FR2857453A1 - Procede de detection serologique de la maladie coeliaque et necessaire de diagnostic associe - Google Patents

Abstract

L'invention concerne le domaine du diagnostic de la maladie coeliaque, par la recherche d'anticorps marqueurs de cette maladie dans le sérum prélevé chez un patient. Plus précisément, il s'agit tout d'abord d'un procédé de détection qui consiste :a) à utiliser des moyens de capture immobilisés sur un support et dirigés contre un antigène spécifique de la maladie coeliaque, éventuellement inclus dans un complexe immun, puis,b) faire réagir les moyens de capture en présence du sérum à tester et de l'antigène choisi, puis,c) révéler les complexes immuns ainsi formés.L'invention concerne également un nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé, ainsi qu'un nécessaire de diagnostic sérologique de la maladie coeliaque.

Description

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PROCEDE DE DETECTION SEROLOGIQUE
DE LA MALADIE C#LIAQUE
ET NECESSAIRE DE DIAGNOSTIC ASSOCIE
La présente invention concerne le domaine du diagnostic de la maladie c#liaque, par la recherche d'anticorps marqueurs de cette maladie dans le sérum prélevé chez un patient.

Plus précisément, l'invention est relative à un procédé de détection sérologique de tels anticorps marqueurs, par le biais de complexes immuns formés entre ces anticorps marqueurs et leur antigène.

L'invention a également trait à un nécessaire pour la mise en #uvre de ce procédé de détection ainsi qu'à un nécessaire de diagnostic sérologique de la maladie c#liaque.

La maladie c#liaque est une maladie inflammatoire à composante auto-immune, déclenchée chez des patients prédisposés génétiquement, par l'ingestion de certaines protéines du blé et d'autres céréales : les prolamines.

Les prolamines sont des protéines de la fraction soluble dans l'alcool du gluten de blé, de seigle et de l'orge. Ces protéines, particulièrement riches en proline et glutamine, sont, par exemple, les gliadines, gluténines, hordénines ou sécalines.

Le principal symptôme de la maladie c#liaque est une atrophie villositaire au niveau de l'intestin grêle proximal pouvant s'étendre à l'ensemble de l'intestin grêle, associée à une hypertrophie des cryptes et une infiltration lymphocytaire massive de l'épithélium intestinal. Cette atrophie villositaire est à l'origine d'un syndrome de malabsorption, d'anémies, de malnutrition ou de diarrhée.

De telles manifestations digestives sont parfois absentes, mais la maladie c#liaque peut présenter d'autres manifestations telles que l'asthénie ou des atteintes dermatologiques (dermatite herpétiforme), neuromusculaires, génitales ou articulaires.

De façon remarquable, ces symptômes disparaissent chez les patients qui suivent un régime alimentaire strictement dépourvu de gluten. Il est donc essentiel de pouvoir établir un diagnostic précoce de la maladie c#liaque, permettant la mise en place d'un tel régime et la rémission des malades. Il est également important de pouvoir suivre l'évolution de la maladie c#liaque chez les malades détectés et astreints à un régime sans gluten.

Le diagnostic de la maladie c#liaque repose principalement sur l'observation histologique, par biopsie, des atteintes intestinales et de leur régression lors du suivi d'un régime sans gluten.

Par ailleurs, l'étude de la composante auto-immune de cette maladie a permis de mettre en évidence l'existence d'anticorps spécifiques, présents dans le sérum des malades c#liaques et utilisés comme marqueurs de cette maladie. Il s'agit notamment d'anticorps dirigés contre la gliadine (AGA), l'endomysium (EMA) ou la réticuline (ARA).

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La transglutaminase tissulaire tTG [EC 2. 3.2.13] a été identifiée comme un autoantigène intervenant dans le déclenchement de la maladie (W. DIETERICH et coll.

"Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease" NATURE MEDECINE, 1997,3(7), pp. 797-801). La tTG est une enzyme intracellulaire ubiquitaire Ca2±dépendante, qui catalyse la formation de liaisons covalentes entre protéines porteuses de résidus glutamine et protéines porteuses de résidus lysine. Cette enzyme intervient notamment dans la coagulation du sang (facteur XIII), dans la formation de l'enveloppe cornée et dans d'autres phénomènes physiopathologiques tels que le cancer et l'apoptose.

Les prolamines, par exemple les gliadines, toxiques pour la muqueuse intestinale des patients souffrant de maladie c#liaque, provoquent des atteintes cellulaires qui mènent à la pénétration de la tTG dans l'espace intercellulaire, où elle peut catalyser irréversiblement la formation de liaisons entre différentes gliadines ou se lier elle-même à des gliadines. Ces nouveaux complexes protéiques pourraient constituer des antigènes provoquant la formation d'anticorps anti-gliadine et d'anticorps anti-tTG (IgA et/ou IgG).

Cela aboutit à une inflammation de la muqueuse intestinale et à sa destruction.

Des tests de diagnostic de la maladie c#liaque, moins traumatisants que les biopsies, fondés sur des techniques de détection de ces anticorps, sont développés. En outre, de telles techniques sont utiles pour orienter le diagnostic d'une maladie c#liaque, notamment chez les patients qui ne présentent pas les symptômes gastro-intestinaux habituels.

Le test CELIKEY (marque déposée) développé et commercialisé par la société PHARMACIA, est un test de type ELISA. L'antigène utilisé est une tTG humaine recombinante, produite dans un système baculovirus/cellule d'insecte. La tTG est immobilisée par adsorption sur un support solide, par exemple une plaque de microtitration, et sert d'antigène pour détecter les anticorps anti-tTG présents dans le sérum du patient.

Cependant, l'adsorption de la tTG sur un support entraîne, d'une part, le masquage de la partie de l'enzyme impliquée dans l'interaction avec le support solide et d'autre part, une distorsion de la structure protéique de la tTG ainsi qu'une modification de sa conformation. De ce fait, certains épitopes de la tTG deviennent inaccessibles et les anticorps recherchés ne peuvent pas être détectés.

Par ailleurs, les procédés industriels de fabrication de plaques recouvertes d'antigène recourent aux techniques de séchage et de lyophilisation pour le stockage des plaques. Ces méthodes entraînent des changements dans la structure native des protéines, dus au phénomène de déshydratation. Cela a pour conséquence de modifier la réactivité de l'antigène.

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Ainsi, ces méthodes ne permettent pas de détecter tous les anticorps et en particuliers ceux qui n'ont pas rencontré les épitopes, dénaturés ou masqués, contre lesquels ils sont dirigés. Or ceux-ci peuvent être important dans le diagnostic précoce de la maladie et/ou le suivi de son évolution.

Le document WO-A-01/29090 divulgue un test immunologique de détection d'anticorps de la maladie c#liaque. Le procédé consiste à immobiliser un substrat de la tTG-un peptide ou polypeptide riche en résidus glutamine, notamment certaines gliadines- sur un support solide tel qu'une plaque, puis à incuber le substrat immobilisé en présence de tTG pour former des complexes tTG-substrat immobilisés, à mettre en contact l'échantillon à tester avec les complexes immobilisés pour retenir les anticorps recherchés, et enfin à marquer les complexes obtenus avant d'estimer la quantité d'anticorps présent dans l'échantillon.

On retrouve ici les inconvénients liés à l'adsorption de la tTG sur un support solide et aux modifications conformationnelles subies par la tTG à cette occasion.

De plus, il est connu que l'interaction des anticorps avec des antigènes peut être non-spécifique : un sérum de malade peut ainsi réagir de façon non-spécifique soit avec l'antigène adsorbé sur le support soit avec ce même support. Il est donc nécessaire de pouvoir disposer d'un test de contrôle, afin d'éviter les faux positifs.

Dans le cas d'une plaque telle que précédemment décrite, il faut donc utiliser un support revêtu d'une molécule, par exemple une protéine normalement non reconnue par les anticorps recherchés, pour évaluer les interactions non-spécifiques éventuelles.

Une telle solution n'est pas envisageable car elle induit des coûts supplémentaires trop importants pour l'usager, ainsi que de nombreuses difficultés d'utilisation.

Le document EP-A-1164375 concerne un test de détection d'anticorps anti-tTG.

Dans ce test, on utilise comme antigène marqueur, de la tTG conjuguée à une substance colorée (or colloïdal, particules de latex coloré). On dépose l'antigène marqueur sur un support inerte d'où il peut être entraîné par un échantillon liquide. Des complexes immuns se forment avec les anticorps anti-tTG présents dans l'échantillon et migrent vers une zone de réaction prévue sur le support, où se trouve immobilisé le même antigène non marqué.

Une partie des complexes immuns va se trouver piégée au niveau de cette zone de réaction.

On peut alors détecter la présence ou non d'anticorps marqués.

Cependant, cette technique ne donne qu'une information qualitative sur la présence éventuelle d'anticorps anti-tTG dans l'échantillon testé. Elle manque également de sensibilité, notamment pour les patients à un stade précoce de la maladie ou présentant peu de symptômes.

Selon le document WO-A-02/86509, on peut réaliser des tests de détection d'anticorps anti-tTG sur des échantillons sanguins totaux, en utilisant, comme autoantigène, la tTG libérée par les hématies à la suite d'un choc osmotique.

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L'inconvénient de cette méthode est qu' il est particulièrement difficile de récupérer et de détecter les complexes immuns formés entre la tTG et les anticorps anti-tTG. La sensibilité du test de détection est donc amoindrie.

Ainsi, les tests de diagnostic de la maladie coeliaque existants ne satisfont pas parfaitement l'impératif de sensibilité recherché, notamment afin d'établir un diagnostic précoce de la maladie ou d'assurer un suivi des patients après ce diagnostic. Ils ne fournissent pas non plus d'information quantitative sur le statut immunologique du patient.

Un objectif de l'invention est donc de pallier cette carence, en proposant un procédé de détection sérologique d'anticorps marqueurs de la maladie c#liaque quantitatif et d'une grande sensibilité. Il est également important de disposer d'un test simple, fiable et peu onéreux.

Un objectif de l'invention est également de proposer un procédé de diagnostic de la maladie c#liaque qui permet de limiter les cas de faux négatifs et de faux positifs, améliorant ainsi la fiabilité du procédé.

Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de diagnostic de la maladie c#liaque, facilement mis en #uvre.

En particulier, un objectif à satisfaire est de mettre au point un procédé objectif de diagnostic de la maladie coeliaque, car certaines méthodes nécessitent des observations dont l'interprétation est parfois subjective et douteuse.

Un autre objectif de l'invention est encore de proposer un nécessaire de diagnostic de la maladie c#liaque répondant aux critères énoncés ci-dessus.

Ces objectifs, parmi d'autres, sont atteints par la présente invention, qui concerne tout d'abord un procédé de détection sérologique d'anticorps marqueurs Ac1de la maladie c#liaque dans un échantillon d'origine humaine, comprenant au moins les étapes suivantes : a) on immobilise sur un support des moyens de capture MC d'au moins un antigène Ag spécifique de la maladie c#liaque et/ou de premiers complexes immuns Cil éventuellement formés entre ledit antigène Ag et lesdits anticorps marqueurs Acl, et/ou on met en #uvre de tels moyens de capture MC immobilisés, puis soit, bl) on pré-incube l'échantillon de sérum à tester en présence dudit antigène Ag pour former des premiers complexes immuns Cil entre des anticorps marqueurs Ac1et ledit antigène Ag, et b2) on incube ledit sérum pré-incubé en présence des moyens de capture MC, pour former des seconds complexes immuns CI2 entre d'une part, lesdits

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moyens de capture MC, et d'autre part, ledit antigène Ag et/ou lesdits premiers complexes immuns Cil, soit, b) on incube simultanément l'échantillon de sérum à tester en présence dudit antigène Ag et des moyens de capture MC, pour former des complexes immuns CI2 entre lesdits anticorps marqueurs Acl, lesdits antigène Ag et lesdits moyens de capture MC, puis, c) on révèle lesdits seconds complexes immuns CI2.

Au sens de l'invention, les mots sérum ou sérologique s'appliquent au sang débarrassé de ses cellules. Il s'agit donc notamment du plasma et du sérum au sens strict (la partie liquide du sang, constituée par le plasma débarrassé de la fibrine).

Lorsque, dans la suite de la description, on parlera de la phase b) du procédé ou phase d'incubation, il pourra s'agir aussi bien des étapes bl) suivie de b2), c'est-à-dire une pré-incubation suivie d'une incubation, que de l'étape b), c'est-à-dire une seule incubation, telles que définies ci-dessus. Dans le cas contraire, cela sera mentionné explicitement.

En d'autres termes, le procédé selon l'invention peut être résumé de la façon suivante. Tout d'abord, l'antigène purifié Ag est mélangé avec des échantillons à tester, sériques ou plasmatiques, afin de former des premiers complexes immuns Cil entre l'antigène et un ou plusieurs types d'anticorps marqueurs Acl susvisés. Les anticorps marqueurs Ac1 sont en particulier du type des IgA.

Ensuite, ce complexe immun CIl est capté par les moyens de capture MC (préalablement) fixés sur le support, aboutissant à la formation de seconds complexes immuns CI2 constitués d'au moins trois entités : antigène Ag, anticorps marqueurs Ac1 et moyens de capture MC. Les moyens de capture sont de différents types, et propres à avoir des interactions avec l'antigène, de façon directe ou indirecte.

Puis, dans la suite du procédé, on révèle les seconds complexes immuns CI2 selon des méthodes de révélation connues, par exemple à l'aide d'anticorps de révélation Ac3 étiquetés.

Les anticorps marqueurs recherchés Acl peuvent mtamment être du type IgA ou IgG. Par exemple, lorsque l'antigène est la tTG, les principaux anticorps sont des IgA. Par contre, lorsque l'antigène est une prolamine, plus particulièrement une gliadine, on trouve des anticorps de type IgA et IgG.

Par ailleurs, il est envisageable de rechercher plusieurs familles d'anticorps marqueurs Acl, dirigés contre des antigènes Ag distincts, spécifiques de la maladie

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c#liaque. Par exemple, on pourra rechercher des anticorps anti-tTG et simultanément, des anticorps anti-gliadine, dans un même échantillon et au cours d'une seule manipulation.

Pour cela, au lieu d'immobiliser un seul type de moyens de capture MC sur le support, on immobilise des moyens de capture spécifiques de différentes familles d'anticorps marqueurs Acl et/ou de premiers complexes immuns formés entre les anticorps marqueurs Acl et les antigènes Ag, spécifiques de la maladie c#liaque, correspondants.

Les moyens de capture MC peuvent être de différents types, mais impliquent tous des interactions d'affinité entre eux-mêmes et l'antigène Ag (ou le premier complexe immun CI1) qu'ils doivent capturer dans le sérum incubé. On peut envisager par exemple les couples anticorps/antigène, enzyme/substrat, récepteur/ligand, le premier membre du couple représentant les moyens de capture.

Une solution préférée consiste à utiliser comme moyens de capture MC, des anticorps Ac2, immobilisés sur le support. Il s'agit notamment d'anticorps dirigés contre l'antigène Ag , ou seulement un fragment de l'antigène utilisé lors de la phase d'incubation du procédé, ou dirigés contre les premiers complexes immuns CI1formés au cours de cette phase.

D'autres solutions sont envisageables : exemple, lorsque l'antigène Ag utilisé lors de l'incubation est conjugué à un ligand, au sens large, les moyens de capture MC pourront par exemple être des anticorps dirigés contre ce ligand. En particulier, lorsque l'antigène Ag est conjugué à la digoxygénine, les moyens de capture sont des anticorps anti- digoxygénine.

Une autre solution consiste à mettre en #uvre des antigènes Ag recombinants conjugués à des monosaccharides ou des oligosaccharides, auquel cas les moyens de capture sont des lectines spécifiques des saccharides conjugués.

Encore une autre solution consiste à conjuguer l'antigène au ligand d'un récepteur particulier. Le ligand sélectionné sera par exemple la biotine et le récepteur, utilisé comme moyen de capture MC, l'avidine ou la streptavidine.

Les moyens de capture MC sont produits selon les techniques habituelles de production de molécules biologiques. S'agissant d'anticorps de capture Ac2 dirigés contre au moins un fragment de l'antigène Ag sélectionné, ce sont par exemple des anticorps polyclonaux de lapin anti-tTG. Mais on pourrait également envisager d'utiliser des anticorps monoclonaux de souris ou de rat, ou de toute autre origine.

Le support utilisé est, de façon usuelle et non limitative, une plaque de microtitration en polystyrène, comportant par exemple 96 puits. On peut également envisager d'utiliser d'autres supports, tels que des billes aimantées ou non, des microtubes,

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des membranes, des cupules, des microarrays (puces à peptides ou à anticorps) ou tout autre support adéquat, pouvant être utilisé pour la mise en #uvre de techniques immunologiques.

Les moyens de capture MC sont immobilisés sur le support, c'est-à-dire que, par exemple, ils sont adsorbés sur le support, ou fixés de façon covalente, ou retenus par le support de toute autre façon.

Par exemple, lorsque l'on souhaite fixer les moyens de capture de façon covalente au support, on peut utiliser une plaque de type COVABTEST (marque déposée), commercialisée par la société COVALAB.

Avantageusement, la quantité d'antigène introduite dans le sérum à tester, lors de la phase d'incubation du procédé est suffisamment importante pour que tous les anticorps marqueurs Acl se trouvent complexés audit antigène Ag : il s'agit d'un phénomène de saturation. Cependant, il ne faut pas non plus introduire un excès d'antigène Ag, car les molécules d'antigène non complexées aux anticorps marqueurs Acl recherchés pourraient entrer en compétition avec celles qui sont complexées, lors de la capture par les moyens de capture MC.

La quantité optimale d'antigène introduite est ainsi de l'ordre du microgramme.

Dans ces conditions optimales, il n'existe donc pas de compétition entre anticorps produits lors d'une phase précoce de la maladie, peu sensibles à l'antigène et anticorps produits ultérieurement et ayant une plus grande affinité pour ledit antigène. Cela permet de détecter les anticorps marqueurs de la maladie c#liaque dès les premiers stades.

De plus, ces conditions optimales permettent, dans les étapes suivantes du procédé, d'immobiliser l'ensemble de ces anticorps marqueurs, et donc d'obtenir un procédé de détection quantitatif.

De préférence, on choisit comme antigène une transglutaminase (TG) et plus particulièrement une transglutaminase tissulaire (tTG). Il est également possible d'utiliser d'autres protéines homologues de la TG, au moins pour ce qui concerne les sites reconnus par les anticorps marqueurs Ac1recherchés dans le sérum du patient. Par exemple, on pourra utiliser la protéine Band 4. 2, laquelle présente une homologie de 50% avec la transglutaminase.

Il est également possible d'utiliser une prolamine, par exemple une gliadine, une gluténine, une hordénine ou une sécaline. Il s'agit de prolamines que l'on trouve dans le gluten de blé, de l'orge ou de seigle.

Il s'agit d'antigène naturel ou recombinant, éventuellement purifié, conjugué ou non. De plus, on peut n'utiliser qu'un ou certains fragments de l'antigène naturel pour la mise en #uvre du procédé. Par exemple, on n'utilise que certaines séquences

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particulièrement conservées de l'antigène, ou bien certaines séquences identifiées comme constituant un épitope.

En outre, il est envisageable de rechercher simultanément plusieurs types d'anticorps marqueurs, ayant des cibles antigéniques distinctes. Pour cela, lors de la phase d'incubation, on introduit dans le sérum plusieurs antigènes distincts, spécifiques de la maladie c#liaque. Par exemple, on introduit simultanément dans le sérum de la tTG et de la gliadine, ou encore de la tTG et une prolamine identifiée comme antigénique. Il peut bien entendu s'agir seulement de fragments immunogènes de ces antigènes. Dans ce cas, il peut être avantageux de conjuguer les antigènes à un même ligand, au sens large, afin de n'avoir à utiliser qu'un seul moyen de capture.

Le fait d'utiliser l'antigène, notamment la tTG, en solution pour analyser un échantillon au cours de l'étape de pré-incubation et/ou d'incubation présente plusieurs avantages.

Tout d'abord, le problème de l'adsorption de l'antigène sur le support et du masquage subséquent de certains épitopes ne se pose pas. De plus, l'antigène ne subit pas de dénaturation : distorsion de la structure protéique ou modification de la conformation.

Cela permet donc de diminuer le risque de faux négatif.

Par ailleurs, pour évaluer la capture non-spécifique du sérum par les moyens de capture, notamment des anticorps de capture Ac2, il suffit de remplacer l'antigène par une solution tampon ou un antigène non spécifique, tel que l'albumine, au cours de l'étape de pré-incubation et/ou d'incubation. Après avoir révélé les anticorps fixés, on mesure l'absorbance correspondant à la capture non-spécifique, qu'il suffit ensuite d'ôter de l'absorbance mesurée lors de l'utilisation de l'antigène spécifique. Cette méthode, particulièrement simple, permet de limiter le diagnostic de faux positifs.

On constate que le procédé conforme à l'invention permet de limiter les faux résultats, positifs ou négatifs, améliorant ainsi la fiabilité du diagnostic de la maladie c#liaque.

Préférentiellement, les moyens de révélation sont des anticorps Ac3 dirigés contre les immunoglobulines humaines, notamment contre les IgA. En outre, les moyens de révélation sont étiquetés, selon diverses méthodes envisageables connues de l'homme du métier.

De préférence, les moyens d'étiquetage sont enzymatiques. Il s'agit préférentiellement d'une enzyme dont on peut détecter et mesurer l'activité, conjuguée aux anticorps révélateurs Ac3. On détecte et on mesure cette activité, et indirectement la présence des anticorps marqueurs Acl, en ajoutant dans le milieu réactionnel un substrat de l'enzyme utilisée, susceptible d'être converti en produit coloré par ladite enzyme.

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On peut utiliser diverses enzymes pour révéler la présence éventuelle des anticorps marqueurs. Ces enzymes sont connues de l'homme du métier, notamment dans les essais de type ELISA.

Il s'agit par exemple de la peroxydase de raifort, de la phosphatase alcaline, de la Blactamase, de la B-galactosidase ou de l'uréase. De telles enzymes sont actives dans des conditions physico-chimiques bien définies, leurs facteurs co-enzymatiques et leurs substrats sont connus. Le cas échéant, il pourra utilement être prévu des moyens, notamment solutions ou réactifs, permettant de se placer dans des conditions d'activité enzymatique optimale.

Par exemple, la peroxydase de raifort, en présence de 3,3',5,5'tétraméthylbenzidine (TMB) donne un produit coloré détectable par mesure de l'absorbance à une longueur d'onde de 450nm. On en déduit la densité optique, qui est une fonction de la concentration en anticorps marqueurs Ac1dans l'échantillon testé.

Les anticorps révélateurs Ac3 sont produits selon des techniques de production de protéines conjuguées largement connues de l'homme du métier. De préférence, les anticorps révélateurs Ac3 utilisés sont des anticorps de chèvre anti-IgA humaines, conjugué à la peroxydase de raifort.

D'autres méthodes d'étiquetage sont envisageables. Par exemple, on peut utiliser un étiquetage par des ligands fluorescents, luminescents ou capables de réagir avec de tels ligands. On peut également utiliser un marquage radioactif, par chromophore ou par fluorophore, ou toute autre méthode adéquate.

Lors de la mise en #uvre du procédé, il peut être utile de procéder à des lavages, afin d'éliminer les réactifs (antigène, anticorps) non-complexés et non-immobilisés. En particulier, après l'incubation du sérum pré-incubé, en présence des anticorps de capture Ac2, on peut procéder à un lavage, par exemple à l'aide d'une solution tampon. Cela permet d'éliminer les protéines sériques non-immobilisées ou n'ayant pas réagi avec l'antigène.

Puis, si l'on utilise des anticorps révélateurs Ac3, après avoir mis en contact lesdits anticorps avec les seconds complexes immuns CI2, on procède encore à un lavage pour éliminer les anticorps révélateurs Ac3 en excès, et éviter ainsi ultérieurement une coloration ne reflétant pas la quantité d'anticorps marqueurs présente dans l'échantillon.

Les différentes étapes d'incubation sont réalisées à des températures positives, de préférence proches de la température corporelle normale, soit de 30 C à 40 C, et plus préférentiellement, près de 37 C. En effet, c'est à cette température que les anticorps marqueurs recherchés présentent une activité optimale.

D'autres variables, telles que la durée des différentes étapes, la quantité de moyens de capture immobilisés sur le support, la quantité d'antigène ou de moyens de révélation

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introduite au cours des différentes étapes du procédé, doivent être ajustées selon les conditions opératoires. Il s'agit de variables que l'homme du métier peut contrôler lors de la mise au point du procédé sous des conditions particulières.

L'invention concerne également un nécessaire pour la mise en #uvre d'un procédé de détection sérologique d'anticorps marqueurs de la maladie c#liaque dans un échantillon d'origine humaine, tel que décrit ci-dessus.

Un nécessaire de détection sérologique d'anticorps marqueurs Ac1 de la maladie c#liaque, dans un échantillon d'origine humaine, comprend au moins : # un support sur lequel sont immobilisés des moyens de capture MC dirigés au moins contre un antigène Ag spécifique de la maladie c#liaque et/ou des premiers complexes immuns CI1 formés entre ledit antigène Ag et lesdits anticorps marqueurs Acl, # des moyens pour préparer une solution comprenant au moins ledit antigène Ag, naturel ou recombinant, # des moyens pour révéler la présence, le cas échéant, de seconds complexes immuns CI2 formés entre d'une part, lesdits moyens de capture MC et d'autre part, un antigène Ag et/ou les premiers complexes immuns CI1.

Les moyens pour préparer une solution contenant ledit antigène Ag et les moyens pour révéler la présence de seconds complexes immuns CI2 se présentent par exemple sous la forme d'une solution, concentrée ou non, ou encore sous la forme de poudre lyophilisée à laquelle on doit ajouter une quantité donnée de solvant. Lors de la dissolution de la poudre lyophilisée, les produits contenus reprennent leur conformation normale.

En particulier, les moyens de révélation comprennent des anticorps de révélation Ac3 dirigés contre les anticorps humains et conjugués à des moyens d'étiquetage, autorisant une révélation par voie enzymatique, par colorimétrie, par fluorescence, par luminescence ou encore par radioactivité.

Selon une autre caractéristique, non limitative, l'antigène Ag utilisé dans le nécessaire est une transglutaminase, en particulier un transglutaminase tissulaire tTG, ou encore une prolamine, de préférence choisie parmi les gliadines, les gluténines, les hordénines ou les sécalines, naturelle ou recombinante, éventuellement purifiée.

L'antigène Ag peut notamment être conjugué à un ligand d'affinité apte à s'apparier aux moyens de capture MC.

Un tel nécessaire de détection peut s'intégrer dans un nécessaire de diagnostic sérologique de la maladie c#liaque.

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L'invention est illustrée par les exemples ci-dessous ainsi que par les figures annexées, parmi lesquelles : - la figure 1 est un histogramme représentant l'absorbance à 450nm de sérums de malades c#liaques testés selon le procédé conforme à l'invention, présentant un titre en anticorps marqueurs Acl décroissant, selon les deux méthodes décrites ci-après, avec et sans pré- incubation, - la figure 2 est un histogramme illustrant la comparaison de la sensibilité du procédé de détection conforme à l'invention (méthode par immunocapture) et de la méthode par adsorption conventionnelle, dam lequel est reportée l'absorbance à 450nm en fonction de la quantité d'antigène tTG apportée dans chaque puits.

Exemple 1 : de plaques revêtues d'anticorps anti-tTG
1. 1 Réactifs et tampons # Plaque de microtitration de 12 barrettes sécables de 8 cupules (COSTAR) # R2 : Solution d'antigène tTG de cobaye à 40 g/ml (CovalAb) # R5 : Solution de lavage : tampon PBS concentré 10X contenant du détergent Tween-20 # R6 : Solution de dilution des échantillons : tampon Tris concentré 10X contenant du détergent Tween-20, de la BSA et de l'azide de sodium 0,01% # R7 : Solution de substrat chromogène : 3,3', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) (CovalAb) # R8 : Solution d'arrêt : acide sulfurique à IN # R9 : Anticorps polyclonal Ac2 de lapin anti-tTG à lmg/ml (CovalAb) # RIO : Solution de bicarbonate 0,05M # RI 1 : Solution de saturation BSA 0,5% dans du PBS # R12 : Anticorps polyclonal de lapin anti-tTG marqué à la biotine à lmg/ml (CovalAb) # R13 : Conjugué streptavidine-peroxydase de raifort (CovalAb)
1. 2. Méthode de préparation des plaques revêtues d'anticorps anti-tTG
On dilue la solution d'anticorps Ac2 anti-tTG (R9) au 1/20 dans la solution de bicarbonate (RIO) et on distribue 1001 par puits de cette solution diluée. On incube pendant une heure à 37 C ou une nuit à +4 C. Ensuite, on aspire le liquide contenu dans les puits et on les lave trois fois avec du tampon de lavage (R5).

Par ailleurs, pour étudier la spécificité de la réaction des anticorps Ac2 anti-tTG fixés dans les cupules avec la tTG en solution, on a testé des plaques revêtues d'anticorps de lapin ayant une spécificité pour un autre antigène (anticorps de contrôle).

On distribue lOOul par puits de la solution de saturation BSA 0.5% (Rll) et on incube pendant une heure à 37 C.

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1. 3. Contrôle des plaques revêtues d'anticorps anti-tTG
Ce test permet d'étudier les conditions de fixation des anticorps Ac2 anti-tTG sur la plaque de microtitration ainsi que leur capacité à capter l'antigène tTG en solution.

On commence par préparer plusieurs dilutions de tTG (R2) (dilution de 2 en 2 dans la solution R6) et on distribue 100)il par puits de cette solution diluée dans une plaque préparée. On incube pendant 30 minutes à 37 C, puis on aspire le liquide contenu dans les puits et on les lave trois fois avec du tampon de lavage.

Ensuite, on distribue 100 l par puits de solution d'anticorps anti-tTG biotinylé (R12) diluée au 1/50 dans du tampon de dilution (R6), on incube pendant 30 minutes à 37 C avant d'aspirer le liquide contenu dans les puits et de les laver trois fois avec du tampon de lavage.

On distribue alors 100 l par puits de la solution de conjugué streptavidineperoxydase (R13) diluée au 1/2000 dans le tampon de dilution (R6), on incube pendant 30 minutes à 37 C. Puis on aspire le liquide contenu dans les puits et on les lave trois fois avec du tampon de lavage.

Enfin, on distribue 100 l de solution de substrat chromogène (R7) par puits, on incube pendant 10 minutes à température ambiante. Puis on distribue 50 l de solution d'arrêt (R8) par puits et on lit les absorbances à 450nm.

Les résultats sont exprimés en densité optique.

1. 4. Résultats
1.4.1. Spécificité
On a réalisé deux répétitions par essai, pour l'étude de la fixation des anticorps antitTG sur les plaques de microtitration et leur capacité à capter l'antigène tTG en solution.

Les résultats sont reportés au tableau 1 ci-dessous.

Les résultats présentés dans le tableau 1 montrent que les anticorps anti-tTG fixés au fond des cupules réagissent spécifiquement avec la tTG puisque leur immunoréactivité est importante avec h tTG (colonne 1 et 2) comparée à la réactivité des anticorps de contrôle (colonnes 3 et 4) et aux cupules sans anticorps (colonnes 5 et 6).

1. 4.2. Efficacité de capture
On étudie ici la capacité des anticorps de capture anti-tTG immobilisés sur la plaque de microtitration, à capturer l'antigène tTG, en fonction de la concentration en antigène.

On étudie également l'influence de la quantité d'anticorps marqueurs artificiels dans un échantillon, sur la mesure de la densité optique. Il s'agit d'anticorps polyclonaux.

Les résultats, exprimés en densité optique, sont reportés dans le tableau II cidessous.

Comme on peut le constater, la densité optique mesurée est corrélée positivement à la concentration en antigène tTG et à la concentration en anticorps.

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Ainsi, l'utilisation d'anticorps de capture polyclonaux, qui par définition reconnaissent plusieurs épitopes de l'antigène, ne semble pas gêner les réactions de capture malgré leur compétition pour les mêmes épitopes.

Une coloration apparaît même lorsqu'il n'est pas ajouté de tTG sur la plaque. Cela correspond à des liaisons non spécifiques des anticorps anti-tTG du sérum à la plaque et aux anticorps de capture.

TABLEAU 1 - Densité optique mesurée en fonction des anticorps utilisés pour revêtir la plaque de microtitration et de la dilution en anticorps anti-tTG biotinylés.

<tb>
<tb>

Dilution <SEP> anticorps <SEP> Anticorps <SEP> Anticorps <SEP> Pas
<tb> anti-tTG <SEP> biotinylés <SEP> anti-tTG <SEP> de <SEP> contrôle <SEP> d'anticorps
<tb> 1/100 <SEP> 2,739 <SEP> 2,588 <SEP> 0,962 <SEP> 0,700 <SEP> 0,189 <SEP> 0,183
<tb> 1/200 <SEP> 2,398 <SEP> 2,366 <SEP> 0,487 <SEP> 0,474 <SEP> 0,17 <SEP> 0,166
<tb> 1/400 <SEP> 2,155 <SEP> 2,12 <SEP> 0,456 <SEP> 0,537 <SEP> 0,132 <SEP> 0,12
<tb> 1/800 <SEP> 1,429 <SEP> 1,392 <SEP> 0,333 <SEP> 0,307 <SEP> 0,131 <SEP> 0,097
<tb> 1/1600 <SEP> 0,986 <SEP> 1,032 <SEP> 0,317 <SEP> 0,338 <SEP> 0,104 <SEP> 0,082
<tb> 1/3200 <SEP> 0,675 <SEP> 0,745 <SEP> 0,268 <SEP> 0,273 <SEP> 0,103 <SEP> 0,064
<tb> 1/6400 <SEP> 0,498 <SEP> 0,456 <SEP> 0,274 <SEP> 0,244 <SEP> 0,109 <SEP> 0,06
<tb> 0 <SEP> 0,284 <SEP> 0,234 <SEP> 0,257 <SEP> 0,255 <SEP> 0,148 <SEP> 0,124
<tb>
TABLEAU II - Densité optique mesurée en fonction de la concentration de tTG et de la concentration en anticorps anti-tTG biotinylés.

<tb>
<tb>

Dilution <SEP> anticorps <SEP> Dilution <SEP> tTG
<tb> anti-tTG <SEP> biotinylés <SEP> 1/2 <SEP> 1/5 <SEP> 1/10 <SEP> 1/20 <SEP> 1/30
<tb> 1/100 <SEP> 3,194 <SEP> 3,119 <SEP> 3,088 <SEP> 2,989 <SEP> 1,666
<tb> 1/200 <SEP> 2,900 <SEP> 2,883 <SEP> 2,720 <SEP> 2,794 <SEP> 1,679
<tb> 1/400 <SEP> 2,584 <SEP> 2,446 <SEP> 2,473 <SEP> 2,290 <SEP> 1,414
<tb> 1/800 <SEP> 1,820 <SEP> 1,881 <SEP> 1,668 <SEP> 1,683 <SEP> 0,881
<tb> 1/1600 <SEP> 1,220 <SEP> 1,193 <SEP> 1,180 <SEP> 1,055 <SEP> 0,670
<tb> 1/3200 <SEP> 0,716 <SEP> 0,736 <SEP> 0,775 <SEP> 0,612 <SEP> 0,439
<tb> 1/6400 <SEP> 0,506 <SEP> 0,560 <SEP> 0,516 <SEP> 0,462 <SEP> 0,282
<tb> 0 <SEP> 0,191 <SEP> 0,201 <SEP> 0,177 <SEP> 0,173 <SEP> 0,175
<tb>

<Desc/Clms Page number 14>

Exemple 2 : Réalisation du dosage
2. 1. Composition du nécessaire
Le nécessaire utilisé est le kit d'immunocapture COELICAP (marque déposée). Il comprend : # RI : Plaque de microtitration en polystyrène, revêtue d'anticorps Ac2 anti-tTG, telle que préparée au point 1. 2 de l'exemple 1.

# R2 : Solution de tTG de cobaye à 40ug/ml, à partir d'une solution ou d'une poudre lyophilisée (CovalAb) # R3 : Solution d'anticorps Ac3 de chèvre anti-IgA humaines, conjugués à la peroxydase de Raifort (Sigma).

# R4 : Echantillons de sérum humain testés en clinique pour le diagnostic de la maladie c#liaque en utilisant la technique par adsorption conventionnelle, contenant des anticorps marqueurs Ac1 de la maladie coeliaque : a. Sérum de malade c#liaque à fort titre en IgA anti-tTG (sérums positifs +++) b. Sérum de malade c#liaque à faible titre en IgA anti-tTG (sérums faibles +) c. Sérum humain de contrôle (sérums négatifs-) d. Contrôle sans sérum (0) # R5 : Solution de lavage : tampon PBS concentré 10X contenant du détergent Tween-20 # R6 : Solution de dilution des échantillons : tampon Tris concentré 10X contenant du détergent Tween-20, de la BSA et de l'azide de sodium 0,01% # R7 : Solution de substrat chromogène : 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) (CovalAb) # R8 : Solution d'arrêt : acide sulfurique à IN
2. 2. Méthode avec pré-incubation des échantillons (environ 2 heures)
Tout d'abord, on met en contact les anticorps humains Acl anti-tTG présent dans les sérums ou plasmas avec la tTG. Pour cela, on utilise des tubes ou des barrettes pour effectuer les dilutions. On commence par diluer les sérums (R4) au 1/50ème dans la solution de dilution des échantillons (R6), puis on distribue 60 l des sérums dilués, dans les puits appropriés. On ajoute ensuite 60 l de la solution de tTG diluée (R2) par puits contenant les sérums pour former le mélange sérum-tTG. On incube le mélange pendant 30 minutes à 37 C.

On réalise ensuite la réaction de capture et de formation des seconds complexes immuns CI2. On distribue 100 l du mélange sérum-tTG dans les puits correspondants de la plaque (RI). On incube pendant 30 minutes à 37 C, puis on aspire le liquide contenu dans les puits et on les lave trois fois avec du tampon de lavage.

L'étape suivante consiste à marquer les seconds complexes immuns à l'aide des anticorps de révélation Ac3 en mettant en contact les seconds complexes immuns immobilisés avec les anticorps conjugués anti-IgA humaine marqués à la peroxydase. Pour

<Desc/Clms Page number 15>

cela, on distribue 1001 par puits de solution d'anticorps anti-IgA humaine diluée au l/5000ème dans du tampon de dilution (R6). On incube pendant 30 minutes à 37 C avant d'aspirer le liquide contenu dans les puits et de les laver trois fois avec du tampon de lavage.

La dernière étape consiste à révéler l'activité peroxydase. On distribue 100 l de solution de substrat chromogène (R7) par puits, puis on hcube pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, on distribue 50)il de solution d'arrêt (R8) par puits et on lit les absorbances à 450nm.

Pour déterminer l'accrochage non spécifique du sérum, on remplace la solution de tTG par le tampon de dilution La valeur de densité optique correspondante doit être ôtée de celles obtenues avec la tTG.

2. 3. Méthode sans pré-incubation des échantillons (environ 1,5 heures)
Cette méthode consiste à réaliser la première étape en mélangeant directement les sérums et la solution de tTG dans la plaque de microtitration. De ce fait, la première incubation de 30 min peut être évitée sans altérer les résultats.

2. 4. Résultats
On a comparé les résultats (densité optique mesurée) obtenus selon les deux méthodes exposées ci-dessus, pour les trois sérums humains cités au point 2. 1 de cet exemple, ainsi qu'avec un témoin de capture non spécifique.

Ces résultats sont reportés à la figure 1, qui représente l'absorbance à 450nm en fonction du titre en IgA anti-tTG. Les barres pointillées concernent les résultats de la méthode avec pré-incubation et les barres hachurées concernent ceux de la méthode sans pré-incubation.

Comme on peut le constater, il n'y a pas de différence entre les deux méthodes pour tous les échantillons étudiés. Cela suggère donc que les épitopes reconnus par les anticorps de capture, immobilisés sur la plaque de microtitration, sont différents de ceux reconnus par les IgA humaines anti-tTG.

Exemple 3: Analyse comparative du procédé selon l'invention (méthode d'immunocapture C#LICAP) et de méthodes conventionnelles
3. 1 Analyse du sérum d'un malade c#liaque par la méthode d'immunocapture C#LICAP
Le sérum utilisé dans cette étude a été contrôlé par les tests conventionnels et confirmé positif pour la maladie c#liaque. Le tableau III représente les résultats de l'effet de la dilution du sérum sur l'immunocapture en utilisant une seule quantité de tTG. La spécificité de cette réaction a été étudiée en utilisant des anticorps de contrôle de lapin.

Ces résultats, exprimés en densité optique, montrent que l'immunocapture du complexe est spécifique.

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Pour optimiser les conditions de l'immunocapture, nous avons étudié l'effet de différentes quantités de tTG dans le milieu réactionnel. Le tableau IV représente les résultats exprimés en densité optique et montre que les fortes valeurs sont obtenues avec la tTG dilué au 1/2. La densité optique diminue quand la tTG est diluée.

TABLEAU III - Densité optique mesurée en fonction des anticorps utilisés pour revêtir la plaque de microtitration et de la dilution du sérum du patient c#liaque.

<tb>
<tb>

Dilution <SEP> sérum <SEP> du <SEP> Anticorps <SEP> Anticorps <SEP> Pas <SEP> d'anticorps
<tb> patient <SEP> c#liaque <SEP> anti-tTG <SEP> de <SEP> contrôle <SEP> Pas <SEP> d'anticorps <SEP>
<tb> 1/50 <SEP> 1,126 <SEP> 1,074 <SEP> 0,562 <SEP> 0,549 <SEP> 0,164 <SEP> 0,252
<tb> 1/100 <SEP> 0,813 <SEP> 0,856 <SEP> 0,529 <SEP> 0,483 <SEP> 0,179 <SEP> 0,144
<tb> 1/200 <SEP> 0,922 <SEP> 0,699 <SEP> 0,607 <SEP> 0,512 <SEP> 0,100 <SEP> 0,109
<tb> 1/400 <SEP> 0,499 <SEP> 0,512 <SEP> 0,399 <SEP> 0,464 <SEP> 0,077 <SEP> 0,077
<tb> 1/800 <SEP> 0,419 <SEP> 0,488 <SEP> 0,391 <SEP> 0,402 <SEP> 0,070 <SEP> 0,064
<tb> 1/1600 <SEP> 0,407 <SEP> 0,372 <SEP> 0,353 <SEP> 0,379 <SEP> 0,123 <SEP> 0,085
<tb> 1/3200 <SEP> 0,315 <SEP> 0,323 <SEP> 0 <SEP> 358 <SEP> 0,367 <SEP> 0,056 <SEP> 0,070
<tb> 0 <SEP> 0,240 <SEP> 0,237 <SEP> 0,239 <SEP> 0,257 <SEP> 0,123 <SEP> 0,125
<tb>
TABLEAU IV - Densité optique mesurée en fonction de la dilution de tTG et de la dilution du sérum du patient c#liaque.

<tb>
<tb>

Dilution <SEP> sérum <SEP> du <SEP> Dilution <SEP> tTG
<tb> patient <SEP> c#liaque <SEP> 1/2 <SEP> 1/5 <SEP> 1/10 <SEP> 1/20 <SEP> 1/30
<tb> 1/50 <SEP> 2,382 <SEP> 1,988 <SEP> 1,080 <SEP> 0,783 <SEP> 0,167
<tb> 1/100 <SEP> 1,940 <SEP> 1,606 <SEP> 1,286 <SEP> 0,659 <SEP> 0,116
<tb> 1/200 <SEP> 1,404 <SEP> 1,162 <SEP> 0 <SEP> 809 <SEP> 0,527 <SEP> 0,052
<tb> 1/400 <SEP> 1,109 <SEP> 0,868 <SEP> 0,552 <SEP> 0,323 <SEP> 0,076
<tb> 1/800 <SEP> 0,648 <SEP> 0,537 <SEP> 0,308 <SEP> 0,131 <SEP> 0,011
<tb> 1/1600 <SEP> 0,483 <SEP> 0,334 <SEP> 0,237 <SEP> 0,112 <SEP> 0,017
<tb> 1/3200 <SEP> 0,323 <SEP> 0,235 <SEP> 0,152 <SEP> 0,075 <SEP> 0,045
<tb> 0 <SEP> 0,099 <SEP> 0,083 <SEP> 0,039 <SEP> 0,039 <SEP> 0,010
<tb>

<Desc/Clms Page number 17>

3. 2. Comparaison de la méthode par adsorption conventionnelle et de la méthode par immunocapture C#LICAP
Dans cette expérience on a comparé le procédé selon l'invention ou méthode par immunocapture, avec la méthode d'adsorption de la tTG, en utilisant quatre quantités différentes de tTG.

Les résultats sont reportés dans l'histogramme de la figure 2, qui indique l'absorbance à 450nm en fonction de la quantité de tTG, exprimée en g par puits. Les barres hachurées concernent les résultats de méthode d'immunocapture et les barres pointillées concernent ceux de la technique par adsorption conventionnelle.

La figure 2 montre une différence significative en faveur de l'immunocapture pour toutes les quantités de tTG étudiées. Pour mesurer les IgA anti-tTG du sérum coeliaque par la technique d'adsorbtion il fallait utiliser une quantité beaucoup plus importante (5 g) que par la technique par immunocapture. La technique d'immunocapture semble donc être très sensible.

3. 3. Dosage des IgA anti-tTG dans des sérums de malades coeliaques
Le dosage des IgA anti-tTG dans les sérums de patients a été réalisé en utilisant le kit d'immunocapture C#LICAP (marque déposée) décrit dans l'exemple 2. en utilisant deux quantités différentes de tTG (essai 1 : 1 g, essai 2 : 2 g) et en comparant les résultats avec ceux obtenu par les méthodes de référence : AGA (dosage des anticorps antigliadine), EMA (dosage des anticorps anti-endomysium) et CELIKEY (marque déposée, test de la société PHARMACIA) (dosage des anticorps anti-tTG, utilisant de la tTG adsorbée sur le support).

Pour cette étude, 11sérums ont été étudié dont 6 sérums très positifs, 1 faible et 4 négatifs déterminés selon le dosage par la méthode de référence CELIKEY.

Parmi les deux tests AGA et EMA, on admet que les anticorps anti-endomysium EMA sont les plus spécifiques et les plus sensibles. Toutefois, leur détection fait appel à l'immunofluorescence indirecte sur #sophage de singe, ce qui rend la technique coûteuse et non-automatisable. Nous avons comparé nos résultats avec les tests EMA et le test CELIKEY qui utilise de la tTG asdorbée.

Les résultats, reportés dans le tableau V ci-dessous, sont exprimés en unités arbitraires (UA) définies par le fabricant, et en densité optique (DO) pour le dosage à l'aide du kit C#LICAP.

Les seuils utilisés sont les suivants :
EMA CELIKEY C#LICAP Interprétation UA < 5 UA < 1 DO < 0,1 test négatif : patient sain
5 = UA < 30 1 = UA < 1,4 0,1= DO < 0,15 test douteux : recommencer plus tard
UA = 30 UA = 1,4 DO = 0,15 test positif : malade c#liaque

<Desc/Clms Page number 18>

TABLEAU V - Etude comparative de dosage de marqueurs de la maladie c#liaque selon la méthode d'immunocapture conforme à l'invention et selon des méthodes de référence.

<tb>
<tb>

Référence <SEP> AGA <SEP> EMA <SEP> anti-tTG <SEP> CCELICAP <SEP> (densité <SEP> optique)
<tb> sérum <SEP> (UA) <SEP> (UA) <SEP> (UA) <SEP> Essai <SEP> 1 <SEP> (tTG <SEP> lg) <SEP> Essai <SEP> 2 <SEP> (tTG <SEP> 2 g
<tb> 1 <SEP> 111 <SEP> 30 <SEP> 2,1 <SEP> 0,115 <SEP> 0,131
<tb> 2 <SEP> 195 <SEP> 100 <SEP> 4,2 <SEP> 0,393 <SEP> 0,622
<tb> 3 <SEP> 170 <SEP> 100 <SEP> 4,3 <SEP> 0,262 <SEP> 0,303
<tb> 4 <SEP> 95 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0,054 <SEP> 0,078
<tb> 5 <SEP> 6,7 <SEP> 100 <SEP> 3,5 <SEP> 0,31 <SEP> 0,672
<tb> 6 <SEP> 200 <SEP> >200 <SEP> >4,5 <SEP> 0,872 <SEP> 1,337
<tb> 7 <SEP> 200 <SEP> 200 <SEP> 4 <SEP> 1,344 <SEP> 1,948
<tb> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,01 <SEP> 0,042
<tb> 9 <SEP> 0 <SEP> 23 <SEP> 1,1 <SEP> 0,126 <SEP> 0,157
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,018 <SEP> 0
<tb> -il <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,081 <SEP> 0
<tb>

Légende: AGA anticorps anti-gliadine (IgA)
EMA anticorps anti-endomysium anti-tTG test CELIKEY de la société PHARMACIA
On constate que sur l'ensemble des échantillons testés la concordance entre la méthode de référence EMA et le dosage par immunocapture C#LICAP des anticorps antitTG est excellente.

Avec le test CELIKEY, le sérum 1 est considéré comme positif alors que les tests EMA et C#LICAP donnent un résultat douteux. De même, le sérum 4 est testé négatif par ces deux tests EMA et C#LICAP, alors que le test CELIKEY donne un résultat douteux.

Ainsi le test CELIKEY, qui utilise de la tTG adsorbée, donne pour certains sérums négatifs ou douteux des dosages supérieurs à ceux obtenus avec les tests EMA ou C#LICAP, qui peuvent s'expliquer par un accrochage non spécifique. En effet, nous avons confirmé une réaction non spécifique de ces deux sérums à l'aide du test C#LICAP, en les faisant réagir sur des plaques en l'absence de tTG comme antigène.

En conclusion, le test par immunocapture C#LICAP possède des performances comparables au test EMA et il est plus sensibles et particulièrement plus spécifique que le test utilisant de la tTG adsorbée.

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détection sérologique d'anticorps marqueurs Acl de la maladie c#liaque dans un échantillon d'origine humaine, comprenant au moins les étapes suivantes : a) on immobilise sur un support des moyens de capture MC d'au moins un antigène Ag spécifique de la maladie c#liaque et/ou de premiers complexes immuns Cil éventuellement formés entre ledit antigène Ag et lesdits anticorps marqueurs Acl, et/ou on met en #uvre de tels moyens de capture MC immobilisés, puis soit, bl) on pré-incube l'échantillon de sérum à tester en présence dudit antigène Ag pour former des premiers complexes immuns CI1 entre des anticorps marqueurs Acl et ledit antigène Ag, et b2) on incube ledit sérum pré-incubé en présence des moyens de capture MC, pour former des seconds complexes immuns CI2 entre d'une part, lesdits moyens de capture MC, et d'autre part, ledit antigène Ag et/ou lesdits premiers complexes immuns CI1, soit, b) on incube simultanément l'échantillon de sérum à tester en présence dudit antigène Ag et des moyens de capture MC, pour former des complexes immuns CI2 entre lesdits anticorps marqueurs Acl, lesdits antigène Ag et lesdits moyens de capture MC, puis, c) on révèle lesdits seconds complexes immuns CI2.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel lesdits moyens de capture présentent une affinité biochimique avec l'antigène Ag et/ou un ligand d'affinité conjugué audit antigène Ag, les moyens de capture MC étant de préférence choisi parmi : # les anticorps, plus préférentiellement, les anticorps Ac2, polyclonaux et/ou monoclonaux, dirigés contre au moins un fragment de l'antigène Ag, ou les anticorps dirigés contre un ligand d'affinité conjugué audit antigène Ag, comme par exemple la digoxygénine, # les récepteurs, l'antigène Ag étant conjugué à un ligand, plus préférentiellement, l'avidine et/ou la streptavidine, ou toute autre molécule ayant une affmité pour la biotine, l'antigène Ag étant conjugué à la biotine, # les lectines, l'antigène Ag étant conjugué à un sucre spécifique de la ou des lectines sélectionnées,

<Desc/Clms Page number 20>

# les enzymes, l'antigène Ag étant conjugué à un substrat de ladite enzyme, # les oligonucléotides, l'antigène Ag étant conjugué à un oligonucléotide complémentaire.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel ledit antigène Ag est au moins un fragment de transglutaminase, de préférence de transglutaminase tissulaire tTG, ou d'une protéine homologue, naturelle ou recombinante, éventuellement purifiée, d'origine humaine, animale ou végétale.

4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel ledit antigène Ag est une prolamine, naturelle ou recombinante, de préférence une prolamine choisie parmi les gliadines, les gluténines, les hordénines ou les sécalines.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'antigène Ag est conjugué à un ligand d'affinité apte à s'apparier aux moyens de capture MC.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on cherche à détecter simultanément des anticorps marqueurs Acla, Aclb,..., Acln de la maladie coeliaque dirigés contre différents antigènes Ag spécifiques de la maladie c#liaque.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on révèle lesdits seconds complexes immuns CI2 à l'aide d'anticorps de révélation Ac3 conjugués à des moyens d'étiquetage.

8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel lesdits anticorps de révélation Ac 3 sont dirigés contre les anticorps humains de type IgA.

9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel les moyens d'étiquetage autorisent une révélation par voie enzymatique, par colorimétrie, par fluorescence, par luminescence ou encore par radioactivité.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel lesdits moyens d'étiquetage comprennent une enzyme choisie parmi la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la B-lactamase, la B-galactosidase et l'uréase.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens de capture MC sont immobilisés sur le support par adsorption ou de façon covalente.

12. Nécessaire pour la mise en #uvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.

13. Nécessaire de détection sérologique d'anticorps marqueurs Acl de la maladie c#liaque dans un échantillon d'origine humaine, comprenant au moins : # un support sur lequel sont immobilisés des moyens de capture MC dirigés au moins contre un antigène Ag spécifique de la maladie c#liaque et/ou des premiers complexes immuns Cil formés entre ledit antigène Ag et lesdits anticorps marqueurs Ac1,

<Desc/Clms Page number 21>

# des moyens pour préparer une solution comprenant au moins ledit antigène Ag, naturel ou recombinant, a des moyens pour révéler la présence, le cas échéant, de seconds complexes immuns CI2 formés entre d'une part, lesdits moyens de capture MC et d'autre part, un antigène Ag et/ou les premiers complexes immuns Cil.

14. Nécessaire selon la revendication 13, dans lequel les moyens de révélation comprennent des anticorps de révélation Ac3 dirigés contre les anticorps humains et conjugués à des moyens d'étiquetage, autorisant une révélation par voie enzymatique, par colorimétrie, par fluorescence, par luminescence ou encore par radioactivité.

15. Nécessaire selon la revendication 13, dans lequel l'antigène Ag est au moins un fragment de transglutaminase, de préférence de transglutaminase tissulaire tTG, ou d'une protéine homologue, d'origine humaine, animale ou végétale, ou une prolamine, de préférence choisie parmi les gliadines, les gluténines, les hordénines ou les sécalines, l'antigène Ag étant naturel ou recombinant, éventuellement purifié.

16. Nécessaire selon la revendication 13, dans lequel ledit antigène Ag est un antigène conjugué à un ligand d'affinité apte à s'apparier aux moyens de capture MC.

17. Nécessaire de diagnostic sérologique de la maladie c#liaque, caractérisé en ce qu'il comprend le nécessaire selon l'une quelconque des revendications 12 à 16.