CN106456797A - 聚合物‑类黄酮缀合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了聚合物‑类黄酮缀合物或其药学上可接受的盐、其用途和其制备方法。所公开的聚合物‑类黄酮缀合物可用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况。

Description

聚合物-类黄酮缀合物及其用途
技术领域
本发明大体上涉及聚合物-类黄酮缀合物、其用途和制备方法。所述聚合物-类黄酮缀合物可用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况。
背景技术
骨关节炎是一种常见的退行性关节疾病，它影响全世界数百万人，特别是在老龄群体中。骨关节炎的症状包括软骨损伤、软骨下骨硬化、骨赘形成和滑膜炎症。这些症状随时间而恶化，造成受影响的关节的疼痛和失能。因此，骨关节炎显著影响患者的生活质量。骨关节炎的发病机理是复杂的，并且未被完全理解。应当认识到，关节上的机械应力可以导致软骨随时间而退化(磨损和撕裂)。遗传因素是骨关节炎发病机理的部分原因，因为软骨的内在质量和关节的解剖结构可以以更易于损伤的方式发育。炎症也参与骨关节炎发展。在骨关节炎软骨、滑液、滑膜和软骨下骨中促炎性细胞因子如白细胞介素-113(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)升高。这些细胞因子抑制软骨细胞外基质(ECM)的合成并增加降解软骨中II型胶原的基质金属蛋白酶(MMP)的产生。滑膜的炎症或滑膜炎导致分泌更多的促炎性细胞因子的炎性细胞的浸润，从而通过进一步增加MMP的产生而加重患病状况。目前没有治愈骨关节炎的方法。现有的治疗目的在于通过非药理学和/或药理学方式缓解疼痛并改进关节功能。如果患者未从非药物治疗和药物治疗的组合中获益，则可以考虑关节置换手术。
近年来，类黄酮已经引起了很多关注，因为已认识到它们具有生物学和药理学性质。然而，类黄酮的活性半衰期在体内限于几小时。因此，尽管类黄酮具有有利的性质，但由于固有的体积约束，因此通过直接大量摄取来实现该化合物在体内的治疗水平是不切实际的。也就是说，为了通过单独的饮食从类黄酮获得治疗或药理学益处，将需要摄取大于实际消耗量的大量的食物和饮料。
在通过口服摄入食物和饮料消耗类黄酮的情况下，类黄酮可以起到作为抗氧化剂的作用，以保护消化道在消化期间免受氧化性损伤。然而，可以预期类黄酮仅保留在消化道中，因此它们有益的生理活性不可能在组织中被利用。此外，它们的强疏水性以及它们与蛋白质形成复合物的倾向使得难以在肠胃外递送这些化合物。
因此，需要提供克服或至少改善上述一种或多种病况的治疗。
发明内容
本公开提供了可用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况的聚合物-类黄酮缀合物。本公开进一步提供了用于形成所述聚合物-类黄酮缀合物的方法。
根据本公开的第一方面，提供了聚合物-类黄酮缀合物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况的药物中的用途。
在本公开的第二方面，提供了用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况的聚合物-类黄酮缀合物或其药学上可接受的盐。
在本公开的第三方面，提供了治疗或预防关节病况的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的聚合物-类黄酮缀合物。
有利地，第一到第三方面的所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以用于治疗骨关节炎。第一方面的所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以有利地改善关节功能并减少疼痛。
进一步有利地，第一到第三方面的所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以恢复软骨缺陷，从而修复软骨。
有利地，使用第一到第三方面的所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以潜在地增强类黄酮的治疗结果。进一步有利地，注射第一到第三方面的所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以克服类黄酮在口服施用时的低生物利用度。进一步有利地，注射第一到第三方面的所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以以低频率进行。
在本公开的第四方面，提供了用于形成聚合物-类黄酮缀合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使含有胺的化合物与一种或多种类黄酮连接，从而形成带有游离胺基的类黄酮；和
(b)通过亲核加成使(a)的产物与聚合物缀合。
有利地，第四方面的所公开的方法可以允许聚合物通过高效且有成本效益的方法与类黄酮缀合。
定义
本文所用的以下词语和术语应当具有所指示的含义：
如本文所用的术语“关节病况”是指涉及调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和/或基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达的病况。例如，术语“关节病况”是指与受试者的关节和结缔组织相关的病况，并且可以包括例如关节炎、软骨损伤、关节疼痛、关节炎症、系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、软骨下骨硬化、滑膜炎症和骨赘形成的病况。
如本文所用的术语“关节炎”是指例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、幼年型关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎。
如本文所用的术语“关节疼痛”包括例如骨关节炎性关节疼痛、类风湿性关节炎性关节疼痛、炎性关节疼痛、急性关节疼痛和慢性关节疼痛。
如本文所用的术语“关节炎症”包括例如关节炎性关节炎症、骨关节炎性关节炎性关节炎症和类风湿性关节炎性关节炎症。
如本文所用的术语“软骨损伤”包括例如骨关节炎性关节或类风湿性关节炎性关节中的损伤。
如本文所用的术语“软骨修复”包括例如软骨损伤、撕裂、畸形或缺陷的愈合和再生、以及在预防对软骨组织的损伤中的预防性用途。软骨损伤可以在关节内。
如本文所用的术语“酰胺基”是指式“-C(O)NRxRy”的基团，其中Rx和Ry可以独立地为氢、烷基、芳基、环烷基、环烯基或杂环。
如本文所用的术语“酰氨基”是指式“-C(O)NRx-”的基团，其中Rx可以是氢、烷基、芳基、环烷基、环烯基或杂环。酰氨基可以通过羰基或氨基连接到母体分子部分。
如本文所用的术语“受试者”是指人和非人动物。
如本文所用的术语“接头”是指可以连接聚合物和类黄酮的任何化学基团，并且包括例如包含一个或多个各种原子基团的分子，所述原子基团包括任选取代的杂烷基、亚甲基(-CH2-)、直链亚烷基、支链亚烷基、芳基、杂芳基、脂环基、聚亚烷基二醇基团(如环氧乙烷基团；-O-CH2-CH2-)、酰胺基(-CONH-)、胺基(-NH-)、酰胺基(-NHC(O)-或-C(O)NH-)、醚基(-O-)、氨基甲酸酯基、缩醛基、酰氨基酯基、烯基和其组合。如本文所用的术语“硫醇接头”是指包含一个或多个硫醇基(-SH)的分子，所述一个或多个硫醇基通过一个或多个连接原子共价接合。硫醇连接的硫醇基可以通过一个或多个各种原子基团接合，所述原子基团包括亚甲基(-CH2-)、直链亚烷基、支链亚烷基、芳基、杂芳基、脂环基、聚亚烷基二醇基团(如环氧乙烷基团；-O-CH2-CH2-)、酰胺基(-CONH-)、胺基(-NH-)、酰胺基(-NHC(O)-或-C(O)NH-)、醚基(-O-)、氨基甲酸酯基、缩醛基、酰氨基酯基、烯基和其组合。
如本文所用的术语“含有胺的化合物”是指含有一个或多个胺基(-NR2，其中R可以独立地为氢、烷基、芳基、环烷基、环烯基或杂环)的化合物。
如本文所用的术语“杂烷基”是指被一个或多个可以相同或不同的杂原子取代的如上所定义的烷基部分，其具有一个或多个碳原子，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个碳原子，其中与分子其余部分的连接点通过所述杂烷基的碳原子或杂原子。合适的杂原子包括O、S和N。非限制性示例包括醚基、硫醚基、胺基、羟甲基、3-羟丙基、1,2-二羟乙基、2-甲氧基乙基、2-氨基乙基、2-二甲基氨基乙基等。杂烷基可以任选被取代。
本文所用的术语“任选被取代”意指该术语所指代的基团可以未被取代，或者可以被一个或多个除氢以外的基团取代，条件是不超过所示原子的正常化合价，并且所述取代产生稳定的化合物。此类基团可以是例如卤素、羟基、氧代、氰基、硝基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基4-烷氧基、烷硫基、羟烷基、烷氧基烷基、环烷基、环烷基烷氧基、烷酰基、烷氧基羰基、烷基磺酰基、烷基磺酰氧基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基、芳基磺酰氧基、芳基磺酰基烷基、烷基磺酰氨基、烷基酰氨基、烷基磺酰氨基烷基、烷基酰氨基烷基、芳基磺酰氨基、芳基羧酰氨基、芳基磺酰氨基烷基、芳基羧酰氨基烷基、芳酰基、芳酰基4烷基、芳基烷酰基、酰基、芳基、芳基烷基、烷基氨基烷基、基团RxRyN-、RxOCO(CH2)m、RxCON(Ry)(CH2)m、RxRyNCO(CH2)m、RxRyNSO2(CH2)m或RxSO2NRy(CH2)m(其中Rx和Ry中的每一个独立地选自氢或烷基，或者在适当时，RxRy形成碳环或杂环的一部分，并且m是0、1、2、3或4)、基团RxRyN(CH2)p-或RxRyN(CH2)pO-(其中p是1、2、3或4)；其中当取代基是RxRyN(CH2)p-或RxRyN(CH2)pO时，Rx与该基团的(CH2)p部分的至少一个CH2也可以形成碳环基或杂环基，并且Ry可以是氢、烷基。
词语“基本上”并不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在需要的情况下，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。
除非另有说明，否则术语“包含”和“包括”和其语法变体意在表示“开放”或“包含性”用语，使得它们包括列举的要素，而且还允许包括额外的、未提及的要素。
如本文所用的术语“约”在制剂的组分的浓度的背景下，通常意指所述值的+/-5％，更通常所述值的+/-4％，更通常所述值的+/-3％，更通常所述值的+/-2％，甚至更通常所述值的+/-1％，且甚至更通常所述值的+/-0.5％。
在本公开通篇内，某些实施方案可以范围形式公开。应当理解，以范围形式描述仅仅是为了方便和简洁且不应当被解释为对所公开范围的范畴的不可改变的限制。因此，应当认为对一个范围的描述已经具体地公开了所述范围内的所有可能的子范围以及单个数值。例如，应当认为对如1到6的范围的描述已经公开了如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等的子范围以及所述范围内的如1、2、3、4、5和6的单个数字。不管所述范围的宽度如何，这都是适用的。不管所述范围的宽度如何，这都是适用的。
在本文中也可以宽泛地和一般地描述某些实施方案。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和子类群也构成本公开的一部分。这包括具有从该种类中去除任何主题的附带条件或负面限制的实施方案的一般性描述，而不管所去除的材料是否在本文中明确述及。
实施方案的详细公开
现在将公开所公开的聚合物-类黄酮缀合物、其用途和制备方法的示例性的非限制性实施方案。
本公开提供了可用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况的聚合物-类黄酮缀合物。本公开进一步提供了用于形成所述聚合物-类黄酮缀合物的方法。
在一个方面，提供了聚合物-类黄酮缀合物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况的药物中的用途。
在另一方面，提供了用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况的聚合物-类黄酮缀合物或其药学上可接受的盐。
在又一方面，提供了治疗或预防关节病况的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的聚合物-类黄酮缀合物。
关节病况可以选自由以下各项组成的组：关节炎、软骨损伤、关节疼痛、关节炎症、系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、软骨下骨硬化、滑膜炎症和骨赘形成。
关节炎可以选自由以下各项组成的组：骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、幼年型关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎。
关节病况的治疗性和/或预防性治疗可以导致软骨修复。
所公开的聚合物-类黄酮缀合物可用于治疗或预防受试者的关节病况的方法中。
聚合物
所述聚合物可以含有游离醛或可以在酸的存在下转化为游离醛的基团，通过所述聚合物经由所述游离醛基与所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位的反应而形成的连接使所述聚合物在所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位缀合。
所述聚合物可以选自由以下各项组成的组：多糖、多核苷酸、多肽、合成的聚合物和其混合物。
所述多糖可以选自由以下各项组成的组：透明质酸(HA)、葡聚糖、纤维素、直链淀粉、淀粉、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、环糊精、硫酸葡聚糖、Ficoll、结冷胶、瓜尔胶、果胶、聚蔗糖、普鲁兰多糖、硬葡聚糖、黄原胶和木葡聚糖。
多糖可以与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。多糖可以与一种表没食子儿茶素没食子酸酯或两种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
多糖可以通过硫醇接头与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
多糖可以在所述表没食子儿茶素没食子酸酯的A环的C6位和/或C8位与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
多核苷酸可以选自由以下各项组成的组：适体、DNA、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA、肽核酸(PNA)和小发夹RNA(shRNA)。
多肽可以选自由以下各项组成的组：蛋白质、抗体、抗体片段、Aptide、肽和聚(氨基酸)。
合成的聚合物可以包含选自由以下各项组成的组的单体：烯烃、醚、羧酸、亚胺、酰胺、胺、酐、碳酸酯、酯、原酸酯和氨基甲酸乙酯。
合成的聚合物可以选自由以下各项组成的组：聚(丙烯酰胺)、聚(烯丙基胺)、聚酐、聚(β-氨基酯)、聚(琥珀酸丁二酯)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚二烷酮、聚乙烯亚胺、聚(甘油)、聚乙醇酸、聚(3-羟基丙酸)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(原酸酯)、聚(2-唑啉)、聚(癸二酸)、聚(对苯二甲酸磷酸酯)共聚物、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和其组合。
类黄酮
类黄酮可以是来自衍生自核心苯基苄基吡喃酮结构的一般类别的分子的任何类黄酮。类黄酮的A、B和C环的简化描述如下所示：
术语“类黄酮”意在包括黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷-3-醇、儿茶素、花色素和查耳酮。在一个具体的实施方案中，类黄酮是儿茶素或基于儿茶素的类黄酮。儿茶素或基于儿茶素的类黄酮是属于通常称为儿茶素(或黄烷-3-醇衍生物)的类别的任何类黄酮，且包括儿茶素和儿茶素衍生物，包括表儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯，并且包括儿茶素或基于儿茶素的类黄酮的所有可能的立体异构体。在具体的实施方案中，基于儿茶素的类黄酮是(+)-儿茶素或(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯。所公开的聚合物-类黄酮缀合物的类黄酮可以选自由以下各项组成的组：黄酮、异黄酮、黄烷、原花色素和花色素。
类黄酮可以选自由以下各项组成的组：(-)-表儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、非瑟酮醇、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、牧豆树醇(Mesquitol)和刺槐亭醇、鞣花单宁、没食子单宁、乌龙茶氨酸(oolongtheanin)、褐藻单宁(phlorotannin)、单宁、茶柠檬素(theacitrin)、茶二苯并托酚酮(theadibenzotropolone)、茶黄素、茶萘醌(theanaphthoquinone)、茶红素、聚酯型儿茶素(theasinensin)和其混合物。
类黄酮可以是类黄酮的单一单体单元，或者它可以是一种或多种类黄酮的二聚体或低聚体。类黄酮的低聚体可以是2个或更多个连接在一起的单体单元。
在一个实施方案中，类黄酮可以是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)：
聚合物-类黄酮缀合物
至少一种类黄酮可以键合到所述聚合物。至少两种类黄酮可以结合到所述聚合物。
所述聚合物可以通过接头键合到所述类黄酮。接头可以是可以连接聚合物和类黄酮的任何化学基团。接头可以选自包括以下各项的组：硫醇基、酰胺基、硫醚基、亚胺基、胺基、偶氮基和/或1,2,3-三唑基。接头可以存在于聚合物的任何部分和类黄酮的任何部分之间。接头可存在于聚合物的末端和类黄酮的任何部分之间。
聚合物-类黄酮缀合物的聚合物可以具有与聚合物缀合的一种或多种类黄酮。类黄酮可以选自由单体类黄酮或二聚体类黄酮组成的组。单体类黄酮可以包含一个类黄酮分子。二聚体类黄酮可以包含通过接头连接在一起的两个类黄酮分子。二聚体类黄酮的类黄酮分子之一可以连接到聚合物。二聚体类黄酮的两个类黄酮分子都可以独立地连接到聚合物。当一种类黄酮存在于所述缀合物中时，所述类黄酮可以通过B环键合到所述聚合物。当两种类黄酮存在于所述缀合物中时，所述类黄酮可以通过A环键合到所述聚合物。
聚合物-类黄酮缀合物的聚合物可以在所述类黄酮的A环上与所述类黄酮缀合。聚合物-类黄酮缀合物的聚合物可以在所述类黄酮化合物的A环的C6位和/或C8位与所述类黄酮缀合。
聚合物上的游离醛基可以允许聚合物以受控方式与类黄酮结构的A环的C6或C8位置或两者缀合，从而防止类黄酮结构、特别是类黄酮的B环和C环的断裂，因此保持类黄酮的有益的生物学和药理学性质。
聚合物-类黄酮缀合物的聚合物可以在所述类黄酮的B环上与所述类黄酮缀合。聚合物-类黄酮缀合物的聚合物可以在所述类黄酮化合物的B环的C2位和/或C6位与所述类黄酮缀合。
所述聚合物可以通过硫醇接头与所述类黄酮缀合。
在另一个实施方案中，聚合物-类黄酮缀合物的聚合物通过硫醇接头与所述类黄酮缀合。硫醇接头可以进一步包含与所述聚合物结合的部分，其中所述部分选自由以下各项组成的组：酰胺、胺、烷基、烯基、芳基、酯、碳酸酯、醚、酰氨基、酰氨基酯、氨基甲酸酯和缩醛基。烷基可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碳原子。烯基可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碳原子。芳基可以具有6个、7个、8个、9个或10个碳原子。
硫醇接头可以进一步包含与所述聚合物结合的部分，其中所述部分选自由以下各项组成的组：酰胺、胺、烷基、烯基、芳基、酯、碳酸酯、醚、酰氨基、酰氨基酯、氨基甲酸酯和缩醛基。
所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以为式1：
其中：
每个n独立地为0到50000的整数，包括端值在内；并且每个m独立地为0到50000的整数，包括端值在内，其中n或m中的至少一个不为0。
所述聚合物-类黄酮缀合物可以为式2：
其中：
每个n独立地为0到50000的整数，包括端值在内；并且每个m独立地为0到50000的整数，包括端值在内，其中n或m中的至少一个不为0。
所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以具有0.1％到100％、或0.1％到90％、或0.1％到80％、或0.1％到70％、或0.1％到60％、或0.1％到50％、或0.1％到40％、或0.1％到30％、或0.1％到20％、或0.1％到10％、或10％到100％、或20％到100％、或30％到100％、或40％到100％、或50％到100、或60％到100％、或70％到100％、或80％到100％、或90％到100％、或0.1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的缀合度。
所公开的聚合物-类黄酮缀合物可用于治疗关节病况，例如用于治疗骨关节炎。
令人惊讶地发现，与单独的类黄酮相比，在聚合物-类黄酮缀合物的存在下，细胞更有存活力，表明类黄酮与聚合物的缀合降低了类黄酮的毒性。用IL-1β刺激骨关节炎软骨细胞增加了炎性细胞因子和MMP的mRNA和蛋白质表达。表明了尽管类黄酮可以有效抑制IL-1β诱导的基因和蛋白质表达，但聚合物单独或聚合物-类黄酮缀合物未能下调IL-6和TNF-α表达。然而，令人惊讶地发现，尤其是在蛋白质水平下，聚合物-类黄酮缀合物比单独的聚合物更有效地下调MMP-1、MMP-3和MMP-13表达。聚合物-类黄酮缀合物对MMP蛋白质表达的抑制被证明是浓度依赖性的。有利地证明，聚合物-类黄酮缀合物可能是用于治疗骨关节炎的成功治疗剂。
用于形成聚合物-类黄酮缀合物的方法
还提供了用于形成聚合物-类黄酮缀合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使含有胺的化合物与一种或多种类黄酮连接，从而形成带有游离胺基的类黄酮；和
(b)通过亲核加成使(a)的产物与聚合物缀合。
步骤(a)可以包括使含有胺的化合物与两种类黄酮连接，从而形成含有胺的桥接类黄酮二聚体。
步骤(b)可以在偶联剂的存在下进行。
偶联剂可以选自由以下各项组成的组：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、1-乙基-3-(3-二甲基二环己基碳二亚胺(DCC)盐酸盐、二异丙基碳二亚胺(DIC)、羰基二咪唑、二亚胺代己二酸二甲酯、N-羟基琥珀酰亚胺、氯甲酸对硝基苯酯和1-(对甲苯磺酰基)咪唑。
可以利用聚合物的醛基与基于儿茶素的类黄酮的酸催化缩合，或者在醛基与基于儿茶素的类黄酮缩合之前利用酸将聚合物上的官能团转化为游离醛来合成所述缀合物。
为了缀合聚合物和类黄酮，可以将聚合物和类黄酮单独溶解在合适的溶剂中。在酸的存在下，将具有游离醛的聚合物例如通过逐滴添加而添加到含有类黄酮的溶液中。使反应完成。在缀合反应之后，例如通过透析或通过分子筛分离可以从缀合物组合物中去除过量的未反应的聚合物或类黄酮。
类黄酮与聚合物的比例可以变化，使得仅存在一个连接到聚合物的类黄酮部分的聚合物部分，或者使得存在连接在聚合物上的超过一个位置的类黄酮部分，或者使得类黄酮部分具有两个连接的聚合物部分，一个在类黄酮的C6位和C8位中的任一个处。
可以通过起始试剂的比例来控制最终组合物中聚合物与类黄酮的比例。例如，当聚合物部分与类黄酮部分的摩尔比为约1时，单个聚合物部分将连接到单个类黄酮部分(可以使用单体或低聚体)。然而，在更高浓度的聚合物下，例如在聚合物与类黄酮的摩尔比为10:1下，可以获得具有聚合物-类黄酮-聚合物的三嵌段结构的组合物。
递送载体
聚合物的缀合还允许将类黄酮并入各种组合物或载体中。通过基于聚合物的物理性质选择含有游离醛基的特定聚合物，可以将类黄酮并入各种不同的载体类型中，从而允许在不同情况下将高浓度的类黄酮递送到身体的各个目标区域。
因此，取决于缀合物的聚合物部分的性质，可以使本发明所公开的聚合物-类黄酮缀合物形成为递送载体。递送载体可以用于将类黄酮递送到身体，包括身体中的特定目标部位，这取决于递送载体的性质。任选地，生物活性剂可以包括于递送载体中，然后可以被同时递送到体内的部位。因此，提供了包含组合物的递送载体，所述组合物包含通过聚合物上的游离醛基与聚合物缀合的类黄酮，所述递送载体任选地进一步包含生物活性剂。生物活性剂可以是在体内具有生物学、药理学或治疗作用的任何试剂，并且包括蛋白质、核酸、小分子或药物。作为蛋白质的生物活性剂可以是肽、抗体、激素、酶、生长因子或细胞因子。作为核酸的生物活性剂可以是单链或双链DNA或RNA、短发夹RNA、siRNA，或可以包括编码治疗产物的基因。另外，在生物活性剂的范围内所包括的为抗生素、化学治疗剂和抗高血压剂。在一个具体实施方案中，递送载体是胶束纳米复合物，其适于将类黄酮和任选的生物活性剂经肠胃外递送到身体内的特定部位。所述聚合物经选择为具有允许其与组合物的类黄酮部分组装的性质从而保护类黄酮免受溶液环境影响。如果选择缀合物的聚合物部分可溶于其中并且比类黄酮更可溶于其中的合适溶剂，则缀合物可以自组装，排除来自类黄酮核心的溶液，从而允许胶束复合物的组装。
生物活性剂的浓度取决于以下因素来选择：待递送到体内特定部位的生物活性剂的总量，以及可以包含于胶束纳米复合物中而不使胶束结构不稳定的生物活性剂的量。在某些实施方案中，高达50％(重量/重量)、或高达40％(重量/重量)的胶束复合物可以包含生物活性剂。
在另一个特定的实施方案中，递送载体是水凝胶，其可以用作伤口或烧伤敷料，用于生物活性剂的持续释放递送，用作组织再生的支持物，用于治疗关节炎，或用于化妆品应用，如面膜。
聚合物可以具有良好的溶胀性特征和可用于使聚合物部分的交联的以及无毒的和生物相容的并且在一些实施方案中可生物降解的合适基团。
在水凝胶的具体实施方案中，聚合物是醛衍生的透明质酸、或透明质酸的衍生物如透明质酸氨基乙醛二烷基缩醛缀合物、或醛衍生的透明质酸或透明质酸氨基乙醛二烷基缩醛缀合物的酪胺衍生物。氨基乙醛二烷基缩醛缀合物的示例包括例如氨基乙醛二甲基缩醛、氨基乙醛二乙基缩醛缀合物、氨基乙醛二丙基缩醛和氨基乙醛二丁基缩醛。
包含透明质酸-类黄酮的缀合物可以容易地交联以形成水凝胶，而不破坏类黄酮的生物学或药理学性质。此类水凝胶还可以任选地包含如上所述的生物活性剂，用于在施加水凝胶的部位释放生物活性剂。
透明质酸-类黄酮缀合物可以通过使透明质酸与类黄酮在酸性条件下，例如在pH约1反应来合成。然后缀合的聚合物-类黄酮例如通过透析来纯化，然后与生物活性剂和交联剂如过氧化氢混合。添加交联催化剂，例如辣根过氧化物酶，然后可以在交联反应完成之前将水凝胶快速倒入模具中以形成期望的形状。例如，水凝胶可以形成为适合用作伤口敷料的厚片。
水凝胶的组分也可以被注射并反应以在体内形成水凝胶，例如通过注射未交联的缀合物、任选地与生物活性剂、连同交联剂如过氧化氢和交联催化剂例如辣根过氧化物酶。此类水凝胶可用于药物递送到身体中的特定部位，或用于组织工程。
由于透明质酸在缀合反应期间具有多个可以与类黄酮反应的位点，因此通过改变起始反应中类黄酮的浓度，可以改变透明质酸聚合物和类黄酮之间的缀合度。例如，可以调节反应物的比例，使得所得缀合物在与类黄酮缀合的聚合物上具有约1％到约10％的位点。或者，可以在水凝胶交联之前将尚未缀合的另外的透明质酸添加到混合物中，使得水凝胶中的一些聚合物分子将不与类黄酮缀合。
上述组合物和递送载体非常适合于将类黄酮受控和靶向递送到体内特定部位。类黄酮可以在目标部位提供抗细菌活性、抗肿瘤活性、抗血栓形成活性、血管舒张活性、抗氧化活性、抗诱变活性、抗致癌活性、高胆固醇血活性、抗病毒活性和抗炎活性。因此，上述缀合物和递送载体可用于各种治疗应用。另外，递送载体可以包括另外的生物活性剂，使得递送载体可用于治疗大范围的病症或疾病。例如，包括细胞因子和生长因子的免疫调节肽和蛋白质已经作为治疗癌症、骨髓抑制性和感染性疾病的一类重要药物出现。
因此，目前提供了向受试者递送类黄酮的方法，其包括施用含有游离醛的聚合物和类黄酮的缀合物，也预期具有在类黄酮的A环的C6位和/或C8位缀合的聚合物的缀合物，如上所述。在某些实施方案中，使缀合物形成为递送载体，如胶束纳米复合物或水凝胶，如上所述。
可以使用已知方法施用缀合物，所述方法将取决于缀合物的形式。非口服途径是优选的，特别是在生物活性剂与缀合物以相同的形式同时被施用时。如果缀合物配制为溶液或胶束纳米颗粒的形式，则所述缀合物可以胃肠外递送，包括静脉注射、肌肉注射或通过直接注射到靶组织或靶器官中。如果缀合物配制为水凝胶，则可以在伤口部位局部或通过手术插入来施用缀合物。
施用
缀合物可以与生物活性剂组合施用，特别是当缀合物配制为如上所述的递送载体时。
当向患者施用时，以有效量和剂量施用缀合物足够的时间段以实现期望的结果。例如，缀合物可以以递送起如下作用的类黄酮所必需的量和剂量来施用：使感染、疾病或病症缓解、改进、减轻、改善、稳定，防止感染、疾病或病症扩散，减缓或延缓感染、疾病或病症发展或治愈感染、疾病或病症，或抑制、降低或削弱疾病相关酶的活性。疾病相关酶是参与代谢或生物化学途径的酶，当所述途径被中断时或当所述酶或途径的调节控制被中断或抑制时，所述酶的活性参与疾病或病症的发作或发展。
向受试者施用的缀合物的有效量可以取决于许多因素而变化，所述因素例如包括聚合物部分和基于儿茶素的类黄酮部分的缀合物的药效学性质、施用方式、受试者的年龄、健康状况和体重、病症或疾病状态的性质和程度、治疗的频率和同步治疗的类型(如果有的话)以及缀合物的浓度和形式。
本领域技术人员可以基于上述因素确定适当的量。缀合物可以最初以可根据需要调节的合适量施用，这取决于受试者的临床反应。缀合物的有效量可以凭经验确定并且取决于可以安全施用的缀合物的最大量。然而，所施用的缀合物的量应当是产生期望结果的最小量。
附图说明
附图说明了所公开的实施方案并且用于解释所公开的实施方案的原理。然而，应当理解，附图被设计为只用于说明的目的，而不是作为本发明范围的定义。
图1显示了描绘使用人骨关节炎软骨细胞的EGCG和HA-EGCG1缀合物(HA-EGCG1浓度：0.1mg/ml、0.5mg/ml和1.1mg/ml，其分别含有10μM EGCG、50μM EGCG和100μM EGCG)的细胞存活力的图。
图2显示了描绘EGCG、HA(90kDa)和HA-EGCG1缀合物对OA软骨细胞中IL-1β诱导的IL-6和TNF-α表达的作用的图。在IL-1β(5ng/ml)存在下，用EGCG(10μM)、HA(0.1mg/ml和1.1mg/ml)或HA-EGCG1缀合物(0.1mg/ml和1.1mg/ml，分别含有10μM EGCG和100μM EGCG)处理细胞。使用RT-PCR分析基因表达(顶行)，并通过ELISA测量培养基中的蛋白质浓度(底行)。
图3显示了描绘EGCG、HA(90kDa)和HA-EGCG1缀合物对骨关节炎软骨细胞中IL-1β诱导的MMP-1、MMP-3和MMP-13表达的作用的图。在IL-1β(5ng/ml)存在下，用EGCG(10μM)、HA(0.1mg/ml和1.1mg/ml)或HA-EGCG1缀合物(0.1mg/ml和1.1mg/ml，分别含有10μM EGCG和100μM EGCG)处理细胞。使用RT-PCR分析基因表达(顶行)，并通过ELISA测量培养基中的蛋白质浓度(底行)。
图4显示了描绘使用人类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的EGCG和HA-EGCG2缀合物(HA-EGCG2浓度：0.2mg/ml、0.9mg/ml和1.8mg/ml，其分别含有12.5μM EGCG、50μMEGCG和100μM EGCG)的细胞存活力的图。
图5显示了描绘EGCG、HA(800kDa)和HA-EGCG2缀合物对OA软骨细胞中IL-1β诱导的IL-6和TNF-α表达的作用的图。在IL-1β(5ng/ml)存在下，用EGCG(10μM)、HA(0.2mg/ml和2.2mg/ml)或HA-EGCG1缀合物(0.2mg/ml和2.2mg/ml，分别含有10μM EGCG和100μM EGCG)处理细胞。使用RT-PCR分析基因表达(顶行)，并通过ELISA测量培养基中的蛋白质浓度(底行)。
图6显示了描绘EGCG、HA(800kDa)和HA-EGCG2缀合物对OA软骨细胞中IL-1β诱导的MMP-1、MMP-3和MMP-13表达的作用的图。在IL-1β(5ng/ml)存在下，用EGCG(10μM)、HA(0.2mg/ml和2.2mg/ml)或HA-EGCG1缀合物(0.2mg/ml和2.2mg/ml，分别含有10μM EGCG和100μM EGCG)处理细胞。使用RT-PCR分析基因表达(顶行)，并通过ELISA测量培养基中的蛋白质浓度(底行)。
图7是骨关节炎的大鼠前交叉韧带横断(ACLT)模型，其显示了关节内注射生理盐水、HA(800kDa)和HA-EGCG2缀合物对胫骨内侧髁的结构的作用。
实施例
将通过参考特定实施例来进一步更详细地描述本发明的非限制性实施例和比较实施例，这不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
材料
从JNC公司(日本东京)获得透明质酸(HA)(90kDa和800kDa)。从Sigma(新加坡)获得三(2-羧乙基)膦盐酸盐、半胱胺盐酸盐、甲磺酸(MSA)、2,2-氨基乙醛二乙缩醇(DA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、二甲亚砜(DMSO)和氯化钠(NaCl)。从Merck(新加坡)购得2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)。杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-12由Biopolis(新加坡)的培养基制备设备供应。
实施例1：HA-EGCG1缀合物的合成
通过用硫醇基团修饰HA主链中的羧基来合成硫醇化的HA衍生物。通常，在氮气氛下将1g HA(90kDa，2.5mmol-COOH)溶解在100mL蒸馏水中。向该溶液中添加半胱胺盐酸盐(136mg，1.2mmol)。然后添加EDC·HCl(485mg，2.5mmol)和NHS(290mg，2.5mmol)以引发缀合反应。当反应进行时，用1M NaOH使混合物的pH维持在4.7。反应混合物在25℃搅拌过夜，然后使pH达到7.0。将溶液转移到截留分子量为3500Da的透析管中。将纯化的溶液冻干，获得HA-半胱胺缀合物(0.84g)。取代度(DS)定义为HA中每100个重复二糖单元的取代基数。通过Ellman测定确定DS为7。将干燥的HA-半胱胺缀合物(0.5g，87.5μmol-SH)溶解在24.5mL0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中。向该溶液中添加1.5mL 0.5M TCEP溶液。将EGCG(3.45mmol，1.567g)溶解在预混合的溶剂(25mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)、5mL DMSO和1mL 100mM丙酮酸钠)中。然后将该溶液添加到搅拌的HA-半胱胺缀合物溶液中。在搅拌的同时在25℃温育反应混合物3小时。然后，添加5mL DMSO并在25℃搅拌过夜。通过添加1％乙酸使混合物的pH达到5，然后将溶液转移到截留分子量为3500Da的透析管。在氮气氛下管相对于蒸馏水透析3天。将纯化的溶液冻干，获得EGCG-接枝的HA(0.48g)。通过测量在273nm处EGCG的吸光度来确定DS。DS为3.72。通过1H NMR光谱确认产物的结构。1H NMR(D20):δ2.0(s,来自HA的-C＝OCH3),3.3-4.0(m，HA的质子),4.51和4.54(d,HA异头质子),5.60-5.85(s，C环的H-2和H-3),6.7(s,B环的H-6'),6.98(s,D环的H-2"和H-6")。
实施例2：HA-EGCG2缀合物的合成
首先，合成乙胺桥接的EGCG二聚体。向1.2ml冷MSA:THF(1:5，v/v)混合物中添加145μl DA(1mmol)。将所得混合物逐滴转移到溶解在3.8ml THF和1.7μl MSA中的EGCG(2.29g，5mmol)中。使反应在黑暗中在室温下进行过夜。第二天，通过蒸发去除溶剂并进一步在真空下干燥过夜。将干燥的产物溶解在10ml H2O中。通过使用分液漏斗用10ml乙酸乙酯萃取而去除未反应的EGCG。重复萃取程序，直到使用Waters Acuity UPLC-MS在水相中检测不到游离EGCG。通过碳二亚胺/活性酯介导的偶联反应使乙胺桥接的EGCG二聚体与HA缀合。通过搅拌将HA(800kDA，250mg，0.62mmol)溶解在具有2.5ml DMF的20.2ml的0.4M MES缓冲液(pH 5.2)中。接下来，添加NHS(89mg，0.78mmol)和乙胺桥接的二聚体(在2.33ml H2O中0.205mmol)。然后，添加EDC-HCl(150mg，0.78mmol)，并将反应物的pH调节到4.7。将反应混合物用N2剧烈吹扫10分钟，然后在室温下在N2下在黑暗中温育过夜。通过沉淀纯化HA-EGCG2缀合物。简单地说，将125ml H2O和16.7ml 5M NaCl溶液添加到反应混合物中，并用10M HCl溶液将pH降低到3。然后在搅拌的同时添加310ml乙醇。通过离心(6000rcf，5min)收集沉淀物。在倾析上清液之后，将沉淀物再溶解在250ml水中。在添加33ml 5M NaCl溶液并将pH调节到3之后，添加620ml乙醇。通过离心收集沉淀物并将其再溶解在500ml H2O中。在添加67ml 5M NaCl溶液并将pH降低到3之后，添加1.24L乙醇。通过离心再次收集沉淀物并将其再溶解在300ml H2O中。然后缀合物在N2中相对于H2O透析(Spectra/Por 7，MWCO＝3500Da)过夜。将纯化的HA-EGCG2缀合物冻干。产量为185mg(74％)。为了确定取代度(每100个二糖单位缀合的EGCG二聚体的数目)，将缀合物以0.5mg/ml溶解在水中，并记录吸光度光谱。通过在273nm处的吸光度测定缀合物中所含的EGCG的量，并且DS为1。
实施例3：人骨关节炎软骨细胞的培养
从Cell Applications公司(美国)获得冷冻保存的人骨关节炎软骨细胞(第1次传代)。将细胞解冻并使用完全生长培养基(补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基)在T75细胞培养瓶中培养。将细胞维持在37℃和5％CO2气氛下。每2-3天更换生长培养基，并且将细胞以80％融汇传代培养。在本研究中仅使用第2次传代和第3次传代的细胞。在扩增后，根据先前建立的有一些修改的方案，使细胞在海藻酸盐珠中再分化。简单地说，细胞用胰蛋白酶消化，形成小球并重悬于0.15M NaCl中的1.2％(w/v)海藻酸钠中。通过210针将细胞悬浮液逐滴分配到凝胶化溶液(102mM CaCl2，10mM HEPES和0.0005％Tween 20，pH 7.4)中。将大约15个海藻酸盐珠分散在6孔板中的5ml凝胶化溶液中。在凝胶化10min之后，去除凝胶化溶液，并且用5ml 0.15M NaCl洗涤海藻酸盐珠两次。然后添加完全生长培养基(5ml)，并且细胞在海藻酸盐珠中再分化8天。每2-3天更换培养基。在8天之后，将海藻酸盐珠溶解在溶解溶液(55mM EDTA和10mM HEPES，pH 7.4)中。使回收的细胞形成小球并以0.5×106个细胞/ml重悬于完全生长培养基中。对于细胞存活力测定，向96孔板的每孔中添加100μl细胞悬浮液。对于基因和蛋白质表达研究，向48孔板的每孔中添加200μl细胞悬浮液。在过夜温育之后，在用IL-1β刺激和/或用HA-EGCG缀合物处理之前，使细胞血清饥饿12小时。
实施例4：细胞存活力测定
在血清饥饿之后，去除用过的培养基，并将EGCG、HA、HA-EGCG1或HA-EGCG2缀合物添加于100μl无血清培养基中。不含药物的细胞用作对照。在温育24小时之后，根据制造商的说明书通过评估细胞存活力。在HA-EGCG1缀合物的存在下，使用人OA软骨细胞来确定细胞存活力。在HA-EGCG2缀合物的存在下，使用人类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞来确定细胞存活力。在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RMPI培养基中培养滑膜细胞。在进行细胞存活力测定之前，按照与骨关节炎软骨细胞相同的方案接种细胞并进行血清饥饿。
惊讶地发现，与EGCG相比，在HA-EGCG1缀合物的存在下，细胞更有存活力，表明EGCG与HA的缀合降低了EGCG毒性(图1)。用IL-1β刺激骨关节炎软骨细胞增加炎性细胞因子(图2)和MMP(图3)的mRNA和蛋白质表达。虽然EGCG(10μM)有效抑制IL-1β诱导的基因和蛋白质表达，但HA(90kDa)和HA-EGCG1缀合物未能下调IL-6和TNF-u表达(图2)。然而，惊讶地发现，尤其是在蛋白质水平下，HA-EGCG1缀合物比HA(90kDA)更有效地下调MMP-1、MMP-3和MMP-13表达(图3)。HA-EGCG1缀合物对MMP蛋白质表达的抑制被证明是浓度依赖性的。类似地，在相同的EGCG浓度下，与单独的EGCG相比，HA-EGCG2缀合物显示更低的细胞毒性(图4)。在基因和蛋白质水平两者下，HA-EGCG2缀合物比HA(800kDa)更有效地下调IL-1β刺激的OA软骨细胞中的IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3和MMP-13表达(图5和图6)。HA-EGCG2浓度的增加进一步降低了基因和蛋白质表达。总之，结果证实HA-EGCG1缀合物和HA-EGCG2缀合物是用于治疗骨关节炎的成功治疗剂。
实施例5：基因表达分析
在血清饥饿之后，去除用过的培养基，并将EGCG、HA、HA-EGCG1或HA-EGCG2缀合物添加于无血清培养基中。在2h之后，添加IL-1β(5ng/ml)，并且将细胞再温育24h。不含药物和IL-1β刺激的细胞用作对照。第二天，收集用过的培养基并将其储存在-80℃。根据制造商的说明书，通过Direct-zolTMRNA MiniPrep(Zymo Research)从细胞中分离RNA。根据制造商的说明书，通过RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific)合成第一链cDNA。根据制造商的方案使用iQ5实时PCR系统(BioRad)通过SensiFASTTM探针No-ROX试剂盒(Bioline)进行实时PCR(RT-PCR)。使用基因表达测定来扩增和检测RT-PCR中的IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3和MMP-13表达。GAPDH用作内部对照。将阈值循环(CT)值导出到Microsoft Excel，并且以GAPDH作为参照基因计算ΔΔCT。
实施例6：酶联免疫吸附测定(ELISA)
使用ELISA试剂盒(Abcam，香港)根据制造商的说明书确定培养基中IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13的浓度。还通过ELISA(Life Technologies)确定TNF-α的浓度。进行初步实验以确定每次测定所需的稀释倍数，以确保蛋白质的浓度落在可检测的范围内。
实施例7：前交叉韧带横断(ACLT)模型
将雄性威斯塔(Wistar)大鼠(220-260g)用甲苯噻嗪/氯胺酮(10/75mg/kg)经腹膜内麻醉。将右膝剃光并用碘/氯己定和70％乙醇交替消毒三次。在切开皮肤之后，打开关节囊。将前交叉韧带(ACL)定位并用一把剪刀切断。然后用缝合线(4-0，间断缝合)闭合皮肤。对于假手术，将ACL暴露但不横切。在用于预防性感染控制和疼痛减轻手术之后分别给予Baytril(10mg/kg，每日一次)和丁丙诺啡(buprenorphine)(0.05-2mg/kg，皮下，每日两次)5天和3天。允许大鼠在手术之后每天进行不受限制的笼活动，并且在手术后的前24-72小时对其进行密切观察。
在手术后四周进行关节内(i.a.)注射。用异氟烷麻醉动物(3％诱导和2％维持)，然后将50微升生理盐水、HA(在生理盐水中800kDa，10mg/ml)、HA-EGCG2缀合物(在生理盐水中10mg/ml)经关节内注射到右膝中。每周进行一次注射，连续5周。用生理盐水注射对假手术组。在手术后10周，通过CO2将动物无痛致死，并收获右关节。将关节在10％中性缓冲福尔马林中固定，在5％甲酸中脱钙，随后包埋在石蜡膜中。制备冠状切片(7μm)并用番红O和固绿染色。将载玻片用苏木精复染色。如图7中所示，尽管在所有治疗组的胫骨内侧髁中均观察到蛋白聚糖和软骨细胞的损失，但用HA-EGCG2缀合物治疗的关节显示即使在软骨的边缘，也存在软骨细胞(白色箭头)。由于存在软骨细胞，因此证明膝关节处的软骨被修复。
应用
所公开的聚合物-类黄酮缀合物可用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况。
有利地，所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以用于治疗骨关节炎。所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以有利地改善关节功能并减少疼痛。
有利地，使用所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以潜在地增强类黄酮的治疗结果。进一步有利地，注射第一到第三方面的所公开的聚合物-类黄酮缀合物可以克服类黄酮在口服施用时的低生物利用度。
还提供了用于制备所公开的聚合物-类黄酮缀合物的方法。
有利地，所公开的方法可以允许聚合物通过高效且有成本效益的方法与类黄酮缀合。将显而易见的是，在阅读上述公开内容后在不脱离本发明的精神和范围的情况下，对本领域技术人员来说，本发明的各种其它修改和改进是显而易见的，并且意在所有此类修改和改进都在所附权利要求的范围内。

Claims (94)

1.一种聚合物-类黄酮缀合物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述关节病况选自由以下各项组成的组：关节炎、软骨损伤、关节疼痛、关节炎症、系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、软骨下骨硬化、滑膜炎症和骨赘形成。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述关节炎选自由以下各项组成的组：骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、幼年型关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述关节病况的治疗性和/或预防性治疗导致软骨修复。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中一种或多种类黄酮与所述聚合物缀合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述聚合物通过接头与所述一种或多种类黄酮缀合。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述一种或多种类黄酮是单体类黄酮或二聚体类黄酮。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述聚合物在所述类黄酮的A环处与所述一种或多种类黄酮缀合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述聚合物在所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位与所述类黄酮缀合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的用途，其中所述聚合物含有游离醛或可以在酸的存在下转化为游离醛的基团，通过所述聚合物经由所述游离醛基与所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位反应而形成的连接使所述聚合物在所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位缀合。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述聚合物与所述类黄酮的B环缀合。
12.根据权利要求1-7和11中任一项所述的用途，其中所述聚合物在所述类黄酮的B环的C2位和/或C6位与所述类黄酮缀合。
13.根据权利要求1-7和11-12中任一项所述的用途，其中所述聚合物通过硫醇接头与所述类黄酮缀合。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的用途，其中所述聚合物选自由以下各项组成的组：多糖、多核苷酸、多肽、合成的聚合物和其混合物。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述多糖选自由以下各项组成的组：透明质酸、葡聚糖、纤维素、直链淀粉、淀粉、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、环糊精、硫酸葡聚糖、Ficoll、结冷胶、瓜尔胶、果胶、聚蔗糖、普鲁兰多糖、硬葡聚糖、黄原胶和木葡聚糖。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述多核苷酸选自由以下各项组成的组：适体、DNA、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA、肽核酸(PNA)和小发夹RNA(shRNA)。
17.根据权利要求14所述的用途，其中所述多肽选自由以下各项组成的组：蛋白质、抗体、抗体片段、Aptide、肽和聚(氨基酸)。
18.根据权利要求14所述的用途，其中所述合成的聚合物包含选自由以下各项组成的组的单体：烯烃、醚、羧酸、亚胺、酰胺、胺、酐、碳酸酯、酯、原酸酯和氨基甲酸乙酯。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述合成的聚合物选自由以下各项组成的组：聚(丙烯酰胺)、聚(烯丙基胺)、聚酐、聚(β-氨基酯)、聚(琥珀酸丁二酯)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚二烷酮、聚乙烯亚胺、聚(甘油)、聚乙醇酸、聚(3-羟基丙酸)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(原酸酯)、聚(2-唑啉)、聚(癸二酸)、聚(对苯二甲酸磷酸酯)共聚物、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和其组合。
20.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述类黄酮选自由以下各项组成的组：黄酮、异黄酮、黄烷、原花色素和花色素。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述类黄酮选自由以下各项组成的组：(-)-表儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、非瑟酮醇、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、牧豆树醇和刺槐亭醇、鞣花单宁、没食子单宁、乌龙茶氨酸、褐藻单宁、单宁、茶柠檬素、茶二苯并托酚酮、茶黄素、茶萘醌、茶红素、聚酯型儿茶素和其混合物。
22.根据权利要求13-21中任一项所述的用途，其中所述硫醇接头进一步包含与所述聚合物结合的部分，其中所述部分选自由以下各项组成的组：酰胺、胺、烷基、烯基、芳基、酯、碳酸酯、醚、酰氨基、酰氨基酯、氨基甲酸酯和缩醛基。
23.根据权利要求14-15中任一项所述的用途，其中所述多糖与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述多糖与两种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
25.根据权利要求23所述的用途，其中所述多糖通过硫醇接头与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
26.根据权利要求23或25所述的用途，其中所述多糖在所述表没食子儿茶素没食子酸酯的B环的C2和/或C6环与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
27.根据权利要求23-24中任一项所述的用途，其中所述多糖在所述表没食子儿茶素没食子酸酯的A环的C6位和/或C8位与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
28.根据权利要求1所述的用途，其中所述聚合物-类黄酮缀合物为式1：
其中：
每个n独立地为0到50000的整数，包括端值在内；并且每个m独立地为0到50000的整数，包括端值在内，其中n或m中的至少一个不为0。
29.根据权利要求1所述的用途，其中所述聚合物-类黄酮缀合物为式2：
其中：
每个n独立地为0到50000的整数，包括端值在内；并且每个m独立地为0到50000的整数，包括端值在内，其中n或m中的至少一个不为0。
30.根据权利要求28或29中任一项所述的用途，其中所述式1或式2的聚合物-类黄酮缀合物具有0.1％到50％的缀合度。
31.一种用于形成聚合物-类黄酮缀合物的方法，包括以下步骤：
(a)使含有胺的化合物与一种或多种类黄酮连接，从而形成带有游离胺基的类黄酮；和
(b)通过亲核加成使(a)的产物与聚合物缀合。
32.根据权利要求31所述的方法，其中步骤(a)包括使含有胺的化合物与两种类黄酮连接，从而形成含有胺的桥接类黄酮二聚体。
33.根据权利要求31-32中任一项所述的方法，其中步骤(b)在偶联剂的存在下进行。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述偶联剂选自由以下各项组成的组：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、1-乙基-3-(3-二甲基二环己基碳二亚胺(DCC)盐酸盐、二异丙基碳二亚胺(DIC)、羰基二咪唑、二亚胺代己二酸二甲酯、N-羟基琥珀酰亚胺、氯甲酸对硝基苯酯和1-(对甲苯磺酰基)咪唑。
35.一种聚合物-类黄酮缀合物或其药学上可接受的盐，用于治疗性和/或预防性治疗受试者的关节病况。
36.根据权利要求35所述的缀合物，其中所述关节病况选自由以下各项组成的组：关节炎、软骨损伤、关节疼痛、关节炎症、系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、软骨下骨硬化、滑膜炎症和骨赘形成。
37.根据权利要求36所述的缀合物，其中所述关节炎选自由以下各项组成的组：骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、幼年型关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎。
38.根据权利要求35-37所述的缀合物，其中所述关节病况的治疗性和/或预防性治疗导致软骨修复。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的缀合物，其中一种或多种类黄酮与所述聚合物缀合。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物通过接头与所述一种或多种类黄酮缀合。
41.根据权利要求35-40中任一项所述的缀合物，其中所述一种或多种类黄酮是单体类黄酮或二聚体类黄酮。
42.根据权利要求35-41中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物在所述类黄酮的A环处与所述一种或多种类黄酮缀合。
43.根据权利要求35-42中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物在所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位与所述类黄酮缀合。
44.根据权利要求35-43中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物含有游离醛或可以在酸的存在下转化为游离醛的基团，通过所述聚合物经由所述游离醛基与所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位反应而形成的连接使所述聚合物在所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位缀合。
45.根据权利要求35-41中任一项所述的用途，其中所述聚合物与所述类黄酮的B环缀合。
46.根据权利要求35-41和45中任一项所述的用途，其中所述聚合物在所述类黄酮的B环的C2位和/或C6位与所述类黄酮缀合。
47.根据权利要求35-41和45-46中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物通过硫醇接头与所述类黄酮缀合。
48.根据权利要求35-47中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物选自由以下各项组成的组：多糖、多核苷酸、多肽、合成的聚合物和其混合物。
49.根据权利要求48所述的缀合物，其中所述多糖选自由以下各项组成的组：透明质酸、葡聚糖、纤维素、直链淀粉、淀粉、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、环糊精、硫酸葡聚糖、Ficoll、结冷胶、瓜尔胶、果胶、聚蔗糖、普鲁兰多糖、硬葡聚糖、黄原胶和木葡聚糖。
50.根据权利要求48所述的缀合物，其中所述多核苷酸选自由以下各项组成的组：适体、DNA、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA、肽核酸(PNA)和小发夹RNA(shRNA)。
51.根据权利要求48所述的缀合物，其中所述多肽选自由以下各项组成的组：蛋白质、抗体、抗体片段、Aptide、肽和聚(氨基酸)。
52.根据权利要求48所述的缀合物，其中所述合成的聚合物包含选自由以下各项组成的组的单体：烯烃、醚、羧酸、亚胺、酰胺、胺、酐、碳酸酯、酯、原酸酯和氨基甲酸乙酯。
53.根据权利要求52所述的缀合物，其中所述合成的聚合物选自由以下各项组成的组：聚(丙烯酰胺)、聚(烯丙基胺)、聚酐、聚(β-氨基酯)、聚(琥珀酸丁二酯)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚二烷酮、聚乙烯亚胺、聚(甘油)、聚乙醇酸、聚(3-羟基丙酸)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(原酸酯)、聚(2-唑啉)、聚(癸二酸)、聚(对苯二甲酸磷酸酯)共聚物、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和其组合。
54.根据权利要求35-53中任一项所述的缀合物，其中所述类黄酮选自由以下各项组成的组：黄酮、异黄酮、黄烷、原花色素和花色素。
55.根据权利要求54所述的缀合物，其中所述类黄酮选自由以下各项组成的组：(-)-表儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、非瑟酮醇、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、牧豆树醇和刺槐亭醇、鞣花单宁、没食子单宁、乌龙茶氨酸、褐藻单宁、单宁、茶柠檬素、茶二苯并托酚酮、茶黄素、茶萘醌、茶红素、聚酯型儿茶素和其混合物。
56.根据权利要求47-55中任一项所述的缀合物，其中所述硫醇接头进一步包含与所述聚合物结合的部分，其中所述部分选自由以下各项组成的组：酰胺、胺、烷基、烯基、芳基、酯、碳酸酯、醚、酰氨基、酰氨基酯、氨基甲酸酯和缩醛基。
57.根据权利要求48-49中任一项所述的缀合物，其中所述多糖与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
58.根据权利要求57所述的缀合物，其中所述多糖与两种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
59.根据权利要求57所述的缀合物，其中所述多糖通过硫醇接头与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
60.根据权利要求57或59所述的缀合物，其中所述多糖在所述表没食子儿茶素没食子酸酯的B环的C2和/或C6环与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
61.根据权利要求57-60中任一项所述的缀合物，其中所述多糖在所述表没食子儿茶素没食子酸酯的A环的C6位和/或C8位与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
62.根据权利要求35所述的缀合物，其中所述聚合物-类黄酮缀合物为式1：
其中：
每个n独立地为0到50000的整数，包括端值在内；并且每个m独立地为0到50000的整数，包括端值在内，其中n或m中的至少一个不为0。
63.根据权利要求35所述的缀合物，其中所述聚合物-类黄酮缀合物为式2：
其中：
每个n独立地为0到50000的整数，包括端值在内；并且每个m独立地为0到50000的整数，包括端值在内，其中n或m中的至少一个不为0。
64.根据权利要求62或63中任一项所述的缀合物，其中所述式1或式2的聚合物-类黄酮缀合物具有0.1％到50％的缀合度。
65.一种治疗或预防关节病况的方法，包括向受试者施用治疗有效量的聚合物-类黄酮缀合物。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述关节病况选自由以下各项组成的组：关节炎、软骨损伤、关节疼痛、关节炎症、系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、软骨下骨硬化、滑膜炎症和骨赘形成。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述关节炎选自由以下各项组成的组：骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、幼年型关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述关节病况的治疗性和/或预防性治疗导致软骨修复。
69.根据权利要求65-68中任一项所述的方法，其中一种或多种类黄酮与所述聚合物缀合。
70.根据权利要求65-69中任一项所述的方法，其中所述聚合物通过接头与所述一种或多种类黄酮缀合。
71.根据权利要求65-70中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类黄酮是单体类黄酮或二聚体类黄酮。
72.根据权利要求65-71中任一项所述的方法，其中所述聚合物在所述类黄酮的A环处与所述一种或多种类黄酮缀合。
73.根据权利要求65-72中任一项所述的方法，其中所述聚合物在所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位与所述类黄酮缀合。
74.根据权利要求65-73中任一项所述的方法，其中所述聚合物含有游离醛或可以在酸的存在下转化为游离醛的基团，通过所述聚合物经由所述游离醛基与所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位反应而形成的连接使所述聚合物在所述类黄酮的A环的C6位和/或C8位缀合。
75.根据权利要求65-72中任一项所述的方法，其中所述聚合物与所述类黄酮的B环缀合。
76.根据权利要求65-72和75中任一项所述的方法，其中所述聚合物在所述类黄酮的B环的C2位和/或C6位与所述类黄酮缀合。
77.根据权利要求65-72和75-76中任一项所述的方法，其中所述聚合物通过硫醇接头与所述类黄酮缀合。
78.根据权利要求65-77中任一项所述的方法，其中所述聚合物选自由以下各项组成的组：多糖、多核苷酸、多肽、合成的聚合物和其混合物。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述多糖选自由以下各项组成的组：透明质酸、葡聚糖、纤维素、直链淀粉、淀粉、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、环糊精、硫酸葡聚糖、Ficoll、结冷胶、瓜尔胶、果胶、聚蔗糖、普鲁兰多糖、硬葡聚糖、黄原胶和木葡聚糖。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述多核苷酸选自由以下各项组成的组：适体、DNA、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA、肽核酸(PNA)和小发夹RNA(shRNA)。
81.根据权利要求78所述的方法，其中所述多肽选自由以下各项组成的组：蛋白质、抗体、抗体片段、Aptide、肽和聚(氨基酸)。
82.根据权利要求78所述的方法，其中所述合成的聚合物包含选自由以下各项组成的组的单体：烯烃、醚、羧酸、亚胺、酰胺、胺、酐、碳酸酯、酯、原酸酯和氨基甲酸乙酯。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述合成的聚合物选自由以下各项组成的组：聚(丙烯酰胺)、聚(烯丙基胺)、聚酐、聚(β-氨基酯)、聚(琥珀酸丁二酯)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚二烷酮、聚乙烯亚胺、聚(甘油)、聚乙醇酸、聚(3-羟基丙酸)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(原酸酯)、聚(2-唑啉)、聚(癸二酸)、聚(对苯二甲酸磷酸酯)共聚物、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和其组合。
84.根据权利要求65-83中任一项所述的方法，其中所述类黄酮选自由以下各项组成的组：黄酮、异黄酮、黄烷、原花色素和花色素。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述类黄酮选自由以下各项组成的组：(-)-表儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、非瑟酮醇、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、牧豆树醇和刺槐亭醇、鞣花单宁、没食子单宁、乌龙茶氨酸、褐藻单宁、单宁、茶柠檬素、茶二苯并托酚酮、茶黄素、茶萘醌、茶红素、聚酯型儿茶素和其混合物。
86.根据权利要求77-85中任一项所述的方法，其中所述硫醇接头进一步包含与所述聚合物结合的部分，其中所述部分选自由以下各项组成的组：酰胺、胺、烷基、烯基、芳基、酯、碳酸酯、醚、酰氨基、酰氨基酯、氨基甲酸酯和缩醛基。
87.根据权利要求78-79中任一项所述的方法，其中所述多糖与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述多糖与两种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述多糖通过硫醇接头与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
90.根据权利要求86或89所述的方法，其中所述多糖在所述表没食子儿茶素没食子酸酯的B环的C2和/或C6环与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
91.根据权利要求86-89中任一项所述的方法，其中所述多糖在所述表没食子儿茶素没食子酸酯的A环的C6位和/或C8位与至少一种表没食子儿茶素没食子酸酯缀合。
92.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物-类黄酮缀合物为式1：
其中：
每个n独立地为0到50000的整数，包括端值在内；并且每个m独立地为0到50000的整数，包括端值在内，其中n或m中的至少一个不为0。
93.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物-类黄酮缀合物为式2：
其中：
每个n独立地为0到50000的整数，包括端值在内；并且每个m独立地为0到50000的整数，包括端值在内，其中n或m中的至少一个不为0。
94.根据权利要求92或93中任一项所述的方法，其中所述式1或式2的聚合物-类黄酮缀合物具有0.1％到50％的缀合度。
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