'un seul compartiment, qui peut, dans un mode de réalisation particulier, s'assimiler au support solide lui-même, fournir au moins x supports solides), ou au moins x ensembles de billes.
Le procédé d'analyse multiplexe selon l'invention permet par exemple la détection de n analytes dans au moins 1 échantillon, au moins deux échantillons, au moins 5 échantillons, au moins 10 échantillons, de préférence au moins 20 échantillons, par exemple au moins 40 échantillons, au moins 60 échantillons ou encore au moins 80 échantillons.
Le nombre n est un nombre entier supérieur ou égal à 2, par exemple 2, 3, 4, 5, de préférence supérieur ou égal à 6, par exemple 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou supérieur à 18.
Lorsque des étapes ne sont pas réalisées simultanément, elles sont généralement suivies d'une ou plusieurs étapes de lavage.
Une étape de lavage permet d'éliminer les composés non liés aux spots ou aux billes ou aux différents composés liés auxdits spots ou auxdites billes.
Typiquement, une étape de lavage consiste en au moins un cycle, de préférence au moins deux cycles, plus préférentiellement 3 à 6 cycles, de distribution (par exemple un volume de 400 μί) et aspiration d'une solution de lavage dans chaque compartiment ou en présence de chaque ensemble de billes. Typiquement, la solution de lavage peut être un tampon Tris NaCI 0,01 M, pH 7,4 additionné de Tween 20 à 0,1 %.
Lorsque le procédé est mis en œuvre avec au moins un support solide comprenant au moins deux compartiments, les compartiments du ou des supports solides sont, de préférence, identiques, en particulier en termes de nombre et composition des spots.
Alternativement, le procédé peut être mis en œuvre avec au moins un support solide comprenant au moins deux groupes distincts (ou types) de compartiments, chacun des groupes distincts ayant un nombre et/ou une composition de spots différent(s).
Lorsque le procédé est mis en œuvre avec au moins deux ensembles de billes, les ensembles de billes peuvent être identiques, en particulier en termes de nombre et composition des billes.
Alternativement, le procédé peut être mis en œuvre avec au moins deux groupes distincts (ou types) d'ensembles de billes différents, en particulier chacun des groupes distincts d'ensembles de billes ayant un nombre et/ou composition de billes différent(s).
Les étapes b), d), e) et f) sont réalisées dans chaque compartiment destiné à analyser un échantillon ou dans chaque récipient contenant un ensemble de billes destiné à analyser un échantillon.
S'agissant de l'étape c), un échantillon est ajouté par compartiment ou par récipient contenant un ensemble de billes.
Le ou les échantillons, les analytes, le ou les additifs, le ou les composés contrôle, les ligands de détection des analytes, le ou les ligands de détection du ou des additifs, le ou les ligands de détection du ou des composés contrôle et le ou les rapporteurs sont notamment tels que définis ci-dessus dans les paragraphes correspondants. Un additif utilisé dans le procédé selon l'invention est un additif reconnu par le ou les ligands de capture du contrôle de dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
Un composé contrôle présent dans l'échantillon est un composé contrôle reconnu par le ou les ligands de capture du contrôle du dépôt d'un échantillon.
Chaque ligand de détection d'un analyte est spécifique d'un analyte reconnu par au moins un ligand de capture présent dans un spot de détection d'un analyte ou sur une bille de détection d'un analyte.
Lorsque l'étape b) n'est pas réalisée simultanément avec l'une des étapes c), d) ou e), une ou plusieurs étapes de lavages peuvent être réalisées après l'étape b) et avant lesdites étapes c), d) et e) uniquement lorsque I est égal à 0.
Les étapes b), c), d) et e), lorsqu'elles sont présentes, peuvent être réalisées dans n'importe quel ordre souhaité : successivement, ou une, deux ou ces trois étapes simultanément. Toutefois, lorsqu'une étape b) et une étape d) mettent en œuvre respectivement au moins un additif et au moins un ligand de détection dudit additif, ladite étape d) est toujours réalisée simultanément ou ultérieurement à ladite étape b). De la même façon, une étape e), lorsqu'elle est présente, est toujours réalisée simultanément ou ultérieurement à l'étape c), ou encore avant l'étape c) à condition qu'il n'y ait pas d'étape de lavage entre l'étape e) et c). Par ailleurs, lorsque l'étape c) est réalisée après une étape b) dans laquelle I est supérieur ou égal à 1 et/ou après une étape d) dans laquelle Γ est supérieur ou égal à 1 et/ou après l'étape e), aucune étape de lavage n'est réalisée entre cette ou ces étapes et l'étape c).
A titre d'exemple, les étapes b) à e), lorsqu'elles sont présentes, peuvent être réalisées simultanément et/ou successivement, dans les ordres suivants : b) à e), b) c) e) d), c) b) d) e), c) b) e) d) ou c) e) b) d).
Les étapes c), d) et/ou e) peuvent être réalisées simultanément à l'étape b).
Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, les étapes b) et c) sont réalisées simultanément.
Dans un autre mode de réalisation avantageux selon l'invention, les étapes c) et d) sont réalisées simultanément. Il peut en effet être avantageux de mettre en présence l'échantillon simultanément aux ligands de détection des analytes qui interagissent mieux en solution avec l'analyte dont ils sont spécifiques que lorsque l'analyte est déjà lié à l'anticorps de capture de l'analyte.
Dans encore un autre mode de réalisation avantageux selon l'invention, les étapes b), c) et d) sont réalisées simultanément.
Lorsque plusieurs additifs sont utilisés, le procédé peut comporter une ou plusieurs étapes b) (et une ou plusieurs étapes d)), chacune des étapes b) pouvant être réalisée indépendamment avant, après ou simultanément à l'étape c). Il peut par exemple y avoir au moins deux étapes b), l'une étant réalisée avant ou simultanément à l'étape c), l'autre étant réalisée après ou simultanément à l'étape c).
Les composés d'une étape donnée peuvent être apportés sous la forme d'un mélange, c'est-à-dire d'une solution, qui comprend l'ensemble des composés de cette étape et éventuellement les composés d'une ou plusieurs étapes réalisées simultanément.
Lorsque deux ou plus de deux étapes sont réalisées simultanément, les composés de ces différentes étapes peuvent être apportés sous forme d'un ou plusieurs mélanges, c'est-à-dire d'une ou plusieurs solutions, de préférence sous la forme d'un seul mélange (c'est-à-dire d'une seule solution).
Par exemple, lorsque les étapes b), c) et d) sont réalisées simultanément, les ou les additifs (lorsqu'ils sont présents), les I ligands de détection de chacun des p analytes à détecter, le ou les ligands de détection dudit ou desdits additifs (lorsqu'ils sont présents), les I" ligands de détection de chacun des m analytes à détecter peuvent être apportés sous la forme d'un seul mélange.
Dans un mode de réalisation avantageux, Γ est égal à n, c'est-à-dire qu' au moins n ligands de détection des n analytes sont ajoutés à l'étape d).
Dans certains modes de réalisation, l'étape e) est réalisée postérieurement à l'étape c). Il s'agit notamment du cas où la présence du ou d'un des ligands de détection d'un composé contrôle en même temps que l'échantillon risque de provoquer des interférences.
Par exemple, lorsque le ligand de détection du composé contrôle est un anticorps spécifique de la transferrine et que l'échantillon comprend de la transferrine libre, l'étape e) est réalisée postérieurement à l'étape c).
Lorsque l'étape e) est réalisée postérieurement à l'étape c), de préférence au moins une étape de lavage des compartiments est réalisée après l'étape c) et avant l'étape e).
Lorsque le procédé selon l'invention comprend l'étape f), cette étape est toujours réalisée ultérieurement aux étapes a) à e) et elle est généralement précédée d'au moins une étape de lavage des spots de chaque compartiment ou de chaque ensemble de billes. Le procédé peut également comprendre plusieurs étapes f) si au moins deux contrôles de dépôt d'un rapporteur sont utilisés, à savoir de préférence une étape f) par rapporteur.
Lorsque le procédé selon l'invention comprend une étape g), cette étape est toujours réalisée ultérieurement à une étape f) et elle est généralement précédée d'au moins une étape de lavage des spots de chaque compartiment ou de chaque ensemble de billes.
Le ou au moins un des rapporteurs de l'étape f) est, de préférence, à la fois un rapporteur d'un marqueur de détection indirect couplé à au moins un ligand de détection d'un analyte et celui d'un marqueur de détection présent dans au moins un contrôle du dépôt d'un rapporteur.
Il peut être avantageux que les contrôles utilisés pour la mise en œuvre du procédé d'analyse multiplexe selon l'invention miment les différentes étapes de la détection des analytes. Par exemple, si les ligands de capture des analytes et les ligands de détection des analytes sont des anticorps, le ligand de détection de l'additif et, de préférence, le ligand de détection du composé contrôle sont également des anticorps. De même, le ligand de détection de l'additif et, de préférence, le ligand de détection du composé contrôle sont marqués avec le même marqueur que celui des ligands de détection des analytes.
Le procédé selon l'invention comprend généralement une étape h) de détection du signal correspondant aux marqueurs de détection du ou des contrôles (en particulier du ou des spots contrôle ou de la ou des billes contrôle) et du ou des analytes.
Un contrôle est positif si un signal positif est détecté à la fin du procédé.
Un contrôle est négatif en l'absence de signal positif détecté à la fin du procédé. La détection d'un signal positif pour chaque contrôle utilisé lors de la mise en œuvre du procédé permet de valider l'ensemble du procédé.
L'absence de signal au niveau d'un ou plusieurs contrôles signifie qu'une ou plusieurs étapes ne se sont pas déroulées correctement. Dans ce cas, les résultats obtenus ne doivent pas être utilisés.
Lorsqu'un ligand de détection d'un composé contrôle est déposé ultérieurement au dépôt de l'échantillon et après au moins une étape de lavage, un contrôle du dépôt d'un échantillon négatif signifie que l'échantillon n'a pas été déposé et/ou que ledit ligand de détection d'un composé contrôle n'a pas été déposé.
Le contrôle du dépôt d'un échantillon, le contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et, le cas échéant, le contrôle du dépôt d'un rapporteur sont complémentaires et permettent de s'assurer du bon déroulement de chacune des étapes du procédé et permettent de comprendre l'origine d'un éventuel défaut rencontré dans le procédé d'analyse.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre :
- au moins deux étapes b) et au moins deux étapes d), lorsqu'au moins deux contrôles du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte sont utilisés,
- au moins deux étapes f), lorsqu'au moins deux contrôles du dépôt d'un échantillon sont utilisés, et/ou
- au moins deux étapes f), lorsqu'au moins deux contrôles du dépôt d'un rapporteur sont utilisés.
Utilisation d'un ou plusieurs contrôles pour sécuriser un procédé d'analyse multiplexe d'un échantillon.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un contrôle du dépôt d'un échantillon et/ou d'au moins un contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte, pour sécuriser une analyse multiplexe d'un échantillon.
Ladite utilisation peut comprendre en outre l'utilisation d'au moins un contrôle du dépôt d'un rapporteur.
La présente invention a particulièrement pour objet l'utilisation d'au moins un contrôle sélectionné dans le groupe consistant en un contrôle du dépôt d'un échantillon, un contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et un contrôle du dépôt d'un rapporteur, pour sécuriser une analyse multiplexe d'un échantillon.
Par « sécuriser une analyse multiplexe d'un échantillon », on entend ici garantir la fiabilité des résultats d'une analyse multiplexe, en particulier en évitant la présence de « faux négatifs ».
Un « faux négatif » est un résultat négatif traduisant l'absence d'un ou de plusieurs analytes à détecter dans un échantillon, alors que ledit ou lesdits analytes étaient présents dans l'échantillon et auraient du être détectés.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins deux contrôles sélectionnés dans le groupe consistant en un contrôle du dépôt d'un échantillon, un contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et un contrôle du dépôt d'un rapporteur, pour sécuriser une analyse multiplexe d'un échantillon.
La présente invention a particulièrement pour objet l'utilisation d'au moins un contrôle du dépôt d'un échantillon, au moins un contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et au moins un contrôle du dépôt d'un rapporteur, pour sécuriser une analyse multiplexe d'un échantillon. Ladite utilisation est de préférence réalisée sur un support solide comprenant au moins un compartiment tel que défini ci-dessus ou sur un ensemble de billes tel que défini ci-dessus.
Le contrôle du dépôt d'un échantillon, le contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte, le contrôle du dépôt d'un rapporteur et l'échantillon sont notamment tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un kit (ou trousse) caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en au moins un support solide selon l'invention et/ou au moins un ensemble de billes selon l'invention et, le cas échéant, au moins une composition ou solution à utiliser pour mettre en œuvre un procédé d'analyse multiplexe selon l'invention et/ou une notice d'utilisation.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux au travers des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatif. Ces exemples et figures illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Figures
Figure 1 : Exemple de support solide de type microplaque pour une analyse multiplexe sécurisée. En A est représenté un schéma de principe d'une microplaque comportant 18 puits. En B est représenté schématiquement le fond d'un puits de la microplaque. Chaque puits de la microplaque comprend 9 spots, dont 6 spots sont destinés chacun à la détection d'un ou plusieurs analyte(s) permettant de diagnostiquer une infection (respectivement A1 , A2, A3, A4, A5 et A6) et 3 spots contrôles : SDC (Contrôle du dépôt d'un échantillon), PVC (Contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte) et RVC (Contrôle du dépôt d'un Rapporteur). En C sont représentés schématiquement les trois spots contrôles comprenant les anticorps de détection liés à la phase solide (PS). Ac CC : Anticorps de détection du composé contrôle. Ac Add : Anticorps de détection de l'additif. MS + B : Molécule support marquée à la biotine.
Figure 2 : Schéma d'un contrôle du dépôt d'un échantillon (SDC) positif en format hétérologue. Le contrôle du dépôt d'un échantillon comprend l'anticorps de capture du composé contrôle fixé à la phase solide (PS). L'anticorps de capture est ici spécifique du récepteur soluble de la transferrine (sTfR). Le composé contrôle, ici le complexe 2 : 2 récepteur soluble de la transferrine (sTfR) : transferrine (Tf) est fixé à l'anticorps de capture au niveau du contrôle du dépôt d'un échantillon et à l'anticorps de détection (Ac 2) qui est spécifique de la transferrine. L'anticorps de détection (Ac 2) est marqué avec la biotine (B). La révélation se fait par ajout de streptavidine couplée à de la peroxydase (S- POD), puis du substrat de cette enzyme (non représenté). L'anticorps de capture et l'anticorps de détection peuvent être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Dans tous les cas, il s'agit d'un sandwich hétérologue.
Figure 3 : Schéma d'un contrôle du dépôt d'un échantillon (SDC) positif en format homologue. Le contrôle du dépôt d'un échantillon comprend l'anticorps de capture du composé contrôle fixé à la phase solide (PS). L'anticorps de capture est ici spécifique du récepteur soluble de la transferrine (sTfR). Le composé contrôle, ici le complexe 2 : 2 récepteur soluble de la transferrine (sTfR) : transferrine (Tf) est fixé à l'anticorps de capture au niveau du contrôle du dépôt d'un échantillon et à l'anticorps de détection (Ac 2) qui est également spécifique du récepteur soluble de la transferrine (sTfR). L'anticorps de détection (Ac 2) est marqué avec la biotine (B). La révélation se fait par ajout de streptavidine couplée à de la peroxydase (S-POD), puis du substrat de cette enzyme (non représenté). L'anticorps de capture et l'anticorps de détection sont par exemple des anticorps monoclonaux. Il s'agit d'un sandwich homologue.
Figure 4 : Schéma d'un contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte (PVC) positif. Le contrôle de procédé comprend l'anticorps de capture de l'additif fixé à la phase solide (PS). L'anticorps de capture est ici spécifique de la digoxigénine (Dig). L'additif comprend de la digoxigénine et de la BSA, la digoxigénine étant complexée à la BSA. L'additif est lié via la digoxigénine à l'anticorps de capture au niveau du contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et à l'anticorps de détection (Ac 2). L'anticorps de détection (Ac 2) est marqué avec la biotine (B). La révélation se fait par ajout de streptavidine couplée à de la peroxydase (S-POD), puis du substrat de cette enzyme (non représenté). L'anticorps de capture et l'anticorps de détection peuvent être tous les deux des anticorps monoclonaux ou tous les deux des anticorps polyclonaux, auquel cas il s'agit d'un sandwich homologue. L'anticorps de capture peut être un anticorps monoclonal et l'anticorps de détection un anticorps polyclonal, ou inversement, auquel cas il s'agit d'un sandwich hétérologue.
Figure 5 : Schéma d'un contrôle du dépôt d'un rapporteur positif (RVC). Le contrôle du dépôt d'un rapporteur comprend une molécule support (MS) couplée à de la biotine (B) fixée à la phase solide (PS). La révélation se fait par ajout de streptavidine couplée à de la peroxydase (S-POD), puis du substrat de cette enzyme (non représenté).
Figure 6 : Grille de « spotting » située au fond d'un puits d'une microplaque et comportant les spots de 5 analytes à doser (A1 à A5) et les trois spots contrôle SDC, PVC et RVC. Figure 7 : Distribution du signal des billes contrôle SDC en format simplex d'une population de 94 échantillons. En ordonnées est indiqué le nombre d'échantillons et en abscisse des intervalles d'unités Relatives d'Intensité de Fluorescence (RFI).
Figure 8 : Distribution du signal des billes contrôle PVC en format simplex d'une population de 38 échantillons. En ordonnées est indiqué le nombre d'échantillons et en abscisse des intervalles d'unités Relatives d'Intensité de Fluorescence (RFI).
Exemples
Exemple 1 : Procédé « puce liquide »
Principe
Les deux contrôles décrits dans cet exemple permettent de valider (cf. tableau 1) :
- pour le SDC (« Sample Deposit Control » ou « contrôle du dépôt d'un échantillon ») : le dépôt de l'échantillon et également l'étape 2 (dépôt des conjugués 2, i.e. les ligands de détection déposés dans l'étape 2) et l'étape 3 (dépôt du rapporteur S- PE : streptavidine couplée à la Phycoérythrine) et
- pour le PVC (« Process Vérification Control » ou « contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte ») : le dépôt de l'étape 1 (dépôt des conjugués 1 , i.e. les ligands de détection déposés à l'étape 1 ) et également l'étape 2 (dépôt des conjugués 2, en pointillé car non illustré dans cet exemple) et l'étape 3 (dépôt du rapporteur S-PE).
Tableau 1 : Etapes contrôlées par les contrôles SDC et PVC
Matériels
(i) Système d'analyse
L'analyseur BioPlex 200® (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France) est utilisé selon les instructions du fabricant. Cet automate d'immunoanalyse contient un cytomètre en flux et un détecteur Luminex 100™ (Luminex Corp., Austin, Texas, Etats-Unis) et utilise des jeux hétérogènes de particules superparamagnétiques. Chaque groupe homogène de particules, composées de polystyrène et d'acide méthacrylique (fonction COOH), et d'une taille de 8 μηι de diamètre, est fabriqué avec différents pourcentages de fluorochromes (CL1 et CL2) produisant un code d'identification unique assigné à chaque groupe de particules et détectable par le laser du détecteur Luminex 100™ (Luminex Corp., Austin, Texas, Etats-Unis). Après la réaction immunologique, les billes d'un jeu passent une à une à travers une cellule à flux, au centre d'une gaine liquide, pour être simultanément excitées et lues par deux lasers distincts. Les mesures sont réalisées au passage de chaque bille.
Le laser à rayon rouge de 638 nm excite les fluorochromes d'identification (CL1 et CL2) incrustés à la surface de chaque particule et le signal composite est interprété pour identifier l'analyte détecté par la particule. Ce laser sert donc, en identifiant la catégorie de particule, à identifier le test en cours.
Le laser à rayon vert de 532 nm excite le rapporteur S-PE (streptavidine couplée à la Phycoérythrine) et la fluorescence émise est proportionnelle à la quantité de rapporteur fixé sur la particule. Ce laser sert donc à mesurer la réactivité de l'analyte immobilisé sur ladite particule.
Le logiciel du système convertit le signal lié à la présence du ligand de détection en une valeur d'intensité relative de fluorescence (IRF en français ou RFI en anglais). Un ratio peut être calculé afin de classer le résultat qualitativement en positif ou négatif.
(ii) Phase solide (billes)
Un ensemble de billes comportant six groupes distincts de particules superparamagnétiques Luminex™ (Luminex Corp., Austin, Texas, Etats-Unis) est utilisé. Cet ensemble de billes comprend un groupe de billes pour contrôler le dépôt d'un échantillon (billes SDC), un groupe de billes pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte (billes PVC) et 4 groupes de billes de détection d'un analyte (analytes à doser : A1 , A2, A3 et A4).
Chaque groupe de particules est revêtu d'un ligand de capture spécifique d'un test particulier. Chaque ligand de capture est couplé à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel.
Les billes SDC sont recouvertes d'un anticorps monoclonal de souris antirécepteur soluble de la Transferrine (Fitzgerald, Etats-Unis) immobilisé à 1 mg de particules.
Les billes PVC sont recouvertes d'un anticorps polyclonal de mouton anti- Digoxigénine (Abcam, Etats-Unis) immobilisé à 5 μg/mg de particules.
Les billes de détection des analytes A1 , A2, A3 et A4 sont recouvertes avec un ou des ligands de captures spécifiques des analytes à détecter. (iii) Liqands de détection
Le ligand de détection du composé contrôle (du contrôle SDC), pAb-anti-Tf-biot, est un anticorps polyclonal de mouton anti-Transferrine (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) couplé à la biotine (Thermo Scientific, France) à l'aide d'un réactif hétéro- bifonctionnel en soi connu de l'homme du métier.
Le ligand de détection de l'additif (du contrôle PVC), pAb-anti-DIG-biot, est un anticorps polyclonal de mouton anti-Digoxigénine (Abcam, France) couplé à la biotine (Pierce, Etats-Unis) à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel en soi connu de l'homme du métier.
(iv) Additif
L'additif BSA-DIG est de la Digoxigénine (Sigma, France) greffée sur une molécule support, dans cet exemple l'Albumine de Sérum Bovin (Millipore, France) à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel en soi connu de l'homme du métier.
(v) Rapporteur
Le rapporteur S-PE est de la streptavidine (Roche, Allemagne) couplée à la Phycoérythrine (Cyanotech, Hawai, Etats-Unis) à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel en soi connu de l'homme du métier.
(vi) Diluants
vi.1 . Diluant des particules superparamagnétiques
Solution de tampon Tris 50 mM, pH 7,5 contenant : NaCI 150 mM, EDTA 20 mM, Albumine de Sérum Bovin à 10%, IgG de souris (Meridian, Etats-Unis) à 500 μg/mL, Octyl-n-Glucoside à 0,10%, NaN3 à 0,095%. vi.2. Diluant des conjugués 1
Solution de Tampon Tris 50 mM, pH 7,5 contenant : NaCI 150 mM ; EDTA 20 mM, Chaps 0,1 %, Glycérol 10%, NaN3 à 0,095%. vi.3. Diluant des conjugués 2
Solution de tampon citrate 50 mM, pH 6,7 contenant : NaCI 150 mM, EDTA 5,6 mM, Albumine de Sérum Bovin à 1 %, Triton à 2%, Sérum de mouton à 10%, IgG de souris (Meridian, Etats-Unis) à 500 μg/mL, Proclin 300™ (marque de la société Supelco) à 0,5%, lait de vache (100% écrémé) à 15%, Glycérol 10%, NaN3 à 0,095%. vi.4. Diluant du rapporteur S-PE
Tampon phosphate, pH 7,4 contenant : NaCI 150 mM, Tween 20™ (marque de la société Sigma) à 0,1 %, Proclin 300™ (marque de la société Supelco) à 0,5%, PEG 6000 2,75%, Albumine de Sérum Bovin 1 %, Sérum Normal de mouton 1 %, NaN3 à 0,095%. vi.5. Solution de lavage
Solution de tampon Tris 10 mM, pH 7,4 contenant : NaCI 218 mM, Tween 20™ (marque de la société Sigma) à 0,1 %, Proclin 300™ (marque de la société Supelco) à 0,002%.
(vii) Cuvettes réactionnelles
Les réactions immunologiques ont lieu dans les puits de microplaques 96 puits en polypropylène ayant un volume maximum de 355 μ\- par puits.
(viii) Echantillons
Les échantillons négatifs (sérum ou plasma) utilisés proviennent de l'établissement français du sang de Lille.
Méthodes
Le protocole d'essai en format multiplex comprend le dosage de 4 analytes différents, le dosage des analytes A1 et A2 étant réalisé en un temps immunologique, le dosage des analytes A3 et A4 étant réalisé en deux temps immunologiques.
Le format des essais est représenté dans les figures 2 et 4, dans lesquelles la S- PE est utilisé à la place de la S-POD.
Etape 1 :
1 . Dans chaque puits d'une microplaque sont distribués successivement :
+ 100 μΐ d'échantillon
+ 25 μ\- de diluant des conjugués 1 contenant :
+/- BSA-DIG
+/- les ligands de détection des analytes A1 et A2
+ 25 μ\- de particules superparamagnétiques immunoréactives (mélange de particules, 1 ,2 μg par type de billes : SDC, PVC +/- billes des analytes à doser)
2. Le mélange est mis en incubation pendant 40 minutes à 37°C sous agitation. 3. Les étapes suivantes de lavage sont réalisées : séparation des phases solides et liquide par aimantation et 3 lavages successifs avec au moins 300 μΙ_ de solution de lavage. Au dernier lavage les particules sont remises en suspension.
Etape 2 :
4. Dans chaque puits réactionnel sont distribués 90 μΙ_ de diluant des conjugués 2 contenant :
+/- le ligand de détection du composé contrôle pAb-anti-Tf-biot
+/- le ligand de détection de l'additif pAb-anti-DIG-biot
+/- les ligands de détection des analytes A3 et A4
5. Le mélange est mis en incubation pendant 15 minutes à 37°C sous agitation.
6. Les étapes de lavage (idem point 3) sont réalisées.
Etape 3 :
7. 90 μ\- du rapporteur S-PE sont distribués dans chaque puits réactionnels.
8. Le mélange est mis en incubation pendant 15 minutes à 37°C sous agitation.
9. Les étapes de lavage (idem point 3) sont réalisées.
10. Les particules sont remises en suspension dans chaque puits réactionnel en ajoutant 120 μ\- de solution de lavage puis la microplaque est agitée.
1 1 . La suspension de particules de chaque puits est aspirée par le cytomètre en flux.
12. La suspension de particules de chaque puits est lue à l'aide des deux rayons lasers.
13. Les résultats des lectures sont directement traités par le cytomètre en flux et enregistrés en unités Relatives d'Intensité de Fluorescence (unités RFI).
14. Pour l'interprétation des résultats, pour chaque échantillon un ratio est calculé par rapport à une valeur-seuil (« cut-off »).
Calcul du ratio
Le ratio SDC des échantillons est calculé de la façon suivante :
Signal RFI de l'échantillon
Ratio- SDC échantillon =
Valeur seuil SDC
De même, le ratio PVC des échantillons est calculé comme il suit Signal RFÎ de l'échantillon
Ratio PVC échantillon =
Valeur seuil PVC
Les échantillons dont les ratios (SDC ou PVC) sont supérieurs à 1 sont déclarés «valides », ceux pour lesquels les ratios sont inférieurs à 1 sont déclarés « invalides ».
La valeur seuil SDC et PVC a été établie suivant une étude statistique décrite dans les résultats ci-dessous.
Résultats
(i) Système SDC en format simplex
Dans ce système, les billes de détection des analytes A1 à A4 et leurs ligands de détection ne sont pas utilisés.
L'étude de 94 échantillons permet de définir la valeur seuil du système SDC (cf. figure 7). La valeur seuil du système SDC est calculée en soustrayant 3 fois l'écart type du signal de la population d'échantillons à la valeur moyenne du signal de la population.
Tableau 2 : Statistiques du signal SDC de la population de 94 échantillons et calcul de la valeur seuil
La réponse du système SDC est mesurée dans le cas d'un procédé nominal (Volume échantillon déposé = 100 μί, Volume Conjugués 2 = 90 μί, Volume S-PE = 90 μί) (cas n°1 du tableau 3). Les cas 2, 3, 4 du tableau 3 sont des procédés dégradés : cas 2 = absence de dépôt échantillon, cas 3 = absence de dépôt des conjugués 2, cas 4 = absence de dépôt S-PE.
Dans ce cas, le mélange comprenant les « conjugués 2 » comprend 90 μ\- de diluant des conjugués 2 contenant le ligand de détection du composé contrôle pAb-anti- Tf-biot. Tableau 3 : Récapitulatif des ratios SDC obtenus lors d'un procédé nominal (cas 1 ) et de procédés dégradés (cas 2, 3 et 4)
*RFIs : Intensités Relatives de Fluorescence Les cas 2, 3, 4 conduisent à des ratios SDC inférieurs à 1 ce qui permet d'invalider les mesures issues de ces procédés dégradés.
(ii) Impact du système SDC sur les performances en format multiplex
Dans le système SDC en format multiplex (MPX), les billes de détection des analytes A1 à A4 et les ligands de détection correspondants sont utilisés.
En comparant les signaux RFI obtenus entre un format MPX sans SDC versus MPX avec SDC (cf. tableau 4), l'ajout d'un format SDC n'impacte pas les performances d'un multiplex comportant 4 analytes (i.e. les écarts en % entre les signaux RFI d'un format MPX sans SDC versus MPX avec SDC sont compris dans un intervalle +/- 20% ce qui est considéré comme statistiquement acceptable).
Tableau 4 : Comparaison en % des signaux RFI obtenus entre un format MPX sans SDC versus un format MPX avec SDC
(iii) PVC en format simplex
Comme précédemment, dans ce format, les billes de détection des analytes A1 à A4 et les ligands de détection correspondant ne sont pas utilisés.
L'étude de 38 échantillons permet de définir la valeur seuil du système PVC (cf. figure 8).
La valeur seuil du système PVC est calculée en soustrayant 3 fois l'écart-type du signal de la population d'échantillons à la valeur moyenne du signal de la population (cf. tableau 5).
Tableau 5 : Statistiques du signal PVC de la population de 38 échantillons et calcul de la valeur seuil.
Moyenne (RFI) 356
Ecart-type (σ) (RFI) 70,92
Coefficient de variation (CV) en % 19,9%
Maximum de la population (RFI) 510
Minimum de la population (RFI) 222
Valeur seuil = Moyenne - 3 σ (RFI) 143,4 La réponse du système PVC est mesurée dans le cas d'un procédé nominal (Volume échantillon déposé = 100 μί, Volume Conjugués 1 = 90 μ\-, Volume S-PE = 90 μΙ_) (cas n°1 du tableau 6). Les cas 2, 3 du tableau 6 sont des procédés dégradés : cas 2 = absence de dépôt des conjugués 1 , cas 3 = absence de dépôt S-PE.
Tableau 6 : Récapitulatif des ratios PVC obtenus lors d'un procédé nominal (cas
1 ) et de procédés dégradés (cas 2, 3)
Les cas 2 et 3 conduisent à des ratios PVC inférieurs à 1 ce qui permet d'invalider les mesures issues de ces procédés dégradés.
(iv) Impact du mode simplex versus multiplex sur les performances du système PVC
Dans le système PVC en format multiplex, les billes de détection des analytes A1 à A4 et les ligands de détection correspondants sont utilisés.
Les performances du système PVC sont similaires en mode simplex et en mode multiplex (cf. tableau 7).
Tableau 7 : Comparaison des performances PVC en mode simplex versus multiplex
4 Analytes,
PVC (simplex) PVC (multiplex)
Moyenne RFI de 38 échantillons (RFI) 356 320
CV (%) 19,9% 20,6%
Max (RFI) 51 0 472
Min (RFI) 222 1 94
Valeur seuil = Moyenne - 3 σ (RFI) 143,4 1 21 ,7 Par ailleurs, en comparant les signaux RFI obtenus entre un format MPX sans SDC ni PVC versus un format MPX avec SDC et PVC, il s'avère que l'ajout des tests SDC et PVC n'impacte pas les performances d'un multiplex comportant 4 analytes à doser (i.e. les écarts en % entre les signaux RFI d'un format MPX sans SDC ni PVC versus un format MPX avec SDC et PVC sont compris dans un intervalle +/- 20%, ce qui est considéré comme statistiquement acceptable).
Exemple 2 : Procédé en spots ou « spottinq »
Matériels et Méthodes
Les trois contrôles décrits dans cet exemple permettent de valider (cf. tableau 8) :
- pour le SDC (« Sample Deposit Control » ou « contrôle du dépôt d'un échantillon ») : le dépôt de l'échantillon et également l'étape 2 (dépôt des conjugués 2), l'étape 3 (dépôt du rapporteur S-POD) et l'étape 4 (dépôt du substrat Luminol),
- pour le PVC (« Process Vérification Control » ou « contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte ») : les dépôts de l'étape 1 (dépôt de l'additif et dépôt des conjugués 1 ), l'étape 3 (dépôt du rapporteur S-POD) et l'étape 4 (dépôt du substrat Luminol), et
- pour le RVC (« Révélation Vérification Control » ou « contrôle du dépôt d'un rapporteur » : l'étape de révélation, en contrôlant à la fois l'étape 3 (dépôt du rapporteur S-POD) et l'étape 4 (dépôt du substrat Luminol).
Tableau 8 : Etapes contrôlées par les contrôles SDC, PVC et RVC
Matériels
(i) Système d'analyse
La technologie employée pour ce système est une technologie multiplex innovante nanospotting sur biochip (cf. définition ci-dessous), avec révélation par chimiluminescence grâce à un rapporteur marqué par l'enzyme de la peroxydase de raifort et révélé par un substrat de type luminol.
Le terme « biochip » (ou encore « biopuce ») est une collection de sites d'essais miniaturisés (ou « micro-array ») disposés sur un support solide qui permet d'effectuer de nombreux tests simultanément afin d'obtenir une cadence plus élevée.
Au sein de chaque puits d'une microplaque (Greiner, Allemagne) sont déposés par rangées à l'aide d'un robot spotteur, des gouttes de 50 nL d'une solution de protéines ou d'anticorps spécifiques de l'analyte à doser (A1 , A2, A3, A4, A5, SDC, RVC et PVC) {cf. figure 6). Le fond de chaque puits de ces microplaques possède des capacités d'adsorption de protéines et peptides en soi connu de l'homme du métier. Les spots ainsi obtenus sont saturés avec une solution de saturation en soi connu de l'homme du métier.
Il est ensuite possible de réaliser une réaction immunologique classique en 1 temps ou 2 temps immunologiques au sein de ces biochips (ou biopuces).
Après la réaction immunologique, l'ajout du substrat de révélation entraine une émission lumineuse. En effet, l'oxydation du luminol par catalyse enzymatique conduit à une émission lumineuse proportionnelle à la quantité de rapporteur Streptavidine- peroxydase fixé par le spot. L'acquisition du signal est réalisée par une caméra scientifique. L'image qui en résulte est alors analysée afin de déterminer l'intensité de la luminescence produite par chaque zone géographique du fond du puits correspondant à chaque spot (adressage de l'information).
Le logiciel du système convertit le signal mesuré par spot en une valeur d'Unités Relatives de Luminescence (« URL » en français ou « RLU » en anglais). Un ratio peut être calculé afin de classer le résultat qualitativement en positif ou négatif, comme détaillé ci-après.
(ii) Phase solide (spots)
Les différents spots de contrôle sont :
- le spot SDC comprenant un anticorps monoclonal de souris anti-récepteur soluble de la Transferrine (Fitzgerald, Etats-Unis) immobilisé à 50 μg/mL,
- le spot PVC comprenant un anticorps monoclonal de souris anti-Digoxigénine (Covalab, France) immobilisé à 25 μg/mL, et
- le spot RVC comprenant un anticorps monoclonal de souris anti-KLH (« Keyhole Limpet Hemocyanin ») (Genway, Etats-Unis) couplé à la biotine (Thermo Scientific, France) à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel en soi connu de l'homme du métier et immobilisé à 1 μ9ΛηΙ_.
(iii) Liqands de détection
Le ligand de détection du composé contrôle (relatif au contrôle SDC), pAb-anti-Tf- biot, est un anticorps polyclonal de mouton anti-Transferrine (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) couplé à la biotine (Thermo Scientific, France) à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel en soi connu de l'homme du métier.
Le ligand de détection de l'additif (relatif au contrôle PVC), mAb-anti-DIG-biot, est un anticorps monoclonal de souris anti-digoxigénine couplé à la biotine (Covalab, France).
(iv) Additif
L'additif BSA-DIG est de la Digoxigénine (Sigma, France) greffée sur une molécule support, dans cet exemple l'Albumine de Sérum Bovin (Millipore, France). Le couplage est réalisé à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel en soi connu de l'homme du métier.
(v) Rapporteur
Le rapporteur S-POD est de la streptavidine (Roche, Allemagne) couplée à la Peroxydase (Roche Allemagne) par la méthode décrite par P. Nakane et A. Kawaoi (J Histochem Cytochem (1974) Vol. 22, No. 12. pp. 1084-1091 ), en soi connue de l'homme du métier.
(vi) Diluants
a) Diluant de l'additif
Solution de tampon Tris 50 mM, pH 7,5 contenant : NaCI 150 mM, EDTA 20 mM, IgG de souris (Meridian, Etats-Unis) à 500 μg/mL, Lait de vache (100% écrémé) à 15%, Sérum de mouton à 10%, NaN3 à 0,095%. b) Diluant des conjugués 1
Solution de Tampon Tris 50 mM, pH 7,5 contenant : NaCI 150 mM ; EDTA 20 mM, Chaps 0,1 %, Glycérol 10%, NaN3 à 0,095% c) Diluant des conjugués 2
Solution de tampon citrate 50 mM, pH 6,7 contenant : NaCI 150 mM, EDTA 5,6 mM, Triton à 2%, Sérum de mouton à 10%, IgG de souris 500 μg/mL, Proclin 300™ (marque de la société Supelco) à 0,5%, lait de vache (100% écrémé) à 15%, Glycérol 10%. NaN3 à 0,095% d) Diluant du rapporteur S-POD
Solution de tampon citrate 50 mM, pH 6,7 contenant : NaCI 2053 mM, Tween 20™ (marque de la société Sigma) à 0,5%, Proclin 300™ (marque de la société Supelco) à 0,5%, lait de vache (100% écrémé) à 7%, Glycérol 20%. e) Solution de lavage
Solution de tampon Tris 10 mM, pH 7,4 contenant : NaCI 218 mM, Tween 20™ (marque de la société Sigma) à 0,1 %, Proclin 300™ (marque de la société Supelco) à 0,002%. f) Substrat de révélation
Le substrat de révélation ELISTAR ETA C Ultra ELISA (Cyanagen, Italie) se compose de deux solutions : XLSE024L Luminol enhancer solution (A) et XLSE024P Peroxide solution (B).
(vii) Cuvettes réactionnelles
Les réactions immunologiques ont lieu dans des microplaques 96 puits en polystyrène ayant un volume maximum de 392 μί par puits. (viii) Echantillons
Les échantillons négatifs (sérum ou plasma) utilisés proviennent de l'établissement français du sang de Lille.
Méthodes
Le protocole d'essai comprend les étapes suivantes.
Etape 1 :
1 . Dans chaque puits d'une microplaque (comprenant les spots) sont distribués successivement :
+ 20 μΐ de diluant de l'additif contenant l'additif BSA-DIG
+ 20 μ\- de diluant des conjugués 1 comprenant :
+ le ligand de détection de l'additif mAb-anti-DIG-biot et
+ les ligands de détection des analytes à doser 1 , 2 et 3
+ 40 μ\- d'échantillon
2. Le mélange est mis en incubation pendant 40 minutes à 37°C sous agitation.
3. Trois lavages successifs avec au moins 400 μ\- de solution de lavage sont réalisés. Etape 2 :
4. Dans chaque puits réactionnel sont distribués 50 μΙ_ de diluant des conjugués 2 contenant :
+ le ligand de détection du composé contrôle pAb-anti-Tf-biot et
+ les ligands de détection des analytes à doser 4 et 5.
5. Le mélange est mis en incubation pendant 15 minutes à 37°C sous agitation.
6. Les étapes de lavage (idem point 3) sont réalisées.
Etape 3 :
7. 50 μ\- du rapporteur S-POD sont distribués dans chaque puits réactionnel.
8. Le mélange est mis en incubation pendant 15 minutes à 37°C sous agitation.
Etape 4 :
9. 25 μ\- de solution de révélation « B » sont distribués dans chaque puits réactionnels. 10. 25 μ\- de solution de révélation « A » sont distribués dans chaque puits réactionnels.
10. Le mélange est mis en incubation pendant 1 minute à 37°C sous agitation.
1 1 . L'acquisition du signal de luminescence est réalisée pendant 180 secondes.
12. Les résultats des lectures sont directement traités par un système d'analyse d'image et enregistrés en Unités Relatives de Luminescence ou Relative light Unit (RLU).
13. Pour l'interprétation des résultats, pour chaque échantillon un ratio est calculé par rapport à une valeur-seuil (ou « cut-off »).
Calcul du ratio
Deux modes d'analyses sont illustrés ci-dessous:
Mode d'analyse 1 : une seule valeur seuil
Le ratio SDC des échantillons est calculé de la façon suivante
Signal RLU de l'échantillon
Ratio SDC échantillon =
Valeur seuil SDC
De même, le ratio PVC des échantillons est calculé
Signal RLU de fêckantillo
R tio PVC échantillon =
Valeur seuil PVC De manière similaire, le ratio RVC des échantillons est calculé
Signal RLU de i échantillon
Ratio- RVC échantill on =—
Valeur seuil RVC
Les échantillons dont les ratios (SDC ou PVC ou RVC) sont supérieurs à 1 sont déclarés « valides », ceux pour lesquels les ratios sont inférieurs à 1 sont déclarés « invalides ». La valeur seuil SDC, PVC et RVC a été établie suivant une étude statistique décrite au chapitre résultats ci-dessous.
Mode d'analyse 2: deux valeurs seuil
Deux ratios SDC des échantillons sont calculés de la façon suivante :
, S4gnal RLU de l'écha tillon
Ratio SDC échantillon (seuil -) = -
Valeur (seuil -iSDC
Signal R LU de l'échantillon
Ratio SDC échantillon (seuil +) =
Valeur (seuil +JSDC
De même, les ratios PVC des échantillons sont calculés :
Signal RLU de V 'échantillon
Ratio PVC échantillon (seuil -) =
Valeur (seuil -)PVC
Signal R LU de l'échantillon
Ratio PVC échantillon (seuil +) =
Valeur (seuil + PVC
De manière similaire, les ratios RVC des échantillons sont calculés :
Signal RLU de l'échantillon
Rati o RVC échantillon (seuil -} =
Val eur (seuil -)RVC
Signal RLU de l'échantillon
Ratio RVC échantillon (seuil +) =
Valeur (seuil +)RVC
Les échantillons dont les ratios (seuil-) (SDC ou PVC ou RVC) sont supérieurs à 1 sont déclarés « valides », ceux pour lesquels les ratios sont inférieurs à 1 sont déclarés « invalides ».
Les échantillons dont les ratios (seuil+) (SDC ou PVC ou RVC) sont inférieurs à 1 sont déclarés « valides », ceux pour lesquels les ratios sont supérieurs à 1 sont déclarés « invalides ».
La valeur seuil SDC, PVC et RVC a été établie suivant une étude statistique décrite au chapitre résultats ci-dessous. Résultats
Le multiplex décrit dans cet exemple comporte 5 analytes à doser 3 analytes dont les ligands de détection sont ajoutés en étape 1 (A1 , A2 et A3), 2 analytes dont les ligands de détection sont ajoutés en étape 2 (A4 et A5) et les trois contrôles SDC, PVC et RVC.
Le tableau 9 regroupe les cas de figure pouvant être rencontrés lors d'une invalidation isolée ou cumulée des contrôles SDC, PVC et RVC.
Les réponses des contrôles SDC, PVC et RVC sont mesurées dans le cas d'un procédé nominal (Volume additif = 20 μί, Volume Conjugués 1 = 20 μί, Volume échantillon déposé = 40 μί, Volume Conjugués 2 = 50 μ\-, Volume S-POD = 50 μί, Volume Luminol = 25 μ\- solution B + 25 μ\- solution A) pour 22 échantillons.
L'étude de ces 22 échantillons permet de caractériser la réponse SDC, PVC, RVC en termes de réponse moyenne, déviation standard, valeur minimale et maximale (cf. tableaux 10a et 10b). Les valeurs seuils des contrôles SDC, PVC et RVC sont également calculées.
Tableau 9 : Interprétation de l'ensemble des contrôles SDC, PVC et RVC et identification de l'étape déficiente dans le procédé.
Statut
Statut Statut Statut
SDC et
SDC PVC RVC PVC et
Etape déficiente à l'origine de RVC
VALIDE / VALIDE / VALIDE / l'invalidation du procédé
NON NON NON
VALI DE /
VALI DE VALI DE VALI DE NON VALI DE
NON NON Dépôt échantillon ou dépôt des ligands de
VALIDE VALIDE VALIDE VALIDE détection à l'étape 2
NON NON Dépôt de l'additif ou dépôt des ligands de
VALIDE VALIDE VALIDE VALIDE détection à l'étape 1
Dépôt échantillon ou dépôt des ligands de détection à l'étape 2
NON NON NON
VALIDE et
VALIDE VALIDE VALIDE
Dépôt de l'additif ou dépôt des ligands de détection à l'étape 1
Dépôt S-POD ou Luminol
De plus, dans ce cas de figure, les dépôts
NON NON NON NON
échantillons, additif, ligands de détection VALIDE VALIDE VALIDE VALIDE
de l'étape 1 , ligands de détection de l'étape 2 ne peuvent être validés ou invalidés.
Mode d'analyse 1 : une seule valeur seuil
Tableau 10a : Réponse des contrôles SDC, PVC et RVC (réponse moyenne, déviation standard, valeur minimale et maximale, valeurs seuils).
Mode d'analyse 2 : deux valeurs seuil
Tableau 10b : Réponses des contrôles SDC, PVC et RVC (réponse moyenne, déviation standard, valeur minimale et maximale, valeurs seuils).
En combinant les réponses des contrôles SDC, PVC, RVC et les valeurs seuils calculées (cf. tableau 10a et 10b), les ratios SDC, PVC et RVC sont calculés pour chaque échantillon (cf. tableau 11a et 1 1b). Mode d'analyse 1 : une seule valeur seuil
Tableau 11a : Réponses des contrôles SDC, PVC et RVC en RLU et ratios d'une population de 22 échantillons.
SDC PVC RVC
Statut
Statut Statut Statut SDC ET PVC
Ech SDC PVC RVC ET RVC
N° RLUs Ratio RLUs Ratio RLUs Ratio
SDC SDC VALIDE/ PVC PVC VALIDE / RVC RVC VALIDE/ VALIDE /
NON NON NON NON VALIDE VALIDE VALIDE VALIDE
1 974 1,55 VALIDE 2997 1,39 VALIDE 3368 1,32 VALIDE VALIDE
2 970 1,55 VALIDE 2407 1,11 VALIDE 3437 1,34 VALIDE VALIDE
3 863 1,38 VALIDE 2489 1,15 VALIDE 2773 1,08 VALIDE VALIDE
4 1072 171 VALIDE 2724 1,26 VALIDE 3216 1,26 VALIDE VALIDE
5 1246 1,99 VALIDE 2830 1,31 VALIDE 3340 1,31 VALIDE VALIDE
6 1219 1,94 VALIDE 2617 1,21 VALIDE 3165 1,24 VALIDE VALIDE
7 1002 1,60 VALIDE 2743 1,27 VALIDE 3535 1,38 VALIDE VALIDE
8 1172 1,87 VALIDE 2670 1,24 VALIDE 3150 1,23 VALIDE VALIDE
9 835 1,33 VALIDE 2686 1,24 VALIDE 3082 1,20 VALIDE VALIDE
10 932 1,49 VALIDE 2575 1,19 VALIDE 2806 1,10 VALIDE VALIDE
11 1061 1,69 VALIDE 2641 1,22 VALIDE 3274 1,28 VALIDE VALIDE
12 929 1,48 VALIDE 2617 1,21 VALIDE 3200 1,25 VALIDE VALIDE
13 1098 1,75 VALIDE 2495 1,15 VALIDE 3445 1,35 VALIDE VALIDE
14 996 1,59 VALIDE 2551 1,18 VALIDE 3382 1,32 VALIDE VALIDE
15 876 1,40 VALIDE 2732 1,26 VALIDE 3459 1,35 VALIDE VALIDE
16 896 1,43 VALIDE 2623 1,21 VALIDE 3310 1,29 VALIDE VALIDE
17 897 1,43 VALIDE 2429 1,12 VALIDE 3219 1,26 VALIDE VALIDE
18 798 1,27 VALIDE 2611 1,21 VALIDE 2977 1,16 VALIDE VALIDE
19 906 1,44 VALIDE 2440 1,13 VALIDE 2993 1,17 VALIDE VALIDE
20 1007 1,61 VALIDE 2412 1,12 VALIDE 2894 1,13 VALIDE VALIDE
21 1093 174 VALIDE 2868 1,33 VALIDE 3294 1,29 VALIDE VALIDE
22 1108 1,77 VALIDE 2547 1,18 VALIDE 3083 1,20 VALIDE VALIDE Mode d'analyse 2 : deux valeurs seuil
Tableau 1 1 b : Réponses des contrôles SDC, PVC et RVC en RLU et ratios (seuil+), ratios (seuil-) d'une population de 22 échantillons.
Le statut des interprétations à partir des ratios (seuil+) et (seuil-) des contrôles SDC ; PVC, RVC est « Valide » pour les 22 échantillons. Le statut des interprétations des contrôles SDC et PVC et RVC est « Valide » pour l'ensemble des 22 échantillons.
Une étude de cas de procédés réalisés en mode dégradé est illustrée dans les tableaux 12 et 13a et 13b. Six cas sont présentés : Cas 1 = absence de dépôt d'échantillon.
Cas 2 = absence de dépôt d'additif.
Cas 3 = absence de dépôt de conjugués 1 .
Cas 4 = absence de dépôt de conjugués 2.
Cas 5 = absence de dépôt de S-POD.
Cas 6 = absence de dépôt de Luminol.
Mode d'analyse 1 : une seule valeur seuil
Les cas 1 et 4 conduisent à des ratios SDC inférieurs à 1 ce qui permet d'invalider les mesures issues de ces procédés dégradés.
Les cas 2 et 3 conduisent à des ratios PVC inférieurs à 1 ce qui permet d'invalider les mesures issues de ces procédés dégradés.
Les cas 5 et 6 conduisent à des ratios SDC, PVC et RVC inférieurs à 1 ce qui permet d'invalider les mesures issues de ces procédés dégradés. Le signal RVC permet d'invalider spécifiquement l'étape de révélation (dépôt S-POD et dépôt Luminol). Cependant, l'invalidation du procédé par un ratio RVC inférieur à 1 implique une absence du signal systématique des contrôles SDC et PVC (cf. zone grise du tableau 9). Il n'est, dans ce cas, pas possible de déterminer si les dépôts de l'échantillon et des conjugués 2 (dépôts contrôlés par SDC) ou les dépôts d'additif et des conjugués 1 (dépôts contrôlés par PVC) se sont déroulés correctement ou non.
Mode d'analyse 2 : deux valeurs seuil
Les cas 1 et 4 conduisent à des ratios (seuil-) SVC inférieurs à 1 ce qui permet d'invalider les mesures issues de ces procédés dégradés. De plus dans le cas 1 , le ratio (seuil+) PVC est supérieur à 1 ce qui traduit un impact indirect de l'absence d'échantillon sur le contrôle PVC.
Les cas 2 et 3 conduisent à des ratios (seuil-) PVC inférieurs à 1 ce qui permet d'invalider les mesures issues de ces procédés dégradés.
Les cas 5 et 6 conduisent à des ratios (seuil-) SDC, PVC et RVC inférieurs à 1 ce qui permet d'invalider les mesures issues de ces procédés dégradés. Le signal RVC permet d'invalider spécifiquement l'étape de révélation (dépôt S-POD et dépôt Luminol).
Cependant l'invalidation du procédé par un ratio (seuil-) RVC inférieur à 1 implique une absence du signal systématique des contrôles SDC et PVC (cf. zone grise du tableau 9).
Il n'est, dans ce cas, pas possible de déterminer si les dépôts de l'échantillon et des conjugués 2 (dépôts contrôlés par SDC) ou les dépôts d'additif et des conjugués 1
(dépôts contrôlés par PVC) se sont déroulés correctement ou non. Tableau 12 : Détail des 6 cas de procédé dégradé
Mode d'analyse 1 : une seule valeur seuil
Tableau 13a : Réponse des contrôles SDC, PVC et RVC en RLU et ratio d'une population de 22 échantillons
SDC PVC RVC SDC ET PVC ET
SDC PVC RVC
RVC VALIDE VALIDE / VALIDE
Cas RLUs Ratio RLUs Ratio RLUs Ratio VALIDE /
/ NON NON / NON
SDC SDC PVC PVC RVC RVC NON VALIDE VALIDE VALIDE VALIDE
(NV) (NV) (NV)
(NV)
1 37 0,06 NV 3939 1 ,82 VALIDE 3458 1 ,35 VALIDE NV
2 991 1 ,58 VALIDE 72 0,03 NV 3569 1 ,39 VALIDE NV
3 983 1 ,57 VALIDE 59 0,03 NV 3046 1 ,19 VALIDE NV
4 18 0,03 NV 2727 1 ,26 VALIDE 3655 1 ,43 VALIDE NV
5 5 0,01 NV 4 0,00 NV 5 0,00 NV NV
6 6 0,01 NV 7 0,00 NV 5 0,00 NV NV Mode d'analyse 2 : deux valeurs seuil
Tableau 13b : Réponse des contrôles SDC, PVC et RVC en RLU et ratio d'une population de 22 échantillons
Par ailleurs, en comparant les signaux RLU obtenus entre un format MPX sans SDC ni PVC versus un format MPX avec SDC et PVC, il s'avère que l'ajout des tests SDC et PVC n'impacte pas les performances d'un multiplex comportant 4 analytes à doser (i.e. les écarts en % entre les signaux RLU d'un format MPX sans SDC ni PVC versus un format MPX avec SDC et PVC sont compris dans un intervalle +/- 20% ce qui est considéré comme statistiquement acceptable).

Claims

REVENDICATIONS
Support solide approprié pour une analyse multiplexe d'au moins un échantillon, ledit support solide comprenant au moins un compartiment, ledit compartiment comprenant au moins un spot contrôle et au moins deux spots de détection d'un analyte, caractérisé en ce que ledit spot contrôle est sélectionné dans le groupe consistant en un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon, un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et un spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Support solide selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le spot contrôle ou un des spots contrôle est un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon ou un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
Support solide selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit compartiment comprend au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Support solide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit compartiment comprend au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon et au moins un spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte.
Support solide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le spot pour contrôler le dépôt d'un échantillon comprend au moins un ligand de capture d'un composé contrôle.
Support solide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le spot pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte comprend au moins un ligand de capture d'un additif.
Support solide selon l'une des revendications 1 ou 3 à 6, caractérisé en ce que le spot pour contrôler le dépôt d'un rapporteur comprend un marqueur indirect ou une molécule support couplée à un marqueur indirect.
Ensemble de billes approprié pour une analyse multiplexe d'un échantillon, comprenant au moins une bille contrôle et au moins deux billes de détection d'un analyte, caractérisé en ce que la bille contrôle est sélectionnée dans le groupe consistant en une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon, une bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et une bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Ensemble de billes selon la revendication 8, comprenant au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un échantillon, au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et éventuellement au moins une bille pour contrôler le dépôt d'un rapporteur.
Procédé d'analyse multiplexe pour la détection d'au moins n analytes dans au moins un échantillon, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, ledit procédé comprenant au moins les étapes a), c) et e) ou au moins les étapes a), b), c) et d) suivantes :
a) fournir au moins un support solide comprenant au moins un compartiment selon l'une des revendications 1 à 7 ou au moins un ensemble de billes selon la revendication 8 ou 9,
b) mettre en présence des spots dudit compartiment ou en présence dudit ensemble de billes : I ligands de détection de p analytes à détecter et, le cas échéant, au moins un additif, I étant de préférence supérieur ou égal à p, c) mettre un échantillon à analyser en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes,
d) mettre en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes : Γ ligands de détection de m analytes à détecter et, le cas échéant, au moins un ligand de détection dudit ou desdits additifs, Γ étant de préférence supérieur ou égal à m, et
e) mettre en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes : au moins un ligand de détection d'un composé contrôle et I" ligands de détection de y analytes à détecter, I" étant de préférence supérieur ou égal à y,
I, Γ, I", m, p et y étant des nombres entiers supérieurs ou égaux à 0 et la somme m+p+y étant supérieure ou égale à 1 .
11. Procédé d'analyse multiplexe selon la revendication 10, comprenant une étape ultérieure f) consistant à mettre au moins un rapporteur en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes. Procédé d'analyse multiplexe selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que le rapporteur ou au moins un des rapporteurs de l'étape f) est couplé à un marqueur indirect, par exemple une enzyme, et en ce que ledit procédé comprend une étape ultérieure g) consistant à mettre au moins un deuxième rapporteur dudit marqueur indirect couplé au rapporteur de l'étape f) en présence des spots dudit compartiment ou dudit ensemble de billes, ledit deuxième rapporteur étant par exemple un substrat, de préférence choisi parmi le luminol, l'isoluminol ou un de leurs dérivés.
Utilisation d'au moins un contrôle du dépôt d'un échantillon et/ou d'au moins un contrôle du dépôt d'un ligand de détection d'un analyte et/ou d'au moins un contrôle du dépôt d'un rapporteur pour sécuriser un procédé d'analyse multiplexe d'un échantillon.
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