CN103635802B - 基于微阵列的样检系统 - Google Patents

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Abstract

披露了一种用于检测靶分子的微阵列组件。该微阵列组件包括微阵列位于其中的阵列腔并且以有助于阵列腔内液体运动为特点。还披露了利用可靠的膜制造微阵列组件的方法和利用阵列点中的内部控制荧光基团检测微阵列点的方法。

Description

基于微阵列的样检系统
本申请要求于2011年4月13日提交的美国临时专利申请61/475,107的优先权。上述申请的全文被援引纳入本文。
领域
本技术领域是微流体系统，尤其是具有样检用微阵列的微流体系统。
背景
微阵列在研究实验室内最流行作为用于描绘基因表达水平的工具，因为成千上万的取样能够调查单个样品。其实用性不像临床诊断、环境和农业应用那样普遍存在，尽管其信息密度、冗余性、嵌入式控制(正、负)即分析灵敏度。阻止像诊断试验那样采用微阵列的阻碍主要是因为其操作的复杂性和费用(通常每项测试花费数百美元)以及与包含微阵列的微流体装置相关的技术问题，例如由微流体装置中的气泡造成的不可预测的流体流动行为。例如气泡可能阻塞通道，干扰生化反应(尤其是那些要求表面反应的)，造成错误配量，干扰光学读数并且导致不可预测的流动。不可预测的流动尤其对于依赖被分析物稳定扩散至结合配体如寡核苷酸或捕捉抗体的系统是一个问题。因而，人们还是需要基于微阵列的微流体检测系统，其设计用于提供可预测的流体流动并能以低成本来制造。
概述
本申请的一个方面涉及一种用于检测样品中的靶分子的微阵列组件。在一个实施例中，该微阵列组件包括：阵列腔，其具有在第一端的进样口、在第二端的出样口、内顶面、内底面、多个侧壁和位于内底面上的微阵列；与阵列腔的出样口流体连通的废样腔，其中，该阵列腔包括被定位成有助于水基流体完全填充该阵列腔和有助于流体从进样口至出样口连续流动的亲水性内表面，其中，在阵列腔的第一端的横截面面积大于在阵列腔的第二端的横截面面积。
在其它实施例中，该微阵列组件包括：阵列腔，其具有进样口、出样口、内顶面、内底面、多个侧壁和位于内底面上的微阵列；废样腔，其包括废样入口和吸收材料；和具有扩张段的通道，该扩张段具有靠近阵列腔的出口的第一端和靠近废样腔的入口的第二端，其中，该内顶面是有助于含水流体完全填充阵列腔的亲水性表面，并且在扩张段的第一端的横截面面积小于在扩张段的第二端的横截面面积。
在其它实施例中，该微阵列组件包括：阵列腔，其具有在第一端的进样口、在第二端的出样口、内顶面、内底面、多个侧壁和位于该底面上的微阵列；与阵列腔的出口流体连通的废样腔，其中，该阵列腔包括被定位成能帮助水样流体完全填充该阵列腔的亲水性内表面以及包括多个通道，这些通道具有形成在该内底面和/或该内顶面之中以促进干燥的矩形横截面。
本申请的另一方面涉及一种用于控制微阵列中的阵列元件的制造质量的方法。该方法包括以下步骤：用光波照射具有多个阵列点的微阵列以便从每个阵列点产生荧光；对于每个阵列点测量荧光强度，其中，该荧光由内部质量控制荧光基团产生；产生该微阵列的荧光图像；基于该荧光图像确定每个阵列点的信息；和，在条形码、存储装置或RFID标签中编码该信息，其中，该条形码、存储装置或RFID标签是与该微阵列相对应的。
本发明的另一个方面涉及一种微阵列组件的制造方法。该方法包括以下步骤：由一个或多个底膜卷轴退绕展开底膜；将微阵列打印到退绕展开的底膜上；将衬膜层压在打印后的底膜上，其中，衬膜在安放步骤之前被预裁切以提供用于阵列腔的空间并且通过一个或多个衬膜卷轴被安放到该打印后的底膜上；将覆膜层压在该衬膜上以形成多层微阵列结构；和将多层微阵列结构裁切成单独的微阵列组件。
附图简介
具体描述将参照以下附图：
图1A是微阵列组件实施例的示意图，其包含储槽、横截面递减的阵列腔、点阵列、废样腔和吸收材料。图1B是图1A的阵列组件的横截面图。
图2是阵列腔的放大视图，示出了在具有递减横截面面积的腔室底面上打印的线性点阵列。
图3是具有将阵列腔连通至废样腔的扩张通道的微阵列组件。
图4A是示出了具有小的矩形通道的阵列腔的示意图，这些通道垂直于腔室内的液体流动方向。图4B是示出了具有小的矩形通道的阵列腔的示意图，这些通道平行于反应腔室内的液体流动方向。图4C是示出了具有小的矩形通道的阵列腔的示意图，这些通道垂直于或平行于反应腔室内的液体流动方向。图4D是示出了具有小的矩形通道的阵列腔的示意图，这些通道相对于腔室内的液体流动方向形成一个角度。
图5示出了用于制造膜上试验装置的连续组装线的示意图。
图6示出了包括Cy5和Cy3点的一系列稀释物的阵列图。
图7示出了钝针打印头的图像。
图8示出了在聚合之前和之后用真空歧管在聚酯薄膜上打印的阵列的亮场图像以及Cy3阵列的荧光图像。
图9示出了用于钝针打印的薄膜真空歧管的图片。
图10示出了材料PCR后的荧光图像，所述材料与包括印有阵列的聚酯膜在内的可卷绕材料的组合。
图11是照片组合，示出了卷带倒卷打印配置，包括BioDot超非接触阵列打印机(顶板)和在尚未被化学处理或改性的移动膜(底板)上利用BioDot超非接触打印的视频帧。
图12示出了在工厂QC中拍摄的用于提取点参数的MRSA阵列的红波道荧光图像。
图13示出了用最终用户成像仪成像的杂化阵列的绿波道荧光图像。成像仪软件利用阵列QC数据来置放网格和围绕每个单独点的圆。
图14示出了用最终用户装备成像的杂化阵列的荧光图像，但没有使用QC数据，使得置放网格和围绕每个单独点的圆更具挑战性。
具体说明
本说明是要结合附图来阅读的，附图应被认为是本发明的完整书面说明的一部分。附图不一定按比例，本发明的某些特征可以比例夸大地或略微示意性地被示出，以便清楚简明。在说明书中，相对术语如“前”、“后”、“上”、“下”、“顶”、和“底”及其派生词应该被解释为是指随后所述的或如所介绍的图所示的取向。相对术语是用于方便描述的且通常不打算要求特定取向。关于“附接”、“接合”等的术语例如“连接的”和“附接的”是指这样的关系，其中这些结构被直接或间接通过中间结构来相互紧固或附接，以及也能都可移动的或刚性的附接或关系，除非另有明确说明。
本文所用的术语“微阵列”是指代表与相关配位体结合的排序点阵列。微阵列由至少两个点构成。相关配位体包括但不限于核酸(如分子灯标、适体、锁核酸、肽核酸)、蛋白质、肽、多糖、抗体、抗原、病毒和细菌。
本文所用的术语“亲水性表面”是指这样的表面，其将与留在这样表面上的一滴纯水形成45°或更小的接触角度。本文所用的术语“疏水性表面”是指这样的表面，其将会形成与留在这样表面上的纯水滴的大于45°的接触角度。接触角度可以用接触角度测角器来测量。
本文所用的术语“阵列腔”是指微阵列周围的封闭空间，其与入口和出口直接或间接流体连通。阵列腔在填充有液样时容许微阵列浸没在液样中，从而液样中的靶分子能保持与微阵列取样的紧密接触。
设计用于帮助系统内的流体流动的微阵列系统
本申请的一个方案涉及一种基于微阵列的检测系统，其包括微阵列组件，该微阵列组件包括具进样口、出样口和位于其中的微阵列的阵列腔、与阵列腔流体连通的废样腔。阵列腔具有定位成帮助完全填充阵列腔以及流体从阵列腔流向废样腔的亲水性表面。亲水性表面在液体从进样口进入阵列腔时接触液体并且容许完全填充该阵列腔。某些实施例中，阵列腔呈具有可变宽度的细长通道形状，其直接连通至废样腔。在其它实施例中，阵列腔通过废样通道被连通至废样腔。
液样或反应混合物的表面张力通常阻止液样或反应混合物完全填充小空间如微阵列系统的阵列腔。表面张力是液样分子之间利用各种分子间力相互吸引的产物。在此类型液样中，每个分子在所有方向上被相邻的液体分子同样拉拽，使得净力为零。在液样表面上，许多分子被更深层位于液体内的其它分子向内拉，而没有被相邻介质(假定是真空、空气或其它流体)中的分子同样强烈地吸引。因此，表面上的所有分子受到向内的分子吸引力，其只能通过液样抗压缩阻力来平衡。向内拉拽倾向于缩小表面面积，就此而言，液体表面像是拉伸的弹性膜。因此，液体本身挤在一起，直到它具有可能的局部最小表面面积。最终结果是液样可以在小空间内保持近球形并且没有填充角部，尤其是小空间的方形角部。将盖与阵列腔内的微阵列表面分隔开的典型的小间隙通常将液体压成柱形。
在微阵列系统情况下，填充微列腔的液体最可能是含水溶液如杂化缓冲剂或清洗缓冲剂。含水溶液的表面张力可以通过用亲水性材料至少涂覆阵列腔内表面的一部分来克服。某些实施例中，微阵列位于阵列腔的底面上，阵列腔的顶面或者至少一部分顶面涂覆有亲水性涂层。
亲水性材料的例子包括但不限于亲水性聚合物，例如聚乙二醇、聚甲基丙烯酸羟乙酯、Bionite、聚(N-乙烯基内酰胺)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚（环氧乙烷）、聚（环氧丙烷）、聚丙烯酰胺、纤维素、甲基纤维素、聚酸酐、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、复合多元醇单酯、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯和山梨糖醇酐脂肪酸酯；无机亲水性材料，例如无机氧化物、金、沸石和类金刚石碳；和表面活性剂如聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、聚山梨酯（Tween）、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂硫酸铵、烷基硫酸盐、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(SLES)、烷基苯璜酸盐、肥皂、脂肪酸盐、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)亦称鲸蜡三甲基溴化铵、烷基三甲基铵盐、西吡氯铵(CPC)、聚邻乙氧基苯胺(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰子两性甘氨酸盐聚（环氧乙烷）、聚（环氧乙烷）和聚（氧化丙烯）的共聚物(商业上称为泊洛沙姆或Poloxamines)、烷基多糖苷、脂肪醇、椰油单乙醇酰胺、椰油二乙醇酰胺、椰油酰胺二乙酸盐。
某些实施例中，至少一种表面活性剂与反应聚合物如聚氨酯和环氧树脂混合以用作亲水性涂层。其它实施例中，阵列腔的顶面或底面通过表面处理例如被制成亲水性，例如大气等离子体处理、电晕处理或者气体电晕处理。
亲水性带的例子包括但不限于Adhesives Research(AR)带90128，AR带90469，AR带90368，AR带90119，AR带92276和AR带90741(AdhesivesResearch公司,Glen Rock,PA)。亲水性膜的例子包括但不限于膜和膜(Film Specialties公司,Hillsborough,NJ)和Lexan HPFAF(GEPlastics,Pittsfield,MA)。其它亲水性表面可以从Surmodics公司(EdenPrairie,MN)、Biocoat公司(Horsham,PA)、Advanced SurfaceTechnology(Billerica,MA)和Hydromer公司(Branchburg,NJ)获得。
某些实施例中，亲水性带或膜具有足够高的透明性以允许从阵列腔顶面光学探询该微阵列。
该微阵列可以是任何类型的微阵列，包括但不限于寡核苷酸微阵列和蛋白质微阵列。在一个实施例中，该微阵列是抗体阵列，该微阵列系统被用于捕捉和标记靶抗原。在一个实施例中，该微阵列利用例如如美国专利5,741,700、5,770,721、5,981,734、6,656,725和美国专利申请10/068,474、11/425,667和60/793,176所述的打印凝胶点法来形成，所有这些文献的全文兹被援引纳入。在某些实施例中，该微阵列包括被印在构成阵列腔底面的阵列基材上的多个阵列点。在某些实施例中，阵列基材是玻璃或塑料。
在某些实施例中，阵列点包含内部控制荧光基团，其发光光谱不同于与靶分子相关的荧光基团的发光光谱(即，靶分子将用其发光光谱不同于内部控制荧光基团的发光光谱的荧光基团来标记)。在野外或在制造过程中的内部控制可以被分析以改善质量。内部控制将提供评估点荧光强度的定量手段(如平均值、中间值或积分)，其可能因为滴径、形态、多孔性或可改变点和点之间的再现性的任何因素而变化。影响这些性能的因素包括UV剂量、温度、表面性能、合成、黏度、浓度、清洗(即因由温度、黏度、流速、紧迫的差异或者可能影响点的去除或失真的任何东西造成的影响)、在针打印技术中的针在聚合物溶液中的浸没深度或者会影响凝胶元件的形态或者其中的取样浓度的任何性能。野外成像将会附带负责：使用者误用，凝胶元件因凝胶元件的操作、清洗不良而毁坏，因盐的存在而亮度增强，热循环，降低荧光效应的高温条件，增强荧光效应的低温条件，搁置降级和/或在阵列制造中在最初QA/QC后有助于荧光信号变化的任何事情。
荧光基团例子包括但不限于芘、7-甲氧基香豆素、级联蓝、6-MI、3-MI、7-氨基香豆素-X(AMCA-X)、6-MAP、太平洋蓝、马里纳蓝、二甲基氨香豆素、氟硼二吡咯（BODIPY）493/503、BODIPY-FI-X、DTAF(5-DTAF)、6-FAM(荧光)、丹磺酰-X、Oregon green500、Oregon green488(5异构体)、罗多尔绿、Oregon绿514、罗丹明绿-X、NBD-X、TET、2’4’5’7’-四溴磺酸荧光黄、BODIPY-FI BR2、BODIPY-R6G、6-JOE、BODIPY530/550、HEX、羧基罗丹明6G、BODIPY558/568、BODIPY-TMR-X、PyMPO、BODIPY564/570、Cy3、TAMRA-X、罗丹明红-X、BODIPY576/589、BODIPY581/591、德克萨斯红-X、Cy3.5、ROX、BODIPY-TR、Syto-81、Cy5、萘荧光黄、Cy5.5、VIC、SYBR green I和SYBR green II。
在其它实施例中，内部控制是比色分析信号变化，其在点与点之间是不同的。在其它实施例中，内部控制是化学发光信号变化，其在点与点之间是不同的。在其它的实施例中，内部控制是电化学信号变化，其在点与点之间是不同的。
在某些实施例中，阵列点是包含第一荧光基团(如Cy5)的凝胶点。样品中的靶在PCR中用第二荧光基团(如Cy3)来标记并且随后被杂化至共价结合到胶滴聚合物的取样。第一荧光基团具有不同于第二荧光基团的发光峰值。在此设定条件下，第一荧光基团(如Cy5)用于允许用能检测第一和第二荧光基团(如Cy3和Cy5)的成像系统精确定位凝胶点。
在某些实施例中，成像系统是微阵列样检系统的组成部分。在其它实施例中，成像系统是制造微阵列组件时所用的机器观测系统的一部分，因而每个点的坐标可以在观察中被精确确定。这些坐标被上载到附接至微阵列组件的条形码或RFID标签上以便未来分析。为有效实现此做法，第一荧光基团(即内部控制荧光基团)坐标要求第二荧光基团(即靶荧光基团)参考基准作为组合图的一部分被加入，从而该网格可以被置放。但是，不像传统方案(其或是试图基于精确间隔的点来置放网格，或是要求两种颜色荧光基团成像仪)，所公开的方案使用来自条形码的坐标以置放点检测用的固定圆。第一荧光基团(即内部控制荧光基团)点的位置可以与阈值算法连用，以寻找随后被用于固定圆置放的中心。
使用机器观测来识别点的好处是相同系统可以被用于拒绝多个点，而不拒绝整个微阵列，这将提高效率。可以基于许多标准例如越界的内部控制荧光强度值、非对称性和直径来拒绝多个点。因此，本发明的某些实施例涉及一种控制微阵列中的阵列元件制造质量的方法，包括：用光波照射具有多个阵列点的微阵列以便从每个阵列点产生荧光；对每个阵列点测量荧光强度，其中，该荧光由内部质量控制荧光基团产生；产生微阵列荧光图像；基于荧光图像确定每个阵列点的信息；和在条形码、存储器或RFID标签中编码该信息，其中，该条形码、存储器或RFID标签与微阵列对应关联。每个阵列点的信息可以包括每个点的位置、每个点的荧光强度、每个点的直径和每个点的形态。微阵列图像分析可以如此进行，即，利用基于内控制荧光而确定的点位置信息，对微阵列图像上的每个微阵列点安放固定的圆。
在一个实施例中，本申请提供一种微阵列图像分析方法。该方法包括以下多个步骤：获得微阵列图像；基于通过在上述阵列点中的内部控制荧光获得的阵列点位置信息将围绕每个微阵列点的固定的点边界圆安放在微阵列图像上；针对每个阵列点测量在该固定的点边界圆内的靶荧光强度；以及基于在每个阵列点的靶荧光强度与内部荧光强度之比确定样品中的靶分子数量。
另一个实施例中，一种微阵列图像分析方法包括以下步骤：对于微阵列中靶点确定靶荧光强度；对于微阵列中的所述靶点确定内部荧光强度；对于微阵列中的所述靶点确定信号强度，其中，该信号强度是靶荧光强度与内部荧光强度之比，其中，微阵列靶点的内部荧光强度是如前所述地被确定的。
在另一个实施例中，本申请提供一种微阵列中的阵列元件的成像方法。该方法包括以下步骤：用第一波长的光波照射具有多个阵列点的微阵列以从内部控制荧光基团产生荧光；基于由内部控制荧光基团所产生的荧光(控制荧光)确定微阵列的阵列点位置；用第二波长的光波照射微阵列以由直接或间接地与结合至阵列点的靶分子相关的靶荧光基团产生荧光；测量由靶荧光基团产生的荧光(靶荧光)；以及，基于在相关阵列点中的控制荧光强度与靶荧光强度之比确定样品中的靶分子数量。
该废样腔可以是任何形状的并且一般具有大于阵列腔体积的体积。在一个实施例中，废样腔在垫圈带中构成，垫圈带随后被附接到打印有微阵列的基材上。在又一个实施例中，基材的顶面上有切口。切口的尺寸和位置能匹配于垫圈中的废样腔的尺寸和位置，从而废样腔一旦形成在基材和垫圈之间,将会具有大于阵列腔厚度的厚度。在另一实施例中，基材由塑料构成，从而切口可以容易地形成在基材上。在又一个实施例中，阵列腔和废样腔形成在基材中，而没有使用垫圈。但废样腔可以具有大于阵列腔深度的深度。
在一个实施例中，废样腔装有吸收材料，吸收材料一旦接触阵列腔中的液体就将液体从阵列腔芯吸走，由此允许微阵列在干燥状态下做好准备。
吸收材料可以是能保持相对大量液体的任何材料。在一个实施例中，吸收材料由纤维聚团构成。在另一实施例中，吸收材料是由透风结合法制造的无纺布。无纺布的构成纤维可以是亲水性合成纤维、浆液等的天然纤维素纤维或者再生纤维素纤维。纤维可涂覆有或渗透有表面活性剂或亲水性油以改善液体吸收性。不局限于透风结合法，在此所用的无纺布可以按任何其它方法制造，例如纺粘工艺、空气成网工艺、射流喷网工艺等。在一个实施例中，吸收材料是得自Millipore(Billerica,MA)的纤维素纸(C048)。
某些实施例中，废样腔通过排气口被排气至大气。在一个实施例中，排气口简单地通过在废样腔盖上冲制孔口来产生。
在另一个实施例中，阵列腔内的液体被如此去除，即，迫使储槽内的液体进入阵列腔并建立阵列腔内的液体和废样腔内吸收材料之间的接触。该接触可以通过对阵列腔内的液体施压以推动液体流出阵列腔或通过在废样腔出口施加抽吸以拉动液体流出阵列腔来建立。作用于阵列腔内液体的压力可以通过经控制阀施压来产生(例如用滴定管或注射器)。如果阵列腔只用亲水性胶带或亲水性膜覆盖，则对阵列腔内液体的压力可以简单地通过按压构成阵列腔顶面的亲水性胶带或膜来产生。或者，阵列腔内液体与吸收材料的接触可以通过靠近阵列腔放置吸收材料来建立，从而吸收材料接触通道内的液体。
一旦建立了接触，则阵列腔内的液体经阵列腔被吸入废样腔中的吸收材料。液体流速由阵列腔尺寸、表面张力和液体黏度和吸收材料的芯吸速度来决定。另外，流速随着吸收材料变得更加饱和而减小。
在另一个实施例中，微阵列系统还包括单向阀用于注入液体(如样品、含有靶的PCR缓冲剂、杂化缓冲剂或清洗缓冲剂)到阵列腔。样品经单向阀被注入阵列腔以阻止环境污染，环境污染在某些应用例如生物品试剂检测中是重要的关注点。单向阀可以是安置在阵列腔入口处的控制阀、圆顶阀或鸭嘴阀。各种尺寸的圆顶阀可以例如从Minivalve International(Yellow Springs,OH)商购获得。
某些实施例中，阵列腔的侧壁是疏水性的以截留气泡。在其它实施例中，阵列腔具有亲水性盖，其设计成靠近阵列腔出口地形成亲水区域。在相关的实施例中，利用亲水性凝胶元件产生亲水区域。
在另一个实施例中，阵列腔入口包含可刺透的隔膜/带或圆顶阀、控制阀或鸭嘴阀，以容许发生清洗而不会造成阵列腔的内装物释流出微阵列组件。
在另一个实施例中，微阵列系统还包括储槽用于将液体注入阵列腔。在一个相关实施例中，储槽松弛地结合至所述装置，从而它可以被折断并取下以便在传统微阵列中或比色分析读取仪中成像。在另一实施例中，阵列腔被连通至多个废样腔以保证芯吸按照适当间隔发生。
一旦气泡进入阵列腔，则气泡可留置在阵列腔中并且部分或完全阻断阵列腔内的液体流动。如果气泡恰好位于液体和吸收材料的界面处，则气泡也可以停止吸收材料的芯吸作用。某些实施例中，微阵列组件的阵列腔的形状有助于气泡在阵列腔内运动。某些实施例中，阵列腔的横截面面积从腔室一端到另一端地连续递减或者逐级递减，以帮助液体以及气泡从阵列腔入口至阵列腔出口的运动。
图1A示出了微阵列组件100的一个实施例，其设计用于帮助去除阵列腔内的气泡。微阵列组件100包括从进样口112跨越到出口114的漏斗状阵列腔110，出口通入具有吸收材料122的废样腔120。微阵列腔110中装有就位于基材150上的多个微阵列点130(见图1C)，该基材也形成了阵列腔110的底面。在某些实施例中，阵列腔110连通至储槽140。在此实施例中，阵列腔110具有朝向废样腔120递减的横截面面积，于是，毛细管压力随着阵列腔110内的液体到达废样腔120而连续增大。该压差导致液体运动向废样腔120中的吸收材料122。换句话说，阵列腔110的形状提供将阵列腔110内的液体连续芯吸向废样腔120，直到液体到达废样腔120中的吸收材料122。某些实施例中，在阵列腔110入口端的横截面面积比在阵列腔110出口端的横截面面积大2倍、3倍、4倍或5倍。
在一个实施例中，阵列腔110呈梯形，其入口端的尺寸在0.5-20mm之间，出口端的尺寸在0.1-5mm之间。在另一实施例中，阵列腔110包括一组阶梯结构，其具有从入口端到出口端渐小的横截面面积。这些特征被设计用于在前移锋面具有比后退锋面小的弯曲半径，从而阵列腔110内的气泡前进向废样腔120，阻止与气泡相关的上述问题。
图1B是微阵列组件100的沿图1A的线AA截取的横剖视图。在此实施例中，微阵列组件100包括阵列底层150、衬层160和覆层170。在一个实施例中，衬层是具有0.25mm厚度的双面胶带如内垫圈条(可从3M获得，零件号9087)。其它实施例中，阵列底层150是喷射模制塑料，具有产生阵列腔110壁和废样腔120凹窝的结构特征，并且在这些实施例中没有衬层160。
在其它实施例中，亲水性膜利用热和/或压力被层压到塑料阵列基材150上以形成其上打印有微阵列的亲水性表面。层压可利用激光焊或超声波焊进行。
图2提供图1A的漏斗状阵列腔110的放大视图。如图2所示，递减的腔室宽度或者阵列腔的楔形容许增大的毛细管压力作用于废样腔120侧。此配置形式容许气泡流经阵列腔并且避免气泡堵塞阵列腔110。漏斗状的狭窄腔室110也帮助样品中的靶分子扩散到阵列点130。某些实施例中，样品被装填入储槽140并且连续流经阵列腔110至废样腔120。
某些实施例中，微阵列点130以多条形式排列(例如蛋白质条阵列)，它们垂直于阵列腔110内的流动以改善样品中的靶分子和阵列元件之间的相互作用。在一个实施例中，在阵列腔110内打印蛋白质阵列或蛋白质条阵列。从样品中提取的蛋白质被装填入储槽140并且连续流经阵列点130或条30而进入废样腔120。
本领域普通技术人员将会理解，微阵列组件100可以具有许多变型。例如整个微阵列组件100可以被模制成两半，产生的分割线跨越基材150、废样腔120和储槽140的中心线。分割线可以呈仿形路径形式以容许阵列腔110顶面的亲水性表面处理和/或在基材150顶面打印阵列点130简单易行。阵列组件的上半部可以被处理成亲水性的，例如用等离子体处理、表面活性剂或任何上述技术，并且利用超声焊、激光焊、卡接设计、胶、胶带或任何接合方式被接合就位。某些实施例中，覆层170的尺寸能仅覆盖腔室区域，但未覆盖微阵列组件100的整个上表面。
图3示出了微阵列组件100的另一个实施例，其设计用于帮助除去阵列腔110内的气泡以及在长期遭遇极端温度(达到95℃)时保持样品在阵列腔110中。在此实施例中，微阵列组件100包括具有进样口112、出样口114和位于基材150上方的多个微阵列点130的阵列腔110、具有吸收材料122、入口116和排出口124的废样腔120以及连通阵列腔110的出样口114和废样腔120的入口116的通道118。在此实施例中，通道118具有扩张段118A和曲折形段118B。扩张段118A具有朝向废样腔120递增的横截面面积，从而阵列腔110内的气泡一旦进入通道118就被陷留在扩张段118A侧壁上，未阻断通道118内的流体流动。在阵列腔110遭遇高温时的样品膨胀过程中，扩张段118A帮助将液体接触线“钉”在该部段的凸角上。在一个实施例中，通道118侧壁是疏水性的以截留气泡。某些实施例中，在通道118A的废样腔端的横截面面积比在通道118A的阵列腔端的横截面面积大至少2倍、3倍、4倍或5倍。某些实施例中，曲折形段118B包含两个拐弯而形成S形或Z形通道段。在一个实施例中，这两个弯是90°弯。
在其它实施例中，阵列腔110加工形成有小的矩形通道180(即具有矩形横截面的通道)，其垂直于流动方向以提供干燥阵列的手段(见图4A)。这些通道180具有导致了流体-空气界面的小弯曲半径的锐角并且提供了使液体沿侧壁前进到废样腔120的高毛细管压力。另一实施例中，多个矩形通道180平行于液体流路(见图4B)。在另一实施例中，多个矩形通道180既平行于流体流路，也垂直于液体流路(见图4C)。在另一实施例中，多个矩形通道180以在从30至120度范围内的角度与液体流路相交(见图4D)。在另一实施例中，基材150的顶面被糙化以沿表面裂缝提供相同的芯吸作用。
顶面也可以被糙化，从而有多个方形微通道，其呈平行、相交、垂直形式或这些形式中的一部分或全部。在角处的接触角度应该小于90度，以使液体沿这些通道前进向废样腔(吸收材料)。此做法与在针叶树中的管胞(方形毛细管)中的情况相似，其允许液体克服静液压力的作用，沿树杆长度上行。
用微阵列组件检测靶分子
本申请的另一方案涉及利用上述微阵列组件检测样品中的靶分子的方法。该样品可以是任何生物样品如拭子、鼻咽吸气或者完整血液样品。总核酸可以利用本领域普通技术人员已知的技术被分离出来。在一个实施例中，总核酸利用可商购得到的核酸隔离试剂或套件例如Qiagen试剂被分离出来。在另一实施例中，总核酸利用样由Akonni Biosystems研发的品预备器械被分离出来。Akonni的样品预备方法的概括事件顺序包括在溶胞缓冲剂中变性该样品；经样品预备器械连续灌注溶胞样品；清洗并从样品预备器械中洗脱出核酸。
分离出的核酸被装填入微阵列系统并且在微阵列组件中利用本领域技术人员已知的方法被扩增。扩增后，微阵列组件在期望温度被培养一段时间(例如在50-65℃培养10-60分钟)，以允许扩增子杂化至微阵列。培养后，微阵列系统被清洗(例如用水)并且在微阵列读取仪上(如Akonni的便携式微阵列读取仪)上被成像。在一个实施例中，微阵列系统在成像前被干燥。在另一实施例中，干燥过程利用将丙酮注入阵列腔和/或加热阵列腔来完成。在另一个实施例中，分离核酸的扩增和扩增产物的标记发生在非对称PCR主混合中，其与未标记的“正”引物相比包含远远超出(如超出5-20倍)的荧光标记的“反”引物。该做法主要产生具有在其5’端的单个标记的简单标准靶。
阵列试验可伴随多种变化来进行。在一个实施例中，扩增产物在杂化后保持在反应腔内，并且微阵列成像前没有清洗。在另一实施例中，扩增产物保持在阵列腔中，阵列点在杂化过程中被实时成像以显示由Khodakov等人(2008)所描述的生长曲线。在又一个实施例中，阵列腔支持一系列培育和清洗步骤以用于多步骤试验如ELISA。在一个实施例中，培育步骤在周期性振动或连续振动的情况下进行以改善阵列元件和靶蛋白之间的相互作用。
微阵列组件的制造
本申请的另一方面涉及利用可卷绕的薄膜材料和卷带倒卷装置的微阵列组件制造方法，其具有底层、衬层和覆层。简单说，可卷绕的薄膜材料被用于微阵列组件的底层、衬层和覆层。这些层膜被如此层压在一起，即，一个叠一个地打开几个卷，产生由期望组成部分构成的夹层结构，其在生产线末端被裁切定尺。确切说，使可卷绕的底膜前移到制造平台上。阵列点被打印到膜上，形成具有固定的阵列间间隔的微阵列。被打印的底膜随后被层压上已经利用单独的卷带倒卷制造法被预裁切以产生用于阵列腔的空间的可卷绕的衬带。可卷绕的覆膜随后被层压到衬膜上方以密封该阵列腔。在某些实施例中，可卷绕的衬带被预裁切以产生用于阵列腔和一个或多个废样腔的空间。吸收材料在覆膜被层压至衬膜前被置入每个废样腔。该制造方法的优点是大量生产是非常成本划算的，因为利用标准生产装备，微阵列组件的组装能以很高的速度被完全自动化。
底膜可以是任何薄膜，其表面具有双键碳原子。底膜最好具有疏水性表面。底膜的例子包括但不限于聚酯膜、聚酯/聚碳酸酯膜复合膜、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚醚酰亚胺、聚醚醚酮和聚苯乙烯。在某些实施例中，底膜的厚度在20-200微米范围内，优选在50-125微米范围内。
衬膜可以是具有期望厚度的双面胶带。在某些实施例中，衬膜由疏水性材料制成并且厚度在20-500微米范围内，最好是100-300微米。衬膜例子包括但不限于聚酯膜、聚酯/聚碳酸酯掺混膜、聚丙烯、聚碳酸酯、缩醛、聚甲基丙烯酸甲酯、来自Adchem的256M带膜和聚四氟乙烯。覆膜可以是具有亲水性表面的任何薄膜。亲水性膜的例子包括但不限于膜和膜(Film Specialties公司，Hillsborough,NJ)和Lexan HPFAF(GEPlastics,Pittsfield,MA)。其它亲水性表面可以从Surmodics公司(EdenPrairie,MN)、Biocoat公司(Horsham,PA)、Advanced Surface Technology公司(Billerica,MA)和Hydromer公司(Branchburg,NJ)得到。
某些实施例中，覆膜厚度在25-250微米、最好是50-150微米范围内。
在某些实施例中，该微阵列是用非接触式微阵列打印机(例如压电打印机)打印到底膜上的凝胶点微阵列，该打印机允许在移动的膜上打印。在某些实施例中，凝胶点包括取样如蛋白质取样或核苷酸取样，其通过紫外线致共聚被共价交联至聚合物主链。
图5示出了卷带倒卷组装线用于本发明的微阵列器械制造。简言之，底膜510通过底膜卷轴512被铺放到组装线500上。凝胶点打印机514打印阵列点到底膜510上。凝胶点中的取样通过UV辐照被共价交联到聚合物主链。在一个实施例中，交联通过单步骤氩气氛UV致共聚过程中在UV腔室516内完成。在一个实施例中，薄膜利用卷轴之间的固有张力保持就位在系统上。这通过在共聚中将薄膜保持平摊在UV腔室内而改善了在薄膜表面上的UV辐照均匀性。交联微阵列在清洗站518被清洗，被气刀520干燥，由质量控制(QC)摄像机522检查。有缺陷的阵列利用拒绝打标机524来标记，并且衬膜526通过衬膜卷轴528被层压到底膜510。衬膜526可在层压前被预裁切以产生用于阵列腔和一个或多个废样腔的空间。吸收材料530随后被加入废样腔，从而包含粘性衬底的定尺预切吸收材料片段通过吸收材料卷轴532被置于敞开的废样腔内。覆膜534随后通过覆膜卷轴536被层压在底膜/衬膜结构上。所组成的多层结构随后被闸刀538裁切以产生单独的微阵列组件。
例子
例1
补偿微阵列打印变化的方法
包含Cy3和Cy5荧光基团的凝胶滴点微阵列根据以下组合图案被打印到十个单独的载片。以下步骤被用于打印微阵列：(1)准备合适的Cy3/Cy5寡混合物并且在CentriVap上干燥，(2)准备聚合物溶液(单体+交联剂+甘油+缓冲剂)，(3)在共聚物溶液中溶解干燥的寡混合物，(4)将溶液置入源板中，和(5)使用源板用于阵列打印/聚合化/清洗。
组合图
利用采用以下设定的GenePix4000B来分析：100%激光功率用于两种颜色，500增益用于红波道光电倍增管压设定，375增益用于绿波道光电倍增管压设定，5μm分辨率，175μm直径圆。对于每个点，用GenePix软件计算综合强度，对所有198个Cy5点、198个Cy3点和Cy3/Cy5点的比例计算相对标准偏差(RSD)。如表1所示，对于所有10个载片，当与Cy3或Cy5信号强度相比使用Cy3/Cy5综合强度之比时偏差(CV)系数较低，某些情况下低了高达3倍。此数据支持内部荧光控制的实施，例如Cy5染料，其作为制造QC的一部分被扫描或成形以补偿由UV剂量、温度、表面性能、合成、黏度、凝聚、清洗(即因为由温度、黏度、流速、应急的差异或可能影响点的去除或失真的任何东西造成的影响)、对于针打印技术而言针在聚合物溶液中的浸没深度或任何能影响在某个点中的取样形态和/或浓度的性能引起的变化。
表1
例2
图像分析法
在Akonni的MRSA微阵列上实施了内部荧光控制并且如图所示有效用于补偿荧光强度变化。表2示出了在掺杂有Cy5荧光基团和MecA取样的MRSA微阵列中的一组4个凝胶滴荧光的数据。对于在工厂QC(红波道)中和在杂化后(绿波道)取得的所有4个相同的液滴，综合信号强度被制表。因为相同样品3的物理损伤，红波道和绿波道对于相同样品3显示出显著降低的综合信号强度。作为减弱的相同样品3信号强度的结果，相对偏差针对红波道和绿波道分别是23.8%和29.5%。当绿波道数据和红波道数据作为比值来计算时，该相对偏差被减小至12.2%。这表明内部荧光控制数据(红波道)可以被用于减小微阵列图像和/或微阵列制造的可变性。
表2
例3
图像生成算法
算法1
该算法拍摄在杂化前的阵列Cy5QC图像并产生包含阵列QC参数的数据文件。
1.读取Cy5QC图像并产生两个当地拷贝，一个是未变的原件(CY5_原件)，另一个将在步骤2和3中被转化为二进制图像(Cy5_处理)。
2.拍摄Cy5_处理图像，进行数字过滤和像素演算来产生包含均匀零值背景的图像。
3.将图像开始转入二进制图像并作为Cy5_处理存储起来。
4.基于尺寸对识别的过滤物体的二进制图像(Cy5_处理)进行颗粒分析。物体的测量和记录参数是：质量中心、边界框、颗粒面积和椭圆度。
5.查看在步骤4中识别的物体的数目是否满足最低要求，否则拒绝该载片。
6.寻找网格。
a.选择一个物体并假定其质量中心是网格起点。
b.形成网格并且计算每个网格单元的像素位置。
c.将所有物体施加到网格并检查是否应包含Cy3液滴的至少80%的网格单元容纳了物体。如果是，则该网格被发现并且进至步骤7。如果没有，则以不同物体的质量中心为网格起点来重复6A-6C。
7.旋转图像，从而由Cy3液滴形成的角度小于自水平轴起的0.2度。
8.微调网格。因为在步骤6种，网格起点在二进制图像种由一个物体的质量中心确定，故该质量中心能略微偏离真正物体中心。
a.按照(0,1)移动网格原点，即X坐标减去0像素，Y坐标减去1像素。
b.对于每个Cy3液滴，计算：
i.偏差X:在Cy3液滴中心和其网格单元中心之间的X坐标距离。
ii.偏差Y:在Cy3液滴中心和其网格单元中心之间的Y坐标距离。
对于所有Cy3液滴求偏差之和，利用取值=(abs(偏差X)+abs(偏差Y))。较低取值意味着更好的网格安放。
c.对于如下表所示的总共24种组合重复8A-8C。
d.
e.选择网格中心，从而其值最低。
9.对于每个点计算QC数据。
a.偏差X:液滴中心X坐标减去网格中心X坐标。
b.偏差Y:液滴中心Y坐标减去网格单元中心Y坐标。
c.拒绝标记：基于直径、椭圆度等拒绝点。
d.点密度
e.直径
10.参见表3，将QC数据写为文本文件。
表3示例性阵列QC数据
网格行 网格列 点类型 拒绝? 网格中心X 网格中心Y 偏差X 偏差Y 点密度 直径
1 1 Cy3 错 105 88 3 1 2143818 8.85
1 2 空 错 135 88 0 0 261 0.00
1 3 空 错 166 88 0 0 568 0.00
1 4 空 错 196 88 0 0 -87 0.00
1 5 空 错 226 88 0 0 228 0.00
1 6 Cy3 错 257 88 0 3 1612600 9.72
1 7 Cy3 错 287 88 1 3 1567664 9.02
1 8 空 错 318 88 0 0 506 0.00
1 9 空 错 348 88 0 0 1426 0.00
1 10 空 错 378 88 0 0 3420 0.00
1 11 空 错 409 88 0 0 991 0.00
1 12 Cy3 错 439 88 -1 3 2216029 9.65
2 1 空 错 105 119 0 0 -319 0.00
2 2 空 错 135 119 0 0 334 0.00
2 3 取样31 错 166 119 5 0 1618379 10.12
2 4 空 错 196 119 0 0 486 0.00
2 5 空 错 226 119 0 0 83 0.00
2 6 H 错 257 119 -1 -1 1750396 8.99
2 7 空 错 287 119 0 0 40709 0.00
2 8 空 错 318 119 0 0 -162 0.00
2 9 取样31 错 348 119 0 3 2061064 10.61
2 10 空 错 378 119 0 0 127 0.00
2 11 空 错 409 119 0 0 289 0.00
网格行 网格列 点类型 拒绝? 网格中心X 网格中心Y 偏差X 偏差Y 点密度 直径
2 12 H 错 439 119 -1 3 2030635 9.19
3 1 空 错 105 149 0 0 1143 0.00
3 2 取样14 错 135 149 4 1 2222565 9.43
3 3 取样35 错 166 149 2 1 2088478 9.16
3 4 空 错 196 149 0 0 3938 0.00
3 5 空 错 226 149 0 0 -96 0.00
3 6 空 错 257 149 0 0 -33 0.00
3 7 空 错 287 149 0 0 582 0.00
3 8 取样14 错 318 149 0 1 2073261 9.90
3 9 取样35 错 348 149 2 1 1651170 8.86
3 10 空 错 378 149 0 0 837 0.00
3 11 空 错 409 149 0 0 370 0.00
3 12 空 错 439 149 0 0 315 0.00
4 1 空 错 105 180 0 0 162 0.00
4 2 空 错 135 180 0 0 -179 0.00
4 3 取样36 错 166 180 3 2 1782715 8.49
4 4 空 错 196 180 0 0 633 0.00
4 5 取样29 错 226 180 3 0 1715205 9.51
4 6 空 错 257 180 0 0 274 0.00
4 7 空 错 287 180 0 0 242 0.00
4 8 空 错 318 180 0 0 329 0.00
4 9 取样36 错 348 180 -1 -1 1666545 9.66
4 10 空 错 378 180 0 0 12157 0.00
4 11 取样29 错 409 180 -1 1 1706590 10.47
4 12 空 错 439 180 0 0 1180 0.00
5 1 空 错 105 210 0 0 308 0.00
5 2 空 错 135 210 0 0 180 0.00
网格行 网格列 点类型 拒绝? 网格中心X 网格中心Y 偏差X 偏差Y点密度 直径
5 3 取样37 错 166 210 2 11537455 9.70
5 4 dN20 错 196 210 1 01854849 10.35
5 5 空 错 226 210 0 0486 0.00
5 6 取样90 错 257 210 2 11697651 9.01
5 7 空 错 287 210 0 0-115 0.00
5 8 空 错 318 210 0 0-382 0.00
5 9 取样37 错 348 210 1 22009715 9.84
5 10 dN20 错 378 210 0 12187695 10.80
5 11 空 错 409 210 0 01099 0.00
5 12 取样90 错 439 210 0 02007504 10.03
6 1 Cy3 错 105 240 5 01264671 8.35
6 2 空 错 135 240 0 0-203 0.00
6 3 空 错 166 240 0 0476 0.00
6 4 空 错 196 240 0 0214 0.00
6 5 空 错 226 240 0 0695 0.00
6 6 空 错 257 240 0 0218 0.00
6 7 Cy3 错 287 240 1 31125959 9.57
6 8 空 错 318 240 0 0107 0.00
6 9 空 错 348 240 0 0874 0.00
6 10 空 错 378 240 0 0617 0.00
6 11 空 错 409 240 0 0528 0.00
6 12 空 错 439 240 0 0580 0.00
7 1 Cy3 错 105 271 1 -11734877 9.71
7 2 空 错 135 271 0 0-634 0.00
7 3 空 错 166 271 0 0-69 0.00
7 4 空 错 196 271 0 0276 0.00
7 5 空 错 226 271 0 0-199 0.00
网格行 网格列 点类型 拒绝? 网格中心X 网格中心Y 偏差X 偏差Y 点密度 直径
7 6 Cy3 错 257 271 0 -2 1581737 10.49
7 7 Cy3 错 287 271 0 0 1522026 9.37
7 8 空 错 318 271 0 0 -748 0.00
7 9 空 错 348 271 0 0 2635 0.00
7 10 空 错 378 271 0 0 747 0.00
7 11 空 错 409 271 0 0 246 0.00
7 12 Cy3 错 439 271 -1 0 1640104 10.37
8 1 空 错 105 301 0 0 586 0.00
8 2 空 错 135 301 0 0 439 0.00
8 3 取样31 错 166 301 1 -1 2008843 10.06
8 4 空 错 196 301 0 0 247 0.00
8 5 空 错 226 301 0 0 319 0.00
8 6 H 错 257 301 -1 0 1534132 10.46
8 7 空 错 287 301 0 0 -477 0.00
8 8 空 错 318 301 0 0 13815 0.00
8 9 取样31 错 348 301 -1 -1 1704828 10.04
8 10 空 错 378 301 0 0 260 0.00
8 11 空 错 409 301 0 0 2993 0.00
8 12 H 错 439 301 0 2 1569671 9.96
9 1 空 错 105 332 0 0 148 0.00
9 2 取样14 错 135 332 2 -3 1969286 9.77
9 3 取样35 错 166 332 3 -1 1636381 9.53
9 4 空 错 196 332 0 0 792 0.00
9 5 空 错 226 332 0 0 -377 0.00
9 6 空 错 257 332 0 0 594 0.00
9 7 空 错 287 332 0 0 570 0.00
9 8 取样14 错 318 332 1 -3 1812677 10.36
网格行 网格列 点类型 拒绝? 网格中心X 网格中心Y 偏差X 偏差Y 点密度 直径
9 9 取样35 错 348 332 0 -2 1881764 9.97
9 10 空 错 378 332 0 0 444 0.00
9 11 空 错 409 332 0 0 -423 0.00
9 12 空 错 439 332 0 0 287 0.00
10 1 空 错 105 362 0 0 426 0.00
10 2 空 错 135 362 0 0 -23 0.00
10 3 取样36 错 166 362 1 -4 1582212 9.85
10 4 空 错 196 362 0 0 1518 0.00
10 5 取样29 错 226 362 1 -1 1629291 11.09
10 6 空 错 257 362 0 0 4511 0.00
10 7 空 错 287 362 0 0 201 0.00
10 8 空 错 318 362 0 0 -397 0.00
10 9 取样36 错 348 362 -1 1 1683589 9.69
10 10 空 错 378 362 0 0 75 0.00
10 11 取样29 错 409 362 0 1 1763951 10.31
10 12 空 错 439 362 0 0 607 0.00
11 1 空 错 105 392 0 0 -321 0.00
11 2 空 错 135 392 0 0 437 0.00
11 3 取样37 错 166 392 0 -4 1782130 9.95
11 4 dN20 错 196 392 3 -2 1886735 10.28
11 5 空 错 226 392 0 0 293 0.00
11 6 取样90 错 257 392 0 -4 1569567 10.77
11 7 空 错 287 392 0 0 1805 0.00
11 8 空 错 318 392 0 0 -262 0.00
11 9 取样37 错 348 392 -1 -3 1872819 9.83
11 10 dN20 错 378 392 1 -4 2034194 10.21
11 11 空 错 409 392 0 0 -258 0.00
网格行 网格列 点类型 拒绝? 网格中心X 网格中心Y 偏差X 偏差Y 点密度 直径
11 12 取样90 错 439 392 0 0 1693534 10.95
12 1 Cy3 错 105 423 3 -1 1658433 8.06
12 2 空 错 135 423 0 0 521 0.00
12 3 空 错 166 423 0 0 285 0.00
12 4 空 错 196 423 0 0 -447 0.00
12 5 空 错 226 423 0 0 -436 0.00
12 6 空 错 257 423 0 0 -129 0.00
12 7 Cy3 错 287 423 1 0 1392853 8.72
12 8 空 错 318 423 0 0 257 0.00
12 9 空 错 348 423 0 0 649 0.00
12 10 空 错 378 423 0 0 -108 0.00
12 11 空 错 409 423 0 0 64 0.00
12 12 空 错 439 423 0 0 -84 0.00
算法2
此过程拍摄杂化后阵列的两张张片：一张用正常曝光(图像_正常曝光)，一张用高度曝光以凸现Cy3标(图像_高度曝光)。
1.将图像_高度曝光和图像_正常曝光读入存储装置。
2.从QC文本文件中读取。
3.在图像_高度曝光图像上操作以找到网格。
a.拍摄Cy5_高度曝光图像，进行数字过滤和像素演算以产生具有均匀的零值背景的图像。
b.将该图像开始转入到二进制图像。
c.基于尺寸对识别的过滤物体的二进制图像进行颗粒分析。物体的测量和记录参数：质量中心，边界框，颗粒面积和椭圆度。
d.查看在步骤3C中识别的物体的数量是否满足最低要求，如果不满足则拒绝该载片。
e.与算法1中的步骤6相似，寻找网格。
f.旋转该图像，从而由Cy3液滴形成的角度小于自水平轴的0.2度。
g.微调该网格，与算法1中的步骤8相似。
4.将在图像_高度曝光中发现的网格用到图像_正常曝光中。
5.利用来自QC文件的X偏差、Y偏差、直径和拒绝标，确定相关的点参数。
a.如果拒绝标是真的，则从分析中排除该点。
b.点X坐标：X坐标，网格中心+X偏差。
c.点X坐标：Y坐标，网格中心+Y偏差。
d.点径：来自QC数据的点径。
6.计算点密度和背景。
7.进行最后计算以确定分析结果。
例4
利用含抗体的凝胶液滴元件构成蛋白质微阵列组件。打印有凝胶元件微阵列的玻璃载片载室温下用含1%的BSA的PBS封住1小时。载片用DI水清洗并允许在无尘环境中空气干燥。微阵列组件随后与所封住的玻璃载片组合，激光切割来自Adchem的256M带即亲水性膜和储槽。约0.5mL的SEB(1μg/mL在含0.05%Tween-20和1%的BSA的PBS中)被滴定到微阵列系统储槽，并且在室温下经阵列腔连续吸入。接着，在含1%BSA的PBST中的0.2mL的抗SEB单克隆抗体稀释液被滴定入微阵列系统的储槽，其经阵列腔连续吸入至废样腔。接着，0.2mL的PBST被滴定入微阵列系统的储槽，其经阵列腔连续吸入至废样腔的吸收材料。随后，0.1mL的Alexa568标记抗鼠抗体以在含1%BSA的PBST中的2μg/mL被滴定入微阵列系统的储槽，其经阵列腔连续吸入至废样腔的吸收材料。附加的0.2mL的PBST洗剂被滴定入微阵列系统的储槽中，其经阵列腔连续吸入至废样腔的吸收材料。微阵列系统随后用具有605nm滤光器的绿色激光器(532nm)在Aurora PortArray5000上被成像。
例5
寡核苷酸混合物根据图9所示的阵列图被合成用于MRSA。每个取样沿内部控制取样Cy5被合成。与相同的寡核苷酸序列相关的附加Cy3控制取样也与Cy5控制取样混合。Cy3/Cy5点按照在1log浓度变化中的0.1nM至10μM的密度被打印，以便建立校准曲线。成像系统由两个光学元件系列组成。这两个光学元件系列由LED和非冷却式CCD摄像机构成。一个光学元件系列用于探测Cy3点(550nm激励和570nm发光)，另一光学元件系列用于探测Cy5点(650nm激励和670nm发光)。这些光学元件系列相对于仪器的空间位置固定。移动台架移动阵列至绿波道并且获取10个图像来改善动态范围；短曝光时间的多图像需求阻止可能因使用含高自动荧光的材料而出现的饱和，同时也允许信号平均以减轻无序噪声效果。台架移动该阵列至红波道并且获取10个图像。该过程重复5次以负责可能有的因定位精度、错误曝光时间、失焦和/或可能折中正确成像的任何其它异常造成的失准。关于Cy3/Cy5系列浓度稀释，画出校准曲线，如在以下的组合图中用阵列外边界表示的那样。从浓度梯度得到的校准曲线是要修正影响整个组件的因素如取样搁置降级、温度、UV剂量变化、合成变化或者可能导致不可重现行为的任何系统人工制品。Cy5的校准曲线是在利用Cy3校准曲线分析时画出的。
Ired＝mred×moles(Cy5)+bred
Igreen＝mgreen×moles(Cy3)+bgreen
其中，Ired和Igreen是消除背景的综合强度。斜率mred和mgreen和坐标bred和bgreen从这些校准曲线算出。校准曲线的平均值被绘出，拒绝范围外的值。为了负责点之间、组件之间以及批之间的重现性，针对每个点算出Cy5除背景综合强度值。在合成过程中，对于每个点，每个点的取样(14,31,35,36,37,29,90,H或dN20)浓度具有等摩尔浓度的寡核苷酸取样和Cy5荧光基团。于是，以下关系成立：
Cy3浓度≈Cy5浓度
因此，
Igreen，saturation≈mgreen×moles(Cy5)+bgreen
其中，Igreen,saturation表示假定情况，此时凝胶元件中的所有取样被结合至标记的Cy3分子。注意，摩尔(Cy5)取代摩尔(Cy3)，因为以上等式中的等摩尔当量。在代表性的点测量并计算用于确定MRSA存在的这些点的取样的背景修正综合强度。如果该强度满足以下标准：
I green , meas I green , saturation > 0.001
则该值被认为为正。即，多于0.1%的可能有的取样分子具有与Cy3标签的结合靶。该方法也可以被用于定量说明。
例6
针对衬带卷轴制造轻触裁切条带卷轴，其包含裁切的衬膜，在覆带卷轴上预冲切出入口填孔和排气填孔。如图5所示，在制造中，底膜卷轴展开，放出的衬材被集中在上卷轴上。凝胶元件打印机在基膜上打印凝胶元件。膜随后在惰性气氛(如氩气)下受UV照射。氩气正压被缓慢加入氩气室，因为其密度大于空气，故氩气沉淀至基材所处的室底。这允许氩气缓慢流入腔室，于是对室内构成空气有最低要求。为了保证未聚合化的聚合物留在基材上，基材移动经过如此就位的清洗站，即能消除溅入聚合腔室。经过清洗的阵列用传统的气刀组件被干燥。QC摄像机保证这些元件按照规范被打印，拒绝打标机警告操作者除去不合规定的组件。限定出微阵列腔的双面衬带被解开并粘附到基材上。衬带中的开孔设计用于允许在衬带层压至基材时的相对宽松的误差，其容许制造出具有可变形状和复杂性的凝胶元件阵列，而无需改动组合线。可卷绕的吸收材料被打开并安装至组件的废样腔，它在这里用胶或双面胶带被密封就位。一种加入吸收材料的替代做法是利用拾取-置放机器人将吸收材料插入废样腔。当前的流动单元设计利用附加衬层容纳厚度是反应室两倍的吸收材料。最后，施加具有许多填充孔的覆膜。填充孔可以明显大于或小于衬膜中的孔，允许对准时的粗略误差。闸刀随后将带切成合适尺寸。
针打印机器人一般具有打印头，打印头流行具备精确机加工的针。打印头被连接至精确的xyz轴控制臂(图7)。控制臂负责以微米级精度在打印溶液源板(如384井微量滴定板)、基材打印站(印版)和清洗站(用于在独特溶液沉积之间的清洗针)之间移动打印头。或者，高产量非接触打印头将多个溶液同时沉积在微阵列-PCR反应腔室内。
在某些实施例中，整个微阵列被一次打印上。放电加工(EDM)可被用于制造具有125微米针和目前所用的300微米中心的打印头(目前所用的针直径)。而且，并行合成设计提供24576井板，其井具有560微米中心。这换算为约350个点/平米厘米。虽然这么多的点足以充分用于大多故障诊断应用，但需要附加点的试验可以利用在组合线上依次布置多个打印机来完成，打印时间只延长了从一台打印机到下一台打印机的移动时间。在移动膜上打印的另一个实施例包括使用非接触打印机，其采用压电晶体和毛细管作用，其吸入微阵列打印溶液并且将皮升液体分散为纳升液滴至基材上。打印头可以包括多个毛细管用于同时打印一系列包含独立取样的独特微阵列点。而且，该打印头可以是高密度毛细管阵列用于增加独特微阵列点的数量。或者，打印头可以上下左右交叉扫描该底膜以打印复制点，或者打印头扫描法可被用来吸入单独的聚合物-取样悬浮液以便用相同的打印头打印多个独立点。另一个选项是在第一次打印过程后将底膜重装到卷带倒卷系统上，以再次针对每个微阵列在基膜卷上打印附加(独立)点。该复制做法可以包括基准以在第二、第三和第n次打印时正确对准该膜。相关基准的一个例子是使用穿孔边缘，例如与35毫米膜连用的穿孔边缘。另一个打印选项包括来自Labcyte的声音喷射非接触法，其中高频声波从源板喷射纳升液滴至目标板。
例7
图8示出了在0.005"聚酯膜上打印Cy3凝胶元件的结果，该聚酯膜以膜卷规格购自McMaster-Carr(Santa Fe Springs,CA)。该膜被置于如图9所示的真空夹盘中并被打印。它在聚合化之前和之后利用亮长照明被成像。该阵列也利用Akonni成像仪被成像，该成像仪由LED和非冷却式摄像机构成。在打印之后，上述MRSA阵列被打印到聚酯膜上并且利用300pg的纯化MRSADNA遇到Qiagen MasterMix。在Quanta Bioscience载片块热循环控制仪上进行热循环。图10示出了当可卷绕的膜被用于顶面、底面以及衬带时的结果，该图示出了MRSA的确定识别。图11示出了卷带倒卷打印设定，利用了BioDot超非接触阵列打印机(顶板)和利用在移动膜上的BioDot Ultra的非接触打印的视频帧，该膜尚未被化学处理和改性(底板)。这些结果显示利用非接触阵列打印机在移动膜上打印微阵列的可行性，该打印机容许高速低成本地制造本发明的微阵列组件。
例8
图12-14示出了阵列图像分析过程。图12是在工厂QC用红色通道成像仪拍摄以抽取阵列QC数据的阵列图像。QC软件算法自动找寻阵列中的每个点并且将每个点分配给在阵列网格中的其各自位置。该软件显示12×12方形网格并且围绕每个点画圆。QC软件计算在其边界方形网格框中的每个圆的相对位置(偏差X，偏差Y)并且作为QC数据的一部分存储该信息以帮助杂化后图像分析。
图13是在杂化后利用最终用户绿波道成像仪拍摄的阵列图像。图像分析软件基于Cy3荧光标定位阵列网格并且画出12×12方形网格。图像分析随后利用相对点位置(来自阵列QC文件的偏差X和偏差Y)来定位每个点并且围绕点画圆以便视觉辨识。注意，在阵列QC数据帮助下，该软件能够定位这列上的每个点并且画出完全围绕每个点的圆。
图14是在杂化后用最终用户绿波道成像仪器拍摄的阵列图像。该图像分析软件基于Cy3荧光标定位阵列网格并且画出12×12方形网格。对于此图像，图像分析软件没有从阵列QC文件中获得关于相对点位置的信息。相反，图像分析软件在假定每个方形网格单元的中心是该点中心的情况下识别每个点。该软件因画出一些没有完全围绕该点的圆而错误识别几个点。错误识别的点包括位于第2行第2列和第11行第6列的点。注意，这种没有阵列QC数据的图像分析法在点识别方面与利用如图13所示的阵列QC数据的图像分析相比不太健全。

Claims (12)

1.一种制造微阵列组件的方法，其包括：
由一个或多个底膜卷轴退绕展开底膜；
将微阵列打印到退绕展开的底膜上；
将衬膜层压在打印后的底膜上，其中，该衬膜在安放步骤之前被预裁切以提供用于阵列腔的空间，并且该衬膜是通过一个或多个衬膜卷轴被安放到该打印后的底膜上的；
将覆膜层压在该衬膜上以形成多层微阵列结构；和
将多层微阵列结构裁切成多个单独的微阵列组件。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，该衬膜被预裁切以提供用于一个或多个废样腔的空间。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，该衬膜被预裁切以提供用于一个或多个阵列腔的空间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，该打印步骤是在生产线上在移动的底膜上进行的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，该底膜是疏水性膜，并且该覆膜是亲水性膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，该底膜的厚度在20-200微米范围内。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，该覆膜的厚度在25-250微米范围内。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，该衬膜的厚度在20-500微米范围内。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，该底膜的表面具有双键碳原子。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，该衬膜由疏水性材料制成。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，该微阵列是用非接触式微阵列打印机打印到底膜上的凝胶点微阵列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，该凝胶点微阵列包括蛋白质取样或核苷酸取样，其通过紫外线致共聚被共价交联至聚合物主链。
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EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20140312

Assignee: Shanghai Ruian Gene Technology Co., Ltd.

Assignor: Akonni Biosystems

Contract record no.: 2019990000134

Denomination of invention: Microarray based sample detection system

Granted publication date: 20151021

License type: Exclusive License

Record date: 20190429

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